JPS6182166A - 分析対象を検出し測定する免疫アツセイ系及びアツセイ方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、分析対象を定量的Ｋ及び／もしくは定性的に
アッセイ（検定）する方法及び装置に関する。

従来の技術 固相免疫アッセイは、所定標本中の未知の材料（分析対
象）を検出し測定するもつとも特徴的かつ敏感な方法を
提供する。この方法の実際的な使用分野は今日極めて限
定されているが、固相アッセイの種々の変形法が開発さ
れており、初期の液相免疫アッセイ（例えばゲル拡散、
沈澱、凝着）を新しい世代の免疫アッセイで代替するた
めの改良方法も提案されている。固相アッセイはよシ複
雑であり、よ）精密で複雑な技術を必要とするが、よシ
敏感であり定量作業によシ適している。固相免疫アッセ
イの今日の技術水準及び適用は米国特許第３．６５４，
０９０号及び４，２９９，９１６号に詳しく記載されて
いる。

簡単にいうと、現在の方法は、既知抗原に対する抗体、
或いは抗原である限シ、即ち特定の抗体が結びつく材料
である限ル未知分析対象を測定することが可能である。

未知対象の性質に従い、即ちそれが抗体であるか抗原で
あるかによって、特定の対応体（受体）が例えば試験管
の内壁、浸漬片或いはビーズ等のような固体面に固着さ
れる。分析対象はかくしてその固相受体に結合する。結
合した分析対象の存在及びその量はラベルした分子（プ
ローブ）によシ決定することができる。プルーブは分析
対象それ自体（競合的なアッセイ）或いは分析対象に対
する抗体（“サンドイッチ”アッセイ）である。

ラベルは放射性（：）ジオ免疫アッセイ）、酵素性（酵
素免疫アッセイ）或いは螢光性（螢光免疫アッセイ）で
あってよい。固相原則はアッセイ系（抗原及び／もしく
は抗体）の未結合ラベル素子及び未ラベル素子の分離を
容易にする。

発明が解決しようとする問題点 固相免疫アッセイの敏感性は特定の場合には良好であり
、特異性は容易に得る仁とができるけれども、アッセイ
はより信頼性を高め、使用しやすくポータプルであるよ
うＫするために改善する必要がある。そのため以下の改
良がなされることが望ましい： イ）試薬を簡単にし安定化させ、それＫよシアッセイ素
子が安価にかつ長期間にわたって保存されるようＫする
。

口）各段階における即時的な、組込み式品質管理モニタ
ー系を設けるようにする。なぜなら材料が古くなシ処理
段階が不適切に行われ、かくして最終的な結果が歪めら
れるおそれがあるからである。

ハ）単一のアッセイで複数の未既知物がスクリーンされ
るような伝染病の鑑別診断を行う。このような診断は好
ましくは最小限の手順で単一の装置を用いて行うことが
好ましい。

二）未訓練現場スタッフがアッセイを行い得られる結果
を視覚検査で分析しうる装置を提供する。

この目的を達成するためには、アッセイキットは保蔵安
定性があシ使用が簡単なものでなければならない。この
ようなキットは最小限の数の素子からなシ、容易に充填
することができ、未知物及び標準値を記録保持しうるも
のでなければならない。

問題点を解決するための手段 本発明の目的の一つはアッセイ法及び装置であって、コ
ンパクトかつ効果的であり、また、エラーの危険を最小
限にするように使用者が注意深く品質対照しうる装置及
び方法を提供することである。

本発明の別の目的は、各成分すべての有効性、及びアッ
セイのタイミングを使用者の意志によって変更すること
のできるアッセイ法及びキットを提供することである。

本発明の更に別の目的は、半定量的な試験が視覚による
検査によって行われ、それＫよシ高価な光学測定装置の
必要をなくするようなアク七イキットを提供することで
ある。それにもかかわらず光学的測定装置を使用してよ
シ正確な定量読取シをすることは可能である。

本発明の別の特徴は、種々の試薬が乾燥しているか或い
は半乾燥状態で保存され、必要な場合、使用する前に再
水和するだけでよいようなキットを提供しうろことであ
る。このようなキットを、アッセイ中試薬品質を保証す
る手段と共に使用することにより極めて強力な診断ツー
ルとなる。

上述目的は本発明によれば、標本における一種もしくは
数種の未知分析対象を検出するための、そして必要な場
合少くとも半定量的に測定するための固相免疫アッセイ
系を用いて達成される。本発明によシアッセイされる分
析対象の例は、プロティン、核酸、炭水化物、多Ｗ類、
脂質、或いはこれらの組合せからなる群から選ばれる分
析対象である。とのアッセイ系は分析対象受体を結合し
た固体支持体を含り０受体は支持体上の異なる位置で結
合している。同じ固体支持体上に相異なる分析対象を結
合させる相異なる受体があってもよく、それによ）従来
の複数の、連続的なアッセイに比較し、−回のアッセイ
で鑑別診断が可能になる。アッセイされる標本溶液は一
つ以上の分析対象以上を含んでもよく、それによシ疑い
のある標本は一つ以上の分析対象にりいて同時にアッセ
イすることができる。できるだけコンパクトにした手段
が設けられてシフ、分析対象を固体支持体と接触するよ
うにする。特定の分析対象が存在するか否かの指示のた
めの測定可能な信号を発生しうる信号発生系が使用され
ており、これは、分析対象に結合するラベルしたプロー
ブであってもよく、或いはプローブに結合するラベルし
た抗体と組合せた分析対象に結合する非ラベルプローブ
であってもよい。本発明によるプローブはプロティン、
核酸、炭水化物、多糖類、脂質、或いはこれらの組合せ
からなる群の中から選ばれる。

固体支持体それ自体は種々の形のものであってよく、例
えば平板な矩形シート、丸いシート、棒、スティック、
円筒体などであってよい。好ましい支持体は平板な矩形
シートである。明らかな理由によ抄固体支持体は水に不
溶でちシ可撓性のあるものであることが好ましい。固体
支持体はポリビニル、ポリスチレン、セルリーズ、ナイ
ロン或い拡ガラス（例えば固体、繊維質等の）からなる
群から選ばれた材料から製造する。

受体は通常疑いのある分析対象によって選択する。例示
すると、受体はプロティン、免疫グロブリン、核酸或い
は多糖類から選ばれるものであってよい。使用される特
定のグ田プリンは固体支持体に対し結合しうるものでな
ければならない。

受体は当然ながら固体支持体に着合するものである。あ
る場合には、受体及び／或いは支持体は着合しうるよう
に改質しなければならない。このような技術は例えば米
国特許第４，２９９，９１６号に開示されており、これ
においては結合基を使用して受体を固体支持体の表面に
着合する方法が開示されている。好ましい着合方法は、
背景ノイズを最少にするものであプ、受体と分析対象も
しくはプローブとの間の活性に干渉しないようＫするも
のでなければならない。

支持体上の結合力を増大させるために、固体支持体は、
受体が補足的な結合位置に結合される前に液体の溶液で
処理してもよい。このような方法はフィッシユ　アンド
　ノイズ（Ｆｉｓｈ　ａｎｃＬｚｌｔｔ　）の論文（ア
ース　ルム（Ａｒｔｈ　Ｒｈｕａ＋）誌ス号、５３４ペ
ージ、１９８１年）に開示されている。固体支持体拡分
析対象の溶液に浸漬、滴下、或いは支持体の受体位置に
標本を塗シつけることにより、標本と接触される。多Ｎ
類の分析対象を試験する場合、固体支持体を標本と接触
させ、この際受体−分析対象の結合する対にもっとも好
ましい物理化学的条件のもとで接触が行われるようにす
る。

必要な場合缶処理が終る毎に固体支持体を洗浄し、最初
の洗浄は支持体が標本と接触した後行う。

洗浄溶液は好ましくは０．５ＭＮａｃ１である。

溶液は遅延剤、例えばＢＲＩＪ３５を含有するようにし
てもよい。

プローブがラベルされると、ラベルされたプローブ状分
析対象に対するラベルし九受体或いはラベルした抗体で
あって、サンドイッチ状に形成される。例示すると、ラ
ベルしたプローブ社標本中の抗体分析対象を検出し測定
するための、アッセイにおける免疫グロブリン型の分析
対象に対する抗体であってよい。

ラベルそれ自体は放射性もしくは酵素的なものである。

本発明により使用しうる酵素ラベルは、例えば過酸化酵
素或いはグルコースオキシダーゼであって両者共着色反
応を生成するものであるが、勿論他の顕色酵素基体の組
合せであってもよい。

本発明の好ましｈ態様においては、ラベルは溶解性ある
無色の色素を不溶解性染料に変換する物質であり、色素
は結合ラベルの位置で沈積して色素反応を生ずる。或い
は、ラベルは不溶性無色色素を結合ラベルの位置で不溶
性着色染料に変換して観察及び測定が可能になるもので
あってもよい。

分析対象が核酸である場合、ラベルした抗体は標本中の
核酸を検出し測定するために使用される。

例示すれば、ラベルされた抗体は抗二重ストランドＤＮ
Ａ抗体であってもよい。

分析対象が核酸である場合、あらかじめ化学的調質を施
こされるようにしてもよく、この場合ラベルされた抗体
は、化学的に調質を施こされる抗体でらりてよい。ある
実施態様によれば核酸は、例エハレ７コビッツ及びパー
ニス（アカデミツクプレス１９７９社）の“イムノロジ
カル　メソッド（工ｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　ｍｓｔ
ｈｏｄｇ）”の１３７−１５０ページにキー７アーによ
υ開示されているように硫酸ピクリルにより改質するよ
うにしてもよい。

