PT1786788E - Triazinas substituídas como ligandos de proteína priónica e o seu uso para detetar ou remover priões - Google Patents

Triazinas substituídas como ligandos de proteína priónica e o seu uso para detetar ou remover priões Download PDF

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PT1786788E
PT1786788E PT05762896T PT05762896T PT1786788E PT 1786788 E PT1786788 E PT 1786788E PT 05762896 T PT05762896 T PT 05762896T PT 05762896 T PT05762896 T PT 05762896T PT 1786788 E PT1786788 E PT 1786788E
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James Christopher Pearson
Helen Rosemary Tatton
Patrick Vasconcelos Gurgel
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Prometic Biosciences Ltd
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Description

1
DESCRIÇÃO "TRIAZINAS SUBSTITUÍDAS COMO LIGANDOS DE PROTEÍNA PRIÓNICA E O SEU USO PARA DETETAR OU REMOVER PRIÕES"
ÂMBITO DA INVENÇÃO
Esta invenção relaciona-se com a área das interações proteína-ligando e mais particularmente com compostos que se ligam a proteina priónica ("ligandos de proteina priónica") e métodos de usar os compostos para detetar ou remover priões de amostras biológicas.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A proteina priónica "PrPc" nativa ou celular está largamente distribuída entre os mamiferos e tem uma sequência de aminoácidos e estrutura proteica particularmente bem conservadas. Pensa-se que os priões infecciosos são compostos por uma forma modificada da proteina priónica normal celular (PrPc) e são chamados de "PrPsc". Os priões têm algumas propriedades em comum com outros agentes patogénicos infecciosos, mas não parecem conter ácido nucleico. Em vez disso, é proposto que uma alteração conformacional pós-translacional esteja envolvida na conversão de PrPc não infecciosa em PrPsc infecciosa durante a qual α-hélices são transformadas em folhas-β. A PrPc contém três α-hélices e tem pouca estrutura de folhas-β; pelo contrário, a PrPsc é rica em folhas-β. A conversão de PrPc em PrPsc acredita-se que conduz ao desenvolvimento de encefalopatias espongiformes transmissíveis (TSEs) durante a qual PrPsc acumula-se no sistema nervoso central (CNS) e é acompanhada por alterações neuropatológicas e disfunção neurológica. A PrPsc, frequentemente referida como a forma de "scrapie" da proteina priónica, é considerada necessária e possivelmente suficiente para a 2 transmissão e patogénese destas doenças neurodegenerativas transmissíveis de animais e humanos.
Exemplos específicos de TSEs incluem scrapie, que afeta ovelhas e cabras; encefalopatia espongiforme bovina (BSE), que afeta bovinos; encefalopatia trasmissível da marta; encefalopatia espongiforme felina; e doença debilitante crónica (CWD) do veado-mula, veado de cauda branca, veado de cauda preta e alce. Em humanos, as doenças TSE podem apresentar-se como kuru, doença de Creutzfeldt-Jakob (CJD) , Síndrome de Gerstmann-Straússler-Scheinker (GSS), insónia familiar fatal e variante da doença de Creutzfeldt-Jakob (vCJD). A vCJD emergiu recentemente em humanos como resultado da epidemia de BSE na Grã-Bretanha e é muito provavelmente causada pelo consumo de géneros alimentícios derivados de bovinos infetados com BSE ou "doença das vacas loucas". Um número indeterminado de pessoas no Reino Unido ingeriu comida potencialmente contaminada com tecido nervoso de bovinos infetados com BSE em meados dos anos 80 até início dos anos 90. Como o período de incubação da doença contraída oralmente poder ser mais de 20 anos em humanos, a verdadeira incidência de vCJD pode não ser evidente por muitos anos. Até à data, sabe-se que mais de 150 pessoas contraíram a doença, principalmente no Reino Unido; no entanto, foram também reportados casos no Canadá, França, Hong Kong, Irlanda, Itália, e nos EUA. A exportação de rações de bovino contaminadas do Reino Unido para todo o mundo indica uma possível presença global de BSE e portanto a probabilidade de vCJD. Consistente com estas observações, é a deteção de BSE na maior parte dos países Europeus, Canadá, EUA, Japão e Israel. Consequentemente, a capacidade para detetar e remover proteína priónica infecciosa de uma variedade de materiais incluindo géneros alimentícios é de enorme importância. 3
Historicamente, o diagnóstico de TSEs foi baseado na ocorrência de sinais clínicos da doença e só podia ser confirmado por exame histológico posta mortem de tecido cerebral. Uma caracteristica de todas as TSEs é a falta de uma resposta imune mensurável do hospedeiro ao agente. Deste modo, não são produzidos anticorpos e nenhum teste serológico convencional pode ser usado para identificar animais infetados. Recentemente, a identificação da proteina priónica anormal no cérebro melhorou a capacidade de fazer um diagnóstico da doença.
Para além da ingestão de produtos infetados de origem bovina, transfusões de sangue e transplantes de órgãos representam outro potencial modo de transmissão de vCJD entre humanos. Houve dois casos suspeitos de transmissão de vCJD por transfusão de sangue no Reino Unido. A infeciosidade da vCJD em humanos por transfusão de sangue é atualmente desconhecida mas há uma crescente preocupação de que este possa ser um meio mais eficaz de transmissão de vCJD comparado com ingestão. Isto é consistente com dados de modelos animais experimentais incluindo a transmissão a partir de ovelhas. Ao contrário de outras TSEs humanas, a PrPsc está presente no sistema linforeticular de doentes de vCJD, aumentando desse modo a probabilidade do agente infeccioso estar no sangue e a sua transmissão através de transfusões sanguíneas. Outros fatores que aumentam a preocupação em relação ao risco de transmissão por transfusão incluem o número indeterminado, mas supostamente elevado, de pessoas expostas a BSE e a falta de um teste diagnóstico pré-clinico para vCJD. Para além do mais, a virulência de vCJD parece ser aumentada a seguir a adaptação da espécie em primatas e ratos, sugerindo que a transmissão de humano para humano pode ser mais eficaz do 4 que de vaca para humano. Deste modo, há uma necessidade urgente de métodos para prevenir a transmissão de vCJD por transfusão sanguínea. Essas medidas podem incluir a identificação precoce de dadores infetados e a remoção e inativação dos agentes de TSE em alimentos derivados de animais e produtos de saúde para consumo ou aplicação em animais ou humanos, produtos derivados do sangue de bovino e humano, e transplantes de órgãos. Infelizmente, a PrPsc é extraordinariamente resistente a métodos de inativação quimicos e fisicos, e um método seletivo de inativação é elusivo. A remoção de priões através de interação especifica com ligandos parece mais promissora. Vários ligandos já foram identificados que se ligam à proteina priónica. Bibliotecas combinatórias de péptidos foram analisadas em relação a ligandos que se ligam à sequência repetida octapéptido (PHGGGWGQ) que se encontra em todas as proteínas priónicas conhecidas em mamíferos e vários ligandos foram descobertos, como descrito na WO 01/77687. Outros materiais incluem uma variedade de polímeros, por exemplo amino polimetacrilato da TosoBioSep, geralmente resinas de troca iónica (ver a Patente US No 5, 808,011 de Gawryl et al) , ligandos que interagem com a placa amilóide, por exemplo, Vermelho do Congo (Ingrosso et al, J. Virology 69:506-508 (1995)), 4-iodo, 4-desoxi doxorubicina (Tagliavini et al, Science 276:1119-1122 (1997)), anfotericina B, porfirinas e ftalocianinas (Priola et al, Science 287:1503-1506 (2000)), metais (Stockel et al, Biochemistry, 37, 7185-7193 (1998)), péptidos que interagem com a PrP para formar complexos (ver a Patente US 5, 750,361 de Prusiner et al e Soto et al, Lancet, 355:192-197 (2000)), heparina e outros polianiões polisulfatados (Caughey et al, Binding of the Protease-sensitive form of prion protein PrP to Sulphated 5
Glycosaminoglycan e Congo Red, J. Virology 68:2135-2141(1994)), anticorpos (Kascsak et al, Immunological Invest. 26:259-268 (1997)), e outras proteínas, por exemplo, plasminogénio (Fischer et al, Nature 408:479-483 (2000)). Atualmente, nenhum ligando foi totalmente caracterizado ou se verificou ser capaz de se ligar ao prião numa variedade de meios, embora alguns possam ser úteis em circunstâncias específicas (ver Patente US No 5,808,011 de Gawryl et al). Ligandos de afinidade para proteína priónica são descritos em E. N. Soto Renou et al., Journal of Molecular Recognition 2004, 17, 248-261.
Até à data, as doenças TSE humanas são 100% fatais. Infelizmente, embora vários compostos incluindo anfotericinas, polianiões sulfatados, corante vermelho do Congo e antibióticos antraciclinas tenham sido descritos como possíveis agentes terapêuticos, todos eles demonstraram apenas um modesto potencial para impedir a propagação do prião, e nenhum mostrou ter qualquer efeito na remoção de priões pré-existentes de um hospedeiro infetado. Portanto, permanece uma necessidade urgente de novos agentes terapêuticos. A montagem e desmontagem de proteínas normalmente solúveis em formas insolúveis e de conformação alterada pensa-se ser o processo causador de várias outras doenças, muitas das quais são doenças neurológicas. A relação entre o início da doença e a transição de proteína normal para uma conformacionalmente alterada não é bem entendida. Exemplos de tais proteínas insolúveis para além do prião incluem: péptido β-amilóide nas placas amilóides da doença de Alzheimer e angiopatia amilóide cerebral (AAC); depósitos de α-sinucleina nos corpos de Lewy da doença de Parkinson; tau em emaranhados neurofibrilares na demência 6 frontotemporal e doença de Pick; superóxido dismutase na esclerose amiotrófica lateral; e huntingtina na Doença de Huntington.
