WO2014069512A1 - 糖鎖認識分子を検出するための膜担体 - Google Patents

糖鎖認識分子を検出するための膜担体 Download PDF

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albumin
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雅哲 豊田
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Definitions

  • the present invention relates to a membrane carrier for detecting a molecule that recognizes a sugar chain, a device for detecting a molecule that recognizes a sugar chain by immunochromatography, and a method for detecting a molecule that recognizes a sugar chain by immunochromatography.
  • the present invention has been made in view of the above-described problems of the prior art, and provides a substance and a method capable of detecting a molecule that recognizes a sugar chain quickly and easily with high sensitivity regardless of location.
  • the purpose is to do.
  • Immunochromatography is known as a method that can detect specific molecules quickly and easily regardless of location.
  • the binding between the sugar chain recognition molecule and the sugar chain is weak, and it is difficult to immobilize the sugar chain at a high density on the membrane carrier used for immunochromatography. Sufficient sensitivity to detect the recognition molecule could not be obtained.
  • a protein to which the sugar chain is bound is immobilized on a detection line.
  • the membrane carrier according to ⁇ 1>, wherein the protein to which the sugar chain is bound is formed by binding the reducing end of the sugar chain and the amino group of the protein by a reductive amination reaction.
  • ⁇ 3> The membrane carrier according to ⁇ 1> or ⁇ 2>, wherein the protein is albumin.
  • ⁇ 4> A method for detecting a molecule recognizing a sugar chain by immunochromatography, After bringing the test sample into contact with a molecule that recognizes and recognizes a molecule that recognizes a sugar chain, the test sample is placed in the detection line in the membrane carrier according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3>.
  • ⁇ 5> A device for detecting a molecule recognizing a sugar chain by immunochromatography, comprising the membrane carrier according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3> and the following (a) to (c): A device comprising at least one component selected from the group (a) a sample pad (b) a conjugate pad (c) an absorbent pad.
  • a molecule that recognizes a sugar chain can be detected quickly and easily with high sensitivity regardless of location.
  • FIG. 1 is a schematic plan view showing a preferred embodiment of a device for detecting a molecule recognizing a sugar chain of the present invention by immunochromatography.
  • FIG. 2 is a schematic sectional side view showing a cut surface when the device shown in FIG. 1 is cut along the line II-II in FIG. 2 is a photograph showing a result of staining a gel obtained by developing an albumin and a gel obtained by binding albumin with a sugar chain (GM1) (GM1-bound albumin) by SDS-PAGE with a protein staining reagent.
  • GM1 GM1-bound albumin
  • the five lanes of GM1-bound albumin show the results of developing 1000 ⁇ g, 500 ⁇ g, 250 ⁇ g, 125 ⁇ g, 62.5 ⁇ g GM1 and 66 ⁇ g albumin in order from the left.
  • Gel obtained by developing albumin and GM1-bound albumin by SDS-PAGE was transferred to a PVDF membrane, and HRP-labeled cholera toxin ⁇ subunit (HRP-CTB) was allowed to act on the membrane to give 4-chloro-1-naphthol. It is a photograph which shows the result dye
  • the five lanes of GM1-bound albumin show the results of developing 1000 ⁇ g, 500 ⁇ g, 250 ⁇ g, 125 ⁇ g, 62.5 ⁇ g GM1 and 66 ⁇ g albumin in order from the left. Results obtained by allowing HRP-CTB to act on a membrane carrier (HiFlow Plus HFB180UBCAST, HiFlow Plus HFB07502, HiFlow Plus HFB12002) on which GM1-bound albumin and albumin are immobilized, and staining using 4-chloro-1-naphthol as a chromogenic substrate It is a photograph which shows.
  • FIG. 3 is a photograph showing the result of staining with 4-chloro-1-naphthol as a chromogenic substrate by allowing HRP-CTB to act on a membrane carrier on which GM1-bound albumin and albumin are immobilized.
  • the quantity (100 ng, 10 ng, 1 ng) in the figure indicates the amount spotted on the membrane carrier of GM1-bound albumin or albumin.
  • 2 is a photograph showing the result of staining with 4-chloro-1-naphthol as a chromogenic substrate by allowing HRP-CTB to act on a membrane carrier on which GM1-bound albumin and GM1 ganglioside are immobilized.
  • the quantity (100 ng, 10 ng) in the figure indicates the amount spotted on the membrane carrier of GM1-bound albumin or GM1 ganglioside.
  • 2 is a photograph showing the result of staining with 4-chloro-1-naphthol as a chromogenic substrate by allowing HRP-CTB to act on a membrane carrier on which GM1-bound albumin and GM1 ganglioside are immobilized. Concentrations in the figure (1.0 ⁇ g / mL, 0.1 ⁇ g / mL, 0.01 ⁇ g / mL) indicate the concentration of HRP-CTB applied to the membrane carrier.
  • the present invention provides a membrane carrier used in a device for detecting a molecule that recognizes a sugar chain by immunochromatography, wherein the protein to which the sugar chain is bound is immobilized on a detection line. is there.
  • the “sugar chain” refers to a polysaccharide in which two or more monosaccharides (monosaccharides and derivatives thereof) are connected by glycosidic bonds, and is a sugar chain to be detected by immunochromatography according to the present invention.
  • Such sugar chains may be composed of one kind of monosaccharide (homo sugar chain) or may be composed of two or more kinds of monosaccharides (hetero sugar chain).
  • the type and number of monosaccharides constituting the sugar chain are not particularly limited, and the glycosidic bond between monosaccharides may be either an ⁇ bond or a ⁇ bond.
  • the sugar chain may be naturally derived, or may be naturally derived and artificially modified with addition or substitution of a functional group, and is chemically synthesized. There may be.
  • the “molecule recognizing a sugar chain” is not particularly limited, and includes an antibody that recognizes the sugar chain and a protein that recognizes the sugar chain (lectin).
  • the “protein” to which the sugar chain is bound is not particularly limited with respect to the type and number of amino acids constituting the protein as long as the sugar chain can be bound in a multivalent manner.
  • the “protein” may be obtained by separation / extraction / purification from natural products such as plants, animals, microorganisms (fungi, viruses, etc.), and cell-free protein synthesis systems (for example, reticulates). Erythrocyte extract, wheat germ extract), Escherichia coli, animal cells, insect cells, plant cells, etc., may be synthesized by genetic techniques, and further chemistry using automatic synthesizer etc. It may be synthesized.
  • the “protein” according to the present invention is derived from a natural product from the viewpoint that it is easier to bind more sugar chains according to the present invention because it does not have sugar chains unless it is artificially modified with sugar chains. If so, albumin and ribonuclease A are preferable, and from the same viewpoint, a protein synthesized by genetic techniques using E. coli or a chemically synthesized protein is preferable.
  • the method for preparing a protein to which a sugar chain is bound there is no particular limitation on the method for preparing a protein to which a sugar chain is bound.
  • a method of binding the reducing end of the sugar chain and the amino group of the protein (reductive amination reaction), Bromoacetylating the reducing end of the protein and covalently bonding it to the thiol group in the cysteine of the protein, introducing an amino group to the reducing end of the sugar chain, and covalently binding the carboxyl group of the protein
  • a method of synthesizing the protein by linking chemically bonded amino acids by a polymerization reaction is mentioned, but it is not necessary to introduce a new functional group at the reducing end of the sugar chain, and from the viewpoint that the reaction is simple
  • a reductive amination reaction is preferred.
