KR20070051285A - 프리온 단백질 리간드로써 치환된 트리아진 및 프리온을탐지 또는 제거하는 그의 용도 - Google Patents

프리온 단백질 리간드로써 치환된 트리아진 및 프리온을탐지 또는 제거하는 그의 용도 Download PDF

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KR20070051285A
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제임스 크리스토퍼 피어슨
헬렌 로즈마리 타톤
패트릭 바스콘셀로스 구르겔
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프로메틱 바이오사이엔시즈 리미티드
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Abstract

본 발명은 구조식 (Ⅰ)의 화합물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 여기서 R1 및 R2는 동일하거나 다르고 각각 선택적으로 치환된 알킬기, 선택적으로 치환된 씨클로알킬기, 선택적으로 치환된 아릴기, 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴기이고, R3은 수소 또는 아릴 치환기이거나 R3은 스페이서를 통해 선택적으로 접착된 고체 지지체이고, Z는 산소 원자, 황 원자 또는 NR4를 나타내고, Y는 산소 원자, 황 원자 또는 NR5를 나타내고, 여기서, R4 및 R5는 동일하거나 다르며, 수소, 1개 내지 6개의 탄소원자를 포함하는 선택적으로 치환된 알킬기, 선택적으로 치환된 페닐기, 선택적으로 치환된 벤질기 또는 선택적으로 치환된 β-페닐에틸기이고, X1 및 X2 중 하나는 질소 원자를 나타내고 X1 및 X2 중 다른 것은 질소 원자 또는 CR6이고, 여기서 R6은 수소 또는 아릴 치환기인 프리온 단백질의 친화성 결합에 유용한 화합물에 관한 것이다.

Description

프리온 단백질 리간드로써 치환된 트리아진 및 프리온을 탐지 또는 제거하는 그의 용도{SUBSTITUTED TRIAZINES AS PRION PROTEIN LIGANDS AND THEIR USE TO DETECT OR REMOVE PRIONS}
본 발명은 단백질 리간드 상호작용 분야에 관한 것으로, 보다 상세하게는 프리온 단백질("프리온 단백질 리간드")에 결합하는 화합물 및 생물학적인 샘플로부터 프리온을 탐지 또는 제거하는 화합물의 사용방법에 관한 것이다.
천연 또는 세포 프리온 단백질 "PrPc"는 포유류 전체에 넓게 분포되어 있고 특히 잘 보존된 아미노산 서열과 단백질 구조를 갖는다. 감염성 프리온은 정상 세포의 프리온 단백질(PrPc)의 변형된 형태로 구성되는 것으로 생각되어 "PrPsc" 불리워진다. 프리온은 다른 감염성 병원균과 공통적인 몇몇의 특성을 갖지만, 핵산을 포함하는 것으로 보이지 않는다. 그 대신에, 번역 후 형태 변화(post-translational conformational change)는 α-헤릭스가 β-쉬트 구조로 변형되는 동안 비감염성 PrPc가 감염성 PrPsc로의 변환에 관련된다고 제안되었다. PrPc는 세개의 α-헤릭스를 포함하고 β-쉬트는 거의 포함하지 않는다. 즉 대조적으로 PrPsc는 β-쉬트에 풍부하다. PrPc에서 PrPsc로의 변환은 PrPsc가 중추신경계(CNS)에 축적되어 신경병리학적 변화 및 신경 기능장애를 수반하는 동안 전염성해면상뇌 증(Transmissible Spongiform Encephalopathy)(TSEs)의 전개로 이른다고 생각된다. 스크래피(Scrapie) 형태의 프리온 단백질로서 종종 정의되는 PrPsc는 필연적이며 동물과 인간의 이러한 전염성 퇴행성 질환의 전염 및 발병이 일어날 수 있을 것으로 간주된다.
TSEs의 특정한 예들은 양과 염소를 감염시키는 스크래피, 소에 감염되는 광우병(Bovine Spongiform Encephalopathy, BSE), 전염성밍크뇌증(Transmissible Mink Encephalopathy), 고양이 해면상뇌증(Feline Spongiform Encephalopathy) 및 뮬사슴(mule deer), 흰꼬리 사슴(white-tailed deer), 검은 꼬리 사슴 및 붉은 사슴의 만성 소모성 질환(CWD)을 포함한다. 인간에서, TSE 병은 쿠루병, 크로이츠펠트-야코브병(Creutzfeldt-Jakob, CJD), 저스만 스트라우슬러 쉥크병(Gerstmann-Straussler-Scheinker Syndrome, GSS), 치사성 불면증 및 변종 크로이츠펠트-야코브병(Creutzfeldt-Jakob, vCJD) 자체로 나타날 수 있다. 최근 vCJD는 영국에서 BSE 전염병의 결과로 인간에게 나타났으며, BSE 또는 "광우병"에 감염된 소로부터 유래된 식품 소비로 야기될 수 있다. 1980년대 중반에서 1990년대 초반 동안, 알려지지 않은 많은 영국 사람들이 BSE에 감염된 소의 신경조직에 잠재적으로 감염된 식품을 섭취하였다. 인간의 경구 수축증의 잠복기는 20년 이상일 수 있기 때문에, vCJD의 정확한 발병은 수년 동안 분명하지 않을 수 있다. 지금까지, 맨처음 영국에서 150명 이상의 사람들이 이 병에 걸린 것으로 알려졌다. 그러나, 이러한 사례들은 캐나다, 프랑스, 홍콩, 아일랜드, 이탈리아 및 미국에서도 보고되었다. 영국에서 감염된 소 사료의 전세계적인 수출은 BSE의 세계적 존재의 가능성과 이에 따른 vCJD의 확률을 나타낸다. 이러한 관찰은 대부분의 유럽국가, 캐나다, 미국, 일본 및 이스라엘에서 BSE 발견과 일치한다. 결론적으로, 식품을 포함한 다양한 원료로부터 감염성 프리온 단백질의 검출 및 제거력은 매우 중요하다.
역사적으로, TSEs의 진단은 이 질병의 임상적 표시의 발생을 기초로 하고 뇌 조직의 사후조직검사로만 확인될 수 있다. 모든 TSEs의 특징은 병원체에 반응하는 중요한 숙주면역의 부족이다. 그러므로, 항체가 생산되지 않고 일반적인 혈청시험은 감염된 동물을 확인하는데 사용될 수 없다. 최근, 뇌의 이상 프리온 단백질 확인은 질병진단력을 개선하였다.
소 유래의 감염된 식품의 섭취뿐만 아니라, 수혈 및 기관이식은 인간에서 또다른 vCJD의 잠재 감염 모드를 나타낸다. 영국에서 수혈로 인한 vCJD 감염으로 의심되는 두가지 사례가 있다. 수혈에 의한 인간의 vCJD 감염은 현재 알려지지 않지만, 이것은 섭취에 비해서 vCJD 감염의 보다 효과적인 수단일 수 있다는 우려가 증가하고 있다. 이것은 양으로부터의 감염을 포함하여 실험동물모델의 데이터와 일치한다. 다른 인간의 TSEs와는 달리, PrPsc는 vCJD 환자의 림프망세포계에서 나타나서, 혈액에 존재하는 감염원의 확률을 증가시키고 수혈을 통한 감염을 증가시킨다. 수혈에 의한 감염 위험을 상승시키는 다른 요소는 알려지지는 않았지만, 추정상 매우 많은 사람들이 BSE에 노출되어 있고, vCJD에 대한 잠복기 진단 시험이 부족하다. 더구나, vCJD의 발병력은 영장류동물 및 쥐에서 종의 적응력에 따라 증가되는 것으로 나타나며, 인간에서 인간으로의 감염은 소에서 인간으로의 감염보다 더 유력할 수 있다는 것을 암시한다. 그러므로, 수혈로 인한 vCJD 감염의 방지 방법이 시급하게 요구된다. 이러한 조치는 감염 공여자의 초기 확인, 및 동물 또는 인간 소비 또는 용도로 의도된 동물유래의 식품 및 건강제품, 인간 및 소 혈액 유래의 제품, 및 기관 이식의 TSE 병원체의 제거 및 불활성화를 포함할 수 있다. 유감스럽게도, PrPsc는 화학 및 물리적 불활성화 방법에 매우 저항성있고, 선택적 불활성화 방법은 어렵다.
리간드와의 특정한 상호작용을 통한 프리온 제거는 보다 유망하다. 많은 리간드는 이미 프리온 단백질에 결합하는 것으로 확인되었다. 조합 펩타이드 라이브러리는 PCT 국제공개공보 WO 01/77687호에 기재된 바와 같이, 모든 공지된 포유동물의 프리온 단백질에서 발견된 옥타펩타이드 반복서열(PHGGGWGQ)에 결합하는 리간드를 선별하여 일련의 리간드를 발견하였다. 다른 물질들은 다양한 폴리머, 예를 들면 TosoBioSep사가 제조한 아미노 폴리메타크릴레이트, 일반적인 이온교환수지(Gawryl 등의 미국특허 US 5,808,011호 참조), 아밀로이드 플라크와 상호작용하는 리간드, 예를 들면 Congo Red{Ingrosso 등, J. Virology 69:506-508(1995)}, 4-요오드, 4-데옥시 독소루비신{Tagliavini 등, Science 276:1119-1122(1997)}, 암포테리신 B, 포르피린 및 프탈로시아닌{Priola 등, Science 287:1503-1506(2000)}, 금속{Stockel 등, Biochemistry, 37, 7185-7193(1998)}, 복합체를 형성하는 PrP와 상호작용하는 펩타이드{Prusiner 등 및 Soto 등, 미국특허 US 5,750,361, Lancet, 355:192-197(2000)}, 헤파린 및 다른 폴리설페이트된 다가음이온{Caughey 등, 프로테아제 민감성 형태의 프리온 단백질 PrP의 셀페이트된 글리코사미노글리칸 및 Congo Red에 결합, J. Virology 68:2135-2141(1994)}, 항체{Kascsak 등, Immunological Invest, 26:259-268(1997)} 및 다른 단백질, 예를 들면 플라스미노겐ischer 등, Nature 408:479-483(2000)}를 포함한다. 일부가 특수한 환경(Gawryl 등, 미국특허 US 5,808,011호 참조)에서 유용하다 할지라도, 매우 다양한 매개체로부터 프리온에 결합될 수 있는 리간드를 완전히 특징화하거나 찾을 수 없다.
현재까지, 인간 TSE 질환은 100% 치사한다. 유감스럽게도 암포테리신, 셀페이트된 다가음이온, Congo Red 염료 및 안트라씨클린 항생제를 포함하는 많은 화합물이 전망있는 치료제로서 보고되어 왔지만, 모두 프리온 전파를 방해하는 일반적인 가능성만을 증명하고, 감염 숙주에서 기존의 프리온 제거에 효과가 있다는 것을 아무도 증명하지 않는다. 그러므로, 새로운 치료제에 대한 시급한 요구가 남아있다.
정상 수용성 단백질의 구조 변경 및 불용성 형태로의 조합 및 분해는 다양한 다른 질병의 원인과정으로 생각되고, 많은 질병들은 신경질환이다. 병의 개시와 정상에서 형태변형 단백질로의 전이 사이의 관계는 불충분하게 이해되고 있다. 프리온 뿐만 아니라 이러한 불용성 단백질의 예들은 알쯔하이머 병 및 대뇌 아밀로이드 맥관병증(Cerebral Amyloid Angiopathy)(CAA)의 아밀로이드 플라크에 있는 β-아밀로이드 펩타이드; 파킨슨 병의 루이소체(lewy body)에서 α-시뉴클레인 침전물; 전측두 치매(frontal temporal dementia)의 신경섬유농축제(neurofibrillary tangle)에서 타우(tau)입자; 근위축성측삭경화증(Amyotrophic Lateral Sclerosis)의 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈; 및 헌팅턴 병의 헌팅틴(huntingtin)을 포함한다.
종종 이러한 높은 불용성 단백질은 β-주름 시트 형태의 일반적인 특성을 가 진 무측쇄 원섬유로 구성된 응집물을 형성한다. 중추신경계에서, 아밀로이드는 대뇌 및 뇌막 혈관(뇌혈관 침전물) 및 뇌 실질(parenchyma)(플라크)에서 존재할 수 있다. 인간 및 동물 모델에 대한 신경병리학적 연구는 아밀로이드 침전물에 인접하는 세포들은 그 정상기능이 방해되는 것으로 나타냈다.
