EA014365B1 - Замещённые триазины в качестве лигандов белка приона и их применение для обнаружения или удаления прионов - Google Patents

Замещённые триазины в качестве лигандов белка приона и их применение для обнаружения или удаления прионов Download PDF

Info

Publication number
EA014365B1
EA014365B1 EA200700161A EA200700161A EA014365B1 EA 014365 B1 EA014365 B1 EA 014365B1 EA 200700161 A EA200700161 A EA 200700161A EA 200700161 A EA200700161 A EA 200700161A EA 014365 B1 EA014365 B1 EA 014365B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
group
optionally substituted
arylalkyloxyalkyl
alkyl
aryl
Prior art date
Application number
EA200700161A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200700161A1 (ru
Inventor
Джеймс Кристофер Пирсон
Хелен Роузмери Тэттон
Патрик Вэсконселос Гарджел
Original Assignee
Проуметик Байосайенсез Лимитед
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Проуметик Байосайенсез Лимитед filed Critical Проуметик Байосайенсез Лимитед
Publication of EA200700161A1 publication Critical patent/EA200700161A1/ru
Publication of EA014365B1 publication Critical patent/EA014365B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D251/00—Heterocyclic compounds containing 1,3,5-triazine rings
    • C07D251/02—Heterocyclic compounds containing 1,3,5-triazine rings not condensed with other rings
    • C07D251/12—Heterocyclic compounds containing 1,3,5-triazine rings not condensed with other rings having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D251/26—Heterocyclic compounds containing 1,3,5-triazine rings not condensed with other rings having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with only hetero atoms directly attached to ring carbon atoms
    • C07D251/40—Nitrogen atoms
    • C07D251/54—Three nitrogen atoms
    • C07D251/70—Other substituted melamines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/53—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with three nitrogens as the only ring hetero atoms, e.g. chlorazanil, melamine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/22—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising organic material
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
    • B01J20/286—Phases chemically bonded to a substrate, e.g. to silica or to polymers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3202—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the carrier, support or substrate used for impregnation or coating
    • B01J20/3204—Inorganic carriers, supports or substrates
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3202—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the carrier, support or substrate used for impregnation or coating
    • B01J20/3206—Organic carriers, supports or substrates
    • B01J20/3208—Polymeric carriers, supports or substrates
    • B01J20/321—Polymeric carriers, supports or substrates consisting of a polymer obtained by reactions involving only carbon to carbon unsaturated bonds
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3202—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the carrier, support or substrate used for impregnation or coating
    • B01J20/3206—Organic carriers, supports or substrates
    • B01J20/3208—Polymeric carriers, supports or substrates
    • B01J20/3212—Polymeric carriers, supports or substrates consisting of a polymer obtained by reactions otherwise than involving only carbon to carbon unsaturated bonds
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3214—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the method for obtaining this coating or impregnating
    • B01J20/3217—Resulting in a chemical bond between the coating or impregnating layer and the carrier, support or substrate, e.g. a covalent bond
    • B01J20/3219—Resulting in a chemical bond between the coating or impregnating layer and the carrier, support or substrate, e.g. a covalent bond involving a particular spacer or linking group, e.g. for attaching an active group
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
    • B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
    • B01J20/3244—Non-macromolecular compounds
    • B01J20/3246—Non-macromolecular compounds having a well defined chemical structure
    • B01J20/3248—Non-macromolecular compounds having a well defined chemical structure the functional group or the linking, spacer or anchoring group as a whole comprising at least one type of heteroatom selected from a nitrogen, oxygen or sulfur, these atoms not being part of the carrier as such
    • B01J20/3251—Non-macromolecular compounds having a well defined chemical structure the functional group or the linking, spacer or anchoring group as a whole comprising at least one type of heteroatom selected from a nitrogen, oxygen or sulfur, these atoms not being part of the carrier as such comprising at least two different types of heteroatoms selected from nitrogen, oxygen or sulphur
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
    • B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
    • B01J20/3244—Non-macromolecular compounds
    • B01J20/3246—Non-macromolecular compounds having a well defined chemical structure
    • B01J20/3248—Non-macromolecular compounds having a well defined chemical structure the functional group or the linking, spacer or anchoring group as a whole comprising at least one type of heteroatom selected from a nitrogen, oxygen or sulfur, these atoms not being part of the carrier as such
    • B01J20/3255—Non-macromolecular compounds having a well defined chemical structure the functional group or the linking, spacer or anchoring group as a whole comprising at least one type of heteroatom selected from a nitrogen, oxygen or sulfur, these atoms not being part of the carrier as such comprising a cyclic structure containing at least one of the heteroatoms nitrogen, oxygen or sulfur, e.g. heterocyclic or heteroaromatic structures
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2220/00—Aspects relating to sorbent materials
    • B01J2220/50—Aspects relating to the use of sorbent or filter aid materials
    • B01J2220/54—Sorbents specially adapted for analytical or investigative chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07B—GENERAL METHODS OF ORGANIC CHEMISTRY; APPARATUS THEREFOR
    • C07B2200/00—Indexing scheme relating to specific properties of organic compounds
    • C07B2200/11—Compounds covalently bound to a solid support
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G01N2800/2828—Prion diseases

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • General Preparation And Processing Of Foods (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)

Abstract

Соединения формулы (I)в которой Rи Rявляются одинаковыми или разными и представляют собой каждый необязательно замещенные алкильные, необязательно замещенные циклоалкильные, необязательно замещенные арильные или необязательно замещенные гетероарильные группы; Rпредставляет собой водород или заместитель арильной группы или Rпредставляет собой твердую подложку, необязательно прикрепленную через спейсер; Z представляет собой атом кислорода, атом серы или NR; Y представляет собой атом кислорода, атом серы или NR; где Rи R, которые могут быть одинаковыми или разными, представляют собой водород, необязательно замещенный алкил, содержащий 1-6 атомов углерода, необязательно замещенный фенил, необязательно замещенный бензил или необязательно замещенный β-фенилэтил; и один из Xи Xпредствляет собой атом азота, а другой из Xи Xпредставляет собой атом азота или CR, где Rпредставляет собой водород или заместитель арильной группы, применяют для аффинного связывания белка приона.

