JPH03501777A - ハプテン誘導捕獲膜及び該膜を使用する診断アツセイ法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ハプテン誘導捕獲膜及び該層を使用する診断アッセイ法発明の背景 本明細曹は１９８８年１０月１７８に提出された係属中の米国特許第２５８８９ ４号明細書の一部継続出願である。

発明の分野 本発明は特異的に結合する錯体を浴液から除去するために使用される診断試薬、 すなわち捕獲膜、および該試薬を用いるアッセイ法に関する。特異的に結合する 錯体とは抗原／抗体錯体、ＤＮＡ　、抗−ＤＮＡ　（ＤＮＡに対する抗体）又は −重鎖ＤＮＡ結合蛋白質（例えば大腸菌からのＳＳＢ　）　、ＤＮＡ　、　ＤＮ Ａ　ハ（ブリッド、ＲＮＡ、ＲＮＡハイブリッドおよび類似の特異的に結合する 錯体でおる。

関連技術 ￥ｆ！Ａ的結合錯結合錯体する診断アッセイ法および試薬の分野において広範曲 にわたる教示がろる。抗原／抗体反応は広く抗原および抗体を決定するために使 用される。これらの錯体のｓｇ員′ｆｒ：酵素又は蛍光呆料のような検出可能な 標識で標威することは十分に公知である。爵板から錯体ｔ−除去する手段として 抗原又は抗体と固体支持体とを結合させることも公知でるる。ビオチンのような バッテンとストレプトアビシンのような抗ハプテンの診断アッセイへの使用はア ナリヱティカ／ｌ／−バイオケミストリー（ＡｎａｌｙＬｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈ ｅｍｉｓｌ；ｒｙλ渠１７１巻、第１〜６２貞（１９８８年）　ｙＵ掲載されて いるレビュー中で広範囲にわたって論議されている。

固体支持体に付層したビオチンは米国特許第４２８２２８７号、同第４４７８９ １４号および同第４６５６２０２号明細書中に記載されている。まさにこれらの 特許は、ビオチンをまず固体表面に付着させ、引き続きアビジンおよびエクステ ンダーの連続層を適用して、表面特性の調節された改変をもたらす＠層技術を記 載している。

ヨーロッパ特許第８７５０７８５０−５号明細薔はグローブＤＮＡのサンプルに 結合するマクロ分子にＩ′ｔＭしたビオチンを包含する慣用植物ウィルス診祈法 に向けられている。このグローブを含有するｍｌｌ動物、植物組城から誘導され たＤＮＡのテストサンプルをその上に固定した固体−＝Ｉト’）ツクスに適用す る。ターデッド配列の存在は酵素結合アビジンを有するマトリックスを況浄し、 引き絖さマトリックスと関連付けらルた酵素活性にＩＡシて効力快定することに より決定される。

米国特許第４４６７０！＋１号明細省は抗体へのレポーター酵素を結合するため の有オリで安定な結合基としてビオチノーアビゾン系を用いるｊ＃素−免疫アッ セイを記載している。

米国特許第４２２８２３７号明細書はリガンドの検出２よび測定法にビオチン− アビジン系の使用を記載している。抗体に付看狂でろるリガンドに関する仇不を 有する表面をりがンドのサンプルと反応させ、引き続きビオチンと結合している 第２のリガンド′＃異的抗体と反応させる０次いで、この錯体をアビシン結合酵 素と反応させ、生じ之ものｔ−酵素活性の測定によシ決定する。

米国特許第４６５６０２５号明細書は繍瘍グロデリンに関するスクリーニングア ッセイを記載している。

エリザ（ＥＬＩＳＡ）　ｆレート上に結合した補優グロデリンービオチンをアビ シン結合酵素と反応させ、プレートに結合した１瘍グロデリンの量をこれに好適 な呈色基質の適用によシ決定する。

米国特許第４５３５０５７号明細書は抗体−ウィルス錯体を介して固体支持体に 結合したビオチンを有する免疫アッセイを記載している。次いで、このビオチン −抗体ウィルス錯体をレボーメー基又は標識ＴｌｃＭ合したアビジンと反応させ る、こうして表面と結合した標識の存在がサンプル中のウィルスの存在を指示す る。

米国待ｉＩ！ｆ第４７２７０１９号及び同第４６３２９０１号明細書はアビシン を固体支持体に結合し、サンプル中に存在するリガンドをこの支愕体に結合する 免疫アッセイ法を記載する。木国狩許第４２９８６８５号明細簀は同様に固体叉 待犀上に固定したアビジンを包含する診断試薬を記載する。米国待杵第４５８２ ８１０号＃４−沓はアビシンを共有的に結合する粒子（Ｄｉｄ濁液ｔビオチン− 抗体一体と反応させ、羊毛状を示す溶液をも次らす錯体を形成する測定法を記載 する。

米国特許第４５５００７５号明細書は固体支持体を全く有さないビオチン−アビ ジン系をベースとするリガンド測定法を記載している。

米国特許第４４８６５３０号明蛾書は抗原物質及びこの抗原に結合した第１及び 第２抗体の三成分錯体からなる免疫アッセイ法を記載しており、ここではこの錯 体は襖を介して濾過することによシ溶液から除去される。

クリニカル・ケミストリー（Ｃ１ｉｎｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔ、ｒｙ）、第３ ４％、＋４８号、第１５８５頁（１９８８年）は尿中の黄体形成ホルモン（ＬＨ ）のためのモノクローナル抗体をベースとし之非競合アビジンービオチンアッセ イを記載している。

米国譜杵第４７７８７５１号明細曹は抗原測定法を配啄して２す、この方１去は 抗原（Ａｇ１）、抗体（Ａｇｉ）またはハプテン（Ｈ，ｌがそれぞれ時異的な抗 体（Ａｂ入抗Ｉ１．　（Ａｇ）または抗・・ブテン（＊−Ｈ）を介して、液相に 可溶性でめり、かつリガンド（Ｘ）を有し、かつ１つより多い’Ｆ１４的恍体（ Ａｂ）、抗原（Ａｇ）または抗ノ・ブテン（［４）に化学的に結合可能でめるノ マトリックスに結合している可溶性錯体を連相反応で形成し：このｉ’ｒｉｇａ ａ体のリガンド（Ｘ）　ｖこ抗−リガント＜Ｙ）を介して結合しｆｃ固体支持体 からなる不溶性化錯体を形成し、その際この不Ｉ＠注化一体は仇−抗原（抗−Ａ ｇｌ）する；この不溶注始体を洗浄し：この洗浄不溶性化錯渾を標ｉ！１（Ｚ） の存在に関して観察し、ここで標識（Ｚ）の存在はサンプル中での抗原（Ａｇ　 １　）　、抗体（＊ｂ１）又はハゲテン（Ｈ）のレベルを指示することよｐなる 。

ヨーロッパ特許第８６１１１３７９．３号明細書は蛍光又は色のような検出可能 な物理的特性を有する化学基からなる襟鷹試渠の使用を包含する多１免疫アッセ イテスト装置を記載している。

ヨーロッパ特許第８８５０８１６４．８号は固体支持体が結合している一重Ａ　 ＤＮＡ結合蛋白質への一重鎖ＤＮＡの結合をベースとする一重鎖ＤＮＡの測定法 を記載している。

モレキュラー・イムノロイ−（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）第 ３４巻、ｍ２２７〜２３０ｓ（’ｌ　９８９年）ｌｄポリスチレン上にａＮされ たビオチニル化千ヤリャー蛋白質へのストレプトアビジンによる結合を介するビ オチ二ｙ化ＣＡｂｓ　（Ｄ　７定ｔ＆言するＥＬＩＳＡ　（エリザ）システムを 記載している。本発明は溶液から特異的（Ｃ結合する鰯体で猷去するための技術 を提供しており、これはこの発明の試案が膜に直接又ｄ＋ｓｌ妥的に結合し淀ハ ！テン、有利にビオチンを有する多孔性膜であるということにおいて従来の技術 とは異なっている。