  • the average number of sugar chains per molecule of the protein depends on the type of the sugar chain and the protein, the preparation method of the protein to which the sugar chain is bound, and is usually 1 to 40. From the viewpoint of densification of sugar chains in proteins and ease of production of proteins to which sugar chains are bound, the number is preferably 5 to 25.
  • the “membrane carrier” on which the sugar chain-bound protein is immobilized is a protein capable of immobilizing the sugar chain-bound protein and subjecting the test sample to be subjected to immunochromatography to capillary action.
  • Any film made of a deployable material may be used. Examples of such materials include celluloses such as nitrocellulose, polyvinylidene fluoride (PVDF), polyethersulfone (PES), polyethylene terephthalate (PET), polyethylene, polypropylene, nylons, and glass fibers.
  • the pore diameter of the membrane carrier of the present invention is not particularly limited, and may be appropriately adjusted in consideration of the development rate of the test sample and the like, for example, 0.1 to 10 ⁇ m.
  • the “detection line” in such a membrane carrier is a site for capturing and detecting a sugar chain recognition molecule in a test sample developed on the membrane carrier. Therefore, the “detection line” needs to be arranged on the downstream side of the membrane carrier.
  • the upstream side and the downstream side are the upstream side (left side in FIGS. 1 and 2 described later) and the downstream side (FIGS. 1 and 2 described later) of the flow of the test sample developing the membrane carrier. Means right side).
  • the “detection line” needs to immobilize a protein linked to a sugar chain, which is a molecule for capturing a sugar chain recognition molecule.
  • the immobilization method is not particularly limited, and examples thereof include physical adsorption, electrostatic interaction, hydrophobic interaction, and a method using a crosslinking agent.
  • the amount of protein immobilized with a sugar chain is appropriately adjusted according to the material of the membrane carrier, the binding property to the sugar chain recognition molecule, the type of label of the molecule that recognizes the molecule that recognizes the sugar chain described below, and the like. For example, it is 1 ng to 1 ⁇ g.
  • the present invention is a method for detecting a molecule that recognizes a sugar chain by immunochromatography, wherein a test sample is contacted with a molecule that recognizes a molecule that recognizes a sugar chain and is labeled, and then the membrane of the present invention.
  • the present invention provides a method of developing a test sample toward the detection line on a carrier and detecting the labeling substance on the detection line.
  • test sample is not particularly limited, and for example, blood, serum, plasma, spinal fluid, saliva, sputum, tears, eye oil, oral cavity, isolated from animals such as bacterial cells, soil, and humans. And nasal mucosa, urine, feces, skin, various organs, muscles, bones and nerves, and extracts from these.
  • the “molecule recognizing a sugar chain” is not particularly limited, and may be an antibody that recognizes a sugar chain recognition molecule.
  • the sugar chain recognition molecule is an antibody
  • Protein A or protein G may be used.
  • it may be a sugar chain recognized by a sugar chain recognition molecule.
  • the labeling substance added to the “molecule recognizing a sugar chain” include a color labeling substance and an enzyme labeling substance.
  • the color labeling substance include metal colloids such as gold colloid and platinum colloid, as well as synthetic latex such as polystyrene latex colored with respective pigments such as red and blue, and latex such as natural rubber latex.
  • the enzyme labeling substance include horseradish peroxidase (HRP), ⁇ -galactosidase, luciferase, and alkaline phosphatase.
  • the “contact” between the test sample and the molecule that recognizes and recognizes the sugar chain-recognized molecule may be performed until the test sample introduced into the membrane carrier reaches the detection line.
  • the sample Before introducing a test sample into the membrane carrier of the present invention or the device of the present invention described later, the sample may be contacted by adding a molecule that recognizes and recognizes a sugar chain to the sample.
  • the test sample may be contacted by passing through a conjugate pad described below.
  • a developing solution may be used in order to efficiently develop a test sample and a molecule that recognizes a sugar chain and a labeled molecule by capillary action.
  • the developing solution include a buffer solution containing at least one of proteins, polysaccharides, surfactants, organic solvents, polymers, and the like.
  • the developing solution may be mixed with the test sample and then introduced into the membrane carrier, or may be introduced from the upstream side of the membrane carrier after the test sample or the like is introduced into the membrane carrier.
  • a sugar chain recognition molecule is contained in the test sample, a complex of the sugar chain recognition molecule formed by the contact and a molecule that recognizes the molecule and is labeled is detected on the detection line. By being captured by the sugar chain, the labeling substance is accumulated in the detection line.
  • the presence or absence of the sugar chain recognition molecule in the test sample can be determined by detecting the labeling substance in the detection line.
  • “detection of the labeling substance” can be performed by visually confirming the color generated by the accumulation of the labeling substance in the detection line.
  • it is an enzyme labeling substance, it can carry out by visually confirming the coloring which arises by adding the coloring substrate of the said enzyme to a detection line.
  • a chromogenic substrate include 4-chloro-1-naphthol, ABTS, O-phenylenediamine (OPD), and tetramethylbenzidine (TMB) when HRP is used as the enzyme labeling substance.
  • the present invention is a device for detecting a molecule recognizing a sugar chain by immunochromatography, wherein the membrane carrier of the present invention is at least one selected from the group consisting of the following (a) to (c): A device comprising a component (a) Sample pad (b) Conjugate pad (c) An absorbent pad is provided.
  • a suitable example of such a device of the present invention is shown in FIGS.
  • FIG. 1 is a schematic plan view of such a device
  • FIG. 2 is a schematic sectional side view showing a cut surface when the device shown in FIG. 1 is cut along the line II-II in FIG.
  • the device of the present invention will be described below with reference to these drawings.
  • the device of the present invention is a device comprising the membrane carrier 1 of the present invention and at least one component selected from the group consisting of a sample pad 4, a conjugate pad 5 and an absorbent pad 6, as shown in FIG. .
  • the membrane carrier 1 is as described above, but as shown in FIGS. 1 and 2, a control line 3 may be provided in addition to the detection line 2 described above.
  • control line 3 Since the control line 3 is a part for recognizing the aforementioned molecule that recognizes the sugar chain and capturing the labeled molecule, the labeling substance is not detected in the detection line 2, but only in the control line 3. When it is detected, it can be determined that no sugar chain recognition molecule is present in the test sample.
  • a molecule for example, an antibody, a lectin, or an aptamer
  • Fixed in order to recognize the molecule that recognizes the sugar chain and to capture the labeled molecule.
  • the sample pad 4 is a part for holding and passing a test sample or a developing solution introduced into the device of the present invention. Therefore, in the device of the present invention, the sample pad 4 needs to be in contact with the membrane carrier 1 directly or indirectly and disposed on the upstream side of the membrane carrier 1.
  • the conjugate pad 5 is a part for recognizing the molecule recognizing the sugar chain and carrying a labeled molecule, and bringing the molecule into contact with the test sample. Therefore, in the device of the present invention, the conjugate pad 5 needs to be directly or indirectly in contact with the sample pad 4 and the membrane carrier 1 and disposed on the downstream side of the sample pad 4 and the upstream side of the membrane carrier 1. is there.
  • the absorption pad 6 is a part for suppressing the backflow while promoting the development of the test sample on the membrane carrier by absorbing the surplus test sample and the developing solution that have passed through the membrane carrier. Therefore, in the device of the present invention, the absorbent pad 6 needs to be in contact with the membrane carrier 1 directly or indirectly and disposed on the downstream side of the membrane carrier 1.
  • the material of the sample pad 4, the conjugate pad 5 and the absorbent pad 6 is not particularly limited, and celluloses such as nitrocellulose, polyvinylidene fluoride (PVDF), polyethersulfone (PES), polyethylene terephthalate (PET), polyethylene , Polypropylene, nylon and glass fiber.