別の実施態様によれば、核酸は例えば国際出願の国際公
開番号ＰＣＴ　ＷＯ３３１０１４５９Ｋ開示されている
ように未ラベルプローブとして利用されるものであって
もよい。核酸は化学的に改質され、結合分析対象と共に
熱処理されうるものである。ラベルした抗プローブを次
に使用する。これは化学的改質を受ける抗体である。未
ラベルプローブは、化学的な改質を受ける前は、結合し
た受体と同じであってよい。未ラベルプローブは好まし
くは硫畿ピクリルによって改質される。望ましい場合に
は、未ラベルプローブは化学的な改質を受ける前に水解
して核酸の小片にしうる。

本発明によれば、すべてのアッセイ素子ではないとして
も少くとも一部の適切な活性をモニターするため、また
処理時間及び条件を管理するために品質管理系が設けら
れてｂる。

品質管理系は下記を含む： ０　　染料−基体系の活性の管理； （ｂ）　　受体の管理； （ｃ）プローブの活性の管理；及び、 （ｄ）十分の処理時間の管理。

アッセイの種々の素子は、管理物質を固体支持体上の特
定域に結合させることによる適切な活性のためにモニタ
ーされる。調整物質は一般的にプロティン、核酸、炭水
化物、多糖類、脂質、及びこれらの組合せからなる群よ
り選ばれる。

かくして複合体を形成し染料−基体顕色系と反応する酵
素は支持体く結合し、染料−基体系の活性の管理をなす
。

これに加え或い紘これと別に、分析対象に対応する物質
を適切なプローブ分析対象活性の試験をするため支持体
に結合してもよい。管理域及び受体城から生ずる信号の
顕色化石、この信号を標本からの結合分析対象によシ生
ずる信号と比較する。

比較によシ結合分析対象の存在及び／もしくは存在の大
きさがわかる。この方法はまた、プローブ含有溶液の活
性に関する管理ともなる。なぜなら十分に活性でないと
すれば、十分な着色反応が得られないからである。

また、ラベルしたプローブ或いはラベルした抗プローブ
のラベルの活性もまた、支持体上の特定域であってアビ
ジン、ビオチン、測定可能な信号を生ずるプローブもし
くは抗プローブ複合体を生成する抗体或いは受体からな
る群より選ばれた物質が結合されている域とプローブを
接触することＫより管理される。

結合プローブ（或いは抗プローブ）の存在は観察によシ
半定量的に、或いは従来の器具によシ定量的に測定され
る。

本発明は、種々の試薬が液体型、乾燥警戒いは半乾型で
収容されており、アクセイ法と関連して使用する容器に
関する。必要な場合、試薬は使用前に再構成される。容
器は個別の小室を有し、この中でアッセイの各処理が個
別に行われる。かくして小室のそれぞれは、アッセイの
各処理段階に対応する相異なる試薬が収容されている。

個別小室のそれぞれはオリフィスを有し、これを通じ液
体が試薬を再構成するために注入される。

オリフィスは各小室底部でゴム隔膜を被諷するようにし
てもよく、それによシ湿気に過度にさらされることを防
止する。小室は同様に頂部に開口を有し、開口はゴムス
トリップにより被覆され、ゴム小室は開口を有し、これ
は通常閉止されているが支持体の挿入及びとシ出しは可
能である。開口は勿論支持体の形状に対応しておシ、例
えば細長いもの或いは丸いもの等であってよい。長い開
口である場合、このゴムス）ＩＪツブの開口は各小室の
内壁と平行している。開口の長さは、支持体の挿入及び
取出しを可能にするため少くとも固体支持体の幅の長さ
を有していなければならない。

各小室は試薬を充填されており、接着テープで別々に密
閉されている。

固体支持体は所定の時間適当な小室に浸漬され、長手ス
リットを有するゴムカバーストリップを頂部に有する開
口から引き出される。ゴムストリップのリップは拭う作
用によシ固体支持体から試薬をより完全に除去する。リ
ップは所望の拭う作用を行いうるほどに閉止していなけ
ればならない。

本発明は更にホースラディッシー（ワサビ）過酸化酵素
の存在を検出する方法に関し、この方法は、ホース２デ
イツシエ過峻化酵素を含有することが疑われる物質をヨ
ウ化カリウム、澱粉及び過酸化水素と接触させることを
含ｂ０ ヨウ化カリウム、澱粉及び過酸化水素はｗＡ濁濁液−は
ゲル状であってもよい。過酸化水素は、グルコースオキ
シダーゼをグルコースとその場所で反応させ過酸化水素
を生成するようにすることによ）得られる。

好ましい実施態様の説明 本発明はすぐれた品質管理を可能にするような態様で、
分析対象を定量的に及び定性的に分析することが可能な
方法及び装置に関する。

本発明によるアッセイ系は、単一の標本から複数の分析
対象を分析する場合、即ち多分析対象アッセイＫ特に適
用しうる。この多分析能力は、一種以上の分析対象が疑
わしい場合における一種以上の分析対象を分析しうる利
点となる。このことは、鑑別診断を行う場合、また複数
のアラ七イが通常必要とされる場合に特に有利である。

本発明は、伝染病の鑑別診断において特に価値がある。

現在の技術水準ではこのような伝染病の免疫診断は微生
物があらかじめ分離され、培養され、微生物学的、ウィ
ルス学的及び／もしくは生化学的手段によシ同定されて
後にはじめて可能となる。現在の免疫診断学的アラ七イ
は“群抗原″を検出するのみでアシ、従ってこのような
方法は分離されたｍ苗が属する群或いは菌株を特定する
ことができるだけである。このような試験は疫病学的研
究には重要であるけれども、同じ菌の非病原性分散のた
めには十分に特定性を有するものではない。

本発明の方法は、一つの標本における複数の分析対象の
鑑別アッセイな可能にする。

例工ばエシェリヒア　コリ（Ｅ８゜ｈｅｒｉ。ｈｉａＯ
ｏｌｌ）族の細菌は人間及び動物小腸は正常に寄生する
が、時によシ病原性となる。病原性となった時、病原性
変種は、正常な変種と同じ群抗原を有するかもしれない
。病原性細菌を区別す同定するもっとも特定的な方法は
その“発病力因子”によるものである。このような因子
は、細菌が宿主に侵入し発病させるようにする構造成い
は分子である。このような因子のいくつかは外毒素、ヘ
モリシン及び着生因子である。

第１表はある種の病原性細菌、及びその特定の発病力因
子であって本発明による伝染病の多分析対象鑑別診断に
おける抗原となシうる因子のいくつかをリストしたもの
である。第１表は勿論説明のためだけのものであ）、本
発明を限定するものではない。

第１表 細　菌　　　　　　　　病原性因子 バチルス　アントラシス　　　浮腫生成毒素複合体ボル
デテラ　ペルツシス　　　　　ペルッシス毒素コルネパ
クテリウム ジフテリア　　　　　　ジフテリア毒素ニスへりヒア　
コリ　　　　　熱不安定腸毒素スタフイロコカス オウレウス　　　　外葉状毒素；島毒素ストレプトコカ
ス ピオゲネス　　　　　赤血球生成毒素。

鑑別検出は核酸分析対象にも有用である。この場合、基
体に着合する補完受体も核酸の補完ストランドであって
よい。単一ストランドの核酸が分析対象である場合、あ
らかじめ処理をすることなく受体に結合しうる。分析対
象が二重スト２ンド核徴である場合、分析対象の変性が
、分析対象を受体にさらす前に必要である。

第１表は、核酸の鑑別検出が有用であり、従って本発明
の方法の価値を向上させる例をリストしたものである。

第■表 Ｌ　ビールス性伝染−潜伏感染の検出（ヘルペス、パリ
セラーシスター、ΣＢｖ）： 脳背髄炎：ｉ＃疹或いはルベ ラ（鑑別診断）。

２　遺伝性疾病　　−初期診断（両親及び胎児における
）。

第■表は症候が同様な病気の群の部分的なリストであり
て、抗原及び／もしくは抗体の検出状鑑別分析において
有用なものである。勿論、リストはすべてを含むもので
なく本発明を限定するものではないっ 第■表 症候　　　　病因 ンフルエンザＢ菌、アデノ ビールス、ヘルペス、コク サラキー、エプスタイン パール　ビールス。

中膜耳炎　　　　　　連鎖肺炎歯、■、インフルエンザ
菌、化膿連ｒＲ球菌、葡 萄状球菌、プロテウス、プ ソイドモナス属。

インフルエンザ　　　種々の血球凝集素及びシアリダー
ゼ型。

口内炎　　　　　　　ステマイトの使用を避けるために
必要なヘルペスとそ の他の間の鑑別診断。

髄膜炎　　　　　　　Ｈ，インフルエンザ菌、ＭＭ炎菌
、連鎖肺炎歯、葡萄状 球菌、醇母菌症菌、ヘルペ ス　シンプレックス。

耳下腺炎　　　　　　おたふくかぜ、インフルエンザ、
パラインフルエンザ、 葡萄状球菌、ストレプトビ リダンス、肺炎球菌、大腸 菌、ヘモフイリス。

百日咳　　　　　　　百日咳菌、パラ百日咳菌、アデノ
ビールス。

肺　炎　　　　　　　連鎖肺炎歯（肺炎球菌）、ストレ
プト　へモリティク ス、化膿連ｆＲ球菌、葡萄状 球、菌、Ｎ！ｉＩ炎菌、肺炎タレ プシエ２、大Ｓ菌、エール ギノーザ、インフルエンザ 菌、肺炎マイコプラズマ、 レギオネラ　ニエーモフイ ２、種々のビールス。

