DE19741607A1 - Synthetische Polypeptide zur Diagnose und Therapie von Prionerkrankungen - Google Patents

Synthetische Polypeptide zur Diagnose und Therapie von Prionerkrankungen

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DE19741607A1
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tyr
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Markus Moser
Bruno Oesch
Carsten Korth
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Prionics AG
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Prionics AG
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf synthetische Polypeptide, die insbe­ sondere bei der Diagnose, Vorbeugen und Behandlung von einer Reihe von übertragbaren, degenerativen neurologischen Erkrankungen Verwendung finden können. Diese Erkrankungen werden unter dem Begriff spongiforme Enzephalopatien oder auch Prionerkrankungen zusammengefaßt. Sie treten in unterschiedlichen Säugetierspezies auf, z. B. als Scrapie bei Schafen, als BSE bei Kühen und als Kuru oder Creutzfeldt-Jacob-Krankheit bei Menschen.
Als einziges mit dem infektiösen Agens assoziiertes Molekül wurde bislang ein krankheitsspezifisches Prionprotein (PrPSc) gefunden, das eine abnorme Isoform eines normalen Wirtsproteins (PrPC) unbekannter Funktion ist. Beide Isoformen PrPSc und PrPC stimmen bezüglich Molekulargewicht und Aminosäuresequenz überein. Sie unterscheiden sich in ihrer räumlichen Faltung und ihren Eigen­ schaften. Während z. B. PrPC überwiegend α-helicale Sekundärstrukturen besitzt, löslich und proteaseverdaubar ist, weist PrPSc vor allem β-Faltblattstrukturen auf, ist unlöslich und kann von Proteasen nur teilweise abgebaut werden. Viele Indizien, insbesondere die Abwesenheit von anderen Molekülen außer PrPSc im Prion, und vor allem die Abwesenheit von Nukleinsäuren, deuten darauf hin, daß PrPSc eine (wenn nicht die) zentrale Rolle bei der Auslösung der oben genannten Krankheiten zukommt. Es wird angenommen daß PrPSc-Proteine in der Lage sind, normale PrPC-Proteine in die krankheitsspezifische Faltung zu konvertieren, was die Infektiosität von PrPSc-Proteinen erklären würde.
Es scheint daher vielversprechend ausgehend von PrPSc als zentralen Krank­ heitsmolekül Therapie- oder Diagnosemöglichkeiten zu entwickeln.
Aufgabe der Erfindung ist in diesem Zusammenhang, synthetische Polypeptide bereitzustellen, die immunogene Eigenschaften oder generell Bindungseigen­ schaften des PrPSc nicht jedoch dessen Infektiösität aufweisen.
Gelöst wird die Aufgabe mit synthetischen Polypeptiden entsprechend des An­ spruchs 1.
Es handelt sich dabei um Polypeptide, die eine oder mehrere definierte Sequenzen des PrP (PrP bezeichnet das Prionprotein im allgemeinen unabhängig von seiner Konfiguration) enthalten, wobei diese Sequenzen von PrPSc-bindenden Substanzen in z. B. den weiter unten beschriebenen Mapping-Experimenten erkannt werden. Es gibt eine ganze Reihe von unterschiedlichen PrPSc-spezifisch bindenden Substanzen. Beispiele hierfür sind weiter unten angegeben.
Zusammengefaßt enthalten die erfindungsgemäßen synthetischen Polypeptide dann mindestens eine Sequenz, die im nativen PrPSc an dessen Oberfläche an­ geordnet ist und dort alleine oder in Verbindung mit weiteren der im Rahmen der Erfindung einsetzbaren Sequenzen eine Bindungsstelle bilden. An der Ausbildung dieser PrPSc-spezifischen Oberflächenstrukturen ist mindestens eine der beiden im Strukturmodell des rekombinanten PrP vorhandenen β- Faltblattstrukturen, oder beide, beteiligt. Es wird angenommen, daß diese Strukturen im PrPSc als Nukleationspunkt bei der Ausbildung der Oberfläche einen dominierenden Einfluß haben.
Künstliche Polypeptide, die im nativen PrPSc vorhandene Bindungsstelle simulieren, können sowohl zur Therapie oder Diagnose als auch zur Vorbeugung und sonstigen Anwendungszwecken von Interesse sein.
Unter die Erfindung fallen insbesondere synthetische Polypeptide, die einen oder mehrere der im Anspruch 2 genannten folgenden Sequenzbereiche aufweisen:
  • a) Gly-R1-Asp-R2-Glu-Asp-Arg-(Tyr-Tyr)
  • b) (Gln)-(Val)-Tyr-Tyr-R3-Pro-R4-Asp-R5-Tyr-R6-(Asn-Gln)
  • c) Cys-R7-Thr-Gln-Tyr-R8-R9-Glu-Ser-R10-Ala-(R11Tyr)
  • d) (Tyr-Arg)-Glu-Asn-Met-R12-Arg-Tyr-Pro-Asn-(Gln-Val-Tyr)
in denen R1
= Asn oder Ser, R2
= Trp oder Tyr, R3
= Arg oder Lys, R4
= Met, Val oder Ala, R5
= Gln, Glu oder Arg, R6
= Ser oder Asn, R7
= Val, Thr oder Ile, R8
= Gln oder Glu, R9
= Lys, Arg oder Gln, R10
= Gln oder Glu, R11
und Tyr, Ser oder Ala und R12
= His, Tyr oder Asn ist und die in Klammern angegebenen Aminosäuren nicht zwingend vorhanden sind.