초로성 반점(neuritic plaque)을 형성하는 정확한 기작, 및 플라크 형성과 질병관련 신경퇴행성 진행의 관계는 거의 알려지지 않는다. 용이하게 분류할 수 있거나 두개 이상의 다른 형태의 단백질, 예를 들어 PrPc 및 PrPsc을 구별할 수 있는 계통분류학은 변환과정을 이해하고 질병관련 형태와 특정하게 상호작용할 구조를 찾는 것이 필요하다. 아이소 형태(isoform) 간에 분리 또는 구별하는 현재의 계통분류학은, 요소와 같은 케이오트로프(chaotrope) 존재하에서 폴리아크릴아미드 겔, 즉 트랜스버스 요소 기울기(TUG)겔의 다른 유동성; 프로테아제 처리, 예를 들면 단백질분해효소 K(PK)에 대한 다른 민감성 및 PrPres로 정의되는 PrPsc의 PK 저항성 소화생성물의 검출; 다른 온도 안정성; 비이온 세제의 상대용해도; 및 일정한 화학물질, 예를 들면 Congo red 및 이소플라빈 S에 결합하는 섬유구조력을 포함한다. 그러나, 형태적으로 변형된 단백질 및 특히 질병관련한 형태들에 대하여 특이적인 고친화력 시약을 확인하는데 충족되지 않은 요구가 남아 있다. 이러한 시약은 다른 형태 단백질의 분리 및 정제용과, 치료제, 생물학적 생산물, 백신 및 식품에서 감염형태의 질병의 제거용과, 치료용 진단 킷트를 개발하는데 유용할 수 있다.
본 발명의 제 1양상에 따라, 프리온 단백질의 친화성 결합용 구조식 (Ⅰ)의 화합물의 용도가 제공된다.
Figure 112007016061858-PCT00001
여기서 R1 및 R2는 동일하거나 다르고 각각 선택 치환된 알킬기, 선택 치환된 씨클로알킬기, 선택 치환된 아릴기, 또는 선택 치환된 헤테로아릴기이고,
R3은 수소 또는 아릴 치환기이거나 R3은 스페이서를 통해 선택 결합된 고체 지지체이고,
Z는 산소 원자, 황 원자 또는 NR4를 나타내고,
Y는 산소 원자, 황 원자 또는 NR5를 나타내고,
여기서, R4 및 R5는 동일하거나 다르며, 수소, 1개 내지 6개의 탄소원자를 포함하는 선택 치환된 알킬기, 선택 치환된 페닐기, 선택 치환된 벤질기 또는 선택 치환된 β-페닐에틸기이고,
X1 및 X2 중 하나는 질소 원자를 나타내고 X1 및 X2 중 다른 것은 질소 원자 또는 CR6이고, 여기서 R6은 수소 또는 아릴 치환기이다.
구조식 (Ⅰ)의 화합물은 생물학적 유동체 또는 환경샘플와 같은 샘플로부터 프리온 단백질을 탐지 또는 제거하는데 유용할 수 있다. 상기 화합물은 상기 샘플로부터 모든 프리온 단백질을 탐지 또는 제거하는데 사용되며, 단일형태의 프리온 단백질을 탐지 또는 제거하는데 선택적으로 선택될 수 있으므로, 인간 TSEs로 고통받는 환자 및 스크래피, BSE 또는 CWD로 고통받는 동물 샘플에서 감염성 프리온 단백질과 비감염성 프리온 단백질을 구별하는데 사용된다. 상기 화합물들은 프리온 질병의 진단 및 치료 방법뿐만 아니라 인간 또는 동물 유래의 생물학적 유동체 또는 환경 샘플과 같은 샘플에서 프리온 단백질을 탐지하는 방법에 유용하다. 예를 들면, 본 발명의 화합물은 CJD, vCJD, GSS, 치사성 불면증, 스크래피, BSE 및 CWD와 같은 병상, 및 전체 혈액, 혈액 구성분, 세포, 혈청, 혈장, 혈장 유도체, 뇌척수액, 소변, 눈물, 편도, 충수 및 다른 조직들을 이용하는 다른 TSEs를 치료 및 진단하는데 유용할 수 있다. 또한 상기 화합물은 혈액 샘플, 혈액 구성분, 세포, 혈청, 혈장, 혈장 유도체, 뇌척수액, 소변, 눈물, 편도, 충수 및 다른 물질들과 같은 샘플로부터 프리온 단백질을 제거하는데 유용할 수 있다.
다른 양상에서, 본 발명은 샘플에서 프리온 단백질을 탐지, 및/또는 샘플로부터 프리온 단백질을 제거하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 샘플과 상기 기재된 바와 같은 구조식(Ⅰ)의 화합물을 접촉시키는 단계를 포함한다.
또한, 고체 지지체에 결합하지 않는 구조식(Ⅰ)의 화합물(여기서, R3은 수소 또는 치환기를 나타낸다)은 환자의 프리온 관련 병상 전개를 치료 또는 지연시키는데 유용할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 리간드는 CJD, vCJD, GSS, 치사성 불면증, 스크래피, BSE 및 CWD와 같은 병상을 치료하는데 유용할 수 있다. 어떠한 이론과도 결합되지 않고도, 이러한 리간드는 PrPsc의 중합을 방해하거나 PrPsc 및 PrPc의 상호작용을 저해하는 것을 통해 작용할 수 있으므로, 추가의 PrPsc 전개가 느려진다.
그러므로, 본 발명의 추가 양상에서, 인간 또는 동물 환자의 프리온 관련 병상의 전개를 치료 또는 지연하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 고체 지지체에 결합되지 않는 구조식(Ⅰ)의 화합물을 치료적 유효량으로 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
이와 같이, 프리온 관련 병상 치료용 약제의 제조시에 고체 지지체에 결합하지 않는 구조식(Ⅰ)의 화합물의 용도를 더 제공한다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 이하의 상세한 설명 및 바람직한 실시예로 분명해질 것이다.
정의
본 명세서에서 사용되는 "단수"용어는 "한개 이상"을 의미하는 것을 정의하고 문맥이 적당하다면 복수를 포함한다.
"3F4" 용어는 고유의 PrPsc 또는 PrPres 가 아니라, 고유형태의 PrPc에 특이적인 단일클론 항체를 나타낸다. 상기 항체는 변성 형태의 햄스터 및 인간 PrPc, PrPsc 및 PrPres에 특이성을 갖는다.
"알케닐" 용어는 직선상 또는 분지상일 수 있는 탄소와 탄소 이중결합을 포함하는 알리파틱 탄화수소기를 나타낸다. 바람직한 알케닐기는 사슬에서 2 내지 12개의 탄소원자, 및 보다 바람직하게 사슬에서 2 내지 6개의 탄소원자, 예를 들어 프로페닐, n-부텐닐, 이소-부테닐, 3-메틸부트-2-에닐, n-펜텐닐 및 헵텐닐을 포함한다. "씨클로알케닐" 및 "헤테로씨클로알케닐"용어는 유사어이다.
"알콕시"용어는 알킬-O-기를 나타내고 상기 알킬기는 본 명세서에서 설명된 바와 같다. 예들은 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 이소프로폭시, 부톡시 및 펜톡시를 포함한다.
본 명세서에서 단독 또는 결합으로 사용되는 "알킬" 용어는 직선상 또는 분지상의 1 내지 15개 탄소원자를 가지는 포화 탄화수소를 나타낸다. 탄소 1 내지 6개를 갖는 저급 알킬기는 예를 들면, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이차-부틸, 이소부틸, 삼차-부틸, n-펜틸, 2-메틸부틸, 3-메틸부틸, n-헥실, 4-메틸펜틸, 네오펜틸 및 2,2-디메틸프로필이 바람직하다. 알킬기가 "선택 치환"으로 기재되는 경우, 그러한 기는 한 개 이상의 치환기, 특히 본 명세서에서 정의된 바와 같이 한 개 이상의 "알킬 치환기"로 치환될 수 있다.
"알킬 치환기"용어는 다르게 정의하지 않는다면, 하이드록시, 아미노, 알킬, 할로겐, 하이드록시알킬, 아미드, 아실, 아실아미노, 알콕시, 알콕시카보닐, 알킬렌디옥시, 알킬설피닐, 알킬술포닐, 알킬티오, 아로일, 아로일아미노, 아릴, 아릴알콕시, 아릴알콕시카보닐, 아릴알킬티오, 아릴옥시, 아릴옥시카보닐, 아릴설피닐, 아릴술포닐, 아릴티오, 카복시{또는 생물학적 동등체 산(acid bioisostere)}, 시아노, 헤테로아로일, 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬옥시, 헤테로아로일아미노, 헤테로아로일옥시, 니트로 또는 트리플루오르메틸을 나타낸다.
"아로일" 용어는 아릴-CO-기를 나타내고, 여기서 아릴기는 본 명세서에서 기재된 바와 같이 예를 들면, 벤조일 및 1- 및 2-나프토일이다.
작용기 또는 작용기의 부분으로서 "아릴"용어는
⒜ 페닐, 나프탈렌, 아세안스릴렌(aceanthrylene), 아세나프틸렌, 아세펜안스릴렌, 아쥴렌(azulene), 크리센(chrysene), 인다센(indacene), 인딘, 플루오르, 펜알렌 및 펜난트렌과 같은 탄소수 6 내지 18개의 선택치환된 모노씨클릭 또는 멀티씨클릭 방향 카복시 모이어티; 또는
⒝ 선택 치환된 부분 포화 멀티시클릭 방향 카보시클릭 모이어티(여기서, 아릴 및 씨클로알킬, 씨클로아케닐, 헤테로씨클로알킬 또는 헤테로씨클로알케닐기는 함께 융합하여 인돌리닐, 테트라하이드로나프틸, 인데닐 또는 인다닐 고리와 같은 시클릭 구조를 형성한다)이다.
바람직한 아릴기는 선택 치환된 페닐기이다.
아릴기가 "선택치환"으로 기재되는 경우, 그러한 작용기가 한 개 이상의 치환체, 특히 본 명세서에서 정의된 바와 같이 한 개 이상의 "아릴 치환기"에 의해 치환될 수 있다.
"아릴 치환기"는 다르게 정의하지 않는다면, 하이드록실, 아미노, 알킬, 할로겐, 하이드록시알킬, 아미드, 아실, 아실아미노, 알콕시, 알콕시카보닐, 알킬렌디옥시, 알킬설피닐, 알킬술포닐, 알킬티오, 아로일, 아로일아미노, 아릴, 아릴알콕시, 아릴알콕시카보닐, 아릴알킬티오, 아릴옥시, 아릴옥시카보닐, 아릴설피닐, 아릴술포닐, 아릴티오, 카복시(또는 생물학적 동등체 산), 시아노, 헤테로아로일, 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬옥시, 헤테로아로일아미노, 헤테로아릴옥시, 니트로, 옥소 또는 트리플루오르메틸이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "혈액 유래 조성물"용어는 전체 혈액, 적혈구세포 농축물, 혈장, 혈청, 고 혈소판 및 저 혈소판 분획, 혈소판 농축물, 백혈구, 혈장 침전물, 혈장 분획 침전물 및 상청액, IgA, IgE, IgG 및 IgM을 포함하는 면역글로불린 제제, 정제 응집원 농출물, 피브리노겐 농축물 또는 인간 또는 동물로부터 유래된 다양한 다른 조성물을 포함하는 것을 의미한다. 또한 이온교환, 친화력, 겔 투과, 및/또는 소수성 크래마토그래피를 포함하는 기술분야에서 공통적인 임의의 다양한 방법 또는 차별 침전에 의해 제조되는 정제 혈액 유래 단백질을 포함한다.
"결합 라이브러리" 용어는 고체상 결합화학 기법으로 합성된 화학물질의 수집이다. 이러한 정의는 임의의 백만개 화합물을 생성하거나 정의된 구조를 포함하도록 설계될 수 있는 분열 연결 재조합방법(split-couple-recombine method)를 사용하는 것을 포함한다. 기본골격은 트리아진 골격 등이다.
"씨클로알킬"용어는 측쇄가 있거나 또는 없는 3개 내지 12개의 탄소수를 가진 포화 모노씨클릭, 비씨클릭 또는 폴리씨클릭 고리이며, -(C=O)-가 선택적으로 삽입되어 있다. 바람직한 씨클로알킬기는 모노씨클로알칸, 예를 들면 씨클로프로필, 씨클로펜틸, 씨클로헥실, 씨클로헵틸; 탄소 한 개에 연결된 비씨클로 알칸, 예를 들면 스피로노난; 및 탄소 두 개에 연결된 비씨클로알칸을 포함하는 포화 브릿지링 계, 예를 들면 노보네인, 비씨클로[4.3.2]운데칸, 비씨클[4.1.0]헵탄 및 데칼린, 및 폴리씨클릭 브릿지계, 예를 들면 아다멘틴이다. 보다 바람직하게 씨클로알킬기는 모노씨클로알칸 또는 브릿지링계이다. 가장 바람직하게 씨클로알킬기는 씨클로헥실, 노보네인 또는 아다멘틴이다.
씨클로알킬기가 "선택치환"으로 기재된 경우, 그러한 기는 한 개 이상의 치환기, 특히 본 명세서에 정의된 바와 같이 한 개 이상의 "알킬치환기"로 치환될 수 있다.
"할로겐"용어는 플루오르, 염소, 브롬 또는 요오드를 의미한다.
