CN101023066A - 作为朊病毒蛋白配体的被取代的三嗪及其检测和去除朊病毒的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有结构式(I)的化合物的用途：其中R1和R2相同或不同，各自为任选被取代的烷基、任选被取代的环烷基、任选被取代的芳基或任选被取代的杂芳基；R3是氢或芳基取代基或者R3是任选经由间隔基连接的固体载体；Z代表氧原子、硫原子或NR4；Y代表氧原子、硫原子或NR5；其中R4和R5可以相同或不同，表示氢，任选被取代的含1－6个碳原子的烷基、任选被取代的苯基、任选被取代的苄基，或任选被取代的β－苯乙基；和X1和X2中的一个表示氮原子，X1和X2中另一个表示氮原子或CR6，其中R6表示氢或芳基取代基；可用于与朊病毒蛋白的亲和结合。

Description

作为朊病毒蛋白配体的被取代的三嗪及其检测和 去除朊病毒的应用
技术领域
本发明涉及蛋白质-配体相互作用领域，特别是与朊病毒蛋白(″朊病毒蛋白配体″)结合的化合物，及使用该化合物从生物样本中检测或去除朊病毒(prion)的方法。
背景技术
天然或细胞的朊病毒蛋白“PrPc”广泛分布于哺乳动物中，具有特别保守的氨基酸序列和蛋白质结构。传染性朊病毒被认为是由正常细胞(PrPc)朊病毒蛋白的修饰形式所构成，称为“PrPsc”。朊病毒具有一些与其它传染性病原体相同的性质，但并不显示含有核苷酸。反而有提议认为翻译后的构象变化与非传染性PrPc转变成为传染性PrPsc有关，在这一过程中α-螺旋转换为β-折叠。PrPc含3个α-螺旋，基本不含β-折叠结构；相反，PrPsc富含β-折叠。认为PrPc到PrPsc的转变导致了传染性海绵状脑病(TSEs)的形成，在这一过程中，PrPsc在中枢神经系统(CNS)蓄积并伴有神经病理性改变和神经机能障碍。PrPsc，通常是指朊病毒蛋白的“绵羊瘙痒病”型，被认为是动物和人的传染性神经变性疾病的传播和发病的必要和可能的充分条件。
TSEs的具体例子包括绵羊瘙痒病，它影响绵羊和山羊；牛海绵样脑病(BSE)，它影响牛；传染性水貂脑病；猫海绵状脑病；及长耳鹿、白尾鹿、黑尾鹿及麋鹿的慢性萎缩性疾病(CWD)。在人类，TSE病可表现为库鲁病、克罗伊茨费尔特-雅各布病(CJD)、格-施-沙综合征(GSS)、致命性失眠和变异性克罗伊茨费尔特-雅各布病(vCJD)。最近出现于人类的  vCJD是英国BSE流行的结果，很可能是由食用获自感染了BSE或“疯牛病”的牛的食品而造成的。在1980年代的中期到1990年代早期，英国有不知数目的人摄入了可能受到获自感染了BSE的牛的神经组织污染的食物。由于人类经口传播疾病的潜伏期可超过20年，vCJD的真正发病率可以许多年都不明显。迄今，已知有超过150人已经感染该病，主要是在英国；然而，病例报告也见于加拿大、法国、香港、爱尔兰、意大利和美国。来自英国的受污染的牛饲养产品的全世界性出口，表明全球出现BSE的可能和由此产生的vCJD的可能性。与这些观察相一致，在大多数欧洲国家、加拿大、美国、日本和以色列，检出了BSE。因此，能够从包括食品的各种材料中检测和去除感染性朊病毒蛋白非常重要。
历史上，TSEs的诊断是基于出现该病的临床征象，并且只能通过死后的脑组织学病理检查才能确诊。所有TSEs的一个特征是缺乏可测定的对试剂的宿主免疫应答。因而，没有生产出抗体，也没有常规血清学化验能够用于诊断感染了的动物。近来，对脑中异常朊病毒蛋白的鉴别提高了诊断该病的能力。
除摄入来源于牛的感染食品之外，输血和器官移植代表了另外一种人间传播vCJD的可能方式。在英国，已有两例通过输血传播vCJD的可疑病例。在人类，通过输血途径的vCJD的传染性目前尚未知，但越来越多的注意到这可能是比摄食更有效的vCJD传播方式。这与包括从绵羊传播的实验性动物模型所得到的数据相一致。不同于其它的人TSEs，PrPsc存在于vCJD患者的淋巴网状系统，从而增加了感染血液中存在的感染原和通过输血传播可能性。其它提高了关于输血传播危险的考虑的因素包括，尚未知的，但假定是，许多人接触BSE并且缺少vCJD的临床前诊断试验。而且，随着灵长类和小鼠的物种适应，vCJD的毒性显示出增强，这提示人与人之间的传播可能比从牛到人的传播更为有效。因而，迫切需要一种方法来阻止通过输血途径的vCJD传播。这样的措施可能包括早期鉴别供体，去除和灭活获自动物的食品、旨在动物或人消费或应用的保健产品、人和牛血液制品和器官移植中的TSE因子。不幸的是，PrPsc对于化学和物理灭活方法抵抗力很强，并且难以找到选择性灭活方法。
通过与配体的特殊相互作用来去除朊病毒显示出更大的希望。已经鉴别出许多与朊病毒蛋白相结合的配体。对组合的多肽库进行筛选，寻找与所有已知哺乳动物中均发现的朊病毒蛋白的八肽重复序列(PHGGGWGQ)相结合的配体，发现了一系列配体，见WO 01/77687。其它材料包括多种聚合物，如通常获自TosoBioSep离子交换树脂的氨基聚甲基丙烯酸酯(见Gawryl等的专利号为5,808,011的美国专利)，与淀粉样蛋白斑相互作用的配体如刚果红(Ingrosso等，J.Virology69：506-508(1995))，4-碘，4-脱氧阿霉素(Tagliavini等，Science276：1119-1122(1997))，两性霉素B，吡咯紫质和酞菁(Priola等，Science 287：1503-1506(2000))，金属(Stockel等，Biochemistry，37.7185-7193(1998))，肽与PrP相互作用形成复合物(见Prusiner等和Soto等的专利号为5,750,361的美国专利，Lancet，355：192-197(2000))，肝素和其它多硫酸化多聚阴离子(Caughey等，Binding of the Protease-sensitive form of prion protein PrP toSulphated Glycosaminoglycan and Congo Red，J.Virology68：2135-2141(1994))，抗体(Kascsak等，Immunological Invest.26：259-268(1997))，以及其它蛋白质，如纤溶酶原(Fischer等，Nature 408：479-483(2000))。尽管有些可以在特殊环境下有用(见Gawryl等的专利号为5,808,011的美国专利)，但目前没有配体已经充分显示出或者发现能够在多种介质中与朊病毒结合。
迄今为止，人TSE病100％致命。不幸的是，尽管已经报告有许多化合物作为未来的治疗试剂，包括两性霉素、硫酸化多聚阴离子、刚果红染料和蒽环类抗生素，所有这些均证明仅有微小的阻止朊病毒增殖的可能性，并且无一表现出任何去除感染宿主的预成朊病毒的作用。因而，仍然迫切需要新的治疗试剂。
正常可溶蛋白质进行组合和分解，发生构象变化及形成不溶形式，被认为是许多其它疾病中的成因性过程，这些疾病中的多数是神经系统疾病。对于疾病发生与正常蛋白质到构象改变的转变之间的关系，知之甚少。除朊病毒外，这种不溶蛋白质的例子包括：阿尔茨海默氏病和脑淀粉样血管病(CAA)的淀粉样蛋白斑中的β-淀粉状蛋白肽；帕金森氏病的向心性多层圆形小体中的α-突触核蛋白沉淀；额颞痴呆和匹克氏病的神经原纤维缠结中的tau蛋白；肌萎缩性侧索硬化中的超氧化物歧化酶和亨廷顿氏病中的huntingtin蛋白。
通常这些高度不可溶蛋白质形成聚集物，聚集物包括不分支原纤维，具有共同的β-折叠片构象特征。在中枢神经系统，淀粉状蛋白可存在于脑和脑膜血管(脑血管沉积)和脑实质中(斑块)。人和动物模型神经病理学研究指出，与淀粉样沉淀物相邻近细胞的正常功能受到妨碍。
