JPS6298260A - 免疫活性物質測定キツト - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ｌ−溌ＪＦ１料」矢疲呪 （産業上の利用分野） 本発明は、主として体液中の被測定物質を免疫学的手法
により簡便に測定しうる測定キットに関する。

（従来の技術） 生体成分を簡便に測定しうる診断用キットや試験紙が市
販されている。例えば、尿成分を測定するための試験紙
は試料の尿と接触させると発色が起こり、尿中の蛋白質
などが検出もしくは半定量される。このような診断用キ
ットや試験紙で測定されうる物質は蛋白質、ブドウ糖、
尿素などの生化学物質に限られ、生体内の免疫グロブリ
ンなどの免疫活性物質を間車な手法で短時間のうちに測
定できる診断用キットや試験紙はほとんど存在しない。

免疫学的手法を用いた市販の診断用キットとしては、わ
ずかに妊娠診断用キットが製造されているだけである。

この妊娠診断用キットでは、妊婦の尿中に存在するヒト
絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）を免疫学的に測定する
ことにより妊娠の有無を判断する。上記キットにはＨＣ
Ｇに特異的な抗体がセットされており２　これに検体を
加えると被測定′Ｊｊ！ＩＪ質であるＨＣＧが上記抗体
に結合する反応が生じる。その結果、沈降リングが形成
される。

このリングの形状を判断することにより妊娠の有無が判
断される。しかし、専門的知識の乏しい者にとっては沈
降パターン（リングの形状）を正確に判断するのが難し
いという欠点がある。

上記抗ＨＣＧ抗体を担持させたラテックスを長期間保存
すると、抗ＨＣＧ抗体が変質したりラテックスの非特異
的凝集反応が起こるおそれもある。

ラテンクス粒子の代わりに凍結乾燥した赤血球を用いる
場合も多いが、赤血球自体が蛋白質であるため、やはり
保存性に劣る。凍結乾燥を行う手間もかかる。

一方１通常、免疫活性物質を測定するには、酵素免疫測
定法（エンザイム　イムノアッセイ；ＥＩＡ）や放射免
疫測定法（ラジオイムノアッセイ；　ＲＩＡ）か利用さ
れている。ＥＩＡとＲ１へのいずれの方法においても固
相法が好適に利用される。固相法のひとつとしてサンド
インチ法が知られている。サンドイツチ法は被測定物質
およびそれに特異的な抗原もしくは抗体が２つ以上の結
合部位をもつ場合に利用されうる。このサンドインチ法
により例えばインシュリンを定量する場合には、まず、
セファデックス（フェルマシア社製）微粒子などの不活
性担体懸濁液に抗インシュリン抗体を加えて。

これを該担体に担持させる。この固相化抗体に被測定物
質であるインシュリンを作用させ、該インシュリンを上
記抗インシュリン抗体に結合させる。

次に、放射性物質や酵素で標識した過剰量の抗インシュ
リン抗体をこれに作用させ、標識化抗インシュリン抗体
をインシュリンに結合させる。このようにすると、被測
定物質であるインシュリンは抗インシュリン抗体にサン
ドイッチ状にはさまれた形態となる。放射性物質で標識
した場合は、洗浄後、上記酵素反応後の固相系をオート
ラジオグラフィにかけると放射性物質が検出されるため
インシュリン量が算出されうる。酵素で標識した場合は
、これに基質を作用させて該酵素反応による反応結果を
測定１例えば発色状態を比色定量することにより酵素量
が検出される。つまりインシュリン量が算出されうる。

上記サンドイツチ法などの固相法で測定を行う場合に２
例えば上記サンドインチ法において、不活性担体に抗イ
ンシュリン抗体と被測定物質であるインシュリンとが担
持された固相系に標識化抗インシュリン抗体を加えて反
応させた後、過剰量の抗インシュリン抗体を洗浄・除去
する必要がある。不活性担体として用いられるセファデ
ックスは微細な粒子であるため、洗浄を行うためには。

通常、数回の遠心分離操作を必要とする。このように、
固相法により被測定物質を測定する場合には、固相系に
結合した抗原もしくは抗体（ｂｏｕｎｄｆｏｒｍ）と結
合しなかった抗原もしくは抗体（ｆｒｅｅｆｏｒｍ）と
の分離（Ｂ／Ｆ分離）に煩雑な操作が必要であり、測定
に時間がかかるという欠点を有する。