Muitas vezes, estas proteínas altamente insolúveis formam agregados compostos por fibrilhas não ramificadas com a característica comum de uma conformação de folha β pregueada. No sistema nervoso central, a amilóide pode estar presente nos vasos sanguíneos cerebrais e meningeais (depósitos cerebrovasculares) e no parênquima cerebral (placas). Estudos neuropatológicos em modelos humanos e animais indicam que células proximais aos depósitos de amilóide são perturbadas nas suas funções normais. 0 mecanismo exato pelo qual as placas neuríticas são formadas e a relação da formação das placas e os processos neurodegenerativos associados à doença são em grande parte desconhecidos. Metodologias que possam facilmente separar ou que possam distinguir entre duas ou mais formas conformacionais diferentes de uma proteína, por exemplo, PrPc e PrPsc, são necessárias para entender o processo de conversão e para encontrar estruturas que vão interagir especificamente com a forma associada à doença. Metodologias atuais para separar ou distinguir entre isoformas incluem: mobilidade diferencial em géis de poliacrilamida na presença de um caotrópico tal como ureia, isto é, géis de gradiente de ureia transverso (GUT); sensibilidade diferencial ao tratamento com protease, por exemplo, proteínase K (PK) e a deteção do produto de digestão resistente a PK da PrPsc referido como PrPres; estabilidade a temperatura diferencial; solubilidade relativa em detergentes não-iónicos; e a capacidade das estruturas fibrilares de se ligarem a certos químicos, por exemplo, vermelho do Congo e isoflavina S. No entanto, 7 permanece uma necessidade que ainda não foi conseguida de identificar reagentes de alta afinidade que são específicos para a proteina conformacionalmente alterada e especialmente formas associadas à doença. Esses reagentes podem ser úteis para desenvolver kits de diagnóstico, para separação e purificação das diferentes formas da proteina, para remoção das formas infecciosas da doença de agentes terapêuticos, produtos biológicos, vacinas e géneros alimentícios, e para tratamento.
RESUMO DA INVENÇÃO
De acordo com um primeiro aspeto da presente invenção, é fornecido o uso, ex vivo, de um composto de fórmula (I):
R3 é hidrogénio ou um grupo arilo substituinte ou R3 é um suporte sólido opcionalmente ligado por via de um espaçador; Z representa um átomo de oxigénio, um átomo de enxofre ou NR4; Y representa um átomo de oxigénio, um átomo de enxofre ou NR5 ; em que R4 e R5, que podem ser o mesmo ou diferentes, representam hidrogénio, alquilo opcionalmente substituído contendo 1 até 6 átomos de carbono, fenilo opcionalmente substituído, benzilo opcionalmente substituído ou β-feniletilo opcionalmente substituído; um de X1 e X2 representa um átomo de azoto e o outro de X1 e X2 representa um átomo de azoto ou CR6, em que Rb representa hidrogénio ou um grupo arilo substituinte; e em que R1 representa um grupo -(CfbJir^Q1 em que m é desde 0 até 7, e Q1 representa -NR11R12, em que R11 e R12, em conjunto com o átomo de azoto ao qual estão ligados, formam um grupo heterocicloalquilo opcionalmente substituído; e R2 representa um grupo -(CH2)n-Q2, em que n é desde 0 até 7, e Q2 representa -CR21R22R23 ou -NR21R22, em que R23 representa hidrogénio, alquilo, cicloalquilo ou heterocicloalquilo, e R21 e R22, em conjunto com o átomo de carbono ou azoto ao qual estão ligados, formam um grupo cicloalquilo opcionalmente substituído ou heterocicloalquilo opcionalmente substituído; para a ligação de afinidade de uma proteina priónica.
Os compostos de fórmula (I) podem ser úteis para detetar ou remover uma proteina priónica de uma amostra, tal como um fluido biológico ou uma amostra ambiental. Os compostos são usados para detetar ou remover toda a proteina priónica da amostra ou podem ser seletivamente escolhidos para detetar ou remover uma única forma da proteina priónica e podem portanto ser usados para distinguir entre proteínas priónicas infecciosas e não infecciosas na amostra de doentes afetados com TSEs humanas e animais afetados com scrapie, BSE ou CWD. Os compostos são úteis em métodos para detetar proteina priónica numa amostra, tal como um fluido biológico derivado de humanos ou animais ou uma amostra ambiental, assim como métodos para diagnosticar e tratar doença priónica. Por exemplo, os compostos da invenção podem ser úteis para tratar ou diagnosticar patologias tais como CJD, vCJD, GSS, insónia familiar fatal, scrapie, BSE e CWD e outras TSEs usando sangue inteiro, componentes do 9 sangue, células, soro, plasma, derivados do plasma, fluido cerebrospinal, urina, lágrimas, amígdalas, apêndice e outros tecidos. Os compostos podem também ser úteis para a remoção de proteina priónica de uma amostra, tal como uma amostra de sangue, componentes do sangue, células, soro, plasma, derivados do plasma, fluido cerebrospinal, urina, lágrimas, amígdalas, apêndice e outros materiais.
Noutro aspeto, a invenção fornece um método para detetar uma proteína priónica numa amostra, e/ou remover uma proteína priónica de uma amostra, método esse que compreende contactar a amostra com um composto de fórmula (I) como definido acima.
Compostos de fórmula (I) que não estão ligados a um suporte sólido, mas nos quais R3 representa hidrogénio ou um substituinte, podem também ser úteis para tratar ou retardar o desenvolvimento de uma patologia associada a priões num indivíduo. Por exemplo, os ligandos da invenção podem ser úteis para tratar patologias tais como CJD, vCJD, GSS, insónia familiar fatal, scrapie, BSE e CWD. Sem querer estar limitado por alguma teoria, esses ligandos podem atuar inibindo a polimerização de PrPsc ou através da inibição da interação da PrPsc e PrPc retardando, desse modo, o desenvolvimento de mais PrPsc.
Assim, num aspeto adicional da invenção, é fornecido o uso de um composto de fórmula (I) que não está ligado a um suporte sólido no fabrico de um medicamento para o tratamento de uma patologia associada a priões.
Outras características e vantagens da invenção vão tornar-se evidentes com a seguinte descrição pormenorizada e formas de realização preferidas. 10
DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO
Definições
Os termos "um," "uma" e "o" como aqui usados são definidos para significar "um ou mais" e incluem o plural a menos que o contexto seja inapropriado. O termo "3F4" refere-se a um anticorpo monoclonal especifico das formas nativas de PrPc, mas não de PrPsc ou PrPres nativas. O anticorpo tem especificidade para formas desnaturadas de PrPc, PrPsc e PrPres de hamster e de humano. O termo "alquenilo" refere-se a um grupo hidrocarboneto alifático contendo uma ligação dupla carbono-carbono e que pode ser linear ou ramificado. Grupos alquenilo preferidos têm 2 até 12 átomos de carbono na cadeia, e mais preferencialmente 2 até 6 átomos de carbono na cadeia, por exemplo, propenilo, n-butenilo, iso-butenilo, 3-metilbut-2-enilo, n-pentenilo e heptenilo. Os termos "cicloalquenilo" e "heterocicloalquenilo" são análogos. O termo "alcoxi" refere-se a um grupo alquil-O- em que o alquilo é como aqui descrito. Exemplos incluem metoxi, etoxi, propoxi, isopropoxi, butoxi e pentoxi. O termo "alquilo" como aqui usado, sozinho ou em combinação, refere-se a um hidrocarboneto linear ou ramificado, saturado com 1 até 15 átomos de carbono, grupos alquilo menores com 1 até 6 carbonos são preferidos, por exemplo, metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, sec-butilo, isobutilo, tert-butilo, n-pentilo, 2-metilbutilo, 3-metilbutilo, n-hexilo, 4-metilpentilo, neopentilo e 2,2-dimetilpropilo. Quando um grupo alquilo é 11 descrito como "opcionalmente substituído" então esse grupo pode ser substituído por um ou mais substituintes, particularmente por um ou mais "grupos alquilo substituintes" como aqui definido. 0 termo "grupo alquilo substituinte" refere-se, a menos que definido de outro modo, a hidroxilo, amina, alquilo, halogénio, hidroxialquilo, amida, acilo, acilamina, alcoxi, alcoxicarbonilo, alquilenodioxi, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, alquiltio, aroílo, aroilamina, arilo, arilalcoxi, arilalcoxicarbonilo, arilalquiltio, ariloxi, ariloxicarbonilo, arilsulfinilo, arilsulfonilo, ariltio, carboxi (ou um bioisóstero de ácido), ciano, heteroaroílo, heteroarilo, heteroarilalquiloxi, heteroaroilamina, heteroariloxi, nitro ou trifluorometilo. 0 termo "aroílo" refere-se a um grupo aril-CO- em que o grupo arilo é como aqui descrito, por exemplo, benzoílo, e 1- e 2-naftoílo. 0 termo "arilo" como um grupo ou parte de um grupo refere-se a: a) uma porção carbocíclica aromática multicíclica ou monocíclica opcionalmente substituída de 6 até 18 átomos de carbono, tais como fenilo, naftaleno, aceantrileno, acenaftileno, acefenantrileno, azuleno, criseno, indaceno, indeno, flúor, fenaleno, e fenantreno; ou b) uma porção carbocíclica aromática multicíclica parcialmente saturada opcionalmente substituída em que um arilo e cicloalquilo, cicloalquenilo, heterocicloalquilo ou heterocicloalquenilo são fundidos para formar uma estrutura cíclica, tal como um anel indolinilo, tetrahidronaftilo, indenilo ou indanilo. 12
Grupos arilo preferidos são grupos fenilo opcionalmente substituídos.
Quando um grupo arilo é descrito como "opcionalmente substituído" então esse grupo pode ser substituído com um ou mais subs tituintes, particularmente com um ou mais "grupos arilo substituintes" como aqui definido.
Um "grupo arilo substituinte" refere-se, a menos que definido de outro modo, a um hidroxilo, amina, alquilo, halogénio, hidroxialquilo, amida, acilo, acilamina, alcoxi, alcoxicarbonilo, alquilenodioxi, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, alquiltio, aroílo, aroilamina, arilo, arilalcoxi, arilalcoxicarbonilo, arilalquiltio, ariloxi, ariloxicarbonilo, arilsulfinilo, arilsulfonilo, ariltio, carboxi (ou um bioisóstero de ácido), ciano, heteroaroilo, heteroarilo, heteroarilalquiloxi, heteroaroilamina, heteroariloxi, nitro, oxo ou trifluorometilo.