Weitere synthetische Polypeptide im Rahmen der Erfindung können nach An­ spruch 3 eine oder mehrere der folgenden Sequenzen enthalten:
  • e) Gly-Trp-Gly-Gln-Pro-His-Gly-Gly-Gly-Trp-Gly-Gln-Pro-His-Gly
  • f) Lys-Pro-R14-Lys-Pro-Lys-Thr-R14-R15-Lys-His-R16-Ala-Gly
  • g) Tyr-R16-Leu-Gly-Ser
  • h) Ser-Ala-Met-Ser-Arg-Pro-R17-R17-His-Phe-Gly-R14-Asp
  • i) Asn-Met-R18-Arg-Tyr-(Pro-R14)-(Gln-Val-Tyr-Tyr-R19)
in denen R14
= Asn oder Ser, R15
= Met, Leu oder Phe, R16
= Met oder Val, R17
= Ile, Leu oder Met, R18
= His, Tyr oder Asn und R19
= Lys oder Arg ist und die in Klammern gesetzten Aminosäuren oder Sequenzbereiche nicht zwingend vorhanden sind.
Die Sequenzen gemäß Anspruch 2 und 3 wurden in sogenannten "Mapping- Experimenten" auf einer immobilisierten Peptidbank gefunden. Auf der benutzten Peptidbank (erhältlich von Jerini Biotools, Berlin) sind 104 Peptide mit jeweils 13 Aminosäuren mit ihrem C-terminalen Ende auf einer Cellulosemembran befestigt. Sie decken die gesamte Sequenz des PrP (PrP bezeichnet im folgenden generell die dem Prionprotein zugrundeliegende Aminosäuresequenz unabhängig von der Konformation) ab und sind so angeordnet, daß sie um jeweils zwei Ami­ nosäuren verschoben sind, d. h. jeweils 11 Aminosäuren zwischen zwei benachbarten Peptiden überlappen. In mehreren Mapping-Experimenten wurden Peptidbänke mit unterschiedlichen PrPSc bindenden Substanzen beaufschlagt und die Bindung dieser Substanzen an spezielle Sequenzbereiche unter Verwendung z. B. eines Chemolumineszenz-Kits (ECL, Amersham, USA) sichtbar gemacht.
Zur Ermittlung der Sequenzen gemäß Anspruch 2 wurden in "Mapping- Experimenten" als PrPSc-bindende Substanzen ein PrPSc-spezifischen Antikörper mit der Bezeichnung 15B3 und (wie in eigenen Vorversuchen gezeigt wurde ebenfalls PrPSc-spezifisches) rekombinantes bovines-PrP (rbPrP) mit der in Fig. 4 angegebenen Sequenz eingesetzt. Zur Herstellung von rbPrP kann z. B. eine Zell­ linie (z. B. E. coli) mit einem Vektor, der rbPrP exprimiert, in einem geeigneten Medium (z. B. Luria-Broth) angezogen und dann aus den Inklusionskörpern der Zellen nach Lysis und weiteren konventionellen Reinigungsmethoden das Prion- Protein isoliert werden (siehe auch Hornemann et als., FEBS-Letters (97) 413 (2; 277-28)).
Bei 15B3 handelt es sich um einen unlängst von den Erfindern entdeckten mono­ klonalen PrPScAntikörper. Hybridomazellen, die die genannten (PrPSc spezifischen) Antikörper 15B3 produzieren, wurden am 13. Februar 1997 unter der Nummer DSM ACC2298 bei der deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH in Braunschweig hinterlegt.
In beiden Fällen erkannten die beiden unterschiedlichen bindenden Substanzen, der Antikörper 15B3 und das rekombinante rbPrP übereinstimmend die Sequenzen a-d gemäß Anspruch 1, wie für 15B3 in Fig. 1 und für rbPrP in Fig. 2 wieder­ gegeben.
Die in Fig. 1 und 2 angegebenen Nummern bezeichnen die unterschiedlichen Peptidsequenzen der Bank, an denen der monoklonale Antikörper 15B3 bzw. rbPrP bindet. Die erfindungsgemäßen Sequenzen entsprechend dabei jeweils den den jeweiligen räumlich benachbarten Bindungspeptiden gemeinsamen Bereichen. Fig. 2 gibt dabei wie bereits erwähnt das Ergebnis eines Mappingexperi­ mentes wieder, dessen Bedingungen dem in Fig. 1 dargestellten Experiment ent­ sprechen. Hier wurde lediglich der Antikörper 15B3 gegen rekombinantes bovines rbPrP ausgetauscht. Die Bindungsstellen des rekombinanten rbPrP sind auf der aus technischen Gründen nicht besser wiederzugebende Darstellung mit Markierungen hervorgehoben. Es handelt sich um mit Fig. 1 übereinstimmende Bindungsstellen.