작용기 또는 작용기의 부분으로서 "헤테로아릴"용어는
⒜ 다르게 정의하지 않는다면, 본 명세서에서 정의된 바와 같이 한 개 이상의 아릴치환기로 선택 치환된 모노씨클릭 아릴(여기서, 한 개 이상의 고리 구성요소는 탄소 이외의 원소, 예를 들면 N, O 또는 S이고, 바람직한 예는 모노씨클릭 또는 비씨클릭, 예를 들면 벤즈이미다조일, 벤즈티아조일, 퓨릴, 이미다조일, 인돌릭, 인돌리지닐, 이소옥사졸, 이소퀴놀릴, 이소티아조일, 옥사디아조일, 피란닐, 피라지닐, 피리다지닐, 피라조일, 피리딜, 피리미디닐, 피로릴, 퀴나졸리닐, 퀴놀릴, 1,3,4-티아디아졸릴, 티아졸릴, 티에닐 및 트리아졸릴기이다) 또는
⒝ 선택 치환된 부분 포화 멀티씨클릭 헤테로카보씨클릭 모이어티{여기서, 헤테로아릴 및 씨클로알킬, 씨클로아케닐, 헤테로씨클로알킬 또는 헤테로씨클로알케닐기는 함께 융합되어 씨클릭구조(다르게 정의된 경우를 제외하고, 그러한 작용기의 예는 본 명세서에서 정의된 바와 같이 한 개 이상의 아릴 치환기로 선택치환된 피리다닐기를 포함한다)를 형성한다}이다.
헤테로아릴기가 "선택치환"으로 기재된 경우, 그러한 작용기는 한 개 이상의 치환기, 특히 본 명세서에서 정의된 바와 같이 한 개 이상의 "아릴 치환기"로 치환될 수 있다.
"헤테로씨클로알킬"용어는 헤테로원자 또는 헤테로원자를 포함하는 작용기, 예를 들면 O, S, N 또는 NR7(R7이 수소 또는 알킬기인 경우)로 대체된 적어도 한 개의 탄소고리를 가진 씨클로알킬기이다. 바람직한 헤테로씨클로알킬기는 한 개 이상의 질소 원자, 예를 들면 이미다졸리딘, 피퍼리딘, 모르폴린, 피페라진, 피롤리돈, 피라졸리딘 및 퀴뉴클리딘을 포함한다. 보다 바람직한 예는 한 개 이상의 질소원자는 갖는 헤테로모노씨클로알칸, 예를 들면 피페리딘 및 피페라진이다. 헤테로씨클로알킬기가 "선택치환"으로 설명된 경우, 그러한 작용기는 한 개 이상의 치환기, 특히 본 명세서에 정의된 바와 같이 한 개 이상의 "알킬 치환기"로 치환될 수 있다.
"소수성기(hydrophobic group)"용어는 일반적으로 전기적으로 중성이고 비극성인 친유성기이다. 소수성기는 수용성 용매 또는 환경과 대립하기 때문에, 중성 및 비극성 용매 또는 분자환경을 선호한다. 그러므로, 소수성기는 정상 생리적 환경에서 다른 소수성기에 대하여 친화력을 갖는다. 소수성기의 예는 일반적으로 알킬 및 씨클로알킬기, 바람직하게 치환되지 않은 알킬 및 씨클로알킬기, 및 아릴기를 포함한다.
본 발명에 설명된 화합물들은 일반적으로 생리적 pH와 같거나 가까운 pH에서 사용될 것이다. 이러한 화합물의 소수성 특성, 또는 이러한 화합물 내에서 특별한 모이어티의 소수성 특성은 관련된 모이어티가 그러한 pH에서 하전되는지에 의해 결정될 것이다. 예를 들어 생리적 pH에서 질소가 전하를 띠지 않을 때 1-(2-아미노에틸)피페리딘이 소수성기이다.
"리간드"용어는 단백질, 펩타이드 또는 폴리펩타이드가 결합하는 분자이다. 본 발명의 리간드는 트라이진과 같은 치환된 헤테로방향족 화합물이다.
"PrPc"용어는 포유동물 체내에서 자연적으로 다양하게 발현되는 고유 프리온 단백질 분자이다. 이 구조는 매우 보존적이며, 질병 상태와 관련이 없다.
"PrPsc"용어는 PrPc 분자의 형태적으로 변형된 형태이고, 이것은 감염성인 것으로 생각되며 vCJD, CJD, 쿠루병, 치사성 불면증, GSS, 스크래피, BSE, CWD, 전용 및 실험 동물의 다른 휘귀한 TSEs를 포함한 TSE/ 프리온 질병과 관련이 있다. 이것은 정상적 세포성 PrPc로써 동일한 아미노산 서열을 갖지만, α-헤릭스의 일부는 β-시트로 변환되고, 질병상태와 관련된다.
"PrPres"용어는 PK를 갖는 PrPsc의 부분 소화 다음에 남는 27~30 kDa PrPsc 단백질의 프로테이나제(proteinase) 저항 유도체이다.
"PrP"용어는 일반적으로 프리온 단백질이다.
"스페이서"용어는 친화력 리간드를 지지 매트릭스에 연결하는 선택적 모이어티이다. 바람직한 스페이스 분류는 일반 구조식(Ⅱ)로 표시된다:
-T-[-L-V-]a- (Ⅱ)
여기서, T는 O, S 또는 NR7을 나타내고,
V는 -O-, -S-, -COO-, CONH-, 또는 -NHCO-, -PO3H-, -NH-, 아릴렌-SO2-CH2CH2- 또는 NR7-을 나타내고,
L은 탄소원자 2 내지 20개를 포함하는 선택 치환된 탄화수소결합을 나타내고,
a는 0 또는 1이다.
"지지 매트릭스"용어는 입자 또는 비입자, 용해성 또는 불용성, 다공성 또는 비다공성인 것에 상관없이 임의의 화합물 또는 물질이며, 본 발명에 따라 친화력 리간드 매트릭스 컨쥬게이트를 형성하는데 사용될 수 있고, 용액의 용질로부터 친화력 리간드를 분리하는 편리한 수단을 제공한다. 그러므로 지지 매트릭스는 예를 들어 컬럼, 비드(bead), 작은 입자, 멤브레인 또는 망사 형태를 취한다.
지지 매트릭스의 예는 자연 발생하는 폴리머와 같은 용해성 지지 매트릭스를 포함할 수 있으며, 예를 들면, 폴리펩타이드 또는 교차결합된 알부민과 같은 단백질, 아가로즈, 알기네이트, 카라기난, 키틴, 셀룰로오스, 덱스트란 또는 전분과 같은 다당류; 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌, 폴리아크올레인, 폴리비닐 알코올, 폴리메틸아크릴레이트, 퍼플루오르카본과 같은 합성 폴리머; 실리카, 유리, 규조토(kieselguhr), 알루미나, 산화철 또는 다른 금속 산화물과 같은 무기화합물, 또는 자연 발생하는 두개 이상의 폴리머, 합성 폴리머 또는 무기화합물의 임의의 조합으로 구성되는 코폴리머가 있다.
지지 매트릭스의 정의 안에 덱스트란, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐알콜 또는 지질 분할에 사용되는 친화력 리간드 매트릭스 컨쥬게이트를 제공하는 가수분해된 전분과 같은 폴리머를 포함하는 용해성 지지 매트릭스, 또는 친화력 에멀젼 형성에 사용되는 친화력 리간드 매트릭스 컨쥬게이트를 제공하는 퍼플루오르데칼린과 같은 화합물을 포함하는 고체 지지 매트릭스를 포함한다.
지지 매트릭스의 정의 안에 리간드의 결합 전 또는 결합 동안 활성화제 처리에 의해 변형되어 있거나 변형된 아가로즈, 셀루로오즈, 덱스트란, 전분, 알기네이트, 카라기난, 합성 폴리머, 실리카, 유리 및 금속 산화물과 같은 지지 매트릭스를 더 포함한다.
지지 매트릭스는 바람직하게 선택적으로 활성화된 아가로즈, 실리카, 셀룰로오즈, 유리, 메타아크릴레이트, 하이드록시에틸메타아크릴레이트, 폴리아크릴아미드, 스티렌디비닐벤젠, 하이퍼 D 또는 퍼플루오르카본이다. 보다 바람직하게 지지 매트릭스는 상표명 토요펄(Toyopearl)(Tosoh Bioscience LLC, 156 Keystone Drive, Montgomeryville, PA, 18936, USA)으로 판매되는 타입의 메타크릴레이트 물질이다.
PCT국제공개공보 WO 97/10887호는 친화력 리간드를 지지 매트릭스에 결합하는 방법, 예를 들어 활성화 방법의 용도, 및 친화력 리간드 매트릭스 컨쥬게이트를 형성하기 위해 스페이서를 통해, 예를 들어 축합반응에 의해 친화력 리간드를 매트릭스에 결합하는 방법을 기재한다.
구조식(Ⅰ)의 화합물은 X1 및 X2 가 모두 질소 원자를 나타낼 때 바람직하다.
구조식(Ⅰ)의 화합물은 Z와 Y가 모두 NR4일 경우, 특히 R4가 수소일 경우 바람직하다.
적어도 하나의 R1 및 R2는 선택치환된 알킬기를 나타내는 것이 바람직하다.
구조식(Ⅰa)의 화합물로 정의된 일반 구조식(Ⅰ)의 특히 바람직한 화합물의 제1 작용기에서,
R3은 상기 정의된 바와 같고,
X1 및 X2는 상기 정의된 바와 같고,
Y는 상기 정의된 바와 같고,
Z는 상기 정의된 바와 같고,
R1은 -(CH2)m-Q1 작용기를 나타내고, 여기서 m은 0 내지 7이고, Q1 은 CR11R12R13 또는 NR11R12를 나타내고, 여기서 R11, R12 및 R13은 각각 수소, 알킬, 씨클로알킬 또는 헤테로씨클로알킬기를 나타내고, R11, R12 및 R13 중 두 개는 탄소 또는 질소원자에 결합하여 선택 치환된 씨클로알킬 또는 선택 치환된 헤테로씨클로알킬기를 형성하고.
R2는 -(CH2)n-Q2 작용기를 나타내고, 여기서 n은 0 내지 7이고, Q2 는 -CR21R22R23 또는 -NR21R22를 나타내고, 여기서 R21, R22 및 R23은 각각 수소, 알킬, 씨클로알킬 또는 헤테로씨클로알킬을 나타내고, 이 R11, R12 및 R13 중 두 개는 탄소 또는 질소원자와 결합하여 함께 선택 치환된 씨클로알킬 또는 선택 치환된 헤테로씨클로알킬기를 형성한다.
구조식(Ⅰa)의 화합물에서,
⒜ X1 및 X2는 모두 질소인 것이 바람직하고,
⒝ Z 및 Y 모두 NR4를 나타내는 것이 바람직하고, 특히 여기서 R4는 수소이고,
⒞ m은 바람직하게 0 내지 4이고, 보다 바람직하게 0 내지 3이고, 가장 바람직하게 1 내지 3이고,
⒟ Q1은 바람직하게 -NR11R12이고, R11 및 R12는 바람직하게 질소 원자에 결합하여 함께 헤테로씨클로알킬기를 형성하고,
⒠ n은 바람직하게 0 내지 4 이고, 보다 바람직하게 0 내지 2이고, 가장 바람직하게 0이고,
⒡ R21 및 R22는 바람직하게 탄소 원자 또는 질소원자에 결합하여 함께, 씨클로알킬 또는 헤테로씨클로알킬기를 형성한다.
Q2가 나타낼 수 있는 특히 바람직한 작용기는 특히 적어도 6개 원자를 포함하는 고리계를 갖는 소수성 씨클로알킬 및 헤테로씨클로알킬기를 포함한다. 이러한 작용기의 예는 씨클로헥실, 피페리딜, 특히 1-피페리딜 및 브릿지 카보씨클릭 고리계, 특히 노보닐을 포함한다. 이러한 작용기는 바람직하게 치환되지 않고, 특히 임의의 극성 치환기로 치환되지 않는다.
Q1이 나타낼 수 있는 특별한 작용기는 헤테로씨클로알칼기, 특히 피페리딜, 특히 1-피페리딜, 및 피페라지닐, 특히 1-피페라지닐을 포함한다.
구조식(Ⅰb)의 화합물로 정의되는 일반 구조식(Ⅰ)의 특히 바람직한 화합물의 제2 작용기에서,
R3은 상기 정의된 바와 같고,
X1 및 X2는 상기 정의된 바와 같고,
Y는 상기 정의된 바와 같고,
Z는 상기 정의된 바와 같고,
R1은 알킬렌 사슬 -(CH2)P-CH3를 나타내고, 여기서 p는 0 내지 6이고, 한 개 이상의 카복실기에 의해 치환되고, 한 개 이상의 추가의 알킬 치환기에 의해 선택적으로 치환되며,
R2는 -(CH2)q-Ar기를 나타내고, 여기서 q는 0 내지 7이고, Ar은 선택 치환된 아릴기를 나타낸다.