Description

Данное изобретение относится к области взаимодействий белок-лиганд и более конкретно к соединениям, которые связываются с белками-прионами (лиганды белка-приона) и к способам применения соединений для обнаружения или удаления прионов из биологических образцов.
Уровень техники изобретения
Природный или клеточный белок-прион (РгРс) является широко распространенным во всех млекопитающих и имеет, в частности, хорошо сохраняемую аминокислотную последовательность и структуру белка. Полагают, что инфекционные прионы состоят из модифицированной формы нормального клеточного белка-приона (РгРс) и называются РгРкс. Прионы имеют некоторые свойства общие с другими инфекционными патогенами, но по-видимому не включают в себя нуклеиновую кислоту. Вместо этого, предполагают, что посттрансляционное конформационное изменение вовлекается в превращение неинфекционного РгРс в инфекционный РгРкс, во время которого α-спирали трансформируются в βскладчатые конформации. РгРс содержит три α-спирали и имеет небольшую β-складчатую структуру; в противоположность этому РгРкс обогащен β-складчатой конформацией. Полагают, что превращение РгРс в РгРкс приводит к развитию форм трансмиссивной губчатой энцефалопатии (Т8Е), во время которой РгРкс аккумулируется в центральной нервной системе (ΟΝ8) и сопровождается невропатологическими изменениями и неврологической дисфункцией. Полагают, что РгРкс, часто называемую скрепи-формой белка-приона, является необходимой и возможно достаточной формой для переноса и патогенеза этих трансмиссивных нейродегенеративных заболеваний животных и людей.
Конкретные примеры форм Т8Е включают в себя скрепи, которая поражает овец и коз, коровью губчатую энцефалопатию (В8Е), которая поражает скот; трансмиссивную энцефалопатию норки; кошачью губчатую энцефалопатию и хронический вастинг-синдром (С\УЭ) мула оленя, белохвостого оленя, чернохвостого оленя и лося. У людей заболевания Т8Е могут представлять собой куру, болезнь Крейтцфельдта-Якоба (СТО), синдром Герстман-Штрауслер-Шаинкера (088), фатальную инсомнию и вариант болезни Крейтцфельдта-Якоба (уСГО). Недавно уСГО появилась у людей как результат эпидемии В8Е в Великобритании и, наиболее вероятно, вызвана употреблением пищевых продуктов, полученных из скота, инфицированного В8Е или заболеванием коровьим бешенством. Неизвестное число людей в Соединенном Королевстве употребляли пищу, возможно зараженную нервной тканью из инфицированного В8Е скота в течение от середины 1980-х до начала 1990-х годов. Из-за инкубационного периода для заболевания, вызванного пероральным заражением, который может быть более 20 лет у людей, действительная заболеваемость νί'ΊΌ не могла стать очевидной в течение многих лет. На сегодняшний день известно, что свыше 150 человек заражены болезнью, главным образом в Великобритании; однако, зарегистрированы также случаи в Канаде, Франции, Гонконге, Ирландии, Италии и США. Экспорт зараженных коровьих пищевых продуктов из Великобритании по всему миру указывает на возможное глобальное присутствие В8Е и, следовательно, вероятность νί'ΊΌ. Согласно этим наблюдениям имеет место обнаружение В8Е в большинстве европейских стран, Канаде, США, Японии и Израиле. Следовательно, возможность обнаружения и удаления инфекционного белка приона из различных материалов, включающих пищевые продукты, имеет большое значение.
Исторически диагностика форм Т8Е была основана на проявлении клинических симптомов заболевания и могла быть подтверждена только гистологическим исследованием ткани головного мозга после смерти. Характерным для всех форм Т8Е является отсутствие поддающейся измерению иммунной реакции хозяина на агент. Таким образом, антитела не продуцируются и нет общепринятого серологического теста, который можно использовать для выявления инфицированных животных. Недавно идентификацией аномального белка-приона в головном мозге повысили способность устанавливать диагноз заболевания.
Кроме приема внутрь инфицированных продуктов, полученных из коров, другим возможным способом переноса νί'ΊΌ среди людей является трансфузия крови и трансплантация органа. В Великобритании имеются два случая подозрения на перенос νί'ΊΌ трансфузией крови. Инфективность νί'ΊΌ у людей трансфузией крови в настоящее время неизвестна, но имеется повышенная возможность этого, которая может быть более эффективным способом переноса уСЮ, по сравнению с приемом внутрь. Это совпадает с данными из экспериментальных животных-моделей, включающими перенос ν61ϋ от овцы. В отличие от других форм Т8Е у человека РгРкс присутствует в лимфоретикулярной системе пациентов с νί'ΊΌ. тем самым увеличивая возможность существования инфекционного агента в крови и его переноса через трансфузию крови. Другие факторы, повышающие обеспокоенность относительно риска переноса трансфузией, включают в себя неизвестное, но предположительно большое число людей, подвергнутых воздействию В8Е, и отсутствие предклинического диагностического теста на νί'ΊΌ. Кроме того, повидимому, вирулентность νί'ΊΌ усиливается после адаптации вида в приматах и мышах, это позволяет предположить, что перенос от человека к человеку может быть более эффективным, чем от коровы к человеку. Таким образом, имеется острая необходимость в способах предотвращения переноса νί'ΊΌ трансфузией крови. Такие показатели могут включать в себя раннюю идентификацию инфицированных доноров и устранение и инактивацию агентов Т8Е в пище, полученной из животных, и продуктах для
- 1 014365 укрепления здоровья, предназначенных для потребления животным или человеком, или для применения продуктов, полученных из крови человека и коровы, и органов-трансплантатов. К сожалению, РгРкс необычно устойчив к химическим и физическим методам инактивации, и селективный метод инактивации является ненадежным.
Удаление приона через специфическое взаимодействие с лигандами представляется более перспективным. Уже идентифицировали ряд лигандов, которые связываются с белком-прионом. Методами комбинаторных библиотек пептидов осуществили скрининг лигандов, которые связываются с октапептидной повторяющейся последовательностью (РНСССАСО), найденной во всех известных белках-прионах млекопитающих, и обнаружили ряд лигандов, как описано в АО 01/77687. Другие вещества включают в себя ряд полимеров, например аминополиметакрилат от То§оВю8ер, общепринятые ионообменные смолы (см. патент США № 5808011 Оаетту1 е! а1.), лиганды, которые взаимодействуют с амилоидной бляшкой, например конго красный ((1идго88о е! а1., 1. У1то1оду 69:506-508 (1995)), 4-йод, 4дезоксидоксорубицин (Тад11ау1ш е! а1., 8с1еисе 276:1119-1122 (1997)), амфотерицин В, порфирины и фталоцианины (Рпо1а е! а1., 8с1еисе 287:1503-1506 (2000)), металлы (8!оске1 е! а1., ВюсйетМгу. 37, 7185-7193 (1998)), пептиды, которые взаимодействуют с РгР с образованием комплексов (см. патент США 5750361 Ргиыиег е! а1. аиб 8о!о е! а1., Ьаисе!, 355:192-197 (2000)), гепарин и другие полисульфатированные полианионы (Саидйеу е! а1., Вшбшд ок !йе Рго!еа8е-8еи8Й1уе котт ок рпои рто!еш РгР !о 8и1рйа!еб С1усо5а11йиод1усаи аиб Соидо Веб, к Упо1оду 68:2135-2141 (1994)), антитела (Казскак е! а1., 1ттиио1од1са1 1иуе§!. 26:259-268 (1997)) и другие белки, например, плазминоген (Рщйег е! а1., Ыа!иге 408:47 9-483 (2000)). В настоящее время из широкого разнообразия веществ полностью не охарактеризован или не найден лиганд, способный связываться с прионом, хотя некоторые вещества могут быть полезными в определенных случаях (см. патент США № 5808011 Оа^ту1 е! а1.).
На сегодняшний день заболевание человека Т8Е является 100% смертельным. К сожалению, хотя ряд соединений, включающий амфотерицины, сульфатированные полианионы, краситель конго красный и антрациклиновые антибиотики, описан как перспективные терапевтические агенты, все они демонстрируют только умеренную возможность задерживать распространение приона, и, как показано, ни один из них не оказывает какого-либо влияния на удаление ранее находившихся прионов из организма инфицированного хозяина. Таким образом, остается острая необходимость в новых терапевтических агентах.
Полагают, что формирование и расформирование обычно растворимых белков в конформационно измененные и нерастворимые формы является процессом, вызывающим болезнь, в целом ряде других заболеваний, многие из которых представляют собой неврологические заболевания. Связь между началом заболевания и переходом от обычного к конформационно измененному белку недостаточно понятна. Примеры таких нерастворимых белков, помимо приона, включают в себя β-амилоидный пептид в амилоидных бляшках болезни Альцгеймера и церебральной амилоидной ангиопатии (САА); отложения αсинуклеина в тельцах Леви при болезни Паркинсона; τ- в нейрофибриллярных сплетениях при лобновисочной деменции и болезни Пика; супероксиддисмутазу при амиотрофическом боковом склерозе и гентингтин при болезни Гентингтона.
Часто эти совершенно нерастворимые белки образуют агрегаты, состоящие из неразветвленных фибрил со стандартной характеристикой β-плетированной складчатой конформации. В центральной нервной системе амилоид может присутствовать в церебральных и менингеальных кровеносных сосудах (отложения в сосудах головного мозга) и в паренхиме головного мозга (бляшки). Невропатологические исследования на моделях человека и животных показывают, что клетки, проксимальные к амилоидным отложениям, имеют нарушения в их нормальных функциях.
Точный механизм, по которому образуются нейритные бляшки, и связь образования бляшки, с ассоциированными с заболеванием нейродегенеративными процессами в основном являются неизвестными. Методологии, которые могут легко разделять или которые могут находить различие между двумя или более различными конформационными формами белка, например РгРс и РгРкс, необходимы, чтобы понять процесс превращения и чтобы найти структуры, которые будут специфически взаимодействовать с ассоциированной с заболеванием формой. Современные методологии для разделения или различия между изоформами включают в себя дифференциальную подвижность в полиакриламидных гелях в присутствии такого хаотропного средства, как мочевина, т.е. гели с обратным градиентом мочевины (ТИО); дифференциальную чувствительность к обработке протеазой, например протеиназой К (РК) и обнаружение РК-резистентного перевариваемого продукта РгРкс, обозначенного как РгРгек; дифференциальную термическую стабильность; относительную растворимость в неионных детергентах; и способность фибриллярных структур к связыванию некоторых химических веществ, например конго красного и изофлавина 8. Однако остается неудовлетворенная потребность идентификации высокоаффинных реагентов, которые являются специфическими для конформационно измененного белка и особенно форм, ассоциируемых с заболеванием. Такие реагенты могут быть полезны для разработки диагностических наборов, для разделения и очистки различных форм белка, для удаления форм белка, вызывающего инфекционное заболевание, из терапевтических агентов, биологических продуктов, вакцин и пищевых продуктов и для терапии.
- 2 014365
Сущность изобретения
Согласно первому аспекту настоящего изобретения предложено применение соединения формулы (I)
в которой К1 и К2 являются одинаковыми или разными и представляют собой каждый необязательно замещенные алкильные, необязательно замещенные циклоалкильные, необязательно замещенные арильные или необязательно замещенные гетероарильные группы;
К3 представляет собой водород или заместитель арильной группы, или К3 представляет собой твердый носитель, необязательно присоединенный через спейсер;
Ζ представляет собой атом кислорода, атом серы или ΝΚ4;
Υ представляет собой атом кислорода, атом серы или ΝΚ5;
где К4 и К5, которые могут быть одинаковыми или разными, представляют собой водород, необязательно замещенный алкил, содержащий 1-6 атомов углерода, необязательно замещенный фенил, необязательно замещенный бензил или необязательно замещенный β-фенилэтил; и один из X1 и X2 представляет собой атом азота, а другой из X1 и X2 представляет собой атом азота или СК6, где К6 представляет собой водород или заместитель арильной группы, для аффинного связывания белка-приона.
Соединения формулы (I) можно применять для обнаружения или удаления белка приона из такого образца, как биологическая жидкость или образец внешней среды. Соединения применяют для обнаружения или удаления всего белка приона из образца или могут быть селективно выбраны для обнаружения или удаления одной формы белка-приона и поэтому их можно применять для установления различия между инфекционным и неинфекционным белком-прионом в образце из организма пациентов, пораженных Т8Е человека и животных, пораженных скрепи, В8Е или СУЭ. Соединения являются полезными в способах обнаружения белка-приона в образце, таком как биологическая жидкость, полученная из организма человека или животного, или образца окружающей среды, а также способах диагностики и лечения заболевания, вызванного прионом. Например, соединения изобретения могут быть полезными для лечения или диагностики таких патологий, как СТО, уСГО, С88, фатальной инсомнии, скрепи, В8Е и СУЭ и других Т8Е, с применением цельной крови, компонентов крови, клеток, сыворотки, плазмы, производных плазмы, цереброспинальной жидкости, мочи, слез, миндалин, аппендикса и других тканей. Соединения могут также быть полезными для удаления белка-приона из такого образца, как образец крови, компоненты крови, клетки, сыворотка, плазма, производные плазмы, спинномозговая жидкость, моча, слезы, миндалины, аппендикс и другие материалы.
По другому аспекту изобретение предлагает способ детектирования белка-приона в образце и/или удаления белка-приона из образца, такой способ включает в себя контактирование образца с соединением формулы (I), как указано выше. Соединения формулы (I), которые не связаны с твердым носителем, но в которых К3 представляет собой водород или заместитель, также могут быть полезными для лечения или замедления развития связанной с прионом патологии у субъекта. Например, лиганды изобретения могут быть полезными для лечения патологий, таких как СТО, уСГО, С88, фатальная инсомния, скрепи, В8Е и СУЭ. Без желания быть связанным с какой-либо теорией, считают, что такие лиганды могут действовать через ингибирование полимеризации РгРкс или взаимодействия РгРкс и РгРс, тем самым далее замедляя развитие РгРкс.
Таким образом, в следующем аспекте изобретения предложен способ лечения или замедления развития связанной с прионом патологии у субъекта, человека или животного, такой способ включает в себя введение субъекту терапевтически эффективного количества соединения формулы (I), которое не связа но с твердым носителем.
Подобным же образом изобретение далее предлагает применение соединения формулы (I), которое не связано с твердым носителем, для изготовления лекарственного препарата для лечения связанной с прионом патологии.
Другие признаки и преимущества изобретения будут очевидны из последующего подробного опи сания и предпочтительных вариантов осуществления.
Подробное описание изобретения
Определения
Термин 3Е4 относится к моноклональному антителу, специфичному для природных форм РгРс, но не для природной формы РгРкс или РгРгек. Антитело обладает специфичностью для денатурированных форм РгРс, РгРкс и РгРгек хомяка и человека.
Термин алкенил относится к алифатической углеводородной группе, содержащей углеродуглеродную двойную связь, которая может быть нормальной или разветвленной. Предпочтительные алкенильные группы имеют 2-12 атомов углерода в цепи и более предпочтительно 2-6 атомов углерода в
- 3 014365 цепи, например пропенил, н-бутенил, изобутенил, 3-метилбут-2-енил, н-пентенил и гептенил. Термины циклоалкенил и гетероциклоалкенил являются аналогичными.
Термин алкокси относится к алкил-О-группе, в которой алкил имеет значения, указанные выше в контексте. Примеры включают в себя метокси, этокси, пропокси, изопропокси, бутокси и пентокси.