発１の概要 本発明は漠に直接又は間装的に結合した）〜ブテン、有利にビオチンを有する多 孔性フィルター膜からなる捕獲遍を包含し、この際特異的に結合する一体の結合 偽成員に結合した抗ハプテン、有利にアビジン又はストレプトアビジンを有する 、特異的結合錯体は襖を介して溶液を流す時ハプテンによシ尋液から除去される 。

発明の詳細な説明 前記のように本発明はハシテンを結合する多孔性膜又はフィルターからなる；こ の膜又はフィルターは特異的結合錯体の結合構成員に結合した抗ノ・ブテンを有 する特異的結合錯体を含有していてよい溶液を濾過することができる。

膜又はフィルターの材料は蛋白質又はその他のマクロ分子が付着されうる材料か ら選択する。多くの種類の材料を使用することができる。この分野における専門 家の人々はナイロン、＋６−酸セルロース、ポリオレフィン、ポリアクリルアミ ド、ニトロセルロース又は他の多孔性材料を本発明に使用することができるとい うことを１臓している。蛋白質又は他のマクロ分子を付着する他の合成又は天然 に生じ友材Ｎ”を使用するＯともできる。有利な膜はニトロセルロ−スから製造 さ几る。

ハシテンはマクロ分子に結合しない場合は抗体形成金ひきおこさない物質でハシ 、これは″＃異的結合物質を提供することができる特異的有機材料として本発明 中に適用することができる。ハプテンに対する抗体は抗体応答を惹起するための 蛋白質にハプテンを結合することによって形成されうる。′＃異的結合物質とは 他の物質を除外してハプテンへの特異的結合栽和注を有する任意の物質又は物質 群である。適用されるハプテンは蛋白質又は他のマクロ分子に直接又は伸長結合 基を介して結合することができなけ几ばならない。本発明に従って使用ｏＪ能な ハプテンの例はステロイド、例エハエスッロン、エストラジオール、テストステ ロン、プレグナンジオールおよびプロプステロン：ビタミン、例えばＢ１２、ビ オチンおよび葉ａ２ニトリヨートチｏ二ン、チロキシン、ヒスタミン、セロトニ ン、ジゴキシン、プロスタグランシン、アドレナリン、ノルアドレナリン、モル フイン、植物ホルモン２よび抗生物質、り１えばペニシリンを損金するゆ ハゲテンが天然に生じるレセプターを有する物質である場合、このレセプターが ハシテンにとって特異的な形で単離されうるという条件でこのレセプターを抗ハ ゲテンとして使用することができる。天然に生じるレセプターを有するハプテン の例としてはチロキシン、多くのステロイド、ポリペプチド、例えばインシュリ ン、アンジオテンシン、ビオチンおよびその他多く０もＯが包含される。ハシテ ンＯこのクラスのレセプターは通常蛋白質又は核酸である。

伸長粘合基は、ハシテンがよりよく抗−ノ・グランに接近するように、ハプテン を蛋白質又はマクロ分子に結合する基でおる。本発明に２いて有用な伸長結合基 はサクシニル化ポリリジン、デキストラン、？リエチレングリコール、および有 利にポリアミドエーテル伸長基を包含する。これらの伸長結合基は種々の長さお よび結合特性の伸長結合基を得るために別々にまたは組み合わせて使用される。

伸長結合基は血清サンプル、特に脂血症血清サンプルと使用するために有利であ る。

明らかに、血清サンプル中には妨害物質があシ、この物質による妨害は伸長結合 基によシ見服される。伸長結合基が必要でない場合、ビオチンのようなノーｆテ ンは伸長結合基なしに繰上の官能基に結合されるか、又は膜上にあってよい蛋白 質上の官能基に結合される。

伸長結合基は蛋白質又はマクロ分子に結合することができなければならない。有 利に一方の末端に結合したハプテンを有する伸長結合基はアミド結合で蛋白質又 はマクロ分子に結合しているニアミド結合のアミンは蛋白質から生じ、アミド結 合のカルボキシルは伸長基のカルボキシ末端から生じる。蛋白質上の遊離カルボ キシル基またはヒドロキシル基を同様に使用することもできる。

本発明の蛋白質およびマクロ分子は牛血清アルブミン（ＢＳＡ）　、十ガンマー グロデリノおよびフイプリノーデン′ｌｋ包含するが、これらに限定されない。

フィルターを介して通過させる時溶液から除去される、特異的結合によシ生成す る錯不は２つの結合構成＾と１つの抗原からなり、ここで１つの結合構成員は抗 −・ブテンに結合してンジ、もう１つの結合構成員は標識基に結合している。

本発明の結合構成員に結合した抗ハシテンは前記ハプテンにレセプターとして慟 〈前記分子からなる。抗体は有利に酵素又は蛍光栄科で標識された有利な結合構 成員であシ、かつ同様に有利にアビジン又はスト１７ゾトアビジンのような抗ハ プテンに、またはハシテンへの抗体に結合している。

本発明のこの実施態様上次のように示すことができる： 捕獲膜　錯体 換−ハゲテン　・　抗ハシテン−ＡｂＡｇＡｂ−（標識）膜−（ビオチン）・　 （ストレプトアビシン）Ａｂ’　Ａｇ’　Ａｂ　（酵素）該分野の専門家は捕獲 膜を逐次アッセイ法に適用することもできるということを認める。そのような逐 次アッセイ法においては、一連の濾過工程が決定すべきｖＪ實を捕獲し、かつ検 出するために使用される。そのようなアッセイ法はスタンダードな非逐次アッセ イよシ多くの利点を有している。

例えば抗−ハゲテンの浴液をハプテン化多孔江フィルター襄を介して、２１遇す ることができ、その除抗ノ・ブテンｒｔ膜上に（１！獲される。その後、抗ハプ テン結合物質を含有する浴液は膜を介して濾過でれるが、その猷抗−ハブテン結 合′４Ｄ賀を捕獲する。この抗−）・ブテン結合物質はハプテンであっても又は 抗ノ・ブテンＩｌｃ結合する他の物質でめってもよい。抗ハプテン結合物質は有 利に測定すべき吻實のための結合位で改変されている。測定すべ＠物質の溶液を 膜を介して濾過する際に、測定すべき物質は繰上に捕獲される。測定すべき物質 は濾過し、検出可能な標識で測定すべき物質を標識し、膜上でこの標識を検出す ることによシ、測定すべき物質は膜上で検出される。例えば、半導体である電極 は本発明の１実２１ｔｉｉ例で適用してよい。

該分野に２いて習熟した人は逐次アッセイ法の多くの組合わせを行なうことがで きるということを認識している。錯体は抗ハプテン、−・ブテン、抗原、抗体、 測定すべき物質および検出ｏＴ籠な律潰の間で形成されてよい。こｎらの錯体は １つ又はそれ以上の構成分子を有していてよい。こうして、アッセイは特異的物 質からの妨害τ回避するように設計されていてよい。

本発明のこの実施態様を次のように示すことができる： 捕獲膜　錯　体 膜−ハプテン−仇ハゲテン・　へブテン−ＡｂＡｇＡｔ）−（−）遵−（ビオチ ン）−（ストレプトアビ２））・ビオチン−Ａｂ’Ａｇ’Ａｂ−（酵素）抗体１ −抗原に関してと同様な方法で測定することができる。錯体を抗ハプテン、抗体 、−・ブテンまたは抗ハシテンに結合した抗原２よび標織基に結合した他の抗原 の間で形成されてより。

ハゲテンおよび仇−ハプテンはハプテンおよヒ抗ハシテンとしてすでに記載され た分子からなる。抗原は＃累又は蛍光染料で有利に１ａ識されていてよく、有利 にハシテンまたは抗ハプテンに結合していてもよい。

本発明のこれらの実施態様を次に示す：捕獲膜　錯体 膜−ハゲテン　・抗ハブテン−ハプテン−ＡｇＡｂＡｇ−標識漠−（ビオチン） ・　（ストレプトアビジン）（ビオチン）−ＡｇＡｂＡｇ−（＃ｌ素） 本発明に使用した抗体はポリクローナルまたはモノクローナル抗体であってよく 、このアッセイ法のターデッド抗原に応答して生産される０種々の生物学的物質 に対する抗体の生産法はすでに十分公知である。