Die in Anspruch 3 angegebenen Sequenzen wurden ebenfalls mittels Mappingex­ perimenten ermittelt. Allerdings wurde hier als erkennende Substanz nicht ein Antikörper oder rbPrP, sondern der Farbstoff Kongorot eingesetzt, dessen spezifische Bindung für PrPSc bereits seit längerem bekannt ist (Prusiner et al., Cell 35, 349-358; 1983). Fig. 3 zeigt die entsprechende Peptidbank mit den angefärbten Bindungsbereichen, aus denen wie oben angegeben die Sequenzen e-i ermittelt wurden.
In den Fig. 1-3 erkennt man, daß es sich bei den Sequenzen a-d bzw. e-i um nicht linear zusammenhängende Sequenzen aus PrP handelt. An einem 3- dimensionalen Modell eines C-terminalen Fragments von rekombinantem Maus- PrP konnte gezeigt werden, daß sich hier zwei der im Anspruch 2 angegebenen Sequenzen a-d in räumlicher Nähe zueinander befinden. Mit großer Wahrscheinlichkeit ist davon auszugehen, daß bei der Konformationsänderung auch die beiden anderen Sequenzen eine andere Position einnehmen, dergestalt daß im PrPSc wohl alle vier Sequenzen a-d benachbart angeordnet sind und mit hoher Wahr­ scheinlichkeit ein konformationelles Epitop ausbilden.
Die beanspruchten Sequenzen stellen damit Sequenzbereiche dar, die in einer Peptidbank einzeln von z. B. einem PrPSc-spezifischen Antikörper erkannt werden und die darüber hinaus mit hoher Wahrscheinlichkeit im nativen PrPSc- Protein einzeln oder zu mehreren einen oberflächlichen Bindungsbereich z. B. ein Epitop ausbilden. Unter Epitop wird der spezifische Ort auf der Oberfläche des PrPSc-Proteins verstanden, der z. B. durch das Idiotyp von 15B3 gebunden werden kann.
Erfindungsgemäß werden damit synthetische Polypeptide bereitgestellt, die im Mindestfall eine der von den genannten PrPSc bindenden Substanzen in der Pep­ tidbank erkannten Sequenzen (sowie möglicherweise zusätzliche) enthalten.
Künstliche Polypeptide, die einen antigenen Bereich von PrPSc aufweisen, sind bereits in der WO 93/11153 angegeben worden. Die dort genannten Sequenzen stellen relativ umfangreich Ausschnitte aus der PrP-Sequenz dar. Die genaue Abgrenzung einer Sequenz, die z. B. ein Epitop ausbildet oder daran beteiligt ist, fehlt, was insbesondere den räumlichen Nachbau von minimalen synthetischen Polypeptiden mit z. B. der immunogenen Wirkung von PrPSc erschwert bzw. unmöglich macht.
Wie oben ausgeführt, können die synthetischen Polypeptide im Minimalfall le­ diglich aus einer der z. B. im Anspruch 2 oder genannten Sequenzen bestehen. Es ist aber auch möglich, sie mit geeigneten weiteren Sequenzen, die im Folgenden Konformationssequenzen genannt werden, zu verbinden.
Theoretisch wäre es z. B. möglich, die z. B. die Sequenzen ggf. über diese Konforma­ tionssequenzen und eventuelle weitere Sequenzen dergestalt untereinander zu verbinden, daß die vermutete räumliche Anordnung im PrPSc-Protein simuliert wird. Im Idealfall würde man auf diese Weise ein Protein mit einer Oberfläche (Epitop) erhalten, in dem wie im PrPSc mehrere räumlich benachbarte Bindungs­ stellen enthalten sind.
Erfindungsgemäß ist in einer Ausgestaltung zunächst jedoch vorgesehen, lediglich eine der beanspruchten Sequenz (Sequenz b) dergestalt mit einer Konfor­ mationssequenz zu verknüpfen, daß ein synthetisches Polypeptid mit ausreichender immunogener Bindungswirkung z. B. für 15B3 entsteht, wie Untersuchungen der Erfinder zeigten. Ein Polypeptid in dieser Ausgestaltung kann eine der beiden folgenden Sequenzen aufweisen:
  • j) (X)-(Gly)-Ala-Val-Val-Gly-Gly-Leu-Gly-Gly-Tyr-(R13)-Z-Tyr- Tyr-R3-Pro-R4-Asp-R5-Tyr-R6-(Asn-Gln)-(Y)
  • k) (X)-Tyr-Tyr-R3-Pro-R4-Asp-R5-Tyr-R6(Asn-Gln)-Z-(Gly)-Ala- Val-Val-Gly-Gly-Leu-Gly-Gly-Tyr-(R13)-(Y)
wobei X und Y beliebige Aminosäuresequenzen sind, Z ein üblicher Spacer z. B. Gly-Gly ist, R3
= Arg oder Lys, R5
= Gln, Glu oder Arg, R6
= Ser oder Asn und R13
= Met oder Val ist und die in Klammern gesetzten Sequenzbereiche nicht zwingend vorhanden sein müssen.