  • PVDF polyvinylidene fluoride
  • PES polyethersulfone
  • PET polyethylene terephthalate
  • polyethylene polyethylene
  • Polypropylene nylon and glass fiber.
  • a holding plate 12 may be provided to hold the membrane carrier 1, the sample pad 4, the conjugate pad 5 or the absorption pad 6 described above.
  • the material of the holding plate 12 is preferably plastic in terms of ease of molding, cost, and lightness. Various plastic materials can be selected as the plastic material. Formability, heat resistance, and chemical resistance are selected according to the characteristics of the intended use, treatment, solvent used, bioactive substance, and detection method. In consideration of the adsorptivity and the like, it is appropriately selected.
  • polystyrene polyethylene, polyvinyl chloride, polypropylene, polycarbonate, polyester, polymethyl methacrylate, polyvinyl acetate, vinyl-acetate copolymer, styrene-methyl methacrylate copolymer, acrylonitrile-styrene copolymer, acrylonitrile- Examples thereof include butadiene-styrene copolymer, nylon, polymethylpentene, silicone resin, amino resin, polysulfone, polyethersulfone, polyetherimide, fluororesin, and polyimide.
  • additives such as pigments, dyes, antioxidants, and flame retardants may be appropriately mixed with these plastic materials.
  • the device of the present invention may include caging (upper caging 10 and lower caging 11) for fixing and storing the above-described membrane carrier 1, pad, and holding plate 12.
  • the base material of the upper casing 10 and the lower casing 11 is preferably plastic in terms of ease of molding, cost, and lightness.
  • plastic materials include polystyrene, polyethylene, polyvinyl chloride, polypropylene, polycarbonate, polyester, polymethyl methacrylate, polyvinyl acetate, vinyl-acetate copolymer, styrene-methyl methacrylate copolymer, and acrylonitrile-styrene copolymer.
  • Examples thereof include polymers, acrylonitrile-butadiene-styrene copolymers, nylon, polymethylpentene, silicone resins, amino resins, polysulfones, polyether sulfones, polyether imides, fluororesins, polyimides, and the like.
  • additives such as pigments, dyes, antioxidants, and flame retardants may be appropriately mixed with these plastic materials.
  • structures for fixing the contents such as the sample pad 4, the conjugate pad 5, the membrane carrier 1, the absorption pad 6, and the holding plate 12 can be appropriately formed. .
  • the upper casing 10 may be formed with an introduction port 7, a determination window 8 or an air hole 9.
  • the introduction port 7 is a part for introducing a test sample to be subjected to immunochromatography.
  • the seal (seal) of the container (sample collection container) containing the test sample can be broken, so that the sample can be rapidly deployed on the detection line 2 side without leaking to the outside.
  • the determination window 8 is a part for visually observing the detection line 2 and the control line 3 described later on the membrane carrier 1 and determining the presence or absence of a sugar chain recognition molecule in the test sample.
  • the determination window 8 may be formed by, for example, the upper casing being penetrated in the thickness direction, and a transparent plastic plate or film may be added to the through hole.
  • the air hole 9 is a part for discharging the air in the caging, thereby improving the absorption efficiency of the test sample by the absorption pad 6 described later, and thus enabling rapid development of the test sample on the membrane carrier. To do.
  • the air hole 9 may be formed by penetrating the upper casing in the thickness direction, and the shape and number thereof are not particularly limited. For example, as shown in FIGS. One rectangular through hole is mentioned.
  • the size of the device of the present invention is not particularly limited.
  • the size of the device (caging) shown in FIGS. 1 and 2 is 5 to 11 cm in length, 1 to 3 cm in width, and 0.2 in height. Up to 1.5 cm.
  • the device of the present invention has been described above, but the device of the present invention is not limited to the above embodiment.
  • a person skilled in the art can appropriately apply, modify, and add to the device configuration, material, structure, and the like while taking the above into consideration.
  • a reductive amination reaction was performed in order to bind the reducing end of the sugar chain (GM1) of the glycolipid (ganglioside GM1) and the amino group of human-derived albumin.
  • the amount of sugar chain to be reacted with respect to 66 ⁇ g of albumin was 1000 ⁇ g, 500 ⁇ g, 250 ⁇ g, 125 ⁇ g or 62.5 ⁇ g.
  • the gel in which only the product or albumin was developed was transferred to a PVDF membrane.
  • a cholera toxin ⁇ subunit known as a GM1 recognition molecule labeled with HRP (hereinafter also referred to as “HRP-CTB”.
  • HRP-CTB concentration: 0.2 ⁇ g / mL) is used for the PVDF membrane.
  • the gel was stained with 4-chloro-1-naphthol, which is a color developing substrate for HRP. The obtained results are shown in FIG.
  • the molecular weight of the prepared GM1-bound albumin is about 86, 84, 79, 76, or 73 kDa, so the increase in molecular weight due to the sugar chain bound to albumin is about 20, 18, 13 It was found to be 10 or 7 kDa.
  • the molecular weight per GM1 sugar chain is about 1 kDa
  • the average number of sugar chains bound to one albumin molecule is about 20, 18, 13, 10 or 7. It was.
  • the average number of sugar chains bound to one albumin molecule can be increased according to the amount of sugar chains charged in the reductive amination reaction. became.
  • albumin having an average of 20 GM1 bound per molecule is larger than albumin having an average of 7 GM1 bound, and recognizes the sugar chain (GM1). It was revealed that it is bound to CTB, which is a molecule to be conjugated.
  • the membranes used are Millipore membranes HiFlow Plus HFB180UBCAST, HiFlow Plus HFB07502 and HiFlow Plus HFB12002 made of nitrocellulose.
  • the membrane spotted with GM1-bound albumin or albumin was air-dried and then developed with HRP-CTB (HRP-CTB concentration: 0.2 ⁇ g / mL) and 4-chloro-1-naphthol. The obtained results are shown in FIG.
  • the amount spotted on the membrane was changed from 1 ⁇ g to 100 ng, 10 ng or 1 ng, and GM1-bound albumin was immobilized on an immunochromatography membrane (HiFlow Plus HFB180UBCAST) in the same manner as described above, and HRP-CTB (HRP-CTB concentration) : 0.2 ⁇ g / mL) and 4-chloro-1-naphthol.
  • HRP-CTB HRP-CTB concentration
  • CTB cholera toxin ⁇ subunit
  • ELISA method As a method for detecting a glycolipid recognition molecule, there is an ELISA method.
  • a microplate on which 100 ng of GM1 ganglioside is immobilized per well is usually used (see Patent Document 1). Therefore, in terms of detecting glycolipid recognition molecules, the ELISA method was compared with immunochromatography using the membrane carrier of the present invention.
  • GM1-bound albumin (average number of sugar chains bound to one albumin molecule: 20) was spotted on a membrane (HiFlow Plus HFB180UBCAST), and the membrane of the present invention prepared by immobilization.
  • Carriers (Examples 1 and 2) were prepared.
  • membrane carriers (Comparative Examples 1 and 2) on which 100 ng and 10 ng of GM1 ganglioside were immobilized instead of GM1-bound albumin were prepared.
  • 100ng and 10ng of GM1 binding albumin contain GM1 equivalent to 50ng and 5ng of GM1 ganglioside.
  • the staining property of the membrane carrier of the present invention (Example 2) on which GM1-bound albumin corresponding to 5 ng of GM1 ganglioside is immobilized is that 100 ng of GM1 ganglioside is immobilized. It was equivalent to that in the membrane carrier (Comparative Example 1). Further, the staining property of the membrane carrier of the present invention (Example 1) on which GM1-bound albumin corresponding to 50 ng of GM1 ganglioside was immobilized was significantly superior to that in Comparative Example 1.