神经斑块形成的精确机制，以及斑块形成和与疾病相关的神经变性过程间的关系，大部分未知。需要能够容易的分离或区分两个或多个不同蛋白构象形式，如PrPc和PrPsc，的方法，来理解转变的过程，并发现能够与疾病相关的形式有特定相互作用的结构。目前用于分离或区分亚型的方法包括：在促溶剂如尿素存在下的聚丙稀酰胺凝胶，即横向尿素梯度(TUG)凝胶剂中移动性的不同；对蛋白酶处理敏感性的差异，如蛋白酶K(PK)和检测出PrPsc的抗PK消化产物即PrPres；不同的温度稳定性；在非离子型去污剂中的相对溶解度；纤维结构结合特定化学试剂的能力，如刚果红和异黄素(isoflavin)S。然而，能够与构象改变的蛋白质以及与和疾病相关的形式特殊高度亲和的试剂，仍未鉴别出。这种试剂可用于建立诊断试剂盒，分离和纯化不同形式的蛋白质，去除治疗剂、生物制品、疫苗和食物中的疾病传染性形式，以及用于治疗。
发明概述
根据本发明的第一个方面，发明提供了具有如下结构式(I)的化合物的用途：
Figure A20058003162200101
其中R1和R2相同或不同，均为任选被取代的烷基、任选被取代的环烷基、任选被取代的芳基或任选被取代的杂芳基；
R3是氢或芳基取代基或者R3是任选经由间隔基连接的固体载体；
Z代表氧原子、硫原子或NR4；
Y代表氧原子、硫原子或NR5；
其中R4和R5可以相同或不同，表示氢，任选被取代的含1-6个碳原子的烷基、任选被取代的苯基、任选被取代的苄基或任选被取代的β-苯乙基；和
X1和X2中的一个表示氮原子，X1和X2中另一个表示氮原子或CR6，其中R6表示氢或芳基取代基；
用于朊病毒蛋白的亲和结合。
具有结构式(I)的化合物可用于检测或去除样品中的朊病毒蛋白，如生物液体或环境样品。该化合物用于检测或去除样品中的所有朊病毒蛋白，或者可以选择性的检测或去除朊病毒蛋白的单个形式，从而可以用于区分来自感染了人TSEs患者和感染了绵羊瘙痒病、BSE或CWD的动物样本中的传染性和非传染性朊病毒蛋白。该化合物用于检测样本中朊病毒蛋白的方法，如获自人或动物的生物液体和环境样本，以及用于诊断、治疗朊病毒的方法。例如，本发明中的化合物可以用于治疗或诊断病理改变，如CJD、vCJD、GSS、致命性失眠、绵羊瘙痒病、BSE和CWD及其它TSEs，采用全血、血液成分、细胞、血清、血浆、血浆衍生物、脑脊液、尿、泪、扁桃体、阑尾和其它组织。该化合物也可以用于去除样本中的朊病毒蛋白，如血样、血液成分、细胞、血清、血浆、血浆衍生物、脑脊液、尿、泪、扁桃体、阑尾和其它材料。
另一方面，本发明提供了一种在样本中检测朊病毒蛋白，和/或从样本中去除朊病毒蛋白的方法，该方法包括用如上文所定义的具有结构式(I)的化合物接触样本。
未与固体载体结合，但其中R3代表氢或取代基时，具有结构式(I)的化合物也可以用于治疗或延缓受试者中与朊病毒相关的病理发展。例如，本发明中的配体可用于治疗病理改变如CJD、vCJD、GSS、致命性失眠、绵羊瘙痒病、BSE和CWD。不打算局限于任何理论，这些配体可以通过抑制PrPsc聚合或通过抑制PrPsc和PrPc相互作用从而减慢PrPsc的进一步发展而起作用。
因而，在本发明的进一步的方面，提供了一种治疗或延缓在人或动物受试者中朊病毒相关病理发展的方法，该方法包括给予受试者治疗有效量的未结合固体载体的具有结构式(I)的化合物。
类似的，本发明进一步提供了未结合固体载体的具有结构式(I)的化合物在制备用于治疗朊病毒相关病理的药物中的用途。
本发明的其它特征和优点将在下文的详细描述和优选实施例中体现。
发明详述
定义
此处所用的术语“一种(a)”、“一种(an)”和“该(the)”定义为表示“一或多”，除非与上下文不相适宜，也包括复数。
术语“3F4”指特异性针对PrPc，而非PrPsc或PrPres的自然形式的单克隆抗体。抗体对于仓鼠和人类的PrPc、PrPsc和PrPres的变性形式有特异性。
术语“烯基”指含有碳-碳双键的脂肪族烃基，可以是直的或分支的。优选链上有2-12个碳原子的烯基基团，更优选链上有2-6个碳原子的烯基基团，如丙烯基、正烯基、异-丁烯基、3-甲基丁-2-烯基、正-戊烯基和庚烯基。术语“环烯基”和“杂环烯基”类似。
术语“烷氧基”指烷基-O-基团，其中烷基如本申请描述。例子包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基和戊氧基。
此处所用的术语“烷基”，单用或联用，指直链或支链、具有1-15个碳原子的饱和烃。优选具有1-6个碳原子的低级烷基，如甲基、乙基、正-丙基、异丙基、n-丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正-戊基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正-己基、4-甲基戊基、新戊基和2，2-二甲丙基。当烷基被描述为“可任选被取代”时，该基团可以被一个或多个取代基取代，特别是被此处所定义的一个或多个“烷基取代基”取代。
术语“烷基取代基”，除另有定义，指羟基、氨基、烷基、卤素、羟烷基、酰胺、酰基、酰氨基、烷氧基、烷氧羰基、亚烷二氧基、烷基亚磺酰基、烷基磺酰基、烷硫基、芳酰基、芳酰氨基、芳基、芳基烷氧基、芳基烷氧羰基、芳基烷硫基、芳氧基、芳氧基羰基、芳基亚磺酰基、芳基磺酰基、芳硫基、羧基(或酸生物等排物)、氰基、杂芳酰基、杂芳基、杂芳烷氧基、杂芳酰氨基、杂芳氧基、硝基或三氟甲基。
术语“芳酰基”指芳基-CO-基团，其中芳基如本申请所述，如苯甲酰基和1-和-2-萘甲酰基。
术语“芳基”作为基团或基团的一部分是指：
a)6-18个碳原子的可任选被取代的单环或多环芳香族碳环部分，如苯、萘、醋蒽烯、苊、醋亚菲基、甘菊环、蔗、引达省、茚、氟、非那烯和菲；或
b)可任选被取代的部分饱和的多环芳香族碳环部分，其中芳基和环烷基、环烯基、杂环烷基或杂环烯基稠合在一起形成环状结构，如二氢吲哚基、四氢化萘基、茚基或茚满基环。
优选的芳基是可任选被取代的苯基。
当芳基被描述为“可任选被取代”时，该基团可被一个或多个取代基取代，特别是被此处所定义的一个或多个“芳基取代基”所取代。
“芳基取代基”，除非另有定义，指羟基、氨基、烷基、卤素、羟烷基、酰胺、酰基、酰氨基、烷氧基、烷氧羰基、亚烷二氧基、烷基亚磺酰基、烷基磺酰基、烷硫基、芳酰基、芳酰氨基、芳基、芳基烷氧基、芳基烷氧羰基、芳基烷硫基、芳氧基、芳氧基羰基、芳基亚磺基、芳基磺酰基、芳硫基、羧基(或酸生物等排物)、氰基、杂芳酰基、杂芳基、杂芳烷氧基、杂芳酰氨基、杂芳氧基、硝基、氧或三氟甲基。
如此处的使用，术语“获自血液的成分”意味着包括全血、红细胞浓缩液、血浆、血清、富血小板的和贫血小板部分、血小板浓缩液、白细胞、血浆沉淀、血浆分离沉淀物和上清液、免疫球蛋白制剂包括IgA、IgE、IgG和IgM，纯化的凝结因子浓缩物、纤维蛋白原浓缩物，或各种获自人或动物的其它成分。它也包括纯化的或通过任何本领域中的常规方法，包括离子交换、亲和、凝胶渗透和/或疏水色谱法或示差沉淀(differential precipitation)，而制得的获自血液的蛋白质。
术语“组合库”指通过化学固相组合技术所合成的化学试剂的收集。这一定义包括使用分裂-配对-重组方法产生数百万的随机化合物，或者可以设计成包括所定义的结构。标准构建单元可以是三嗪骨架，及类似物。
术语“环烷基”指3-12个碳原子的饱和单环、二环或多环环状系统，有或没有侧链，可任选被-(C＝O)-间断。优选的环烷基是单环烷烃，如环丙基、环戊基、环己基、环庚基；在一个碳上连接的二环烷烃，如螺壬烷；饱和的桥环系统包括在两个碳上连接的二环烷烃类，如降冰片烷、二环[4.3.2]十一烷、二环[4.1.0]庚烷和萘烷，及多环桥系统，如金刚烷。更优选的，环烷基是单环烷烃或桥环系统。最优选的，环烷基是环己基、降冰片烷或金刚烷。
当环烷基被描述为″可任选被取代″时，该基团可以被一种或多种取代基取代，特别是被此处所定义的一个或多个“烷基取代基”所取代。
术语“卤素”指氟、氯、溴或碘。
术语“杂芳基”作为基团或基团的一部分是指：