구조식(Ⅰb)의 화합물에서,
⒜ X1 및 X2는 모두 질소인 것이 바람직하고,
⒝ Z 및 Y는 모두 바람직하게 NR4를 나타내고, 특히 여기서 R4는 수소이고,
⒞ p는 바람직하게 0 내지 4이고, 보다 바람직하게 0 내지 3이고,
⒟ R1은 바람직하게 한 개 또는 두 개의 카복실기로 치환되고, 이러한 카복실기중 적어도 한 개는 알킬렌 사슬 -(CH2)p-CH3의 말단 탄소 원자에 의해 운반되고,
⒠ q는 바람직하게 0 내지 4이고, 보다 바람직하게 0 내지 3이고, 가장 바람직하게 1 또는 2이고,
⒡ Ar은 페닐, 페녹시, 톨릴, 클로로벤질, 메톡시벤질, 플루오르벤질, 피리딜 및 인돌기로 구성된 그룹으로부터 선택되는 한 개 이상의 치환기에 의해 선택 치환된 모노씨클릭 카보씨클릭 또는 헤테로씨클릭 방향족기가 바람직하다. Ar은 페닐, 페녹시 또는 피리딜이 보다 바람직하다.
R1이 나타낼 수 있는 특히 바람직한 작용기는 카복시메틸, 4-카복시부틸 및 1-(1,3-디카복시)프로필기이다.
Ar이 나타낼 수 있는 특히 바람직한 작용기는 페닐, 4-하이드록시페닐 및 피리딜, 특히 2-피리딜을 포함한다.
구조식 (Ⅰa) 및 (Ⅰb)의 화합물은 신규하고, 본 발명의 추가 양상을 나타낸다.
본 발명에 유용한 것으로 발견된 특수한 화합물 구조식(Ⅰ)의 일 세트는 구조식 (Ⅰa)의 화합물이고, 여기서,
R3는 상기 정의된 바와 같고,
X1 및 X2는 모두 N 이고,
Y 및 Z는 모두 NH를 나타내고,
m은 2를 나타내고,
Q1은 피페리딜 또는 피페라지닐을 나타내고,
n은 0 또는 2를 나타내고,
Q2는 1-피페리딜 또는 아다만틸을 나타낸다.
본 발명에서 유용한 것으로 발견된 특수한 화합물 구조식(Ⅰ)의 다른 세트는 구조식 (Ⅰb)의 화합물이고, 여기서,
R3는 상기 정의된 바와 같고,
X1 및 X2는 모두 N 이고,
Y 및 Z는 모두 NH를 나타내고,
R1은 카복시메틸, 4-카복시부틸 및 1-(1,3-디카복시)프로필을 나타내고,
q는 2를 나타내고,
Ar은 페닐, 2-피리딜 또는 4-하이드록시페닐을 나타낸다.
본 발명의 바람직한 실시예는 단지 설명에 의해서만 이하의 방법 및 실시예를 참고하여 지금부터 기재될 것이다.
리간드 합성
구조식(Ⅰ)의 화합물을 제조할 수 있는 방법은 일반적으로 기술분야의 당업자에게는 자명할 것이다. 예를 들어 참조문헌은 PCT 국제공개공보 WO97/10887호에 기재된 합성방법으로 만들어질 것이다.
구조식(Ⅰ)의 화합물을 제조할 수 있는 일 방법은 일반구조식(Ⅱ)의 화합물 반응과 관련한다.
Figure 112007016061858-PCT00002
여기서, R1, Z, R2, Y, X1 및 X2는 구조식(Ⅰ)과 관련하여 상기 설명된 바와 같이 아민을 포함하는 지지 매트릭스를 가진다.
구조식(Ⅰ)의 화합물을 제조할 수 있는 다른 방법은 구조식 (Ⅲ)의 화합물 반응과 관련한다.
Figure 112007016061858-PCT00003
여기서, R1, Z, X1 및 X2는 구조식(Ⅰ)과 관련하여 상기 기재된 바와 같이 구조식(Ⅳ)의 화합물을 형성하는 아민을 포함하는 지지 매트릭스를 가진다.
Figure 112007016061858-PCT00004
여기서, R1, Z, X1 및 X2는 구조식(Ⅰ)과 관련하여 상기 기재된 바와 같고, R3은 스페이서를 통해 선택 결합된 지지 매트릭스를 나타내며, 구조식 H-Y-R2 화합물과 구조식(Ⅳ)의 화합물의 반응이 이어진다.
추가의 일반적인 제조방법에서, 구조식(Ⅴ)의 화합물은 구조식 H-Z-R1 및 H-Y-R2의 화합물과 연속적으로 반응하며,
Figure 112007016061858-PCT00005
여기서, X1 및 X2는 구조식(Ⅰ)과 관련하여 상기 기재된 바와 같고, R3은 스페이서를 통해 선택 결합된 지지 매트릭스를 나타낸다.
리간드 확인
리간드는 다음과 같이 확인될 수 있다. 유사체 라이브러리가 합성되고 프리온 분석 대상물의 결합력을 선별한다. 프리온 분석 대상물은 컬럼을 통과하고, 결합 분석 대상물은 프리온 단백질에 특이적인 표지 항체에 의한 것과 같이 종래의 방법을 사용하여 탐지된다. 분석 대상물이 결합하는 비드는 적합한 리간드가 존재하는 것으로 확인된다.
프리온을 제거하기 위한 리간드의 사용
프리온 또는 프리온의 단편에 결합하는 리간드는 다양한 분석, 제조 및 진단 용도에 유용하다. 프리온 결합 리간드는 비드 또는 멤브레인과 같은 지지체에 고정될 수 있고, 샘플에서 프리온을 결합하고 제거하는데 사용된다. 리간드가 결합하는 고체상은 프리온 리간드 복합물을 형성하기에 충분한 조건하에서 생물적 유동체와 같은 샘플에 접촉하게 하고, 샘플의 프리온 단백질은 리간드에 결합한다. 그 다음 고체상은 샘플로부터 분리되어, 샘플로부터, 고체상에 결합된 리간드에 결합한 프리온 단백질을 제거한다. 예를 들어, 오염원을 제거하기 위한 수지 및 멤브레인은 Baumbach 등의 미국특허 US 5,834,318호 및 PCT국제공개공보 WO 01/77687호에 기재된 바와 같이 기술분야에 공지되어 있다.
생물학적 샘플의 예는 혈액, 혈액 유래의 조성물 및 혈청을 포함하지만 여기에 제한되지 않는다. 추가적인 생물학적 샘플은 뇌척수액, 뇨, 침, 젖, 관액(ductal fluid), 눈물 또는 정액을 포함한다. 다른 샘플들은 콜라겐, 뇌 및 그란드 추출물을 포함할 수 있다.
분자를 다양한 고체 표면에 고정시키기 위한 많은 방법은 기술분야에서 공지되어 있다. 예를 들어, 고체 표면은 멤브레인(예를 들어, 니트로셀룰로오즈), 마이크로타이터 디쉬(microtiter dish)(예를 들어, PVC, 폴리프로필렌 또는 폴리스티렌), 테스트튜브(유리 또는 플라스틱), 계량봉(예를 들어, 유리, PVC, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 라텍스 등), 초원심분리 튜브, 또는 유리, 실리카, 플라스틱, 금속 또는 폴리머 비드일 수 있다. 바람직한 구성성분은 공유결합, 또는 비특이적 결합을 통한 비공유 결합일 수 있다.
천연 및 합성 모두의 매우 다양한 유기 및 무기 폴리머는 고체 표면용 물질로 사용될 수 있다. 실례가 되는 폴리머는 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리(4-메틸부텐), 폴리스티렌, 폴리메타크릴레이트, 폴리아크릴레이트, 폴리(에틸렌 테레프탈레이트), 레이온, 나일론, 폴리(비닐 부티레이트), 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF), 실리콘, 폴리포름알데하이드, 셀룰로오즈, 셀룰로오즈 아세테이트, 니트 로셀룰로오즈 등을 포함한다. 사용될 수 있는 다른 물질은 종이, 유리, 세라믹, 금속, 준금속, 반도체 물질, 시멘트 등을 포함한다. 또한 단백질(예를 들어 겔라틴), 지질다당체(lipopolysaccharide), 실리케이트, 아가로즈 및 폴리아크릴아미드과 같은 겔을 형성하는 물질이 사용될 수 있다. 덱스트란, 폴리알킬렌 글리콜 또는 인지질, 장쇄(12 내지 24개의 탄소원자) 알킬 암모늄염 등과 같은 계면활성제와 같은 몇몇의 수성상을 형성하는 폴리머 또한 적합하다. 고체 표면이 다공성인 경우, 많은 포어(pore) 크기는 계(system)의 특성에 따라 사용될 수 있다. 또한, 펩타이드는 고체 표면의 중합동안에 결합될 수 있다.
표면을 제조할 때에, 복수개의 다른 물질은 다양한 특성을 획득하기 위해서 예를 들어 적층체로 사용될 수 있다. 예를 들어, 겔라틴과 같은 단백질 코팅은 비특이적 결합을 방지하고, 공유결합을 단순화시키고, 신호탐지 등을 강화하는데 사용될 수 있다.
화합물과 표면 간의 공유결합이 바람직하다면, 상기 표면은 일반적으로 다기능적이거나, 다기능화될 수 있을 것이다. 상기 표면에 존재할 수 있거나 또는 결합에 사용될 수 있는 작용기는 카복실산기, 알데하이드기, 아미노기, 시아노기, 에티렌닉기, 하이드록실기, 멀캅토기 등을 포함할 수 있다. 다양한 표면에 매우 많은 화합물을 결합시키는 방식은 공지되어 있고, 본 문헌에서 상세히 설명된다.
또한 프리온 단백질은 친화력 크래마토그래피를 사용하여 샘플의 다른 단백질로부터 분리될 수 있다. 본 발명에 따른 리간드는 수지 또는 멤브레인과 같은 고체 지지체에 결합될 수 있고, 용액에서 프리온을 결합하고 제거하는데 사용될 수 있다. 이러한 예에서, 리간드는 고체 지지체, 예를 들어 멤브레인 또는 수지와 같은 비활성 지지체에 결합될 수 있고, 프리온 단백질은 고정제에 결합된다. 고정제/프리온은 항체에 의해 탐지될 수 있다. 바람직하다면, 초기 선별에서 획득된 한 개 이상의 서열은 폴리메타크릴레이트 또는 아가로즈와 같은 수지에 고정될 수 있다. 사용될 수 있는 다른 타입의 수지는 예를 들어 세파로오즈, 교차결합된 아가로즈, 교차결합된 다당류 복합물, 셀라이트, PVDF, 아크릴레이트, 폴리스티렌 및 셀룰로오즈를 포함한다. 예를 들어 나일론 및 셀룰로오즈와 같은 멤브레인도 사용될 수 있다. 상기 수지는 폴리메타크릴레이트 수지일 수 있다.
프리온을 탐지하기 위한 리간드의 사용
본 명세서에 기재된 리간드도 생물학적 샘플에서 프리온 단백질의 존재를 탐지하거나 측량하는 방법에 유용하다. 상기 기재된 생물학적 샘플에 한정되지는 않지만 그러한 샘플은 프리온 단백질과 리간드 간의 복합체 형성을 유발하기에 충분한 조건 하에서 리간드와 결합한다. 상기 복합체는 종래의 방법에 의해 탐지되어, 생물학적 샘플에서 프리온의 존재를 탐지한다.
상기 복합체는 상기 리간드를 표지하고, 상기 표지된 리간드와 상기 샘플을 결합하고, 표지된 리간드-프리온 복합체를 탐지하여 탐지된다. 상기 리간드는 펩타이드 합성동안과 같은 리간드 생성 동안 표지되거나, 또는 표지는 표지가 공유 또는 비공유적으로 결합하여 리간드에 결합된다. 대안적으로 항체와 같은 리간드에 특이적인 결합 분자가 표지되어 상기 복합체가 간접적으로 탐지된다. 매우 다양한 표지 및 접합기법은 공지되고 과학 및 특허 문헌에서 심도있게 보고된다. 적합한 표지는 방사성핵종(radionucleotide), 효소, 기질, 보조인자, 저해제, 형광 모이어티, 화학적발광 모이어티, 자기(magnetic) 입자 등을 포함한다.