下１１　　　　　　　　シゲラ　スピロヘータ、サルモ
ネラ　スピロヘータ、 大腸菌、ガス菌、ビブリオ ハラへモリティクス、コレ ラビブリオ、カンピ四バク ター　７エツス、エルジニ ア、エンテロコリティク、 ロタビールス。

尿路威染症　　　　　大腸菌、プロテウス　スピロヘー
タ、アエロバクタ− スピロヘータ、ストレプト ７アエカリス、葡萄状球菌、 プソイドモナス　スピロへ −タ、その他。

本発明はまた、同じ標本から単一の基体くより抗原と抗
体の両方のアッセイを同時に行うことを可能とする。こ
のような方法は、過剰量の抗原が病気の回復期を意味し
、化学療法がもはや必要でないことを意味する場合に、
伝染病の診断に有用である。

以下は本発明によシ共にアッセイされる抗原−抗体の例
である。

第■表 エニーカッスル病 百日咳 麻疹 インフルエンザ 肺炎 上記かられかるように、本発明の方法を用いて以下の生
成する受体−分析対象対：ホルモン及びその受体；種々
の薬品、化学品及びビタミン類とその受体；神経トラン
スミツター及び阿片剤と七〇受体；酵素及びその基体、
毒素とそり受体；を検出することによ）他の分析対象を
検出しうる。

本発明の説明のため、′受体（ｒｅｏｅｐｔｏｒ）’な
る用語はその亀っとも広い意味で使用されており、分析
対象に対し結合及び／もしくは着合しうる物質であって
、結合した材料がその後使用或いは処理しうるよう、好
ましくはその同定及び／もしくは定量が容易になるよう
にしうる物質を指し、例えば普通に使用される受体はダ
マティン類である。

本発ＢＡ系は発病力因子例えば外毒素、着生因子、ヘモ
リシン；核酸；ホルモン：薬剤；化学品；ビタミン；神
経トランスミツター：阿片剤；酵素；つ素管；の存在の
分析に有用であるっ 本発明の一つの好ましい面は、複数の受体であってそれ
ぞれ相異なる分析対象に結合する能力のある受体を有す
る固体支持体を用いてアッセイな行いうろことである。

固体支持体は分析される溶液に不溶であ）、操作が容易
であるように十分に可撓性を有することが好ましい。

本発明の支持体は種々の形態のものであってよく、円形
、平板状、カード状であってよく、例えば正方形、矩形
等の平板状或いは筒状の棒、スティック、円筒体などで
あってよい。使用される支持体は使用中その全体的な形
状を保持することのできる材料から形成する。本発明に
よる好ましい形態の支持体はシート状のものであって円
形であってもよいがよシ好ましくは矩形のものである。

このような基体はポリビニル、ポリスチレン或いは高価
Ｍｇリスチレンから作るが、勿論他の材料から形成して
もよい。支持体の形状及びその製造材料は使用の状態に
よシ変えてもよいことは明らかである。

本発明によれば複数の受体が支持体の固体面に結合して
いる。使用される受体の数及び種類は予測される分析対
象に依存する。特定の分析対象に対しそれぞれ特異性の
ある相異なる受体がかくして使用される。

これら相異なる受体は支持体に様々の方法で結合する。

免疫グ四プリン（抗体）及び多くのプロティン抗原は自
然的に種々のプラスチックス、例えばポリスチレン及び
ポリビニル、或い紘その他の重合性物質、例えばセルロ
ーズ及びナイ田ン、或いはガラス繊維に結合する。高衝
撃ポリスチレンは特に好適な固体支持体である。これは
プロティン抗原と良好に結合し、アッセイの後の段階で
背景活性が低いからである。また支持体拡、その表面積
を増加させる目的でニトロセルローズなどのポリマ一層
その他の物質で被覆した材料からなるものでらりてもよ
い。　　　　　　　”単一ストランド接置もまた上の段
階で述べたような物質に自然的に結合する。二重ストラ
ンド核酸はこのような物質と共に使用する時はあまシ広
範囲に結合しない。このため二つの方法が考えられる。

第一の方法によれば、二重核酸はカチオンポリマー、例
えばボリーレーリジンによって支持体に結合される（フ
ィッシェ　アンド　ライ７、アーツ、ロイム（Ｆｉｓｈ
　ａｎｄ　Ｚｉｆｆ、ムｒｔｈ、Ｒｈ＠ｕｍ、　）ス巻
５３４号、１９８１年に開示される方法による）。

第二の方法によれば核酸は支持体それ自体が活性化した
後共有結合的に結合する。セルローズ紙のような支持体
を活性化するために種々の方法があり、このようなセル
ローズ紙は例えばシーライヒヤー　アンド　シェール、
或いはオージェエックス　Ｈテッドのような種々の供給
元から市販されている。

セルローズを活性化させるための一つの方法は塩化シア
ヌール豪な使用するものである。このシアヌールｍは従
前は例えば紙のような平板な面体に適用されていなかっ
たがもっとも好都合で経済的であることがわかった。同
じ方法はより滑面状の物質、例えばセルローズ、酢歳セ
ルローズ、硝酸セルローズ或いはアガローズＮ膜につい
ても適用される。

多糖類は、ポリマーに自然的に結合しないという点で二
重ストランド核酸と同様である。しかしこれらは別の荷
電ポリマー、例えばポリーレーリジンによシブラスチッ
クに結合することができるが、プラスチックＫｇ＆収さ
せる前Ｋｊｉ”ｆｆつ化Ｃ醗豪化によシ、そしてシッフ
の塩基形成によシブロチインに共有結合することができ
る。繰シ返すが、この塩化シアヌール酸活性化法は多糖
類をもセルローズ性物質に結合させる丸めに使用するこ
とができるのである。

低分子量の物質紘通常直接には固体支持体に結合せず、
従って固体支持体に結合する前に先ずスペーサ分子、例
えばプロティンに結合させなければならない。米国特許
第４，２９９，９１６号は、受体な固体相支持体に結合
させる種々の方法をｆｌＩ＆観している。

支持体のあらかじめ設定した位置へ選択的に結合する受
体は、勿論、アラ七イされる分析対象により変化させて
よい。従って所定の分析対象、或いは一群の分析対象に
対して受体は特定の抗体でなければならない。分析対象
がある抗体である場合、受体は対応する抗原である。

一種のもしくは複数の受体が例えば吸収及び／もしくは
吸着によシ支持体に結合した後、特に受体がプロティン
である場合、支持体を希釈した洗浄剤で洗浄し、それ以
上プロティンが結合しないようにする。ある場合には結
合したプロティンと異なる別のプロティン溶液による表
面上の“ブロッキング或いは“飽和”が、例えば米国特
許第４．２９９，９１６号に記載されているように必要
である。

支持体表■が化学的に活性化した場合には、適当な薬剤
によシある条件下において不活化させることが必要なこ
とがある。例えば塩化シアヌール酸活性セルローズが支
持体として使用された時ＰＨ８，０で１Ｍのエタノール
アミンによる不活性化が好ましい。

受体の活性に依存して、使用前の保東中受体を保設する
ために特別な注意が必要な場合がある。

更に、受体によっては特別全乾燥法が必要である。

支持体に受体が結合すると、得られる量、標本の供給源
及び支持体の形に依存して種々の方法で分析対象を含む
標本が支持体に適用される。

このように処理し九基体は十分な時間、そして適当な条
件下に、分析対象を含む液と接触させ、種々の分析対象
がそれぞれの受体に結合するようにする。事情に応じて
このような接触、適用は、基体を分析対象を含む溶液に
浸漬すること、分析対象で塗布することにより行っても
よい。

第１図に示すようなカード状の支持体１１を使用する場
合、標本が液体の場合にはカード１１全体を標本中に浸
漬してもよい或いは標本それ自体を固体支持体１１の適
当表スペースに塗りつけるようにしてもよい。カードに
はアラ七イの種々の係数を監視する管理点１３と、受体
処理域１７と比較するための標準曲線を与える標準点１
５が被覆しである。

他の分析対象−受体対は他の条件を要する。固体もしく
は半固体標本、例えば細菌培養体、組織等は受体−被覆
基体表面に適用する前にある程度の機械的及び／もしく
は酵素的均等化が必要である。この処理段階中、夫々の
分析対象−受体対の物理化学的条件は最適なものにして
おかなければならない。このことは抗原−抗体相互反応
、例えば中性９１以上である等室環境が最適なものでな
ければならないことを意味する。受体結合後固体相を洗
浄するために同じ洗浄剤を組み込むようにすることは、
反応の特異性を実際的に増大し、後の段階における望ま
しくない背景反応を減する。

勿論、分析対象と受体との相互反応のために十分な時間
が与えられなければならない。物理化学的条件は変更す
ることができ、例えばより高い温度、或いは相互反応す
るこの混合物中にある種のポリマー、例えば４Ｘポリエ
チレングリコール６０００を含有させるようにするとと
Ｋよって、必要な場合接触時間を短縮させることができ
る。