a)可任选被取代的单环芳基，其中环的一个或多个成员是非碳元素，如N、O或S，优选的例子是单环或二环，如苯并咪唑基、苯并噻唑基、呋喃基、咪唑基、吲哚基、中氮茚基、异唑基、异喹啉基、异噻唑基、二唑基、吡喃基、吡嗪基、哒嗪基、吡唑基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基、喹唑啉基、喹啉基、1，3，4-噻二唑基、噻唑基、噻吩基和三唑基基团，除非另有定义，可任选被一个或多个此处所定义的芳基取代基取代；或
b)可任选被取代的部分饱和的多环的杂碳环部分，其中杂芳基和环烷基、环烯基、杂环烷基或杂环烯基基团稠合在一起，形成环状结构(这种基团的例子包括4-氮杂全氢茚基，除非另有定义，可任选被一个或多个此处所定义的芳基取代基任意取代)。
当杂芳基被描述为″可任选被取代″时，该基团可以被一个或多个取代基取代，特别是被此处所定义的一个或多个“芳基取代基”所取代。
术语“杂环烷基”指至少一个环碳原子被杂原子或含杂原子的基团所代替的环烷基，所述杂原子或含杂原子的基团如O、S、N或NR7，R7是氢或烷基。优选的杂环烷基含有一个或多个N原子，如咪唑烷、哌啶、吗啉、哌嗪、吡咯烷酮、吡唑烷和奎宁环。更优选的例子是具有一个或多个N原子的杂单环烷烃，如哌啶和哌嗪。当杂环烷基被描述为″可任选被取代″时，该基团可以被一个或多个取代基取代，特别是被此处所定义的一个或多个“烷基取代基”所取代。
术语“疏水基”指一个通常为电中性和非极性的亲脂性基团。疏水基优选中性和非极性溶剂或分子环境，与水性溶剂或环境相反。因此，在正常生理环境下，疏水基对于其它疏水基有亲和力。疏水基的例子通常包括烷基和环烷基，优选非取代的基团，以及芳基。
本发明所描述的化合物通常在与生理pH值相同或相近的pH下使用。化合物的疏水性，或者这些化合物中特定部分的疏水性，将取决于所考虑的部分在该pH值下是否带电荷。例如，在生理pH值，氮不带电，1-(2-氨乙基)哌啶是疏水基。
术语“配体”指与蛋白质、肽或多肽结合的分子。本发明中的配体是被取代的杂芳族化合物，如三嗪。
术语“PrPc”指天然朊病毒蛋白分子，在哺乳动物体内有天然和广泛的表达。它的结构高度保守，并与疾病状态不相关联。
术语“PrPsc”指PrPc分子的构象改变形式，被认为有传染性，与TSE/朊病毒病相关，包括vCJD、CJD、库鲁病、致命性失眠、GSS、绵羊瘙痒病、BSE、CWD，和其它捕获和实验动物中罕见的TSEs。它与正常的细胞PrPc有相同的氨基酸序列，但一些α-螺旋转变成了β-折叠，并且与疾病状态相关。
术语“PrPres”指27-30 kDa的PrPsc蛋白质的蛋白水解酶抵抗衍生物，它保持伴随有PK的PrPsc的部分消化。
术语“PrP”指一般而言的朊病毒蛋白。
术语“间隔基”指将亲和配体与载体基质相连接的可任选的部分。一类优选的间隔基由结构通式(II)代表：
-T-[-L-V-]a-  (II)
其中
T代表O、S或NR7；
V代表-O-、-S-、-COO-、-CONH-或-NHCO-、-PO3H-、-NH-亚芳基-SO2-CH2CH2-或-NR7-；
L代表含2-20个碳原子的可任选被取代的烃连接基；以及
a是0或1。
术语“载体基质”指任何的化合物或材料，不论微粒或非微粒、可溶或不可溶、多孔或非多孔，可以根据本发明用于形成亲和配体-基质轭合物，并且提供方便的在溶液中将亲和配体从溶质分离的方法。因此，载体基质可以采用例如柱、珠、小颗粒、薄膜或筛的形式。
载体基质的例子包括可溶性载体基质，诸如天然聚合物，如多肽或蛋白质，如交联白蛋白或多糖如琼脂糖、藻朊酸盐、角叉菜胶、几丁质、纤维素、葡聚糖或淀粉；合成的聚合物如聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚丙烯醛、聚乙烯醇、聚丙烯酸甲酯、全氟化碳；无机化合物诸如硅石、玻璃、硅藻土、矾土、铁氧化物或其它金属氧化物，或包括两种或多种天然聚合物、合成聚合物或无机化合物的任意组合的共聚物。
载体基质的定义中也包括可溶性载体基质，包含聚合物如右葡聚糖、聚乙二醇、聚乙烯醇或水解淀粉，提供用于液体分配的亲和-配体基质轭合物；或固体载体基质包括诸如全氟萘烷化合物，提供用于亲和乳液形成中的亲和配体-基质轭合物。
在载体基质的定义中进一步包括载体基质，诸如琼脂糖、纤维素、葡聚糖、淀粉、藻朊酸盐、角叉菜胶、合成的聚合物、硅石、玻璃和金属氧化物，先于或在配体结合过程中，采用活化剂已经或被修饰。
载体基质优选可任选被活化的琼脂糖、硅石、纤维素、玻璃、异丁烯酸酯、羟乙基甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、苯乙烯二乙烯基苯、Hyper D或全氟化碳。最优选的载体基质是异丁烯酸酯材料，用于销售的商品名为Toyopearl(可获自Tosoh Bioscience LLC，156Keystone Drive，Montgomeryville，PA 18936，USA)。
WO 97/10887描述了将亲和配体连接到载体基质的方法，如使用活化方法，以及经由间隔基将亲和配体连接到基质的方法，如通过缩合反应，形成亲和配体-基质轭合物。
优选X1和X2均为氮原子的结构式(I)化合物。
优选Z和Y均为NR4的结构式(I)化合物，更优选R4为氢者。
优选R1和R2中至少一个为可任选被取代烷基。
在第一组尤其优选的结构通式(I)的化合物中，是指具有结构式(Ia)的化合物：
R3同上文定义；
X1和X2同上文定义；
Y同上文定义；
Z同上文定义；
R1代表-(CH2)m-Q1基团，其中m为从0-7，Q1代表-CR11R12R13或-NR11R12，其中R11、R12和R13独立代表氢、烷基、环烷基或杂环烷基，或者R11、R12和R13中的两个与它们所连接的碳或氮原子一起形成可任选被取代的环烷基或可任选被取代的杂环烷基；和
R2代表-(CH2)n-Q2基团，其中n为从0-7，Q2代表-CR21R22R23或-NR21R22，其中R21、R22和R23独立代表氢、烷基、环烷基或杂环烷基，或者R11、R12和R13中的两个与它们所连接的碳或氮原子一起形成任选被取代的环烷基或任选被取代的杂环烷基。
在结构式为(Ia)的化合物中：
a)X1和X2均优选氮；
b)Z和Y均优选为NR4，特别是当R4为氢时；
c)m优选为0-4，更优选0-3，最优选1-3；
d)Q1优选-NR11R12；R11和R12优选与它们所连接的氮原子一起形成杂环烷基；
e)n优选为0-4，更优选0-2，最优选0；和
f)R21和R22优选与它们所连接的碳原子或氮原子一起形成环烷基或杂环烷基；
更优选的基团，Q2可以代表包括疏水环烷基和杂环烷基，特别是具有包括至少有6个原子的环系统。这种基团的例子包括环己基、哌啶基，特别是1-哌啶基，和桥接碳环体系，如降冰片基。这样的基团优选未取代的，特别是不被任何极性取代基取代。
特殊基团中Q1可以是包括杂环烷基，特别是哌啶基，特别是1-哌啶基，和哌嗪基，特别是1-哌嗪基。
在第二组更优选的结构通式(I)的化合物中，是指具有结构式(Ib)的化合物：
R3同上文定义；
X1和X2同上文定义；
Y同上文定义；
Z同上文定义；
R1代表亚烷基链-(CH2)p-CH3，其中p为0-6，被一个或多个羧基取代，以及任选的被一个或多个额外烷基取代基取代；和
R2代表基团-(CH2)q-Ar，其中q为0-7，Ar代表可任选被取代的芳基。
在结构式为(Ib)的化合物中：
a)X1和X2均优选氮；
b)Z和Y均优选为NR4，特别是当R4为氢时；
c)p优选为0-4，更优选0-3；
d)R1优选被一个或两个羧基取代，这些羧基中至少有一个被亚烷基链-(CH2)p-CH3的末端碳原子所携带；
e)q优选为0-4，更优选0-3，最优选1或2；和
f)Ar优选单环碳环或杂环芳族基团，可任选被一个或多个取代基所取代，这些取代基选自苯基、苯氧基、甲苯基、氯苄基、甲氧苄基、氟苄基、吡啶基和吲哚基。Ar更优选苯基、苯氧基或吡啶基。
R1可以代表的更优选的基团为羧甲基、4-羧基丁基和1-(1，3-二羧基)丙基。
Ar可以代表的更优选的基团包括苯基、4-羟基苯基和吡啶基，特别是2-吡啶基。