탐지는 이뮤노블롯팅, 웨스턴분석, 겔이동변화분석(gel-mobility shift assays), 형광 자체 혼성분석(fluorescent in situ hybridization analysis)(FISH), 방사성 또는 생체발광 추적 마커, 핵자기 공명, 전자 상자성 공명, 흐름멈춤(stopped-flow) 스팩트로스코피, 컬럼 크래마토그래피, 모세관 전기영동, 또는 크기 및/또는 전하의 변화에 기초한 분자를 추적하는 다른 방법과 같은 임의의 공지된 방법으로 진행될 수 있다. 분석에 사용되는 특별한 표지 또는 탐지가능한 작용기는 본 발명의 중대한 양상이 아니다. 탐지가능한 작용기는 탐지가능한 물리 또는 화학적 특성을 갖는 임의의 물질일 수 있다. 이러한 탐지가능한 표지는 충분히 발달되어, 일반적으로 이러한 방법에 유용한 임의의 표지는 본 방법에 적용될 수 있다. 그러므로, 표지는 스팩트로스토피, 광화학, 생화학, 면역화학, 전기적, 광학적 또는 화학적 수단에 의해 탐지가능한 임의의 조성물이다. 본 발명에 유용한 표지는 형광염료(예를 들어, 플루오레세인 이소시아네이트, 텍사스 레드, 로드아민 등), 방사능표지(예를 들어, 3H, 125I, 35S, 14C 또는 32P), 효소{예를 들어, LacZ, CAT, 호스레디쉬 퍼옥시데이즈(Horse radish peroxidase), 알칼라인 포스포테이즈 및 EIA 또는 ELISA에서 탐지효소로 일반적으로 사용되는 다른 것 등} 및 콜로이드 골드, 착색 유리 또는 플라스틱(예를 들어, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 라텍스 등) 비드와 같은 색도계 표지(colorimetric label)를 포함한다. 표지는 기술 분야에서 잘 알려진 발명에 따라 분석에서 바람직한 구성성분과 직접 또는 간접적으로 결합될 수 있다. 상기에 기재한 바와 같이, 필요한 민감도에 화합물의 결합 용이성, 안정성 요건, 이용가능한 기계 및 처리규정에 따라 표지를 선택하여 매우 다양한 표지를 사용할 수 있다.
비방사능 표시는 종종 간접수단으로 결합된다. 일반적으로, 리간드 분자(예를 들어, 바이오틴)은 상기 분자에 공유결합한다. 그 다음 상기 리간드는 본질적으로 탐지가능하거나, 탐지효소, 형광화합물 또는 화학발광 화합물과 같은 신호시스템에 공유결합하는 안티 리간드(예를 들어, 스트렙타비딘) 분자에 결합한다. 많은 리간드와 안티 리간드가 사용될 수 있다. 리간드가 천연 안티 리간드, 예를 들어 바이오틴, 티록신 및 코티솔을 갖는 경우, 이것은 표지된 자연발생하는 안티리간드와 결합하여 사용될 수 있다. 대안적으로, 임의의 부착소(hapten) 또는 항원 화합물은 항체와 결합하여 사용될 수 있다.
또한 상기 분자는 예를 들어 효소 또는 플루오르포어(fluorophore)와의 결합에 의해 신호발생 화합물에 직접적으로 결합될 수 있다. 표지로서 관계하는 효소는 주요하게 하이드롤레이즈, 특히 포스페테이즈, 에스테레이즈 및 글리코시데이즈, 또는 옥시도리덕테이즈, 특히 퍼옥시데이즈일 수 있다. 형광화합물은 플루오레세인 및 이의 유도체, 로다민 및 이의 유도체, 덴실, 움벨리페론(umbelliferone) 등을 포함한다. 화학발광 화합물은 루시페린 및 2,3-디하이드로프탈아진디온, 예를 들어 루미놀을 포함한다.
표지 탐지수단은 기술분야의 당업자에게 잘 알려져 있다. 그러므로, 예를 들 어 표지가 방사능표지인 경우, 탐지수단은 섬광계측기 또는 자가방사기록법의 포토그래픽 필름을 포함한다. 상기 표지가 형광표지인 경우, 이것은 적당한 광파장을 갖는 형광색소를 여기시키고 예를 들어, 전하결합 디바이스(CCDs) 또는 광전자증배관(photomultiplier) 등과 같은 전자탐지기를 사용하여 포토그래픽 필름을 통해 마이크로스코피, 가시검사로 여기된 형광을 탐지하여 검출될 수 있다. 유사하게, 효소 표지는 효소에 적당한 기질을 제공하고 얻어진 반응생성물을 탐지하여 검출된다. 결국, 간단한 색도계 표지는 표지와 결합된 색을 관찰하여 간단히 검출될 수 있다. 그러므로, 다양한 계량봉 분석에서, 다양한 결합된 비드가 비드의 색을 나타내는 반면, 결합된 금은 종종 분홍색으로 나타낸다.
또한 본 발명의 리간드는 고체물질로부터 용액에 추출되는 타겟을 탐지하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 고체 샘플은 수성, 유기 용매 또는 초임계유체로 추출될 수 있고, 얻어진 상청액은 리간드와 접촉될 수 있다. 고체 샘플의 예는 동물 유래의 생성물, 특히 프리온 전염원에 노출되는 것들, 예를 들어 소의 원천으로 부터 유래된 골분(bone meal)을 포함한다. 일부 실시예에서 리간드는 토양에서 프리온 단백질의 존재를 탐지하는데 사용될 수 있다. 다른 고체 샘플은 뇌조직, 각막조직, 배설물, 골분, 소고기 부산물, 양, 양 부산물, 사슴 및 엘크, 사슴 및 엘크 부산물, 및 다른 동물 및 동물 유래의 생성물을 포함한다.
대안적으로, 프리온 리간드 복합체는 PK로 처리될 수 있다. PrPsc는 PrPres를 형성하기 위해 부분 소화되는 반면, PrPc는 PK에 매우 민감하다. PrPres 분자 자체는 단백질 분해에 매우 저항적이다. 그러므로, PK 처리는 PrPc를 소화시킬 것 이고, PK 민감성 PrPsc는 PrPres로 변환할 것이다. PK를 제거한 다음, PrPres는 변성되어 3F4와 같은 항체에 의해 탐지될 수 있다.
다른 실시예에서, 본 발명에 따른 리간드는 PrPc를 초과하는 PrPsc의 선택농도에 사용될 수 있다.
프리온을 측량하기 위한 리간드의 사용
리간드 프리온 복합체, 또는 대안적으로 리간드 또는 리간드 프리온 복합체의 항체는 기술분야의 당업자에게 공지된 임의의 많은 수단에 의해 탐지되어 측량될 수 있다. 이러한 것은 스펙트로포토메트리, 방사능기록법, 전기영동, 모세관 전기영동, 고성능 액체 크로마토그래피법(HPLC), 박막 크로마토그래피법(TLC), 고분산 크래마토그래피법 등과 같은 분석 생화학법, 및 유동체 또는 겔 침전 반응, 면역확산(단일 또는 이중), 면역전기영동, 방사선면역측정법(RIAs), 효소면역분석(ELISAs), 면역형광 분석 등과 같은 다양한 면역학적 방법을 포함한다.
비특이적 결합의 감소
어떤 기술은 때때로 분석 시 및 샘플로부터 분석물의 제거동안 비특이적 결합을 감소시키는 것이 종종 바람직한 것으로 평가된다. 상기 분석이 리간드 또는 고체 기질 상에 고정된 리간드나 다른 포획제에 관련하는 경우, 고체 기질에 비특이적으로 결합하는 양을 최소화시키는 것이 바람직하다. 이러한 비특이적 결합의 감소수단은 기술분야의 당업자에게 공지되어 있다. 전형적으로, 이것은 기질을 단백질성의 조성물로 코팅하는데 관련한다. 특히, 소 및 인간 혈청 알부민(BSA)과 같은 단백질 조성물, 비지방 분말우유 및 겔라틴이 광범위하게 이용된다.
다른 분석 포맷
또한 웨스턴 블롯분석은 샘플에서 프리온 단백질의 존재를 탐지하고 측량하는데 사용될 수 있다. 일반적으로 상기 기법은 SDS 존재시 분자량을 기초로 겔 전기영동에 의해 샘플 생성물을 분리하고, 상기 분리된 단백질을 적합한 고체지지체(예를 들어, 니트로셀룰로오즈 필터, 나일론 필터 또는 유도 나일론 필터)로 이동시키고, 본 명세서에 기재된 리간드와 결합된 샘플을 배양하는 것과 관련한다. 상기 리간드는 특이적으로 상기 고체 지지체 상에 고정된 프리온 펩타이드와 결합한다. 이러한 리간드는 직접적으로 표지되거나 또는 대안적으로, 이들은 특이적으로 리간드에 결합하는 표지된 항체를 이용하여 연속적으로 탐지될 수 있다.
다른 분석 포맷은 리포솜 면역분석(LIAs)를 포함하고, 특이적 분자(예를 들어 리간드)에 결합하도록 설계된 리포솜을 사용하고, 켑슐화된 시약 또는 마커를 방출한다. 또한 상기 방출된 화학물질은 표준 기법에 따라 탐지된다.
약학 조성물
지지체에 결합하지 않는 본 명세서에 기재된 리간드는 포유동물이 프리온 유기체에 감염된 것에 의해 발생한 TSEs 처리용 치료 및 예방 용도에 유용하다. 상기 리간드는 PrPsc와 PrPsc의 결합 방지를 통해 PrPsc 중합을 억제한다. 또한, PrPsc와 Pc의 결합을 억제를 방해할 수 있어서, PrPc가 PrPsc로 PrPsc 매개 변환하는 것을 감소시켜 임상적 증상의 개시를 지연시킨다. 더구나, 리간드 자체는 PrPsc 축적 부위의 분자를 목적으로 하여 반응제를 첨가하여 변형될 수 있다. 이러한 조성물은 다양한 약물전달체계에 이용하는데 적합하다.
상기 방법에 따라 치료될 수 있는 질병은 BSE, 전염성밍크뇌증, 고양이 해면상뇌증, CWD, CJD, GSS, 치사성 불면증, 및 vCJD를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
약학 조성물은 비경구, 국소(topical), 경구 또는 국소(local) 투여로 의도된다. 바람직하게 약학조성물은 비경구, 예를 들어 정맥, 피하, 진피내, 코안, 또는 근육내에 투여된다. 그러므로, 본 발명은 허용가능한 담체, 바람직하게는 수성 담체에 용해되거나 또는 부유된 상기 기재된 제제 용액을 포함하는 비경구투여용 조성물을 제공한다. 다양한 수성 담체는 예를 들어, 물, 완충수, 0.4% 실란, 0.3% 글리신, 히알루론산, 피브린 봉합제 등이 사용될 수 있다. 이러한 조성물은 기존에 공지된 멸균기법으로 멸균될 수 있거나, 또는 멸균여과될 수 있다. 얻어진 수성용액은 있는 그대로 또는 냉동건조(lyophilized)된 것으로 사용하기 위해 포장되며, 상기 냉동건조 제조는 투여에 앞서 멸균용액과 혼합된다. 상기 조성물은 pH 조절 및 완충제, 강직성 조절제, 습윤제 등, 예를 들어 소디움 아세테이트, 소디움 락테이트, 소디움 클로라이드, 포타슘 클로라이드, 칼슘 클로라이드, 소비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올레이트 등과 같은 적당한 생리적 조건에 요구되는 것으로서 약학적으로 허용가능한 보조물질을 포함할 수 있다.
고체 조성물은, 종래의 비독성 고체 담체를 사용할 수 있으며, 예를 들어 약용 만니톨, 락토즈, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 소디움 사카린, 탤컴, 셀룰로오즈, 글루코오즈, 슈크로오즈, 마그네슘 카보네이트 등이 있다. 경구 투여에 대해, 약학적으로 허용가능한 비독성 조성물은 상기 기재된 담체와 같은 임의의 정상 사 용된 부형제, 및 일반적으로 활성성분 1~95% 및 보다 바람직하게 25%~75%의 농도로 결합하여 형성된다.
분무 투여에 대해, 활성제는 바람직하게 계면활성제 및 분사제와 함께 정교하게 분리된 형태로 공급된다. 물론, 계면활성제는 비독성, 바람직하게는 분사제에용해성임에 틀림없다. 이러한 제제의 대표적인 것은 알리파틱 다가알콜(aliphatic polyhydric alcohol) 및 이것의 씨클릭 무수화물을 갖는 카프로산, 옥테인산, 라우르산, 팔미트산, 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 올레스테르산 및 올레산과 같은 6 내지 22개의 탄소원자를 포함하는 지방산의 에스테르 또는 부분 에스테르이다. 혼합 또는 천연 글리세라이드와 같은 혼합된 에스테르가 사용될 수 있다. 또한 담체는 바람직하게 예를 들어, 코안전달(intranasal delivery)용 레시틴을 갖는 것을 포함할 수 있다.
투여량은 투여되는 것, 치료받는 포유동울의 상태 및 투여방식에 따라 다양하다. 치료용도에서, 조성물은 프리온의 확산을 억제하거나 또는 질병 또는 질병의 합병증의 증상을 적어도 부분적으로 억제하는데 충분한 양으로 프리온 감염으로 고통받고 있는 포유동물에 투여된다. 이것을 성취하는데 충분한 양은 "치료적으로 유효선량"으로 정의된다. 이 용도로 유효량은 병의 심각도, 특수한 조성물, 및 수용체의 중량 및 일반 상태에 달려 있을 것이다. 일반적으로, 상기 양은 1일 약 1 ㎎ 내지 약 5 ㎎의 범위, 바람직하게는 70 ㎏ 환자에게 1일 약 100 ㎎의 범위일 것이다.