このアッセイ法に２いてターゲットとされた抗原は：［ｇＥ、プロスタティック はホスファターゼ、前立腺特異的抗原、α−フェトプロティン、胎児性−抗原、 黄体形成ホル七ン、タレアチンキナーゼＭＢ、　ヒト絨毛性がナトトロピン（Ｈ ＣＧ）のような抗原および血清、血漿、尿筐几は他の液体媒体中の他の抗原を包 含するが、これに限定されるものではない。

ボリデオ中シリポヌクレオチドは一重鎖ＤＮＡ　結合蛋白質（ＳＳＢ）　Ｓ、− よび抗−ＤＮＡ抗体と反応させることによって測定することができる。このよう に、標識化ＳＳＢまたは仇−ＤＮＡおよびビオチニル化ＳＳＢまたは仇−ＤＮＡ の種々の組合わせが適用される。この実施態様にお−て、ストレプトアビジンは ビオチニル化ＳＳＢまたは抗−ＤＮＡに結合し、こうしてこの一体はビオチンを 有する捕獲膜に結合することができる。　ＳＯＢのかわシに、オリがヌクレオチ ドプローブをＤＮＡ　（Ｄ検出に使用することもできる。

バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ　Ｌｒｙ）中の記事（第２５巻、第２ １頁、１９８６年）に大暢薗から〇−重鎖結合蛋白質（ＳＳＢ）の大規模な過剰 生産が記載されている。ＤＮＡに対するモノクローナル抗体は生物学的液体中の ＤＮＡを測定するために使用された（　Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　工ｍｍｕｎｏｌｏ ｇｉｅａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　、第８８巻、１９８６年、第１８５〜１９２頁） 。

本発明のこれら実施ｇ様を次のように示すことができる： 捕獲膜　虐　体 膜−ビオチン・　ストレプトアビジン−ビオチン−抗−ＤＮＡ／ＤＮＡ／５ＳＢ −酵素 膜−ビオチン・　ストレプトアビジン−ビオチン−８ＳＢ／ＤＮＡ／抗−ＤＮＡ −酵素 漢−ビオチン拳　ストレグドアＣジン−ビオチン−オリがヌクレオチドグローブ ／ＤＮ人／オリゴヌクレオチドプローシー酵素 不発明中に使用することのでさる標＊４Ｆｉ酵素、蛍光襟誠および放射性同位不 ｔ−＆含する。有利な標識は抗原への抗体の結合を妨害しない位置で抗体に結合 しな反応性基を有すべきであシ、かつ特異的な生物学的物質に関して効力検定全 行なう液体中に天然に認識可能な程度に生じるべきではない。更に、酵素は比較 的長い保存寿命２よび高い特異的活性を有すべきであシ、かつ容易に、例えば可 視光分光光度計を用いて効力検定可能でろるべきである。

本発明方法に有利に使用することのできる噂素の例は、フレエートデヒドロデナ ーゼ、リパーゼ、δ−５−ケトステロイド、イソメラーゼ、イースト・アルコー ル・デヒドロゲナーゼ、イースト・グル：２−ｘ−６スフ二−ト・デヒドロゲナ ーゼ、トリｌ−スーホス７エートｅイソメラーゼ、洋画ワサビｅペルオキシダー ゼ、アル刀す江ホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコース・オキシダーゼ 、β−ガラクトシダーゼ、訃よびより有利にはウレアーゼでわる。通常、酵素が 汚染蛋白質を１ｆぢず、純粋な形でろるのが有利である。

本発明に使用するための酵素標誠生物学的物質の実速は種々Ｏ公知技術により行 なうことができる。生物学的＠寅の酵素への結合の例は、例えばり、Ａ、スタイ ンペルガー（Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇｅｒ）によりイムノサイトケミストリー（Ｉｍ ｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓＬｒｙ　；　Ｐｒｅｎｔ、ｉｃｅ　Ｈａｌｌ＋Ｎ ｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ　、　１９７４年）中に記載されている。

１２１５１又は３２Ｐ　（２）ような放射性同位体を標識として使用することも できるが、非放射性標識が有利である。

特異的結合錯体中に抗原を含有していると思われる溶液を多孔性フィルター膜を 介して濾過した後、次いで多孔性喚上の標識化抗体の存在をサンプル中のターデ ッド抗原の存在を示すものとして測定する。酵素標識の場合、基質に酵素と反応 させるために多孔性構成員に色形成基質の醇？１！を重加することによシ行なう ことができる。測定は有利に米国特許第４５９１５５０号および同第４７０４３ ５５号明細書２よび米国特許出願８７６９２５号明細薔（１９８６年６月２０日 に提出され、かつ本顧明細誉と同じ譲受人に譲渡されたり中に記載された装置お よび方法によって行なわれる。

本発明を次に実施例により更に詳細に説明するが、これらの内は本発明の範四又 は樗神を例中に記載され７を特異的な方法に限定するものではない。

図面の説明 第１図はアビシン（ストレプトアビジン）膜対ビオチン膜（ＢＸＬ−ＢＳＡ　、 ビオチニル化−牛皿渭アルデミン）の改良さまた効率を示す。

第２囚は２禰の興なるタイプの膜と２つの異なる流速を用いて櫨々の濃度のビオ チンでストレプトアビジンの捕獲の効果を図示する。

第６図は編上の遣々の濃度のＢＸＬ−ＢＳＡで、カフ種々のストレプトアビジン 流速で、０．８μニトロセルロースフイルターの捕獲効率を図示する。

第４図はＴＳＨＯ御］定を図示する。

第５図は二重ｆローゾアッセイによフ得られた標準曲線である。

第６図は二重ブローゾアッセイにょシ測定されたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＢ ）生成物の総量を図示した半対数グラフである。

第７図は二重ブローデ７ッ七イを用いて測定したＰＣＢの効率のグラフである。

第８図は逐時および同時方法によるＭｕ：［ｇＧの測定に関する標準曲線である 。

有利な捕獲膜を次の反応工程により製造する式中、この伸長結合基を有するビオ チン５〜２０がＢＳＡ　Ｋ結合している。

例　１ 捕獲膜の製造 反応緩衝液−８，２を炭酸水素ナトリウム８．４０．９及び塩化ナトリウム８． ７６ｇを溶液１ぷを作るために十分菫の蒸留水に溶かして製造した。

牛血清アルブミン（ＢｓＡ）　１０．００１を反応緩衝液−８，２２５０ｄ中に 溶かし、生じたＢＳＡ　浴液を透析膜を用いて反応緩衝液に対して徹底的に透析 を行なった。

透析後の容薫はなお２５０１／であった。

ＢＳＡ　＠度Ｕ、２８［１ｎｍでの吸収によって決定してこの時点で４０９７ば てめった。このＢＳＡ溶液に関して行なわれたＴＮＢＳアッセイはＢＳＡあたシ １８個の遊離アミノ基を示した５ＴＮＢＳは蛋白質中の遊離アミノ基に関する２ 、４．６−ドリニトロベンゼンスルホンｆＲ酸／サルファイドをベースとしたア ッセイ法であり、これはバルマー（Ｐａｌｍｅｒ）等によシ記載された方法（Ｃ １１ｎ、　Ｃｈｅｍ、　、第１５巻、第８９１〜９０１頁、１９６９年）の変法 である。アリコートを波のＴＮＢＳアッセイのために除去した。次いで、ＢＳＡ 溶液にに２ｃｏ３６．５２　ｇｔ−加え、かつ生じた溶液ｔ−Ｄオ８３．５肩ｌ 中のサクシネート無水物５．５４　ｇの溶液を１４分かけてゆりくフと加えなが ら電力に攪拌した。次いで、生じた溶液を更に５分間攪拌し、１時間室温に放置 した。次いで、こＯ溶液を反応緩衝液に対して徹底的に透析し、ミニタン（Ｍｉ ｎｉｌ、ａｎ）　０］１縮機を用いて濃縮し、２５０　ＩＩ／とじた。