具有结构式(Ia)和(Ib)的化合物具有新颖性，代表了本发明的另一方面。
发现可用于本发明的一组特殊的结构式(I)化合物为结构式(Ia)化合物，其中：
R3同上文定义；
X1和X2均为N；
Y和Z均代表NH；
m代表2；
Q1代表哌啶基或哌嗪基；
n代表0或2；和
Q2代表1-哌啶基或金刚烷基。
发现可用于本发明的另一组特殊结构式(I)化合物为结构式(Ib)化合物，其中：
R3同上文定义；
X1和X2均为N；
Y和Z均代表NH；
R1代表羧甲基、4-羧基丁基和1-(1，3-二羧基)丙基；
q代表2；和
Ar代表苯基、2-吡啶基或4-羟基苯基。
具体实施方式
本发明优选的实施方案，参见以下的方法和例子，将仅以举例的方式进行描述。
合成配体
具有结构式(I)的化合物的制备方法对本领域技术人员而言是显而易见的。如，参见WO97/10887中所披露的合成方法。
可以制备具有结构式(I)的化合物的一种方法中涉及了具有结构通式(II)的化合物与含有胺的载体基质的反应
Figure A20058003162200211
其中R1、Z、R2、Y、X1和X2同上文与结构式(I)有关的定义。
可以制备具有结构式(I)的化合物的另一种方法涉及到具有结构通式(III)的化合物与含胺的载体基质的反应
Figure A20058003162200221
其中R1、Z、X1和X2同上文与结构式(I)有关的定义，形成具有结构式(IV)的化合物
Figure A20058003162200222
其中R1、Z、X1和X2同上文与结构式(I)有关的定义，R3代表可任选经由间隔基连接的载体基质，然后进行结构式(IV)化合物与结构式H-Y-R2的化合物的反应。
在进一步的一般制备方法中，结构式(V)的化合物依次与结构式H-Z-R1和H-Y-R2的化合物反应
Figure A20058003162200223
其中X1和X2同上文与结构式(I)有关的定义，R3代表可任选经由间隔基连接的载体基质。
配体鉴别
配体可如下进行鉴别。合成模拟库并筛选结合朊病毒分析物的能力。采用常规方法，如通过标识对朊病毒蛋白的特异性抗体，朊病毒分析物通过柱，并检测结合的分析物。分析物所结合的微粒被鉴定为合适的配体。
使用配体去除朊病毒
结合朊病毒或朊病毒片段的配体对多种分析、制备和诊断应用有用。朊病毒结合配体可以在串珠或薄膜载体上固定，用于从样本中结合和去除朊病毒。在足以造成朊病毒-配体复合物形成以及样本中的朊病毒蛋白与配体相结合的条件下，使与配体结合的固相接触样本，如生物液体。然后从样本中分离出固相，从而从样本中去除结合了连接在固相上的配体的朊病毒蛋白。例如，现有技术中已知的树脂和薄膜去除污染物的方法，见Baumbach等的专利号为5,834,318的美国专利和WO 01/77687。
生物样本的例子包括但不限于，血液、获自血液的成分和血清。另外的生物样本包括脑脊液、尿、唾液、乳、导管液、泪或精液。其它样本可以包括胶原、脑和腺体提取物。
现有技术中已知许多在各种固体表面固定分子的方法。例如，固体表面可以是薄膜(如硝基纤维素)、微量滴定皿(如PVC，聚丙稀或聚苯乙烯)、试管(玻璃或塑料)、浸渍片(如玻璃、PVC、聚丙稀、聚苯乙烯、乳胶等)、微量离心管，或玻璃、二氧化硅、塑料、金属或聚合物串珠。所希望的组件可以是共价连接，或通过非特异性连接的非共价连接。
多种有机和无机聚合物，天然和合成的，可以用作固体表面材料。聚合物的例子包括聚乙烯、聚丙烯、聚(4-甲基丁烯)、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚(对苯二甲酸亚乙酯)、人造丝、尼龙、聚(丁酸乙烯基酯)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、硅树脂、聚甲醛、纤维素、醋酸纤维素、硝基纤维等。可采用的其它材料，包括纸、玻璃、陶瓷、金属、非金属、半导体材料、结合剂等。另外，可以使用形成凝胶的物质，如蛋白质(如明胶剂)、脂多糖、硅酸盐、琼脂糖和聚丙烯酰胺。形成几种水相的聚合物也适用，如葡聚糖、聚亚烷基二醇或表面活性剂、如磷脂、长链(12-24碳原子)烷基铵盐等。当固体表面为多孔时，根据系统的性质可以采用各种孔径。另外，在固体表面的聚合作用过程中，可以合并使用肽。
在表面的制备中，可以采用多种不同材料，如叠层，以获得各种性质。例如，蛋白涂层，诸如明胶可用于避免非特异连接、简化共价结合和增强信号检测等。
如果希望化合物和表面间为共价结合，表面将通常为多功能的或能够多功能化的。可出现于表面并用于连接的功能基团包括羧酸、醛、氨基、氰基、烯基、羟基、巯基等。多种化合物与多种表面的连接方法是公知的，并在文献中有详细说明。
通过使用亲和色谱法，朊病毒蛋白也可在样本中从其它蛋白质中分离出来。根据本发明的配体可以连接到固体载体上，如树脂或薄膜，并用于从溶液中结合和去除朊病毒。在这种情况下，配体可以与固体载体偶联，如薄膜或树脂这样的惰性载体，朊病毒蛋白结合到固定试剂上。固定试剂/朊病毒可以通过抗体方法检测到。如果希望，获自起始筛选的一种或多种序列可以固定在树脂上，如聚甲基丙烯酸酯或琼脂糖。可以使用的其它类型的树脂包括，如琼脂糖凝胶、交联琼脂糖、复合交连多糖、次乙酰塑料、PVDF、丙烯酸酯、聚苯乙烯和纤维素。也可使用膜，例如尼龙和纤维素。树脂可以是聚甲基丙烯酸酯树脂。
使用配体检测朊病毒
此处所描述的配体也用于在生物样本中检测朊病毒蛋白的存在或定量的方法。在足以造成朊病毒蛋白和配体间的复合物形成的条件下，用配体接触上文所列出的那些生物样本，但不仅限于这些样本。然后通过常规方法检测复合物，从而检测生物样本中朊病毒的存在。
复合物的检测通过标识配体，将标识的配体和样本结合，检测被标识的配体-朊病毒复合物来进行。配体在配体的产生过程中被标识，如在肽的合成过程中，或通过以共价或非共价形式将标记连接到配体上来结合标记。可供选择的是，标识配体的特异性结合分子，如抗体，间接的检测到复合物。已知多种标记和结合技术，报告于大量的科学和专利文献中。适用的标记包括放射性核苷酸、酶、底物、辅助因子、抑制剂、荧光部分、化学发光部分、磁粉等。
检测可以任何已知方法进行，如免疫印迹法、western blot技术、凝胶可动性变速测定、荧光原位杂交分析(FISH)、放射示踪或生物发光标记示踪、核磁共振、电子顺磁共振、停流光谱学、柱色谱法、毛细管电泳，或其它根据大小和/或电量变更示踪分子的方法。测定中使用的特定标记或可探测基团不是本发明的关键方面。可探测基团可以是具有可探测的物理或化学性质的任何材料。这种可探测标记已得到了良好发展，一般任何这种方法中使用的标记均可应用于本发明的方法中。因而，标记是任何可以被分光计、光化学、生物化学、免疫化学、电、光学或化学手段检测到的成分。本发明中的有用的标记包括荧光染料(如异硫氰酸荧光素、得克萨斯红色、若丹明等)、放射示踪(如3H、125I、35S、14C、或32P)、酶(LacZ，CAT、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶及其它在EIA或ELISA中通常用作可检测酶的酶)，色度法标记如胶态金或有色玻璃或塑料(如聚苯乙烯、聚丙烯、乳液等)珠粒。根据现有技术中熟知的方法，标记可以与所希望的组分直接或间接偶联。如上文所指出的，可以使用多种标记，标记的选择取决于所要求的分析敏感性、化合物结合的容易程度、稳定性要求、可利用的仪器和处理规定。
非放射性标记通常以间接手段连接。一般的，配体分子(如生物素)共价结合于分子。然后配体连接到本身即可检测到的或共价结合到信号系统的抗-配体(如抗生蛋白链菌素)分子上，如可检测到的酶、荧光化合物或化学发光化合物。许多配体和抗-配体可以使用。当配体有天然的抗-配体时，如生物素、甲状腺素和皮质醇，它可在与标识的、天然的抗-配体的结合中使用。可选择的，任何半抗原或抗原化合物可在与抗体的结合中使用。