そのため、このような手法は簡便に測定を行うための／
１１１１定キットには応用することが難しい。特に。

ＰＴＡでは放射性物質を用いるため、一般に市販するた
めのキ・ノドには応用できない。

（発明が解決しようとする問題点） 本発明は上記従来の欠点を解決するものであり。

その目的とするところは、被測定物質を簡単な操作で短
時間に、かつ精度良く免疫学的に測定しうる測定キット
を提供することにある。本発明の他の目的は、被測定物
質を固相法を用いてＥＩＡの手法により簡単な操作で短
時間にかつ精度良く測定しうろ測定キットを提供するこ
とにある。

（問題点を解決するための手段） 本発明の免疫活性物質測定キットは、（１）蛋白質およ
び／もしくはアミノ酸結合能力を有するシート１２）被
測定物質に特異的な酵素標識化抗原もしくは抗体；また
は被測定物質に特異的な抗原もしくは抗体、および該抗
原もしくは抗体に特異的な酵素標識化抗体もしくは抗原
；（３）蛋白質および／もしくはアミノ酸、（４）該酵
素の基質、および（５）緩衝液を含有し、そのことによ
り上記目的が達成される。

本発明キットに含まれる蛋白質および／もしくはアミノ
酸結合能力を有するシートは、少なくともその表面に、
被測定物質（通常、蛋白質）を物理吸着、共有結合もし
くはイオン結合により結合させうる。物理吸着により被
測定物質を結合しうるシートの基材としては、ニトロセ
ルロース；活性炭、多孔質ガラス、カオリンなどの吸着
側を含有する高分子重合体；などがある。共有結合によ
り被測定物質を結合しうるシートの素材としては。

該被測定物質を化学的に結合しうる（共有結合しうる）
基が導入された高分子重合体がある。例えば、臭化シア
ン、ジアゾニウム塩、酸アジド、イソシアネート、活性
型ハロゲン化アルキルなどで活性化された高分子重合体
がある。アミノ基を有する高分子重合体のアミノ基を使
用直前にジアルデヒド、例えばグルタルアルデヒド、な
どにより活性化させることによっても被測定物質を共有
結合させることができる。イオン結合により被測定物質
を結合しうるシートの素材としては、該被測定物質をイ
オン結合しうるイオン交換基が導入された高分子重合体
がある。このようなイオン交換基としてはスルホン酸基
、カルボキシル基などがある。シートの素材として９例
えば、ナイロン。

レーヨン、ポリエステル、ビニロン、コツトン。

再生セルロース、酢酸セルロースは被測定物質を結合す
る能力がないため本発明のキットには使用できない。

上記シートは、フィルム状、織布、不織布状。

多孔質膜状のいずれの形態であってもよい。特に。

表面積が大きい多孔質膜が好適に用いられる。本発明キ
ットには、特にニトロセルロース製の多孔質膜にトロセ
ルロース製メンブランフィルタ−；孔径０．１〜１００
μｍ）が好適に用いられる。

本発明キットで廁定しうる被測定物質は、抗原。

抗体などの免疫活性物質であれば特に限定されない。被
測定物質としては９例えば、ヒトや動物の免疫グロブリ
ン、α−フェトプロティン、Ｃ反応性蛋白（ＣＲＰ　）
などの蛋白質；肝炎ウィルス関連抗体、風疹Ｈ＾抗原な
どの各種ウィルス抗原；各種細菌（例えば、トキソプラ
ズマ、マイコプラズマ。

梅毒トレボネーマ）、真菌、毒素などの微生物抗原；ア
ルブミン、補体成分などの各種血漿蛋白成分；ニストロ
ジエン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＩＩｃＧ）などの
各種ホルモン；がある。これらを抗原としたときの抗体
も測定が可能である。

本発明キットにおいて使用される酵素標識化抗原、抗体
などは通常の標識化の手法により得られる。標識物質で
ある酵素としては着色反応を行う反応を触媒するものが
用いられる。そのような酵素としては、パーオキシダー
ゼ、カタラーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−Ｄ−ガラ
クトシダーゼ。