Термин алкил, применяемый здесь, как таковой или в комбинации относится к нормальному или разветвленному насыщенному углеводороду, имеющему 1-15 атомов углерода. Низшие алкильные группы с 1-6 углеродами являются предпочтительными, например метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, втор-бутил, изобутил, трет-бутил, н-пентил, 2-метилбутил, 3-метилбутил, н-гексил, 4-метилпентил, неопентил и 2,2-диметилпропил. Когда алкильная группа описана как необязательно замещенная, то такая группа может быть замещена одним или более заместителями, конкретно, одним или более заместителями алкильной группы, как указано в контексте.
Термин заместитель алкильной группы относится, если не оговорено особо, к гидроксилу, амино, алкилу, галогену, гидроксиалкилу, амидо, ацилу, ациламино, алкокси, алкоксикарбонилу, алкилендиокси, алкилсульфинилу, алкилсульфонилу, алкилтио, ароил, ароиламино, арилу, арилалкокси, арилалкоксикарбонилу, арилалкилтио, арилокси, арилоксикарбонилу, арилсульфинилу, арилсульфонилу, арилтио, карбокси (или биоизостеру кислоты), циано, гетероароилу, гетероарилу, гетероарилалкилокси, гетероароиламино, гетероароилокси, нитро или трифторметилу.
Термин ароил относится к арил-СО-группе, в которой арильная группа имеет значение, как указано в контексте, например бензоил и 1- и 2-нафтоил.
Термин арил как группа или часть группы относится к:
a) необязательно замещенной моноциклической или полициклической ароматической карбоциклической группе из 6-18 атомов углерода, такой как фенил, нафталин, ацеантрилен, аценафтилен, ацефенантрилен, азулен, хризен, индацен, инден, флуорин, фенален и фенантрен; или
b) необязательно замещенной, частично насыщенной полициклической ароматической карбоциклической части, в которой арил и циклоалкил, циклоалкенил, гетероциклоалкил или гетероциклоалкенил конденсированы вместе с образованием такой циклической структуры, как кольцо индолинила, тетрагидронафтила, инденила или инданила.
Предпочтительные арильные группы представляют собой необязательно замещенные фенильные группы.
Когда арильную группу описывают как необязательно замещенную, то такая группа может быть замещена одним или несколькими заместителями, конкретно одним или более одного, или несколькими заместителями арильной группы, как здесь указано.
Заместитель арильной группы относится, если не оговорено особо, к гидроксилу, амино, алкилу, галогену, гидроксиалкилу, амидо, ацилу, ациламино, алкокси, алкоксикарбонилу, алкилендиокси, алкилсульфинилу, алкилсульфонилу, алкилтио, ароилу, ароиламино, арилу, арилалкокси, арилалкоксикарбонилу, арилалкилтио, арилокси, арилоксикарбонилу, арилсульфинилу, арилсульфонилу, арилтио, карбокси (или биоизостеру кислоты), циано, гетероароилу, гетероарилу, гетероарилалкилокси, гетероароиламино, гетероарилокси, нитро, оксо или трифторметилу.
Считают, что применяемый здесь термин полученные из крови композиции означает цельную кровь, концентрат эритроцитов, плазму, сыворотку, обогащенные тромбоцитами и обедненные тромбоцитами фракции, концентраты тромбоцитов, лейкоциты, осадки плазмы крови, фракционированные осадки плазмы крови и супернатананты, препараты иммуноглобулина, включающие в себя 1дА, 1дЕ, 1дС и 1дМ, концентраты очищенного фактора коагуляции, концентрат фибриногена или различные другие композиции, которые получены из организма людей или животных. Термин также включает в себя выделенные из крови очищенные белки, полученные любым из разнообразных способов, обычных в данной области, включающих в себя ионообменную, аффинную, гель-проникающую и/или гидрофобную хроматографию или дифференциальное осаждение.
Термин комбинаторная библиотека относится к коллекции химических веществ, которая синтезирована по методикам твердофазного синтеза, принятого в комбинаторной химии. Это определение включает в себя применение способа расщепления-сочетания-рекомбинирования, который генерирует миллионы случайных соединений или может быть предназначен для включения определенных структур. Строительными блоками могут быть триазиновые структуры и тому подобные.
Термин циклоалкил относится к насыщенной моноциклической, бициклической или полициклической кольцевой системе из 3-12 углеродых атомов с боковой цепью или без нее, и необязательно прерванной -(С=О)-. Предпочтительные циклоалкильные группы представляют собой моноциклоалканы, например циклопропил, циклопентил, циклогексил, циклогептил; бициклоалканы, которые соединены у одного углерода, например спирононан; и насыщенные мостиковые кольцевые системы, включающие в себя бициклоалканы, которые соединены у двух углеродов, например норборнан, бицикло[4,3,2]ундекан, бицикло [4,1,0]гептан и декалин, и полициклические мостиковые системы, например адамантан. Более предпочтительно циклоалкильная группа представляет собой моноциклоалкан или мостиковую кольцевую систему. Наиболее конкретно циклоалкильная группа представляет собой циклогексил, норборнан
- 4 014365 или адамантан.
Когда циклоалкильная группа описана как необязательно замещенная, то такая группа может быть замещена одним или несколькими заместителями, конкретно, одной или более одной, или несколькими заместителями алкильной группы, как здесь указано.
Термин галоген означает фтор, хлор, бром или йод.
Термин гетероарил как группа или часть группы, относится к:
a) необязательно замещенному моноциклическому арилу, в котором один или несколько членов кольца и/или элементов кольца другой, чем углерод, например Ν, О или 8, предпочтительными примерами являются моноциклические или бициклические арилы, например бензимидазоильные, бензтиазоильные, фурильные, имидазоильные, индолильные, индолизинильные, изоксазоильные, изохинолильные, изотаизоильные, оксадиазоильные, пиранильные, пиразинильные, пиридазинильные, пиразоильные, пиридильные, пиримидильные, пирролильные, хиназолинильные, хинолильные, 1,3,4-тиадиазолильные, тиазолильные, тиенильные и триазолильные группы, необязательно замещенные одним или несколькими заместителями арильной группы, как указано здесь, если не указано иначе; или
b) необязательно замещенной частично насыщенной полициклической гетерокарбоциклической частью, в которой гетероарильные и циклоалкильные, циклоалкенильные, гетероциклоалкильные или гетероциклоалкенильные группы конденсированы вместе с образованием циклической структуры (примеры таких групп включают в себя пириданильные группы, необязательно замещенные одним или несколькими заместителями арильной группы, как указано здесь, за исключением случаев, когда указано иначе).
Когда гетероарильная группа описана как необязательно замещенная, то такая группа может быть замещена одним или несколькими заместителями, конкретно, одним или более одного, или несколькими заместителями алкильной группы, как указано здесь.
Термин гетероциклоалкил относится к циклоалкильной группе, по меньшей мере с одним атомом углерода цикла, замененным гетероатомом или группой, содержащей гетероатом, например О, 8, N или ΝΚ7, где Я7 представляет собой водород или алкил. Предпочтительные гетероциклоалкильные группы содержат один или несколько атомов Ν, например имидазолидин, пиперидин, морфолин, пиперазин, пиролидинон, пиразолидин и хинуклидин. Более предпочтительными примерами являются гетеромоноциклоалканы с одним или несколькими атомами Ν, например пиперидин и пиперазин. Когда гетероциклоалкильная группа описана как необязательно замещенная, то такая группа может быть замещена одним или несколькими заместителями, конкретно, одним или более одного, или несколькими заместителями алкильной группы, как указано здесь.
Термин гидрофобная группа относится к липофильной группе, которая обычно является электрически нейтральной и неполярной. Гидрофобные группы предпочитают нейтральные и неполярные растворители или молекулярные среды, в противоположность водным растворителям или средам. Гидрофобная группа, следовательно, будет иметь сродство к другим гидрофобным группам в нормальной физиологической среде. Примеры гидрофобных групп обычно включают в себя алкильные и циклоалкильные группы, предпочтительно незамещенные, и арильные группы.
Соединения, описанные в изобретении, обычно используют при значении рН, которое является таким же как или близким к физиологическому значению рН. Гидрофобный характер соединений или отдельных частей в этих соединениях будет определяться в зависимости от того, является ли рассматриваемая группа заряженной при таком рН. Например, 1-(2-аминоэтил)пиперидин является гидрофобной группой, когда при физиологическом значении рН атом азота является незаряженным.
Термин лиганд относится к молекуле, с которой связывается белок, пептид или полипептид. Лиганды настоящего изобретения представляют собой замещенные гетероароматические соединения, такие как триазины.
Термин РгРс относится к молекуле природного белка-приона, которая обычно и широко экспрессируется внутри организма млекопитающих. Его структура весьма устойчива и не связана с патологическим состоянием.
Термин РгРбс относится к конформационно измененной форме молекулы РгРс, которая является молекулой, как предполагают, инфекционной и связанной с Т8Е/прионными заболеваниями, включающими в себя уСГО, СГО, куру, фатальную инсомнию, 688, скрепи, В8Е, СХУЭ и другие, редко встречающиеся формы Т8Е находящихся в неволе и экспериментальных животных. Она имеет такую же аминокислотную последовательность как нормальная, клеточная РгРс, но некоторая часть α-спирали превращается в β-складчатую структуру и ассоциируется с патологическим состоянием.
Термин РгРгеб относится к устойчивым к протеиназе производным белка РгРбс с 27-30 кДа, которые остаются после частичного переваривания РгРбс протеиназой РК.
Термин РгР обычно относится к белку-приону.
Термин спейсер относится к необязательной части, которая связывает аффинный лиганд с матрицей-подложкой. Один предпочтительный класс спейсера представлен общей формулой (II)
-Т-[-Ь-У-]а- (II)
- 5 014365 в которой Т представляет собой О, 8 или ΝΚ7;
V представляет собой -0-, -8-, -СОО-, -ΕΘΝΗ- или -ΝΗί'Ό-. -РО3Н, -NΗ-арилен-8Ο2-СН2СН2- или -ΝΚ7-;
Ь представляет собой необязательно замещенную углеводородную связывающую группу, содержащую 2-20 атомов углерода; и а равно 0 или 1.
Термин матрица-подложка относится к любому соединению или веществу независимо от того, является ли оно или не является частицами, растворимым или нерастворимым, пористым или непористым, которое можно применять, чтобы образовывать конъюгат аффинный лиганд-матрица согласно изобретению, и который обеспечивает подходящие средства отделения аффинных лигандов от растворенного вещества в растворе. Поэтому матрица-подложка может принимать форму, например, стержня, гранул, маленьких частиц, мембраны или сетки.
Примеры матриц-подложки включают в себя растворимые матрицы-подложки, такие как полимеры природного происхождения, например полипептид, или белок, такой как сшитый альбумин, или полисахарид, такой как агароза, альгинат, каррагенан, хитин, целлюлоза, декстран или крахмал; синтетические полимеры, такие как полиакриламид, полистирол, полиакролеин, поливиниловый спирт, полиметилакрилат, перфторуглерод; неорганические соединения, такие как диоксид кремния, стекло, кизельгур, оксид алюминия, оксид железа или другие оксиды металлов, или сополимеры, состоящие из любой комбинации из двух или более полимеров природного происхождения, синтетические полимеры или неорганические соединения.
В определение матриц-подложек включены также растворимые матрицы-подложки, содержащие такие полимеры, как декстран, полиэтиленгликоль, поливиниловый спирт или гидролизованный крахмал, который обеспечивает применение конъюгатов аффинный лиганд-матрица при жидкостном разделении; или твердые матрицы-подложки, включающие в себя такие соединения, как перфтордекалин, который обеспечивает применение конъюгатов аффинный лиганд-матрица при образовании аффинных эмульсий.
В определение матриц-подложек дополнительно включены такие матрицы-подложки, как агароза, целлюлоза, декстран, крахмал, альгинат, каррагенан, синтетические полимеры, оксид кремния, стекло и оксиды металлов, которые были или являются модифицированными обработкой активирующим агентом до или во время прикрепления лиганда.
Матрицы-подложки предпочтительно представляют собой необязательно активированную агарозу, диоксид кремния, целлюлозу, стекло, метакрилат, гидроксиэтилметакрилат, полиакриламид, стиролдивинилбензол, Нирег Ό или перфторуглероды. Наиболее предпочтительной матрицей-подложкой является метакрилатное вещество твердого типа торговой марки Тоуореаг1 (доступный из Токой Вю8С1епее ЬЬС, 156 Кеуйопе Όγ№, МоШдошегууШе, РА 18936, США).
В патенте \¥О 97/10887 описаны способы прикрепления аффинных лигандов к матрицамподложкам, например применение активирующих способов и способов прикрепления аффинного лиганда к матрице через спейсер, например, реакциями конденсации с образованием конъюгатов аффинный лиганд-матрица.
Предпочтительными являются соединения формулы (I), в которой как X1, так и X2 представляют собой атомы азота.
Предпочтительными являются соединения формулы (I), в которой как Ζ, так и Υ представляют собой ΝΚ4, в частности, где В4 представляет собой водород.
Предпочтительно, чтобы по меньшей мере один из В1 и В2 представлял собой необязательно замещенную алкильную группу.
В первой группе особенно предпочтительные соединения общей формулы (I) обозначили как соединения формулы (1а):
В3 имеет указанные выше значения;
X1 и X2 имеют указанные выше значения;
Υ имеет указанные выше значения;
Ζ имеет указанные выше значения;
В1 представляет собой группу -(СН2)т-р\ где т равно 0-7 и 0' представляет собой -СВПВ12В13 или
12 11 12 13
-ΝΡ В , где В , В и В независимо представляют собой водород, алкил, циклоалкил или гетероциклоалкил, или два из В11, В12 и В13 вместе с атомом углерода или азота, к которому они присоединены, образуют необязательно замещенную циклоалкильную или необязательно замещенную гетероциклоалкильную группу; и
В2 представляет собой группу -(СН2)п-ф2, в которой п равно 1-7 и ф2 представляет собой -СВ В В или -ΝΡ В , где В , В и В независимо представляют собой водород, алкил, циклоалкил или гетероциклоалкил, или два из В11, В12 и В13 вместе с атомом углерода или азота, к которому они присоединены, образуют необязательно замещенную циклоалкильную или необязательно замещенную гетероциклоалкильную группу.
В соединениях формулы (1а):
- 6 014365
a) X1 и X2, оба, предпочтительно представляют собой атом азота;
b) как Ζ, так и Υ предпочтительно представляют собой ΝΚ4, в особенности, где Я4 представляет собой водород;
c) т предпочтительно равно 0-4, более предпочтительно 0-3 и наиболее предпочтительно 1-3;
й) θ' предпочтительно представляет собой -ΝΚ.Κ.12; и Я11 и Я12 предпочтительно образуют вместе с атомом азота, к которому они присоединены, гетероциклоалкильную группу;
е) η предпочтительно равно 0-4, более предпочтительно 0-2 и наиболее предпочтительно равно 0; и
1) Я21 и Я22 предпочтительно образуют вместе с атомом углерода или атомом азота, к которому они присоединены, циклоалкильную или гетероциклоалкильную группу.
Конкретно, предпочтительные группы, которые могут представлять собой ф2, включают в себя гидрофобные циклоалкильные и гетероциклоалкильные группы, в особенности с циклическими системами, которые включают в себя по меньшей мере шесть атомов. Примеры таких групп включают в себя циклогексил, пиперидил, конкретно 1-пиперидил, и мостиковые карбоциклические кольцевые системы, например норборнил. Такие группы являются предпочтительно незамещенными, особенно не замещенными любыми полярными заместителями.
Предпочтительными группами, которые могут представлять ф1, являются гетероциклоалкильные группы, предпочтительно пиперидил, конкретно 1-пиперидил и пиперазинил, конкретно 1-пиперазинил.
Во второй группе, конкретно, предпочтительные соединения общей формулы (I) обозначили как соединения формулы (1Ь):
Я3 имеет значения, указанные выше;
X1 и X2 имеют значения, указанные выше;