一旦基体に結合すると、支持体を洗浄して不要な過剰分
を除去する。引きつづく洗浄処理は、あらゆる固体相免
疫アッ七イの場合と同様に極めて重要である。このこと
は本発明による多分析対象系の場合に特にあてはまる。

洗浄処理は洗浄剤、例えばＢＲＩＪ　　３５Ｔ、或いは
その他の適当な洗浄剤を用いて行ってもよい。

本発明によれば洗浄処理は、支持体から過剰液を絞シ出
す絞シ作用を適用することによりて容易になる。洗浄し
た、分析対象含有支持体を次に顕色処理して分析対象の
存在について定量的及び／もしくは定性分析を行う。こ
の顕色処理は着色反応、放射性免疫アッセイ、或いはサ
ンドイツチ法によシ行りてもよい。

種々の分析対象の同定は支持体上のその位置を単に観察
することＫよって行う。なぜなら分析対象は、支持体上
の所定位置に既に位置しているレセプタ１７に着合する
からである。かくして支持体の所定位置の陽性反応を検
査するだけで疑いのある分析対象の存在がわかる。

洗浄した支持体はフィールド条件下でもあるいは実験室
内でも顕色処理できる。

結合した分析対象を検出するために使用するプローブは
通常、問題となっている分析対象に対するラベルした受
体である。プローブは受体−結合分析対象に特異的に結
合し、これと関連するラベルによって検出し定性化する
ことができる。

抗原に対する免疫アッセイにおいて、プローブは好まし
くは固体支持体に結合された受体と同じであることが好
ましい。固体支持体受体が抗原である場合の抗体の免疫
反応においては、プローブは免疫グロブリン型の分析対
象抗体に対する抗体であることが好ましい。例えばラベ
ルした対人間免疫グロブリンは入間の抗体に対するプロ
ーブとなシうる。

プローブ抗体は放射性アイソトープ、或いは例えば米国
特許第３，６５４，０９０号及び４，０９９，９１６号
に記載されたいるような公知方法による種々の酵素を用
いてラベルする。

本発明において、種々のプローブ位置で非溶解性着色反
応を生ずる酵素、例えば過酸化酵素、グルコース酸化酵
素、或いはベータガラクトース酵素を使用することがで
きる。

本発明においてはまた放射性ラベルも使用することがで
きるがその結果は検出が若干複雑になシベースがおちる
。従って本発明の目的のためには、酵素法の方がよシ好
ましい。

ある場合には未ラベルプローブを使用し、このプローブ
を、ラベルした物質、例えばプローブに対する抗体、で
検出することが望ましいうこのような方法はよシ高い背
景反応を引き起こす一方敏感性を増大させる。この方法
は既に公知であり、例えばバイオケシストリー、Ｊ　、
　８８　：　１３７．１９６３のヘイル及びランドルの
論文に開示されており、これ以上ここでは述べない。

処理手順 支持体に結合する二重ストランド核酸分析対象の場合、
プローブを得るための三つの一般的な方法の一つを採用
してもよい。

手順Ｉ 抗二重スト２／ドＤ　ＮＡ　（ａｎｔｉ−ｄａ　ＤＮＡ
　）抗体を全身系ａｆＭ紅斑症患者もしくは同等の病気
な有する動物から分離する。抗単−ストランドＤＮＡ抗
体は先ず適当なｇ＆収法によシ除去されなければならな
い。残る抗−ｄａＤＮＡは最初にラベルされ直接に使用
され、結合して二重体を形成する分析対象物質を同定す
る。或いは、未うベル二重結合抗−（１１１ＤＮＡ抗体
を、この二重体が支持体に結合している間にラベルつき
抗免疫グレプリン抗体で検出するようＫしてもよい。

手順■ 分析対象標本を先ず化学的に調整し、免疫反応基を標本
に１その立体構造を実質的に損傷することなく添加する
。単純な化学調整剤の例は硫酸ピクリルであって、これ
はＴＮＰ（トリニトロ７エ二ル）群を核酸分析対象のア
ミン類中に導入する役割をする。抗−ＴＮＰ抗体の生成
によく知られた手順によればよく、例えば１９６９年ニ
ー−ヨークのスブリンガー　７工ルラーク社の１免疫化
学における基本実習（Ｂａｍｉａ　Ｈｘｅｅｒｃｉｓｌ
ｓ　ｉｎ工ｍ−ｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　）”、ノ
ートニ著に開示されている。免疫反応基を核酸中に導入
する別の方法は、ボベレニイほかのＪ、イム／ル、メソ
ッド（Ｊ。

工ｍｍｕｎｏ　ｌ　、Ｍａｔｈｏｄａ　）　１６　：　
３１３．１９７９年、に記載されている。核酸に対する
ラベルされた抗体の調整剤は、結合した分析対象を検出
するプローブとして使用される。

手順■ 受体と同様の核酸分子は生体内で免疫反応基を、上記手
順■に記載された方法或いはその他の方法によシラベル
される。これら分子を次にゆつくシと加水分解され、プ
ローブとしての役をなす核酸の小片を生成する。これら
プローブを次に穏やかな変成条件下（６０度０，２０−
４０％ホルマリン）で結合した分析対象の一部と共に焼
きつける。焼きつけ後プローブを、すぐ上に記載したよ
うにして免疫反応基に対する抗体によシ検出する。

酵素ラベルを使用する時、色素反応を顕色化して結合し
た酵素ラベルしたプローブを検出するようｋする。本発
明によれば、酵素色素反応を顕色化する好ましい方法は
、過酸化酵素をラベルしたプローブを使用するかその他
適当な酵素であって、溶解染料を結合酵素の位置に沈澱
する不溶解染料に変える酵素を使用することを含む。

別の方法によれば、使用する未着色染料は、着色反応に
変える前に既に不溶性であってもよい。

不溶性になシうる染料を使用することは本発明に訃いて
極めて重要である。何故なら染料の位置状、正確な同定
が可能であるようにするためには、酵素ラベル抗体プ冒
−プの位置と一致していなければならないからである。

過酸化酵素の局在化のための公知の方法の一つはバラケ
ル及びラニーライン（Ｇａｍｅ誌１１１４９．１９８１
年）Ｋよシ細菌コロニー面上のプロティンを検出するア
ラ七イの一部として記載されている。

この方法は、平板な固体支持体（酵素をラベルしたプロ
ーブを有する）を基体及び過ｍ化酵素の染料系を含有す
るゼラチン基質ゲルの間に接触させることを含む。この
方法は研究所の実験室条件下で適用しうるけれども、現
地条件下で使用することができるようにキットを設計す
ることが困難である。

かくして本発明の別の局面においては保蔵にすぐれ現地
使用ができるように設計された酵素顕色基体系が提供さ
れる。酵素ラベルの基体である過酸化水素は極めて不安
定であり水性溶液中で自然溶解する。従って本発明によ
れば以下の基体系が提供される： （ａ）　　セルロース主体シートであって紙、セルロー
ス膜等からなシ、染料及びバッファを含有し、高温でゼ
ラチン主体流体ゲルで含浸され、自然乾燥或いは凍結乾
燥によシ乾燥しうるようなシート。使用前にシートは過
酸化水素と５０Ｘメタノールの溶液に浸漬され、次に顕
色化のため過酸化酵素と酵素を有する固体支持体に接触
させる。

（ｂ）上記（ａ）と同じ方法が採用されるが厭それ自体
もグルコーズオキシダーゼを含浸するように処理される
。使用前にはこの紙が希釈した古いグルコーズ溶液（２
Ｎ濃度）Ｋ浸漬される。過酸化水素がグルコーズオキシ
ダーゼにより生成され、試薬キットをより安定なものと
する。

（Ｃ）染料基体の試薬混合物は完全に乾燥し、下記　　
　゛を含む： （１）　　活性化するために加熱する必要のないゲル化
剤、例えばインスタント澱粉、アルギン酸ナトリウム； （２）必要な場合ゲル化開始剤、例えばアルギン２ｊＪ
［のためのカルシウムイオン： （３）　　グルコーズオキシダーゼ及びグルコース（過
酸化水素源として； （４）染料； （５）バッファ系；及び （６）起活剤（常に必要ではないが、混合及び反応促進
のための化学的手段として使用されてもよい）。

この方法を用いてこの基体混合物は適当な溶媒、例えば
水、或いは水とアルコールなどに懸濁されろうこの平板
な固体相支持体は懸濁液中に浸漬されｊちに取シ出され
る。色素反応はゲル中で発生し、支持体の平板面に着合
する。色素が顕色化した後ゲルｉＬ、　壱浄され固体支
持体から除去される。

（ｄ）　　この方法は上記（０）と同じであるが、染料
でなくヨウ化カリウムが添加される。ヨウ化イオン社、
過酸化酵素によシ触媒される反応に対する電子ドナーの
後をなす。かくして生成された分子ヨードはゲル化剤で
ある澱粉と結合し、見ることが可能な青色ｖ１１倉体を
生成する。

明らかなことであるが上記検出方法のそれぞれには、グ
ルコースオキシダーゼでラベルしたプローブを使用する
ことができる。この場合、グルコーズと過酸化酵素はす
べての基体−染料混合物中に含まれていなければならな
い。

上記の固相支持体に基体−染料混合物を着合する方法は
、他の酵素ラベルで行うこともでき、この場合基体組成
を適切に変化させる。

このほかの染料生成系がバイオ　ラッド　プライス　リ
スト（Ｂｉｏ　Ｒａ１ｉＰｒｉｃｅ　Ｌｉ５ｔ　Ｊ）、
１９８４（１６９ページ）Ｋ記載されており、この会社
或いはその他の化学会社（例えばシグマ）から市販され
ている。この系は、電子ドナー色素形成基体としての４
−クロｏ−１−す７トールを主体とする。

