JP3396231B2 - 免疫反応測定用試薬および免疫反応測定法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、高感度で非特異反応が
少ない免疫反応測定用試薬および免疫反応測定方法に関
する。

【０００２】

【従来の技術】各種生体成分から特定の被測定物質を検
出もしくは定量するために抗原抗体反応が利用されてい
る。例えば、試料中の抗原の測定に際し、該抗原に対応
する抗体をラテックスなどを担体として担持させ、その
免疫反応により生じた凝集の程度を検出することによ
り、試料中に含まれる抗原を検出あるいは定量する方法
がとられている。この凝集の程度を検出する方法として
は、凝集の有無を肉眼により目視観察し、判定する方法
と、反応液に光を照射して散乱光あるいは透過光を測定
する方法がある。

【０００３】肉眼で判定する方法は、一般に不溶性担体
に担持された抗体と試料中の抗原との凝集の状態を肉眼
で判定し、試料中の抗原の有無の判定、あるいは半定量
分析として用いられている。光学的な測定方法は、試料
中の抗原の定量分析に用いられている。このほかに、抗
原抗体反応の検出を酵素反応を利用して発色として捕ら
える方法、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法
（ＲＩＡ）など各種方法が知られている。

【０００４】上記各種の免疫反応の測定法において、測
定感度の向上あるいは、抗原抗体反応の促進を目的とし
て種々の添加剤が用いられている。例えば、特開昭５９
−５４９６８号公報には、赤血球凝集反応の促進剤とし
て、リン酸緩衝液に溶解したポリエチレングリコールを
使用する方法が開示されており、特公昭６３−４５０６
６号公報には、リウマチ因子の測定において、凝集促進
剤としてポリエチレングリコールまたはポリビニルアル
コールを用いる方法が開示されており、さらに、特開平
２−１７３５６７号公報には、免疫反応測定に際し、反
応系にアルキル化多糖類を添加する方法が開示されてい
る。これらの添加剤は水溶性または親水性ポリマーであ
り、これらを加えることにより、疎水性相互作用により
進行する抗原抗体反応が促進される。例えば、上記のラ
テックスを担体として用いる方法では、抗原抗体反応が
促進された結果、ラテックス間の凝集反応が促進され
る。反応系に添加される水溶性または親水性ポリマーの
濃度は適宜決められる。例えば、ラテックス凝集反応を
用いる系では、反応時に水溶性または親水性ポリマーと
ラテックス懸濁液が混合されたときにラテックス溶液が
自己凝集を起こさない範囲で、上記水溶性または親水性
ポリマーの濃度が決定される。しかしこれらの添加剤を
加えることにより抗原抗体反応は促進されるが、担体自
身の非特異的凝集、および血液中のリウマチ因子のよう
な挾雑物質による抗原抗体反応以外の非特異反応もまた
促進されることがあり、測定系としてみた場合に、感度
が上昇しているとはいえない場合もある。さらに、ポリ
エチレングリコールの市販品は、２９０ｎｍ付近に吸収
を有する不純物を含有することが多い。そのため、使用
前に精製する必要があり、取り扱いが煩雑となる。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、従来の問題
点を解決するものであり、その目的とするところは、担
体間の凝集、抗原抗体反応以外の非特異反応が抑制さ
れ、かつ凝集促進効果の高い免疫測定用試薬および免疫
反応測定方法を提供することにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明の免疫測定用試薬
は、被測定物質である抗原または抗体に対する抗体また
は抗原が担持された担体（但し、無機化合物からなるも
のを除く）、およびプルランを含有し、そのことにより
上記の目的が達成される。

【０００７】本発明の免疫測定法は、抗原または抗体で
ある被測定物質を、該抗原または抗体に対する抗体また
は抗原を担持させた担体（但し、無機化合物からなるも
のを除く）を用い、免疫反応により測定する方法であっ
て、該免疫反応の反応系にプルランを存在させ、そのこ
とにより上記の目的が達成される。