Υ имеет значения, указанные выше;
Ζ имеет значения, указанные выше;
Я1 представляет собой алкиленовую цепь -(СН2)Р-СН3, где р равно 0-6, замещенную одной или более карбоксильными группами и необязательно замещенную одним или более дополнительными заместителями алкильной группы; и
Я2 представляет собой группу -(СН2)Ч-Лт, в которой с.| равно 0-7 и Аг представляет собой необязательно замещенную арильную группу.
В соединениях формулы (1Ь):
a) X1 и X2, оба, предпочтительно представляют собой атомы азота;
b) как Ζ, так и Υ предпочтительно представляют собой ΝΚ4. особенно, где Я4 представляет собой водород;
c) р предпочтительно равно 0-4, более конкретно 0-3;
й) Я1 предпочтительно замещен одной или двумя карбоксильными группами, причем по меньшей мере одна из этих карбоксильных групп имеет концевой атом углерода у алкиленовой цепи -(СН2)Р-СН3;
е) с.| предпочтительно равно 0-4, более конкретно 0-3 и наиболее конкретно равно 1 или 2; и
1) Аг представляет собой предпочтительно моноциклическую карбоциклическую или гетероциклическую ароматическую группу, необязательно замещенную одним или несколькими заместителями, выбранными из группы, включающей в себя фенил, фенокси, толил, хлорбензил, метоксибензил, фторбензил, пиридил и индолил. Аг представляет собой более конкретно фенил, фенокси или пиридил.
Особенно предпочтительными группами, которые могут представлять Я1, являются карбоксиметил, 4-карбоксибутил или 1-(1,3-дикарбокси)пропил.
Особенно предпочтительными группами, которые могут представлять Аг, являются фенил, 4гидроксифенил и пиридил, конкретно 2-пиридил.
Соединения формул 1а и 1Ь являются новыми и представляют собой дополнительные аспекты настоящего изобретения.
Одним набором конкретных соединений формулы (I), которые, как обнаружено, являются полезными в изобретении, являются соединения формулы (1а), в которой
Я3 имеет значения, указанные выше;
X1 и X2, оба, представляют собой Ν;
Υ и Ζ, оба, представляют собой ΝΗ;
травно 2;
ф1 представляет собой пиперидил или пиперазинил;
η равно 0 или 2 и р2 представляет собой 1-пиперидил или адамантил.
Другой набор специфических соединений формулы (I), которые, как обнаружено в изобретении, являются полезными, представляет собой соединения формулы (1Ь), в которой
Я3 имеет значения, указанные выше;
X1 и X2, оба, представляют собой Ν;
Υ и Ζ, оба, представляют собой ΝΗ;
Я1 представляет собой карбоксиметил, 4-карбоксибутил и 1-(1,3-дикарбокси)пропил;
с.| равно 2;
- 7 014365
Аг представляет собой фенил, 2-пиридил или 4-гидроксифенил.
Описание предпочтительных вариантов осуществления
Предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения теперь будут описаны только путем иллюстрации, со ссылкой на последующие методологии и примеры.
Синтезы лигандов
Способы, по которым можно получать соединения формулы (I), обычно являются очевидными для специалиста в данной области. Можно сделать ссылку, например, на способы синтеза, описанные в патенте №0 97/10887.
Один способ, по которому можно получать соединения формулы (I), включает в себя взаимодействие соединения общей формулы (II)
в которой К1, Ζ, К2, Υ, X1 и X2 имеют значения, указанные выше для формулы (I), с аминосодержащей матрицей-подложкой.
Другим способом, по которому можно получать соединения формулы (I), является взаимодействие соединения формулы (III)
в которой К1, Ζ, X1 и X2 имеют значения, указанные выше для формулы (I), с аминосодержащей матрицей-подложкой с образованием соединения формулы (IV)
в которой К1, Ζ, X1 и X2 имеют значения, указанные выше для формулы (I), и К3 представляет собой матрицу-подложку, необязательно прикрепленную через спейсер, с последующим взаимодействием соединения формулы (IV) с соединением формулы Η-Υ-К2.
В следующем общем препаративном способе соединение формулы (V)
в которой X1 и X2 имеют значения, указанные выше для формулы (I), и К3 представляет собой матрицуподложку, необязательно прикрепленную через спейсер, подвергают взаимодействию последовательно с соединениями формулы Η-Ζ-К1 и Η-Υ-К2.
Идентификация лиганда
Лиганды можно идентифицировать следующим образом. Синтезируют миметические библиотеки и подвергают скринигу способность анализируемых веществ к связыванию с прионом. Анализируемое вещество-прион пропускают через колонку и связанное анализируемое вещество детектируют с применением общепринятых способов, таких как меченое антитело, специфичное для белка-приона. Гранулы, с которыми связано анализируемое вещество, идентифицируют как подходящие лиганды.
Применение лигандов для удаления прионов
Лиганды, которые связывают прионы или фрагменты прионов, применяют для целого ряда аналитических, препаративных и диагностических областей применения. Прионсвязывающие лиганды можно иммобилизовать на такой подложке, как гранула или мембрана, и применять для связывания и удаления приона из образца. Твердой фазе, с которой связываются лиганды, предоставляют возможность контактировать с образцом, таким как биологическая жидкость, в условиях, достаточных, чтобы вызвать образование композита прион-лиганд, и белок-прион в образце связывается с лигандом. Затем твердую фазу отделяют от образца, тем самым удаляя белок-прион, связанный с лигандом, который прикреплен к твердой фазе, из образца. Например, смолы и мембраны для удаления загрязнений хорошо известны в
- 8 014365 данной области, такие как описанные в патенте США № 5834318 ВаитЬаей с1 а1. и \УО 01/77687.
Примеры биологических образцов включают в себя, но не ограничиваются перечисленным, кровь, полученные из крови композиции и сыворотку. Дополнительные биологические образцы включают в себя спинномозговую жидкость, мочу, слюну, молоко, проточную жидкость, слезы или сперму. Другие образцы могут содержать коллаген, экстракты мозга и железы.
В данной области известно много способов для иммобилизации молекул на различных твердых поверхностях. Например, твердой поверхностью может быть мембрана (например, нитроцеллюлоза), чашка микротитратора (например, из ПВХ, полипропилена или полистирола), пробирка (стеклянная или полимерная), указатель уровня (например, из стекла, ПВХ, полипропилена, полистирола, латекса и тому подобного), пробирка для микроцентрифуги или стеклянная, из диоксида кремния, пластмассовая, металлическая или полимерная гранула. Требуемый компонент может быть ковалентно связанным или нековалентно присоединенным посредством неспецифического связывания.
Широкий ряд органических или неорганических полимеров как природных, так и синтетических, можно применять в качестве вещества для твердой поверхности. Иллюстративные полимеры включают в себя полиэтилен, полипропилен, поли(4-метилбутен), полистирол, полиметакрилат, полиакрилат, поли(этилентерефталат), район, найлон, поли(винилбутират), поливинилидендифторид (РУНЕ), силиконы, полиформальдегид, целлюлозу, ацетат целлюлозы, нитроцеллюлозу и тому подобное. Другие вещества, которые можно применять, включают в себя бумагу, стекла, керамики, металлы, металлоиды, полупроводниковые материалы, цементы и тому подобное. Кроме того, можно применять вещества, которые образуют гели, такие как белки (например, желатины), липополисахариды, силикаты, агароза и полиакриламиды. Также подходящими являются полимеры, которые образуют отдельные водные фазы, такие как декстраны, полиалкиленгликоли или сурфактанты, такие как фосфолипиды, соли алкиламмония с длинной цепью (12-24 атома углерода) и тому подобное. Когда твердая поверхность является пористой, то могут применяться различные размеры пор в зависимости от природы системы. Кроме того, пептид может быть введен во время полимеризации твердой поверхности.
В изготовлении поверхности можно применять множество различных материалов, например, в виде ламинатов, чтобы обеспечить различные свойства. Например, такие белковые покрытия, как желатин, можно применять, чтобы избежать неспецифического связывания, для упрощенной ковалентной конъюгации и усиления сигнала для обнаружения или тому подобное.
Если требуется ковалентное связывание между соединением и поверхностью, то поверхность, как правило, является полифункциональной или способной становиться полифункциональной. Функциональные группы, которые возможно присутствуют на поверхности и применяются для связывания, могут включать в себя карбоновые кислоты, альдегиды, аминогруппы, цианогруппы, этиленовые группы, гидроксильные группы, меркаптогруппы и тому подобное. Способ связывания широкого многообразия соединений с различными поверхностями хорошо известен и достаточно иллюстрирован в литературе.
Белки-прионы можно также отделить от других белков в образце применением аффинной хроматографии. Лиганды, согласно изобретению, можно прикреплять к такой твердой подложке, как смола или мембрана, и применять для связывания и удаления приона из раствора. В этом случае лиганд может сочетаться с твердой подложкой, например инертной подложкой, такой как мембрана или смола, и белокприон связывается с иммобилизованным агентом. Иммобилизованный агент/прион можно детектировать посредством антител. Если требуется, одну или более последовательностей, полученных из первоначального скрининга, можно иммобилизовать на смоле, такой как полиметакрилат или агароза. Другие типы смолы, которые можно использовать, включают в себя, например, сефарозу, сшитую агарозу, композит сшитых полисахаридов, целит, РУНЕ, акрилат, полистирол и целлюлозу. Мембраны, такие как, например, найлон и целлюлоза, также можно использовать. Смола может быть полиметакрилатной смолой.
Применение лигандов для детектирования прионов
Лиганды, описанные здесь, также являются полезными в способе детектирования присутствия или количественного определения белка-приона в биологическом образце. Биологический образец, такой как указано выше, но не ограниченный перечисленным, контактирует с лигандом в условиях, достаточных, чтобы вызвать образование комплекса между белком-прионом и лигандом. Затем комплекс детектируют общеизвестными способами, тем самым определяя присутствие приона в биологическом образце. Комплекс детектируют мечением лиганда, смешиванием меченого лиганда с образцом и детектируют меченый комплекс лиганд-прион. Лиганд метят во время получения лиганда, например во время синтеза пептида, или метку конъюгируют с лигандом связыванием ее с лигандом либо ковалентной, либо нековалентной связью. В альтернативном случае, связывающую молекулу, специфическую для лиганда, такого как антитело, метят и комплекс детектируют опосредованным путем. Широкое разнообразие меток и методик конъюгации известно и широко описано как в научной, так и патентной литературе. Подходящие метки включают в себя радиоактивные нуклеотиды, ферменты, субстраты, кофакторы, ингибиторы, флуоресцентные части, хемилюминесцентные части, магнитные частицы и тому подобное.
Детектирование можно осуществлять любым известным способом, таким как иммуноблоттинг, вестерн-анализы, анализы на замедление подвижности в геле, флуоресцентный анализ гибридизации ίη δίΐιι
- 9 014365 (ΕΙ8Η), слежение за радиоактивными или биолюминесцентными маркерами, ядерный магнитный резонанс, электронный парамагнитный резонанс, спектроскопия остановленной струи, колоночная хроматография, капиллярный электрофорез или другие способы, которые следят за молекулой на основании изменения размера и/или заряда. Конкретная метка или обнаруживаемая группа, применяемая в анализе, не является критическим аспектом изобретения. Детектируемой группой может быть любое вещество, имеющее обнаруживаемое физическое или химическое свойство. Такие детектируемые метки хорошо разработаны и, обычно, любую метку, применимую в таких способах, можно применять для настоящего способа. Таким образом, метка представляет собой любую композицию, детектируемую спектроскопическими, фотохимическими, биохимическими, иммунохимическими, электрическими, оптическими или химическими средствами. Полезными для настоящего изобретения метками являются флоуресцентные красители (например, флуоресцеин изотиоцианат, техасский красный, родамин и тому подобное), радиоактивные метки (например, 3Н, 125Ι, 358, 14С или 32Р), ферменты (например, Ьас2, САТ, пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза и другие, часто применяемые как детектируемые ферменты либо в методе ΕΙΑ, либо в методе ЕЫ8А), и такие колориметрические метки, как коллоидное золото или окрашенные стеклянные или полимерные (например, полистирольные, полипропиленовые, латексные и т.д.) гранулы. Метка может непосредственно или опосредованно сочетаться с требуемым компонентом анализа согласно способам, хорошо известным в данной области. Как указано выше, можно применять широкое разнообразие меток с выбором метки в зависимости от требуемой чувствительности, легкости конъюгации соединения, требования стабильности, имеющегося приборного оснащения и распологаемого обеспечения.
Нерадиоактивные метки часто присоединяют опосредованными средствами. Обычно молекулу лиганда (например, биотин) ковалентно связывают с молекулой. Затем лиганд связывается с молекулой антилиганда (например, стрептавидином), который либо детектируется по своей природе, либо ковалентно связывается с сигнальной системой, такой как детектируемый фермент, флуоресцентное соединение или хемилюминесцентное соединение. Можно использовать ряд лигандов и антилигандов. Когда лиганд имеет природный антилиганд, например биотин, тироксин и кортизол, то его можно применять в сочетании с мечеными антилигандами, встречающимися в природе. В альтернативном варианте, любое гаптеновое или антигенное соединение можно применять в сочетании с антителом.
Молекулы также можно конъюгировать непосредственно с соединениями, генерирующими сигнал, например, конъюгацией с ферментом или флуорофором. Ферментами, представляющими интерес как метки, главным образом являются гидролазы, конкретно фосфатазы, эстеразы и гликозидазы или оксидоредуктазы, в особенности пероксидазы. Флуоресцентные соединения включают в себя флуоресцеин и его производные, родамин и его производные, дансил, умбелиферон и т.д. Хемилюминесцентные соединения включают в себя люциферин и 2,3-дигидрофталазиндионы, например люминол.
Средства обнаружения меток хорошо известны специалисту в данной области. Поэтому, например, когда метка представляет собой радиоактивную метку, средства для обнаружения включают в себя счетчик сцинтилляций или фотографическую пленку как в авторадиографии. Когда метка представляет собой флуоресцентную метку, ее можно детектировать возбуждением флуорохрома светом с подходящей длиной волны и обнаружением образующейся флуоресценции, например, микроскопией, визуальным осмотром, через фотографическую пленку, применением электронных детекторов, таких как связанные с зарядом устройства, или фотоумножителей и тому подобное. Подобным образом ферментативные метки детектируют обеспечением подходящих субстратов для фермента и обнаружением полученного продукта реакции. Наконец, простые колориметрические метки можно детектировать просто наблюдением цвета, связанного с меткой. Таким образом, в различных анализах с указателем уровня конъюгированное золото часто оказывается розовым, в то время как различные конъюгированные гранулы оказываются цвета гранул.
Лиганды изобретения можно также применять для обнаружения мишеней, экстрагированных в раствор из твердого вещества. Например, твердый образец можно экстрагировать водой, органическим растворителем или критической жидкостью и полученный в результате супернатанат может контактировать с лигандом. Примеры твердых образцов включают в себя продукты, полученные из животного, в особенности продукты, которые подвергались воздействию агентов, которые переносят прионы, например костная мука, полученная из коровы как источника. Лиганды в некоторых вариантах осуществления можно применять для детектирования присутствия белка-приона в почве. Другие твердые образцы включают в себя ткань головного мозга, корнеальную ткань, фекальное вещество, костную муку, субпродукты из говядины, овцу, субпродукты из овцы, оленя и лося, субпродукты из оленя и лося и других животных и продукты, полученные из животных.