この時点でＢＳＡ　傾度が４０１１９／Ｍであることが吸収により測定された。

サクシニル化−ＢＳＡ浴液に関して行なわれｆｃＴＮＢＳアッセイはサクシニル 化ＢＳＡ　ｈ　ｆｃ、り遊離アミン基が１つより少ないことを示した。

この時点で、反応緩衝液中の２．２′−オ牛シビス（エチルアミン）ジヒドロク ロリド（−８−２）の１Ｍ弓液液２５ｍｌ！　ｆ攪拌ＢＳＡ　ｍ　＊に加えた。

次いで、１−（６−シメチルアミノプロビル）−３−エチルカルボジイミド塩酸 塩６．３９ｇを張力に攪拌されるＢＳＡ　浴液に加えた。すべてのカルボシイミ ドが溶けた後で攪拌をやめ、生じた溶液をおおい、かつ１時間室温で恒温保持し た。

次いで、この浴液を反応緩衝液に対して徹底的に透ル）濃縮〆を用いて濃縮し、 ２５０ゴとした。

ＢＳＡ濃度を４０＃９／−であるように吸収によシ再びニＪ定した。前記のよう に製造したＢＳＡ−オキシース（エチルアミン）溶液に関して実施したＴＮＢＳ −アッセイは遊離アミノ基１５閥の存在を示した。最終分析緩１１ｉＬＩ液に関 して実施しｆｃＴＮＢＳアッセイはＢｓＡ溶液からの遊離アミンの十分な透Ｊｆ ′ｒｔ″示した。次いで、このＢＳＡ　ｄ液Ｖこサク・ンンイミゾル６−（ビオ チンアミド）ヘキサノニー）　１．５１．９を加え、該溶液を５分関預力に攪拌 し、その後こｆ’Ｌ’７お２い、かつ室温で１時間恒温保持した。

ビオチニル化−ＢＳＡ溶液をｊＪ［項緩備液−７に対して徹底的に透析した。こ の燐酸堰緩４ＪＪ液は次のように製造した二二塩基性燐酸ナトリウム４．９７． ９、−項基址燐ばナトリウム２．０７１　＞よび塩化ナトリウム６．７７ｇを溶 ｇ１）を作るため（て十分量の蒸留水中に溶かし几。

透析後の１＠液中のビオチニル化−ＢＳＡの濃度を１５■／ｄであるように液収 により決め友。

ビオチニル化−ＢＳＡ俗液に関して実施したＴＮＢ８アッセイは６つの遊離アミ ン基の存在を示した。ビオチはビオチニル化−ＢＳＡ中のビオチンの数である。

ニトロセルロース慎又はインモビロン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ）膜０．８μを２０ ３Ｘ３０！の太ささのシーツに切断し丸、ビオチニル化ＢＳＡ　５■／ｗｄ燐酸 塩緩ｗＩ液を有するビオチン固定溶液１００ｒｉ！をこね鉢に入れ友。

この膜ｔ″蛋白質溶敞中に浸す。この湿ったＩＩＩをガラス皿の底に２さ、この 皿を転倒し、この膜を４５分間恒温保持した。次いでこの皿にＩＩ４酸塩蝋−液 ５００ｄを加え、１５分間恒温株狩した。久いで、この溶液を傾瀉し友。

０．１％ｆルタルアルデヒド固定Ｍ液を、２５％グルタルアルデヒド溶＠４ｙｄ に１Ｊにするために十分量の燐酸塩緩＠液を加えることによフ製造した。次いで 、こＯグルタルアルデヒド固定溶液５００ａ／’＆ニトロセルロ一ス膜含有皿に 加え、この内容物を室温で２時間恒温株侍し几、０．１Ｍエタノールアミン−９ ，５の溶液金インモボリン（Ｉｍｍｏｂｏｌｉｎ）膜を有する皿に加え、内容物 を室温で１夜恒渥保狩した。

この固定溶液又はエタノールアミンを傾１した後、ｙＩｅＲ塩緩衝液５００ｄを 加え、かつ内容物を１５分間恒温保持し几、この溶液を再び傾瀉し、蒸留水５０ ０ゴを加え、内容物を１５分間恒温保持した。

この水恒温保持を１回繰り返した。次いで、この膜を二枚のワットマン（Ｗｈａ Ｌｍａｎ）　３　′ＭＭ吸い取シ紙の間に挿入し、過剰の液体ｔ−除去し、この 吸い取シ紙から取シ出す際にファイバーグラススクリーン材料の間に置いた。こ の僕を支持するスクリーンを常用のオープン中に６５℃で１５分間装いた。

この漠をオープンから覗り出し、貯電のために室温で真空デシケータ−中に入れ た。

ビオチンで被覆した膜の捕獲効果の分析ピオチン被＝　ＦＡ（ＢＸＬ−ＢＳＡ　 ）へのストレプトアビジンの種々の流速に２ける結合ｔｆｆ性及びフトレデトア ビジン被８ｆ膜へのビオチニル化ＢＳＡ　Ｏ種々の流速に２ける結合Ｗ注を幕１ 図に示す、ニトロセルロースｉｔ、相応する結合対の量が約当量の結合を許すよ うにストレプトアビジンまたはＢＸＬ−ＢＳＡで被覆し几、放射性凛誠ストレグ トアビゾン又はＢＸＬ−ＢＡＡ　３　Ｃ１Ｏμｔ′ｆｃ種々の流速で適拍なＦ！ ４を介して１通した。最も低い流速で各膜上に捕獲された放射性を捕獲１００チ とした。捕獲された総計のパーセンテージｔ−流速の対数に対する最大捕獲のパ ーセンテージとしてプロットした。

捕獲曲−が安定を開始しないので、　ＢＸＬ−ＢＳＡの１００チ捕獲のために試 験される最大流速はストレプトアビジン膜にとってなお早すぎたということもあ る。しかしながら、ビオチン被覆膜は流速７５μｊ／分でストレプトアビジンの ９５チを捕獲することができるが、ストレプトアビジン膜の場合同じパーセンテ ージのＢＸＬ−ＢＳＡ　ｔ−捕獲するために流速１７μｊ／分が必要でおった。

ストレプトアビジンの捕獲に関するビオチン密度（ハプテン数として挙げたビオ チン／　ＢＳＡ比により測定した）の効果を第２図に示す、２つのタイプの膜を 糧々の流速で試験した：　０．４５ニトロセルロース（ＮＣ）２よび０゜６５μ インモビロン〔ＩＭ″＋１．１゜後者のものはミリボール−ラボラトリーズ（Ｍ ｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｅｓ）により製造され、ポリピニリデン ジフルオリドをベースとした膜でめシ、栽水注ポリマーで被覆され、共有蛋白質 結合を行なうように宿性化されている。この膜を種々Ｏ程度にビオチンで標識さ れた十皿渭アルデミン（ＢＳＡ）で被覆した。ＮＯ３−よびＩＭＩＩＩＩはＢＳ Ａ約１０μｇ　／　Ｃｌｉ”　＆よび２μｇ　／　ｃｒｙ”をそれぞれ含有した 。刀ツコ中の数は膜を介して１２５ニーストレプトアビジン６００μｔを泥丁た めＶＣかかった時間を表わす。この図はＢＡＡ上のビオチン田度が蔦ければ高騎 程膜上にスト１／グトアビゾンを禰殖することτ示す。このことはＩＭｆｉに２ いてよシ明白でおる。工Ｍ膜上でのより大きな効果は編上の蛋白質のより低い量 に起因する。このことは次の図（＠３図）からも明らかでるる。

ストレプトアビジンｔ−補獲するというビオチン−ＢＳＡで破榎され九ニトロセ ルロース膜の能力に関して蛋白質積載の効果を第３図に示す。ノ・ブテン数１６ ．６のビオチン−ＢＳＡは種々のｌ！１度でニトロセルロース膜上に固定された 。Ｘ軸は膜を被覆するために適用され次ビオチン−ＢＳＡの濃度を示す、膜上の ビオチン−ＢＳＡ　Ｃ１ｔはｉｔ　ｔ’Ｌ”　２−５．５．１０．３０．５　Ｑ 　ｐｇ　／　ｃｍ”でるる。３００μ７？または１２５エーストレゾトアビジン を膜を介して１．５分間２よび５分間で濾過した。Ｙ−軸は膜によシ捕獲され九 数を量大数結合のパーセンテージとして示す。図中に示されているように、膜上 の１オチンーＢＳＡの総量も膜上のストレプトアビジンの捕獲効果に役１ｌＩｌ を果す。