分子也可直接连接到信号产生化合物，如通过酶素或荧光发色团的结合。作为标记物的酶素主要是水解酶，特别是磷酸酶、酯酶和糖苷酶，或氧化还原酶，特别是过氧化物酶。荧光化合物包括荧光素及其衍生物、若丹明及其衍生物、丹酰、伞形酮等。化学发光化合物包括荧光素和2，3-二氢酞嗪二酮，如鲁米诺。
检测标记的方法对本领域技术人员而言是熟知的。因而，例如，当标记为放射性标记时，检测方法包括闪烁计数器或照相胶片，如放射自显影术。当标记是荧光标记时，可以通过用适当波长的光激发荧光并检测所造成的荧光来进行检测，如通过显微镜检查法、目检、经照相胶片，通过使用电子探测器如电荷耦合器件(CCDs)或光电倍增管等。类似地，酶标记通过提供适当的酶作用底物，检测所得反应产物来检测。最后，简单的色度法标记可以通过观察与标记相关的颜色来检测。因此，在多种浸渍片测定法中，结合的金通常显示粉红色，而各种结合的珠粒显示珠粒的颜色。
本发明中的配体也可用于检测从固体材料中提取进入溶液的目标物。例如，可以用水、有机溶剂或临界液提取固体样本，产生的上清液接触配体。固体样本的例子包括获自动物的产品，特别是那些曾暴露于传播朊病毒的试剂者，如获自牛的骨粉。在一些实施方案中配体可用于检测土壤中存在的朊病毒蛋白。其它固体样本包括脑组织、角膜组织、粪便、骨粉、牛肉副产品、羊、羊副产品、鹿和麋鹿、鹿和麋鹿的副产品，及其它动物和获自动物的产品。
可供选择的是，朊病毒-配体复合物可以用PK处理。PrPc对PK高度敏感，而PrPsc被部分消解形成PrPres。PrPres分子本身对蛋白水解作用高度抵抗。因而，PK处理将消解PrPc，并将对PK敏感的PrPsc转变为PrPres。伴随PK的去除，PrPres可变性并被抗体如3F4检测到。
在另一个实施方案中，根据本发明的配体可用于从PrPc中选择性浓缩PrPsc。
用配体定量朊病毒
配体-朊病毒复合物，或可替代的，配体或配体-朊病毒复合物的抗体可以通过本领域技术人员所熟知的大量方法中的任何方法检测和定量。这些包括分析生化法，如分光光度测定法、射线照相术、电泳、毛细管电泳、高效液相色谱法(HPLC)、薄层色谱分析法(TLC)、超扩散色谱法等，和各种免疫学方法，如液体或凝胶沉淀反应、免疫扩散(单倍或双倍)、免疫电泳、放射免疫测定(RIAs)、酶联免疫吸附测定(ELISAs)、萤光免疫检验法的试验等。
非特异性结合的还原
本领域技术人员将会认识到，在测定中和在从样本中去除分析物的过程中，常常希望还原非特异性结合。当测定涉及配体或其它固定于固体底物上的捕获剂时，希望使与固体底物的非特异性结合的量减至最少。这种还原非特异性结合的方法是本领域技术人员所熟知的。典型的，这涉及用蛋白质性质的组分涂敷底物。特别地，蛋白质组分如牛和人血清白蛋白(BSA)、脱脂奶粉和明胶被广泛使用。
其它分析方法
Western blot分析也可以用于检测和定量样本中存在的朊病毒蛋白。该技术一般涉及通过在SDS的存在下，根据分子量通过凝胶电泳分离样本产品，转移分离的蛋白质到适当的固体载体(如硝基纤维素滤器、尼龙滤器或衍生的尼龙滤器)，并用此处所描述的配体孵育结合的样本。配体特异结合到固定在固体载体上的朊病毒肽。这些配体被直接标记，或者，可供选择的，它们可以采用特异结合到配体的标记抗体而被随后检测到。
其它分析方法包括脂质体免疫测定(LIAs)，它使用设计的脂质体来结合特定分子(如配体)，并释放被包裹的试剂或标记。根据标准技术继而检测到所释放的化学试剂。
药物组合物
此处所描述的不与载体基质偶联的配体可用于治疗和预防通过感染有朊病毒组织的哺乳动物所造成的TSEs。通过抑制PrPsc到PrPsc的结合，配体可以阻止PrPsc的聚合作用。另外，它可以阻止PrPsc到PrPc的抑制性结合，从而减少PrPsc介导的PrPc到PrPsc的转化，因而延缓了临床症状的出现。此外，配体本身可以通过添加活性剂来将分子定位于PrPsc积聚的位置来修饰其自身。这种组合物适用于各种递药系统。
依据该方法所治疗的疾病包括，但不限于BSE、传染性水貂脑病、猫海绵状脑病、CWD、CJD、GSS，致命性失眠和vCJD。
药物组合物设计为胃肠外、局部(topical)、口服或局限(local)给药。优选药物组合物为胃肠外给药，如经静脉、皮下、皮内、鼻内或肌肉给药。本发明从而提供了胃肠外给药的组合物，该组合物含有上文所描述的溶解或混悬于可接受的载体中的药剂溶液，优选含水载体。多种含水载体可以使用，如水、缓冲液、0.4％盐水、0.3％甘氨酸、透明质酸、纤维蛋白粘合剂等。这些组合物可以通过常规的、已知的灭菌技术灭菌，或可以过滤除菌。所产生的含水溶液可以包装使用，或者冻干，给药前，冻干制剂与灭菌溶液结合。根据所要求接近的生理学情况，组合物可以包含药学上接受的辅料，如pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂、湿润剂等，例如，醋酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、单月桂酸山梨醇酐酯、油酸三乙醇胺酯等。
对于固体组合物，可以使用常规的无毒固体载体，包括，如药物等级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。对于口服给药，药学上可接受的无毒组合物通过采用任何常规辅料制成，如那些先前所列出的载体，通常为1-95％的活性成分，更优选的浓度为25％-75％。
对于气雾给药，活性成分优选与表面活性剂和推进剂一起以精确等分的形式提供。当然，表面活性剂必须是无毒的，优选能溶于推进剂中。代表性的这种试剂是含6-22个碳原子的脂肪酸，如己酸、辛酸、月桂酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、olesteric、油酸与脂族多元醇或其环酐的酯或偏酯。也可采用混合酯，如混合或天然的甘油酯。如果希望的话，也可包含载体，如用于鼻内递药的卵磷脂。
给药量根据所正在给予的(药物)、接受治疗的哺乳动物的状态和给药方式而不同。在治疗应用中，给予已经遭受朊病毒感染的哺乳动物足以抑制朊病毒传播的组合物用量，或者至少是部分阻止疾病及其并发症症状的量。能够实现这一作用的量被定义为“治疗有效量”。这一用途的有效量取决于疾病的严重程度、特定制剂和体重及服用者的一般状态。一般的，对于70kg的患者，剂量将在大约1mg-大约5mg每天的范围内，优选大约100mg每天。
实施例1
朊病毒-结合配体的鉴别
下面表中所描述的朊病毒-结合配体的定义见下文。
合成模拟库
在环氧化物活化的Purabead 6XL上，合成了两个8×8组合的模拟配体库(库A和库B)。PuraBead 6XL是交联耐用的多孔串珠状琼脂糖载体。合成的方法与WO 97/10887中所描述的相似，本领域技术人员可容易的重复。简言之，合成完成后，每个库的成员含有通过柔韧的胺化间隔基连接到Purabead 6XL的三嗪部分。每个库成员的三嗪组件进一步用两个另外的胺取代。
库A
该库的柔韧胺化间隔基是三个碳原子长，通过交联Purabead 6XL与氯甲代氧丙环和氨的依次反应引入的。表1概述了合并到每个库成员的三嗪上的两个其它胺，这些胺对应于结构式(I)中的-Z-R1和-Y-R2基团。胺通过下列数字被指代，被识别为1/1的配体含有两个2-金刚胺基团，被识别为2/1者含有一个4-(2-氨乙基)-吗啉基和一个2-金刚胺基团，等：
1＝2-金刚胺
2＝4-(2-氨乙基)-吗啉
3＝1-(2-氨乙基)-哌啶
4＝1-(2-氨乙基)-哌嗪
5＝(+/-)-2-氨基降冰片烷
6＝1-(2-氨基丙烷)-2-吡咯烷酮
7＝3-氨基喹宁环
8＝1-(2-羟乙基)-哌嗪
9＝N，N-二甲基氨乙二胺
表1
    1/1     2/1     3/1     5/1     6/1     7/1     8/1     9/1
    1/2     2/2     3/2     5/2     6/2     7/2     8/2     9/2