В альтернативном варианте комплексы прион-лиганд можно обрабатывать РК. РгРс являются очень чувствительными к РК, в то время как РгРкс частично переваривается с образованием РгРгек. Молекула РгРгек сама является очень резистентной к протеолизу. Таким образом, обработка РК будет переваривать РгРс и будет превращать резистентную к РК РгРкс в РгРгек. После удаления РК РгРгек можно денатурировать и детектировать такими антителами, как 3Е4.
В другом варианте осуществления лиганды, согласно изобретению, можно применять для селективного концентрирования РгРкс по сравнению с РгРс.
- 10 014365
Применение лигандов для определения количества прионов
Комплекс лиганд-прион или в альтернативном варианте антитело против лиганда или комплекс лиганд-прион можно детектировать и количественно определять любым из ряда средств, хорошо известных специалисту в данной области. Средства включают в себя аналитические биохимические способы, такие как спектрофотометрия, радиография, электрофорез, капиллярный электрофорез, высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), тонкослойная хроматография (ТСХ), гипердиффузионная хроматография и тому подобное, и такие различные иммунологические способы, как реакции преципитации в растворе или геле, иммунодиффузия (простая или двойная), иммуноэлектрофорез, радиоиммуноанализы (К1Лк), твердофазные иммуноферментные анализы (ЕЫ8Лк), иммунофлуоресцентные анализы и тому подобное.
Уменьшение неспецифического связывания
Любому из специалистов будет понятно, что часто требуется уменьшать неспецифическое связывание в анализах и во время удаления анализируемого вещества из образца. Когда анализ включает в себя лиганд или другой улавливающий агент, иммобилизованный на твердом субстрате, требуется минимизировать количество неспецифического связывания с твердым субстратом. Средства уменьшения такого неспецифического связывания хорошо известны специалистам в данной области. Обычно, это включает в себя покрытие субстрата белковой композицией. В особенности широко применяют композиции белка, такого как сывороточный альбумин коровы и человека (В8А), обезжиренное порошковое молоко и желатин.
Другие форматы анализа
Анализ методом вестерн-блоттинга также можно применять для детектирования и количественного определения присутствия белка-приона в образце. Обычно, метод включает в себя разделение продуктов образца электрофорезом геля на основе молекулярной массы в присутствии 8Ό8, перенос разделяемых белков к подходящей твердой подложке (такой как нитроцеллюлозный фильтр, найлоновый фильтр или дериватизированный найлоновый фильтр) и инкубирование связанного образца с указанными здесь лигандами. Лиганды специфически связываются с пептидом-прионом, фиксированным на твердой подложке. Эти лиганды непосредственно метят или в альтернативном случае их можно впоследствии детектировать, применяя меченые антитела, которые специфически связываются с лигандом.
Другие форматы анализа включают в себя липосомный иммуноанализ, в котором применяют липосомы, предназначенные для связывания специфических молекул (например, лигандов) и высвобождения инкапсулированных реагентов или маркеров. Затем высвобождаемые химические соединения детектируют по стандартным методикам.
Фармацевтические композиции
Описанные здесь лиганды, которые не сочетаются с матрицей-подложкой, являются полезными в терапевтических и профилактических применениях для лечения форм Т8Е, вызванных инфицированием млекопитающего прионовыми организмами. Лиганд может предотвращать полимеризацию РгРкс через ингибирование связывания РгРкс с РгРкс. Кроме того, он может предотвращать ингибирование связывания РгРкс с РгРс, уменьшая таким образом опосредованное РгРкс превращение РгРс в РгРкс и тем самым замедляя появление клинических симптомов. Кроме того, сами лиганды можно модифицировать присоединением реакционноспособного агента, чтобы нацелить эту молекулу на сайт аккумуляции РгРкс. Такие композиции являются подходящими для применения в различных системах доставки лекарственного средства.
Заболевания, котрые лечат согласно методу, включают в себя, но не ограничиваются перечисленными, В8Е, трансмиссивную энцефалопатию норки, губчатую энцефалопатию кошки, СУЭ, СТО, 088, фатальную инсомнию и уСГО.
Фармацевтические композиции предназначены для парентерального, местного, перорального или локального введения. Предпочтительно фармацевтические композиции вводят парентерально, например внутривенно, подкожно, внутрикожно, интраназально или внутримышечно. Таким образом, изобретение предлагает композиции для парентерального введения, которые включают в себя раствор агентов, указанных выше, растворенных или суспендированных в подходящем носителе, предпочтительно водном носителе. Можно использовать различные водные носители, например воду, забуференную воду, 0,4% раствор соли, 0,3% раствор глицина, гиалуроновую кислоту, фибриновый изолирующий материал и тому подобное. Эти композиции можно стерилизовать общепринятыми, хорошо известными методами стерилизации или можно стерилизовать фильтрованием. Полученные водные растворы можно упаковать для применения как таковых или лиофилизовать, причем лиофилизованный препарат смешивают со стерильным раствором перед введением. Композиции могут содержать фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, требуемые для аппроксимированных физиологических условий, такие как регуляторы рН и буферные агенты, агенты, регулирующие тоничность, увлажняющие агенты и тому подобное, например ацетат натрия, лактат натрия, хлористый натрий, хлористый калий, хлористый кальций, монолаурат сорбитана, триэтаноламинолеат и т.д.
Для твердых композиций можно применять общепринятые нетоксичные твердые носители, которые включают в себя, например, фармацевтические сорта маннита, лактозы, крахмала, стеарата магния, на
- 11 014365 трийсахарин, тальк, целлюлозу, глюкозу, сахарозу, карбонат магния и тому подобное. Для перорального введения фармацевтически приемлемую нетоксичную композицию получают введением любого из стандартно применяемых эксципиентов, таких как указанные ранее носители, и обычно 1-95% активного ингредиента и более предпочтительно при концентрации 25-75%.
Для аэрозольного введения активные ингредиенты предпочтительно поставляют в тонко измельченной форме вместе с сурфактантом и пропеллентом. Сурфактант должен быть, конечно, нетоксичным и предпочтительно растворимым в пропелленте. Представителем таких агентов являются сложные эфиры или неполные сложные эфиры жирных кислот, содержащих от 6 до 22 атомов углерода, таких как капроновая, октановая, лауриновая, пальмитиновая, стеариновая, линолевая, линоленовая, олестеариновая и олеиновая кислоты, с алифатическим многоатомным спиртом или его циклическим адгидридом. Можно применять смешанные сложные эфиры, такие как смешанные или природные глицериды. Также может быть включен носитель, если требуется, как, например, лецитин, для интраназальной доставки.
Вводимое количество будет изменяться в зависимости от того, что вводят, состояния млекопитающего, получающего лечение, и способа введения. При терапевтических применениях композиции вводят млекопитающему, уже страдающему от инфекции прионом, в количестве, достаточном для замедления распространения прионов или, по меньшей мере, частичного подавления симптомов заболевания и его осложнений. Количество, адекватное для выполнения этого, указывается как терапевтически эффективная доза. Количества, эффективные для этого применения, будут зависеть от тяжести заболевания, конкретной композиции и массы и общего состояния реципиента. Обычно доза будет в интервале от приблизительно 1 до приблизительно 5 мг в день, предпочтительно приблизительно 100 мг в день для 70 кг пациента.
Пример 1. Идентификация прионсвязывающих лигандов.
Прионсвязывающие лиганды, описанные в нижеприведенной таблице, были идентифицированы следующим образом.
Синтезы библиотеки миметиков
Были синтезированы две комбинаторные библиотеки 8x8 миметических лигандов на активированной эпоксидом подложке РигаЬеаб 6ΚΓ (библиотека А и библиотека В). РигаВеаб бУБ представляет собой подложку из пористой гранулированной агарозы, которая сшита, чтобы повысить прочность. Способы синтеза были подобны тем, которые описаны в УО 97/10887, и может легко повторить практический специалист в данной области.
Итак, после завершения синтеза каждый член библиотеки, включающий в себя триазиновую часть, связывался с РигаЬеаб 6ΚΓ гибким аминированным спейсером. Триазиновый компонент каждого члена библиотеки дополнительно замещали двумя другими аминами.
Библиотека А.
Гибкий аминированный спейсер для этой библиотеки имел в длину три атома углерода, и его вводили последовательной реакцией сшитой РигаЬеаб 6КГ с эпихлоргидрином и аммиаком. В табл. 1 суммировали дополнительные два амина, введенные в триазин каждого члена библиотеки, причем эти амины соответствуют группам -Ζ-К1 и -Υ-К2 формулы (I). Амины обозначили нижеследующими числами, лиганды идентифицировали как 1/1, включающие в себя две 2-адамантаминовые группы, которые идентифицировали как 2/1, включающие в себя одну 4-(2-аминоэтил)морфолиновую группу и одну 2адамантаминовую группу, и т. д.
= 2-адамантамин = 4-(2-аминоэтил)морфолин = 1-(2-аминоэтил)пиперидин = 1-(2-аминоэтил)пиперазин = (+/-)-2-аминонорборнан = 1-(2-аминопропил)-2-пирролидинон = 3-аминохинуклидин = 1-(2-гидроксиэтил)пиперазин = Ν,Ν-диметилэтилендиамин
- 12 014365
Таблица 1
1/1 . 2/1 ' 3/1 5/1 6/1 7/1 8/1 9/1
1/2 2/2 3/2 5/2 6/2 7/2 8/2 9/2
1/3 2/3 3/3 5/3 6/3 7/3 8/3 9/3
1/4 2/4 3/4 5/4 6/4 7/4 8/4 9/4
1/5 2/5 3/5 5/5 6/5 7/5 8/5 9/5
1/7 2/7 3/7 5/7 6/7 7/7 8/7 9/7
1/8 2/8 3/8 5/8 6/8 7/8 8/8 9/8
1/9 2/9 3/9 5/9 6/9 7/9 8/9 9/9
Загрузка лиганда на смолу была 12 ммол./г отвержденной смолы, как определили анализом свободного амина после присоединения аминированного спейсера, и анализом хлорида, высвобождаемого после присоединения трихлортриазина к аминированному спейсеру.
Библиотека В.
Подвижный аминированный спейсер для этой библиотеки имел в длину десять атомов углерода и был введен последовательной реакцией сшитой РитаЬеаб 6ХЬ с 1,4-бутандиолдиглицидиловым простым эфиром и аммиаком. В табл. 2 суммировали дополнительные два амина, введенные в триазин каждого члена библиотеки, причем амины обозначены следующими числами:
= β-аланин = 2-аминоэтилпиридин = 3-аминобензиловый спирт = фенетиламин = тирамин = 4-фторбензиламин = 4-метилбензиламин = 2-(4-хлорфенил)этиламин = триптамин = глицин
- Ь-глутаминовая кислота = ОЬ-валин = 5-аминовалериановая кислота = 4-аминомасляная кислота = Ь-тирозин = ε-аминокапроновая кислота
Таблица 2
10/11 19/11 20/11 21/11 22/11 23/11 24/11 25/11
10/12 19/12 20/12 21/12 22/12 23/12 24/12 25/12
10/13 19/13 20/13 21/13 22/13 23/13 24/13 25/13
10/14 19/14 20/14 21/14 22/14 23/14 24/14 25/14
10/15 19/15 20/15 21/15 22/15 23/15 24/15 25/15
10/16 19/16 20/16 21/16 22/16 23/16 24/16 25/16
10/17 19/17 20/17 21/17 22/17 23/17 24/17 25/17
10/18 19/18 20/18 21/18 22/18 23/18 24/18 25/18
Загрузка лиганда на смолу была 19 ммол./г отвержденной смолы, как определили анализом свободного амина после присоединения аминированного спейсера и анализом хлорида, высвобождаемого после присоединения трихлортриазина к аминированному спейсеру.
Скрининг связывания библиотеки миметиков
Библиотеку перемещали несколько раз, что обеспечивало возможность осаждаться и вытекать самотеком, с последующими 2 промываниями 1 мл воды и 1 промыванием 1 мл 10 мМ РВ8, рН 7,4 на лунку. Лунки останавливали и добавляли 0,5 мл РВ8 на лунку. Библиотеку сохраняли в течение ночи в холодильнике. Две пробирки, содержащие 1,8 мл 10% гомогената головного мозга хомяка (НаВН) в каж
- 13 014365 дой, доставали из хранилища в жидком азоте и оттаивали. В каждую пробирку добавляли 180 мкл 5% саркозила. Суспензию инкубировали при переворачивании в течение 30 мин при комнатной температуре с последующим центрифугированием в течение 10 мин при 13400 об./мин в настольной микроцентрифуге. Супернатанат собирали и разбавляли 1:10 РВ8 (окончательное разбавление НаВН 1:100). Библиотеку освобождали от жидкости самотеком и добавляли 500 мкл раствора НаВН на лунку и освобождали от раствора самотеком в планшет для сбора. После того как лунки были освобождены от раствора, каждую лунку промывали дополнительно 500 мкл РВ8, который собирали в тот же планшет для сбора. Этот планшет для сбора был помечен как несвязанный. В каждую лунку добавляли 500 мкл 1М №1С1 в РВ8 и собирали в другой планшет для сбора, помеченный как элюирование солью, с последующим добавлением 500 мкл 2% раствора уксусной кислоты, также собранного в планшет для сбора, помеченный как элюирование уксусной кислотой. Аликвоты смолы, каждая по 26 мкл, переносили в пробирки микроцентрифуги и сохраняли для анализа оставшегося связанного приона. Растворы, обозначенные как несвязанный, элюирование солью и элюирование уксусной кислотой, замораживали в планшетах для сбора.
Разведения раствора НаВН при конечных концентрациях 1:200 и 1:500 применяли как контроль для анализов методом 8Э8-РАСЕ и вестерн-блоттинга.
Анализы несвязанных фракций методами вестерн-блоттинга и 8Б8-РАСЕ мкл каждого из несвязанных образцов добавляли к 50 мкл 2Х образца буфер/восстанавливающий агент (смесь образца буфера 1иуйтодеи ШРАСЕ ЬЭ8 4Х (25 мкл), образца восстанавливающего агента 1иуйтодеи ЫиРАСЕ (10 мкл) и воды сорта АС8 (15 мкл)). Каждую пробирку нагревали при 90°С в течение 10 мин.
Дупликатные гели подвергали электрофорезу, чтобы осуществлять анализ общего белка методом вестерн-блоттинга и 8Ό8 РАСЕ. Формат образцов в каждой из 17 лунок с гелем был следующим:
Лунка Анализируемый образец Объем (мкл)
1 1пУ11;годеп ЗееВ1ие плюс 2 маркера молекулярной массы (Са£#БС5925) 5
2 Гомогенат головного мозга хомяка (1:200) 10
3 Гомогенат головного мозга хомяка (1:500) 10
4-17 14 различных «несвязанных» образцов 10
17-Луночную кассету геля МиРАСЕ промывали деионизированной водой. Белую полоску ленты и гребенку удаляли, дорожки промывали рабочим буфером 1Х ЫиРАСЕ МЕ8 (Са1#№0002), и кассету помещали в резервуар модуля для геля Хсе11 М1ш-Се1 Моби1е (или совместимый). Центральный резервуар заполняли 200 мл рабочего буфера 1Х ЫиРАСЕ МЕ8, содержащего 500 мкл антиоксиданта ЫиРАСЕ (Са1#№0005). После проверки на просачивание, внешний резервуар заполняли рабочим буфером 1Х М.1РАСЕ МЕ8 (без добавления антиоксиданта), Модуль М1ш-Се1 присоединяли к совместимому источнику энергии и проводили электрофорез геля приблизительно в течение 45 мин при постоянном напряжении 200 В до тех пор, пока фронт красителя будет в 0,5 см от дна геля.
81)8 РАСЕ
Гель удаляли из кассеты геля и промывали три раза водой АС8 (25 мл, 5 мин). Гель окрашивали в течение 1 ч 1иуйтодеи 81шр1уВ1ие 8аГе51аш, перед обесцечиванием трехкратным промыванием водой АС8 (25 мл, 1 ч).
Вестерн-блоттинг
17-Луночную кассету геля ЫиРАСЕ (са1#ПР0349) промывали деионизированной водой и дорожки промывали рабочим буфером 1Х ЫиРАСЕ. Гель помещали в модуль Хсе11 М1ш-Се1 (1иуйпдеи са1#Е10001) или совместимое устройство. Нижнюю камеру заполняли рабочим буфером 1Х из исходного раствора (рабочий буфер 1иуйтодеи 20Х ЫиРАСЕ МЕ8 са1#№0002 или са1#№0002-02). Верхнюю камеру заполняли рабочим буфером 1Х, содержащим антиоксидант (1иуйтодеи са1#№0005).
К каждому образцу добавляли образец буфера, содержащий восстанавливающий агент (1иуйпдеи са1#№0007 и са1#№0004) и образцы нагревали при 90°С в течение 10 мин, кратковременно центрифугировали и загружали по 5 мкл каждого образца. Загружали также 5 мкл маркера молекулярной массы (1иуйтодеи са1#ЬС5925). Гель подвергали электрофорезу в течение 45 мин при постоянном напряжении 200
- 14 014365
В. После завершения электрофореза кассету удаляли из ячейки, открывали и удаляли гель. Гель пропитывали в охлажденном буфере для блоттинга в течение 5 мин.