Conforme aqui usado, o termo "composições derivadas de sangue" pretende incluir sangue inteiro, concentrado de glóbulos vermelhos, plasma, soro, frações ricas em plaquetas e pobres em plaquetas, concentrados de plaquetas, glóbulos brancos, precipitados de plasma sanguíneo, precipitados de fracionamento de plasma sanguíneo e sobrenadantes, preparações de imunoglobulinas incluindo IgA, IgE, IgG e IgM, concentrados de fatores de coagulação purificados, concentrado de fibrinogénio, ou várias outras composições que são derivadas de humanos ou animais. Também inclui proteínas derivadas do sangue purificadas preparadas por qualquer um dos vários métodos comuns na técnica incluindo troca iónica, afinidade, permeação de gel, e/ou cromatografia hidrofóbica ou por precipitação diferencial. 13 0 termo "biblioteca combinatória" refere-se a uma coleção de quimicos que foram sintetizados por técnicas quimicas combinatórias de fase sólida. Esta definição enqloba usar um método de dividir-acoplar-recombinar que gera milhões de compostos aleatórios ou pode ser concebido para incluir estruturas definidas. Os blocos de construção podem ser estruturas de triazina, e semelhantes. 0 termo "cicloalquilo" refere-se a um sistema de anel saturado monociclico, biciclico ou policiclico de 3 até 12 átomos de carbono, com ou sem uma cadeia lateral, e opcionalmente interrompida por -(C=0)-. Grupos cicloalquilo preferidos são monocicloalcanos, por exemplo, ciclopropilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo; bicicloalcanos que estão ligados a um carbono, por exemplo, espirononano; e sistemas de anéis saturados com pontes incluindo bicicloalcanos que estão ligados a dois carbonos, por exemplo, norbornano, biciclo[4.3.2]undecano, biciclo[4.1.0]heptano e decalina, e sistemas policiclicos com pontes, por exemplo, adamantina. Mais preferencialmente, o grupo cicloalquilo é um monocicloalcano ou sistema de anel com pontes. O mais preferencialmente, o grupo cicloalquilo é ciclohexilo, norbornano ou adamantano.
Quando um grupo cicloalquilo é descrito como "opcionalmente substituído" então esse grupo pode ser substituído por um ou mais substituintes, particularmente por um ou mais um ou mais "grupos alquilo substituintes" como aqui definido. O termo "halogénio" significa flúor, cloro, bromo ou iodo. O termo "heteroarilo" como um grupo ou parte de um grupo refere-se a: 14 a) um arilo monocíclico opcionalmente substituído no qual um ou mais dos membros do anel são elementos que não carbono, por exemplo N, 0 ou S, e exemplos preferidos são grupos monocíclicos ou bicíclicos, por exemplo, benzimidazoílo, benztiazoílo, furilo, imidazoílo, indolilo, indolizinilo, isoxazoílo, isoquinolilo, isotiazoílo, oxadiazoílo, piranilo, pirazinilo, piridazinilo, pirazoílo, piridilo, pirimidinilo, pirrolilo, quinazolinilo, quinolilo, 1,3,4-tiadiazolilo, tiazolilo, tienilo e triazolilo, opcionalmente substituídos com um ou mais grupos arilo substituintes como aqui definido, a menos que definido de outro modo; ou b) uma porção heterocarbocíclica multicíclica parcialmente saturada opcionalmente substituída na qual um grupo heteroarilo e um cicloalquilo, cicloalquenilo, heterocicloalquilo ou heterocicloalquenilo estão fundidos para formar uma estrutura cíclica (exemplos desses grupos incluem grupos pirindanilo, opcionalmente substituídos por um ou mais grupos arilo substituintes como aqui definido, exceto quando definido de outro modo).
Quando um grupo heteroarilo é descrito como "opcionalmente substituído" então esse grupo pode ser substituído por um ou mais substituintes, particularmente por um ou mais um ou mais "grupos arilo substituintes" como aqui definido. 0 termo "heterocicloalquilo" refere-se a um grupo cicloalquilo com pelo menos um átomo de carbono do anel substituído por um heteroátomo ou grupo contendo um heteroátomo, por exemplo, 0, S, N ou NR7, em que R7 é hidrogénio ou alquilo. Grupos heterocicloalquilo preferidos contêm um ou mais átomos de N, por exemplo imidazolidina, piperidina, morfolina, piperazina, pirolidinona, pirazolidina e quinuclidina. Exemplos mais preferidos são heteromonocicloalcanos com um ou mais átomos de N, por 15 exemplo piperidina e piperazina. Quando um grupo heterocicloalquilo é descrito como "opcionalmente substituído" então esse grupo pode ser substituído por um ou mais substituintes, particularmente por um ou mais um ou mais "grupos alquilo substituintes" como aqui definido. 0 termo "grupo hidrofóbico" refere-se a um grupo lipofílico que é normalmente eletricamente neutro e não polar. Grupos hidrofóbicos preferem solventes neutros e não polares ou ambientes moleculares, ao contrário de solventes ou ambientes aquosos. Um grupo hidrofóbico vai, portanto, ter uma afinidade para outros grupos hidrofóbicos num ambiente fisiológico normal. Exemplos de grupos hidrofóbicos incluem normalmente grupos alquilo e cicloalquilo, preferencialmente não substituídos, e grupos arilo.
Os compostos descritos na invenção vão geralmente ser usados num pH que é o mesmo, ou próximo, do pH fisiológico. 0 caráter hidrofóbico dos compostos, ou de porções específicas dentro desses compostos, é determinado pelo facto da porção em questão ser ou não carregada a esse pH. Por exemplo 1-(2-aminoetil)piperidina é um grupo hidrofóbico quando, a pH fisiológico, o azoto não é carregado. 0 termo "ligando" refere-se a uma molécula à qual uma proteína, péptido ou polipéptido se liga. Os ligandos da presente invenção são compostos heteroaromáticos substituídos tais como triazinas. 0 termo "PrPc" refere-se a uma molécula de proteína priónica nativa que é naturalmente e amplamente expressa dentro do organismo de mamíferos. A sua estrutura é 16 altamente conservada e não está associada a um estado da doença. 0 termo "PrPsc" refere-se a uma forma conformacionalmente alterada da molécula de PrPc que se pensa ser infecciosa e está associada a TSE/doenças priónicas, incluindo vCJD, CJD, kuru, insónia familiar fatal, GSS, scrapie, BSE, CWD, e outras TSEs raras de animais de cativeiro e de experiências. Tem a mesma sequência de aminoácidos que a PrPc normal celular, mas parte da α-hélice é convertida em folha-β e está associada a um estado da doença. 0 termo "PrPres" refere-se a derivados resistentes a proteinase da proteina PrPsc de 27-30 kDa que permanece após digestão parcial da PrPsc com PK. O termo "PrP" refere-se a proteina priónica em geral. O termo "espaçador" refere-se a uma porção opcional que liga o ligando de afinidade a uma matriz de suporte. Uma classe preferida de espaçador é representada pela fórmula geral (II): em que T representa O, S ou NR7; V representa um -O-, -S-, -COO-, -CONH- ou -NHCO-, - P03H-, -NH- arileno-S02-CH2CH2- ou -NR7-; L representa uma ligação de hidrocarboneto opcionalmente substituído contendo 2 até 20 átomos de carbono; e a é 0 ou 1. 17 0 termo "matriz de suporte" refere-se a qualquer composto ou material, particulado ou não particulado, solúvel ou insolúvel, poroso ou não poroso, que pode ser usado para formar um conjugado de matriz e ligando de afinidade de acordo com a invenção e que fornece um meio conveniente para separar os ligandos de afinidade dos solutos numa solução. A matriz de suporte pode portanto ter a forma de uma coluna, esferas, pequenas partículas, uma membrana ou uma rede, por exemplo.
Exemplos de matrizes de suporte incluem matrizes de suporte solúveis tais como polímeros de ocorrência natural, por exemplo, um polipéptido ou uma proteína tal como albumina reticulada ou um polissacárido tal como agarose, alginato, carragenanos, quitina, celulose, dextrano ou amido; polímeros sintéticos tais como poliacrilamida, polistireno, poliacroleína, álcool polivinílico, polimetilacrilato, perfluorocarbono; compostos inorgânicos tais como sílica, vidro, kieselgur, alumina, óxido de ferro ou outros óxidos de metais, ou copolímeros consistindo em qualquer combinação de dois ou mais polímeros de ocorrência natural, polímeros sintéticos ou compostos inorgânicos.
Também incluídos na definição de matrizes de suporte estão matrizes de suporte solúveis compreendendo polímeros tais como dextrano, polietileno glicol, álcool polivinílico ou amido hidrolizado que fornecem conjugados matriz e ligando de afinidade para uso em particionamento líquido; ou matrizes de suporte sólido compreendendo compostos tais como perfluorodecalina que fornecem conjugados de matriz de ligandos de afinidade para uso na formação de emulsões de afinidade. 18
Também incluídas na definição de matrizes de suporte estão matrizes de suporte tais como agarose, celulose, dextrano, amido, alginato, carragenanos, polímeros sintéticos, sílica, vidro e óxidos de metais que foram, ou são, modificados por tratamento com um agente de ativação antes, ou durante, a ligação do ligando.
Matrizes de suporte são preferencialmente agarose opcionalmente ativada, sílica, celulose, vidro, metacrilato, hidroxietilmetacrilato, poliacrilamida, estirenodivinilbenzeno, Hiper D ou perfluorocarbonetos. 0 mais preferencialmente, a matriz de suporte é um material de metacrilato, do tipo vendido sob o nome comercial Toyopearl (disponível da Tosoh Bioscience LLC, 156 Keystone Drive, Montgomeryville, PA 18936, EUA). A WO 97/10887 descreve métodos para ligar ligandos de afinidade a matrizes de suporte, por exemplo, o uso de métodos de ativação, e métodos para ligar o ligando de afinidade a uma matriz por via de um espaçador, por exemplo, por reações de condensação, para formar conjugados de ligando de afinidade-matriz.
Compostos de fórmula (I) são preferidos em que ambos X1 e X2 representam átomos de azoto.
Compostos de fórmula (I) são preferidos em que ambos Z e Y representam NR4, em particular quando R4 é hidrogénio.
Num primeiro grupo de compostos particularmente preferidos de fórmula geral (I): a) X1 e X2 são preferencialmente ambos azoto; b) ambos Z e Y representam preferencialmente NR4, em particular quando R4 é hidrogénio; 19 c) m é preferencialmente desde 0 até 4, mais preferencialmente desde 0 até 3, e o mais preferencialmente desde 1 até 3; d) Q1 é -NR11R12; e R11 e R12 formam, em conjunto com o átomo de azoto ao qual estão ligados, um grupo heterocicloalquilo; e) n é preferencialmente desde 0 até 4, mais preferencialmente desde 0 até 2, e o mais preferencialmente é 0; e f) R21 e R22 formam, em conjunto com o átomo de carbono ou o átomo de azoto ao qual estão ligados, um grupo cicloalquilo ou heterocicloalquilo.