【０００８】本発明に用いられるプルランとは、α−
１、４結合のマルトトリオースがその両端でα−１、６
結合により繰り返し重合した直鎖状のαグルカンであ
る。プルランの分子量は、１０００以上１，０００，０
００以下が適当である。分子量が大きすぎると、水に溶
解させたときの粘度が高くなるため、取り扱いが困難と
なる。

【０００９】本発明により測定されるべき物質は特に限
定されず、一般に抗原抗体反応を利用して測定し得る生
理活性物質はいずれも測定が可能である。被測定物質と
しては、タンパク、脂質などがあり、それには例えば、
各種抗原、レセプター、酵素などが挙げられる。具体的
には、Ｃ反応性タンパク（ＣＲＰ）、繊維素分解産物
（ＦＤＰ）、癌胎児性抗原（ＡＦＰ）などの血液中タン
パク、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢ）、Ｃ型肝炎ウイルス
（ＨＣ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびこ
れらに対する抗体などの、感染症に関する抗原、抗体な
どが挙げられる。

【００１０】本発明により被測定物質を測定する場合の
測定系としては、例えば免疫比濁法、ＥＩＡ、ＲＩＡな
どが利用され得る。例えば、ラテックス試薬を用いた免
疫反応により、被測定物質を測定する場合には、被測定
物質である抗原または抗体に対応する抗体または抗原を
担持させたラテックスを含有する溶液に、あらかじめプ
ルランを添加しておく。このような試薬を用いて免疫凝
集反応を行い、生じた凝集の程度を光学的に観察もしく
は目視観察することにより被測定物質が測定され得る。
あるいは、プルランを含まないラテックスを使用するこ
とも可能であり、この場合には免疫反応時にプルランが
該反応系に存在するようにすればよい。例えば、検体希
釈液としてプルランを添加しておく方法；使用する試薬
中にプルランを加えておく方法などがあり、特に限定さ
れない。反応時に含有されるプルランは、反応系に０．
０１〜５％（ｗ／ｖ）、好ましくは、０．１〜３％（ｗ
／ｖ）の割合で含まれるように調製を行う。本発明によ
る測定では、反応の際のｐＨは５〜１０、特に、６〜８
が好ましい。使用する緩衝液は、リン酸緩衝液、トリス
緩衝液、グリシン緩衝液、アンモニア緩衝液など、被測
定物質を失活させることなく、かつ、抗原抗体反応を阻
害しないようなイオン強度やｐＨを有するものであれば
よい。反応温度は０〜５０℃、特に２０〜４０℃が好ま
しい。

【００１１】以下に実施例を挙げ本発明を説明する。

【００１２】

【実施例】（実施例１） 〔ラテックス凝集法を用いたＣＲＰの肉眼判定による測
定〕 本実施例においては、次に挙げる試薬および測定検体を
使用した。後述の実施例３・５および比較例１〜３にお
いても特に指示されない限り、同名の試薬については、
同様のものを使用した。

【００１３】ＰＢＳ（リン酸緩衝液）：リン酸一ナトリ
ウム（２水和物）、リン酸二ナトリウム（２水和物）お
よび塩化ナトリウムを、リン酸および塩化ナトリウムの
終濃度がそれぞれ０．０２Ｍ、０．１５Ｍ、ｐＨが７．
２となるように精製水を加えて調製した。

【００１４】１％ＢＳＡ−ＰＢＳ：ＰＢＳに試薬特級Ｂ
ＳＡ（ウシ血清アルブミン）を１％（ｗ／ｖ）となるよ
うに溶解させて調製した。

【００１５】３％ポリエチレングリコール：１％ＢＳＡ
−ＰＢＳにポリエチレングリコール６０００（和光純薬
工業社製）を３％（ｗ／ｖ）となるように溶解させた。

【００１６】３％デキストラン：１％ＢＳＡ−ＰＢＳに
デキストラン（シグマ社製 平均分子量１９５００）を
３％（ｗ／ｖ）となるように溶解させた。

【００１７】３％ポリビニルアルコール：１％ＢＳＡ−
ＰＢＳにポリビニルアルコール（和光純薬工業社製 重
合度約５００）を、３％（ｗ／ｖ）となるように、溶解
させた。