これらの図面は本発明の重要な親点を示す＝（１）同じ白質を捕獲するよシ、よ り効果的にストレプトアビジンを捕獲する。（２）ビオチン漠の捕獲効果は膜上 のビオチン濃度によって決定される。Ｃオチン密度はＢＳＡのハシテン数と倶上 のビオチン−ＢＡＡ童の両方によって調節される。

ＴＳＨに関するアッセイへ０ビオチン膜の使用沈浄緩衝液−７，０を１００−燐 酸ナトリヮム、１５０　ｍＭ　ＮａＣｊ　、　０．１％牛−ｒ−グロデリンおよ び０．０５蝿界面活性剤、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート を含有するように製造した。

ニトロセルロースａｌｌを？オチニル化ＢＳＡ　（ＢＸＬ−ＢＳＡ）で前記のよ うｒｔｃ′ｇＺａした。ビオチニル化膜の１平方センチメーターを１ｃｍｘｌＱ ｃｍ酢酸ビニル棒の直径６鳳の孔の上に転写テープで備えつけた。

鷹を有する棒をフィルターユニット中にｆｌｉｅ、コ。

際このフィルターユニットの上方部は膜を通して液体を流させる直径４ｕ（Ｄ開 口部を有するじょうご状のカートリッジである。

ｐＨ７Ｏ複合体サンプル希釈緩衝液ｔ−ｉ　Ｑ　ｍＭ燐酸ナトリウム、１５０　 ｍＭ　ＮｅＬＣｌ　ｓ　１０　ｍＭＮＩ１２ＳＯ３，１ｍＭ　２−メルカプトエ タノール、０．０１％ＮａＮ３．０−　ｉ％牛−γ−グロブリン、０゜ＯＳＳ界 面活性剤、例えばポリオキシエチレンφモノオレエート、０．２５％オクトキシ ノール、１ｍＭ　ＥＤＴＡを含有するように製造した。ストレプトアビシン−抗 甲状腺刺激ホルモン２μｇ／ｗｌおよびウレアーゼ−抗甲状腺刺激ホルモン２ｐ ｇ／ｉＬ／をアッセイを実施する直前に緩衝溶成に加え友。

複合サンプル希釈緩−額７５０−ｌを血清２５０μｌに加え、生じた通合″？Ｊ ｔ−優われたプラスチックチューブ中で６７”○で１時間恒温保持した。

このサンプル−覆合不児合吻４５０μｔをシリンジポンプによる。に２下に儒え らｎ次ビオチニル化膜を介して６分間にわたって７１通した。

この膜を洗浄緩備液ＦＪ→７゜０５００μ−で約１分間濾過することによシ元浄 した。

次いで、このＩｍをフィルター・ユニットから取り出し、シリコンウェハーを有 するセンサー・アッセンブリー中に装入した。米国特許第４５９１５５０号明細 薔の装置ａｔｔ″参照、棒の濾過域をシリコンウェハーの光にインターロブイト する部分にあわせた。リーダーの一面のみが使用され、かつプランジャー位置を シリコンウェハー表面から７０μにセットした。反応を低シグナル（２５０μＶ ／秒）で１５０秒および高シグナルで５０秒監視した。第４図はＴＳＨ測定に関 する典型的な結果を示す。

例　２ プールされた血清から添〃ΩしたＴＳＨの回収に関するビオチン板付はアームの 効果 備獲リガンド回収　サンプル　率　係 ビオチン−ＢＳＡ　駿衝［１ム込　”１００”とオチンーＢＳＡ　血ｆｆ１９１ １１ ＢＸＩＩ−ＢＳＡ　緩衝ｉ　２５９２”ＩＬｌＯ”ＢＸＩｔ　−ＢＳＡ　血ｆｆ 　２７．５１　１０５ｗ１紀のａｒｃビオチア　ＢＳＡＯ長鎖ｇ　（ＢＸＬ　− ＢＳＡ〕を使用する噌短鯖ピオチン−ＢＳＡ　（Ｂｉｏｔｉｎ　−ＢＡＡ　）と 比較して血ｆｆからのＴＳＨの回収ｉＣｊｒ　ｌ／ａて改良ざｎたことを示して ＾る・ａ記結果に創紀襟準アッセイ報告により得られた。プールされた皿溝（皿 慣）にｔ複台サンプル希釈＊＊ｇｃ椴爾敞ノに−ＴＳＪ（１■を添加した。

サンプルｔ−ｇｏ七几ぞれの臘に関し稜衡敏テンプルの１１会に（回収係）標準 化した。血清中でのよ夕大きな胞状に加えて、表置液中での高いシグナルな短鎖 ビオチンとの複曾罐体りりＢＸＬ　−ＢＳＡとのｄ曾錯俸がより大きな全坏にわ たる補獲効果を有することｔ示して匹る。

内　３ ＤＮＡアッセイ、投与菫一応答 換二ビオテン−ＢＳＡ　Ｈ＆ニトロセルロース属（孔径０．８　μ〕。

ＤＮＡサンプル：ｍ＊塩緩衝塩水ＣＰＢＳ）　２００μ！中の−３［鎖子午！！ ｉ４臓ＤＮ人０，５．１０．２５．５Ｄｐｇ。

試薬：　Ｉ　Ｄ　ｍＭ　）リス−Ｈ（Ｊｉ衝猷、１　ｍＭ　ＥＤＴＡ−ウレアー ゼｉｎｇ／ＩＬｔ、ビオ！ンー仇−ＤＮＡ　１０　ｎｇ／−１１饅ＢＳＡ。

アッセイ法：　ＤＮＡサンプル２００μｌｋ試薬５００μ！と３７℃に３０分闇 恒温沫侍した。この混曾安を約１００μｌ／分の流速でとオテンーＢＳＡ破ｆｉ 礫を介して濾過した。次＾て、この膜を最大は速約６１１１１７分で況紗稜備液 −５（１−酢酸ナトリウム、口。１ＭＮａＣ１，０，Ｌｌ　５％ポリオキシエチ レンモノ第１／ニートノｉ　ｃｃで洗浄した。況ＩＩ！）後、この換ｔ−センサ ー呈（米１侍肝第４５９１５５０号公報）に移し、基質を８宮しくｐＨ５ｅ！ｒ 、＃＋１００−尿禾ノ、ｐつ一応谷ヲ胱んだ。

結果 ＤＮＡＣｐｇ／サンプルン　シグナルの率（μＶ／抄） ０　６２±　３ ５　１０６±　７ １０　１５６±１０ ２５　３１０±　１ ５０　７７８±７０ 例　４ インシュリンおよび顆粒性白血球マクｏ７７−−／：ｙロニー胸直２７クター（ ０ＭＣ３Ｆ　）サンプル中のＤＮＡの慣出 繞：ピオテンーｂｓＡ被榎ニド４セルロース展（九径０゜８−）。

豚インシ為リンの前処理工インシュリン１０ダ／ａ（１０ｍＭ　）リス緩衝液、 Ｉ　ＸＱＭ　ｍＴｈ　％　−８，５中〕を１０テイナ−ｔ’に１００Ａ＃／ａｔ で５５°で一夜消化した。インシュリンγ８化智１峠中に子牛胸腺ＤＮＡ０．５ および５　［ｔ　ｐｇ　ｋ自濁した。他方の凪の実験にお＾ては、子牛−＃腺Ｄ Ｎ人０．５および５０　Ｐｇ　ｋ　０ＭＣ８ＦＩＪ、４　Ｉｖｆｔｔ有するＰＢ Ｓ浴液中に繞刀口した（総容麓μ２００＾り。ナベてのサンプル全プロプイナー −ｅＫを不活性化し、かりＤＮＡ　ｔ″−Ｘ鯖に質性するために１００℃で５分 子’＜、ｍ熱した。インシュリンサンプルを氷上で冷却し％　ＧＭＣ８？サンプ ルｆｅ呈漉に冷却した。