    1/3     2/3     3/3     5/3     6/3     7/3     8/3     9/3
    1/4     2/4     3/4     5/4     6/4     7/4     8/4     9/4
    1/5     2/5     3/5     5/5     6/5     7/5     8/5     9/5
    1/7     2/7     3/7     5/7     6/7     7/7     8/7     9/7
    1/8     2/8     3/8     5/8     6/8     7/8     8/8     9/8
    1/9     2/9     3/9     5/9     6/9     7/9     8/9     9/9
设定的树脂上载荷配体的量是12mmol/g，根据通过在加入胺化间隔基后测定游离氨基，及测定向胺化间隔基中加入三氯三嗪后氯化物的释放确定。
库B
该库的柔韧胺化间隔基是十个碳原子长，通过交联Purabead 6XL与1，4-丁二醇二环氧甘油醚和氨依次反应引进。表2概述了合并到每个库成员的三嗪上的两个其它的胺。胺通过下列数字被指代：
10＝β-丙氨酸
11＝2-氨乙基-吡啶
12＝3-氨基苯甲醇
13＝苯乙胺
14＝酪胺
15-4-氟苄胺
16-4-甲基苄胺
17-2-(4-氯苯)-乙胺
18-色胺
19-甘氨酸
20-L-谷氨酸
21-DL-缬氨酸
22-5-氨基戊酸
23-4-氨基丁酸
24-L-酪氨酸
25-ε-氨己酸
表2
 10/11  19/11  20/11  21/11  22/11  23/11  24/11  25/11
 10/12  19/12  20/12  21/12  22/12  23/12  24/12  25/12
 10/13  19/13  20/13  21/13  22/13  23/13  24/13  25/13
 10/14  19/14  20/14  21/14  22/14  23/14  24/14  25/14
 10/15  19/15  20/15  21/15  22/15  23/15  24/15  25/15
 10/16  19/16  20/16  21/16  22/16  23/16  24/16  25/16
 10/17  19/17  20/17  21/17  22/17  23/17  24/17  25/17
 10/18  19/18  20/18  21/18  22/18  23/18  24/18  25/18
设定的树脂上载荷配体的量是19mmol/g，根据通过在加入胺化间隔基后测定游离氨基，和测定向胺化间隔基中加入三氯三嗪后氯化物的释放确定。
模拟库结合筛选
库经过了几次翻转，使得通过重力沉降和引流，然后用1mL水洗涤两次和1mL 10mM PBS洗涤1次，每孔的pH值为7.4。密封储器并向每个储器中加入0.5mL PBS。库冷藏保存过夜。两个含1.8mL 10％仓鼠脑组织匀浆(HaBH)的试管从液氮储存中取出并解冻。向每个试管中加入180μL5％肌氨酰。室温下滚动孵育混悬液30分钟，随后在台式微量离心机中以13,400rpm离心10分钟。收集上清液，用PBS稀释至1∶10(HaBH最终稀释成：1∶100)。经重力对库进行引流，每个储器中加入500μL HaBH溶液，并经重力引流至收集皿中。一旦储器引流完成，每个储器用另外500μL PBS清洗，并收集在同一个收集皿中。该收集皿被标注为‘非结合’。将500μL含1M NaCl的PBS加入到每个孔中，收集在另一个标记为‘盐洗脱’的收集皿中，随后用500μL2％醋酸溶液，也收集在一个标记为‘醋酸洗脱’的收集皿中。每个树脂的26μL等分液被转移至微量离心管中，储存并用于分析剩余的结合朊病毒。非结合、盐洗脱和醋酸洗脱溶液在收集皿中冷冻。
最终浓度为1∶200和1∶500的HaBH溶液稀释液用作SDS-PAGE和western blot技术的对照。
未结合合部分的western blot和SDS PAGE分析
将每个‘未结合’样本的50μL加入到50μL2X样本缓冲/还原剂(Invitrogen NuPAGE LDS样本缓冲液4X(25μL)、InvitrogenNuPAGE样本还原剂(10μL)和ACS级水(15μL)的混合物)。每个试管在90℃加热10分钟。
对双份凝胶剂进行实验测定，对全蛋白质进行western blot和SDSPAGE分析。17个储器凝胶中每个样本的信息如下：
    储器 分析物     体积(μL)
    1 Invitrogen SeeBlue Plus2分子量标记(Cat#LC5925)     5
    2 仓鼠脑组织匀浆(1∶200)     10
    3 仓鼠脑组织匀浆(1∶500)     10
    4-17 14份不同的‘非结合’样本     10
用去离子水漂洗17-储器NuPAGE凝胶夹盒。去除白色条带和梳子(comb)，用1X NuPAGE MES电泳缓冲液(Cat#NP0002)冲洗泳道，将夹盒置于Xcell Mini-Gel Module(或适合的)的凝胶贮器中。中心贮器填充以200mL含500μLNuPAGE抗氧剂(Cat#NP0005)的1XNuPAGE MES电泳缓冲液。检查渗漏后，以1X NuPAGE MES电泳缓冲液(未加抗氧剂)填充外部贮器。将Mini-Gel Module连接到适合的电源，在持续200V下凝胶电泳大约45分钟，直至染料前沿(dye front)在凝胶底部的0.5cm之内。
SDS PAGE
将凝胶从凝胶夹盒中去除，并用ACS水冲洗(25mL，5分钟)。在用ACS水洗涤脱色(25mL，1小时)前，用Invitrogen SimplyBlueSafestain将凝胶染色1小时以上。
western blot技术
用去离子水冲洗17-储器的NuPAGE凝胶夹盒(cat.#NP0349)，并用1X NuPAGE电泳缓冲液冲洗泳道。凝胶放置于Xcell Mini-GelModule(Invitrogen cat#EI0001)或适合的装置中。下电泳槽从储备溶液(Invitrogen 20X NuPAGE MES电泳缓冲液cat#NP0002或#NP0002-02)中填充1X电泳缓冲液。上电泳槽填充以含抗氧剂的1X电泳缓冲液(Invitrogen cat#NP0005)。
向每一样本中加入含还原剂的样本缓冲液(Invitrogen cat#NP0007和cat#NP0004)，并将样本在90℃加热10分钟，短暂离心，每个样本负荷5μL。也负荷5μL分子量标记物(Invitrogen cat#LC5925)。在恒定200V下，凝胶电泳45分钟。电泳结束后，从装置中去除凝胶夹盒，打开，去除凝胶。将凝胶在冷冻转移电泳缓冲液中浸渍5分钟。
在甲醇中浸湿转移膜，转移至转移电泳缓冲液，搅动孵育2×10分钟。从储备溶液中的电极转移电泳缓冲液(Invitrogen cat#NP0006-1)是通过加入20％甲醇和抗氧剂制备的，使用前冷却。以冷却电极转移电泳缓冲液半填充转移室贮器(BioRad cat#170-4070)。用足够量的冷却电极转移电泳缓冲液来准备塑料BioRad转移储片夹托盘中的BioRad转移单元夹盒。转移夹层通过在海绵、滤纸、PVDF转移膜(Invitrogen cat.#LC2005)、凝胶、滤纸和海绵序列中层叠而制备。夹盒被折叠并夹闭。在腔内为室温下，以恒定100V转移凝胶45分钟。
转移后，在室温下，在获自抗-小鼠Invitrogen Western Breeze化学发光试剂盒(cat.# WB7104)的25mL Western Breeze阻断剂中，将膜置于干净的盘子并在摇动台上孵育1小时。