ウレアーゼ、アルカリホスファターゼがある。これらの
酵素は９例えば、カルボジイミド類、ジアルデヒド類、
ジイソシアネート類、ビスジアゾベンジジンなどにより
被標識化物質に共有結合させることができる。

本発明の測定キットは９通常、（１）蛋白質および／も
しくはアミノ酸結合能力を有するシート（２）ゼラチン
、グリシンなどの蛋白質（アミノ酸）溶液、（３）被測
定物質に特異的な酵素標識化抗原もしくは抗体；または
被測定物質に特異的な抗原もしくは抗体、および該抗原
もしくは抗体に特異的な酵素標識化抗体もしくは抗原、
（４）上記（３）の酵素が触媒しうる反応（着色反応）
の基質、および（５）反応時の洗浄用などに用いられる
緩衝液を含む。これらのほか、必要に応じて、硫酸水溶
液などの酵素反応停止後；反応時に使用する試験管など
がセットされていてもよい。

本発明のキットを用い、被測定物質を測定するには１通
常１次の方法（第１の方法）が採用される。これをＣＲ
Ｐを測定する場合を例に挙げて説明する。まず、被測定
物質（ＣＲＰ　）を含有する試料を蛋白質および／もし
くはアミノ酸結合能力を有するシートに付与し、　ＣＲ
Ｐをシートに結合させる。

このとき試料として２例えば血清を用いると、血清中に
含有されるＣＲＰ以外の血漿蛋白質もシートに結合する
。次にこのシートに過剰量の蛋白質および／もしくはア
ミノ酸溶液２例えばゼラチン溶液やグリシンを含有する
ハソファーを付与する。

するとこの蛋白質やアミノ酸はシートの蛋白質（アミノ
酸）結合能を有する残余部分に結合（飽和結合）する。

これに、被測定物質に特異的な過剰量の標識化抗原もし
くは抗体（抗ＣＲＰ抗体）を作用させるとこの標識化抗
ＣＲＰ抗体はもはやシートには結合せず、シートに結合
しているＣＲＰに特異的に結合する。シートを洗浄して
、結合しなかった標識化抗ＣＲＰ抗体を除去する。シー
ト上の標識を検出することによりＣＲＰが測定される。

例えば。

パーオキシダーゼ標識抗ＣＲＰ抗体を用いる場合には、
パーオキシダーゼの基質である過酸化水素と０−フェニ
レンジアミンとがキットに含まれる。

この過酸化水素と０−フェニレンジアミンとを含む溶液
をシートに付与すると、標識化抗ＣＲＰ抗体が存在すれ
ば、酵素反応により着色がおこる。この着色の度合を口
視観察することにより試料中のＣＲＰの有無の判定もし
くはＣＲＰの半定量がなされる。上記過酸化水素と０−
フェニレンジアミンとを含有する溶液に反応後のシート
を浸漬して攪拌し。

着色した溶液の吸光度を測定すれば試料中のＣＲＰを定
量することも可能である。上記酵素反応を所定の時間で
止めて着色度合を観察するために、稀硫酸などの反応停
止液が添加される場合もある。

上記の方法の他２次に示す第２の方法によっても測定が
なされうる。この場合は、測定キットには被測定物質に
特異的な酵素標識化抗原もしくは抗体の代わりに、被測
定物質に特異的な抗原もしくは抗体、および該抗原もし
くは抗体に特異的な酵素標識化抗体もしくは抗原がセン
トされている。

この方法で測定を行うためには、まず２蛋白質および／
もしくはアミノ酸結合能力を有するシートに被測定物質
を加えて結合させた後、上記方法と同じく蛋白質および
／もしくはアミノ酸溶液で処理を行う。次に、被測定物
質に特異的な過剰量の抗原もしくは抗体を、上記シート
上に結合した被測定物質に結合させる。結合しなかった
抗原もしくは抗体を洗浄・除去した後、この抗原もしく
は抗体に特異的な酵素標識化抗体もしくは抗原を。