  • the binding ability to CTB is significantly stronger with GM1-bound albumin than with GM1 ganglioside, and the immunochromatography using the membrane carrier of the present invention is more recognizing glycolipid recognition than the ELISA method using GM1 ganglioside. It has been found that it is remarkably superior in terms of detecting molecules (CTB).
  • GM1-bound albumin can detect glycolipid recognition molecules with high sensitivity. That is, the membrane carrier of the present invention (Example 3) in which 0.7 ⁇ g of GM1-bound albumin was immobilized as in Examples 1 and 2, and the membrane in which 1 ⁇ g of GM1 ganglioside was immobilized as in Comparative Examples 1 and 2.
  • a carrier (Comparative Example 3) was prepared. These membrane carriers were allowed to act on HRP-CTB, and then stained using 4-chloro-1-naphthol as a chromogenic substrate. Note that the concentration of HRP-CTB in the HRP-CTB solution that was allowed to act is 1.0, 0.1, or 0.01 ⁇ g / mL. Moreover, it is estimated that 0.7 micrograms of GM1 binding albumin contains GM1 equivalent to 0.35 micrograms of GM1 ganglioside. The obtained result is shown in FIG.
  • the membrane carrier (Comparative Example 3) on which 1 ⁇ g of GM1 ganglioside is immobilized cannot be detected unless the concentration of HRP-CTB is about 0.1 to 1.0 ⁇ g / mL.
  • the concentration of HRP-CTB is about 0.01 ⁇ g / mL, although the sugar chain amount is only about 35% of GM1 ganglioside.
  • sugar chains can be immobilized on the membrane carrier at a high density by immobilizing the protein to which the sugar chain is bound to the membrane carrier. And it became clear that by using such a membrane carrier, sugar chain recognition molecules can be detected with higher sensitivity than conventional methods (for example, ELISA method).
  • a molecule that recognizes a sugar chain can be detected quickly and easily with high sensitivity regardless of location.
  • immunochromatography using the membrane carrier of the present invention involves research and development that requires detection of molecules that recognize sugar chains (lectins, antibodies that recognize sugar chains), and autoantibodies that recognize sugar chains. It is useful in the diagnosis of diseases.
  • SYMBOLS 1 Membrane carrier, 2 ... Detection line, 3 ... Control line, 4 ... Sample pad, 5 ... Conjugate pad, 6 ... Absorption pad, 7 ... Inlet, 8 ... Judgment window, 9 ... Air hole, 10 ... Upper caging , 11 ... lower caging, 12 ... holding plate, 13 ... projection

Abstract

　糖鎖を認識する分子を、場所を選ばず迅速簡便に高感度にて検出することを可能とする物質及び方法を提供する。すなわち、前記糖鎖が結合したタンパク質が検出ラインに固定化されたイムノクロマトグラフィー用の膜担体、該膜担体を備えたデバイス、及びそれらを利用する前記糖鎖を認識する分子をイムノクロマトグラフィーにより検出する方法を提供する。

Description

糖鎖認識分子を検出するための膜担体
　本発明は、糖鎖を認識する分子を検出するための膜担体、糖鎖を認識する分子をイムノクロマトグラフィーにより検出するためのデバイス、並びに糖鎖を認識する分子をイムノクロマトグラフィーにより検出する方法に関する。
　炎症性疾患や自己免疫疾患において、患者血清中に糖脂質の糖鎖部分を認識する自己抗体が検出される例が知られている。特に、糖脂質は神経組織に多く存在することが知られており、このような自己抗体は、神経を傷害する自己免疫型の神経疾患を起こすことが知られている。
　かかる疾患に対しては、自己抗体を患者の体内から除去する血漿交換療法や免疫吸着療法、自己抗体を中和させる免疫グロブリンの大量静脈注射療法等の治療が行われる。しかしながら、これら治療が有効であるのは、発症してから１週間程度であるため、迅速な診断結果の提供が求められている。
　自己免疫疾患等の診断法としては、糖脂質そのものを固相化させたマイクロプレートを用いたＥＬＩＳＡ法がある（特許文献１）。しかしながら、この診断法においては、マイクロプレートリーダー等の分析装置を必要とし、また自己抗体等を検出するための工程が煩雑であり、さらには得られた結果の分析には専門的な知識を要するため、患者等から採取した試料を検査センターに送って検査する必要がある。そのため、迅速な診断結果の提供が求められる自己免疫疾患等において、診断に時間を要するＥＬＩＳＡ法は有効性に乏しかった。また、一般的に糖鎖を認識する分子（糖鎖認識分子）は、糖鎖に対する結合性が弱いため、後述の実施例においても示す通り、従前の糖鎖認識分子を検出する系の感度は低いものであった。