然后，在冷冻下，在浓度为1∶10000的Signet 3F4主要抗体3F4小鼠单克隆抗体(SIGNET，cat#9620)原液的20mL新鲜WesternBreeze主要抗体稀释液中的稀释液中，将膜在摇动台上孵育过夜。将印迹在20mL Western Breeze抗体洗液中漂洗3次，然后，在室温下，在浓度为1∶10,000的KPL-AP二级抗体(KPL，cat.#075-1802)的20mL Western Breeze Primary Antibody Diluent溶液中，将膜在摇动台上孵育60分钟。按上文方法冲洗印迹，然后在室温下，用20mL 20mM Tris-HCl、1mM MgCl2在pH9.8下洗涤10分钟。将膜转移至干燥干净的盘中，并在轻微搅动下用5mL Western Breeze预混化学发光底物(CDP Star)浸渍5分钟。使碱性磷酸酶反应30分钟以上。在折叠保护器中将印迹转移至胶片盒并在室温下暴露于胶片(Amersham cat.#RPN-3130K)5分钟，在显影剂中显影。
实施例2
用连接于琼脂糖的配体5/4捕获红细胞浓缩物中的PrPc
按照实施例1中所描述的方法合成含连接于基础基质Purabead6XL的配体5/4的吸附剂从而提供了具有结构式(VI)的化合物：
琼脂糖
Figure A20058003162200371
解冻浓度为10％w/v的正常仓鼠脑组织匀浆的PBS缓冲液(100μl)样本，加入10μl 10％(w/v)的十二烷基肌氨酸钠，涡旋混合并在湿冰中保存30分钟。在+4℃下，以14,000rpm离心混合物5分钟，去除上清液。将人红细胞浓缩物(RBCC；250ml)与Adsol(110ml)混合，并通过倒转轻柔混合。去除稀释的RBCC(1.8ml)，并与0.2ml仓鼠脑组织匀浆溶液混合。
将化合物(VI)混悬于40mM pH7.0的枸橼酸盐缓冲液/280mM NaCl的1∶1混悬液(400μl)，加入到1.0ml微型柱，并使得在重力下引流。将RBCC中的仓鼠脑组织匀浆(1ml)移液至设定的亲和吸附剂中并允许引流。随后用1ml混悬缓冲剂洗涤吸附剂并使得引流。收集两个流动通过部分，合并、于-20℃储存。
通过混悬于0.5ml混悬缓冲剂中并转移到冷冻小瓶，从柱上去除亲和吸附剂。在让小瓶内容物沉淀及调节上清液体积以提供1∶1的浆液后，记录所转移的亲和吸附剂的体积。将样本(200μl)转移至微量离心管中，用于如实施例1中所描述的结合朊病毒的SDS-PAGE和Western blot技术分析。
通过Western blot技术与仓鼠PrPc相应的强谱带的存在表明，连接于Purabead 6XL(珠粒状琼脂糖基质)的配体5/4能够从人红细胞浓缩物中选择性结合PrPc。
实施例3
连接于聚甲基丙烯酸酯树脂珠粒的朊病毒结合配体的制备
本实施例描述了多种在库A和B中使用的含胺配体的制备，其是在胺化聚甲基丙烯酸酯载体上(Toyopearl 650M)，而不是琼脂糖。
3.1胺化Toyopearl 650M的二氯三嗪衍生物
将Toyopearl AF-氨基-650M(36g)用10份(36mL)RO-水在烧结漏斗上洗涤，然后将凝胶引流并在1M磷酸氢二钾pH7.0(36mL)中重悬浮。将凝胶引流并随后在1M磷酸二氢钾pH7.0(27mL)和RO-水(27mL)中重混悬。将这一混合物搅拌转移至玻璃反应器，加入54mL丙酮。将混合物冷却至0℃，然后加入溶解于冷(0℃)丙酮(27mL)中的氰尿酰氯(2.7g)，0-4℃下搅拌混合物1小时。将所形成的活性产物二氯三嗪浆液倒在烧结玻璃漏斗上，并用含水丙酮(50％v/v，180mL)、RO-水(180mL)、含水丙酮(50％v/v，180mL)和RO-水(360mL)洗涤。
3.2中间产物单氯三嗪
如下由二氯三嗪-活化的Toyopearl 650M制备各种中间产物单氯三嗪：
3.2.1 1-(2-氨乙基)哌啶(胺3)的单氯三嗪胺化Toyopearl 650M加合物是这样制备的：通过在RO-水(28.8mL)中溶解1-(2-氨乙基)哌啶(0.47g)并将溶液冷却至4℃。将该混合物加入到7g已在烧结玻璃漏斗上引流水的二氯三嗪-活化的胺化Toyopearl中，转移至塑料反应器并冷却至4℃。在4℃将混合物震摇2h，然后将混合物倒入烧结玻璃漏斗，用含水DMF(50％v/v，35mL)、RO-水(70mL)洗涤，然后在烧结漏斗上引流。
3.2.2 (+/-)2-氨基降冰片烷(胺5)的单氯三嗪胺化Toyopearl650M加合物是这样制备的：通过在含水DMF(13.3％v/v，57.68mL)中溶解(+/-)2-氨基降冰片烷(0.82g)，并将溶液冷却至4℃。将该混合物加入到14g已在烧结玻璃漏斗上流水的二氯三嗪-活化的胺化Toyopearl中，转移至塑料反应器并冷却至4℃。在4℃将混合物震摇2h，然后将混合物倒入烧结玻璃漏斗，用含水DMF(50％v/v，70mL)、RO-水(140mL)洗涤，然后在烧结物上引流。
3.2.3 L-谷氨酸(胺20)的单氯三嗪胺化Toyopearl 650M加合物是这样制备的：在含水DMF(50％v/v，28.0mL)和含水氢氧化钠(10M，0.7mL)中溶解L-谷氨酸(0.515g)，然后将溶液冷却至4℃。将该混合物加入到已在烧结玻璃漏斗上引流水的二氯三嗪-活化的胺化Toyopearl(7g)中，转移至塑料反应器并冷却至4℃。在4℃将混合物震摇70分钟，然后将混合物倒入烧结玻璃漏斗，用含水DMF(50％v/v，70mL)、RO-水(140mL)洗涤，然后在烧结漏斗上引流。
3.2.4 5-氨基戊酸(胺22)的单氯三嗪胺化Toyopearl 650M加合物是这样制备的：在含水DMF(50％v/v，28.5mL)和含水氢氧化钠(10M，0.35mL)中溶解5-氨基戊酸(0.41g)，并将溶液冷却至4℃。将该混合物加入到7g已在烧结玻璃漏斗上引流水的二氯三嗪-活化的胺化Toyopearl中，转移至塑料反应器并冷却至4℃。在4℃将混合物震摇60分钟，然后将混合物倒入烧结玻璃漏斗，用含水DMF(50％v/v，70mL)、RO-水(140mL)洗涤，然后在烧结漏斗上引流。
3.2.5甘氨酸(胺19)的单氯三嗪胺化Toyopearl 650M加合物是这样制备的：在含水DMF(50％v/v，61.4mL)和含水氢氧化钠(10M，0.75mL)中溶解甘氨酸(0.563g)，并将溶液冷却至4℃。将该混合物加入到15g已在烧结玻璃漏斗上引流水的二氯三嗪-活化的胺化Toyopearl中，转移至塑料反应器并冷却至4℃。在4℃将混合物震摇60分钟，然后将混合物倒入烧结玻璃漏斗，用含水DMF(50％v/v，75mL)、RO-水(150mL)洗涤，然后在烧结漏斗上引流。
3.3最终产物
用于第二步反应的胺溶液的制备如下：
3.3.1将1-(2-氨乙基)哌啶(胺3；0.94g)溶于RO-水(10.8mL)中。
3.3.2将1-(2-氨乙基)哌嗪(胺4；1.90g)溶于RO-水(21.6mL)中，然后分成两份(每份11.8mL)。
3.3.3将2-(2-氨乙基)吡啶(胺11；0.84mL)溶于含水DMF(50％v/v，10.9mL)中。
3.3.4将苯乙胺(胺13；0.88mL)溶于含水DMF(50％v/v，10.9mL)中，制成两等份。
3.3.5将酪胺(胺4；0.96g)溶于DMF(10.8mL)中。
在塑料反应器中，通过将适当的单氯三嗪中间产物和第二步的胺相组合而配制反应混合物，反应器中含有单氯三嗪中间产物(7g)和所述胺溶液，总溶剂体积为35mL，包括在7g单氯三嗪中间产物中的5.75ml RO-水。每个反应器在60℃翻转24h。然后用含水DMF(50％v/v，35mL)、RO-水(35mL)、0.1M盐酸(35ml)、含氢氧化钠(0.2M)的含水异丙醇(30％v/v)(35ml)、RO-水(70mL)和含水乙醇(20％v/v，21mL)洗涤凝胶，并于4℃储存在含水乙醇(20％v/v)中。
实施例4
用连接于疑甲基丙烯酸酯树脂的朊病毒结合配体捕获红细胞浓缩 物中的PrPsc
