JPS6298258A - 免疫学的測定法 - Google Patents

免疫学的測定法

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JPS6298258A
JPS6298258A JP23969385A JP23969385A JPS6298258A JP S6298258 A JPS6298258 A JP S6298258A JP 23969385 A JP23969385 A JP 23969385A JP 23969385 A JP23969385 A JP 23969385A JP S6298258 A JPS6298258 A JP S6298258A
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sheet
antibody
crp
protein
measured
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JP23969385A
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Takashi Kawasaki
隆志 川崎
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Nitto Denko Corp
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Nitto Electric Industrial Co Ltd
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 (産業上の利用分野) 本発明は、主として体液中の被測定物質を抗原抗体反応
を利用して測定する免疫学的測定法に関する。
(従来の技術) 体液中の特定の化学物質を免疫学的手法によって測定す
る方法としては、この被測定物質に特異的な抗原もしく
は抗体を担持させた赤血球やポリスチレンラテックス粒
子と被測定物質とを接触させて、その凝集反応を目視観
察する方法がある。
凝集反応を目視観察する代わりに分光光度計を用いて吸
光度を測定することも行われている。これらの方法は被
測定物質の定性もしく半定量には好適であるが、正確な
定量値を求めるのには適していない。最近2分光光度計
を用いた方法は盛んに検討され、装置も市販されている
が、臨床における充分なる信頼を獲得するには至ってい
ない。
被測定物質を定量的に測定するには、酵素免疫測定法(
エンザイム イムノアッセイ; EIA)や放射免疫測
定法(ラジオイムノアッセイ、 RrA)が利用されて
いる。IEIAとRIAのいずれの方法においても固相
法が好適に利用される。固相法のひとつとしてサンドイ
ツチ法が知られている。サンドイツチ法は被測定物質お
よびそれに特異的な抗原もしくは抗体が2つ以上の結合
部位をもつ場合に利用されうる。このサンドインチ法に
より例えばインシュリンを定量する場合には、まず、セ
ファデックス(フェルマシア社製)微粒子などの不活性
担体懸濁液に抗インシュリン抗体を加えて、これを該担
体に担持させる。この固相化抗体に被測定物質であるイ
ンシュリンを作用させ、該インシュリンを上記抗インシ
ュリン抗体に結合させる。次に、放射性物質や酵素で標
識した過剰量の抗インシュリン抗体をこれに作用させ、
標識化抗インシュリン抗体をインシュリンに結合させる
。このようにすると、被測定物質であるインシュリンは
抗インシュリン抗体にサンドイッチ状にはさまれた形態
となる。放射性物質で標識した場合は、洗浄後、上記酵
素反応後の固相系をオートラジオグラフィにかけると放
射性物質が検出されるためインシュリン量が算出されう
る。酵素で標識した場合は、これに基質を作用させて該
酵素反応による反応結果を測定1例えば発色状態を比色
定量、することにより酵素量が検出される。つまりイン
シュリン量が算出されうる。