　従って、自己免疫疾患等の診断等において、自己抗体等の糖鎖認識分子を、場所を選ばず迅速簡便に高感度にて検出できる方法の開発が求められていたが、かかる方法は未だ実用化されていないのが現状である。
特開２００３－２９４７５２号公報
　本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、糖鎖を認識する分子を、場所を選ばず迅速簡便に高感度にて検出することを可能とする物質及び方法を提供することを目的とする。
　場所を選ばず迅速簡便に特定の分子を検出できる方法として、イムノクロマトグラフィーが知られている。しかしながら、一般的に糖鎖認識分子と糖鎖との結合性は弱く、またイムノクロマトグラフィーに用いられる膜担体に糖鎖を高密度で固定化することは困難であったため、イムノクロマトグラフィーにおいて、糖鎖認識分子を検出すための十分な感度は得ることが出来なかった。
　しかし、本発明者らが鋭意研究を重ねた結果、糖鎖を結合させたタンパク質を、糖鎖認識分子を検出するためのプローブとして用いれば、イムノクロマトグラフィーに用いられる膜担体に高密度に糖鎖を固定化できることが明らかになった。さらに、かかる糖鎖を結合させたタンパク質が固定化された膜担体を用いたイムノクロマトグラフィーは、従来の糖脂質を固定化したものよりも、糖鎖認識分子を高感度に検出できることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、以下を提供するものである。
＜１＞　糖鎖を認識する分子をイムノクロマトグラフィーにより検出するためのデバイスに用いられる膜担体であって、当該糖鎖が結合したタンパク質が検出ラインに固定化された膜担体。
＜２＞　前記糖鎖が結合したタンパク質が、還元的アミノ化反応により、前記糖鎖の還元末端と前記タンパク質のアミノ基とが結合してなる、＜１＞に記載の膜担体。
＜３＞　前記タンパク質がアルブミンである、＜１＞又は＜２＞に記載の膜担体。
＜４＞　糖鎖を認識する分子をイムノクロマトグラフィーにより検出する方法であって、
　被験試料を、糖鎖を認識する分子を認識しかつ標識されている分子に接触させた後、＜１＞～＜３＞のいずれか一に記載の膜担体において、当該被験試料を前記検出ラインに向けて展開させ、当該検出ラインにおいて前記標識物質を検出する方法。
＜５＞　糖鎖を認識する分子をイムノクロマトグラフィーにより検出するためのデバイスであって、＜１＞～＜３＞のいずれか一に記載の膜担体と、下記（ａ）～（ｃ）からなる群から選択される少なくとも１の構成要素とを備えるデバイス
（ａ）　サンプルパッド
（ｂ）　コンジュゲートパッド
（ｃ）　吸収パッド。
　本発明によれば、糖鎖を認識する分子を、場所を選ばず迅速簡便に高感度にて検出することが可能となる。
本発明の糖鎖を認識する分子をイムノクロマトグラフィーにより検出するためのデバイスの好適な一実施形態を示す概略平面図である。 図１に示すデバイスを図１のＩ－II線に沿って切断した場合の切断面を示す概略側断面図である。 アルブミンと、アルブミンに糖鎖（ＧＭ１）を結合させたもの（ＧＭ１結合アルブミン）とをＳＤＳ－ＰＡＧＥにて展開したゲルを、タンパク質染色試薬にて染色した結果を示す写真である。ＧＭ１結合アルブミンの５レーンは左から順に、１０００μｇ、５００μｇ、２５０μｇ、１２５μｇ及び６２．５μｇのＧＭ１と、６６μｇのアルブミンとを反応させたものを展開した結果を各々示す。 アルブミンとＧＭ１結合アルブミンとをＳＤＳ－ＰＡＧＥにて展開したゲルをＰＶＤＦ膜に転写し、該膜にＨＲＰ標識したコレラトキシンβサブユニット（ＨＲＰ－ＣＴＢ）を作用させ、４－クロロ－１－ナフトールを発色基質として用いて染色した結果を示す写真である。ＧＭ１結合アルブミンの５レーンは左から順に、１０００μｇ、５００μｇ、２５０μｇ、１２５μｇ及び６２．５μｇのＧＭ１と、６６μｇのアルブミンとを反応させたものを展開した結果を各々示す。 ＧＭ１結合アルブミンとアルブミンとを固定化した膜担体（ＨｉＦｌｏｗ　Ｐｌｕｓ　ＨＦＢ１８０ＵＢＣＡＳＴ、ＨｉＦｌｏｗ　Ｐｌｕｓ　ＨＦＢ０７５０２、ＨｉＦｌｏｗ　Ｐｌｕｓ　ＨＦＢ１２００２）に、ＨＲＰ－ＣＴＢを作用させ、４－クロロ－１－ナフトールを発色基質として用いて染色した結果を示す写真である。 ＧＭ１結合アルブミンとアルブミンとを固定化した膜担体に、ＨＲＰ－ＣＴＢを作用させ、４－クロロ－１－ナフトールを発色基質として用いて染色した結果を示す写真である。図中の数量（１００ｎｇ、１０ｎｇ、１ｎｇ）は、ＧＭ１結合アルブミン又はアルブミンの膜担体にスポットした量を示す。 ＧＭ１結合アルブミンとＧＭ１ガングリオシドとを固定化した膜担体に、ＨＲＰ－ＣＴＢを作用させ、４－クロロ－１－ナフトールを発色基質として用いて染色した結果を示す写真である。図中の数量（１００ｎｇ、１０ｎｇ）は、ＧＭ１結合アルブミン又はＧＭ１ガングリオシドの膜担体にスポットした量を示す。 ＧＭ１結合アルブミンとＧＭ１ガングリオシドとを固定化した膜担体に、ＨＲＰ－ＣＴＢを作用させ、４－クロロ－１－ナフトールを発色基質として用いて染色した結果を示す写真である。図中の濃度（１．０μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ、０．０１μｇ／ｍＬ）は、膜担体に作用させたＨＲＰ－ＣＴＢの濃度を示す。
　（イムノクロマトグラフィーのための膜担体）
　本発明は、糖鎖を認識する分子をイムノクロマトグラフィーにより検出するためのデバイスに用いられる膜担体であって、当該糖鎖が結合したタンパク質が検出ラインに固定化された膜担体を提供するものである。
　本発明において、「糖鎖」とは、単糖類（単糖及びその誘導体）が２つ以上、グリコシド結合により繋がりあった多糖のことであり、本発明にかかるイムノクロマトグラフィーの検出対象である糖鎖認識分子と特異的に結合することができる分子のことである。また、かかる糖鎖は、１種類の単糖類から構成されるもの（ホモ糖鎖）であってもよく、２種類以上の単糖類から構成されるもの（ヘテロ糖鎖）であってもよい。糖鎖を構成する単糖類の種類、個数については特に制限はなく、また単糖類間のグリコシド結合はα結合、β結合のいずれであってもよい。さらに、糖鎖は天然由来のものであってもよく、天然由来のものに人工的に官能基の付加や置換等の修飾を加えたものであってもよく、化学的に合成されたものであってもよい。
　本発明において、「糖鎖を認識する分子」としては特に制限はなく、前記糖鎖を認識する抗体、前記糖鎖を認識するタンパク質（レクチン）が挙げられる。
　本発明において、前記糖鎖が結合される「タンパク質」としては、糖鎖を多価に結合し得る限り、該タンパク質を構成するアミノ酸の種類、個数については特に制限はない。また、「タンパク質」は、植物、動物、微生物（菌やウィルス等）等の天然物から、分離・抽出・精製して得られるものであってもよく、また無細胞タンパク質合成系（例えば、網状赤血球抽出液、小麦胚芽抽出液）、大腸菌、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等を用い、遺伝学的手法により合成されたものであってもよく、さらには、自動合成装置等を用いて化学的に合成されたものであってもよい。本発明にかかる「タンパク質」としては、人為的に糖鎖修飾を施さなければ糖鎖を有していないため、本発明にかかる糖鎖をより多く結合させ易いという観点から、天然物由来のものであればアルブミン、リボヌクレアーゼＡが好ましく、また同観点から、大腸菌を用いて遺伝学的手法により合成されたタンパク質、化学的に合成されたタンパク質が好ましい。