上記抗原もしくは抗体に結合させる。結合しなかった標
識化抗体もしくは抗原を洗浄・除去した後。

上記第１の方法と同様に、シート上の標識の検出を行う
と被測定物質が測定される。この方法は被測定物質に特
異的な抗原もしくは抗体の標識化が１１１シいため第１
の方法による測定が困難である場合などに採用される。

（作用） このように９本発明の測定キットを用いると。

シート上で抗原抗体反応を行うことにより免疫活性物質
を簡単な操作で測定することができる。被測定物質は酵
素反応による着色の度合を観察することにより測定され
るので、従来の１例えば妊娠診断用キットで沈降リング
を観察する場合に比べて９節単に検出もしくは半定量が
なされる。さらに着色の度合を吸光度測定などによって
計測し。

被測定物質を定量することも可能である。シート上で反
応が行われるため、従来のセファデックス粒子を用いた
固相法のようにＢ／Ｉ’分離のために遠心分離操作を行
う手間がかからす２短時間で測定がなされる。特に、シ
ートとして多孔質膜を用いると反応系の水分を濾過操作
により容易に除去しうるため洗浄操作も簡単である。微
細な孔を有する多孔質膜を用いると、被測定物質が担持
され得る面積が非常に広いため高感度で測定が行われ得
る。

本発明キットを用いた方法では被測定物質がシートに直
接結合されるため、従来の固相法（例えば、セファデッ
クス粒子などの担体に被測定物質に特異的な抗原もしく
は抗体を介して被測定物質を結合させる方法）に比べて
反応工程が１段階少なくてすむ。特に、上記第１の方法
を採用すると而ｍな操作で短時間のうちに測定が行われ
ろる。

本発明キットに用いられるシートは化学的に安定である
ため、従来の赤血球やラテックスを用いた測定キットに
比べてはるかに保存性が良好である。

（実施例） 以下に本発明を実施例につき説明する。

尖施±よ ＣＲＰ　／則定キット ■キットの？Ａ製＝ （Ａ）抗ＣＲＰ抗体の調製：ヒトの血清から分離したＣ
ＲＰをウサギに免疫し、抗血清を採取した。

この抗血清をアフィニティクロマトグラフィーにより精
製してＩｇＧ分画を得、これを抗ＣＲＰ抗体とした。

（Ｂ）パーオキシダーゼ標識抗ＣＩ？Ｐ抗体の調製：（
Ａ）項で得られた抗ＣＲＰ抗体を用い、下記の過ヨウ素
酸架橋法によりパーオキシダーゼ標識抗ＣＲＰ抗体を調
製した。

過ヨウ素酸架橋法によるパーオキシダーゼ標識抗ＣＲＰ
抗体の調製：パーオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ社；　Ｔｙ
ｐｅ　Ｖｌ　）　５　曙／ｍ　ｌ！溶液１容に１％の１
−フルオロ−２・４−ジニトロベンゼンエタノール溶液
１／１０容を加えて、室温で１時間反応させた。これに
０．０６Ｍ過ヨウ素酸ナトリウム１／１０容を加え。

室温で３０分間反応させた後、　０．１６Ｍエチレング
リコール１／１０容を加えて室温で１時間反応させた。

これを５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５（ファルマシア社；
　ｆｉｎｅ）のカラムにかけて未反応試薬を除去した後
、５■７ｍ１ｌの抗ＣＲＰ抗体１容を加え、室温で３時
間反応させた。さらに５■７ｍ（ｌの水素化ホウ素ナト
リウム１容を加え、４℃で一晩放置した後、　５ｅｐｈ
ａｄｅｘＧ−２００（ファルマシア社）のカラムにかけ
てパーオキシダーゼ標識抗ＣＲＰ抗体を得た。

孔径０．４５μｍ、厚み１５０μｍのニトロセルロース
メンブランフィルタ−を有する吸引式濾過器；１％ゼラ
チン（ＤＩＦＣＯ社製；バクトゼラチン）水溶液；　（
Ｂ）項で得られたパーオキシダーゼ標識化抗ＣＲＰ抗体
溶液の４００倍稀釈溶液；ｐＨ７，２のＯ，ＯＩＭホウ
酸バッファー；過酸化水素および０−フェニレンジアミ
ンをそれぞれ５ｍＭおよび２８ｍＭの割合で含有する基
質溶液、そして２Ｎ硫酸をセットしたＣＲＰ測定キット
を得た。