その還元（無色）形態では、この物質はアルコール：水
の混合液に溶解する。過酸化酵素及び過酸化水素の存在
下では、この物質はブルーブラックの沈澱物を形成する
。この方法を用いて、過酸化酵素或いはグルコースオキ
シダーゼをラベルしたプループは、プローブを着合した
固体支持体を、４−クロロ−１−す７トールと過酸化物
の溶液（過酸化酵素をラベルしたプローブの場合）もし
くはグルコースと過酸化酵素の溶液（グルコースオキシ
ダーゼをラベルしたプば一プの場合）に浸漬することに
より検出することができる。

実施例 例１ ヨー化カリウム−過酸化酵素のための澱粉検出９．２２
グラム／リツトルの１価水和物クエン酸、２１．５２グ
ラム／リツトルのＮａｔ　ＨＰ　０４を水中ＫＦＩ！濁
させ、完全に溶解する。０．５−１．０グラム／リツト
ルの馬鈴署澱粉或いは溶解性澱粉を水中に！％！濁させ
る。この澱粉を沸濡し冷却するととくよ）溶解する。こ
の二つの溶液を１：１の割合で混合スル。ヨウ化カリウ
ムを３ｍＭ最終となるまで添加し、トルエンを必要な場
合保存剤として０．０３！Ｘ最終まで添加する。ろ過紙
にこの溶液を含浸させ、乾燥して指示焉となるようにす
る。

使用前にこの指示紙を過酸化水素２Ｘ１０−’％中に浸
漬する。再度水和した指示紙を、プローブを着合した支
持体と接触させることにより使用すると、指示紙上に発
色反応が現われる。

馬鈴署澱粉に代えて高濃度で（材料に依存して全混合量
の１−１０Ｘｖ／ｖ　）急速ゲル化澱粉を用いてもよい
。この場合にはすべての成分はその中に固体支持体を浸
漬させる前に乾燥混合し水和していなければならない。

例２ 過酸化酵素のためのクロロ−ナフトール発色混合液 メタノール１−あた＃）３岬の４−クロロ−ｌ−ナ７ト
ールの１容をＴｒ１１！緩衝食塩水（３）ｍＷのＴｒｉ
ｇ、Ｈｃｌ、５００ｆｆｉＭの１Ｎａｃ　ｌ、ｐＨ７，
５）　Ｋ溶解した０、０１ｂ、−ｂ、Ｊ酸化水素の溶液
５容と混合する。この混合液は過酸化酵素に対する完全
な発色混合液である。ろ過紙を先述のようにこの混合液
で含浸し、上述のように使用前に再度水和させることが
できる。

品質管理 免疫学的アッセイキットにおける固有の問題はキットが
多くの試薬を含み、反応を生起させ、これらそれぞれが
不都合に進行して誤った結果をもたらすかもしれない点
である。本発明は、適切な活性のためアッセイの素子の
いくつか或いはすべてをモニターする任意的な系を提供
する。

更に、本発明は視覚的な観察、或いは比較的安価な測定
装置を用いて分析対象の定量分析或いは半定量分析を行
う方法を提供する。

種々の分析対象の定量分析は、支持体を夫々の疑わしい
分析対象に対するある範囲の分析対象濃度のもので被覆
し、次いで基体のこれら管理域を基体の残りの部分と同
じ条件にさらす（標本分析対象を支持体に着合後）。支
持体全体にわたる結果を比較することにより、特定分析
対象の存在に関し良好な半定量読取りを行うことができ
る。このことは、顕色化した受体域の色をカードに結合
した管理分析対象の顕色域と比較することにより可能で
ある。管理部分は固体支持体（第１図参照）のあらかじ
め指定した域の点Ｂとしてあられれている。このような
決定は視覚によシ或いは機器による検査によシ行うこと
ができる。比較を容易にするため、穿孔１９がカードの
引裂線として設けられておシ、これは決められた域がカ
ードの残りの域と分離するために使用され、使用者によ
シ別個に処置される。

抗原分析対象 固体支持体上の点でそれぞれあられされる品質管理が、
以下の試験を行うことによるアッセイのために設けられ
ている： （１）染料−基体が適切に作用していることを確認する
ために、支持体に個別に結合している酵素（酵素系が採
用されている場合）による染料−基体系の活性の管理。

（２）プローブの活性、即ち抗原分析対象に対する酵素
をラベルした抗体の活性が、支持体に対し分析対象を結
合することＫよシそして酵素プローブ含有溶液に対する
分析対象の活性を観察することによ）達成されることを
確認する管理。

否定的外結果である場合、これは酵素プローブ溶液が活
性を失ったことを意味する。或いは、もしくはこれに加
え、支持体が選択された域でアビジンにより被覆され、
酵素をラベルしたプローブがこれに対応してビオチンで
ラベルされ、プローブが支持体く結合するようになって
いることもある。このことは、＃素−染料基体系が適切
に作用しているならば、顕色処理後は肯定的な結果を示
すはずである。

（３）　　処理中を通じ潜伏時間が十分であったことが
、非関連分析対象−受体系を採用することにより達成さ
れることを確認するための管理。管理分析対象は標本溶
液に組み込まれるか、或いは標本が適用される時、固体
支持体に適用される別体の容器にいれられている。プロ
ーブ溶液はまた管理分析対象を含み、非りロス度応性の
管理分析、対象が、処理を受ける分析対象と同じ扱い及
び潜伏時間処理を受けるよう゛にする。

抗体分析対象 抗体分析対象のためのアッセイの品質管理系は以下の試
験を含心二 （１）　　固体支持体に結合した酵素の形態をとる染料
−基体系、即ち上述のアビジン−ビオチン法を使用する
場合の活性の管理。

（２）固体支持体に結合する非クロス反応抗原によシ十
分な潜伏時間があたえられたことの管理。

同種に由来する抗原に対する抗血清が得られるなら、別
の管理液或いは標本溶液に組み込まれるようにしてもよ
い。人間の場合の標本のように抗血清が得られない時に
はＴＮＰ−生型血清アルブミンを使用してもよい。何故
なら食生上の理由から多くの人間は牛の抗原に対する抗
体を保有しているからである。また疎水性パブテンＴＮ
Ｐ（）リントルフェニル）は、清浄な血清から検出しう
る量の免疫グロブリンを結合Ｌｉ（フイシエ　アンド　
ライフ、Ｊ９、Ｉｍｍｕｎｏ　ｌ　、誌、１２８：４０
９．１９８２年刊参照）。

いずれの場合でも、血液銀行プラズマ或いは血清のバッ
チはこのような抗原の存在のためスクリーンされる。十
分に高いレスポンスを示すものは別の管理血清として組
み込まれるか或いは標本溶液中に組み込噛れるようにし
てもよい。

上記例の両方について、それぞれの場合の管理ｌについ
て一寸した問題が存在する。支持体に結合した酵素の貯
蔵寿命はプローブ中の酵素のそれよシ短いかもしれない
。この場合アッセイが行われると酵素はビオチンラベル
をつけることができ、このラベルは、あらかじめ固体支
持体に結合しているアビジン分子に対して分子全体を固
着させるつ従ってアッセイ処理の一部として、対照酵素
を支持体に着合させ貯蔵寿命がＲ題とならないようにし
てもよい。

例３ 染料系に対する管理 山羊の免疫グ四プリンに結合するホースラデイッシー過
酸化酵素（例えばマイルズ社よシ市販されているもの、
或いはＪ、ＩＩｉｓｔｏｃｈｏｍ　、　Ｏｙｔｏｏｈｅ
ｍ　。

誌２２：１０８４．１９７４年のナカネ′及びカワシに
よシ！ｌ！ｌ整したもの）をリン醗緩衝食塩水、ｐＨ７
，５或いはＩＭの二炭畿ナトリウム液、ｐｌＨ９，５中
に１　：　Ｚｏｏで希釈する。この溶液をポリスチレン
支持体面上に適用する。室温（例えば２度Ｃ）で（資）
−ω分経過彼、ポリスチレンな０．８５Ｎａｅｌ中で洗
浄する。ポリスチレン支持体を次にＢＳＡ（牛血清アル
ブミンＯＲＧ　−７、アルマ−社）の１％Ｗ／Ｖ溶液中
にＩ分間浸漬し、先ず０．８５ＸＮａｃｌ中で、次いで
水で洗浄する。或いはＩＸＢＳＡを含有する０、１５　
Ｍの二炭酸アンモニウムと純粋な酵素それ自体（０，０
１−０，１シー）との溶液をポリスチレン面に適用し乾
燥させるようＫしてもよい。

この支持体に結合した酵素を次に基体−染料系にさらす
。

例４ プローブの活性の管理 分析対象が抗体である場合、抗体分析対象を生ずる種と
同じ健康な若い験体から得られた血清を、りん酸緩衝食
塩水（ＰＢＳ　）或いはＩＭの二炭酸ナトリウムｐＨ９
，６中Ｋｌ　：　１０００で希釈する。

この溶液をポリスチレン支持体に適用し、室温で加分間
潜伏させ、０．ＩＸＢＲＩ　Ｊ３５Ｔを含有する０−８
５ＸＮａ　ｃ　１　で洗浄する。

或いは全血清から分離した免疫グロブリンを使用しても
よい。この場合、ＰＢＳ或いはＩＭの二炭酸ナトリウム
と免疫グロブリンとの１０マイクログラム／ｗｔ溶液を
使用する。