　本発明において、糖鎖が結合したタンパク質の調製方法としては特に制限はなく、例えば、前記糖鎖の還元末端と前記タンパク質のアミノ基とを結合させる方法（還元的アミノ化反応）、前記糖鎖の還元末端をブロモアセチル化し、前記タンパク質のシステイン中のチオール基と共有結合させる方法、前記糖鎖の還元末端にアミノ基を導入し、前記タンパク質のカルボキシル基と共有結合させる方法、前記糖鎖を化学的に結合させたアミノ酸を重合反応により連結し、前記タンパク質を合成する方法が挙げられるが、糖鎖の還元末端に新たな官能基を導入する必要がなく、反応が簡便であるという観点から、還元的アミノ化反応が好ましい。
　また、前記タンパク質１分子あたりの前記糖鎖の平均結合本数は、前記糖鎖や前記タンパク質の種類、前述の糖鎖が結合したタンパク質の調製方法等によるが、通常１～４０本であり、当該タンパク質における糖鎖の高密度化及び糖鎖が結合しているタンパク質の作製のし易さの観点から、好ましくは５～２５本である。
　本発明において、前記糖鎖が結合したタンパク質が固定化される「膜担体」としては、糖鎖が結合したタンパク質を固定化することができ、かつイムノクロマトグラフィーに供される被験試料を毛細管現象により展開できる材質からなる膜であればよい。かかる材質としては、例えば、ニトロセルロース等のセルロース類、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエチレン、ポリプロピレン、ナイロン類、ガラスファイバーが挙げられる。また、本発明の膜担体の孔径は、特に制限されることなく、被験試料の展開速度等を考慮して適宜調節すればよく、例えば、０．１～１０μｍである。
　かかる膜担体における「検出ライン」とは、当該膜担体において展開された被験試料中の糖鎖認識分子を捕捉し、検出するための部位である。従って、「検出ライン」は、膜担体において下流側に配置されている必要がある。なお、本発明において、上流側及び下流側とは、被験試料が膜担体を展開していく流れの上流側（後述の図１及び２においては、左側）及び下流側（後述の図１及び２においては、右側）を各々意味する。
　また、「検出ライン」には糖鎖認識分子を捕捉するための分子である、糖鎖が結合したタンパク質が固定化されている必要がある。固定化の方法としては特に制限はなく、例えば、物理吸着、静電的相互作用、疎水的相互作用又は架橋剤を利用する方法が挙げられる。また、糖鎖が結合したタンパク質の固定化量は、膜担体の材質、糖鎖認識分子との結合性、後述の糖鎖を認識する分子を認識する分子の標識の種類等に合わせて適宜調整すればよく、例えば、１ｎｇ～１μｇである。
　（糖鎖を認識する分子をイムノクロマトグラフィーにより検出する方法）
　本発明は、糖鎖を認識する分子をイムノクロマトグラフィーにより検出する方法であって、被験試料を、糖鎖を認識する分子を認識しかつ標識されている分子に接触させた後、本発明の膜担体において、当該被験試料を前記検出ラインに向けて展開させ、当該検出ラインにおいて前記標識物質を検出する方法を提供するものである。
　本発明において「被験試料」としては特に制限はなく、例えば、菌体、土壌、ヒト等の動物から単離される、血液、血清、血漿、髄液、唾液、喀痰、涙液、眼脂、口腔や鼻腔の粘膜、尿、糞便、皮膚、各種臓器、筋肉、骨及び神経、並びにこれらからの抽出液が挙げられる。
　本発明において、「糖鎖を認識する分子を認識する分子」としては特に制限はなく、糖鎖認識分子を認識する抗体であってもよく、また糖鎖認識分子が抗体である場合には、プロテインＡ、プロテインＧであってもよい。さらには、糖鎖認識分子によって認識される糖鎖であってもよい。また、かかる「糖鎖を認識する分子を認識する分子」に付加される標識物質としては、例えば、呈色標識物質、酵素標識物質が挙げられる。呈色標識物質としては、金コロイド、白金コロイド等の金属コロイドの他、赤色及び青色等のそれぞれの顔料で着色されたポリスチレンラテックス等の合成ラテックス及び天然ゴムラテックス等のラテックスが挙げられる。酵素標識物質としては、例えば、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、βガラクトシダ―ゼ、ルシフェラーゼ、アルカリフォスファターゼが挙げられる。
　被験試料と糖鎖を認識する分子を認識しかつ標識されている分子との「接触」については、膜担体に導入された被験試料が前記検出ラインに達するまでに行われていればよく、例えば、本発明の膜担体又は後述の本発明のデバイスに被験試料を導入する前に、当該試料に糖鎖を認識する分子を認識しかつ標識されている分子を添加することで接触させてもよく、被験試料を後述のコンジュゲートパッド中を通過させることによって接触させてもよい。
　本発明において、被験試料と糖鎖を認識する分子を認識しかつ標識されている分子とを毛細管現象により効率良く展開させるために、展開液を用いてもよい。展開液としては、例えば、タンパク質、多糖類、界面活性剤、有機溶媒及びポリマー等の中から少なくとも1種を含む緩衝液が挙げられる。展開液は、被験試料と混合した上で膜担体に導入してもよく、また被験試料等を膜担体に導入した後に、当該膜担体の上流側から導入してもよい。
　そして、被験試料中に糖鎖認識分子が含まれていれば、前記接触により形成される当該糖鎖認識分子と当該分子を認識しかつ標識されている分子との複合体が、前記検出ラインの糖鎖に捕捉されることにより、当該標識物質が当該検出ラインに集積することになる。
　従って、本発明によれば、検出ラインにおける標識物質を検出することにより、試験試料中の糖鎖認識分子の有無を判断することができる。「標識物質の検出」は、標識物質が前記呈色標識物質であれば、当該検出ラインにおける当該標識物質の集積により生じる着色を目視にて確認することにより行うことができる。また、酵素標識物質であれば、当該酵素の発色基質を検出ラインに添加することにより生じる発色を目視にて確認することにより行うことができる。かかる発色基質としては、酵素標識物質としてＨＲＰを用いる場合には、例えば、４－クロロ－１－ナフトール、ＡＢＴＳ、Ｏ－フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）が挙げられる。
　（イムノクロマトグラフィーのためのデバイス）
　本発明は、糖鎖を認識する分子をイムノクロマトグラフィーにより検出するためのデバイスであって、前述の本発明の膜担体と、下記（ａ）～（ｃ）からなる群から選択される少なくとも１の構成要素とを備えるデバイス
（ａ）　サンプルパッド
（ｂ）　コンジュゲートパッド
（ｃ）　吸収パッド
を提供するものである。このような本発明のデバイスの好適な一例を図１及び２に示す。図１は、かかるデバイスの概略平面図であり、図２は、図１に示すデバイスを図１のＩ－II線に沿って切断した場合の切断面を示す概略側断面図である。以下、これら図面を参照しながら本発明のデバイスについて説明する。
　本発明のデバイスは、図２に示す通り、本発明の膜担体１と、サンプルパッド４、コンジュゲートパッド５及び吸収パッド６からなる群から選択される少なくとも１の構成要素とを備えるデバイスである。
　膜担体１については前述の通りであるが、図１及び２に示す通り、前述の検出ライン２の他、コントロールライン３を備えていてもよい。
　コントロールライン３は、前述の糖鎖を認識する分子を認識しかつ標識されている分子を捕捉するための部分であるため、前記標識物質が検出ライン２では検出されず、コントロールライン３のみにて検出された場合には、被験試料中に糖鎖認識分子は存在していないと判定することができる。また、コントロールライン３には、前述の糖鎖を認識する分子を認識しかつ標識されている分子を捕捉するために、当該分子と特異的に結合する分子（例えば、抗体、レクチン、アプタマー）が固定化される。
　サンプルパッド４は、本発明のデバイスに導入された被験試料や展開液等を保持、通過させるための部分である。従って、本発明のデバイスにおいて、サンプルパッド４は、直接又は間接的に膜担体１に接し、かつ膜担体１の上流側に配置されている必要がある。