上記サンドイツチ法などの固相法で測定を行う場合に1
例えば上記サンドインチ法において、不活性担体に抗イ
ンシュリン抗体と被測定物質であるインシュリンとが担
持された固相系に標識化抗インシュリン抗体を加えて反
応させた後、過剰量の抗インシュリン抗体を洗浄・除去
する必要がある。不活性担体として用いられるセファデ
ックスは微細な粒子であるため、洗浄を行うためには。
通常、数回の遠心分離操作を必要とする。このように、
固相法により被測定物質を測定する場合には、同相系に
結合した抗原もしくは抗体(boundform)と結
合しなかった抗原もしくは抗体(freeform)と
の分離(B/F分離)に煩雑な操作が必要であり、測定
に時間がかかるという欠点を有する。
上記遠心分離操作をなくして短時間で測定を行うために
、不活性担体として4〜6鰭程度の粒径を有するポリス
チレンビーズなどを使用して測定する方法も採用されて
いる。このような粒径の大きいビーズを用いるとデカン
テーションにより洗浄が行われるため操作が簡単である
。しかし、ビーズの総表面積が例えばセファデックスな
どの微細粒子を用いた場合よりも小さくなるため測定感
度が低い。
(発明が解決しようとする問題点) 本発明は上記従来の欠点を解決するものであり。
その目的とするところは、被測定物質を簡単な操作で短
時間に5かつ精度良く免疫学的に測定する方法を提供す
ることにある。本発明の他の目的は。
被測定物質を固相法を用いてEIA 、 RrAなどの
手法により簡単な操作で短時間にかつ精度良く測定する
方法を提供することにある。
(問題点を解決するための手段) 本発明の免疫学的測定法は、(1)被測定物質を蛋白質
および/もしくはアミノ酸結合能力を有するシートに付
与し、該被測定物質を結合させる工程。
(2)該被測定物質の結合したシートに蛋白質および/
もしくはアミノ酸溶液を付与し、該蛋白質および/もし
くはアミノ酸を該シートに結合させる工程。
(3)該シートに結合した該被測定物質に特異的な標識
化抗原もしくは抗体を加えて該被測定物質に結合させる
工程;または該シートに結合した該被測定物質に特異的
な抗原もしくは抗体を加えて該被測定物質に結合させた
後、該抗原もしくは抗体に特異的な標識化抗体もしくは
抗原を該抗原もしくは抗体に結合させる工程;および(
4)上記(3)項で結合したシート上の該標識化抗原も
しくは抗体の標識を検出する工程、を包含し、そのこと
により上記目的が達成される。
本発明方法に使用される蛋白質および/もしくはアミノ
酸結合能力を有するシートは、少なくともその表面に、
被測定物質(通常2蛋白質)を物理吸着、共有結合もし
くはイオン結合により結合させうる。物理吸着により被
測定物質を結合しうるシートの素材としては、ニトロセ
ルロース;活性炭、多孔性ガラス、カオリンなどの吸着
剤を含有する高分子重合体;などがある。共有結合によ
り被測定物質を結合しうるシートの素材としては。
該被測定物質を化学的に結合しうる(共有結合しうる)
基が導入された高分子重合体がある。例えば、臭化シア
ン、ジアゾニウム塩、酸アジド、イソシアネート活性型
ハロゲン化アルキルなどで活性化された高分子重合体が
ある。アミノ基を有する高分子重合体のアミノ基を使用
直前にジアルデヒド、例えばグルタルアルデヒド、など
により活性化させることによっても被測定物質を共有結
合させることができる。イオン結合により被測定物質を
結合しうるシートの素材としては、該被測定物質をイオ
ン結合しうるイオン交換基が導入された高分子重合体が
ある。このようなイオン交換基としてはスルホン酸基、
カルボキシル基などがある。シートの素材としては2例
えば、ナイロン。
レーヨン、ポリエステル、ビニロン、コツトン。
再生セルロース、酢酸セルロースは被測定物質を結合す
る能力がないため本発明方法には使用できない。
上記シートは、フィルム状、織布・不織布状。
多孔質膜状のいずれの形態であってもよい。特に。