■キットを用いたＣＲＰの測定： ヒト血清３０μβを濾過器のニトロセルロースメンブラ
ンフィルタ−の表面に滴下し、１５分間放置した。この
上にゼラチン水溶液１００μｌを添加して５分間放置後
、吸引濾過を行なった。血清を滴下したのと同じ位置に
パーオキシダーゼ標識抗ＣＲＰ抗体溶液３０μｌを滴下
し、２０分間放置した。これを、　０．ＯＩＭホウ酸バ
ッファーを用いて３度洗浄後。

基質溶液を数滴滴下してさらに５分間放置した。

この上に２Ｎ硫酸を滴下して酵素反応を停止させた。メ
ンブランフィルタ−の赤色の着色状態を目視観察し、あ
らかじめ作成した比色表を用いて試料（血清）中のＣＩ
ＩＰ量を求めた。別に１種々の濃度の試料溶液を調製し
て、従来法である毛細管法との比較を行なったところ、
明らかな相関性が認められた。

去逼Ｉ引ん α−フェトプロティン測定キット ■キットの調製： （Ａ）抗α−フェトプロティン抗体の調製：ヒトのガン
患者の腹水から採取したα−フェトプロティンを精製後
ウサギに免疫し、抗血清を採取した。この抗血清をアフ
ィニティクロマトグラフィーにより精製してＩｇＧ分画
を得、これを抗α−フェトプロティン抗体とした。

（Ｂ）アルカリフォスファターゼ標識抗α−フェトプロ
ティン抗体の調製：本実施例（Ａ）項で得られた抗α−
フェトプロティン抗体を用い、下記の方法でアルカリフ
ォスファターゼ標識抗α−フェトプロティン抗体を得た
。

アルカリフォスファターゼ標識抗α−フェトプロティン
抗体の調製法：１００　μｌのアルカリフォスファター
ゼ硫酸アンモニウム懸濁液（５■／ｍ４）をガラス試験
管に取り２０００　Ｘ　ｇで遠心し、上清を除いた後沈
渣を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐｌ＋　６．８）　１５０
μｐに溶解した。次いでこの溶液１００　μｌを抗ＣＲ
Ｐ抗体溶液（抗ＣＲＰ抗体１００μｇを０．１Ｍ、　　
リン酸緩衝ン皮（ｐＨ６，８）　１００　μｌにン容解
）にノ用えたのち１．５％グルタルアルデヒド溶液１２
μｌを加え、直ちに攪拌混和後、２５’Ｃで３時間放置
した。次いで０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，８）　２
００μρ中で一夜透析したのち０．１Ｍリン酸緩衝液（
ｐＨ６，８）で全量を１．５ｍ６に稀釈した。

部分加水分解によりアミノ基が導入されたポリアミド製
不織布（直径３ｃｍ、厚み１酊）；グルタルアルデヒド
；　０．０１Ｍグリシンバッファー（ｐｌ＋７．５）；
　　（Ｂ）項で得られたアルカリフォスファタ−ゼ標識
抗α−フェトプロティン抗体溶液；そして、フェニルリ
ン酸二ナトリウムが１ｍｇ／ｍＪ。

４アミノアンチピリンが０．４５ｍｇ／　ｍｅ、　　フ
ェリシアン化カリウムが１■／ｍ（ｌの割合で含有され
る基質溶液をセットしたα−フェトプロティン測定キッ
トを得た。

■キットを用いたα−フェトプロティン測定ニアミノ基
が導入されたポリアミド製の不織布にグルタルアルデヒ
ドを作用させて常法により活性化させた。この不織布表
面に血清５０μｌを滴下し。

１５分間放置した。次に０．０１Ｍグリシンバッファー
で過剰のアルデヒド基を消費させると共に洗浄を行なっ
た。血清を滴下したのと同じ位置にアルカリフォスファ
ターゼ標識抗α−フェトプロティン抗体溶液５０μｌを
滴下し２０分間放置した。これを０．０１Ｍグリシンバ
ッファー（ｐＨ７，５）で洗浄した。