실시예 1
프리온 결합 리간드의 확인
이하의 표에 기재된 프리온 결합 리간드는 이하와 같이 확인되었다.
유사체 라이브러리 합성
에폭사이드 활성화된 퓨라비드(Purabead) 6XL 상에 유사체 리간드의 두개 8×8 결합 라이브러리가 합성되었다(라이브러리 A 및 라이브러리 B). 퓨라비드 6XL은 내구성을 돕기 위해 교차결합된 다공성 구슬모양의 아가로즈 지지체이다. 합성방법은 PCT 국제공개공보 WO 97/10887호에 기재된 것과 유사하며, 기술분야의 당업자에 의해 용이하게 반복될 수 있다. 요약하면, 합성을 완료한 후에, 각각의 라이브러리 구성요소는 플랙시블 아민화 스페이서에 의해 퓨라비드 6XL에 결합된 트리아진 모이어티를 포함한다. 각각의 라이브러리 구성요소 중 트리아진 구성분은 두개의 다른 아민으로 더 치환되었다.
라이브러리 A
이러한 라이브러리용 플랙시블 아민화 스페이서는 길이로 3개의 탄소원자이고, 에피클로하이드린 및 암모니아와 교차결합된 퓨라비드 6XL의 연속반응에 의해 삽입되었다. 표 1은 각각의 라이브러리 구성요소인 트리아진에 결합된 추가의 두개 아민을 요약하며, 이러한 아민은 구조식(Ⅰ)의 작용기 Z-R1 및 -Y-R2에 해당한다. 상기 아민은 다음의 숫자, 즉 두개의 2-아다만타민기를 포함하는 1/1, 및 한개의 4-(2-아미노에틸)-모르폴린기와 한개의 2-아다만타민기 등을 포함하는 2/1로서 확인되는 리간드로 정의된다.
1 = 2-아다만타민
2 = 4-(2-아미노에틸)-모르폴린
3 = 1-(2-아미노에틸)-피페리딘
4 = 1-(2-아미노에틸)-피페라진
5 = (+/-)-2-아미노노보네인
6 = 1-(2-아미노프로필)-2-피롤리디논
7 = 3-아미노퀴뉴클리딘(3-aminoquinuclidine)
8 = 1-(2-하이드록시에틸)-피페라진
9 = N,N-디메틸 에틸렌디아민
1/1 2/1 3/1 5/1 6/1 7/1 8/1 9/1
1/2 2/2 3/2 5/2 6/2 7/2 8/2 9/2
1/3 2/3 3/3 5/3 6/3 7/3 8/3 9/3
1/4 2/4 3/4 5/4 6/4 7/4 8/4 9/4
1/5 2/5 3/5 5/5 6/5 7/5 8/5 9/5
1/7 2/7 3/7 5/7 6/7 7/7 8/7 9/7
1/8 2/8 3/8 5/8 6/8 7/8 8/8 9/8
1/9 2/9 3/9 5/9 6/9 7/9 8/9 9/9
아민화 스페이서를 첨가한 후에 자유 아민기를 분석, 및 상기 아민화 스페이서에 트리클로로트리아진를 첨가한 후에 클로라이드 방출의 분석에 의해 측정된 바와 같이 수지에 리간드 로딩은 침전된 수지의 12 m㏖/g이었다.
라이브러리 B
이러한 라이브러리용 플랙시블 아민화 스페이서는 길이로 10개의 탄소원자이고, 1,4-부탄디올디글리시딜 에테르 및 암모니아로 교차결합된 퓨라비드 6XL의 연속반응에 의해 삽입되었다. 표 2는 각각의 라이브러리 구성요소 중 트라아진에 결합된 추가의 두개 아민기를 요약하며, 상기 아민은 다음의 숫자로 정의된다.
10 = β-알라닌
11 = 2-아미노에틸-피리딘
12 = 3-아미노벤질 알코올
13 = 펜에틸아민
14 = 티라민
15 = 4-플루오르벤질아민
16 = 4-메틸벤질아민
17 = 2-(4-클로로페닐)-에틸아민
18 = 트립타민
19 = 글리신
20 = L-글루탐산
21 = DL-발린
22 = 5-발레르산
23 = 4-아미노부티르산
24 = L-티로신
25 = ε-아미노카프로산
10/11 19/11 20/11 21/11 22/11 23/11 24/11 25/11
10/12 19/12 20/12 21/12 22/12 23/12 24/12 25/12
10/13 19/13 20/13 21/13 22/13 23/13 24/13 25/13
10/14 19/14 20/14 21/14 22/14 23/14 24/14 25/14
10/15 19/15 20/15 21/15 22/15 23/15 24/15 25/15
10/16 19/16 20/16 21/16 22/16 23/16 24/16 25/16
10/17 19/17 20/17 21/17 22/17 23/17 24/17 25/17
10/18 19/18 20/18 21/18 22/18 23/18 24/18 25/18
아민화 스페이서를 첨가한 후에 자유 아민기를 분석, 및 상기 아민화 스페이서에 트리클로로트리아진을 첨가한 후에 클로라이드 방출의 분석에 의해 측정된 바와 같이 수지에 리간드 로딩은 침전된 수지의 19 m㏖/g이었다.
유사체 라이브러리 결합 선별
상기 라이브러리는 몇회 전화되어 침전되게 하고 중력에 의해 배출되어, 그 다음 각 웰(well) 당 물 1 ㎖로 2회 세척하고 pH 7.4인 10 mM PBS 1 ㎖로 1회 세척하는 것이 이어진다. 상기 웰이 중단되고 PBS 0.5 ㎖가 각 웰에 첨가되었다. 상기 라이브러리는 냉동 하에서 하룻밤 방치하였다. 10% 햄스터 뇌 균질현탁액(HaBH)의 1.8 ㎖를 포함하는 두개의 튜브를 액체질소에서 저장한 것에서 이동시켜 해동하였다. 5% 사코실(sarkosyl)의 180 ㎕을 각각의 튜브에 첨가하였다. 상기 현탁액을 실온에서 30분간 텀블링(tumbling)하에서 배양하고, 벤치탑(benchtop) 초원심분리기에서 13,400 rpm으로 10분간 원심분리가 이어진다. 상청액을 수집하고, PBS로 1:10으로 희석하였다(HaBH의 최종희석: 1:100). 라이브러리는 중력에 의해 배출되고 HaBH 용액 500 ㎕를 각 웰에 첨가하고, 중력에 의해 수집 플레이트에 배출되었다. 한번 웰이 배출되면, 각 웰을 추가적인 PBS 500 ㎕로 세척하고 동일한 수집 플레이트에 수집하였다. 이 수집 플레이트는 "비결합"으로 표지되었다. PBS의 1M NaCl 500 ㎕을 각 웰에 첨가하고, "염 세척분리(Salt Elution)"으로 표지된 다른 수집 플레이트에 수집하고, 2% 아세트산 용액 500 ㎕을 첨가하고 또한 "아세트산 세척분리"로 표지된 수집 플레이트에 수집하였다. 각 수지의 26 ㎕ 분취액(aliquot)을 초원심분리 튜브로 옮기고, 잔존하는 결합 프리온의 분석을 위해 저장하였다. 비결합, 염 세척분리 및 아세트산 세척분리 용액은 수집 플레이트에서 냉동되었다.
1:200 및 1:500의 최종농도로 HaBH 용액의 희석은 SDS-PAGE 및 웨스턴블롯용 대조구로 사용되었다.
비결합 분획의 웨스턴블롯 및 SDS PAGE 분석
각각의 '비결합 샘플' 50 ㎕을 2 × 샘플 버퍼/환원제{인비트로젠 NuPAGE LDS 샘플 버퍼 4 ×(25 ㎕), 인비트로젠 NuPAGE 샘플 환원제(10 ㎕) 및 ACS 초순수(grade water)(15 ㎕)} 50 ㎕에 첨가하였다. 각각의 튜브는 10 분간 90 ℃에서 가열하였다.
복제 겔(duplicate gel)들은 총 단백질의 웨스턴 블롯 및 SDS PAGE 분석을 하도록 흐르게 하였다. 각각의 17개 웰겔의 샘플 포맷은 이하와 같다.
웰 분석대상물 부피(㎕)
1 인비트로젠 SeeBlue Plus2 분자량마커(Cat#LC5925) 5
2 햄스터 뇌 균질현탁액(1:200) 10
3 햄스터 뇌 균질현탁액(1:500) 10
4-17 14 다른 '비결합'샘플 10
17-웰 NuPAGE 겔 카세트를 탈이온수로 헹구었다. 흰색 테이프 조각과 벌집모양(comb)를 제거하고, 레인을 1 × NuPAGE MES 러닝 버퍼(Cat # NP0002)로 헹구고, 상기 카세트를 X셀 미니겔 모듈(Mini-Gel Module)(또는 호환가능함)의 겔 저장기에 위치시켰다.중앙 저장기를 500 ㎕ NuPAGE 항산화제(Cat # NP0005)를 포함하는 1 ×NuPAGE MES 러닝버퍼 200㎖로 충진하였다. 누출을 체크한 다음, 외부 저장소를 1 ×NuPAGE MES 러닝 버퍼(항산화제 첨가하지 않음)로 충진하였다. 미니겔 모듈을 호환가능한 전력공급원에 접속하고, 겔은 염료 표면이 겔 바닥의 0.5 ㎝ 이내에 있을 때까지 일정한 200 V에서 약 45분간 흐르게 한다.
SDS 페이지
겔을 겔 카세트로부터 제거하고, ACS 워터(25 ㎖, 5분)로 3회 헹구었다. 겔을 한 시간 이상 인비트로젠 심플리블루쉐이프스테인(Invitrogen SimplyBlueSafestain)으로 염색한 다음 ACS 워터(25 ㎖, 한시간)로 3회 세척하여 탈색하였다.
웨스턴블롯
17-웰 NuPAGE 겔 카세트(cat.#NP0349)를 탈이온수로 헹구고, 레인을 1 ×NuPAGE 러닝 버퍼로 헹구었다. 상기 겔을 X셀 미니겔 모듈(인비트로젠 cat #EI0001) 또는 호환가능한 장치에 위치시켰다. 하부 챔버를 스톡솔루션(stock solution)으로 부터 1 × 러닝버퍼(인비트로젠 20 ×NuPAGE MES 러닝버퍼)로 충진하였다. 상부 챔버는 항산화제를 포함하는 1× 러닝버퍼(인비트로젠 cat #NP0005)로 충진하였다.
각각의 샘플에 환원제를 포함하는 샘플버퍼(인비트로젠 cat #NP0007 및 cat#NP0004)를 첨가하고 상기 샘플을 10분간 90 ℃에서 가열하고, 간단히 원심분리하고 각 샘플의 5 ㎕을 로드하였다. 또한 5 ㎕ 분자량 마커(인비트로젠 cat # LC5925)를 로드하였다. 상기 겔은 일정한 200 V에서 45분간 전기영동하였다. 완전히 흐른 다음, 상기 카세트를 상기 유닛에서 빼내어, 열고, 겔을 제거하였다. 상기 겔을 냉각 전달 버퍼(chilled transfer buffer)에 5분간 침지하였다.
전달 멤브레인을 메탄올에 적시고, 전달 버퍼로 이동시키고, 진동 하에서 2 ×10분간 배양하였다. 스톡솔루션에서 전극 전달버퍼(인비트로젠 cat #NP0006-1)는 20% 메탄올과 항산화제를 첨가하여 제조하였고, 사용 전에 냉각하였다. 전달 챔버 저장기(BioRad cat #170-4070)의 반을 냉각된 일렉트로블롯 전달버퍼로 충진하였다. 플라스틱 BioRad 전달 카세트 트레이 중 BioRad 전달유닛 카세트는 충분한 양의 냉각된 일렉트로블롯 전달버퍼로 준비하였다. 전달 샌드위치는 서열 스폰지, 여과지, PVDF 전달 멤브레인(인비트로젠 cat.#LC2005), 겔, 여과지, 및 스폰지를 겹쳐서 제조하였다. 상기 카세트를 접어서 용접부분을 고정시켰다. 겔은 일정한 100V에서 45분간 실온의 챔버로 이동하였다.
이동한 다음, 상기 멤브레인을 깨끗한 디쉬에 놓고 실온에서 1시간 동안 진동 평판에서 인비트로젠 브리즈 화학발광 킷트(Invitrogen Breeze Chemiluminescence Kit)인 안티-마우스(cat.#WB7104)로부터 웨스턴 브리즈(Western Breeze) 차단제 25 ㎖로 배양하였다.