Grupos particularmente preferidos que Q2 pode representar incluem grupos cicloalquilo e heterocicloalquilo hidrofóbicos, especialmente com sistemas de aneis que compreendem pelo menos seis átomos. Exemplos desses grupos incluem ciclohexilo, piperidilo, particularmente 1- piperidilo, e sistemas de aneis carbociclicos com pontes, por exemplo, norbornilo. Esses grupos são preferencialmente não substituídos, particularmente não substituído com quaisquer substituintes polares. incluem grupos piperidilo, piperazinilo,
Grupos específicos que Q1 pode representar heterocicloalquilo, especialmente particularmente 1-piperidilo, e particularmente 1-piperazinilo.
Um grupo de compostos específicos de fórmula (I) que se verificou serem úteis na invenção são compostos em que: R3 é como aqui definido; X1 e X2 são ambos N; Y e Z ambos representam NH; m representa 2; 20 Q1 representa piperidilo ou piperazinilo; n representa 0 ou 2; e Q2 representa 1-piperidilo ou adamantilo.
DESCRIÇÃO DAS FORMAS DE REALIZAÇÃO PREFERIDAS vão com
Formas de realização preferidas da presente invenção, ser agora descritas, a titulo de ilustração apenas, referência às seguintes metodologias e Exemplos. 21 Síntese de Liqandos Métodos pelos quais compostos de fórmula (I) podem ser preparados, em geral, vão ser evidentes para os especialistas na técnica. Pode ser feita referência, por exemplo, aos métodos de sintese divulgados na WO97/10887.
Um método pelo qual os compostos de fórmula (I) podem ser preparados envolve a reação de um composto de fórmula geral (II)
em que R1, Z, R2, Y, X1 e X2 são como definido acima em relação à fórmula (I), com uma matriz de suporte contendo amina.
Outro método pelo qual os compostos de fórmula (I) podem ser preparados envolve a reação de um composto de fórmula (III)
Cl
PI 22 em que R1, Z, X1 e X2 são como definido acima em relação à fórmula (I), com uma matriz de suporte contendo amina para formar um composto de fórmula (IV)
em que R1, Z, X1 e X2 são como definido acima em relação à fórmula (I) e R3 representa a matriz de suporte opcionalmente ligada por via de um espaçador, seguido de reação do composto de fórmula (IV) com um composto de fórmula H-Y-R2.
Num outro método preparatório geral, um composto de fórmula (V)
em que X1 e X2 são como definido acima em relação à fórmula (I) e R3 representa uma matriz de suporte opcionalmente ligada por via de um espaçador, é reagido sequencialmente com compostos de fórmula H-Z-R1 e H-Y-R2. 23
Identificação de Ligandos
Os ligandos podem ser identificados como se segue. Bibliotecas miméticas são sintetizadas e analisadas em relação à capacidade de ligação a analitos de prião. Analitos de prião são passados através da coluna e os analitos ligados são detetados usando métodos convencionais tais como um anticorpo marcado especifico para proteina priónica. As esferas às quais o analito se liga são identificadas como sendo ligandos adequados.
Uso de Ligandos para Remover Priões
Os ligandos que se ligam a priões ou fragmentos de priões são úteis para uma variedade de aplicações analíticas, preparatórias, e diagnósticas. Ligandos que se ligam a priões podem ser imobilizados num suporte tal como uma esfera ou membrana, e usado para ligar e remover priões de uma amostra. A fase sólida à qual os ligandos estão ligados é deixada contactar com a amostra, tal como um fluido biológico, sob condições suficientes para causar a formação de um complexo prião-ligando, e a proteína priónica na amostra liga-se ao ligando. A fase sólida é depois separada da amostra, removendo assim a proteína priónica ligada ao ligando, que está ligado à fase sólida, da amostra. Por exemplo, resinas e membranas para remoção de contaminantes são bem conhecidas na técnica tais como as descritas na Patente US No 5,834,318 de Baumbach et al e WO 01/77687.
Exemplos de amostras biológicas incluem, mas não se limitam a, sangue, composições derivadas de sangue e soro. Amostras biológicas adicionais incluem fluido cerebrospinal, urina, saliva, leite, fluido ductal, lágrimas ou sémen. Outras amostras podem conter colagénio, extratos de glândula e cérebro.
Muitos métodos para imobilizar moléculas numa variedade de superfícies sólidas são conhecidas na técnica. Por exemplo, a superfície sólida pode ser uma membrana (por exemplo, nitrocelulose), uma placa de microtitulação (por exemplo, PVC, polipropileno, ou polistireno), um tubo de ensaio (vidro ou plástico), um "dipstick" (por exemplo, vidro, PVC, polipropileno, polistireno, látex, e semelhantes) , um tubo de microcentrifugação, ou uma esfera de vidro, silica, plástico, metálica ou de polímero. 0 componente desejado pode ser ligado covalentemente, ou ligado não covalentemente através de ligações não específicas.
Uma grande variedade de polímeros orgânicos e inorgânicos, ambos naturais e sintéticos podem ser empregues como material para a superfície sólida. Polímeros ilustrativos incluem polietileno, polipropileno, poli(4-metilbuteno), polistireno, polimetacrilato, poliacrilato, poli (etilenotereftalato), raiona, nylon, polivinil butirato), difluoreto de polivinilideno (PVDF), silicones, poliformaldeído, celulose, acetato de celulose, nitrocelulose, e semelhantes. Outros materiais que podem ser empregues, incluem papel, vidros, cerâmicas, metais, metalóides, materiais semicondutores, cimentos ou semelhantes. Para além disso, substâncias que formam géis, tais como proteínas (por exemplo, gelatinas), lipopolissacáridos, silicatos, agarose e poliacrilamidas podem ser usadas. Polímeros que formam várias fases aquosas, tais como dextranos, polialquileno glicóis ou tensoativos, tais como fosfolípidos, sais de amónia alquilo de cadeia longa (12-24 átomos de carbono) e semelhantes são também adequados. Quando a fase solida é porosa, vários tamanhos de poros podem ser empregues dependendo da natureza do sistema. Para além disso, o péptido pode ser incorporado durante a polimerização da superfície sólida. 25
Na preparação da superfície, uma variedade de diferentes materiais pode ser empregue, por exemplo, como laminados, para obter várias propriedades. Por exemplo, revestimentos de proteína, tais como gelatina podem ser usados para evitar ligações não específicas, simplificar conjugação covalente, e melhorar a deteção de sinal ou semelhantes.
Se se desejar a ligação covalente entre um composto e a superfície, a superfície é normalmente polifuncional ou é capaz de ser tornada polifuncional. Grupos funcionais que podem estar presentes na superfície e usados para ligação podem incluir ácidos carboxílicos, aldeídos, grupos amina, grupos ciano, grupos etilénicos, grupos hidroxilo, grupos mercapto e semelhantes. 0 modo de ligar uma grande variedade de compostos a várias superfícies é bem conhecido e está amplamente ilustrado na literatura.
Proteínas priónicas podem também ser separadas de outras proteínas numa amostra usando cromatografia de afinidade. Ligandos de acordo com a invenção podem ser ligados a um suporte sólido, tal como uma resina ou membrana, e usados para ligar e remover o prião da solução. Neste caso, o ligando pode ser acoplado a um suporte sólido, por exemplo, um suporte inerte tal como uma membrana ou uma resina, e a proteína priónica liga-se ao agente imobilizado. 0 agente/prião imobilizado pode ser detetado por meio de anticorpos. Se desejado, uma ou mais das sequências obtidas na análise inicial podem ser imobilizadas numa resina, tal como polimetacrilato ou agarose. Outros tipos de resina que podem ser usados incluem, por exemplo, sefarose, agarose reticulada, polissacáridos reticulados complexos, celite, PVDF, acrilato, polistireno e celulose. Membranas tais 26 como, por exemplo, nylon e celulose podem também ser usadas. A resina pode ser uma resina de polimetacrilato.
Uso de Ligandos para Detetar Priões
Os ligandos aqui descritos são também úteis num método para detetar a presença de ou para quantificar uma proteína priónica numa amostra biológica. Uma amostra biológica tal como, mas não se limitando a, aquelas listadas acima é contactada com um ligando sob condições suficientes para causar a formação de um complexo entre a proteína priónica e o ligando. 0 complexo é depois detetado por métodos convencionais, detetando assim a presença do prião na amostra biológica. 0 complexo é detetado marcando o ligando, combinando o ligando marcado com a amostra, e detetando o complexo ligando marcado-prião. 0 ligando é marcado durante a produção do ligando, tal como durante a síntese peptídica, ou um marcador é conjugado com o ligando unido-o ao ligando, covalentemente ou não covalentemente. Alternativamente, uma molécula ligante específica para o ligando, tal como um anticorpo, é marcada e o complexo é detetado indiretamente. Uma grande variedade de marcadores e técnicas de conjugação são conhecidas e extensamente mencionadas tanto na literatura científica como de patentes. Marcadores adequados incluem radionucleótidos, enzimas, substratos, cofatores, inibidores, porções fluorescentes, porções quimicoluminescentes, partículas magnéticas, e semelhantes. A deteção pode prosseguir por qualquer método conhecido, tal como análise de "western imunoblotting", ensaios de alteração de mobilidade em gel, análise de hibridização fluorescente in situ (FISH), localização de marcadores 27 radioativos ou bioluminescentes, ressonância magnética nuclear, ressonância paramagnética eletrónica, espetroscopia de fluxo parado ("stopped-flow"), cromatografia de coluna, eletroforese capilar, ou outros métodos que localizam uma molécula com base numa alteração de tamanho e/ou carga. 0 marcador específico ou grupo detetável usado no ensaio não é um aspeto crítico da invenção. 0 grupo detetável pode ser qualquer material que tenha uma propriedade física ou química detetável. Esses marcadores detetáveis têm sido bem desenvolvidos e, em geral, qualquer marcador útil nesses métodos pode ser aplicado ao presente método. Deste modo, um marcador é qualquer composição detetável por meio espetroscópico, fotoquímico, bioquímico, imunoquímico, elétrico, ótico ou químico. Marcadores úteis na presente invenção incluem corantes fluorescentes (por exemplo, isotiocianato de fluoresceina, vermelho Texas, rodamina, e semelhantes), radiomarcadores (por exemplo, 3H, 125I, 35S, 14C, ou 32P) , enzimas (por exemplo, LacZ, CAT, peroxidase de rábano, fosfatase alcalina e outros, comummente usados como enzimas detetáveis, em EIA ou em ELISA), e marcadores colorimétricos tais como ouro coloidal ou esferas de vidro ou plástico coloridas (por exemplo, polistireno, polipropileno, látex, etc) . 0 marcador pode ser acoplado diretamente ou indiretamente ao componente desejado do ensaio de acordo com métodos bem conhecidos na técnica. Conforme indicado acima, uma grande variedade de marcadores pode ser usada, com a escolha do marcador a depender da sensibilidade necessária, facilidade de conjugação do composto, requisitos de estabilidade, aparelhos disponíveis, e condições de eliminação.