この不織布上に基質溶液を数滴滴下し、５分後の着色度
を目視観察した。あらかじめ作成した比色表を用いて試
料（血清）中のα−フェトプロティン量を求めた。

ＸＪぎ汐り別 風疹抗体測定キット ■キットの調製： （Ａ）抗風疹抗体の調製：風疹抗原（ＬＥＥ社製）をウ
サギに免疫し、抗血清を採取した。この抗血清をアフィ
ニティクロマトグラフイーにより精製して１ｇＧ分画を
得、これを抗風疹抗体とした。

（Ｂ）パーオキシダーゼ標識抗風疹抗体の調製二本実施
例（Ａ）項で得られた抗風疹抗体を用い。

実施例１　（Ｂ）項の方法に串してパーオキシダーゼ標
識抗風疹抗体を得た。

孔径０．４５μｍ　、厚み１５０μｍ、直径２５ｍｍの
ニトロセルロースメンブランフィルタ−を有する吸引式
濾過器；１％ゼラチン（ＤＩＦＣＯ社製、バクトゼラチ
ン）水溶液、風疹抗原（ＬＥＥ社製）（２５μｇ／　ｎ
＋ｊり　　；　　（Ｂ）項で得られたパーオキシダーゼ
標識抗風疹抗体？８’／ｆｊ、（ＤＩｏｏ　倍＋６釈溶
’ｔＬ　：　ｐＨ７，０（７）リン酸バッファー；そし
て過酸化水素および０−フェニレンジアミンをそれぞれ
５ｍＭおよび２８ｍＭの割合で含有する基質溶液をセッ
トした風疹抗体測定キットを得た。

■キットを用いた風疹抗体の測定： ヒト血？ｉ３０μｌをニトロセルロースメンブランフィ
ルタ−に滴下し、１５分間放置した。フィルター上に１
％ゼラチン水溶液１００μｌを滴下し、５分後に吸引濾
過した。次に風疹抗原溶液（２５μｇ／＋ｎ７り１０μ
ｌをヒト血清を滴下したのと同じ位置己こ滴下し、３０
分間放置した。これにＯ，１Ｍ　リン酸バッファー（ｐ
Ｈ７，０）を加えて吸引濾過し、洗浄を行った。さらに
血清滴下位置にパーオキシダーゼ標識抗風疹抗体溶液１
００μｌを滴下し、３０分間放置した。０．１Ｍリン酸
バッファー（ｐ）ｌ　７．０）で洗浄を行った後、この
メンブランフィルタ−をそのまま基質溶液に浸潤し、攪
拌・反応させた後。

４９２ｎＩｒｌでこの溶液の吸光度を測定した。あらか
じめ作成した検量線をもとに血清中に存在する風疹抗体
を定量した。

（発明の効果） 本発明のキットを用いると、このように、生体内の免疫
活性物質を簡単な操作で短時間のうちに。

しかも精度良く測定することができる。被測定物質は酵
素反応による着色を観察することにより測定されるので
、従来の沈降反応を目視観察する場合に比べて、専門的
知識のない者でも簡単に測定を行うことができる。本発
明キットに用いられるシートは化学的に安定であるため
、従来の赤血球やラテックスを用いた測定キットに比べ
てはるかに保存性が良好である。このような測定キット
は。

特に、試料中の被測定物質を短時間で検出・半定量する
ための診断用キットとして有用である。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（１）蛋白質および／もしくはアミノ酸結合能力を
   有するシート、 （２）被測定物質に特異的な酵素標識化抗原もしくは抗
   体；または被測定物質に特異的な抗原もしくは抗体、お
   よび該抗原もしくは抗体に特異的な酵素標識化抗体もし
   くは抗原； （３）蛋白質および／もしくはアミノ酸、 （４）該酵素の基質、および （５）緩衝液、 を含有する免疫活性物質測定キット。 ２、前記シートが前記被測定物質を物理吸着、共有結合
   またはイオン結合により結合しうる特許請求の範囲第１
   項に記載の測定キット。 ３、前記シートが多孔質膜である特許請求の範囲第１項
   に記載の測定キット。 ４、前記シートがニトロセルロース製メンブランフィル
   ターである特許請求の範囲第１項、第２項または第３項
   に記載の測定キット。