【００１８】０．３％メチルセルロース（ＭＣ）：１％
ＢＳＡ−ＰＢＳにメチルセルロース（和光純薬工業社製
平均粘度４００ｃｐｓ）を０．３％（ｗ／ｖ）となる
ように溶解させた。

【００１９】１％プルラン：１％ＢＳＡ−ＰＢＳにプル
ラン（林原生物化学研究所製、平均分子量 約２０００
００）を１％（ｗ／ｖ）となるように溶解させた。

【００２０】上述のポリエチレングリコール、デキスト
ラン、ポリビニルアルコールおよびメチルセルロースの
濃度は、抗原または抗体担持ラテックスと各ポリマー溶
液を混合した際に、凝集の有無を調べ、凝集しない範囲
で、できるだけ高い濃度とした。

【００２１】（Ｉ）抗ＣＲＰ抗体のラテックスへの担持 ヒツジ抗ＣＲＰ抗体ＩｇＧ分画（生化学工業社製）を１
mg/mlとなるようにＰＢＳに分散させ、これを１０ml
と、ポリスチレンラテックス（積水化学工業（株）社
製、粒径０．２３μｍ、固形分１０％（ｗ／ｖ））５０
０μｌとを混合し、室温で１時間攪拌した。その後、１
５０００ｒｐｍで１時間遠心し、その遠心後の沈澱を１
０mlの１％ＢＳＡ−ＰＢＳに懸濁し、洗浄した。これを
２回繰り返し、遠心後の沈澱を１０mlの１％プルランに
懸濁し、抗ＣＲＰ抗体担持ラテックス試薬を作成した。

【００２２】（II）ＣＲＰの測定 検体１００μｌと（Ｉ）項で得られた抗ＣＲＰ抗体担持
ラテックス１００μｌを凝集判定板（積水化学工業
（株）社製）に採り、混合・攪拌し反応させた。検体と
しては、１０倍、１００倍、および２００倍にそれぞれ
希釈したＣＲＰ陽性ヒト血清（ＣＲＰ濃度１００μg/m
l）、および血清中の挾雑物質としてリウマチ因子（Ｒ
Ｆ）１９００単位を含むＲＦ陽性血清（ＣＲＰ測定用キ
ットであるセラテスタムＣＲＰ−Ｅ（日立化成工業社
製）でＣＲＰ濃度０．０１mg/dl以下であることを確
認）を用い、対照としては、セラテスタムＣＲＰ−Ｅで
ＣＲＰ濃度が０．０１mg/dl以下であった正常ヒト血清
を用いた。攪拌３分後にラテックスの凝集が目視観察さ
れた場合を陽性、観察されなかった場合を陰性とした。
その結果を表１に示す。後述の比較例１の結果も合わせ
て表１に示す。表１において、＋は陽性、そして−は陰
性を示す。

【００２３】（比較例１） １％プルランの代わりに１％ＢＳＡ−ＰＢＳ、３％ポリ
エチレングリコール、３％デキストラン、３％ポリビニ
ルアルコールおよび０．３％メチルセルロースをそれぞ
れ用いたこと以外は、実施例１と同様に行った。

【００２４】

【表１】

【００２５】表１より、デキストラン、ポリビニルアル
コールおよびメチルセルロースでは感度が低く、ポリエ
チレングリコールではＣＲＰに対する感度は高いが、血
清中の挾雑物質であるＲＦに対しても凝集を起こしてお
り、実質的に感度は上昇していない。これに対し、本発
明のラテックス試薬を用いると、挾雑物質との間の反応
は起こっていないのに対し、ＣＲＰとの反応性は上昇し
ており、特異的に感度が上昇していることがわかる。