Marcadores não radioativos são frequentemente ligados por meios indiretos. Geralmente, uma molécula de ligando (por 28 exemplo, biotina) é ligada covalentemente à molécula. 0 ligando liga-se depois a uma molécula anti-ligando (por exemplo, estreptavidina) que é inerentemente detetável ou covalentemente ligada a um sistema de sinal, tal como uma enzima detetável, um composto fluorescente, ou um composto quimiluminescente. Vários ligandos e anti-ligandos podem ser usados. Quando um ligando tem um anti-ligando natural, por exemplo, biotina, tiroxina, e cortisol, ele pode ser usado em conjunto com os anti-ligandos marcados de ocorrência natural. Alternativamente, qualquer composto antigénico ou hapteno pode ser usado em combinação com um anticorpo.
As moléculas podem também ser conjugadas diretamente com compostos geradores de sinal, por exemplo, por conjugação com uma enzima ou fluoróforo. Enzimas de interesse como marcadores são principalmente hidrolases, particularmente fosfatases, esterases e glicosidases, ou oxidoredutases, particularmente peroxidases. Compostos fluorescentes incluem fluoresceina e seus derivados, rodamina e seus derivados, dansilo, umbeliferona, etc. Compostos quimiluminescentes incluem luciferina, e 2,3-dihidroftalazinodionas, por exemplo, luminol.
Meios para detetar marcadores são bem conhecidos dos especialistas na técnica. Assim, por exemplo, quando o marcador é um marcador radioativo, os meios para deteção incluem um contador de cintilação ou película fotográfica como em autoradiografia. Quando o marcador é um marcador fluorescente, ele pode ser detetado por excitação do fluorocromo com o comprimento de onda de luz adequado e detetar a fluorescência resultante, por exemplo, por microscopia, inspeção visual, por via de película fotográfica, pelo uso de detetores eletrónicos tais como 29 dispositivos de acoplamento de cargas (CCDs) ou fotomultiplicadores e semelhantes. Do mesmo modo, marcadores enzimáticos são detetados fornecendo substratos adequados para a enzima e detetando o produto da reação resultante. Finalmente, marcadores colorimétricos simples podem ser detetados simplesmente por observação da cor associada ao marcador. Assim, em vários ensaios de "dipstick", ouro conjugado aparece frequentemente rosa, enquanto que várias esferas conjugadas aparecem da cor da esfera.
Os ligandos da invenção podem também ser usados para detetar alvos extraídos em solução de um material sólido. Por exemplo, uma amostra sólida pode ser extraída com um solvente aquoso, orgânico ou um fluido crítico e o supernadante resultante pode ser contactado com o ligando. Exemplos de amostras sólidas incluem produtos derivados de animais, particularmente aqueles que foram expostos a agentes que transmitem priões, por exemplo, farinha de ossos derivada de fontes bovina. Ligandos em algumas formas de realização podem ser usados para detetar a presença de proteína priónica no solo. Outras amostras sólidas incluem tecido cerebral, tecido corneai, material fecal, farinha de ossos, sub-produtos de bovino, ovelhas, sub-produtos de ovelhas, veado e alce, sub-produtos de veado e alce, e outros animais e produtos derivados de animais.
Alternativamente, os complexos prião-ligando podem ser tratados com PK. PrPc é altamente sensível a PK, enquanto que a PrPsc é parcialmente digerida para formar PrPres. A própria molécula de PrPres é altamente resistente a proteólise. Assim, o tratamento com PK vai digerir a PrPc, e vai converter a PrPsc sensível a PK em PrPres. Após 30 remoção da PK, a PrPres pode ser desnaturada e detetada por anticorpos tais como 3F4.
Noutra forma de realização, ligandos de acordo com a invenção podem ser usados para a concentração seletiva de PrPsc sobre PrPc. 31
Uso de Ligandos para Quantificar Priões
Um complexo ligando-prião, ou alternativamente, um anticorpo para o ligando ou complexo ligando-prião, pode ser detetado e quantificado por qualquer de vários meios bem conhecidos dos especialistas na técnica. Estes incluem métodos bioquímicos analíticos tais como espetrofotometria, radiografia, eletroforese, eletroforese capilar, cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), cromatografia de camada fina (TLC), cromatografia de hiperdifusão, e semelhantes, e vários métodos imunológicos tais como reações de precipitação em fluido ou gel, imunodifusão (simples ou dupla), imunoeletroforese, radioimunoensaios (RIAs), ensaios imunosorbentes ligados a enzima (ELISAs), ensaios imunofluorescentes, e semelhantes.
Redução de Ligações Não Especificas
Um especialista vai reconhecer que é muitas vezes desejável reduzir ligações não específicas em ensaios e durante a remoção do analito da amostra. Quando o ensaio envolve um ligando ou outro agente de captura imobilizado num substrato sólido, é desejável minimizar a quantidade de ligações não específicas ao substrato sólido. Meios de reduzir essas ligações não específicas são bem conhecidos dos especialistas na técnica. Tipicamente, isto envolve revestir o substrato com uma composição proteinácea. Em particular, composições proteicas tais como albumina do soro humano e de bovino (BSA), leite em pó sem gordura, e gelatina são largamente usadas.
Outros Formatos de Ensaios A análise de Western blot pode também ser usada para detetar e quantificar a presença de proteína priónica numa amostra. A técnica geralmente envolve separar produtos da amostra por eletroforese de gel com base no peso molecular 32 na presença de SDS, transferir as proteínas separadas para um suporte sólido adequado (tal como um filtro de nitrocelulose, um filtro de nylon, ou filtro de nylon derivatizado), e incubar a amostra ligada com os ligandos aqui descritos. Os ligandos ligam-se especificamente a um péptido de prião fixado no suporte sólido. Estes ligandos estão diretamente marcados ou, alternativamente, podem ser detetados subsequentemente usando anticorpos marcados que se ligam especificamente ao ligando.
Outros formatos de ensaio incluem imunoensaios de liposoma (LIAs), que usa liposomas concebidos para se ligarem a moléculas específicas (por exemplo ligandos) e libertar reagentes encapsulados ou marcadores. Os químicos libertados são depois detetados de acordo com técnicas padrão.
Composições Farmacêuticas
Os ligandos aqui descritos que não são acoplados a uma matriz de suporte são úteis em aplicações terapêuticas e profiláticas para o tratamento de TSEs causadas pela infeção de um mamífero com organismos priónicos. 0 ligando pode prevenir a polimerização da PrPsc através da inibição da ligação de PrPsc a PrPsc. Para além disso, pode prevenir a ligação de inibição de PrPsc a PrPc, diminuindo deste modo a conversão mediada por PrPsc de PrPc em PrPsc e retardando assim o início dos sintomas clínicos. Para além disso, os próprios ligandos podem ser modificados pela adição de um agente reativo para direcionar essa molécula para o sítio de acumulação de PrPsc. Essas composições são adequadas para uso numa variedade de sistemas de administração de fármacos. 33
Doenças a serem tratadas de acordo com o método incluem, mas não se limitam a, BSE, encefalopatia trasmissivel da marta, encefalopatia espongiforme felina, CWD, CJD, GSS, insónia familiar fatal, e vCJD.
As composições farmacêuticas são para administração parentérica, tópica, oral ou local. Preferencialmente, as composições farmacêuticas são administradas por via parentérica, por exemplo, por via intravenosa, subcutânea, intradérmica, intranasal ou intramuscular. Assim, a invenção fornece composições para administração parentérica que compreendem uma solução dos agentes descritos acima dissolvidos ou suspensos num transportador aceitável, preferencialmente um transportador aquoso. Uma variedade de transportadores aquosos pode ser usada, por exemplo, água, água tamponada, soro fisiológico a 0,4%, glicina a 0,3%, ácido hialurónico, selante de fibrina e semelhantes. Estas composições podem ser esterilizadas por técnicas de esterilização convencionais, bem conhecidas, ou podem ser esterilizadas por filtração. As soluções aquosas resultantes podem ser embaladas para uso como tal, ou liofilizadas, a preparação liofilizada sendo combinada com uma solução estéril antes da administração. As composições podem conter substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis necessárias para aproximar as condições fisiológicas, tais como ajustar o pH e agentes tampões, agentes de ajuste de tonicidade, agentes molhantes e semelhantes, por exemplo, acetato de sódio, lactato de sódio, cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio, monolaurato de sorbitano, oleato de trietanolamina, etc.
Para composições sólidas, transportadores sólidos não tóxicos convencionais podem ser usados, os quais incluem, 34 por exemplo, graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina de sódio, talco, celulose, glucose, sacarose, carbonato de magnésio, e semelhantes. Para administração oral, uma composição não tóxica farmaceuticamente aceitável é formada incorporando qualquer dos excipientes normalmente empregues, tais como aqueles transportadores anteriormente listados, e geralmente 1-95% de componente ativo e mais preferencialmente numa concentração de 25%-75%.
Para administração por aerosol, os componentes ativos são preferencialmente fornecidos em formas finamente divididas juntamente com um tensoativo e propulsor. É claro que o tensoativo tem que ser não tóxico, e preferencialmente solúvel no propulsor. Representantes destes agentes são os ésteres ou ésteres parciais de ácidos gordos contendo desde 6 até 22 átomos de carbono, tais como ácidos capróico, octanóico, láurico, palmítico, esteárico, linoleico, linolénico, olestérico e oleico com um álcool polihídrico alifático ou os seus anidridos cíclicos. Ésteres mistos, tais como glicéridos naturais ou mistos podem ser empregues. Um transportador pode também ser incluído, como desejado, como com, por exemplo, lecitina para administração intranasal. A quantidade administrada vai variar dependendo do que está a ser administrado, do estado do mamífero a receber tratamento e do modo de administração. Em aplicações terapêuticas, as composições são administradas a um mamífero que já sofreu infeção por prião numa quantidade suficiente para inibir a propagação dos priões, ou pelo menos parar parcialmente os sintomas da doença e as suas complicações. Uma quantidade adequada para conseguir isto é definida como "dose terapeuticamente eficaz." Quantidades 35 eficazes para este uso vão depender da gravidade da doença, da composição especifica, e do peso e estado geral do recetor. Geralmente, a dose vai variar numa gama desde cerca de lmg até cerca de 5 mg por dia, preferencialmente cerca de 100 mg por dia, para um doente de 70 kg.