Блоттинг-мембрану смачивали метанолом, переносили в буфер для блоттинга и инкубировали в течение 2x10 мин при перемешивании. Электродный буфер для блоттинга из исходного раствора (Шуйгодеп са!#№0006-1) получали добавлением 20% метанола и антиоксиданта и охлаждали перед применением. Резервуар камеры для блоттинга (ВюКаб са!#170-4070) заполняли наполовину охлажденным буфером для электроблоттинга. Кассету ячейки ВюКаб для блоттинга в пластиковом лотке с кассетой ВюКаб для блоттинга приготовляли с адекватными объемами охлажденного буфера для электроблоттинга. Сендвич для блоттинга приготовляли наслаиванием последовательно губки, фильтровальной бумаги, РУЭР мембраны для блоттинга Цпуйгодеп са!#ЬС2005), геля, фильтровальной бумаги и губки. Кассету складывали и закрывали зажимом. Гели подвергали электрофорезу в течение 45 мин при постоянном напряжении 100 В в камере при комнатной температуре.
После электрофореза мембрану помещали в чистую чашку и инкубировали в течение 1 ч на качающейся платформе при комнатной температуре в 25 мл блокирующего агента ХУеЧегп Вгеехе из хемилюминесцентного набора ХУеЧегп Вгеехе. апй-Моике (са1#\УВ7104).
Затем мембрану инкубировали в растворе при разведении 1:10000 исходного раствора первичного антитела 81дпе! 3Р4, мышиных моноклональных антител 3Р4 (ΝΟΝΕΤ, са!#9620) в 20 мл свежего №е§1егп Вгеехе Рпшагу АпНЬобу Эбиеп! в течение ночи, при охлаждении на качающейся платформе. Блот промывали 3 раза в 20 мл ХУеЧегп Вгеехе АпБЬобу \Уа511 и затем мембрану инкубировали в разведении 1:10000 вторичных антител КРЬ-АР (КРЬ, са!#075-1802) в 20 мл ХУеЧегп Вгеехе Рпшагу АпБЬобу Эбиеп! в течение 60 мин при комнатной температуре на качающейся платформе. Блот промывали, как указано выше, затем промывали 20 мл 20 мМ Тгй-НСЕ 1мМ МдС12 при рН 9,8 в течение 10 мин при комнатной температуре. Мембрану переносили в сухую чистую чашку и пропитывали 5 мл предварительно смешанного хемилюминесцентного субстрата ХУеЧегп Вгеехе (СЭР 81аг) в течение 5 мин при энергичном перемешивании. Щелочной фосфатазе давали возможность взаимодействовать в течение 30 мин. Блот переносили в листовом протекторе к кассете с пленкой и экспонировали на пленку (АшегкИаш са!#КР№ 3130К) в течение 5 мин при комнатной температуре и проявляли в проявителе.
Пример 2. Применение лиганда 5/4, прикрепленного к агарозе, для улавливания РгРс из концентрата эритроцитов.
Адсорбент, включающий в себя лиганд 5/4, присоединенный к базовой матрице РигаЬеаб 6X1, синтезировали, как описано в примере 1, для получения соединения формулы (VI)
Образец 10% мас./об. стандартного гомогената головного мозга хомяка в РВ8 буфере (100 мкл) оттаивали и добавляли 10 мкл 10% (мас./об.) саркозила, интенсивно перемешивали и сохраняли во льду в течение 30 мин. Смесь центрифугировали при 14000 об./мин в течение 5 мин при +4°С и супернатант удаляли. Концентрат эритроцитов человека (КВСС; 250 мл) смешивали с адсолом (110 мл) и смесь энергично перемешивали переворачиванием. Разбавленные КВСС (1,8 мл) удаляли и смешивали с 0,2 мл раствора гомогената головного мозга хомяка.
Суспензию 1:1 (400 мкл) соединения (VI) в 40 мМ смеси цитратный буфер/280 мМ №С1, рН 7,0 добавляли к 1,0 мл микроколонке и давали ей возможность вытекать самотеком. Гомогенизат головного мозга хомяка в КВСС (1 мл) пипетировали на осажденный аффинный адсорбент и давали ему возможность вытекать. Адсорбент затем промывали 1 мл суспензионного буфера и давали возможность жидкости вытекать. Оба потока в виде фракций собирали, объединяли и сохраняли при -20°С.
Аффинный адсорбент удаляли из колонки суспендированием в 0,5 мл суспензионного буфера и переносили в пробирку для замораживания. Объем перенесенного аффинного адсорбента регистрировали после того, как содержимому пробирки давали возможность оседать и объем супернатаната регулировали для получения взвеси 1:1. Образец (200 мкл) переносили в пробирку микроцентрифуги для применения в анализе методом 8Э8-РАСЕ и методом вестерн-блоттинга связанного приона, как описано в примере 1.
Присутствие сильных полос при проведении вестерн-блоттинга, соответствующих РгРс хомяка, указывало, что лиганд 5/4, присоединенный к РигаЬеаб бАБ (гранулированной матрице агарозы) способен селективно связывать РгРс из концентрата эритроцитов человека.
Пример 3. Получение связывающих прион лигандов, прикрепленных к гранулам полиметакрилатной смолы.
- 15 014365
Этот пример описывает получение ряда лигандов, содержащих амины, применяемых в библиотеках А и В, но на аминированных полиметакрилатных подложках (Тоуореаг1 650М)Б, а не на агарозе.
3.1. Дихлортриазиновое производное аминированной Тоуореаг1 650М.
Тоуореаг1 АР - Атшо-650М (36 г) промывали на воронке с фильтром из спекшегося стекла десятью порциями (36 мл) воды для обратного осмоса, затем давали возможность воде вытекать из геля и его повторно суспендировали в 1М фосфате калия при рН 7,0 (36 мл). Давали возможность вытекать воде из геля и затем повторно суспендировали в 1М фосфате калия при рН 7,0 (27 мл) и воде для обратного осмоса (27 мл). Эту смесь переносили в стеклянный реакционный сосуд с перемешиванием и добавляли 54 мл ацетона. Смесь охлаждали до 0°С, затем к ней добавляли хлорангидрид циануровой кислоты (2,7 г), растворенный в холодном (0°С) ацетоне (27 мл), и смесь перемешивали в течение 1 ч при 0-4°С. Полученную взвесь дихлортриазином активированного продукта выливали на фильтр из спекшегося стекла и промывали водным ацетоном (50% об./об., 180 мл), водой для обратного осмоса (180 мл), водным ацетоном (50% об./об., 180 мл) и водой для обратного осмоса (360 мл).
3.2 Монохлортриазиновые промежуточные продукты.
Различные монохлортриазиновые промежуточные продукты получали из активированного дихлортриазином Тоуореаг1 650М, следующим образом.
3.2.1. Аддукт монохлортриазинового аминированного Тоуореаг1 650М с 1-(2-аминоэтил)пиперидином (амин 3) получали растворением 1-(2-аминоэтил)пиперидина (0,47 г) в ΚΟ-воде (28,8 мл) и охлаждением раствора до 4°С. Эту смесь добавляли к 7 г активированного дихлортриазином аминированного Тоуореаг1, освобождали от жидкости вытеканием на фильтр из спекшегося стекла, продукт переносили в пластиковый реакционный сосуд и охлаждали до 4°С. Смесь встряхивали при 4°С в течение 2 ч, затем смесь выливали на фильтр из спекшегося стекла, промывали водным ДМФ (50% об./об., 35 мл), водой для обратного осмоса (70 мл), затем давали возможность жидкости вытекать на фильтр из спекшегося стекла.
3.2.2. Аддукт монохлортриазинового аминированного Тоуореаг1 650М с (+/-) 2-аминонорборнаном (амин 5) получали растворением (+/-) 2-аминонорборнана (0,82 г) в водном ДМФ (13,3% об./об., 57,68 мл) и охлаждением раствора до 4°С. Эту смесь добавляли к 14 г активированного дихлортриазином аминированного Тоуореаг1 650М, который был освобожден от воды вытеканием на фильтр из спекшегося стекла, переносили в пластиковый реакционный сосуд и охлаждали до 4°С. Смесь встряхивали в течение 2 ч при 4°С, затем смесь выливали на фильтр из спекшегося стекла и промывали водным ДМФ (50% об./об., 70 мл), водой для обратного осмоса (140 мл), затем давали возможность стекать жидкости на фильтре из спекшегося стекла.
3.2.3. Аддукт монохлортриазинового аминированного Тоуореаг1 650М с Ь-глутаминовой кислотой (амин 20) получали растворением Ь-глутаминовой кислоты (0,515 г) в водном ДМФ (50% об./об., 28,0 мл) и водном гидроксиде натрия (10М, 0,7 мл), затем охлаждением раствора до 4°С. Эту смесь добавляли к активированному дихлортриазином аминированному Тоуореаг1 (7 г), которую освобождали от жидкости вытеканием на фильтр из спекшегося стекла, продукт переносили в пластиковый реакционный сосуд и охлаждали до 4°С. Смесь встряхивали в течение 70 мин при 4°С, затем смесь выливали на фильтр из спекшегося стекла и промывали водным ДМФ (50% об./об., 70 мл), водой для обратного осмоса (140 мл), затем давали возможность жидкости стекать на фильтре из спекшегося стекла.
3.2.4. Аддукт монохлортриазинового аминированного Тоуореаг1 650М с 5-аминовалериановой кислотой (амин 22) получали растворением 5-аминовалериановой кислоты (0,41 г) в водном ДМФ (50% об./об., 28,5 мл) и водном гидроксиде натрия (10М, 0,35 мл) и охлаждением раствора до 4°С. Эту смесь добавляли к 7 г активированного дихлортриазином аминированного Тоуореаг1, которую освобождали от жидкости вытеканием на фильтр из спекшегося стекла, переносили в полимерный реакционный сосуд и охлаждали до 4°С. Смесь встряхивали в течение 60 мин при 4°С, затем смесь освобождали от жидкости выливанием на фильтр из спекшегося стекла и промывали водным ДМФ (50% об./об., 70 мл), водой для обратного осмоса (140 мл), затем давали возможность жидкости стекать на фильтре из спекшегося стекла.
3.2.5. Аддукт монохлортриазинового аминированного Тоуореаг1 650М с глицином (амин 19) получали растворением глицина (0,563 г) в водном ДМФ (50% об./об., 61,4 мл) и водном гидроксиде натрия (10М, 0,75 мл) и охлаждением раствора до 4°С. Эту смесь добавляли к 15 г активированного дихлортриазином аминированного Тоуореаг1, которую освобождали от жидкости вытеканием на фильтр из спекшегося стекла, переносили в пластиковый реакционный сосуд и охлаждали до 4°С. Смесь встряхивали в течение 60 мин при 4°С, затем смесь выливали на фильтр из спекшегося стекла и промывали водным ДМФ (50% об./об., 75 мл), водой для обратного осмоса (150 мл), затем давали возможность жидкости стекать на фильтре из спекшегося стекла.
3.3. Конечные продукты.
Растворы аминов для вторых стадий реакций получали следующим образом:
3.3.1. 1-(2-Аминоэтил)пиперидин (амин 3; 0,94 г) растворяли в ΚΌ-воде (10,8 мл).
3.3.2. 1-(2-Аминоэтил)пиперазин (амин 4; 1,90 г) растворяли в ΚΟ-воде (21,6 мл), затем разделяли на две части (11,8 мл каждая).
- 16 014365
3.3.3. 2-(2-Аминоэтил)пиридин (амин 11; 0,84 мл) растворяли в водном ΌΜΡ (50% об./об., 10,9 мл).
3.3.4. Фенилэтиламин (амин 13; 0,88 мл) растворяли в водном ΌΜΡ (50% об./об., 10,9 мл), приготавливали в виде двух равных частей.
3.3.5. Тирамин (амин 4; 0,96 г) растворяли в ДМФ (10,8 мл). Реакционные смеси собирали из комбинаций соответствующего монохлортриазинового промежуточного продукта и амина второй стадии в пластиковых реакционных сосудах, объем раствора монохлортриазинового полупродукта синтеза (7 г) и раствора амина доводили до общего объема 35 мл, включая 5,75 мл ΚΌ-воды в 7 г монохлортриазинового полупродукта синтеза. Каждый сосуд перемешивали переворачиванием при 60°С в течение 24 ч. Затем гели промывали водным ДМФ (50% об./об., 35 мл), водой для обратного осмоса (35 мл), 0,1М соляной кислотой (35 мл), водным изопропанолом (30% об./об.), содержащим гидроксид натрия (0,2М) (35 мл), водой для обратного осмоса (70 мл) и водным этанолом (20% об./об., 21 мл) и сохраняли в водном этаноле (20% об./об.) при 4°С.
Пример 4. Применение связывающих прион лигандов, прикрепленных к полиметакрилатной смоле, для улавливания РгРс из концентрата эритроцитов.
Соединения, содержащие аффинные лиганды, прикрепленные к гранулированной полиметакрилатной матрице (Тоуореаг1), синтезировали, как описано в примере 3. Экстракт (1% мас./об.) инфицированного скрепи головного мозга хомяка, введенный иглой в концентрат эритроцитов человека (КВСС), получали с применением методики, описанной для стандартного гомогенизата головного мозга хомяка (пример 2). Связывание РгРкс полиметакрилатными аффинными адсорбентами оценивали наполнением взвесей адсорбента в 1 мл микроколонки и контрольным заражением введением иглой КВСС с применением методики, описанной в примере 2. Анализ методом 8Э8-РЛСЕ и вестерн-блоттинга образцов, экстрагированных из аффинных адсорбентов, производили, как описано в примере 1, за исключением того, что второй набор аликвот образцов обрабатывали протеиназой К перед смешиванием с восстанавливающим буфером 8Э8-РЛСЕ.
Анализы методом вестерн-блоттинга показали, что полиметакрилатные смолы, содержащие лиганды 5/4, 19/13, 5/3, 22/13 и 19/14, все демонстрировали высокую аффинность к РгРкс в присутствии концентрата эритроцитов человека. Связывание РгРкс подтверждали сравнением характера профиля полос вестерн-блоттинга, полученного обработкой +/- протеиназой К. Присутствие четко видимых полос несколько более низкой молекулярной массы для образца, обработанного протеиназой К, по сравнению с необработанным образцом, подтвердило связывание резистентной к протеиназе К формы (инфекционной формы) РгР.
Пример 5. Применение связывающих прион лигандов, прикрепленных к полиметакрилатной смоле для улавливания патогенного приона спорадического СГО человека из концентрата эритроцитов человека.
Эксперимент, описанный в примере 4, повторяли с применением КВСС, введенных иглой, с 1% (мас./об.) гомогената головного мозга человека со спорадическим СГО. Анализы методом вестернблоттинг показали, что полиметакрилатные смолы, содержащие все лиганды 5/4, 19/13, 5/3, 22/13 и 3/4, все демонстрировали высокое сродство к РгР из головного мозга человека со спорадическим СГО в присутствии концентрата эритроцитов.
Пример 6. Применение лиганда 5/4, прикрепленного к гранулам полиметакрилатной смолы, для улавливания РгРкс из плазмы человека и крови человека.
Аффинный адсорбент, содержащий лиганд 5/4, прикрепленный к гранулированной полиметакрилатной матрице (Тоуореаг1), синтезировали, как описано в примере 3. Экстракты (1% мас./об.) инфицированного скрепи головного мозга хомяка, введенные иглой в объединенную плазму человека и цельную кровь человека, получали с применением методики, описанной для стандартного гомогената головного мозга хомяка и КВСС (пример 2). Связывание РгРкс полиметакрилатными аффинными адсорбентами оценивали наполнением взвеси адсорбента в 1 мл микроколонки и контрольным заражением введенной иглой образцами плазмы и цельной крови с применением методики, описанной в примере 2. Анализ методом 8Э8-РЛСЕ и методом вестерн-блоттинг образцов, экстрагированных из аффинных адсорбентов, осуществляли, как описано в примере 1, за исключением того, что второй набор аликвот образцов обрабатывали протеиназой К перед смешиванием с восстанавливающим буфером 8Э8-РЛСЕ.
Анализ методом вестерн-блоттинг показал, что полиметакрилатные смолы, содержащие лиганды 5/4, демонстрировали высокое сродство к РгРкс в присутствии плазмы человека и цельной крови человека. Связывание РгРкс подтверждали сравнением характера профиля полос вестерн-блоттинга, полученного обработкой +/- протеиназой К. Присутствие четко видимых полос несколько более низкой молекулярной массы для образца, обработанного протеиназой К, по сравнению с необработанным образцом, подтвердило связывание резистентной к протеиназе К формы (инфекционной формы) РгР.
Для специалиста в данной области будет очевидно, что лиганд 5/4 и другие описанные здесь лиганды, прикрепленные к матрице подложки, такой как полиметакрилат, в особенности полезны для улавливания и концентрирования широкого разнообразия форм белка приона из различных компонентов крови, включая цельную кровь, КВСС и плазму. Следовательно, такие вещества представляют собой исключительную ценность для удаления РгР из таких компонентов и как средства концентрирования РгР, чтобы
- 17 014365 помочь последующему детектированию и количественному определению.
Хотя способы и вещества, подобные или эквивалентные тем, которые описаны здесь, можно применять на практике или для тестирования настоящего изобретения, подходящие способы и вещество описаны выше. Все публикации, области применения патента, патенты и другие цитируемые ссылки, указанные здесь, включены в качестве ссылок во всей их полноте. Кроме того, вещества, способы и примеры являются только иллюстративными и не предназначены для ограничения.
Приведенное выше описание предложено для описания различных вариантов осуществления, относящихся к изобретению. Для этих вариантов осуществления и/или структур можно сделать различные модификации, добавления и исключения, не выходящие за пределы объема и сущности изобретения.