【００２６】（実施例３） 〔分光光度計を用いたラテックス凝集によるＡＦＰの測
定〕 （Ｉ）抗ＡＦＰ抗体のラテックスへの担持 ヒツジ抗ＡＦＰ抗体ＩｇＧ分画（生化学工業社製）を１
mg/mlとなるようにＰＢＳに分散させ、この分散液１０m
lと、ポリスチレンラテックス（積水化学工業（株）社
製、粒径１０μｍ、固形分１０％（ｗ／ｖ））５００μ
ｌとを混合し、室温で１時間攪拌した。その後、１５０
００ｒｐｍで１時間遠心し、その遠心後の沈澱を１０ml
の１％ＢＳＡ−ＰＢＳに懸濁し、洗浄した。これを２回
繰り返し、遠心後の沈澱を１０mlの１％ＢＳＡ−ＰＢＳ
に懸濁し、抗ＡＦＰ抗体担持ラテックス試薬を得た。

【００２７】（II）ＡＦＰの測定 検体１００μｌと１％プルラン１７５０μｌとを混合
し、５分後に（Ｉ）項で得られた抗ＡＦＰ抗体担持ラテ
ックスを２５０μｌを分光光度計用キュベットに採り、
混合・攪拌し、３７℃で５分間反応させた。検体として
は、１０倍、１００倍、および２００倍にそれぞれ希釈
したＡＦＰ陽性ヒト血清（ＡＦＰ濃度１μg/ml）、およ
び血清の挾雑物質としてリウマチ因子（ＲＦ）１９００
単位を含むＲＦ陽性血清を用い、対照としては、ＡＦＰ
測定用キット、イアトロエースＡＦＰ（ヤトロン社製）
で１ng/dl以下であった正常ヒト血清を用いた。上記抗
ＡＦＰ抗体担持ラテックス混合直後と反応５分後の吸光
度（５７０ｎｍ）を測定し、それらの差（△ＡＢＳ）を
計算した。その結果を表２に示す。後述の比較例２の結
果も合わせて表２に示す。表２中の数字は、△ＡＢＳ×
１００００を示す。

【００２８】（比較例２） １％プルランの代わりに１％ＢＳＡ−ＰＢＳ、３％ポリ
エチレングリコール、３％デキストラン、３％ポリビニ
ルアルコールおよび０．３％メチルセルロースをそれぞ
れ用いたこと以外は、実施例３と同様に行った。

【００２９】

【表２】

【００３０】表２より、デキストラン、ポリビニルアル
コールおよびメチルセルロースでは反応感度の上昇が少
なく、ポリエチレングリコールではＡＦＰに対する反応
性は上昇しているが、血清中の挾雑物質であるＲＦに対
しても凝集を起こしており、実質的な感度は上昇してい
ない。これに対し、本発明のラテックス試薬を用いる
と、挾雑物質との間の反応は起こっていないのに対し、
ＡＦＰとの反応性は上昇しており、特異的に感度が上昇
していることがわかる。

【００３１】（実施例５） 〔酵素免疫測定法によるＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）抗
体の測定〕 （Ｉ）ＨＢｓ抗原担持ポリスチレンビーズの作製 １）ＨＢｓ抗原液 ヒト血漿よりアフィニティークロマトグラフィーにより
精製した精製ＨＢｓ抗原を使用した。抗原はＰＢＳに溶
解し、濃度をローリー法により測定した。

【００３２】２）ＨＢｓ陽性家兎血清 精製ＨＢｓ抗原をフロイントのアジュバントとともに家
兎に免疫して得られた抗血清を正常ヒト血清を結合させ
たカラムで吸収操作をしてから用いた。

【００３３】３）ペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧ ペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧ（ヤギ産生、生化
学工業製）を１％ＢＳＡ−ＰＢＳで１０００倍に希釈し
て使用した。

【００３４】４）ペルオキシダーゼ基質 ｏ−フェニレンジアミン（３０mg錠剤、シグマ社製）１
錠を０．１Ｍリン酸−クエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）１
５mlで溶解し、さらに過酸化水素濃度０．０３％（ｗ／
ｖ）となるように過酸化水素水を加え基質とした。基質
の調製は使用直前に行った。