Nos exemplos seguintes, todos os ligandos não incluídos na fórmula (I) de acordo com a reivindicação 1 são exemplos de referência não de acordo com a invenção.
Exemplo 1
Identificação de Ligandos que se ligam ao Prião
Os ligandos que se ligam ao prião descritos nas Tabelas a seguir foram identificados como se segue. Síntese de Biblioteca Mimética
Duas bibliotecas combinatórias 8 x 8 de ligandos miméticos em Purabead 6XL ativado por epóxido foram sintetizadas (Biblioteca A e Biblioteca B). PuraBead 6XL é um suporte de agarose poroso com esferas que é reticulado para ajudar a durabilidade. Os métodos de síntese foram semelhantes aos descritos na WO 97/10887, e podem ser repetidos facilmente por um especialista na técnica. Em resumo, após completar a síntese, cada membro da biblioteca compreendeu uma porção triazina ligada a Purabead 6XL por um espaçador aminado flexível. O componente de triazina de cada membro da biblioteca foi adicionalmente substituído com duas outras aminas.
Biblioteca A O espaçador aminado flexível para esta biblioteca tinha três átomos de carbono de comprimento, e foi introduzido por reação sequencial de Purabead 6XL reticulado com 36 epiclorhidrina e amónia. A Tabela 1 resume as duas outras aminas incorporadas na triazina de cada membro da biblioteca, estas aminas correspondendo aos grupos -Z-R1 e -Y-R2 de fórmula (I). As aminas são referidas pelos seguintes números, o ligando identificado como 1/1 compreendendo dois grupos 2-adamantamina, o identificado como 2/1 compreendendo um grupo 4-(2-aminoetil)-morfolina e um grupo 2-adamantamina, etc: 1 = 2-Adamantamina 2 = 4-(2-Aminoetil)-morfolina 3 = 1-(2-Aminoetil)-piperidina 4 = 1-(2-Aminoetil)-piperazina 5 = (+/-)-2-Aminonorbornano 6 = 1-(2-Aminopropil)-2-pirrolidinona 7 = 3-Aminoquinuclidina 8 = 1-(2-Hidroxietil)-piperazina 9 = N,N-Dimetil etilenodiamina
Tabela 1 1/1 2/1 3/1 5/1 6/1 7/1 8/1 9/1 1/2 2/2 3/2 5/2 6/2 7/2 8/2 9/2 1/3 2/3 3/3 5/3 6/3 7/3 8/3 9/3 1/4 2/4 3/4 5/4 6/4 7/4 8/4 9/4 1/5 2/5 3/5 5/5 6/5 7/5 8/5 9/5 1/7 2/7 3/7 5/7 6/7 7/7 8/7 9/7 1/8 2/8 3/8 5/8 6/8 7/8 8/8 9/8 1/9 2/9 3/9 5/9 6/9 7/9 8/9 9/9 0 carregamento de ligando na resina foi de 12 mmol/g de resina estável, como determinado por ensaio de amina livre após a adição do espaçador aminado, e ensaio de libertação de cloreto após a adição de triclorotriazina ao espaçador aminado. 37
Biblioteca B 0 espaçador aminado flexivel para esta biblioteca tinha dez átomos de carbono de comprimento, e foi introduzido por reação sequencial de Purabead 6XL reticulado com éter 1,4-butanodioldiglicidílico e amónia. A Tabela 2 resume as outras duas aminas incorporadas na triazina de cada membro da biblioteca, as aminas sendo referidas pelos seguintes números: 10 = β-Alanina 11 = 2-Aminoetil-piridina 12 = álcool 3-Aminobenzilico 13 = Fenetilamina 14 = Tiramina 15 - 4-Fluorobenzilamina 16 - 4-Metilbenzilamina 17 - 2-(4-Clorofenil)-etilamina 18 - Triptamina 19 - Glicina 20 - Ácido L-Glutâmico 21 - DL-Valina 22 - Ácido 5-Aminovalérico 23 - Ácido 4-Aminobutirico 24 - L-Tirosina 25 - Ácido ε-Aminocapróico
Tabela 2 10/11 19/11 20/11 21/11 22/11 23/11 24/11 25/11 10/12 19/12 20/12 21/12 22/12 23/12 24/12 25/12 10/13 19/13 20/13 21/13 22/13 23/13 24/13 25/13 10/14 19/14 20/14 21/14 22/14 23/14 24/14 25/14 10/15 19/15 20/15 21/15 22/15 23/15 24/15 25/15 10/16 19/16 20/16 21/16 22/16 23/16 24/16 25/16 10/17 19/17 20/17 21/17 22/17 23/17 24/17 25/17 38 10/18 19/18 20/18 21/18 22/18 23/18 24/18 25/18 0 carregamento de ligando na resina foi de 19 mmol/g de resina estável, como determinado pelo ensaio de amina livre após a adição do espaçador aminado, e ensaio de libertação de cloreto após a adição de triclorotriazina ao espaçador aminado.
Análise de Ligação da Biblioteca Mimética A biblioteca foi invertida várias vezes, deixada repousar e drenada por gravidade, seguido de 2 lavagens com 1 mL de água e 1 lavagem com 1 mL de PBS 10 mM, pH 7,4 por poço. Os poços foram parados e 0,5 mL de PBS foram adicionados por poço. A biblioteca foi armazenada durante a noite sob refrigeração. Dois tubos contendo 1,8 mL de um homogenado de cérebro de hamster 10% (HaBH) foram cada um removidos da armazenagem em azoto liquido e descongelados. 180 pL de "sarkosyl" 5% foram adicionados a cada tubo. A suspensão foi incubada sob rotação em tambor durante 30 minutos à temperatura ambiente, seguido de centrifugação durante 10 minutos a 13.400 rpm numa microcentrifuga de bancada. O sobrenadante foi colhido, e diluído 1:10 com PBS (diluição final de HaBH: 1:100). A biblioteca foi drenada por gravidade, e 500 pL da solução de HaBH adicionada por poço, e drenada por gravidade para uma placa de recolha. Uma vez drenados os poços, cada poço foi lavado com 500 pL adicionais de PBS, que foram recolhidos na mesma placa de recolha. Esta placa de recolha foi identificada como 'Não-Ligado'. 500 pL de NaCl 1 M em PBS foram adicionados a cada poço, e recolhidos noutra placa de recolha identificada como 'Eluição de Sal' , seguido de 500 pL de solução de ácido acético 2%, também recolhidos numa placa de recolha identificada como 'Eluição de Ácido Acético'. Alíquotas de 26 pL de cada resina foram transferidas para tubos de microcentrifuga, e armazenadas para análise dos restantes 39 priões ligados. As soluções Não Ligado, Eluição de Sal, e Eluição de Ácido Acético foram congeladas nas placas de recolha.
Diluições da solução de HaBH nas concentrações finais de 1:200 e 1:500 foram usadas como controlos para SDS-PAGE e western blots.
Análise Western Blot e SDS PAGE das Frações Não Ligadas 50 pL de cada uma das amostras de 'Não Ligado' foram adicionados a 50 pL de um Tampão de Amostra 2X / Agente Redutor (Mistura de Tampão de Amostra 4X Invitrogen NuPAGE LDS (25 pL) , Agente Redutor da Amostra Invitrogen NuPAGE (10 [pL) , e água de grau ACS (15 pL) . Cada tubo foi aquecido a 90°C durante 10 minutos. Géis duplicados foram corridos para permitir a análise de Western Blot e SDS PAGE da proteina total. O formato das amostras em cada gel de 17 poços foi como se segue:
Poço Analito Volume (pL) 1 Marcadores de Peso Molecular Invitrogen SeeBlue Plus2 5 2 Homogenato de Cérebro de Hámster (1:200) 10 3 Homogenato de Cérebro de Hámster (1:500) 10 4-17 14 amostras diferentes de 'Não Ligado' 10
Uma cassete de gel NuPAGE de 17 poços foi lavada com água desionizada. A tira de fita branca e o pente foram removidos, as linhas lavadas com tampão de correr NuPAGE MES IX (Cat # NP0002), e a cassete colocada no reservatório de gel de um Módulo Xcell Mini-Gel (ou compatível). O 40 reservatório central foi enchido com 200 mL de tampão de correr NuPAGE MES IX contendo 500 pL de antioxidante NuPAGE (Cat # NP0005). Depois de verificar fugas, o reservatório exterior foi enchido com tampão de correr NuPAGE MES IX (nenhum antioxidante adicionado). O módulo Mini-Gel foi ligado a um fornecimento de energia compatível, e os géis corridos durante aproximadamente 45 minutos a 200 V constante até a frente do corante estar a 0,5 cm da base do gel.
SDS PAGE O gel foi removido da cassete de gel e lavado três vezes com água ACS (25 mL, 5 minutos) . O gel foi corado durante uma hora com Safestain SimplyBlue Invitrogen, antes de descorar com três lavagens com água ACS (25 mL, 1 hora).