Die Sequenz j enthält in ihrem C-terminalen Bereich die Sequenz b, die über z. B. den Spacer Gly-Gly mit der sich N-terminal anschließenden Konformationsse­ quenz verbunden ist. In der Sequenz k ist die Abfolge genau umgekehrt. Weitere geeignete Spacer sind generell alle solche Sequenzen, die ausreichende Flexibilität zwischen den verbundenen Peptidbereichen gewährleisten und keinen Einfluß auf die Konformation haben.
Beide bevorzugt eingesetzten synthetischen Polypeptide wurden ausgehend von der Feststellung konzipiert, daß in PrPSc verstärkt β-Faltblatt-Strukturen auftreten, wobei in aller Regel sequenzauf- oder abwärts eine Konformationssequenz vorliegt, die eine β-Faltblatt-Struktur induziert. Die synthetischen Polypeptide gemäß Anspruch 6 wurden daher mit geeigneten Konformationssequenzen ausgestattet, um die Epitopsequenz in einer für PrPSc-spezifischen β-Faltblatt-Struktur anzuordnen.
Wie allgemein bekannt, können Aminosäuren in Abhängigkeit von ihrer Größe und ihrer Polarität bzw. Ladung unterschiedlichen Gruppen zugeordnet werden. Man nennt die in eine Gruppe fallenden Aminosäuren untereinander homolog und unterscheidet folgende 5 Gruppen:
  • 1.) Kleine aliphatische nicht polare oder nur geringfügig polare Säuren: Alanin, Serin, Threonin und in Grenzen Glycin, Prolin
  • 2.) Polare, negativ geladene Säuren und ihre Amide Asparaginsäure, Asparagin, Glutaminsäure und Glutamin
  • 3.) Polare, positiv geladene Säuren: Histidin, Arginin, Lysin
  • 4.) Große aliphatische, nicht polare Säuren: Methionin, Leucin, Isoleucin, Valin, Cystein
  • 6.) Große aromatische Säuren: Phenylalanin, Tyrosin, Tryptophan
In vielen Fällen können in Peptidsequenzen enthaltene Aminosäuren durch ent­ sprechende Säuren aus derselben Gruppe ersetzt werden, ohne daß die Eigenschaften der Sequenz dadurch eine Änderung erfahren. Unter die Erfindung fallen daher auch solche Sequenzen, die nicht den explizit genannten Formeln entsprechen, sondern in denen ein Austausch einer oder mehrerer Aminosäuren gegen eine homologe Säure vorgenommen wurde.
Weiterhin kann grundsätzlich davon ausgegangen werden, daß Aminosäurese­ quenzen unabhängig von ihrer Bildungseinrichtung unter bestimmten Umständen ähnliche Bindungseigenschaften, insbesondere Antikörperbindungseigenschaften haben können. Man spricht in diesem Fall von retro-Aminosäuresequenzen und bezeichnet damit übereinstimmende Sequenzen, die in C- oder N-terminaler Richtung gebildet sind (z. B. [N-terminal]-Glu-Ala-Val-Leu-[C-terminal], [N- terminal]-Leu-Val-Ala-Glu-[C-terminal]). Falls die verwendeten Aminosäuren statt der in Tieren vorkommenden L-Form in der chiralen D-Gegenform vorliegen, so werden die Epitopbereiche spiegelbildlich ausgebildet und ebenfalls von einigen Antikörpern erkannt, wobei sich die Isotypen der Anikörper in diesen Eigenschaften unterscheiden. Man spricht in diesem Fall von inverso- Aminosäuresequenzen. Falls sowohl inverso als auch retro-Aminosäuren verwendet werden, ergeben sich z. B. übereinstimmende Epitopbereiche, die unein­ geschränkt von dem zur ursprünglichen Sequenz spezifischen Antikörper gebunden werden. Der Vorteil der Verwendung von z. B. retro-inverso- Aminosäuresequenzen besteht darin, daß D-Aminosäuren vom Organismus langsamer abgebaut werden, da sie von den abbauenden Enzymen schlechter erkannt werden. Der gleiche Effekt kann auch durch die Substitution von nicht natürlichen Aminosäuren erzielt werden. Die erfindungsgemäßen Peptide können daher auch in retro- und/oder inverso Form vorliegen oder weiterhin auch nicht natürliche (also nicht von Organismus produzierte) Aminosäuren enthalten. Nichtnatürliche Aminosäuren lassen sich durch Synthetisierung von z.B. zusätzlichen Seitenketten oder reaktiven Gruppen gezielt mit speziellen Eigenschaften und an bestimmte Anwendungszwecke angepaßt herstellen.
Wie oben ausgeführt, können die erfindungsgemäßen synthetischen Polypeptide insbesondere bei der Behandlung, Vorbeugung oder auch Diagnose von Prioner­ krankungen eingesetzt werden.
Es ist insbesondere daran gedacht, die erfindungsgemäßen synthetischen Poly­ peptide als Impfstoff darzustellen. Dazu wird z. B. eine ausreichende Menge Pep­ tid mit Freund's komplettem Adjuvans aufgelöst und subkutan oder intramuskulär injiziert. In mehrwöchigen Abständen wird wiederum eine immunogene Menge Peptid in Freund's inkomplettem Adjuvans aufgelöst und injiziert (Boost). Ziel der Impfung ist, eine Immunantwort zu provozieren, die die endogene Produktion von Antikörpern beinhaltet, die spezifisch PrPSc erkennen und neutralisieren bzw. kennzeichnen können, so daß körpereigene Abwehrmechanismen einer Er­ krankung vorbeugen bzw. den Krankheitsprozeß verlangsamen bzw. stoppen können.