サンプル２００μｌｔｇ薬（ストレプト７ピジン２０　Ｕ　ｎｇ　／　Ｌｌ　ｓ 　ピオチン−８ＳＢ　２．５　ｎｇ　／　ａｇ、クレ７−ゼー抗ＤＮＡ　９　ｎ ｌＥ／　”　ｐ　１　％　ＢＳＡ％　０−２５　％オフトイノール、１０　ｍＭ 　）リス−ＥＣＩ；緩衝！、１　ｍＭ　ＡＤＴＡ、−７，５中ン５００μノと混 合した。

このサンプルを３７℃で３０分閲恒温保持し、膜を介して濾過した。洗浄浴液（ ５ｍＭ燐酸ナトリウム１ｐ”　７．０−　Ｉ　Ｍ　ＮａＣＪ　ｓ　Ｄ−０５％ポ リオキシエチレンソルピタンモノオレエー）　）　１　ｃｃを膜を介して２回濾 過した。米１！ｉｔ特ｆＦ第４５９１５５０号明細蕾中に記載さａた型の一セン サーでシグナルを胱藝城った。

結果 サンプル　率（−７７秒） インシュリン　６９ インシユリン＋ＤＮＡ　５　ｐｇ５６ インシニリン＋ＤＮＡ　５０　：９ｇ　２５４ＧＭＣ８Ｆ　２１ ＧＭ０８Ｐ＋ＤＮＡ　Ｓ　ｐｇ　４０ ＧＭＣ８Ｆ＋ＤＮＡ　５０１）ｇ　１９２二ムグローブアツセイ 二ムブロープアツセイ混合吻ｔアッセイ通曾智ろたり２５　ｎｇ　（ターグツ８ 分子７．８　Ｘ　１０ｇ）で開始するＨｌｎｆ　１消化ｐＧＪｌｉＭ３の１：２ 遜絖布択液、５′ビオチニル化２０　Ｙ　−（ＣＣＡＧＴＴＡＣＣＴＴＣＧＧＡ ＡＡＡＡＧ）　／　２　ｎｇお工び５′フルオレセイン化２０マー（ＴＡＧＣＴ ＣＴＴＧ后ＣＣＧＧＣＡＡＡＣ：　）０．５　ｎｇ　５ｃ％　０．２５％界面活 ａ烟、例えはポリオキシエチレンツルとタンモノオレエートヲ有する３ｘ　ｍ（ ３ＱｍＭｆｉ酸ナトリウム、４５０　ｒｒＭＮａＣｌおよび６ｍＭＢＤＴＡ　） 　１００＾ｌ中に苫胃するように製造した６各２０マーのこの配列ｄｐＧＪＩＪ ７３の同じＥｉｎｆ　ｌ　７ラグメントに胸しても見＾出された。仄９で１サン プルＤＮＡ’ｉ１０［Ｊ’ＣＴＳ分間ＣＯ混＆　’ｆｍ　’ｔ：　２Ｘｌ熱ｔｉ ｃとにより変性した。

その波、この九廿物を５Ｌｌ〜５５℃で３０分間恒温保愕した。久いてこの混ｆ ＆物にストレプト７ピジン１廓Ｉ／齢、３Ｘ　ＰＢＳＪＣ中の仇−フルオレセイ ７−ウレアーゼ複曾体８μＩ／ｍ１．％　０．２５％ポリオキシエチレンソルビ タン七ノオレ二一）　、１　ｉｉｈｇ／　ＩＬｔＢＳＡおよび８０μＭＮ−アセ ナルシスティンを含有するように製造さＡ７’Ｃ靜液１ＩＬｔｋ加えた。生じた 複曾不醪液を呈二で３０分間＠温保持した。

次いで、恒温保埒榎曾渾浴衣をプラスチック棒上に設けたビオチン仮榎ニトロセ ルロース換金介して濾過した・仄に％威昇況浄液（１０−燐酸ナトリウム、１０ 　ｕ　ｍＭＮａｃｊ、　［Ｊ、０５％ポリｔ　”Ｐ　シｘ　ｆ　Ｌ／　ｙ　７　 ルヒタンモノオレエート２よび［７−０５優ＮａＮ３．４６．５）ｉＭＪ’ｉ榎 曾庫浴液の俊に換を介して−通し、この線を威外況浄液５０Ｍ＋７中に浸した。

久いてこの禅を基質溶液（開始洗浄液中１００戚尿嶌）１−含有する米−峙肝第 ４５９１５５０号中に記載された型の一センサー呈中に装入した。伏いで、一応 答を耽み取ると、第５区に示したＮ果が得られた。

ｌ１６ ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＢ）への二１７″ロー１アッセイの通用 １、ＰＣＢを用いるｐＧ腹３中の０゜１　ｋｂｐ城の増大ポリメラーゼ連鎖反応 （ＰＣＢ　）混合智を１Ｑ　Ｑ　ｍＭ　）リス−ＨＣ７（ｐＨ８−３）、Ｉ　Ｑ 　ｍＭ　ＭｇＣＪ　３．１−各ｄＮＴＰ、Ｉ　ＡＭプライマーＩ　ＣＣ晶ンｕ緑 ＣＣＡＣＣＧＧＴＡＣＣＡＧ）、１４Ｍプライマー２　（Ａ（）ＴＡ’Ｉ”Ｉ’ ＴＧＧＴＡＴＣＴＧＣＧＣ’ＴＣＴＧノ、繭もッテＨ１ｎｆ　１　”？’消化１ ，７’ｃ　ｐＧＫＭ３　１０１１１１Ｅ　（ター１”ント分子３．１５Ｘ　１　 ［，１’　）　ｔ’ざイするように装造した。増大さルるべき領域は例５中に記 載した２０マ一配列の各々ｔ″苫胃る。このＰＣＲ混会＊に１００’Ｃで５分間 恒温保持し７′ｃ、恒温沫待直俊、５Ｕ／μｅタク（Ｔ改ｑ〕・ボリメラー−ｅ （Ｐｅｒｋｉｎ　ｒｌｍｏｒ　）　’ｌ　Ａｌ　ｆ　ＰＣＲ混仕りに加え、こｎ 茫児全に１曾し、仄りで２４℃に恒温床付した。

エラペンドル７　（Ｋｐｐｅｎｄｏｒｆ　）熱ティクラーを用いて、１亘１株待 温度ｔ９４℃と５５℃の間をサイクルさせた。この熱サイクラ−を各ブイクルが 約６分間続くようにセットした。ＰＣＢサンプルを温度が５６℃に遵した時サイ クル１６．１５おＬび１７でこのサイクラ−中のａ曾＠かうＱ９呂した。こｆ’ Ｌらのサンプルを二電プローブアッセイに後＆Ｃ使用するたりに一２０℃で貯蔵 した。ｐＧム３　ＯＮＡを含有しない窒試験用す／グルをマイナス対照として使 用するために同様に装造したー ２、ＰＣＲサンプルを用いる二ムグローブアッセイ創記のように調至されたＰＣ Ｒテ／グル１０　ｔｔｌ　ｋ例５中で製造した二１プローブアッセイ混合＊９０ ｄと酋し、この全坏で１００岸ｊの混合物を５分間ＩＣｌ０℃で変性した。

１１口、この混合Ｗｋ５０〜５５℃で３０分間恒＠塊持した０次−で、この混合 物ｌこ１μｉ／Ｍストレプト７ピジン、８μｉｌ／Ｍ３工　ＰＢＳＫ　９の仇フ ルロレスセ（ンークレ７−ｔ”複曾＋、０．２５１ポリオキシエテレンソルピタ ンモノオレエー）　、Ｉ　Ｑ　／　１１４　ＢＳＡ　＆　１）８０μＭＮ−７セ チルシステイン′に含有するように実速謳ＸＬｆＣ溶液１−を加えた。この生じ た複仕体溶液を鳳磁で３０分薗恒痣昧侍した。