Western Blot
Uma cassete de gel NuPAGE de 17 poços (cat. # NP0349) foi lavada com água desionizada e as linhas lavadas com tampão de correr NuPAGE IX. O gel foi colocado num Módulo Xcell Mini-Gel (Invitrogen cat # EI0001 ) ou aparelho compatível. A câmara inferior foi enchida com tampão de correr IX da solução de stock (Tampão de correr 20X NuPAGE MES Invitrogen cat #NP0002 ou # NP0002-02). A câmara superior foi enchida com tampão de correr IX contendo antioxidante (Invitrogen cat #NP0005). A cada amostra foi adicionado tampão de amostra contendo o agente redutor (Invitrogen cat # NP0007 e cat # NP0004), e as amostras aquecidas a 90°C durante 10 minutos, centrifugadas rapidamente, e foram carregados 5 pL de cada amostra. 5 pL do marcador de peso molecular (Invitrogen cat # LC5925) foram também carregados. O gel foi sujeito a eletroforese durante 45 minutos a 200 V constantes. Após a 41 corrida estar completa, a cassete foi removida da unidade, aberta, e o gel removido. 0 gel foi encharcado em tampão de transferência refrigerado durante 5 minutos. A membrana de transferência foi molhada em metanol, transferida para tampão de transferência, e incubada durante 2 X 10 minutos sob agitação. O tampão de transferência de elétrodo da solução de stock (Invitrogen cat # NP0006-1) foi preparado com a adição de metanol 20% e antioxidante, e arrefecido antes de usar. O reservatório da câmara de transferência (BioRad cat #170-4070) foi enchido até meio com tampão de transferência eletroblot refrigerado. Uma cassete de unidade de transferência BioRad num tabuleiro de cassete de transferência de plástico BioRad foi preparada com volumes adequados de tampão de transferência eletroblot refrigerado. A "sandwich" de transferência foi preparada pondo camadas em sequência de esponja, papel de filtro, membrana de transferência PVDF (Invitrogen cat. # LC2005), gel, papel de filtro, e esponja. A cassete foi dobrada e fechada com gancho. Os géis foram transferidos durante 45 minutos a 100V constantes, com a câmara à temperatura ambiente.
Após a transferência, a membrana foi colocada numa placa limpa e incubada durante 1 hora, numa plataforma oscilante, à temperatura ambiente, em 25 mL de agente bloqueador Western Breeze do Kit Western Breeze Chemiluminescence da Invitrogen, anti-Rato (cat. # WB7104). numa plataforma A membrana foi depois incubada numa diluição de 1:10000 de solução de stock de anticorpo monoclonal de rato 3F4 anticorpo primário 3F4 Signet (SIGNET, cat # 9620) em 20 mL de Diluente de Anticorpo Primário Western Breeze fresco durante a noite, sob refrigeração, 42 oscilante. A mancha foi enxaguada 3 vezes em 20 mL de Lavagem de Anticorpo Western Breeze e a membrana foi depois incubada em 1:10.000 de anticorpo secundário KPL-AP (KPL, cat. # 075-1802) em 20 mL de Diluente de Anticorpo Primário Western Breeze durante 60 mins à temperatura ambiente numa plataforma oscilante. A mancha foi enxaguada como acima e depois lavada com 20 mL de Tris-HCl 20 mM, MgCl2 1 mM a pH 9,8 durante 10 minutos à temperatura ambiente. A membrana foi transferida para uma placa limpa e seca e embebida com 5 mL de Substrato Quimiluminescente pré-misturado Western Breeze (CDP Star) durante 5 mins sob agitação suave. A fosfatase alcalina foi deixada reagir durante 30 minutos. A mancha foi transferida num protetor de folhas para uma cassete de película e exposta à película (Amersham cat. # RPN-3130K) durante 5 min à temperatura ambiente e revelada num revelador.
Exemplo 2
Uso do ligando 5/4 Ligado a Agarose para Captura de PrPc de um Concentrado de Glóbulos Vermelhos
Um adsorbente compreendendo o ligando 5/4 ligado a matriz de base Purabead 6XL foi sintetizado como descrito no Exemplo 1 para fornecer um composto de fórmula (VI) : / \
Uma amostra de homogenato de cérebro de hámster normal 10% p/v em tampão PBS (100 μρ) foi descongelada e 10 pL de "sarcosyl" 10% (p/v) adicionados, misturada com vórtex e 43 armazenada em gelo molhado durante 30 minutos. A mistura foi centrifugada a 14.000 rpm durante 5 minutos a +4°C e o sobrenadante removido. O concentrado de glóbulos vermelhos humanos (CGV; 250 mL) foi misturado com Adsol (110 mL) e misturado suavemente por inversão. O CGV diluído (1,8 mL) foi removido e misturado com 0,2 mL de solução de homogenato de cérebro de hámster.
Uma suspensão 1:1 (400 pL) do composto (VI) suspendido em 40mM de tampão Citrato/28OmM NaCl pH 7,0, foi adicionada a uma micro-coluna 1,0 mL e deixada drenar sob gravidade. O homogenato de Cérebro de Hámster em CGV (1 mL) foi pipetado para o adsorbente de afinidade estável e deixado drenar. O adsorbente foi subsequentemente lavado com 1 mL de tampão de suspensão e deixado drenar. Ambas as frações com passagem de fluxo foram recolhidas, combinadas e armazenadas a -20°C. O adsorbente de afinidade foi removido da coluna suspendendo em 0,5 mL do tampão de suspensão e transferido para um "cryovial". O volume de adsorbente de afinidade transferido foi registado após permitir que os conteúdos do frasco sedimentassem e o volume de sobrenadante ajustado para proporcionar uma suspensão espessa 1:1. Uma amostra (200 pL) foi transferida para um frasco de microcentrifugação para uso em análise SDS-PAGE e Western blot de priões ligados como descrito no Exemplo 1. A presença de bandas fortes por western blot correspondentes a PrPc de hámster indicaram ligando 5/4 ligado a Purabead 6XL (matriz de agarose com esferas) foi capaz de ligar PrPc seletivamente de um concentrado de glóbulos vermelhos humanos. 44
Exemplo 3
Preparação de Ligandos que se Ligam a Priões ligados a Esferas de Resina de Polimetacrilato
Este exemplo descreve a preparação de vários ligandos contendo aminas usadas nas Bibliotecas A e B, mas em suportes de polimetacrilato aminado (Toyopearl 650M), em vez de agarose.
3.1 Derivado Diclorotriazina de Toyopearl aminado 650M
Toyopearl AF - Amino-650M (36 g) foi lavado num funil de sinterização com dez porções (36 mL) de água-OR, depois o gel foi drenado e re-suspendido em fosfato de potássio 1 M pH 7,0 (36 mL) . O gel foi deixado drenar e depois re-suspendido em fosfato de potássio 1 M pH 7,0 (27 mL) e água-RO(27 mL) . Esta mistura foi transferida para um vaso de reação de vidro agitado e 54 mL de acetona foram adicionados. A mistura foi arrefecida até 0°C, depois a isto foi adicionado cloreto cianúrico (2,7 g) dissolvido em acetona fria (0°C) (27 mL) e a mistura agitada durante 1 h a 0-4°C. A suspensão espessa resultante de produto ativado por diclorotriazina foi deitada num sinterizador de vidro e lavada com acetona aquosa (50% v/v, 180 mL) , água-OR (180 mL) , acetona aquosa (50% v/v, 180 mL) e água-OR (360 mL) . 3.2 Intermediários Monoclorotriazina Vários Intermediários Monoclorotriazina foram preparados a partir de Toyopearl ativado por diclorotriazina 650M como se segue: 3.2.1 O aduto Toyopearl aminado de monoclorotriazina 650M de 1-(2-aminoetil)piperidina (amina 3) foi preparado dissolvendo 1-(2-aminoetil)piperidina (0,47 g) em água-OR (28,8 mL) e arrefecendo a solução até 4°C. Esta mistura foi 45 adicionada a 7 g de Toyopearl aminado ativado por diclorotriazina que tinha sido drenado em água num sinterizador de vidro, transferida para um vaso de reação de plástico e arrefecida até 4°C. A mistura foi agitada a 4°C durante 2 h, depois a mistura foi deitada num sinterizador de vidro, lavada com DMF aquoso (50% v/v, 35 mL), água-OR (70 mL), depois deixada drenar no sinterizador. 3.2.2 O aduto de Toyopearl aminado de monoclorotriazina 650M de (+/-) 2-aminonorbornano (amina 5) foi preparado dissolvendo (+/-) 2-aminonorbornano (0,82 g) em DMF aquoso (13,3% v/v, 57, 68 mL) , e arrefecendo a solução até 4°C. Esta mistura foi adicionada a 14 g de Toyopearl aminado ativado por diclorotriazina que tinha sido drenado em água num sinterizador de vidro, transferida para um vaso de reação de plástico e arrefecida até 4°C. A mistura foi agitada durante 2 h a 4°C, depois a mistura foi deitada num sinterizador de vidro e lavada com DMF aquoso (50% v/v, 70 mL), água-OR (140 mL), depois deixada drenar no sinterizador. 3.2.3 O aduto de Toyopearl aminado de monoclorotriazina 650M de ácido L-glutâmico (amina 20) foi preparado dissolvendo ácido L-glutâmico (0,515g) em DMF aquoso (50% v/v, 28,0 mL) e hidróxido de sódio aquoso (10 M, 0,7 mL) depois arrefecendo a solução até 4°C. Esta mistura foi adicionada a Toyopearl aminado ativado por diclorotriazina (7 g) que tinha sido drenado em água num sinterizador de vidro, transferida para um vaso de reação de plástico vessel e arrefecida até 4°C. A mistura foi agitada durante 70 min a 4°C, depois a mistura foi deitada num sinterizador de vidro e lavada com DMF aquoso (50% v/v, 70 mL) , água-OR (140 mL), depois deixada drenar no sinterizador. 46 3.2.4 0 aduto de Toyopearl aminado de monoclorotriazina 650M do ácido 5-aminovalérico (amina 22) foi preparado dissolvendo o ácido 5-aminovalérico (0,41 g) em DMF aquoso (50% v/v, 28,5 mL) e hidróxido de sódio aquoso (10 M, 0,35 mL) e arrefecendo a solução até 4°C. Esta mistura foi adicionada a 7 g de Toyopearl aminado ativado por diclorotriazina que tinha sido drenado em água num sinterizador de vidro, transferida para um vaso de reação de plástico e arrefecida até 4°C. A mistura foi agitada durante 60 min a 4°C, depois a mistura foi deitada num sinterizador de vidro e lavada com DMF aquoso (50% v/v, 70 mL), água-OR (140 mL) , depois deixada drenar no sinterizador. 3.2.5 O aduto de Toyopearl aminado de monoclorotriazina 650M de glicina (amina 19) foi preparado dissolvendo glicina (0,563 g) em DMF aquoso (50% v/v, 61,4 mL) e hidróxido de sódio aquoso (10 M, 0,75 mL) e arrefecendo a solução até 4°C. Esta mistura foi adicionada a 15 g de Toyopearl aminado ativado por diclorotriazina que tinha sido drenado em água num sinterizador de vidro, transferida para um vaso de reação de plástico e arrefecida até 4°C. A mistura foi agitada durante 60 min a 4°C, depois a mistura foi deitada num sinterizador de vidro e lavada com DMF aquoso (50% v/v, 75 mL) , água-OR (150 mL) , depois deixada drenar no sinterizador. 3.3 Produtos finais
Soluções de aminas para as reações de segundo estádio foram preparadas como se segue: 3.3.1 A 1-(2-Aminoetil) piperidina (amina 3; 0,94 g) foi dissolvida em água-OR (10,8 mL). 47 3.3.2 A 1-(2-Aminoetil) piperazina (amina 4; 1,90 g) foi dissolvida em água-RO (21,6 mL) , depois dividida em duas porções (11,8 mL cada). 3.3.3 A 2-(2-Aminoetil) piridina (amina 11; 0,84 mL) foi dissolvida em DMF aguoso (50% v/v, 10,9 mL). 3.3.4 A eniletilamina (amina 13; 0,88 mL) foi dissolvida em DMF aguoso (50% v/v, 10,9 mL) , e dividida em duas porções iguais.