Eine weitere Möglichkeit besteht darin, die synthetischen Polypeptide in der Diagnose und Therapie einzusetzen. Nach der herrschenden Konversionstheorie wird davon ausgegangen, daß PrPSc und/oder PrPC auch untereinander binden. Ge­ stützt wird diese Annahme durch weitere Mappingversuche der Erfinder, in denen gezeigt wurde, daß (wie aus Fig. 2 zu entnehmen) rekombinantes bovines rbPrP an ähnlichen Sequenzbereichen bindet wie der oben genannte Antikörper 15B3.
Die erwähnten Bindungseigenschaften kann man sich z. B. bei der Therapie zunutze machen. Denkbar wäre, die erfindungsgemäßen Polypeptide in den Körper eines erkrankten Patienten hirngängig zu applizieren und dort dem infektiösen PrPSc als Bindungspartner zur Verfügung zu stellen. Auf diese Weise könnte man die Konversionsrate möglicherweise drastisch senken und das Fortschreiten der Krankheit verlangsamen. Zu Diagnosezwecken wäre es denkbar, in Probe­ material eventuell erhaltenes PrPSc mittels der erfindungsgemäßen Polypeptide spezifisch zu binden und dann auf geeignete Weise nachzuweisen.
Die erfindungsgemäßen synthetischen Polypeptide sind nicht auf die angegebenen Sequenzen beschränkt. Denkbar sind auch Peptide, die in derivatisierter Form vorliegen. Interessant könnte es z. B. sein, solche Peptide mit einem Carrier bzw. Immunogen, wie z. B. Diphteriatoxid oder BSA zur Verstärkung der Im­ munantwort zu verbinden. Eine weitere Möglichkeit der Derivatisierung wäre die Verknüpfung mit Markern, wie z. B. Biotin oder Peroxidase bzw. mit Enzymen oder Nukleinsäuren. Denkbar wäre schließlich auch, Signalsequenzen vorzusehen, die die Durchgängigkeit der Peptide in gewünschte Kompartimente erleichtern. Gedacht ist dabei insbesondere an die Blut-Hirn-Schranke, deren Passage durch Verwendung von Signalsequenzen, die z. B. an Transferrinrezeptor binden, erleichtert werden können.
Wie oben mehrfach angesprochen, sollen die erfindungsgemäßen synthetischen Polypeptide bei der Therapie, Diagnose und Prophylaxe von Prionerkrankungen Verwendung finden. In Verbindung mit allen genannten Anwendungszwecken ist ein wesentliches Element, daß die erfindungsgemäßen Polypeptide einzeln oder in Verbindung mit weiteren Substanzen einem Patienten verabreicht werden, wobei, wie oben ausgeführt, derivatisierte Formen eingesetzt werden können, um die Gängigkeit in bestimmte Kompartimente zu erhöhen.
Die Herstellung der Polypeptide kann auf beliebige Weise erfolgen. Entweder direkt über übliche Peptidsynthese-Techniken oder aber auch indirekt über RNA- oder DNA-Synthese und dann mittels konventioneller molekularbiologischer Techniken. Dementsprechend richtet sich ein weiterer Aspekt der Erfindung auf ein DNA-Molekül, das in der Lage ist, eins der erfindungsgemäßen Polypeptide zu kodieren. Vorzugsweise wird ein solches DNA-Molekül (ggf. auch in einer längeren Sequenz) in einem geeigneten Expressionsvektor zur Verfügung gestellt. Es handelt sich hierbei um Routinetechniken.
Die Erfindung richtet sich weiterhin auch auf einen Kit zur Diagnose von PrPSc bzw. von Antikörpern gegen PrPSc, der mindestens eins der erfindungsgemäßen Polypeptide enthält. Man macht sich hierbei die Tatsache zunutze, daß die Polypeptide spezifisch am PrPSc und an den dagegen gerichteten Antikörpern zu binden vermögen.
Wie oben bereits angesprochen kann eine der zu Ermittlung der Polypeptidse­ quenzen eingesetzten bindenden Substanzen rekombinantes bovines rbPrP sein. Es hat sich überraschend herausgestellt, daß rekombinantes rbPrP in der Lage ist, spezifisch an PrPSc zu binden und an der entsprechenden Peptidbank die selben Sequenzen zu erkennen, wie der Antikörper 15B3 (siehe Fig. 2).
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft daher die Verwendung von rekombi­ nantem rbPrP-Protein entsprechend der Sequenz in Fig. 4. Es hat sich herausge­ stellt, daß bei Verabreichung von rekombinantem rbPrP mit der angegebenen Sequenz PrPSc-spezifische Antikörper produziert werden. Diesen Effekt kann man sich insbesondere im Rahmen der Prophylaxe oder Therapie zunutze machen, indem man einem Patienten rekombinantes rbPrP als Impfstoff aufbereitet verabreicht und eine entsprechende Immunantwort auslöst.