　コンジュゲートパッド５は、前述の糖鎖を認識する分子を認識しかつ標識されている分子を担持しており、当該分子と被験試料とを接触させるための部分である。従って、本発明のデバイスにおいて、コンジュゲートパッド５は、直接又は間接的にサンプルパッド４及び膜担体１に接し、かつサンプルパッド４の下流側及び膜担体１の上流側に配置されている必要がある。
　吸収パッド６は、膜担体を通過してきた余剰の被験試料や展開液等を吸収することにより、膜担体における被験試料の展開を促進しつつ、逆流を抑制するための部分である。従って、本発明のデバイスにおいて、吸収パッド６は、直接又は間接的に膜担体１に接し、かつ膜担体１の下流側に配置されている必要がある。
　サンプルパッド４、コンジュゲートパッド５及び吸収パッド６の材質としては、特に限定されず、ニトロセルロース等のセルロース類、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエチレン、ポリプロピレン、ナイロン類、ガラスファイバーが挙げられる。
　本発明のデバイスにおいては、図１及び２に示す通り、前述の膜担体１、サンプルパッド４、コンジュゲートパッド５又は吸収パッド６を保持するために、保持板１２を備えてもよい。保持板１２の材質は、成形の容易さ、コスト、軽量性の点でプラスチックであることが好ましい。プラスチックの材質としては、種々のプラスチック材料を選択することが可能であり、使用する用途、処理、使用する溶媒、生理活性物質、検出方法の特性に合わせて、成形性、耐熱性、耐薬品性、吸着性等を考慮し適宜に選択される。例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリメチルメタクリレート、ポリビニルアセテート、ビニル－アセテート共重合体、スチレン－メチルメタアクリレート共重合体、アクリルニトリル－スチレン共重合体、アクリルニトリル－ブタジエン－スチレン共重合体、ナイロン、ポリメチルペンテン、シリコン樹脂、アミノ樹脂、ポリスルフォン、ポリエーテルスルフォン、ポリエーテルイミド、フッ素樹脂、ポリイミド等が挙げられる。また、これらのプラスチック材料に、顔料、染料、酸化防止剤、難燃剤等の添加物を適宜混合してもよい。
　さらに、本発明のデバイスにおいては、前述の膜担体１、パッド及び保持板１２を固定、保存するためのケージング（上部ケージング１０及び下部ケージング１１）を備えていてもよい。
　上部ケーシング１０及び下部ケーシング１１の母材には、成形の容易さ、コスト、軽量性の点でプラスチックであることが好ましい。プラスチックの材質としては、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリメチルメタクリレート、ポリビニルアセテート、ビニル－アセテート共重合体、スチレン－メチルメタアクリレート共重合体、アクリルニトリル－スチレン共重合体、アクリルニトリル－ブタジエン－スチレン共重合体、ナイロン、ポリメチルペンテン、シリコン樹脂、アミノ樹脂、ポリスルフォン、ポリエーテルスルフォン、ポリエーテルイミド、フッ素樹脂、ポリイミド等が挙げられる。また、これらのプラスチック材料に、顔料、染料、酸化防止剤、難燃剤等の添加物を適宜混合してもよい。
　また、上部ケーシング１０、下部ケーシング１１には、サンプルパッド４、コンジュゲートパッド５、膜担体１、吸収パッド６、保持板１２等の内容物を固定するための構造物を適宜形成することができる。
　また、本発明のデバイスにおいては、図１及び２に示す通り、上部ケーシング１０には、導入口７、判定窓８又は空気穴９が形成されていてもよい。
　導入口７は、イムノクロマトグラフィーに供するための被験試料が導入されるための部分である。その形状について特に制限はないが、図１及び２に示すような、突起１３を導入口７内部に有していてもよい。この突起により、被験試料を収納している容器（検体採取用容器）の封（シール）を破断することにより、検体が外部に漏れることなく、検出ライン２側に迅速に展開することが可能となる（検体採取用容器、封及び突起については、特開２０１０－３８７９７号公報　参照）。
　判定窓８は、膜担体１における検出ライン２及び後述のコントロールライン３を視認し、被験試料中の糖鎖認識分子の有無の判定等を行うための部分である。判定窓８は、例えば、上部ケージングがその厚さ方向に貫通されることによって形成されるものであってもよく、さらに、この貫通孔に透明のプラスチック板やフィルムが付加されていてもよい。
　空気穴９は、前記ケージング内の空気を排出するための部分であり、これにより、後述の吸収パッド６による被験試料の吸収効率を向上させ、ひいては膜担体における被験試料の迅速な展開を可能とする。空気穴９は、上部ケージングがその厚さ方向に貫通されることによって形成されるものであればよく、その形状、個数については特に制限はなく、例えば、図１及び２に示すような、３個の長方形状の貫通孔が挙げられる。
　本発明のデバイスの大きさについて、特に制限はないが、例えば、図１及び２において示されるデバイス（ケージング）の大きさとしては、長さ５～１１ｃｍ、幅１～３ｃｍ、高さ０．２～１．５ｃｍが挙げられる。
　以上、本発明のデバイスの好適な実施形態について説明したが、本発明のデバイスは上記実施形態に限定されるものではない。当業者であれば、上記を参酌しながら、デバイスの構成、材質、構造等について、適宜応用、変形、追加等を加えることができる。
　以下、実施例及び比較例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
　＜糖鎖が結合したタンパク質の調製＞
　先ず、糖脂質（ガングリオシドＧＭ１）の糖鎖（ＧＭ１）の還元末端と、ヒト由来アルブミンのアミノ基とを結合させるべく、還元アミノ化反応を行った。この還元アミノ化反応においては、６６μｇのアルブミンに対し、反応させる糖鎖量は１０００μｇ、５００μｇ、２５０μｇ、１２５μｇ又は６２．５μｇとした。
　次に、得られた生成物又はアルブミンのみを、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにて展開し、タンパク質染色試薬（ジェルコード（登録商標）ブルー染色試薬、サーモサイエンティフィック社製）にて染色した。得られた結果を図３に示す。
　また、前記生成物又はアルブミンのみを展開したゲルをＰＶＤＦ膜に転写した。次いで、ＧＭ１認識分子として知られているコレラトキシンβサブユニットをＨＲＰにて標識したもの（以下、「ＨＲＰ－ＣＴＢ」とも称する。ＨＲＰ－ＣＴＢの濃度：０．２μｇ／ｍＬ）を、当該ＰＶＤＦ膜に作用させた。そして、ＨＲＰの発色基質である４－クロロ－１－ナフトールにて当該ゲルを染色した。得られた結果を図４に示す。
　図４に示した結果から明らかなように、アルブミンのみを電気泳動したレーンにおいてＨＲＰ－ＣＴＢによる発色は認められなかった。一方、作製した５種のＧＭ１結合アルブミンを泳動したレーンにおいては、約８６、８４、７９、７６及び７３ｋＤａのバンドが、ＨＲＰ－ＣＴＢによる発色により、特異的に検出された。従って、還元的アミノ化反応により、アルブミンにＧＭ１が結合した糖タンパク質が作製できることが明らかになった。