抗原である分析対象のために、管理抗原を上述したよう
な方法で固体支持体に着合する。

（＝）　　プロティン抗原、例えば免疫グロブリン、細
菌毒素（百日喉毒素、コレラ毒素、破傷風毒素）、アル
ブミンと共に抗原を１０マイクログジム／−に希釈し、
支持体面に適用する。

（ｂ）核酸及び多ｍ類と共にプラスチック爾に結合する
ことは、ボリーレーリジｙなどのような多カチオン結合
ポリマーにより容易となる。提案された方法がライフシ
ー　アンド　ライフによ、り　Ａｒｔｈ、ｌｈｅｕｍ、
誌２４：　５３４，１９８１年に開示されている。

例５ 十分な処理時間及び適切な扱いのための管理（＝）　　
抗原分析対象として：非り四ス反応抗原として卵アルブ
ミン、キーホール　リンペット　ヘモシアニン（ＣＬＩ
、及び分析対象−受体系と関係しないその他の抗原、の
うちから選ばれた一種の抗原を選ぶ。同じ動物種で作ら
れる管理抗ｗ、に対する抗血清であって試験される分析
対象に対する受体−抗体がつくられる血清を、ＰＢＳ或
いはＩＭ二炭酸ナトリウムｐＨ９，６中に１７１０００
の割合で希釈し、固体支持体の適当なスペースに受体と
なるよう適用する。この管理分析対象を試験分析対象に
もしくは５０−５００岬／−の濃度の第一洗浄溶液に添
加する。管理プローブは、対照抗原に対する酵素ラベル
抗体を有する。この管理プローブは同じ濃度の試験プル
ーブ溶液に添加される。

（ｂ）　　抗体分析対象として：上記５（ａ）の抗原の
一種を面上（ＰＢＳ或いはＩＭの二炭酸ナトリウムｐＨ
９，６中に１０ｕｇ／ＩＩｔ）の適当な位置に適用する
。管理抗血清に対する抗血清を、測定された分析対象−
抗体或い紘第−洗浄溶液に対し１＝１０００の割合で希
釈する。残りの手順を既に述べたような態様でｌ！！ｉ
シ返えす。

核酸 核酸列を検出し同定する時には同じ型の管理が採用され
る、即ち： （１）既に述べたような基体−染料系のための管理。

（２）　　ラベルしたプローブのための管理。二重スト
ランド核酸或いは化学的に調整した核酸が固体支持体の
適当な位置に結合される。

（３）非交叉交雑核酸対を使用することによる交雑時間
及び条件のための管理。

標準参照曲線 この段階までに記載した多分析対象試験は定性的に使用
される。この糸は従って特定の抗原、抗体或いは核俄の
存在について肯定的或いは否定的な回答を提供する。し
かしながら、′標準点”を、定量的情報を得るため固体
支持体に加えてもよい。

標準点はすべて穿孔引裂線１９（第１図）の片側に位置
させる。

平定性的モードにおいては、夫々の標準点は漸増酵素濃
度を有し、アッセイが十分に進展した後標準点はある割
合の着色濃度を生じ、これらそれぞれは分析対象の異な
る景及び／もしくは濃度に対応している。処理手順の終
了時で紘、使用者は固体支持体を穿孔部（第１図参照）
で引裂きそして分析対象パネルから標準パネルを分離す
ることかで惠る。この処置によって、分析対象位置と標
準対象位置との間の着色濃度の比較がよシ容易になる。

よプ定量的な結果を得るために、固体支持体の管理部分
全体は、適当表光学洟度計を走査することができる。正
確な標準曲線が次につくられ、分析対象の正確な量がよ
シ精密に決定される。

或いは、もしく拡これに加えて、補足的な標準点もしく
は管理点も使用してもよく、それを次に記載する。

手順１ 別の量の酵素を支持体のそれぞれの点に直接に着合する
。染料で完全に顕色化した後、夫々の点は異なる色素濃
度をあられす、゛これらの点は、製造業者によシ分析対
象の量の大きさと対応しており、この情報を試験キクト
に含めるようにしてもよい。

手順２ 異なる量のアビジンを夫々の点に着合する。酵素をラベ
ルしたプローブもまたビオチンをつけてお）、これは、
標準点のアビジンと結合することを可能にする。この後
の手順は、製造業者にょシ与えられる手引書によれば手
順１に記載したものと同様である。

手順３ 分析対象が抗体である場合のアッセイ系については、標
準点はそれぞれ、同じ種から由来し抗体の給体となる免
疫グロブリンを相異なる量で含んでいるようｋしてもよ
い。ラベルしたプローブ（抗免疫グ党プリン）は、着合
した免疫グロブリンの量に対応してこれらの点ｉｃ結合
し、相異なる色濃度を表わす。これらの濃度は、製造業
者によう与えられる標準管理表と再び比較される。

手Ｍ４ 受体−分析対象の組合せを手Ｍ２及び３に記載したよう
ｋして採用する。但しこれら組合せは、試験された分析
対象或いはそり受体を干渉するものであってはならない
。

手Ｎ５ その分子中に多糖類を含む酵素（例えばホースラディッ
シー過豪化酵素に対し、プラスチック面は相異なる量の
レクチン（炭水化物と結合する分子）、例えばコアＡ　
（Ｃａｎ　Ａ　）で被覆されるようＫしてもよい。この
方法の採用は、しかしながら、分析対象それ自体に炭水
化物が欠けている場合のみに限定すべきである。

手順６ ＩＩｉ素に対してつくられる相異なる濃度の抗体であっ
て、酵素−抗体プローブ中において、抗体の給体と同じ
動物種から生じたもの。

彰ユ ６　手順１０例 ナカネ及びカヮシ（Ｊ−ｘ工ｓｔｏｃｈｅｍ、　Ｃｙｔ
ｏａｈｓｍ。

誌、２１１０８４．１９７４年’）ＩＩＣよ＃）ｍ製さ
れる酵素−イムノブ胃プリン共後体をＰＢＳＸｐＨ７，
４もしくはＩＭの二次酸ナトリウムｐＨ９，６中に１：
　１００．１：２００．１　：４００，１　：８００，
１　：１６００、Ｉ　：　３２００の割合で希釈する。

夫々の希釈液をプラスチック支持体の所定点に適用する
。

室温でＩ−０分間保温後、プラスチックシート全体を０
．８５　％Ｎａｃｌと０．ＩＸＢＲＩＪ３５Ｔの溶液で
洗浄する。

７　手順２０例 市販の試薬（例えばシグマ　ケミカル　カンパニー：米
国モンタナ州セントルイスｉｔり或いハ専門誌（アビジ
ン、ターニク及びアブ２ミーズの論文、Ｊ、Ｈｌｓｔｏ
ａｈｅｍ　、　Ｃ！ｙｔｏｃｈｅｍ、誌ｎ号、１１３１
ページ、１９７９年）に記載されているようＫして、抗
体をビオチニル基でラベルする。次ＫＪ、Ｈｉｓｔ−ｏ
ｃｈｅｍ、誌η号、１０８４ページのナカネ及びカワシ
の方法によシ過酸化酵素と共後させる。市販されている
（例えばシグマ）アビジンをＰＢＳ、ｐＨ７，４もしく
はＩＭの二炭醗ナトリウム、ｐＨ９，６中にｌＯマイク
ログラム／−の割合で溶解する。この溶液を１：１で系
列的に希釈して標準曲線の点を得る。夫々の希釈液をグ
ラスチック支持体の所定点に適用する。Ｉ−ω分の保温
時間後、プラスチックを上記のように洗浄する。

＆　手順３の例 以下の二つの方法のいずれかを採用することができる： （ａ）　　免疫グ田プリンの供給源として血清全体を使
用する：未処理血清をＰＢＳ、ｐＨ７，４或いはＩＭの
二炭漕ナトリウムｐＨ９，６に１　：　１０００の割合
で希釈し、次に同じ緩衝液中で系列的に１：３で希釈す
る。種々の濃度のものが例６及び７に示すようＫして適
用される。

（ｂ）　　分離した免疫グロブリンの使用：免疫グロブ
リンは、硫漕アンモニウム沈澱による血清全体から由来
する（例えばライッシー、ビッツ及びクラインの論文、
クリニカル　エクスペリメント　イムノロジー誌１６巻
、３５５ページ、１９７４年）。ＰＢＳ、ｐＨ７，４も
しくはＩＭの二炭酸ナトリウムｐＨ９，６に溶かした１
０マイクログラム／−の溶液を調製する（免疫グロブリ
ン含量は、レインの論文、メソッド　エンジモロジー誌
３号、４４７ページ、アカデミツク　プレス社、１９６
６年、Ｋ記載されるようにＯＤＫよシ２８０及び２６０
ナノメーターで決定される）。この免疫グルプリン溶液
を同じ緩衝液中で系列的に１＝１１に希釈する。その後
の手順は、例６及び７に関して述べたようにして行う。

ａ　手順４０例 基本的には、非クロス反応受体−分析対象系を採用し、
十分な処理時間及び反応条件の対照をする手順と同じで
ある（先述例５参照）。しかしこの場合、受体は、分析
対象がプロティン抗原である場合分析対象の種々の濃度
（例えば２０岬／−−１０００ｎｇ／ｄ）と反応する。