Die Ausgestaltung ist selbstverständlich nicht auf die Verwendung von bovinem rbPrP gemäß Fig. 4 beschränkt. Genauso gut können rekombinante PrP- Sequenzen mit artspezifischen Abweichungen von der in Fig. 4 gezeigten rbPrP- Sequenz verwendet werden.
Schließlich betrifft die Erfindung auch noch ein Verfahren zur Herstellung von PrPSc-spezifischen Antikörpern. Zur Immunisierung wird nicht menschlichen Säugetieren mindestens eins der erfindungsgemäßen Polypeptide in einer zur Immunisierung ausreichenden Dosis verabreicht und der dagegen gebildete Anti­ körper mit üblichen Methoden isoliert.
Die erfindungsgemäßen Peptide eignen sich schließlich auch zur Verwendung in sogenannten pharmazeutischen oder chemischen Libraries, mit denen neue Wirkstoffe getestet bzw. ermittelt werden, die spezifisch an PrPSc binden.

Claims (18)

1. Synthetisches Polypeptid, das eine oder mehrere definierte Sequenzen von PrP oder davon abgeleitete Sequenzen enthält, die von PrPSc-bindenden Substanzen erkannt werden.
2. Synthetisches Polypeptid nach Anspruch 1, bei dem die Sequenz einer der folgenden Formeln entspricht und mindestens eine der genannten Sequenzen oder eine Kombination mehrerer Sequenzen enthalten ist:
  • a) Gly-R1-Asp-R2-Glu-Asp-Arg-(Tyr-Tyr)
  • b) (Gln)-(Val)-Tyr-Tyr-R3-Pro-R4-Asp-R5-Tyr-R6-(Asn-Gln)
  • c) Cys-R7-Thr-Gln-Tyr-R8-R9-Glu-Ser-R10-Ala-(R11Tyr)
  • d) (Tyr-Arg)-Glu-Asn-Met-R12-Arg-Tyr-Pro-Asn-(Gln-Val-Tyr)
in denen R1 = Asn oder Ser, R2 = Trp oder Tyr, R3 = Arg oder Lys, R4 = Met, Val oder Ala, R5 = Gln, Glu oder Arg, R6 = Ser oder Asn, R7 = Val, Thr oder Ile, R8 = Gln oder Glu, R9 = Lys, Arg oder Glu, R10 = Gln oder Glu, R11 = Tyr, Ser oder Ala und R12 = His, Tyr oder Asn ist und die in Klammern angegebenen Aminosäuren nicht zwingend vorhanden sind.
3. Synthetisches Polypeptid nach Anspruch 1, bei dem die Sequenz einer der folgenden Formeln entspricht und mindestens eine der genannten Sequenzen oder eine Kombination mehrerer Sequenzen enthalten ist:
  • e) Gly-Trp-Gly-Gln-Pro-His-Gly-Gly-Gly-Trp-Gly-Gln-Pro-His-Gly
  • f) Lys-Pro-R14-Lys-Pro-Lys-Thr-R14-R15-Lys-His-R16-Ala-Gly
  • g) Tyr-R16-Leu-Gly-Ser
  • h) Ser-Ala-Met-Ser-Arg-Pro-R17-R17-His-Phe-Gly-R14-Asp
  • i) Asn-Met-R18-Arg-Tyr-(Pro-R14)-(Gln-Val-Tyr-Tyr-R19)
in denen R14 = Asn oder Ser, R15 = Met, Leu oder Phe, R16 = Met, oder Val, R17 = Ile, Leu oder Met, R18 = His, Tyr oder Asn und R19 = Lys oder Arg ist, und die in Klammern angegebenen Aminosäuren oder Se­ quenzbereiche nicht zwingend vorhanden sind.
4. Synthetisches Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch ge­ kennzeichnet, daß die Sequenz gegebenenfalls über eine übliche Spacersequenz mit einer "Konformations"-sequenz gekoppelt ist, die die Ausbildung einer de­ finierten Konformation des synthetischen Polypeptids induziert.
5. Synthetisches Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch ge­ kennzeichnet, daß die "Konformations"-sequenz die Ausbildung eines β- Strands induziert.
6. Synthetisches Polypeptid nach Anspruch 2, 4 und 5 entsprechend einer der folgenden Formeln:
  • e) (X)-(Gly)-Ala-Val-Val-Gly-Gly-Leu-Gly-Gly-Tyr-(R13)-Z-Tyr- Tyr-R3-Pro-R4-Asp-R5-Tyr-R6-(Asn-Gln)-(Y)
  • f) (X)-Tyr-Tyr-R3-Pro-R4-Asp-R5-Tyr-R6(Asn-Gln)-Z-(Gly)-Ala- Val-Val-Gly-Gly-Leu-Gly-Gly-Tyr-(R13)-(Y)
wobei X und Y beliebige Aminosäuresequenzen sind, Z ein üblicher Spacer z. B. Gly-Gly ist, R3 = Arg oder Lys, R5 = Gln, Glu oder Arg, R6 = Ser oder Asn und R13 = Met oder Val ist, und die in Klammern gesetzten Sequenzbereiche nicht zwingend vorhanden sein müssen.