그 다음 상기 멤브레인은 20 ㎖ 의 신선한 웨스턴 브리즈 1차항체 희석액(Western Breeze Primary Antibody Diluent)에 Signet 3F4 1차 항체 마우스 모노클로날 항체(SIGNET, cat #9620) 스톡 솔루션의 1:10000 희석으로 진동 평판에서 냉동 조건으로 하룻밤 배양하였다. 상기 블롯은 20 ㎖의 웨스턴 브리즈 항체 세척액(Western Breeze Antibody Wash)으로 3회 헹구고, 그 다음 상기 멤브레인을 20 ㎖의 웨스턴 브리즈 1차항체 희석액(Western Breeze Primary Antibody Diluent)에서 KPL-AP 이차항체(KPL, cat.#075-1802)의 1:10,000 희석으로 진동 평판상에서 실온에서 60분간 배양하였다. 상기 블롯은 상기와 같이 헹구고, 실온에서 10분간 pH 9.8로 20mM 트리스-HCl 및 1mM MgCl2 20 ㎖로 세척하였다. 상기 멤브레인을 건조된 깨끗한 디쉬로 옮기고 보통의 진동하에서 5분간 5 ㎖ 웨스턴 브리즈 미리 혼합된 화학발광 기질(CDP Star)에 적셨다. 알칼라인 포스페테이즈과 30분 이상 반응하게 한다. 상기 블롯은 쉬트 보호기에서 필름 카세트로 이동하였고 실온에서 5분간 필름(Amersham cat. #RPN-3130K)에 노출시키고, 현상액에서 전개되었다.
실시예 2
적혈구 세포 농축물에서 PrPc 포획을 위한 아가로즈에 결합하는 리간드 5/4의 사용
퓨라비드 6XL 기초 매트릭스에 결합하는 리간드 5/4를 포함하는 흡수제는 실시예 1에 기재된 바와 같이 합성되어 이하의 구조식(Ⅵ)화합물을 제공한다.
Figure 112007016061858-PCT00006
PBS 버퍼(100 ㎕)의 10% w/v 정상 햄스터 뇌 균질물 샘플을 해동하고, 10%(w/v) 사코실(sarcosyl) 10 ㎕을 첨가하고, 소용돌이 혼합하고, 30분간 웨트 아이스(wet ice)에 저장하였다. 상기 혼합물은 +4 ℃에서 5분간 14,000 rpm으로 원심분리하고 상청액을 제거하였다. 인간의 적혈구 농축물(RBCC; 250 ㎖)을 아드솔(adsol)(110 ㎖)과 혼합하고 반전에 의해서 보통으로 혼합하였다. 희석된 PBCC(1.8 ㎖)를 제거하고 0.2 ㎖ 햄스터 뇌 균질액과 혼합하였다.
pH 7.0의 40 mM 시트레이트 버퍼/280mM NaCl에 부유된 화합물(Ⅵ)의 1:1 현탁액(400 ㎕)을 1.0 ㎖ 마이크로 컬럼에 첨가하여 중력 하에서 배출되게 하였다. RBCC에서 햄스터 뇌 균질물(1 ㎖)을 고정된 친화력 흡수제에 피펫 첨가하여 배출되게 하였다. 상기 흡수제를 1 ㎖ 현탁액 버퍼로 연속적으로 세척하여 배출되게 하였다. 분획을 통한 양쪽의 흐름을 수집, 결합 및 - 20 ℃에서 저장하였다.
상기 친화력 흡수제를 0.5 ㎖ 현탁액 버퍼에서 부유하여 컬럼에서 빼내어, 냉동용기(cryovial)에 옮겼다. 바이알 용량을 고정되게 하고 1:1 슬러리를 제공하도록 상청액의 함량을 조절한 다음, 이동된 친화력 흡수제의 함량을 기록하였다. 샘플(200 ㎕)을 실시예 1에 기재된 바와 같이 결합된 프리온의 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석에 사용하기 위해 미세원침 바이알(microfuge vial)에 옮겼다.
퓨라비드 6XL(구슬모양의 아가로즈 매트릭스)에 결합한 햄스터 PrPc를 표시하는 리간드 5/4에 해당하는 웨스턴 브롯에 의한 강한 밴드의 존재는 인간의 적혈구 농축물로 부터 선택적으로 PrPc에 결합할 수 있었다.
실시예 3
폴리메타크릴레이트 수지 비드에 결합하는 프리온 결합 리간드의 제조
이 실시예는 라이브러리 A 및 B에, 그러나 아가로즈라기 보다는 오히려 아민화된 폴리메타크릴레이트 지지체(Toyopearl, 650M) 상에서 사용된 아민을 포함하는 많은 리간드의 제조를 설명한다.
3.1 아민화된 토요펄 ( Toyopearl ) 650M의 디클로로트리아진 유도체
토요펄 AF-아미노-650M(36 g)을 RO 워터의 10부분(36 ㎖)으로 소결깔대기(sinter funnel)상에서 세척한 다음, 겔을 배출하고, pH 7.0의 1M 포타슘 포스페이트(36 ㎖)에서 재부유되었다. 겔을 배출되게 한 다음 pH 7.0의 1M 포타슘 포스페이트(27 ㎖)와 RO 워터(27 ㎖)에서 재부유하였다. 이러한 혼합물을 교반유리반응 용기에 옮기고 아세톤 54 ㎖을 첨가하였다. 상기 혼합물을 0 ℃에서 냉각하고, 이 혼합물에 냉각된(0 ℃) 아세톤(27 ㎖)에 용해된 시아누르 염화물(cyanuric chloride)(2.7 g)를 첨가하고 상기 혼합물을 0~4 ℃에서 1시간 교반하였다. 획득된 디클로로트리아진 활성화 슬러리 생성물을 유리 소결물에 붓고, 수성 아세톤(50% v/v, 180 ㎖), RO 워터(180 ㎖), 수성 아세톤(50% v/v, 180 ㎖), 및 RO 워터(360 ㎖)로 세척하였다.
3.2 모노클로로트리아진 중간생성물
많은 모노클로로트리아진 중간생성물은 이하와 같은 디클로로트리아진 활성화된 토요펄 650M으로 제조되었다.
3.2.1 1-(2-아미노에틸)피페리딘(아민 3)의 모노클로로트리아진 아민화된 토요펄 650M 부가생성물은 RO 워터(28.8 ㎖)에서 1-(2-아미노에틸)피페리딘(0.47 g)을 용해시키고 용액을 4 ℃로 냉각시켜서 제조된다. 이 혼합물을 유리 소결물에 있는 물에 배출된 7 g의 디클로로트리아진 활성화 아민화된 토요펄에 첨가하고, 플라스틱반응용기로 옮겨서 4 ℃로 냉각하였다. 상기 혼합물을 2시간 동안 4 ℃에서 진동시킨 다음, 상기 혼합물을 유리 소결물에 붓고, 수성 DMF(50% v/v, 35 ㎖)와 RO 워터(70 ㎖)로 세척하고, 그 다음 소결물에 배출되게 하였다.
3.2.2 (+/-)2-아미노노보란(아민 5)의 모노클로로트리아진 아민화된 토요펄 650M 부가생성물은 수성 DMF (13.3% v/v, 57.68 ㎖)에서 (+/-)2-아미노노보란(0.82 g)을 용해시키고, 상기 용액을 4 ℃로 냉각시켜서 제조하였다. 상기 혼합물을 유리소결물에 있는 물에 배출된 14 g의 디클로로트리아진 활성화 아민화된 토요펄에 첨가하고, 플라스틱 반응용기로 옮겨서 4 ℃로 냉각하였다. 상기 혼합물을 4 ℃에서 2시간 동안 진동시키고, 상기 혼합물을 유리 소결물에 부어서 수성 DMF(50% v/v, 70 ㎖), RO 워터(140 ㎖)로 세척하고, 소결물에 배출되게 하였다.
3.2.3 L-글루탐산의 모노클로로트리아진 아민화 토요펄 650M 부가생성물(아민 20)은 수성 DMF(50% v/v, 28.0 ㎖) 및 수성 소디움 하이드록사이드(10M, 0.7 ㎖)에 L-글루탐산(0.515 g)을 용해시키고, 상기 용액을 4 ℃에서 냉각시켜서 제조하였다. 상기 혼합물을 유리소결물의 물에 배출된 디클로로트라이진 활성 아민화된 토요펄(7 g)을 첨가하고, 플라스틱 반응용기에 옮겨서 4 ℃에서 냉각하였다. 상기 혼합물을 4 ℃에서 70분간 진동하고, 수성 DMF(50% v/v, 70 ㎖) 및 RO 워터(140 ㎖)로 세척하고, 상기 소결물에 배출되게 하였다.
3.2.4 5-아미노발레르산의 모노클로로트리아진 아민화 토요펄 650M 부가생성물(아민 22)은 수성 DMF(50% v/v, 28.5 ㎖) 및 수성 소디움 하이드록사이드(10M, 0.35 ㎖)에서 5-아미노발레익산(0.41 g)을 용해시키고, 상기 용액을 4 ℃로 냉각시켜서 제조하였다. 상기 혼합물을 유리 소결물의 물에 배출된 디클로로트리아진 활성 아민화 토요펄 7 g에 첨가하고, 플라스틱 반응용기에 옮기고 4 ℃로 냉각하였다. 상기 혼합물을 4 ℃에서 60분간 진동시킨 다음, 상기 혼합물을 유리 소결물에 부어서 수성 DMF(50% v/v, 70 ㎖) 및 RO 워터(140 ㎖)로 세척하고, 상기 소결물에 배출되게 하였다.
3.2.5 글리신의 모노클로로트리아진 아민화 토요펄 650M 부가생성물(아민 19)은 글리신(0.563 g)을 수성 DMF(50% v/v, 61.4 ㎖)과 수성 소디움 하이드록사이드(10M, 0.75 ㎖)에 용해시켜 상기 용액을 4 ℃에서 냉각시켜 제조하였다. 상기 혼합물을 유리 소결물의 물에 배출된 디클로로트리아진 활성 아민화 토요펄 15 g에 첨가하고, 플라스틱 반응용기에 옮겨서 4 ℃에서 냉각시켰다. 상기 혼합물을 4 ℃에서 60분간 진동시킨 다음, 상기 혼합물을 유리소결물에 부어서 수성 DMF(50% v/v, 75 ㎖) 및 RO 워터(150 ㎖)로 세척하고, 상기 소결물에 배출되게 하였다.
3.3 최종 생성물
제2단계 반응을 위한 아민 용액은 다음과 같이 제조하였다.
3.3.1 1-(2-아미노에틸)피페리딘(아민 3; 0.94g)을 RO 워터(10.8 ㎖)에 용해시켰다.
3.3.2 1-(2-아미노에틸)피페라진(아민 4; 1.90 g)을 RO 워터(21.6 ㎖)에 용해시켜서 두개의 부분(각각 11.8 ㎖)로 나누었다.
3.3.3 2-(2-아미노에틸)피리딘(아민 11; 0.84 ㎖)을 수성 DMF(50% v/v, 10.9 ㎖)에서 용해시켰다.
3.3.4 페닐에틸아민(아민 13; 0.88 ㎖)을 수성 DMF(50 % v/v, 10.9 ㎖)에 용해시키고, 두개의 동일한 부분으로 만들었다.
3.3.5 티라민(아민 4;0.96 g)을 DMF(10.8 ㎖)에 용해시켰다.
반응혼합물은 적당한 모노클로로트리아진 중간생성물과 제2단계 아민의 결합으로 조합되고, 모노클로로트리아진 중간생성물(7 g)과 총용매 부피에 대해 35 ㎖ 아민용액을 포함하는 플스틱 반응용기에서 구성되고, 모노클로로트리아진 중간생성물 7 g 내에서 5.75 ㎖ RO 워터를 포함한다. 각각의 용기는 24 시간 동안 60 ℃에서 진동하였다. 그 다음 겔을 수성 DMF(50% v/v, 35 ㎖), RO 워터(35 ㎖), 0.1 M 염산(35 ㎖), 소디움 하이드록사이드(0.2M)을 포함하는 수성 이소판올(30% v/v)(35 ㎖), RO 워터(70 ㎖) 및 수성 에탄올(20% v/v, 21 ㎖)로 세척하고, 4 ℃에서 수성 에탄올(20% v/v)에서 저장하였다.
실시예 4
적혈구 농축물에서 PrPsc 포획에 대한 폴리메타크릴레이트 수지에 결합된 프 리온 결합 리간드의 사용
구슬모양의 폴리메타크릴레이트 매트릭스(토요펄)에 결합된 친화력 리간드를 포함하는 화합물을 실시예 3에 기재한 바와 같이 합성하였다. 인간 적혈구 농축물(RBCC)에 첨가된 스크래피 감염된 햄스터 뇌 추출물(1% w/v)을 정상 햄스터 뇌 균질물(실시예 2)에 기재된 절차을 사용하여 제조하였다. 폴리메타크릴레이트 친화력 흡수제에 의한 PrPsc 결합은 1 ㎖ 마이크로컬럼의 흡수제 슬러리를 팩킹하고 실시예 2에 기재된 절차을 사용하여 첨가된 RBCC를 투여하여 평가하였다. 친화력 흡수제에서 추출된 샘플의 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯은 제2세트의 샘플 분취액을 SDS-PAGE 환원버퍼와 혼합하기 전에 프로틴에이즈 K로 처리하는 것을 제외하고 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행되었다.