この恒温味付した複曾坏浴液を次いでプラスチック弾止に設けたビオチン被覆ニ トロセルロース譲を介して５［通した。択に、限界洗浄液（１〇−鱗戚ナトｖウ ム、１０　［Ｊ　ｍＭ　ＮａＣｌ　ｓ　Ｏ−［Ｊ　５　％ポリオキシエテレンソ ルピタンモノオレエー）　＆Ｌび０−０５　％　ＮａＮ＋５、−６．５）１鄭に １１１曾体浴液の後に裏を介して濾過した。

１ｌＩＶｃＷｉけた昶を限界洗浄液５０―中に浸け、久いて基質靜欣（限界洗浄 液中の１００ｍＭ尿素〕τ言有する米国籍ＦＦｗ＆４５９１５５ｃ１号明細書中 に記載された臘のＰ＆′ｉセンサー呈中に意中した。次いで、一応答ｔ−読み取 り、第６図及び第７図に示された結果が得られ九・特異的シグナル（ターグツｈ ＤＮＡｋＷするサンプルと有名ないサンプルとからのシグナル間の走）はサイク ル１３からサイクル１７に直−状より増大する（第６図ン、第３図にティクル１ ３，１５および１７からの特異的なシグナルのｔ’ｚ半対半対ラグラフす。この グラフに、プラスミドＤＮＡの公知麓によってｇｌ：ｌ；る特異的シグナルの麓 との比軟によって＃！１足される１台（内えば胤５図）、特異的シグナルの盆、 したがってＰＣＢ生属智が指数的Ｖこサイクル１３からサイクル１７に上昇する ということｔ示してｉる。サイクルリフｃ９の特異的シグナルの増大ＩＪＰＣＲ 壇大ファクターが１サイクルわたり１．５４でめることｔ−、を休するーに通合 する。理論上のＰＣＢファクターｄ　２．ＯＬｌでｂるので、見賓効率は７７優 でめる・ ４二つの潜在的使用１ｃｉする。第１−１こ、通用ファクターの測定はＰＣ’Ｒ 未汗の５Ａ威的最適化に有用でめる。的えば、創記の実験において史なる最適化 のために明らかに余地がるる、第２に、第７図に示した指数グラフは出発分析物 の童を外挿法に工って鋤足するために使用することができる。ガえは、病原不、 力えば瓜Ｖからの鉄酸の童ｔ−測定することができる。このことに臨床分野に２ いて応答７！’Ｆ倫するのに有用である。

汐、１７ Ａ、マウスエｇＧの同時および逐次測定１、　同時測定法 ｍ曾ｗｔ″Ｍｕ１ｇＧ　、ビオチニル化抗Ｍｕ工ｇＧ、フルオレスセイン化［Ｍ ｕ工ｇＧｓストレグト７ビジンおよび仇フルオレスセインーウレアー−ｅを含有 するように製造した。この生じた混合Ｗｔ−３７℃で１時間恒温味付した。

アッセイ稜衡鼠をこの恒温床待混合吻に刃口え、久いてこ１″Ｌでプラスチック 弾止に設けたピオチン般覆ニトロセルａ−ス繞を）ｒして１５分関τかσて濾過 した・この線ｔ５分間にわたって−７，［Ｊ燐戚項仇Ｐ稜衡欲で′ｆｃ浄した。

基貿浴鼠（限界洗浄液中の尿素〕を貧有する木１付針第４５９１５５０号明細書 中に記載した型の声センサー意中１こ装入した。仄＾で、Ｐ８応答を胱へ久の表 及び第８図に示した結果が侍らル九〇２　逐久副定法 Ｍｕ工ｇＧ、ビオチニル化仇−ＭｕｘｇＧおよびフルオレスセイン化仇−Ｍｕ工 ｇＧの菖せ吻を装造し、３７℃で１時間恒ｊ轟保持した。久いで、この僅、Ｊ１ 沫待混廿物ＶζストレプトアビジンｔＩＸＪえた。ストレプトアとジンを含有す る生じ７ｃ混曾ａｔプラスチツク律上に設けたピオチン被覆ニトロセルロース換 を介して１０分間にわたって４遇し迄。択いで、この編ｔｐｋ１７燐戚塩況ひ椴 備猷で５分間ｉｃ　ｖたってｆ！ｃ伊した〇久ｉで、仇フルオレスセイン・ウレ アーゼの浴８．１ｃ膜を介して５分間１こわ比って４通し、引＠　ｆｆｆｉ　ａ 　ｉ−Ｈ７，０燐酸塩洗浄緩衝液で５分間にわたって洗浄した。次いで、この棒 ｔ−基員溶液（限界洗浄液中の尿素〕を含有する米１峙ｉｆｆ第４５９１５５０ 号中に記′ｇされた量のめセンサー意中に装入した。久いで、一応答を絖み取り 、次表および第８図中に示された結果が侍られた。

同時２よび逐次法によるマウスエｇＧの測定ｐｇ　Ｍｕ工ｇＧ　−ボルト／抄　 Ｓ、Ｄ、（ｎ＝４）υ　５４　３．［Ｊ ｌｏｏ　１２４　３゜０ ５Ｕ［ｌ　４Ｌ１３　１６ １　ｕｕｏ　７５８　９６ ｐｇ　Ｍｕ工ｇ１．）μボルト／Ｅｌ＋　Ｓ　、Ｄ、　（ｎ−＝４）０　１２Ｌ ｌ　１１ ｉｆＪ０　２ｔｌＪ９　１１ ５ＬＪ０　６５８　２４ 抗−人絨毛性性腺刹激ホルモ／（ＨＣ’Ｇ、）の同時および逐次測定 人絨毛性注腺ｆＩ！ｌ淑ホルモン（ＨＣＧ）ｋピオチンで標識し、ビオチニル化 ＨＣＧを得た。Ｉ（ＣＧの他のサンプルをフルオレスセインで標識し、フルオレ スセイン化ＨＣＧ　ｆ得た。

１、抗−ＨｃＧＣ）逐ＦｌｌＪＨ法 抗−ＨＣＧ０，４．２０−Ｊ？Ｌび１０　Ｑ　ｎｇ　ｋ含有ｆるＬ　’）ＶＣ９ ：ｙ’：ｊｋ４　ＣＩ　ＣＩ　Ａｌ　ｔ−裂造した。谷テンプルをビオチニル化 ＨＣＧ　１０　ｎｇおよび２ルオレスセイン化ＨＣＧ　１　（Ｊ　ｎｇｔ−富有 する浴液１υυｂｌと混合し、生じた５００声ｊ混＆ｇｌを呈１で１時間恒温保 持した。

久わで、各恒渥保佇混合切に４　Ｈｇ　／　ｍストレプトアビジン溶ｔｉ　５　 Ｄ　Ｄ　＃を加え、晶曾した俊、プラスチック欅よに設σたビオチン被覆ニトロ セルロースｍを介して濾通した・択いで、各層′に声７．０燐戚項洗浄駿＃猷２ ａで沈浄した。ウレアーゼ−仇−フルオレスセイン浴液の４ｘｌ／ｗ、浴欲５０ 　［１１ｔｓｌ　を換を介して濾通し、これを再び９４酸埴玩伊畿爾准２−でカ ーした。

久＾で、この禅ｔウレアーゼｉλ浴准を富有する米１〜ｔｆ第４５９１５５０号 鴫細簀中に１蛎した型の一センナー意中に編入した。一応答を読みと９、下の表 中に示し７′ＣＭ来が得ら几７′ｃｌＩ２、仇−ＨＣＧの同時測定 試料１１Ｊ　［Ｉ　Ｉｓｌ　’ｔ”Ｋ−ＨＣＧ　ｉＪ、　４．２０および１ＣＩ ＯＡｊｔ言胃する！−５ｉＣ表遺した。谷サンプルｔこの実施例の１の部分で使 用したビオチニル化ＨＣＧ、フルオｖｘセイ７化ｎｃｏ浴ａ１００　ｘｉとａｆ し、ａｔｓｉｔ／ｍｌウレア−’ｔｐ−Ｍ、−フルオレスセイン浴！１０［Ｊμ ｌと混合した。生じた混合物を呈櫨で１時間２０分間恒温保持した。各テーブル にアッセイ酸★［１ｍを加え、生じた混合物をプラスティック棒上に設けたビオ チン被覆ニトロセルロース属を介して濾過した。このＪＪＸを洗浄緩責蔽２−で 沈浄し、前記の一センサー中で絖み取る。−釆を次に示す。