7. Synthetisches Polypeptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es in mindestens einer Teilsequenz in retro- Form vorliegt.
8. Synthetisches Polypeptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine der enthaltenen Aminosäuren in der D-Form vorliegt.
9. Synthetisches Polypeptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es in derivatisierter Form vorliegt.
10. Pharmazeutische Zubereitung zur Therapie von Prionerkrankungen, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens eines der in den Ansprüchen 1-9 genannten synthetischen Polypeptide oder mindestens eine die definierten Sequenzen erkennende PrPSc-bindende Substanz in einer zur Therapie oder Vorbeugung ausreichenden Dosis enthält.
11. Mittel zur Diagnose von Prionerkrankungen, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens eines der in den Ansprüchen 1-9 genannten synthetischen Polypeptide oder mindestens eine die definierte Sequenzen erkennende PrPSc-bindende Substanz in einer für den jeweiligen Nachweis ausreichenden Dosis enthält.
12. Impfstoff zur Vorbeugung und Therapie von Prionerkrankungen mit min­ destens einem der Polypeptide gemäß den Ansprüchen 1-9 oder mindestens einer die definierten Sequenzen erkennende PrPSc-spezifischen Substanz in einer zur Immunisierung ausreichenden Dosis.
13. Pharmazeutische Zubereitung zur Diagnose oder Impfstoff nach einem der Ansprüche 9-12, dadurch gekennzeichnet, daß die enthaltene PrPSc-bindende Substanz rekombinant erzeugtes rbPrp mit der in Fig. 4 wiedergegebenen Formel bzw. artspezifischer Abweichungen davon ist.
14. DNA-Molekül, das mindestens für eines der synthetischen Polypeptide nach den Ansprüchen 1 bis 9 kodiert.
15. Kit zur Detektion PrPSc bzw. von Antikörpern dagegen, dadurch ge­ kennzeichnet, daß er mindestens ein synthetisches Polypeptid nach den Ansprüchen 1 bis 9 enthält.
16. Verfahren zur Herstellung von PrPSc spezifischen Antikörpern, dadurch gekennzeichnet, daß nicht-menschliche Säugetiere mit mind. einem Polypeptid gemäß der Ansprüche 1-9 immunisiert werden und der bzw. die dagegen gebildete(n) Antikörper nach einer zur Immunisierung ausreichenden Zeitperiode auf üblichem Wege aus dem Säugetier isoliert werden.
17. Verfahren zur Detektion von PrPSc spezifischen Oberflächensequenzbe­ reichen, dadurch gekennzeichnet, daß eine PrP-spezifischer Peptidbank mit PrPSc-bindenden Substanzen inkubiert und mittels gängiger Visualisa­ tionstechniken die bindenden Bereiche der Peptidbank sichtbar gemacht und daraus die Sequenzbereiche ermittelt werden.
18. Verwendung der Polypeptide nach den Ansprüchen 1-9 in einer pharma­ zeutischen oder chemischen Library zur Detektion von PrPSc- spezifischen Wirkstoffen.
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Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1158003A1 (de) * 2000-05-23 2001-11-28 Blood Transfusion Centre of Slovenia Antikörper zum selektiven Nachweis von Prion PrP Sc Isoformen
EP1212082A1 (de) * 1999-07-15 2002-06-12 The United States of America, represented by The Secretary of Agriculture Monoklonale antikörper und antikörper enthaltender cocktail zum nachweis von prion proteinen als indikation für übertragbare spongiforme enzephalopathien
WO2002049662A2 (en) * 2000-12-21 2002-06-27 Mcgill University Use of the prion protein (prp) for suppression of bax-mediated apoptosis
DE10108099A1 (de) * 2001-02-19 2002-09-12 Cenas Ag Verfahren zum Nachweis spezifischer Proteine und Verwendung
WO2005068491A1 (fr) * 2004-01-15 2005-07-28 Sergey Ivanovich Chernysh Peptides antitumoraux et antiviraux
DE102004043782A1 (de) * 2004-09-08 2006-03-09 Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf Polypeptide und Verfahren zur spezifischen Bindung von Prionen
US7041807B1 (en) 1999-06-23 2006-05-09 Caprion Pharmaceuticals, Inc. Antibodies to a YYX epitope of a mammalian prion protein
US7098317B1 (en) 2000-05-23 2006-08-29 Blood Transfusion Center Of Slovenia Antibodies capable to selectively detect prion PrPSc isoforms
EP1848830A2 (de) * 2005-01-13 2007-10-31 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Isolierung pathogener prione
EA009555B1 (ru) * 2005-11-30 2008-02-28 Сергей Иванович Черныш Пептид, обладающий иммуномодулирующей активностью, и фармацевтическая композиция
US7435540B2 (en) 2002-09-27 2008-10-14 Idexx Corporation PrPSc-selective peptides
US7834144B2 (en) 2005-09-09 2010-11-16 Novartis Ag Prion-specific peptoid reagents