Claims (12)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Применение соединения формулы (I) (О в которой Я3 представляет собой водород или заместитель арильной группы или Я3 представляет собой твердую подложку, необязательно прикрепленную через спейсер;
    Ζ представляет собой атом кислорода, атом серы или NЯ4;
    Υ представляет собой атом кислорода, атом серы или NЯ5;
    где Я4 и Я5, которые могут быть одинаковыми или разными, представляют собой водород, необязательно замещенный алкил, содержащий 1-6 атомов углерода, необязательно замещенный фенил, необязательно замещенный бензил или необязательно замещенный β-фенилэтил;
    один из X1 и X2 представляет собой атом азота, а другой из X1 и X2 представляет собой атом азота или СЯ6, где Я6 представляет собой водород или заместитель арильной группы;
    Я1 представляет собой группу -(СН2)т-р!, где т равно 0-7 и О' представляет собой -NЯ11Я12, где Я11 и Я12 вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют необязательно замещенную гетероциклоалкильную группу; и
    Я2 представляет собой группу -(СН2),-О2. в которой η равно 0-7 и р2 представляет собой 21 22 23 21 22 23
    СЯ Я Я или -NЯ Я , где Я представляет собой водород, алкил, циклоалкил или гетероциклоалкил, или два из Я21 и Я22 вместе с атомом углерода или азота, к которому они присоединены, образуют необязательно замещенную циклоалкильную или необязательно замещенную гетероциклоалкильную группу;
    причем алкил относится к нормальному или разветвленному насыщенному углеводороду, имеющему 1-15 атомов углерода; и когда алкильная группа описана как необязательно замещенная, то такая группа может быть замещена одним или более заместителями;
    заместитель алкильной группы относится к гидроксилу, амино, алкилу, галогену, гидроксиалкилу, амидо, ацилу, ациламино, алкокси, алкоксикарбонилу, алкилендиокси, алкилсульфинилу, алкилсульфонилу, алкилтио, ароил, ароиламино, арилу, арилалкокси, арилалкоксикарбонилу, арилалкилтио, арилокси, арилоксикарбонилу, арилсульфинилу, арилсульфонилу, арилтио, карбокси (или биоизостеру кислоты), циано, гетероароилу, гетероарилу, гетероарилалкилокси, гетероароиламино, гетероароилокси, нитро или трифторметилу;
    циклоалкил относится к насыщенной моноциклической, бициклической или полициклической кольцевой системе из 3-12 углеродых атомов с боковой цепью или без нее, и необязательно прерванной (С=О)-; и когда циклоалкильная группа описана как необязательно замещенная, то такая группа может быть замещена одним или несколькими заместителями алкильной группы;
    арил как группа или часть группы относится к а) необязательно замещенной моноциклической или полициклической ароматической карбоциклической группе из 6-18 атомов углерода; или Ь) необязательно замещенной, частично насыщенной полициклической ароматической карбоциклической части, в которой арил и циклоалкил, циклоалкенил, гетероциклоалкил или гетероциклоалкенил конденсированы вместе с образованием циклической структуры; и когда арильную группу описывают как необязательно замещенную, то такая группа может быть замещена одним или несколькими заместителями арильной группы;
    заместитель арильной группы относится к гидроксилу, амино, алкилу, галогену, гидроксиалкилу, амидо, ацилу, ациламино, алкокси, алкоксикарбонилу, алкилендиокси, алкилсульфинилу, алкилсульфонилу, алкилтио, ароилу, ароиламино, арилу, арилалкокси, арилалкоксикарбонилу, арилалкилтио, арилокси, арилоксикарбонилу, арилсульфинилу, арилсульфонилу, арилтио, карбокси (или биоизостеру кислоты), циано, гетероароилу, гетероарилу, гетероарилалкилокси, гетероароиламино, гетероарилокси, нитро, оксо или трифторметилу;
    гетероарил как группа или часть группы относится к а) необязательно замещенному моноцикличе
    - 18 014365 скому арилу, в котором один или несколько членов кольца и/или элементов кольца другой, чем углерод, необязательно замещены одним или несколькими заместителями арильной группы; или Ь) необязательно замещенной частично насыщенной полициклической гетерокарбоциклической частью, в которой гетероарильные и циклоалкильные, циклоалкенильные, гетероциклоалкильные или гетероциклоалкенильные группы конденсированы вместе с образованием циклической структуры и когда гетероарильная группа описана как необязательно замещенная, то такая группа может быть замещена одним или несколькими заместителями арильной группы;
    гетероциклоалкил относится к циклоалкильной группе по меньшей мере с одним атомом углерода цикла, замененным гетероатомом или группой, содержащей гетероатом, например О, 8, N или ΝΚ7, где В7 представляет собой водород или алкил, и когда гетероциклоалкильная группа описана как необязательно замещенная, то такая группа может быть замещена одним или несколькими заместителями алкильной группы;
    спейсер относится к необязательной части, которая связывает аффинный лиганд с матрицейподложкой;
    для аффинного связывания белка приона.
  2. 2. Способ обнаружения белка приона в образце и/или удаления белка приона из образца, включаюший в себя контактирование образца с соединением формулы (I) по п.1.
  3. 3. Способ лечения или замедления развития ассоциированной с прионом патологии субъекта, человека или животного, включающий в себя введение субъекту терапевтически эффективного количества соединения формулы (I) по п.1, которое не связано с твердой подложкой.
  4. 4. Применение соединения формулы (I) по п.1, которое не связано с твердой подложкой, при изготовлении лекарственного средства для лечения ассоциированной с прионом патологии.
  5. 5. Соединение формулы (I) (О в которой В3 представляет собой водород или заместитель арильной группы или В3 представляет собой твердую подложку, необязательно прикрепленную через спейсер;
    Ζ представляет собой атом кислорода, атом серы или ΝΚ4;
    Υ представляет собой атом кислорода, атом серы или ΝΚ5;
    где В4 и В5, которые могут быть одинаковыми или разными, представляют собой водород, необязательно замещенный алкил, содержащий 1-6 атомов углерода, необязательно замещенный фенил, необязательно замещенный бензил или необязательно замещенный β-фенилэтил;
    X1 и X2, оба, представляют собой атом азота;
    В1 представляет собой группу -(СН2)т-ф1, где т равно 1-3 и ф1 представляет собой -ХВ11В12, где В11 и В12 вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют необязательно замещенную гетероциклоалкильную группу; и
    В2 представляет собой группу -(СН2)п-ф2, в которой п равно 0-4, более предпочтительно 0-2, ф2 представляет собой -СВ21В22В23 или -МК21В22, где В23 представляет собой водород, алкил, циклоалкил или гетероциклоалкил, или два из В21 и В22 вместе с атомом углерода или азота, к которому они присоединены, образуют необязательно замещенную циклоалкильную или необязательно замещенную гетероциклоалкильную группу;
    причем алкил относится к нормальному или разветвленному насыщенному углеводороду, имеющему 1-15 атомов углерода; и когда алкильная группа описана как необязательно замещенная, то такая группа может быть замещена одним или более заместителями;
    заместитель алкильной группы относится к гидроксилу, амино, алкилу, галогену, гидроксиалкилу, амидо, ацилу, ациламино, алкокси, алкоксикарбонилу, алкилендиокси, алкилсульфинилу, алкилсульфонилу, алкилтио, ароил, ароиламино, арилу, арилалкокси, арилалкоксикарбонилу, арилалкилтио, арилокси, арилоксикарбонилу, арилсульфинилу, арилсульфонилу, арилтио, карбокси (или биоизостеру кислоты), циано, гетероароилу, гетероарилу, гетероарилалкилокси, гетероароиламино, гетероароилокси, нитро или трифторметилу;
    циклоалкил относится к насыщенной моноциклической, бициклической или полициклической кольцевой системе из 3-12 углеродых атомов с боковой цепью или без нее, и необязательно прерванной (С=О)-; и когда циклоалкильная группа описана как необязательно замещенная, то такая группа может быть замещена одним или несколькими заместителями алкильной группы;
    арил, как группа или часть группы, относится к а) необязательно замещенной моноциклической или полициклической ароматической карбоциклической группе из 6-18 атомов углерода; или Ь) необязатель
    - 19 014365 но замещенной, частично насыщенной полициклической ароматической карбоциклической части, в которой арил и циклоалкил, циклоалкенил, гетероциклоалкил или гетероциклоалкенил конденсированы вместе с образованием циклической структуры; и когда арильную группу описывают как необязательно замещенную, то такая группа может быть замещена одним или несколькими заместителями арильной группы;
    заместитель арильной группы относится к гидроксилу, амино, алкилу, галогену, гидроксиалкилу, амидо, ацилу, ациламино, алкокси, алкоксикарбонилу, алкилендиокси, алкилсульфинилу, алкилсульфонилу, алкилтио, ароилу, ароиламино, арилу, арилалкокси, арилалкоксикарбонилу, арилалкилтио, арилокси, арилоксикарбонилу, арилсульфинилу, арилсульфонилу, арилтио, карбокси (или биоизостеру кислоты), циано, гетероароилу, гетероарилу, гетероарилалкилокси, гетероароиламино, гетероарилокси, нитро, оксо или трифторметилу;
    гетероарил как группа или часть группы относится к а) необязательно замещенному моноциклическому арилу, в котором один или несколько членов кольца и/или элементов кольца другой, чем углерод, необязательно замещены одним или несколькими заместителями арильной группы; или Ь) необязательно замещенной частично насыщенной полициклической гетерокарбоциклической частью, в которой гетероарильные и циклоалкильные, циклоалкенильные, гетероциклоалкильные или гетероциклоалкенильные группы конденсированы вместе с образованием циклической структуры, и когда гетероарильная группа описана как необязательно замещенная, то такая группа может быть замещена одним или несколькими заместителями арильной группы;
    гетероциклоалкил относится к циклоалкильной группе, по меньшей мере с одним атомом углерода цикла, замененным гетероатомом или группой, содержащей гетероатом, например О, 8, N или ΝΚ7, где Я7 представляет собой водород или алкил, и когда гетероциклоалкильная группа описана как необязательно замещенная, то такая группа может быть замещена одним или несколькими заместителями алкильной группы;
    спейсер относится к необязательной части, которая связывает аффинный лиганд с матрицейподложкой.
  6. 6. Соединение по п.5, где т равно 2.
  7. 7. Соединение по п.5 или 6, где р: представляет собой гидрофобную циклоалкильную или гетероциклоалкильную группу, конкретно, с циклическими системами, которые включают в себя по меньшей мере шесть атомов.
  8. 8. Соединение по любому из пп.5-7, где р1 представляет собой гетероциклоалкильную группу, особенно пиперидил, конкретно 1-пиперидил или пиперазинил, конкретно 1-пиперазинил.
  9. 9. Соединение по п.5, в котором
    Я3 имеет значения, указанные в п.1;
    X1 и X2 представляют собой, оба, Ν;
    Υ и Ζ, оба, представляют собой ΝΗ;
    травно 2;
    р1 представляет собой пиперидил или пиперазинил;
    η равно 0 или 2 и р2 представляет собой 1-пиперидил или адамантил.
  10. 10. Соединение по п.5, в котором
    Я3 имеет значения, указанные в п.1;
    X1 и X2 представляют собой, оба, Ν;
    Υ и Ζ, оба, представляют собой ΝΗ;
    травно 2;
    р1 представляет собой пиперазинил;
    η равно 0 и р2 представляет собой норборнил.
  11. 11. Применение по п.1, в котором соединение формулы (I) представляет собой соединение по п.5.
  12. 12. Способ по п.2, в котором соединение формулы (I) представляет собой соединение по п.5.
    Евразийская патентная организация, ЕАПВ
    Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
EA200700161A 2004-07-27 2005-07-25 Замещённые триазины в качестве лигандов белка приона и их применение для обнаружения или удаления прионов EA014365B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB0416699.7A GB0416699D0 (en) 2004-07-27 2004-07-27 Prion protein ligands and methods of use
PCT/GB2005/002910 WO2006010915A1 (en) 2004-07-27 2005-07-25 Substituted triazines as prion protein ligands and their use to detect or remove prions