この逐次仇座７ンセイくワクチンへの免疫シし不心谷を１＃定するたむ１こ使用 することがでさる一特異的仄捧に１優よ夕低い？Ｓ度で測定することがでさる・ 仇−ＨＣＧの逐次および同時測定 率（−Ｖ／抄〕 仇−ＨＣＧ　（ｎｇ）　逐次　同　時 ｕ１１５±　４１２ｕ±１５ ４　１３１：ｌ±　６１２１±　２ ２ｔＪ　１２３７±　７１６５±　７ １υＩＪ　５［ＪＯ±２１Ｊ　２７１±１７貞　９ ＤＮＡ投与重応答アッセイ（通訳形） ＤＮＡテンプルを壌酸楓敬膏塩浴漱５ＬｌＯμβ中Ｖこ−Ｘ鎖ＤＮＡ０％　５． １　（Ｊ％　２５％　５０％　１００％　１５Ｑおよび２００　ｐｇを富有する ように装造した。投与量一応答試薬はｓｐｇ／ａｔストレプト７ピジン、２．２ ５ｎｇ／Ｊ！ｊビオチニル化−Ｘ鎖結合蛋白質および９６゜８ｎｇ／−仇−ＤＮ Ａウレアーゼ倉トリスーＩＣＤＴＡ形成椴備液中ｖｃｔＷするように装造した。

ＤＮＡ　ｔンプル５００μｌを９５℃で１０分間７１ＩＩＩ熱変性し、引き続き 冷却し、投与量一応答試薬１゜Ｑｍと混合した。こ７１．らの混合物’に５７℃ で１時間恒温保持し、プラスチック弾止ＫＮけたビオチン−ＢＳＡ仮櫃ニトロ− セルロース換’ｌ”してそれぞれｔｍＡした。各編ｅ１０ａｏａ燐戚塩稜衝敦、 −６，５で況浄し、この弾ｔつＩ／ア〜ゼ基買を甘ｎする米−峙計第４５９１５ ５（Ｊ号明細蓄中に記載された盤の一センナー意中に装入した。一応答を絖与取 ９１でのデータを下記の表に示した。

Ｍ　未 ０７６゜３　１２．７　１６．０ ５　１４８　１５．６　１３゜５ １０　２２２　３５．２　１５．９ ２５　４８８　２３．５　４．６ ５０　９８１　５１Ｊ、９　５．２ １００　２ＬＩ４８　６１．３　３．０１５０　５１４５　１１２．６　６．５ ２００　４６６２　１８９゜５４．１ 別示のために、本発明のせ別な実兄態様を明細書中法 に記載しているが、種々の変！も本発明の精神および範囲から離れることなく作 ることかでさるということは明らかである。従って、本発明ａ請求項の範−によ っての与隈定されるものでるる。

ＢＸＬ−ＢＳＡ対ストレプトアビジン捕獲効果砲３図 地５図 二重ブローブアツ七イ ロ２１ＰＣＲ（ＤＮＡ不含）　区ＤＰＣＲ（ターゲットＤＮＡ含有）第７Ｎ ７７％ＰＣＲ効率 サイクル＃ ｍｕｌｇ　Ｇ（ｐ９／アッセイ） 国際調査報告 □−＾−−１１′’　ＰＣＴ／ＵＳ　８９１０４３２０国際調査報告　ＰＣＴ／ ＵＳ　８９１０４３２０

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．膜に直接又は間接的に結合したハブテンを有する多孔性フィルター膜からな る捕獲膜にかいて、特異的結合錯体の結合構成員に結合した抗ハブテンを有する 溶液中の特異的結合錯体を、この溶液を該膜を介して流す際にこの捕獲膜上のハ ブテンにより溶液から除去する捕獲膜 ２．ハブテンが膜に直接又に間接的に結合する伸長結合基で改変されている請求 項１記載の捕獲膜３．膜に直接又ほ間接的に結合したビオテンを有する多孔性フ イルター膜からなる捕獲膜において、特異的結合錯体の結合構成員に結合したア ビジンまたはストレプトアビジンを有する溶液中の特異的結合錯体を、この溶液 を該膜を介して流す際にこの捕獲膜上のビオテンにより溶液から除去する捕獲膜 ４．ビオテンが伸長結合基で多孔性フィルター膜に付着している蛋白質に結合し ており、それによつてビオテンは多孔性フィルター膜に間接的に結合する請求項 ３記載の捕獲膜 ５．蛋白質が牛血清アルブミンである請求項４記載の捕獲膜 ６．ビオテン分子約５〜２０か各牛血清アルブミン分子に結合している請求項５ 記載の捕獲膜７．次の工程： （ａ）溶液中で結合構成員と測定すべき物質との間で特異的結合錯体を形成する が、その際１つの結合構成員は抗ハブテンを結合して有しており、他の結合構成 員は検出可能な標識を有している、（ｂ）膜に直接的または間接的に結合するハ ブテンを有している多孔性フィルター膜を介して特異的結合錯体を含有する溶液 を濾過し、その際ハブテンと抗ハブテンとの間の結合が膜上に特異的結合錯体を 捕獲し、かつ （ｃ）膜上に付着した標識を検出する；からなるアッセイ法。 ８．特異的結合により形放された特異的結合錯体を結合する膜により特異的結合 錯体を溶液から除去するアツセイ法において、改良点は多孔性膜がこの多孔性膜 に直接またほ間接的に結合するハブテンを有し、抗ハブテンが特異的結合錯体の 結合構成員に結合することからなるアッセイ法。 ９．ポリメラーゼ連鎖反応アツセイ法において、改良が次の工程： （ａ）増大させたＤＮＡの複数のサンブルをポリメラーゼ連鎖反応から種々の時 間に取り出し、（ｂ）検出すべき増大ＤＮＡと、検出すべき増大ＤＮＡに特異的 に結合する、標識化オリゴヌクレオチドプローブと、決定すべき増大ＤＮＡに特 異的に結合し、かつ更にアビジンまたはストレプトアビジンに結合しているビオ チニル化オリゴヌクレオチドプローブとの間に溶液中で特異的結合錯体を形成し 、（ｃ）この溶液を膜に直接またに間接的に結合するビオチンを有する多孔性膜 を介して濾過し、（ｄ）膜上に付着した標識化オリゴヌクレオチドを検出し、 （ｅ）承リメラーゼ連鎖反応により形成されたＤＮＡの量を測定し； （ｆ）増大前に存在するＤＭの量を外挿法により推定する； からなるポリメラーゼ連鎖反応アツセイ法。 １０．抗原に関するアツセイ法において、次の工程：（ａ）検出すべき抗原と、 この抗原に対する酵素標識抗体と、ビオチンが抗体に結合している抗原に対する 抗体と、ストレプトアビジンまたはアビジンとの間で溶液中で特異的結合錯体を 形成し；（ｂ）特異的結合錯体を含有する溶該を多孔性フィルター膜上に分散し た蛋白質に結合する複数のビオチンを有する黄白質を有する多孔性フィルター膜 を介して濾過し、その際ビオチンが膜に特異的結合錯体を結合し；かつ （ｃ）膜上の酵素を検出する； からなる抗原に関するアソセイ法。 １１．次の工程： （ａ）膜に直接または間接的に結合するハブテンを有する多孔性フィルター膜を 介して抗−ハブテンを含有する溶液を濾過し、その際ハブテンと抗ハブテンとの 間の結合が膜上に抗ハブテンを捕獲し；（ｂ）測定すべさ物質のための結合位で 改奕した抗ハブテンを結合する物質を含有する溶液を多孔性膜を介して濾過し、 その際抗ハブテンを結合する物質：を膜上に捕獲し； （ｃ）測定すべき物質を含有しているか、または含有していると思われる溶液を 膜を介して濾過し、この際測定すべき物質が膜上に捕獲され；（ｄ）測定すべき 物質を検出可能な標識で標識し、かつ （ｅ）標識を測定する； からなる逐次アツセイ法。