웨스턴블롯 분석은 리간드 5/4, 19/13, 5/3, 22/13 및 19/14를 포함하는 폴리메타크릴레이트 수지 모두는 인간 적혈구 농축물의 존재하에서 PrPsc에 대한 높은 친화력을 증명하는 것을 나타내었다. PrPsc 결합을 +/- 프로틴에이즈 K 처리로 획득된 웨스턴 블롯 밴딩 패턴을 비교하여 확인하였다. 비처리된 샘플과 비교되는 프로테이나제(proteinase) K 처리된 샘플의 약간 작은 분자량에 대한 선명한 밴드의 존재는 프로테이나제 K 저항성 형태(감염성 형태)의 PrP 결합을 확인하였다.
실시예 5
적혈구 농축물에서 인간 산발성 CJD 원인 프리온 포획을 위한 폴리메타크릴 레이트 수지에 결합된 프리온 결합 리간드의 사용
실시예 4에 기재된 실험은 1%(w/v) 인간 산발성 CJD 뇌 균질물을 첨가한 PBCC를 사용하여 반복되었다. 웨스턴 블롯 분석으로 리간드 5/4, 19/13, 5/3, 22/13 및 3/4를 포함하는 폴리메타아크리레이트 수지 모두 인간 적혈구 농축물의 존재에서 인간 산발성 CJD 뇌에서 PrP 에 대한 높은 친화력을 증명하였다.
실시예 6
인간 혈장과 인간 혈액에서 PrPsc 의 포획에 대한 폴리메타크릴레이트 수지 비드에 결합된 리간드 5/4의 사용
구슬모양의 폴리메타크릴레이트 매트릭스(토요펄)에 결합된 리간드 5/4를 포함하는 친화력 흡수제는 실시예 3에 기재된 바와 같이 합성하였다. 수집한 인간 혈장 및 전체 인간 혈액에 첨가한 스크래피 감염된 햄스터 뇌 추출물(1% w/v)을 정상 햄스터 뇌균질물 및 RBCC(실시예 2)에 기재된 절차를 사용하여 제조하였다. 폴리메타크릴레이트 친화력 흡수제에 의한 PrPsc 결합은 1 ㎖ 마이크로컬럼의 흡수제 슬러리를 팩킹하고 실시예 2에 기재된 절차를 사용하여 첨가된 혈장과 전체 혈액을 투여하여 평가하였다. 친화력 흡수제에서 추출된 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 샘플은 SDS-PAGE 환원버퍼와 혼합하기 전에 제2 세트의 샘플 분취액을 프로틴에이즈 K로 처리하는 것을 제외하고 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행되었다.
웨스턴블롯 분석은 리간드 5/4를 포함하는 폴리메타크릴레이트 수지는 인간 혈장 및 전체 인간 혈액의 존재 하에서 PrPsc에 대한 높은 친화력을 증명하는 것을 나타내었다. PrPsc 결합은 +/- 프로틴에이즈 K 처리로 획득된 웨스턴 블롯 밴딩 패턴과 비교하여 확인하였다. 비처리된 샘플과 비교된 프로틴에이즈 K 처리된 샘플의 약간 작은 분자량의 분명히 보이는 밴드의 존재는 프로틴에이즈 K 저항성 형태(감염 형태)의 PrP 결합을 확인하였다.
폴리메타크릴레이트와 같은 지지 매트릭스에 결합하는 본명세서에 기재된 리간드 5/4 및 다른 리간드는 특히 전체 혈액, RBCC 및혈장을 포함하는 많은 혈액 구성성분에서 매우 다양한 형태의 프리온 단백질의 포획 및 농도에 유용하다는 것은 기술분야의 당업자에게 자명할 것이다. 그러므로 이러한 물질은 이러한 구성성분에서 PrP 제거 및 연속 탐지 및 정량을 돕는 PrP 농도의 수단으로서 예외적인 수치이다.
본 명세서에 기재된 것과 유사 또는 동일한 방법 및 물질을 본 발명의 실시 및 실험에 사용할 수 있다할지라도, 적합한 방법 및 물질은 상기에 기재되었다. 본 명세서에 기재된 모든 공개공보, 특허출원, 특허 및 다른 인용참증은 이들의 전체가 참조문헌으로 결합될 수 있다. 또한 물질, 방법 및 실시예는 단지 예시적인 것이며, 이것에 제한되지 않는다.
앞서 기재내용은 본발명과 관련하는 다양한 실시예를 기재하기 위해 제공되었다. 다양한 변형, 첨가 및 삭제는 본 발명의 범위 및 사상으로부터 이탈함이 없이 이러한 실시예 및/또는 구조를 만들 수 있다.
상기에 상세히 기재한 바와 같이, 본 발명은 단백질 리간드 상호작용 분야에 관한 것으로, 보다 상세하게는 프리온 단백질에 결합하는 화합물 및 생물학적인 샘플로부터 프리온을 탐지 또는 제거하는 화합물의 사용방법에 사용된다.

Claims (15)

  1. 프리온 단백질의 친화성 결합용 이하의 구조식 (Ⅰ)의 화합물의 용도:
    Figure 112007016061858-PCT00007
    여기서 R1 및 R2는 동일하거나 다르고 각각 선택 치환된 알킬기, 선택 치환된 씨클로알킬기, 선택 치환된 아릴기, 또는 선택 치환된 헤테로아릴기이고,
    R3은 수소 또는 아릴 치환기이거나, 또는 R3은 스페이서를 통해 선택 결합된 고체 지지체이고,
    Z는 산소 원자, 황 원자 또는 NR4를 나타내고,
    Y는 산소 원자, 황 원자 또는 NR5를 나타내고,
    여기서, R4 및 R5는 동일하거나 다르며, 수소, 1개 내지 6개의 탄소원자를 포함하는 선택 치환된 알킬기, 선택 치환된 페닐기, 선택 치환된 벤질기 또는 선택 치환된 β-페닐에틸기이고,
    X1 및 X2 중 하나는 질소 원자를 나타내고 X1 및 X2 중 다른 것은 질소 원자 또는 CR6이고, 여기서 R6은 수소 또는 아릴 치환기를 나타낸다.
  2. 샘플에서 프리온 단백질을 탐지하고/탐지하거나 샘플에서 프리온 단백질을 제거하는 방법에 있어서,
    상기 방법은 상기 샘플과 제1항에 기재된 구조식(Ⅰ)의 화합물과 결합하는 단계를 것을 포함하는 프리온 단백질의 제거방법.
  3. 인간 또는 동물 환자에서 프리온 결합 병상의 전개를 치료 또는 지연하는 방법에 있어서,
    상기 방법은 제1항에 기재된 바와 같은 고체 지지체에 결합하지 않는 구조식(Ⅰ)의 화합물을 치료적 유효량으로 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 프리온 결합 병상의 전개를 치료 또는 지연하는 방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    프리온 결합 병상의 치료용 제제의 제조시에 고체 지지체에 결합하지 않는 구조식(Ⅰ)의 화합물 용도.
  5. 제1항의 구조식(Ⅰ)의 화합물에 있어서,
    R3은 상기 제 1항에 기재된 바와 같고,
    X1 및 X2는 상기 제 1항에 기재된 바와 같고,
    Y는 상기 제 1항에 기재된 바와 같고,
    Z는 상기 제 1항에 기재된 바와 같고,
    R1은 -(CH2)m-Q1 작용기를 나타내고, 여기서 m은 0 내지 7이고, Q1 은 -CR11R12R13 또는 -NR11R12를 나타내고, 여기서 R11, R12 및 R13은 각각 수소, 알킬, 씨클로알킬 또는 헤테로씨클로알킬기를 나타내고, R11, R12 및 R13 중 두 개는 탄소 또는 질소원자에 결합하여 선택 치환된 씨클로알킬 또는 선택 치환된 헤테로씨클로알킬기를 형성하고,
    R2는 -(CH2)n-Q2 작용기를 나타내고, 여기서 n은 0 내지 7이고, Q2 은 -CR21R22R23 또는 NR21R22를 나타내고, 여기서 R21, R22 및 R23은 각각 수소, 알킬, 씨클로알킬 또는 헤테로씨클로알킬을 나타내고, R11, R12 및 R13 중 두 개는 탄소 또는 질소원자에 결합하여 함께 선택 치환된 씨클로알킬 또는 선택 치환된 헤테로씨클로알킬기를 형성하는 구조식(Ⅰ)의 화합물.
  6. 제 5항에 있어서,
    ⒜ X1 및 X2는 모두 질소이고,
    ⒝ Z 및 Y 모두 NR4를 나타내고, 특히 여기서 R4는 수소이고,
    ⒞ m은 0 내지 4이고, 보다 바람직하게 0 내지 3이고, 가장 바람직하게 1 내지 3이고,
    ⒟ Q1은 -NR11R12이고, R11 및 R12는 바람직하게 질소 원자에 결합하여 함께 헤테로씨클로알킬기를 형성하고,
    ⒠ n은 0 내지 4 이고, 보다 바람직하게 0 내지 2이고, 가장 바람직하게 0이고,
    ⒡ R21 및 R22는 탄소 원자 또는 질소원자에 결합하여 함께, 씨클로알킬기 또는 헤테로씨클로알킬기를 형성하는 구조식(Ⅰ)의 화합물.
  7. 제 5항 또는 제 6항에 있어서,
    상기 Q2는 특히 적어도 6개 원자를 포함하는 고리계를 갖는 소수성 씨클로알킬 및 헤테로씨클로알킬기를 나타내는 구조식(Ⅰ)의 화합물.
  8. 제 5항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 Q1은 헤테로씨클로알킬기, 특히 피페리딜, 특히 1-피페리딜, 및 피페라지닐, 특히 1-피페라지닐을 나타내는 구조식(Ⅰ)의 화합물.
  9. 제 1항의 구조식(I)의 화합물에 있어서,
    R3은 상기 제 1항에 기재된 바와 같고,
    X1 및 X2는 상기 제 1항에 기재된 바와 같고,
    Y는 상기 제 1항에 기재된 바와 같고,
    Z는 상기 제 1항에 기재된 바와 같고,
    R1은 알킬렌 사슬 -(CH2)P-CH3를 나타내고, 여기서 p는 0 내지 6이고, 한 개 이상의 카복실기에 의해 치환되고, 한 개 이상의 추가의 알킬 치환기에 의해 선택치환되고,
    R2는 -(CH2)q-Ar기를 나타내고, 여기서 q는 0 내지 7이고, Ar은 선택 치환된 아릴기를 나타내는 구조식(Ⅰ)의 화합물.
  10. 제 9항에 있어서,
    ⒜ X1 및 X2는 모두 질소이고,
    ⒝ Z 및 Y는 모두 NR4를 나타내고, 특히 여기서 R4는 수소이고,
    ⒞ p는 0 내지 4이고, 보다 바람직하게 0 내지 3이고,
    ⒟ R1은 한 개 또는 두 개의 카복실기로 치환되고, 특히 상기 카복실기 중 적어도 한개는 알킬렌 사슬 -(CH2)p-CH3의 말단 탄소 원자에 의해 운반되고,
    ⒠ q는 0 내지 4이고, 보다 바람직하게 0 내지 3이고, 가장 바람직하게 1 또는 2이고,
    ⒡ Ar은 페닐, 페녹시, 톨릴, 클로로벤질, 메톡시벤질, 플루오르벤질, 피리딜 및 인돌기로 구성된 그룹으로부터 선택되는 한 개 이상의 치환기에 의해 선택 치환된 모노씨클릭 카보씨클릭 또는 헤테로씨클릭 방향족기인 구조식(Ⅰ)의 화합물.
  11. 제 10항에 있어서,
    상기 R1은 카복시메틸, 4-카복시부틸 또는 1-(1,3-디카복시)프로필인 화합물.
  12. 제 10항 또는 제 11항에 있어서,
    상기 Ar은 페닐, 4-하이드록시페닐 또는 피리딜, 특히 2-피리딜인 화합물.
  13. 제 5항에 있어서,
    R3는 상기 제 1항에 기재된 바와 같고,
    X1 및 X2는 모두 N 이고,
    Y 및 Z는 모두 NH를 나타내고,
    m은 2를 나타내고,
    Q1은 피페리딜 또는 피페라지닐을 나타내고,
    n은 0 또는 2를 나타내고,
    Q2는 1-피페리딜 또는 아다만틸을 나타내는 화합물.
  14. 제 9항에 있어서,
    R3는 상기 제 1항에 기재된 바와 같고,
    X1 및 X2는 모두 N 이고,
    Y 및 Z는 모두 NH를 나타내고,
    R1은 카복시메틸, 4-카복시부틸 및 1-(1,3-디카복시)프로필을 나타내고,
    q는 2를 나타내고,
    Ar은 페닐, 2-피리딜 또는 4-하이드록시페닐을 나타내는 화합물.
  15. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항의 용도 또는 방법에 있어서,
    상기 구조식(I)의 화합물은 제 5항 내지 제 14항 중 어느 한 항의 화합물인 용도 또는 방법.
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