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200700161A1 EA200700161A1 (ru) 2007-10-26
EA014365B1 true EA014365B1 (ru) 2010-10-29

Family

ID=32947488

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200700161A EA014365B1 (ru) 2004-07-27 2005-07-25 Замещённые триазины в качестве лигандов белка приона и их применение для обнаружения или удаления прионов

Country Status (23)

Country Link
US (1) US8030484B2 (ru)
EP (1) EP1786788B1 (ru)
JP (1) JP5201988B2 (ru)
KR (1) KR20070051285A (ru)
CN (1) CN101023066B (ru)
AP (1) AP2007003897A0 (ru)
AT (1) ATE557011T1 (ru)
AU (1) AU2005266208B2 (ru)
BR (1) BRPI0513823A (ru)
CA (1) CA2575214C (ru)
DK (1) DK1786788T3 (ru)
EA (1) EA014365B1 (ru)
ES (1) ES2384573T3 (ru)
GB (1) GB0416699D0 (ru)
IL (1) IL180787A (ru)
MA (1) MA28820B1 (ru)
MX (1) MX2007001103A (ru)
NO (1) NO338345B1 (ru)
NZ (1) NZ552755A (ru)
PT (1) PT1786788E (ru)
TN (1) TNSN07019A1 (ru)
WO (1) WO2006010915A1 (ru)
ZA (1) ZA200700526B (ru)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20120044279A (ko) 2009-04-15 2012-05-07 아브락시스 바이오사이언스, 엘엘씨 무-프리온 나노입자 조성물 및 방법
WO2012059932A1 (en) 2010-11-01 2012-05-10 Aurigene Discovery Technologies Limited 2, 4 -diaminopyrimidine derivatives as protein kinase inhibitors
KR101395814B1 (ko) * 2012-12-11 2014-05-16 한국화학연구원 플루오르알콕시기를 함유하는 트리아진계 반응성 자외선 안정제 및 그의 제조방법
US9676816B2 (en) * 2014-01-21 2017-06-13 Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Heparin affinity tag and applications thereof

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1979000609A1 (en) * 1978-02-09 1979-08-23 Univ New York Preparation of trichloro-s-triazine activated supports
WO2000067900A1 (en) * 1999-05-10 2000-11-16 Prometic Biosciences Ltd. Novel triazine-based detoxification agents and their use
WO2001077687A2 (en) * 2000-04-05 2001-10-18 V.I Technologies, Inc. Prion-binding peptidic ligands and methods of using same
RU2175261C2 (ru) * 1995-09-20 2001-10-27 Ново Нордиск А/С Новые аффинные лиганды и их применение
WO2002098878A1 (en) * 2001-02-08 2002-12-12 Memory Pharmaceuticals Corporation Trifluoromethylpurines as phosphodiesterase 4 inhibitors
WO2003037891A1 (en) * 2001-11-01 2003-05-08 Janssen Pharmaceutica N.V. Heteroaryl amines as glycogen synthase kinase 3beta inhibitors (gsk3 inhibitors)
WO2003050237A2 (en) * 2001-12-12 2003-06-19 New York University Triazine library with linkers
WO2004035199A1 (en) * 2002-10-21 2004-04-29 Cambridge University Technical Services Limited Affinity adsorbents for immunoglobulins
WO2004052870A1 (en) * 2002-12-09 2004-06-24 Prometic Biosciences Ltd. Triazine compounds and their use in forming multidimensional libraries for affinity chromatography

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB814947A (en) 1954-08-16 1959-06-17 Geigy Ag J R Improvements in and relating to plant growth influencing compositions
US3850918A (en) * 1970-06-17 1974-11-26 Ciba Geigy Corp 2-amino-4,6-disalicyloyl-hydrazino-s-triazines
US4204060A (en) * 1974-10-04 1980-05-20 Akzona Incorporated Novel monochloro-s-triazine derivatives
US4261892A (en) * 1978-04-12 1981-04-14 American Cyanamid Company 2,4,6-Tris-(substituted-amino)-s-triazines
GB8911287D0 (en) 1989-05-17 1989-07-05 Ciba Geigy Ag Lubricant compositions
DK0616613T3 (da) 1991-12-03 1999-09-27 Proteus Molecular Design Fragmenter af prionprotein
AU4376093A (en) 1992-05-15 1993-12-13 Instituto Nazionale Neurologico C. Besta Soluble prion polypeptides, and methods for detecting and purifying thereof
US5283274A (en) 1992-06-19 1994-02-01 Uniroyal Chemical Company, Inc. Substituted pyrimidines and substituted triazines as rubber-to-metal adhesion promoters
US5441563A (en) * 1993-07-06 1995-08-15 Armstrong World Industries, Inc. Highly insoluble azole embossing inhibitor and the use thereof
US5834318A (en) * 1995-05-10 1998-11-10 Bayer Corporation Screening of combinatorial peptide libraries for selection of peptide ligand useful in affinity purification of target proteins
US5750361A (en) * 1995-11-02 1998-05-12 The Regents Of The University Of California Formation and use of prion protein (PRP) complexes
US5874576A (en) * 1995-12-19 1999-02-23 Givaudan-Roure (International) Sa Light screening agents
US5808011A (en) * 1996-07-01 1998-09-15 Biopure Corporation Method for chromatographic removal of prions
AU738606B2 (en) 1997-02-06 2001-09-20 Enfer Technology Limited Immunological assay for spongiform encephalopathies
DE19741607A1 (de) 1997-09-20 1999-03-25 Prionics Ag Synthetische Polypeptide zur Diagnose und Therapie von Prionerkrankungen
US6750025B1 (en) 1998-07-09 2004-06-15 V.I. Technologies, Inc. Method of detecting and isolating prion protein and variants thereof
DE60036918D1 (de) * 1999-01-22 2007-12-13 Elan Pharm Inc Verbindungen die die vla-4 vermittelte adhäsion von leukozyten inhibieren
EP1891088B1 (en) 2005-06-10 2011-10-19 Ares Trading S.A. Process for the purification of il-18 binding protein

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1979000609A1 (en) * 1978-02-09 1979-08-23 Univ New York Preparation of trichloro-s-triazine activated supports
RU2175261C2 (ru) * 1995-09-20 2001-10-27 Ново Нордиск А/С Новые аффинные лиганды и их применение
WO2000067900A1 (en) * 1999-05-10 2000-11-16 Prometic Biosciences Ltd. Novel triazine-based detoxification agents and their use
WO2001077687A2 (en) * 2000-04-05 2001-10-18 V.I Technologies, Inc. Prion-binding peptidic ligands and methods of using same
WO2002098878A1 (en) * 2001-02-08 2002-12-12 Memory Pharmaceuticals Corporation Trifluoromethylpurines as phosphodiesterase 4 inhibitors
WO2003037891A1 (en) * 2001-11-01 2003-05-08 Janssen Pharmaceutica N.V. Heteroaryl amines as glycogen synthase kinase 3beta inhibitors (gsk3 inhibitors)
WO2003050237A2 (en) * 2001-12-12 2003-06-19 New York University Triazine library with linkers
WO2004035199A1 (en) * 2002-10-21 2004-04-29 Cambridge University Technical Services Limited Affinity adsorbents for immunoglobulins
WO2004052870A1 (en) * 2002-12-09 2004-06-24 Prometic Biosciences Ltd. Triazine compounds and their use in forming multidimensional libraries for affinity chromatography

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FILIPPUSSON HOROUR ET AL.: "Design, synthesis and evaluation of biomimetic affinity ligands for elastases" JOURNAL OF MOLECULAR RECOGNITION, vol. 13, no. 6, November 2000 (2000-11), pages 370-381, XP009055587 ISSN: 0952-3499 figures 1-4 *
PALANISAMY UMA D. ET AL.: "Design, synthesis and characterisation of affinity ligands for glycoproteins" JOURNAL OF MOLECULAR RECOGNITION, vol. 12, no. 1, January 1999 (1999-01), pages 57-66, XP009055573 ISSN: 0952-3499 figures 1, 4 *
RENOU EMMA N SOTO ET AL.: "The design, synthesis and evaluation of affinity ligands for prion proteins" JOURNAL OF MOLECULAR RECOGNITION, vol. 17, no. 3, May 2004 (2004-05), pages 248-261, XP009055415 & 15TH INTERNATIONAL CONFERENCE ON AFFINITY INTERACTIONS; CAMBRIDGE, UK; JULY 27-AUGUST 01, 2003 ISSN: 0952-3499 page 249; table 1 the whole document *
SCHARN D. ET AL.: "Spatially addressed synthesis of amino- and amino-oxy-substituated 1,3,5-triazine arrays on polymeric membranes" JOURNAL OF COMBINATORIAL CHEMISTRY, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, WASHINGTON, US, vol. 2, June 2000 (2000-06), pages 361-369, XP002241441 ISSN: 1520-4766 figures 1, 6 page 368, column 2 *
STANKOVA M. ET AL.: "Library generation through successive substitution of trichlorotriazine" MOLECULAR DIVERSITY, ESCOM SCIENCE PUBLISHERS, LEIDEN, NL, vol. 2, no. 1/2, 1996, pages 75-80, XP002963972 ISSN: 1381-1991 tables 1-3 figure 1 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP1786788B1 (en) 2012-05-09
ATE557011T1 (de) 2012-05-15
JP2008508245A (ja) 2008-03-21
PT1786788E (pt) 2012-05-24
EP1786788A1 (en) 2007-05-23
AU2005266208B2 (en) 2011-09-15
NZ552755A (en) 2010-09-30
IL180787A (en) 2013-07-31
ZA200700526B (en) 2008-09-25
MA28820B1 (fr) 2007-08-01
US20080269224A1 (en) 2008-10-30
MX2007001103A (es) 2007-08-14
DK1786788T3 (da) 2012-06-18
TNSN07019A1 (en) 2008-06-02
CN101023066B (zh) 2013-10-30
AP2007003897A0 (en) 2007-02-28
CA2575214A1 (en) 2006-02-02
AU2005266208A1 (en) 2006-02-02
NO20071087L (no) 2007-04-23
JP5201988B2 (ja) 2013-06-05
NO338345B1 (no) 2016-08-08
ES2384573T3 (es) 2012-07-09
EA200700161A1 (ru) 2007-10-26
CN101023066A (zh) 2007-08-22
IL180787A0 (en) 2007-06-03
US8030484B2 (en) 2011-10-04
GB0416699D0 (en) 2004-09-01
KR20070051285A (ko) 2007-05-17
BRPI0513823A (pt) 2008-05-20
CA2575214C (en) 2014-05-27
WO2006010915A1 (en) 2006-02-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4485367B2 (ja) プリオンタンパク質リガンドおよび使用方法
ES2436638T3 (es) Materiales de unión de proteínas del prión y métodos de uso
KR20070117533A (ko) 프리온 단백질의 결합 물질 및 사용 방법
AU2010256880B2 (en) Identification of small molecules recognized by antibodies in subjects with neurodegenerative diseases
JP2004502948A (ja) アルギニン化合物の検出のための方法及びキット
EA014365B1 (ru) Замещённые триазины в качестве лигандов белка приона и их применение для обнаружения или удаления прионов
CA1229564A (en) Fluorometric assay of chymopapain and reagents therefor
US5084379A (en) Fluorometric assay of chymopapain hypersensitivity and reagents therefor

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM

QB4A Registration of a licence in a contracting state
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): RU