【００３５】５）ＨＢｓ抗原のポリスチレンビーズへの
担持 ＰＢＳで１μg/mlに希釈したＨＢｓ抗原液１０mlに、1/
4インチポリスチレンビーズ（積水化学工業（株）製）
５０個を加え、攪拌後３７℃で２時間インキュベートし
た。抗原溶液を吸引により除去し、２０mlの生理食塩水
を加え、攪拌し洗浄した。３回洗浄後、１％ＢＳＡ−Ｐ
ＢＳを１０ml加え、３７℃で２時間インキュベートし、
ブロッキングを行った。次いで、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで
３回洗浄し、１％ＢＳＡ−ＰＢＳを１０ml加え、ＨＢｓ
抗原担持ポリスチレンビーズを得た。

【００３６】（II）ＨＢｓ抗体の測定 第１抗体を含む検体として、１００倍、２００倍、およ
び４００倍にそれぞれ希釈したＨＢｓ陽性血清１００μ
ｌ；対照として正常ウサギ血清１００μｌ；および血清
自身の挾雑物質としてリウマチ因子（ＲＦ）１９００単
位を含むＲＦ陽性血清１００μｌのそれぞれを、１％プ
ルラン１０００μｌ、および上記ＨＢｓ抗原担持ポリス
チレンビーズ１個と試験管中で混合した。これを３７℃
で６０分間インキュベートした後、ビーズを１％ＢＳＡ
−ＰＢＳ５mlで３回洗浄した。その後、第２抗体とし
て、ペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧを１mlそれぞ
れに加え、３７℃で１時間インキュベートした。ビーズ
を１％ＢＳＡ−ＰＢＳ５mlで３回洗浄し、試験管にペル
オキシダーゼ基質を１ml加え、室温で１５分間インキュ
ベートした。これに１Ｎ硫酸を１ml加え、酵素反応を停
止させた。基質ブランクとして、第１抗体（または正常
血清またはＲＦ陽性血清）、および第２抗体のいずれを
も加えない試験管を用意し、ペルオキシダーゼ基質を１
ml加え、室温で１５分間インキュベートし、次いで、１
Ｎ硫酸１mlを加え酵素反応を停止させた試験管を用意し
た。この基質ブランクを対照として分光光度計で４９２
nmの吸光度を測定した。その結果を表３に示す。後述の
比較例３の結果も合わせて表３に示す。表３中の数字
は、吸光度を１００００倍した値である。

【００３７】（比較例３） １％プルランの代わりに１％ＢＳＡ−ＰＢＳ、３％ポリ
エチレングリコール、３％デキストラン、３％ポリビニ
ルアルコールおよび０．３％メチルセルロースをそれぞ
れ用いたこと以外は、実施例５と同様に行った。

【００３８】

【表３】

【００３９】表３より、デキストラン、ポリビニルアル
コールおよびメチルセルロースでは反応感度の上昇が少
なく、ポリエチレングリコールでは、ＨＢｓに対する反
応性は上昇しているが、血清中の挾雑物質であるＲＦに
対しても非特異的反応を起こしており、実質的に感度が
上昇していない。これに対し、本発明のＥＩＡ試薬を用
いると、挾雑物質との間の反応は起こっていないのに対
し、ＨＢｓとの反応性は上昇しており、特異的に感度が
上昇している。

【００４０】

【発明の効果】本発明によれば、このように免疫反応を
利用した被測定物質の測定において、非特異反応が抑制
され、かつ、高感度に被測定物質が測定され得る。本発
明は、ラテックス試薬を利用した免疫測定法、ＥＩＡ、
ＲＩＡなどに、利用が可能である。

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 被測定物質である抗原または抗体に対す
   る抗体または抗原が担持された担体（但し、無機化合物
   からなるものを除く）、およびプルランを含有する免疫
   反応測定用試薬。
2. 【請求項２】 抗原または抗体である被測定物質を、該
   抗原または抗体に対する抗体または抗原を担持させた担
   体（但し、無機化合物からなるものを除く）を用い、免
   疫反応により測定する方法であって、該免疫反応の反応
   系にプルランを存在させることを包含する、免疫反応測
   定法。