分析対象が抗体である場合には、抗血清全体の希釈液が
固体享持体に適用される。希釈液は抗血清の特定のパッ
チに依存し、あらかじめ、１：１０からｉ　：　ｔｏｏ
ｏｏｔでの系列的な１：２希釈液を試験することＫよシ
決定されなければならない。

１０、　手順５の例 コンカナバリンＡ（シグマ、ジブコ、ミルズから得られ
る）をＰＢＳＸｐＨ７，４或いはＩＭの二炭酸ナトリウ
ムｐＨ９，６中ＶＣＩＯマイクロクラム／ｍｌＫ溶解す
る。次に同じ緩衝液中へ系列的に１：２で希釈する。夫
々の希釈液は例６に記載されるようにしてプラスチック
支持体上に適用する。

１１、　手順６０例 酵素に対する抗血清、例えばホースラディノシェ過豪化
酵素を市販されているものから得るか、或いは適当な動
物（兎、山羊、ひよこ）中で繰シ返えし免疫処理（１０
０マイク四グラムの酵素を、１．０−の完全な７０イン
ド補助液〈ギブコ或いはジ７コ〉で乳化した１ｍ０．８
５％Ｎａｃ　ｌを注射し、３−４週間後年完全な７０イ
ンド補助液中で乳化した２００−５００ｕｇの過酸化酵
素を注射する）して得る。この抗血清を先述手順３　（
ａ）　（例８）に記載したプラスチック面に適用する。

装置 本発明によるアッセイは種々の装置を用いて行うことが
できる。種々の試薬をカードに適用することができるた
め、アッセイは第２図に示す塁の装置と共に使用するこ
とができ、このような装置はふたのない室ｍを有し、こ
の室は平行な内壁５によシいくりかの小室Ｚ３ｔＣ区分
されている。夫々の小室の外壁の一つにはベッセル底部
に近く、ゴムの隔壁四で被覆されたオリフィスｎが設け
られている。しかしこれはあらゆる種類のアッセイに必
要なわけではない（これは試薬の溶解性に依存する）。

ベッセル全体は可撓性のあるゴムシート３１ｔＣ被覆さ
れており、シート３１は夫々の小室中央に長手スリッ）
３３を有し、このスリットは内壁と平行している。スリ
ットの長さは固型支持体の幅よシ短にものであってはな
らない。この装置の夫夫の小室に適当な試薬を充填した
後、装置全体をシールあ、例えば接着テープで密封する
。夫々の小室は別々に密閉されるようにすることが好ま
しく、それによ）シールをそれぞれ別個に除去しつるよ
うにする。

このような装置はアラ七イの所定段階、例えば潜伏、洗
浄等の段階に対して小室のそれぞれを割当てるように使
用する。

夫々の段階のための試薬が対応する小室に充填されてお
り、これら小室は使用する順序に配置されている。

使用する前に、夫々の小室のシールを除去し溶媒を小室
中に導入する。固体支持体が次に所長の時間この新鮮な
溶液に浸漬される。潜伏期間が終了した後固凰支持体を
ゴムカバーのスリットを通じこの潜伏混合物からとりだ
す。弾性スリットはカードを拭い余分の液を固体面から
除去するう夫々の小室底部の隔壁ごと共に使用する時、
溶媒はオリフィスを通じ溶媒が強制的に乾燥試薬中に注
入される。この方法は、ある場合にはある種の試薬の溶
解性を向上させる。

本発明は平板なカードと関連して説明されたけれども、
同様に他の形態の固体支持体、例えば平板なスティック
或いは俸にも適当することができる。このような他の形
態の例は第３図に示されている。この実施態様において
は＠３７は対照点鳥、受体点４１、標準点４３を棒の別
々の位置に有する。