表面積が大きい多孔質膜が好適に用いられる。本発明方
法には、特にニトロセルロース製の多孔質膜にトロセル
ロース製メンブランフィルタ−;孔径0.1〜100μ
m)が好適に用いられる。
本発明方法で測定しうる被測定物質は、抗原。
抗体などの免疫活性物質であれば特に限定されない。被
測定物質としては1例えば、ヒトや動物の免疫グロブリ
ン、α−フェトプロティン、C反応性蛋白(CRP)な
どの蛋白質;肝炎ウィルス関連抗体、風疹HA抗原など
の各種ウィルス抗原;各種細菌(例えば、トキソプラズ
マ、マイコプラズマ。
梅毒トレポネーマ)、真菌、毒素などの微生物抗原;ア
ルブミン、補体成分などの各種血漿蛋白成分;ニストロ
ジエン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン(IICG)などの
各種ホルモン;がある。これらを抗原としたときの抗体
も測定が可能である。
本発明方法において使用される標識化被測定物質、抗原
、抗体などは通常の標識化の手法により得られる。標識
物質としては放射性物質、酵素。
螢光物質などが用いられ得、標識すべき物質に適したも
のが選択される。放射性物質としては1例えば+31■
または125■が利用され、被標識化物質にクロラミン
T法、ラクトペルオキシダーゼ法、ポルトン・ハンター
法、ヨードケン法などにより結合される。酵素としては
、特に着色反応を行う反応を触媒するものが好適に用い
られる。そのような酵素としては、パーオキシダーゼ、
カタラーゼ。
β−グルクロニダーゼ、β−D−ガラクトシダーゼ、ウ
レアーゼ、アルカリホスファターゼがある。
これらの酵素は9例えば、カルボジイミド類、ジアルデ
ヒド類、ジイソシアネート類、ビスジアゾヘンジジンな
どにより被標識化物質に共有結合させるごとができる。
螢光物質としては、フルオレセインイソチオシアネート
、テトラローダミンイソチオシアネートなどが用いられ
、常法により被標識化物質に結合される。
本発明方法により被測定物質を測定するには。
通常3次の方法(第1の方法)が採用される。これをC
RPを測定する場合を例に挙げて説明する。
まず、被測定物質(CRP)を含有する試料を上記蛋白
質および/もしくはアミノ酸結合能力を有するシートに
付与し、CRPをシートに結合させる。このとき試料と
して例&ば血清を用いると。
血清中に含有されるCRP以外の血漿蛋白質もシートに
結合する。次にこのシートに過剰量の蛋白質および/も
しくはアミノ酸溶液1例えばゼラチン溶液やグリシンを
含有するバッファーを付与する。するとこの蛋白質やア
ミノ酸はシートの蛋白質(アミノ酸)結合能を有する残
余部分に結合(飽和結合)する。これに、被測定物質に
特異的な過剰量の標識化抗原もしくは抗体(抗CRP抗
体)を作用させると、この標識化抗CRP抗体はもはや
シートには結合せず、シートに結合しているCRPに特
異的に結合する。シートを洗浄して、結合しなかった標
識化抗CRP抗体を除去する。シート上の標識を検出す
ることによりCRP量が算出される。例えば、パーオキ
シダーゼ標識抗CRP抗体を用いた場合には、パーオキ
シダーゼの基質である過酸化水素とO−フェニレンジア
ミンとを含有する溶液に上記反応後のシートを浸漬して
攪拌し9着色した溶液の吸光度を測定することにより測
定がなされる。
上記方法の他2次に示す第2の方法によっても測定がな
されうる。まず、蛋白質および/もしくはアミノ酸結合
能力を有するシートに被測定物質を加えて結合させた後
、上記方法と同しく蛋白質および/もしくはアミノ酸溶
液で処理を行う。次に、被゛a(1定物質に特異的な過
剰量の抗原もしくは抗体を上記シート上に結合した被測
定物質に結合させる。結合しなかった抗原もしくは抗体
を洗浄・除去した後、この抗原もしくは抗体に特異的な
標識化抗体もしくは抗原を、上記抗原もしくは抗体に結
合させる。結合しなかった標識化抗体もしくは抗原を洗
浄・除去した後、上記第1の方法と同様に、シート上の