　また、図３に示す通り、タンパク質を一様に染色するジェルコードブルー染色試薬を用いて染色した結果、アルブミンを電気泳動したレーンにおいて、アルブミンの分子量に一致する約６６ｋＤａのバンドが確認された。さらに、図４に示す通り、作製したＧＭ１結合アルブミンの分子量は、約８６、８４、７９、７６又は７３ｋＤａであることから、アルブミンに結合した糖鎖による分子量の増加分は約２０、１８、１３、１０又は７ｋＤａであることが分かった。また、ＧＭ１糖鎖一本当たりの分子量は約１ｋＤａであるので、アルブミン１分子に結合している糖鎖の平均本数は、約２０、１８、１３、１０又は７本であることが明らかになった。さらに、反応させた糖鎖の量を考慮するに、アルブミン１分子に結合している糖鎖の平均本数は、還元アミノ化反応における糖鎖の仕込み量に応じて増加させることができることも明らかになった。さらにまた、図４に示す通り、１分子あたり平均２０本のＧＭ１が結合しているアルブミンの方が、平均７本のＧＭ１が結合しているアルブミンよりも多く、当該糖鎖（ＧＭ１）を認識する分子であるＣＴＢと結合していることが明らかになった。
　＜糖鎖が結合したタンパク質が固定化された膜担体の調製＞
　前記の通り調製したＧＭ１結合アルブミン（アルブミン１分子に結合している糖鎖の平均本数：２０）又はアルブミンを１μｇずつ、三種類のイムノクロマトメンブレンにスポットした。用いたメンブレンは、ニトロセルロースからなるミリポア社製のメンブレン　ＨｉＦｌｏｗ　Ｐｌｕｓ　ＨＦＢ１８０ＵＢＣＡＳＴ、ＨｉＦｌｏｗ　Ｐｌｕｓ　ＨＦＢ０７５０２及びＨｉＦｌｏｗ　Ｐｌｕｓ　ＨＦＢ１２００２である。そして、ＧＭ１結合アルブミン又はアルブミンをスポットしたメンブレンを風乾させた後、ＨＲＰ－ＣＴＢ（ＨＲＰ－ＣＴＢの濃度：０．２μｇ／ｍＬ）及び４－クロロ－１－ナフトールを用いて、発色させた。得られた結果を図５に示す。
　図５に示した結果から明らかなように、ＧＭ１結合アルブミンをスポットした箇所において発色が認められた。一方、アルブミンのみをスポットした箇所では発色が認められなかったことから、ＧＭ１結合アルブミンを試した３種いずれのイムノクロマトメンブレンにおいても固定化できることが明らかになった。
　また、メンブレンにスポットする量を１μｇから、１００ｎｇ、１０ｎｇ又は１ｎｇに変えて、前記同様に、ＧＭ１結合アルブミンをイムノクロマトメンブレン（ＨｉＦｌｏｗ　Ｐｌｕｓ　ＨＦＢ１８０ＵＢＣＡＳＴ）に固定化し、そして、ＨＲＰ－ＣＴＢ（ＨＲＰ－ＣＴＢの濃度：０．２μｇ／ｍＬ）及び４－クロロ－１－ナフトールにより検出した。得られた結果を図６に示す。
　図６に示す通り、１０ｎｇ以上のＧＭ１結合アルブミンを固定化したイムノクロマトメンブレンによって、ＧＭ１に結合する分子であるコレラトキシンβサブユニット（以下「ＣＴＢ」とも称する）を検出できることが明らかになった。
　＜糖鎖が結合したタンパク質が固定化された膜担体についての検証＞
　糖脂質認識分子を検出する方法として、ＥＬＩＳＡ法がある。ＥＬＩＳＡ法において、糖脂質認識分子を検出する場合には、通常１ウェルあたり１００ｎｇのＧＭ１ガングリオシドが固定化されたマイクロプレートが用いられる（特許文献１　参照）。そこで、糖脂質認識分子を検出する点において、かかるＥＬＩＳＡ法と、本発明の膜担体を用いたイムノクロマトグラフィーとを比較した。
　すなわち、先ず、１００ｎｇ及び１０ｎｇのＧＭ１結合アルブミン（アルブミン１分子に結合している糖鎖の平均本数：２０）をメンブレン（ＨｉＦｌｏｗ　Ｐｌｕｓ　ＨＦＢ１８０ＵＢＣＡＳＴ）にスポットし、固定化することによる調製した本発明の膜担体（実施例１及び２）を用意した。また、ＧＭ１結合アルブミンの代わりに、１００ｎｇ及び１０ｎｇのＧＭ１ガングリオシドを固定化した膜担体（比較例１及び２）を用意した。なお、ＧＭ１結合アルブミン１００ｎｇ及び１０ｎｇは、ＧＭ１ガングリオシド５０ｎｇ及び５ｎｇ相当のＧＭ１を含んでいることが推定される。そして、これら膜担体にＨＲＰ－ＣＴＢ（ＨＲＰ－ＣＴＢの濃度：０．２μｇ／ｍＬ）を作用させた後、４－クロロ－１－ナフトールを発色基質として用いて染色した。得られた結果を図７に示す。
　図７に示した結果から明らかな通り、ＧＭ１ガングリオシド５ｎｇ相当に相当するＧＭ１結合アルブミンが固定化されている本発明の膜担体（実施例２）における染色性は、ＧＭ１ガングリオシド１００ｎｇが固定化されている膜担体（比較例１）におけるそれと同等であった。また、ＧＭ１ガングリオシド５０ｎｇ相当に相当するＧＭ１結合アルブミンが固定化されている本発明の膜担体（実施例１）における染色性は、比較例１におけるそれよりも顕著に優れていた。従って、ＣＴＢに対する結合能は、ＧＭ１ガングリオシドよりもＧＭ１結合アルブミンの方が顕著に強く、また、ＧＭ１ガングリオシドを用いたＥＬＩＳＡ法よりも本発明の膜担体を用いたイムノクロマトグラフィーの方が、糖脂質認識分子（ＣＴＢ）を検出する点において顕著に優れていることが明らかになった。
　次に、ＧＭ１結合アルブミンが糖脂質認識分子を感度良く検出できるかどうかを検証した。すなわち、実施例１及び２同様に０．７μｇのＧＭ１結合アルブミンを固定化させた本発明の膜担体（実施例３）と、比較例１及び２同様に１μｇのＧＭ１ガングリオシドを固定化させた膜担体（比較例３）とを調製した。そして、これら膜担体にＨＲＰ－ＣＴＢを作用させた後、４－クロロ－１－ナフトールを発色基質として用いて染色した。なお、作用させたＨＲＰ－ＣＴＢ溶液におけるＨＲＰ－ＣＴＢの濃度は、１．０、０．１又は０．０１μｇ／ｍＬである。また、０．７μｇのＧＭ１結合アルブミンは、ＧＭ１ガングリオシド０．３５μｇ相当のＧＭ１を含んでいることが推定される。得られた結果を図８に示す。
　図８に示した結果から明らかなように、１μｇのＧＭ１ガングリオシドを固定化した膜担体（比較例３）においては、ＨＲＰ－ＣＴＢの濃度が０．１～１．０μｇ／ｍＬ程度でないと検出できないのに対し、ＧＭ１結合アルブミンは、糖鎖量がＧＭ１ガングリオシドの約３５％しかないにも関わらず、ＨＲＰ－ＣＴＢの濃度が０．０１μｇ／ｍＬ程度でも検出できることが明らかになった。
　従って、糖鎖を結合させたタンパク質を膜担体に固定化させることで、当該膜担体に高密度に糖鎖を固定化できることが明らかになった。そして、かかる膜担体を用いることにより、従来の方法（例えば、ＥＬＩＳＡ法）よりも、糖鎖認識分子を高感度に検出できることが明らかになった。
　以上説明したように、本発明によれば、糖鎖を認識する分子を、場所を選ばず迅速簡便に高感度にて検出することが可能となる。
　従って、本発明の膜担体等を用いたイムノクロマトグラフィーは、糖鎖を認識する分子（レクチン、糖鎖を認識する抗体）の検出を必要とする研究開発や、糖鎖を認識する自己抗体が関与する疾患の診断において有用である。
　１…膜担体、２…検出ライン、３…コントロールライン、４…サンプルパッド、５…コンジュゲートパッド、６…吸収パッド、７…導入口、８…判定窓、９…空気穴、１０…上部ケージング、１１…下部ケージング、１２…保持板、１３…突起

Claims (5)

  1. 　糖鎖を認識する分子をイムノクロマトグラフィーにより検出するためのデバイスに用いられる膜担体であって、当該糖鎖が結合したタンパク質が検出ラインに固定化された膜担体。
  2. 　前記糖鎖が結合したタンパク質が、還元的アミノ化反応により、前記糖鎖の還元末端と前記タンパク質のアミノ基とが結合してなる、請求項１に記載の膜担体。
  3. 　前記タンパク質がアルブミンである、請求項１又は２に記載の膜担体。
  4. 　糖鎖を認識する分子をイムノクロマトグラフィーにより検出する方法であって、
    　被験試料を、糖鎖を認識する分子を認識しかつ標識されている分子に接触させた後、請求項１～３のいずれか一項に記載の膜担体において、当該被験試料を前記検出ラインに向けて展開させ、当該検出ラインにおいて前記標識物質を検出する方法。
  5. 　糖鎖を認識する分子をイムノクロマトグラフィーにより検出するためのデバイスであって、請求項１～３のいずれか一項に記載の膜担体と、下記（ａ）～（ｃ）からなる群から選択される少なくとも１の構成要素とを備えるデバイス
    （ａ）　サンプルパッド
    （ｂ）　コンジュゲートパッド
    （ｃ）　吸収パッド。
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