他の構成は容易に想像できるであらう。

更に、本発明は特定の手段、材料及び実施態様にりいて
記載されたけれども、本発明は開示された部分のみに限
定されるものではなく、特許請求の範囲から逸脱しない
均等部分についても及ぶものであることが理解されるべ
きである。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明による−りの可能な固体可撓性支持体を
示す図； 第２図は本発明方法を実施するために使用される容器の
斜視図；そして、 第３図は本発明による開発された棒の斜視図である。 図中の番号１１はカード状支持体、超は管理点、巧は標
準点、１７は受体処理域、１９は引裂線、乙は容器、ｎ
は小室、２７はオリフィス、四はゴム隔壁、３１、ｔｌ
ｉ−ｉ’ムシート、オは長手スリット、あはシールであ
る。 特許出願人　　　オルガニック　リミテッド第　１　　
図　　図面の浄。（内容に変更な、１９ 手続補正口 昭和６０年　７月２９日 分析対象を検出し測定する免疫アッセイ系及びアッセイ
方法３、補正をする者 事件との関係　　　　特　許　出　願　人氏名（名称）
　　オルガニック　リミテッド手続補正書 昭和６０年　９月　９日 特許庁長官　　宇　　賀　　道　　部　　殿昭和　６０
　年　特許願　第　１２９１０３　　号３、補正をする
者 事件との関係　　　　特　許　出　願　人氏名（名称）
　　　オルガニック　リミテッド４、代理人 ６、補正の対象 （１）願書の特許出願人の欄の「代表者」の項（２）代
理権を証明する書面 （３）図面企図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、複数の受体を結合した固体支持体を含んでなる、単
   一の標本における少くとも一種の分析対象を検出し測定
   する固体相免疫アッセイ系。 ２、前記受体のそれぞれが、相異なる分析対象を受体に
   選択的に結合させ、相異なる分析対象の間で鑑別分析し
   うるようにした特許請求の範囲第１項記載の系。 ３、前記支持体を前記標本に接触させる手段を更に有す
   る特許請求の範囲第１項記載の系。 ４、前記支持体を接触させる前記手段が過剰液を支持体
   から除去する圧搾部を有する特許請求の範囲第３項記載
   の系。 ５、前記分析対象の少くとも一種が存在するか否かを表
   示する測定可能な信号を発生しうる信号発生系を更に有
   する特許請求の範囲第１項記載の装置。 ６、前記信号発生系が、前記受体に結合する分析対象と
   複合体を作るように選ばれた、ラベルしたプローブを含
   んでなる特許請求の範囲第５項記載の系。 ７、前記ラベルしたプローブが受体であり、前記ラベル
   したプローブ、分析対象、及び支持体上の受体がサンド
   イッチ状に形成されるようにした特許請求の範囲第６項
   記載の系。 ８、前記ラベルしたプローブが核酸である特許請求の範
   囲第７項記載の系。 ９、前記ラベルしたプローブが硫酸ピクリルでラベルさ
   れている特許請求の範囲第８項記載の系。 １０、前記ラベルしたプローブが、抗体、抗原、酵素及
   び核酸からなる群より選ばれるものである特許請求の範
   囲第６項記載の系。 １１、前記信号発生系が末ラベルプローブを含む特許請
   求の範囲第５項記載の系。 １２、前記信号発生系が色素生成するものである特許請
   求の範囲第５項記載の系。 １３、前記色素生成系が染料、基体、及び酵素を含んで
   なる特許請求の範囲第１２項記載の系。 １４、前記酵素が過酸化酵素及びグルコースオキシダー
   ゼからなる群より選ばれる特許請求の範囲第１３項記載
   の系。 １５、前記酵素がベーターガラクトーシダーゼである特
   許請求の範囲第１３項記載の系。 １６、前記信号発生系が放射性指示剤を含む特許請求の
   範囲第５項記載の系。 １７、前記固体支持体が水不溶性で可撓性があり、平板
   なもしくは矩形シート；丸いシート；棒；スティック；
   或いは円筒体からなる群より選ばれる特許請求の範囲第
   １項記載の系。 １８、前記支持体が、ポリビニル、ポリスチレン、セル
   ローズ、ナイロン或いはガラスからなる群より選ばれた
   物質でつくられる特許請求の範囲第１７項記載の系。 １９、前記支持体が平板なシートであり、前記シートが
   引裂線を有し、それによりシートの一部がシート残部か
   ら分離されるようにした特許請求の範囲第１７項記載の
   系。 ２０、前記支持体が、前記アッセイの反応の少くとも一
   つをモニターする管理手段を有するシートである特許請
   求の範囲第１項記載の系。 ２１、前記品質管理系が、前記支持体上の染料−基体系
   の活性をモニターする手段を含む特許請求の範囲第２１
   項の系。 ２２、前記品質管理系が、分析対象が支持体に着合した
   時には、分析対象に複合体を生成しうるプローブの活性
   をモニターする手段を有する特許請求の範囲第２１項記
   載の系。 ２３、前記品質管理系が、前記分析対象に対してシート
   を十分にさらす時間をモニターするための手段を有する
   特許請求の範囲第２２項記載の系。 ２４、前記支持体が、標準点であってこれと比較するこ
   とにより前記アッセイの結果を視覚的に評価しうる標準
   点を有するシートである特許請求の範囲第１項記載の系
   。 ２５、前記シートがシートの一部を分離するための引裂
   線を有し、前記標準点はすべて引裂線の片側に位置して
   おり、それにより標準点を有するシート部分がシートの
   残り部分と分離され、これと比較するようにした特許請
   求の範囲第２４項記載の系。 ２６、前記受体がプロティン、免疫グロブリン、核酸か
   らなる群から選ばれる特許請求の範囲第１項の系。 ２７、一種以上の分析対象を含むことが疑われる単一の
   標本における少くとも一種の分析対象を検出する方法で
   あって； 前記標本を、前記分析対象の一つ以上と結合するように
   構成した複数の受体を着合した状態で有する固体支持体
   と接触させる段階を有する方法。 ２８、前記標本が液体溶液であり、前記方法が支持体上
   に溶液を塗布することを含む特許請求の範囲第２７項記
   載の方法。 ２９、前記標本が液体溶液であり、前記方法が支持体を
   前記溶液中に浸漬することを含む特許請求の範囲第２７
   項記載の方法。 ３０、前記受体が支持体上のあらかじめ定められた位置
   にまとめられている特許請求の範囲第２７項記載の方法
   。 ３１、分析対象を結合させた支持体をプローブ含有溶液
   と接触させることを更に含む特許請求の範囲第３０項記
   載の方法。 ３２、前記分析対象が、プロティン、核酸、炭水化物、
   多糖類、脂質、及びこれらの組合せからなる群より選ば
   れる特許請求の範囲第３１項記載の方法。 ３３、前記受体がプロティン、免疫グロブリン、核酸、
   多糖類及びこれらの組合せからなる群より選ばれた特許
   請求の範囲第１項記載の方法。 ３４、前記支持体を、分析対象の少くとも一種と複合体
   を生成するよう選ばれたプローブと接触させることを含
   む特許請求の範囲第２７項記載の方法。 ３５、前記プローブが信号発生系でラベルされており、
   前記方法が前記プローブの着合位置を観察することを含
   む特許請求の範囲第３４項記載の方法。 ３６、前記プローブの活性をモニターすることを含む特
   許請求の範囲第３５項記載の方法。 ３７、前記支持体が少くとも一つの対照点を含む特許請
   求の範囲第３５項記載の方法。 ３８、前記プローブが、酵素と放射性物質とからなる群
   から選ばれた素子でラベルされている特許請求の範囲第
   ３５項記載の方法。 ３９、前記ラベルが酵素であり、染料及び基体を前記標
   本及び前記ラベルしたプローブにさらした後支持体と接
   触させて着色反応を起こさせ、前記分析対象が結合して
   いる位置で観察しうるようにすることを更に含む特許請
   求の範囲第１項記載の方法。 ４０、ゲル化剤を前記支持体に添加し、支持体上のゲル
   中で色素の顕色反応を起こさせることを含む特許請求の
   範囲第３９項記載の方法。 ４１、前記支持体を、ゲルを有する顕色シートと接触さ
   せ、顕色シート上のゲル中で色素の顕色反応を起こさせ
   ることを含む特許請求の範囲第３９項記載の方法。 ４２、前記酵素が過酸化酵素、グルコースオキシダーゼ
   、及びベーターカラクトシダーゼからなる群より選ばれ
   る特許請求の範囲第３９項記載の方法。 ４３、前記プローブをプロティン、核酸、炭水化物、多
   糖類、脂質及びこれらの組合せからなる群より選ぶ特許
   請求の範囲第４２項記載の方法。 ４４、前記プローブがラベルされておらず、前記方法が
   更に、前記標本及びプローブにさらした後未ラベル物質
   を前記支持体と接触させることを含む特許請求の範囲第
   ２７項記載の方法。 ４５、前記固体支持体が水に不溶であり可撓性があり、
   平板で矩形のシート；丸いシート；棒；スティック；或
   いは円筒体からなる群より選ばれる特許請求の範囲第２
   ７項記載の方法。 ４６、前記支持体を前記受体と接触させる前に、前記支
   持体上の結合位置の数を増加させることを含む特許請求
   の範囲第２７項記載の方法。 ４７、前記受体が支持体上に選択的に位置し、相異なる
   分析対象を支持体上の異なる位置で結合させるようにし
   た特許請求の範囲第２７項記載の方法。 ４８、前記支持体が引裂線を有するシートであり、シー
   トの一部の分離が容易であるようにした特許請求の範囲
   第４７項記載の方法。 ４９、前記シートが更に、標準値を設定するための標準
   点を有し、前記方法が更に観察される結果を前記標準値
   と比較することを含む特許請求の範囲第２７項記載の方
   法。 ５０、前記シートが引裂線を有し、前記標準点がすべて
   引裂線の片側に位置し、前記方法が、標準点を前記標本
   にさらすこと、前記シートの顕色化すること、標準点の
   あるシート側を残りのシート側と分離すること、標準点
   の最終的な外観を前記受体をさらした後の最終的な外観
   と比較すること、を含む特許請求の範囲第４９項記載の
   方法。 ５１、前記シートが更に、前記方法の少くとも一種の試
   薬の活性をモニターするための管理点を有する特許請求
   の範囲第２７項記載の方法。 ５２、前記支持体が、前記受体の活性をモニターする少
   くとも一つの点を有する特許請求の範囲第５１項記載の
   方法。 ５３、前記支持体が、前記支持体と標本との接触時間を
   モニターする少くとも一つの点を有する特許請求の範囲
   第２７項記載の方法。 ５４、前記シートが更に、前記支持体が十分な時間試薬
   にされたか否かを指示する管理点を有する特許請求の範
   囲第２７項記載の方法。 ５５、前記標本を支持体と接触させた後支持体を洗浄し
   て、過剰の未結合物質を支持体から除去する特許請求の
   範囲第２７項記載の方法。 ５６、複数の小室を有する容器を設け、小室の数は行わ
   れる段階の数に対応し、夫々の小室は特定の試薬もしく
   は試薬群をその中に有し、前記支持体を各小室中に浸漬
   して支持体を小室内の試薬と接触させることにより前記
   方法を実施するようにした特許請求の範囲第２７項記載
   の方法。 ５７、多段階アッセイ手順を行うために使用する装置で
   あって、複数の小室をその中に有する容器を有し、前記
   小室のそれぞれはアッセイのための試薬を収容している
   ことを特徴とする装置。 ５８、小室のそれぞれは細長く、かつその頂部にカード
   を挿入する細長い開孔を有する特許請求の範囲第５７項
   記載の装置。 ５９、前記細長い開口は弾性カバーで被覆されており、
   カバーの中に細長いスリットを設け、二つのリップが小
   室それぞれの上に形成されており、これを通じシートが
   挿入、除去され、前記リップは過剰な物質をシートから
   除去する役割をなすようにした特許請求の範囲第５９項
   記載の装置。 ６０、小室のそれぞれは試薬を脱水形態で収容している
   特許請求の範囲第５９項記載の装置。 ６１、夫々の小室の一つの壁がオリフィスを有し、夫々
   の試薬を水和するために液体がこのオリフィスを通じ注
   入されるようにした特許請求の範囲第６０項記載の装置
   。 ６２、オリフィスのそれぞれが密閉ストリップで被覆さ
   れている特許請求の範囲第６１項記載の装置。 ６３、多分析対象アッセイに使用される支持体であって
   、選択的に処理され、標本にさらされそしてそれ以后の
   処理の後、参照のため前記カードの別の部分と比較され
   る標準参照曲線を呈示する支持体。 ６４、前記標準参照曲線が、支持体上の個別に処理され
   る一連の点から形成され、前記標準点のそれぞれは標本
   にさらされ最終処理を施こされた後別の色を呈示するよ
   うにした特許請求の範囲第６３項記載の支持体。 ６５、前記支持体が引裂線を有する可撓性のある曲線で
   ある特許請求の範囲第６４項記載の支持体。 ６６、標準点のすべてが前記カードの引裂線の片側にあ
   り、前記引裂線に沿って分離した後、その標準曲線をカ
   ードの残り部分と比較しうるようにした特許請求の範囲
   第６５項記載の支持体。 ６７、前記カードが複数の受体をその上に有し、カード
   上の別々の位置の一種以上の分析対象と結合しうるよう
   にした特許請求の範囲第６３項記載の支持体。 ６８、前記支持体がポリビニル、ポリスチレン、セルロ
   ーズ、ナイロン、ガラス繊維、及びこれらの組合せから
   なる群より選ばれた物質から形成される特許請求の範囲
   第６３項記載の支持体。 ６９、少くとも一種の試薬の活性をモニターするため、
   管理物質で選択的に処理される多分析対象アッセイに使
   用する支持体。 ７０、前記支持体がその上に複数の受体を有し、受体は
   、支持体上の一種以上の分析対象と結合しうるものであ
   る特許請求の範囲第６９項記載の支持体。 ７１、前記受体がプロティン、免疫グロブリン、核酸及
   び多糖類からなる群より選ばれる特許請求の範囲第７０
   項記載の支持体。 ７２、前記管理物質がプロティン、核酸、炭水化物、多
   糖類、脂質及びこれらの組合せからなる群より選ばれる
   特許請求の範囲第７１項記載の支持体。 ７３、ホースラディッシュ過酸化酵素を検出する方法で
   あって、ホースラディッシュ過酸化酵素を含んでいるこ
   とが疑われる物質を、ヨウ化カリウム、澱粉及び過酸化
   水素と接触させることを含む方法。 ７４、前記ヨウ化カリウム、澱粉及び過酸化水素が懸濁
   液である特許請求の範囲第７３項記載の方法。 ７５、前記ヨウ化カリウム、澱粉及び過酸化水素がゲル
   状である特許請求の範囲第７３項記載の方法。 ７６、グルコースオキシダーゼをグルコースとその場所
   で反応させ、前記過酸化水素を生成することを含む特許
   請求の範囲第７３項記載の方法。