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2405568A1 (en) * 2000-04-05 2001-10-18 North Carolina State University Prion-binding peptidic ligands and methods of using same
EP1572937B1 (de) * 2002-04-09 2012-02-08 The Scripps Research Institute Hybrid-polypeptide mit eingefügten sequenzmotiven und ihre verwendungen
WO2004018511A2 (en) * 2002-08-23 2004-03-04 Copenhagen Biotech Assets Aps Composite peptide compounds for diagnosis and treatment of diseases caused by prion proteins
WO2005016127A2 (en) 2003-08-13 2005-02-24 Chiron Corporation Prion-specific peptide reagents
GB0416699D0 (en) 2004-07-27 2004-09-01 Prometic Biosciences Ltd Prion protein ligands and methods of use
JP5614930B2 (ja) 2005-06-10 2014-10-29 プロメティック バイオサイエンシズ，リミテッド タンパク質結合性リガンドとしてのトリアジン

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4233604B2 (ja) * 1991-12-03 2009-03-04 プロセリックス メディスンズ ディベロップメント リミテッド プリオンタンパク質のフラグメント
WO1993023432A1 (en) * 1992-05-15 1993-11-25 New York University Soluble prion polypeptides, and methods for detecting and purifying thereof
US5750361A (en) * 1995-11-02 1998-05-12 The Regents Of The University Of California Formation and use of prion protein (PRP) complexes
DE69818388T2 (de) * 1997-02-06 2004-07-01 Enfer Technology Ltd. Immunoassay für spongiforme encephalopathien
EP0861900A1 (de) * 1997-02-21 1998-09-02 Erziehungsdirektion Of The Canton Zurich Immunologischer Nachweis von Prionen

Cited By (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7041807B1 (en) 1999-06-23 2006-05-09 Caprion Pharmaceuticals, Inc. Antibodies to a YYX epitope of a mammalian prion protein
EP1212082A1 (de) * 1999-07-15 2002-06-12 The United States of America, represented by The Secretary of Agriculture Monoklonale antikörper und antikörper enthaltender cocktail zum nachweis von prion proteinen als indikation für übertragbare spongiforme enzephalopathien
EP1212082A4 (de) * 1999-07-15 2005-09-21 Us Agriculture Monoklonale antikörper und antikörper enthaltender cocktail zum nachweis von prion proteinen als indikation für übertragbare spongiforme enzephalopathien
US7098317B1 (en) 2000-05-23 2006-08-29 Blood Transfusion Center Of Slovenia Antibodies capable to selectively detect prion PrPSc isoforms
WO2001090191A2 (en) * 2000-05-23 2001-11-29 Blood Transfusion Centre Of Slovenia ANTIBODIES CAPABLE TO SELECTIVELY DETECT PRION PrPSc ISOFORMS
WO2001090191A3 (en) * 2000-05-23 2002-06-20 Blood Transfusion Ct Of Sloven ANTIBODIES CAPABLE TO SELECTIVELY DETECT PRION PrPSc ISOFORMS
JP2003534000A (ja) * 2000-05-23 2003-11-18 ブラッド・トランスフュージョン・センター・オブ・スロベニア プリオンＰｒＰＳｃイソ型を選択的に検出し得る抗体
EP1158003B2 (de) † 2000-05-23 2012-12-26 Blood Transfusion Centre of Slovenia Antikörper zum selektiven Nachweis von Prion PrP Sc Isoformen
EP1158003A1 (de) * 2000-05-23 2001-11-28 Blood Transfusion Centre of Slovenia Antikörper zum selektiven Nachweis von Prion PrP Sc Isoformen
WO2002049662A2 (en) * 2000-12-21 2002-06-27 Mcgill University Use of the prion protein (prp) for suppression of bax-mediated apoptosis
WO2002049662A3 (en) * 2000-12-21 2003-09-04 Univ Mcgill Use of the prion protein (prp) for suppression of bax-mediated apoptosis
DE10108099A1 (de) * 2001-02-19 2002-09-12 Cenas Ag Verfahren zum Nachweis spezifischer Proteine und Verwendung
US7435540B2 (en) 2002-09-27 2008-10-14 Idexx Corporation PrPSc-selective peptides
WO2005068491A1 (fr) * 2004-01-15 2005-07-28 Sergey Ivanovich Chernysh Peptides antitumoraux et antiviraux
US8372406B2 (en) 2004-01-15 2013-02-12 Sergey Chernysh Antitumoral and antiviral peptides
DE102004043782A1 (de) * 2004-09-08 2006-03-09 Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf Polypeptide und Verfahren zur spezifischen Bindung von Prionen
EP1848830A2 (de) * 2005-01-13 2007-10-31 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Isolierung pathogener prione
EP1848830A4 (de) * 2005-01-13 2009-05-06 Novartis Vaccines & Diagnostic Isolierung pathogener prione
US7834144B2 (en) 2005-09-09 2010-11-16 Novartis Ag Prion-specific peptoid reagents
EA009555B1 (ru) * 2005-11-30 2008-02-28 Сергей Иванович Черныш Пептид, обладающий иммуномодулирующей активностью, и фармацевтическая композиция

Also Published As

Publication number Publication date
WO1999015651A1 (de) 1999-04-01
EP1012287A1 (de) 2000-06-28
AU9744898A (en) 1999-04-12

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