如实施例3中所述合成包含连接于珠粒状聚甲基丙烯酸酯基质(Toyopearl)的亲和配体的化合物。采用所描述的正常仓鼠脑组织匀浆方法(实施例2)，制备感染了绵羊瘙痒病的、加标到人红细胞浓缩物(RBCC)中的仓鼠脑提取物(1％w/v)。PrPsc通过聚甲基丙烯酸酯亲和吸附剂的结合，通过将吸附剂浆料填入1ml微型柱中并采用实施例2中所记载的方法以加标RBCC进行激发的方式来评价。从亲和吸附剂提取的样本的SDS-PAGE和western blot分析如实施例1中所述进行，但其中第二组样本等份液在与SDS-PAGE还原缓冲液混合之前，用蛋白酶K处理。
Western blot分析表明含配体5/4、19/13、5/3、22/13和19/14|的聚甲基丙烯酸酯树脂均显示出在人红细胞浓缩物中对PrPsc的高度亲和力。通过+/-蛋白酶K处理所得western blot结合带型的对照，证实了PrPsc的结合。与非处理样本相比，蛋白酶K处理的样本中，清楚可见的低分子量带的存在，确认了PrP的蛋白酶K抵抗形式(传染性形式)的结合。
实施例5
用连接于疑甲基丙烯酸酯树脂的朊病毒结合配体捕获红细胞浓缩 物中的人散发性CJD成因朊病毒
用1％(w/v)人散发性CJD脑组织匀浆加标的RBCC重复实施例4中所描述的实验。Western blot分析表明含配体5/4、19/13、5/3、22/13和3/4的聚甲基丙烯酸酯树脂均显示出在人红细胞浓缩物中对人散发性CJK脑中的PrP的高度亲和力。
实施例6
用连接于聚甲基丙烯酸酯树脂珠粒的配体5/4捕获人血浆和人血 中的PrPsc
如实施例3中所述合成包含连接于珠粒状聚甲基丙烯酸酯基质(Toyopearl)的配体5/4的亲和吸附剂。采用所描述的正常仓鼠脑组织匀浆和RBCC方法(实施例2)，制备感染了绵羊瘙痒病的、加标到人混合血浆和人全血中的仓鼠脑提取物(1％w/v)。PrPsc通过聚甲基丙烯酸酯亲和吸附剂的结合，通过将吸附剂浆料填入1ml微型柱中并采用实施例2中所记载的方法以加标血浆和全血进行激发的方式来评价。从亲和吸附剂提取的样本SDS-PAGE和western blot分析如实施例1中所述进行，但其中第二组样本在与SDS-PAGE还原缓冲液混合之前，用蛋白酶K处理。
Western blot分析表明含配体5/4的聚甲基丙烯酸酯树脂显示出在人血浆和全血中对PrPsc的高度亲和力。通过+/-蛋白酶K处理所得western blot结合带型的对照，证实了PrPsc的结合。与非处理样本相比，蛋白酶K处理的样本中，清楚可见的低分子量带的存在，确认了PrP的蛋白酶K抵抗形式(传染性形式)的结合。
对本领域技术人员而言是显而易见的，即，配体5/4和此处所描述的连接于载体基质如聚甲基丙烯酸酯的其它配体对于从多种血液成分，包括全血、RBCC和血浆中捕获和浓缩多种朊病毒蛋白极为有用。因而，这种材料对于从这些成分中去除PrP，以及作为浓集PrP的手段来帮助后继的检测和定量，都有很大价值。
尽管与此处所描述的方法和材料相似或等同者也可用于实践或检验本发明，但适合的方法和材料见于上文的描述。所有公开出版物、专利申请、此处所提到的专利和其它文献，全部引入作为参考。另外，材料、方法和实施例仅作为举例说明而非意图加以限制。
上述说明用于描述与本发明相关的各种具体实施方式。对于这些实施方式和/或结构可做各种变化、增加和删除，而不脱离本发明的范围和主旨。

Claims (15)

1.具有结构式(I)的化合物的用途：
Figure A2005800316220002C1
其中R1和R2相同或不同，各自为任选被取代的烷基、任选被取代的环烷基、任选被取代的芳基或任选被取代的杂芳基；
R3是氢或芳基取代基或者R3是任选经由间隔基连接的固体载体；
Z代表氧原子、硫原子或NR4；
Y代表氧原子、硫原子或NR5；
其中R4和R5可以相同或不同，表示氢，任选被取代的含1-6个碳原子的烷基、任选被取代的苯基、任选被取代的苄基，或任选被取代的β-苯乙基；和
X1和X2中的一个表示氮原子，X1和X2中另一个表示氮原子或CR6，其中R6表示氢或芳基取代基；
用于与朊病毒蛋白的亲和结合。
2.一种检测、和/或去除样本中朊病毒蛋白的方法，该方法包括用具有权利要求1中所定义的结构式(I)的化合物接触样本。
3.一种治疗或延缓人或动物受试者中朊病毒相关病理进展的方法，该方法包括给予受试者治疗有效量的如权利要求1所定义的具有结构式(I)的未与固体载体结合的化合物。
4.具有如权利要求1所定义的结构式(I)的化合物的应用，在制造用于治疗朊病毒相关病理的药物中不与固体载体相结合。
5.权利要求1中所定义的具有结构式(I)的化合物，其中：
R3的定义同权利要求1；
X1和X2的定义同权利要求1；
Y的定义同权利要求1；
Z的定义同权利要求1；
R1代表-(CH2)m-Q1基团，其中m为0-7，Q1代表-CR11R12R13或-NR13R12，其中R11、R12和R13独立代表氢、烷基、环烷基或杂环烷基，或者R11、R12和R13中的两个与它们所连接的碳或氮原子一起形成可任选被取代的环烷基或可任选被取代的杂环烷基；和
R2代表-(CH2)n-Q2基团，其中n为0-7，Q2代表-CR21R22R23或-NR21R22，其中R21、R22和R23独立代表氢、烷基、环烷基或杂环烷基，或者R11、R12和R13中的两个与它们所连接的碳或氮原子一起形成任选被取代的环烷基或任选被取代的杂环烷基。
6.根据权利要求5的化合物，其中：
a)X1和X2均为氮；
b)Z和Y均为NR4，特别是当R4为氢时；
c)m为0-4，更优选0-3，最优选1-3；
d)Q1为-NR11R12；R11和R12优选与它们所连接的氮原子一起形成杂环烷基；
e)n为0-4，更优选0-2，最优选0；和
f)R21和R22与它们所连接的碳原子或氮原子一起形成环烷基或杂环烷基。
7.根据权利要求5和6的化合物，其中Q2代表疏水环烷基或杂环烷基，特别是包括至少有6个原子的环系统。
8.根据权利要求5-7任一项所述的化合物，其中Q1代表杂环烷基、特别是哌啶基、特别是1-哌啶基，或哌嗪基，特别是1-哌嗪基。
9.权利要求1所定义的具有结构式(I)的化合物，其中
R3的定义同权利要求1；
X1和X2的定义同权利要求1；
Y的定义同权利要求1；
Z的定义同权利要求1；
R1代表亚烷基链-(CH2)p-CH3，其中p为0-6，被一个或多个羧基取代，以及任选地被一个或多个额外烷基取代基取代；和
R2代表基团-(CH2)q-Ar，其中q为0-7，Ar代表可任选被取代的芳基。
10.根据权利要求9的化合物，其中：
a)X1和X2均为氮；
b)Z和Y均为NR4，特别是当R4为氢时；
c)p为0-4，更优选0-3；
d)R1被一个或两个羧基取代，这些羧基中至少有一个被亚烷基链-(CH2)p-CH3的末端碳原子所携带；
e)q为0-4，更优选0-3，最优选1或2；和
f)Ar为单环碳环或杂环芳族基团，可任选被一个或多个取代基所取代，这些取代基选自苯基、苯氧基、甲苯基、氯苄基、甲氧苄基、氟苄基、吡啶基和吲哚基。
11.根据权利要求10的化合物，其中R1为羧甲基、4-羧基丁基或1-(1，3-二羧基)丙基。
12.根据权利要求10或11的化合物，其中Ar是苯基、4-羟基苯基或吡啶基，特别是2-吡啶基。
13.根据权利要求5的化合物，其中：
R3的定义同权利要求1；
X1和X2均为N；
Y和Z均代表NH；
m代表2；
Q1代表哌啶基或哌嗪基；
n代表0或2；和
Q2代表1-哌啶基或金刚烷基。
14.根据权利要求9的化合物，其中
R3的定义同权利要求1；
X1和X2均为N；
Y和Z均代表NH；
R1代表羧甲基、4-羧基丁基和1-(1，3-二羧基)丙基；
q代表2；和
Ar代表苯基、2-吡啶基或4-羟基苯基。
15.根据权利要求1-4中任意一项所要求保护的用途或方法，其中具有结构式(I)的化合物为权利要求5-14任一项中所要求保护的化合物。
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