標識の検出を行うと被測定物質が測定される。この方法
は被測定物質に特異的な抗原もしくは抗体の標識化が難
しいため第1の方法による測定が困難である場合などに
採用される。
(作用) このように1本発明方法では、シート上で抗原抗体反応
が行われるため、従来のセファデックス粒子を用いた固
相法のようにB/F分離のために遠心分離操作を行う手
間がかからず、短時間で測定がなされる。シートとして
、織布、不織布または多孔質膜を用いると反応系の水分
を濾過して除去することが容易であるため洗浄が節単に
行われろる。微細な孔を有する多孔質膜を利用すると。
その表面積が非常に広いため高感度で測定がなされる。
上記方法では被測定物質がシートに直接結合されるため
、従来の固相法(例えば、セファデックス粒子などの担
体に被測定物質に特異的な抗原もしくは抗体を介して被
測定物質を結合させる方法)に比べて反応工程が1段階
少なくてすむ。特に。
上記第1の方法を採用すると簡単な操作で短時間のうち
に測定が行われうる。上記従来の固相法では、担体に所
望の抗原もしくは抗体を担持させたまま使用時まで保存
する場合が多いが、該抗原もしくは抗体自身が蛋白質で
あるため、変質しやすい。これに対して本発明方法で使
用するシートは化学的に安定であるため長期間の保存が
可能であり、正確な測定値が得られる。
(実施例) 本発明を実施例につき説明する。
L皿 酵素標識法によるCRPの測定 (A)抗CRP抗体の潤製:ヒトの血清から分離したC
RPをウサギに免疫し、抗血清を採取した。この抗血清
をアフィニティクロマトグラフィーにより精製してIg
G分画を得、これを抗CRP抗体とした。
(B)パーオキシダーゼ標識抗CRP抗体の鋼製= (
A)項で得られた抗CRP抗体を用い、下記の過りウ素
酸架橋法によりパーオキシダーゼ標識抗CRP抗体を調
製した。
過ヨウ素酸架橋法によるパーオキシダーゼ標識抗CRP
抗体の調製:パーオキシダーゼ(Sigma社: Ty
pe Vl ) 5 rrg/m e Q容;夜1容に
1%の1−フルオロ−2・4−ジニトロベンゼンエタノ
ール熔/i 1/10容を加えて、室温で1時間反応さ
せた。
これに0.06M過ヨウ素酸ナトリウム1/10容を加
え5室温で30分間反応させた後、 0.16Mエチレ
ングリコール1/10容を加えて室温で1時間反応させ
た。これを5ephadex G−25(ファルマシア
社;fine)のカラムにかけて未反応試薬を除去した
後。
5■7mlの抗CRP抗体1容を加え、室温で3時間反
応させた。さらに5■1mlの水素化ホウ素ナトリウム
1容を加え、4℃で一晩放置した後、 5e−phad
ex G−200(ファルマシア社)のカラムにかけて
パーオキシダーゼ標識抗CRP抗体を得た。
(C)CRPの測定:ヒト血清30μlを吸引濾過器に
セットしたニトロセルロースメンブランフィルタ−(孔
径0.45μm 、厚み150μm、直径25龍)に滴
下し、 15分間放置した。フィルター上に1%ゼラチ
ン水溶液(DIFCO社製;バクトゼラチン)100μ
lを滴下し、5分後に吸引濾過した。次に(B)項で得
られたパーオキシダーゼ標識抗CRP抗体溶液の400
倍希釈液30μiをヒト血清を滴下したのと同じ位置に
滴下し、20分間放置した。
これに0.01Mホウ酸バッファー(pH7,2)を加
えて吸引濾過し、洗浄を行った。洗浄後のメンブランフ
ィルタ−をそのまま過酸化水素およびO−フェニレンジ
アミンをそれぞれ5mMおよび28mMの割合で含有す
る基質溶液に浸漬し、PR拌・反応させた後、 492
nmでこの溶液の吸光度を測定した。あらかしめ作成し
た検量線をもとに血清中に存在するCRPを定量した。
(D)毛細管法との比較:CRPを種々の濃度で含有す
る複数の試料液を調製し、 (C)項の方法で操作を行
い、吸光度を測定した。本発明方法の精度を従来の毛細
管法と比較する目的で、同一の試料について、従来の毛
細管法でも測定を行った。その相関関係を表1に示す。
表1において。