3.3.5 A tiramina (amina 4; 0,96 g) foi dissolvida em DMF (10, 8 mL) .
As misturas de reação foram montadas a partir de combinações do intermediário monoclorotriazina adequado e amina de segundo estádio, feitas em vasos de reação de plástico contendo o intermediário de monoclorotriazina (7 g) e a solução de amina até um volume de solvente total de 35 mL, incluindo 5,7 5mL de água-OR nos 7 g de intermediário monoclorotriazina. Cada vaso foi agitado com tambor a 60°C durante 24 h. Os géis foram depois lavados com DMF aquoso (50% v/v, 35 mL) , água-OR (35 mL) , ácido clorídrico 0,1 M (35 mL) , isopropanol aquoso (30% v/v) contendo hidróxido de sódio (0,2 M) (35 mL) , água-OR (70 mL) e etanol aquoso (20% v/v, 21 mL) e armazenados em etanol aquoso (20% v/v) a 4°C.
Exemplo 4
Uso de Ligandos que se Ligam a Priões Ligados a Resina de Polimetacrilato para Captura de PrPsc de um Concentrado de
Glóbulos Vermelhos 48
Compostos compreendendo ligandos de afinidade ligados a uma matriz de polimetacrilato com esferas (Toyopearl) foram sintetizados como descrito no Exemplo 3. Um extrato (1% p/v) de cérebro de hámster infetado com scrapie cravado num concentrado de glóbulos vermelhos humanos (CGV) foi preparado usando o procedimento descrito para homogenato de cérebro de hámster normal (Exemplo 2) . A ligação de PrPsc pelos adsorbentes de afinidade de polimetacrilato foi avaliada compactando suspensões espessas adsorbentes em microcolunas de 1 mL e estimulando com o CGV cravado usando o procedimento descrito no Exemplo 2. Foram realizados SDS-PAGE e western blots das amostras extraidas dos adsorbentes de afinidade como descrito no Exemplo 1 com a exceção de que um segundo conjunto de aliquotas de amostra foi tratado com proteinase K antes de misturar com tampão redutor de SDS-PAGE. A análise de Western blot indicou que as resinas de polimetacrilato contendo ligandos 5/4, 19/13, 5/3, 22/13 e 19/14 todas demonstraram alta afinidade para PrPsc na presença de concentrado de glóbulos vermelhos humano. A ligação de PrPsc foi confirmada por comparação do padrão de bandas de western blot obtido +/- tratamento por proteinase K. A presença de bandas claramente visíveis de peso molecular ligeiramente mais baixo para a amostra tratada com proteinase K comparado com a amostra não tratada confirmou ligação da forma resistente a proteinase K (forma infecciosa) de PrP.
Exemplo 5
Uso de Ligandos que se Ligam a Prião Ligados a Resina de Polimetacrilato para Captura do Prião Causador de CJD 49
Esporádica Humana a partir de Concentrado de Glóbulos Vermelhos A experiência descrita no Exemplo 4 foi repetida usando CGV cravado com homogenato de cérebro de CJD esporádica humana 1% (p/v) . A análise de Western blot indicou que todas as resinas de polimetacrilato contendo ligandos 5/4, 19/13, 5/3, 22/13 e 3/4 demonstraram alta afinidade para PrP de cérebro de CJD esporádica humana na presença de concentrado de glóbulos vermelhos humano. 50
Exemplo 6
Uso de ligando 5/4 Ligado a Esferas de Resina de Polimetacrilato para Captura de PrPsc a Partir de Plasma Humano e Sangue Humano
Um adsorbente de afinidade compreendendo o ligando 5/4 ligado a uma matriz de polimetacrilato com esferas (Toyopearl) foi sintetizado como descrito no Exemplo 3. Extratos de cérebro de hámster (1% p/v) infetado com scrapie cravado em plasma humano reunido e sangue inteiro humano foram preparados usando o procedimento descrito para homogenato de cérebro de hámster normal e CGV (Exemplo 2). A ligação de PrPsc pelos adsorbentes de afinidade do polimetacrilato foi avaliada compactando suspensões espessas adsorventes em microcolunas de 1 mL e testando-as com amostras de plasma e sangue inteiro cravados usando o procedimento descrito no Exemplo 2. Foram realizados SDS-PAGE e western blots das amostras extraídas pelos adsorventes de afinidade como descrito no Exemplo 1 com a exceção de que um segundo grupo de aliquotas de amostra foi tratado com proteinase K antes de misturar com tampão redutor de SDS-PAGE. A análise de Western blot indicou que as resinas de polimetacrilato contendo ligandos 5/4 demonstraram alta afinidade para PrPsc na presença de plasma humano e sangue inteiro humano. A ligação de PrPsc foi confirmada por comparação do padrão de bandas de western blot obtido +/-tratamento com proteinase K. A presença de bandas claramente visíveis de peso molecular ligeiramente mais baixo para a amostra tratada com proteinase K comparado com a amostra não tratada confirmou a ligação da forma resistente de proteinase K (forma infecciosa) de PrP. 51
Vai tornar-se evidente para um especialista na técnica que o ligando 5/4 e outros ligandos aqui descritos ligados a uma matriz de suporte tal como polimetacrilato são especialmente úteis para a captura e concentração de uma grande variedade de formas de proteina priónica a partir de vários componentes do sangue, incluindo sangue inteiro, CGV e plasma. Esses materiais são portanto de valor excecional para a remoção de PrP desses componentes e como meio de concentração de PrP para ajudar a deteção e quantificação subsequentes.
Embora métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos aqui descritos possam ser usados na prática ou na testagem da presente invenção, métodos e material adequados são descritos acima. Todas as publicações, pedidos de patente, patentes e outras referências citadas mencionadas aqui são incorporadas como referência na sua integridade. Para além disso, os materiais, métodos, e exemplos são apenas ilustrativos e não pretendem ser limitativos. A descrição anterior é fornecida para descrever várias formas de realização relacionadas com a invenção.
Lisboa, 14 de Maio de 2012

Claims (7)

1 REIVINDICAÇÕES 1. 0 uso, ex vivo, de um composto de fórmula (I):
(tf- em que R3 é hidrogénio ou um grupo arilo substituinte ou R3 é um suporte sólido opcionalmente ligado por via de um espaçador; Z representa um átomo de oxigénio, um átomo de enxofre ou NR4; Y representa um átomo de oxigénio, um átomo de enxofre ou NR5; em que R4 e R5, que podem ser o mesmo ou diferentes, representam hidrogénio, alquilo opcionalmente substituído contendo 1 até 6 átomos de carbono, fenilo opcionalmente substituído, benzilo opcionalmente substituído ou β- feniletilo opcionalmente substituído; um de X1 e X2 representa um átomo de azoto e o outro de X1 e X2 representa um átomo de azoto ou CR6, em que R6 representa hidrogénio ou um grupo arilo substituinte; e em que R1 representa um grupo -(CH2)m_Q1/ em que m é desde 0 até 7, e Q1 representa -NR11R12, em que R11 e R12, em conjunto com o átomo de azoto ao qual estão ligados, formam um grupo heterocicloalquilo opcionalmente substituído; e R 2 representa um grupo -(CH2)n-Q2, em que n é desde 0 até 7, e Q2 representa -CR21R22R23 ou -NR21R22, em que R23 representa hidrogénio, alquilo, cicloalquilo ou heterocicloalquilo, e R21 e R22, em conjunto com o átomo de carbono ou azoto ao qual estão ligados, formam um grupo cicloalquilo opcionalmente substituído ou heterocicloalquilo opcionalmente substituído; "grupo arilo substituinte" refere-se, a menos que definido de outro modo, a um hidroxilo, amina, alquilo, halogénio, hidroxialquilo, amida, acilo, acilamina, alcoxi, alcoxicarbonilo, alquilenodioxi, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, alquiltio, aroílo, aroilamina, arilo, arilalcoxi, arilalcoxicarbonilo, arilalquiltio, ariloxi, ariloxicarbonilo, arilsulfinilo, arilsulfonilo, ariltio, carboxi (ou um bioisóstero de ácido), ciano, heteroaroílo, heteroarilo, heteroarilalquiloxi, heteroaroilamina, heteroariloxi, nitro, oxo ou trifluorometilo; para a ligação de afinidade de uma proteína priónica.
2. Método para detetar uma proteína priónica numa amostra, e/ou remover uma proteína priónica de uma amostra, método esse que compreende fazer contactar a amostra com um composto de fórmula (I) como definido na Reivindicação 1.
3. Composto de fórmula (I), como definido na Reivindicação 1, para uso para tratar ou retardar o desenvolvimento de, uma patologia associada a prião num indivíduo humano ou animal.
4. 0 uso de um composto de fórmula (I), como definido na Reivindicação 1, que não está ligado a um suporte sólido no fabrico de um medicamento para o tratamento de uma patologia associada a prião. 3
5. Composto de fórmula (I), como definido na Reivindicação 1, em que: R3 é como definido na Reivindicação 1; X1 e X2 são ambos N; Y e Z representam ambos NH; m representa 2; Q1 representa piperidilo ou piperazinilo; n representa 0 ou 2; e Q2 representa 1-piperidilo ou adamantilo.
6. Composto de fórmula (I) como definido na Reivindicação 1, em que: R3 é como definido na Reivindicação 1/ X1 e X2 são ambos N; Y e Z representam ambos NH; m representa 2; Q1 representa piperazinilo; n representa 0; e Q2 representa norbornilo.
7. Uso ou método como reivindicado em qualquer uma das Reivindicações 1 até 4, em que o composto de fórmula (I) é um composto como reivindicado na Reivindicação 5 ou na Reivindicação 6. Lisboa, 14 de Maio de 2012
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