枠内の数字は試料数を示す。本発明による(E)項の方
法で測定された吸光度は2表2に示すように1毛細管法
における−〜6+までの8段階の測定基準に対応するよ
うに8段階に等紙分けされた。
(以下余白) 表1 − ± 1+ 2+ 3+ 4+ 5+ 6+本発明に
よる評価値 表2 次11性I 酵素標識法によるα−フェトプロティンの測定(A)抗
α−フェトプロティン抗体の調製:ヒトのガン患者の腹
水から採取したα−フェトプロティンを精製後ウサギに
免疫し、抗血清を採取した。この抗血清をアフィニティ
クロマトグラフィーにより精製してIgG分画を得、こ
れを抗α−フェトプロティン抗体とした。
CB)アルカリホスファターゼ標識抗α−フェトプロテ
ィン抗体の調製:本実施例(A)項で得られた抗α−フ
ェトプロティン抗体を用い、下記の方法でアルカリホス
ファターゼ標識抗α−フェトプロティン抗体を得た。
アルカリホスファターゼ標識抗α−フェトプロティン抗
体の調製法7 100μlのアルカリホスファターゼ硫
酸アンモニウム懸濁液(5■/1lll)をガラス試験
管に取り20QOXgで遠心し、上清を除いたのち沈渣
を0.1Mリン酸緩衝液(pH6,8)150μlに溶
解した。次いでこの溶液100II!!を抗CRP抗体
溶液(抗CRP抗体100μgを0.1Mリン酸緩衝液
(pH6,8) 100μlに溶解)に加えたのち1,
5%グルタルアルデヒド溶液12μlを加え、直ちに攪
拌混和後、25℃で3時間放置した。次いで0、1Mリ
ン酸緩衝液(pH6,8)200 m e中で一夜透析
したのち0.IM リン酸緩衝液(pH6,8)で全量
を15mffに希釈した。
(C)α−フェトプロティンの測定:表面を若干加水分
解しアミノ基を導入したポリアミド製の不織布(直径3
0龍、厚み1m*)にグルタルアルデヒドを作用させて
活性化した後、ヒト血清50μlを滴下し、15分間放
置した。次に0.01Mグリシンバッファーを加えて過
剰のアルデヒド基を消費させると共にこのバッファーで
洗浄を行った。さらに(B)項で得られたアルカリホス
ファターゼ標識抗α−フェトプロティン抗体溶液50μ
lを血清と同じ位置に滴下し、20分間放置した。これ
を0.01Mグリシンバッファー(pH7,5)で洗浄
した後、証清滴下位置を中心に直径15鶴の円形に切り
抜いた。
これを、フェニルリン酸ニナトリウムを1■/m1゜4
−アミノアンチピリンを0.45■/m2.そしてフェ
リシアン化カリウムを1■/mlの割合で含有する基質
1容液に漫゛漬し、攪拌・反応させた後、 500nm
でこの)8液の吸光度を測定した。あらかしめ作成した
検量線をもとに血清中のα−フェトプロティンを定■し
た。α−フェトプロティンの標($溶液を用いて測定し
た結果、試料中のα−フェトプロティンは5〜600n
g/m Eの範囲で定量できることが確認された。
夫施桝工 放射性物質標識法によるα−フェトプロティンの測定 (A)抗α−フェトプロティン抗体の調製:実施例2 
(A)項と同様である。
(B)”’I標識抗α−フェトプロティン抗体の調製:
抗α−フェトプロティン抗体溶1夜(4■/mり)20
0μ5にIZS■を2mC1,ラクトペルオキシダーゼ
およびグルコースオキシダーゼをそれぞれ4μg。
そしてブドウ糖を20mMとなるように加え、室温で3
0分間反応させた。これに窒化ナトリウムl0mMを加
えて反応を停止させ、 0.05M ’Jン酸緩衝液(
p117.5)に透析後、沈澱物を遠心分離にて除去し
″2J標識抗α−フェトプロティン抗体を得た。
(C)α−フェトプロティンの測定:ヒト血清50μp
を吸引濾過器にセットしたニトロセルロースメンブラン
フィルタ−(孔径0.20μm、厚み160μm、直径
251m)に滴下し、20分間放置した。フィルター上
に1%ゼラチン水溶液を100μ!滴下し、10分間放
置した後吸引濾過した。次に(B)項で得られた125
■標識抗α−フェトプロティン抗体溶液の1,000倍
希釈液100μeをヒト血清を滴下したのと同し位置に
滴下し、20分間放置した。
これに未結合の標識物を洗浄するために0.01Mグリ
シンバッファー(ρl(7,2)を加えて吸引濾過し洗
浄を行った。洗浄後のメンブランフィルタ−上の放射性
物質(+Z51)の債をシンチレーションカウンターで
測定し、あらかじめ作製した検量線から血清中のα−フ
ェトプロティン量を算出した。
夫施烈↓ 酵素標識法による風疹抗体の測定 (A)抗風疹抗体の調製:風疹抗原(LEE社製)をウ
サギに免疫し、抗血清を採取した。この抗血清?アフィ
ニティクロマトグラフィーにより精製して1IKG分画
を得、これを抗風疹抗体とした。
(13)パーオキシダーゼ標識抗風疹抗体の調製:木実
施例(A)項で得られた抗風疹抗体を用い。
実施例1 (B)項の方法に〈Vじてパーオギシダーゼ
標識抗風疹抗体を得た。
(C)風疹抗体の測定;ヒト血清30μgを吸引dy、
 +U A3にセットしたニトロセルロースメンブラン
フィルタ−(孔径0.45μm、厚み150μm、直径
251m)に滴下し、15分間放置した。フィルター−
にに1%ゼラチン水溶液(DIFCO社製;ハクトゼラ
チン)100μpを滴下し、5分後に吸引濾過した。
次に風疹抗原(LEE社製)溶液(25μg /m/)
 10μpをヒト血清を滴下したのと同じ位置に滴下し
30分間放置した。これに0.1M リン酸バッファー
(pif 7.0)を加えて吸引濾過し、洗浄を行った
さらに血清滴下位置に(B)項で得られたパーオキンダ
ーゼ標識抗風疹抗体溶液の100倍希釈液100μpを
滴下し、30分間放置した。0.1M リン酸ハソファ
−(pH7,0)で洗浄を行った後、このメンブランフ
ィルタ−をそのまま過酸化水素および0−フェニレンジ
アミンをそれぞれ5mMおよび28mMの割合で含有す
る基質溶液に浸漬し、攪拌・反応させた後、 492n
mでこの溶液の吸光度を測定した。
あらかじめ作成した検量線をもとに血清中に存在する風
疹抗体を定量した。
(発明の効果) 本発明方法によれば、このように、免疫学的手法により
体液成分などの被測定物質を簡単な操作で短時間のうち
に、しかも精度良く測定することができる。この方法は
、従来の固相法を用いたEIAやl?TAに比べて測定
方法も簡単であるため、従来法に代えて多方面で利用さ
れうる。
以上

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1、(1)被測定物質を蛋白質および/もしくはアミノ
    酸結合能力を有するシートに付与し、該被測定物質を結
    合させる工程、 (2)該被測定物質の結合したシートに蛋白質および/
    もしくはアミノ酸溶液を付与し、該蛋白質および/もし
    くはアミノ酸を該シートに結合させる工程、 (3)該シートに結合した該被測定物質に特異的な標識
    化抗原もしくは抗体を加えて該被測定物質に結合させる
    工程;または該シートに結合した該被測定物質に特異的
    な抗原もしくは抗体を加えて該被測定物質に結合させた
    後、該抗原もしくは抗体に特異的な標識化抗体もしくは
    抗原を該抗原もしくは抗体に結合させる工程;および (4)上記(3)項で結合したシート上の該標識化抗原
    もしくは抗体の標識を検出する工程、 を包含する免疫学的測定法。 2、前記シートが前記被測定物質を物理吸着、共有結合
    またはイオン結合により結合しうる特許請求の範囲第1
    項に記載の測定法。 3、前記シートが多孔質膜である特許請求の範囲第1項
    に記載の測定法。 4、前記シートがニトロセルロース製メンブランフィル
    ターである特許請求の範囲第1項、第2項または第3項
    に記載の測定法。 5、前記標識化が酵素、放射性物質または螢光物質によ
    りなされる特許請求の範囲第1項に記載の測定法。
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