DE60014372T2

DE60014372T2 - Polypeptid-enthaltende zusammensetzungen, hergestellt durch verwendung von matrizen in gestalt eines coiled-coil und deren gebrauch

Info

Publication number: DE60014372T2
Application number: DE60014372T
Authority: DE
Inventors: Leslie H. Kondejewski; Randall T. Sherwood Park Irvin; Robert S. Edmonton Hodges
Original assignee: University of Alberta
Current assignee: University of Alberta
Priority date: 1999-06-25
Filing date: 2000-06-23
Publication date: 2006-02-02
Anticipated expiration: 2020-06-24
Also published as: CA2377618A1; EP1191836B1; WO2001000010A9; DE60014372D1; EP1191836A1; AU5666300A; WO2001000010A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft synthetische Polypeptid-Zusammensetzungen, die ein selektiertes Epitop aus einer α-helikalen Oberflächenregion eines Proteins umfassen, das in eine Coiled-coil-Polypeptid-Matrize eingefügt ist. Das Epitop, das in der Matrize festgehalten wird, wird zur Präsentation als Antigen dargeboten. Auf diese Weise können Konformations-spezifische Antikörper zur Verwendung als therapeutische und diagnostische Liganden erzeugt werden.
Ausgangspunkt der Erfindung
Eine Proteinbindung oder Protein-Protein-Wechselwirkung kann in breiter Weise als diskrete Wechselwirkung der Oberfläche eines Proteins mit der Oberfläche eines anderen Proteins definiert werden. Solche diskreten Interaktionen treten auf, wenn die Reste eines Proteins nahe den Resten eines anderen Proteins angeordnet sind und zwischen den Resten Anziehungskräfte bestehen, wie z. B. Van-der-Waals-Kräfte, Ionenbindung und Wasserstoff-Brückenbindungen. Spezielle Protein-Protein-Wechselwirkungen, die in höheren lebenden Organismen auftreten, schließen beispielsweise eine Rezeptor-Bindungsproteinbindung an einen Rezeptor; eine Pathogen-Antigen-Bindung an einen Wirtszellrezeptor und Proteinwechselwirkungen an zellulären Anlagerungs- bzw. Bindungsstellen, ein.
Proteine und insbesondere pathogene Proteine wie beispielsweise Bakterien, Pilze, Parasiten und Viren, exprimieren spezifische Antigene auf ihrer Oberfläche zur Interaktion. Es existieren typischerweise auf Antigenen spezielle Stellen bzw. Orte, hierin nachstehend als Bindungsepitope oder Epitope bezeichnet, die an einen komplementären Anteil eines zellulären Proteins binden, der als ein Rezeptorort bezeichnet wird.
Die Identifizierung und/oder Herstellung von Verbindungen, beispielsweise von Peptid- oder Polypeptidverbindungen, die spezifisch entweder Protein-Protein-Wechselwirkungen in Zellen simulieren, d. h. nachahmen, oder blockieren, ist für eine Vielzahl therapeutischer und diagnostischer Zwecke wünschenswert und es wurde beträchtlicher Aufwand betrieben, um Protein-Epitope zu identifizieren. Das Epitop muss, um in therapeutischen und diagnostischen Gebieten von Nutzen zu sein, dargestellt und zur Wechselwirkung mit anderen Proteinen präsentiert werden.
Zusammenfassung der Erfindung
Es ist demgemäß eine Aufgabe der Erfindung, eine synthetische Polypeptid-Zusammensetzung zum Display und zur Darstellung bzw. Präsentation eines Epitops aus einem ausgewählten Protein bereitzustellen.
Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, eine synthetische Polypeptid-Zusammensetzung bereitzustellen, die dazu wirksam ist, Antikörper gegen eine spezifische Konformation eines Protein-Epitops zu erzeugen.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein synthetisches Polypeptid bereitzustellen, das ein Epitop zur Erzeugung von Antikörpern darstellt, die das native Protein, aus dem das Epitop ausgewählt ist, erkennen und an dieses binden können.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Stabilisieren eines Epitops aus einem α-helikalen Protein bereitzustellen, das in seinem nativen Zustand nicht in einer Coiled-coil-Konformation vorliegt.
WO-A-96/38783 offenbart, dass ein Leucin-Zipper mit einem Polypeptid fusioniert werden kann, wie beispielsweise die IL-2-Rezeptor-Ektodomäne, um die Oligomerisierung des sich ergebenden Fusionsproteins zu erhöhen.
Demgemäß schließt in einem Aspekt die Erfindung eine Coiled-coil-Polypeptidzusammensetzung ein, die eine Matrize der Form (ab_ic_ide_if_ig_i)_n umfasst, wobei n zumindest 3 ist, a und d Aminosäuren sind, ausgewählt aus der Gruppe, die aus Leucin, Isoleucin, Valin, Phenylalanin, Methionin, Thyrosin und Derivaten hiervon besteht. Die durch die Positionen (b_ic_ie_if_ig_i)_n gebildete Sequenz ist eine Aminosäuresequenz aus einer Lösungsmittel-zugänglichen Region eines Epitops eines ausgewählten Proteins, die in ihrem nativen Zustand nicht in einer Coiled-coil-Konformation vorliegt.
In einer Ausführungsform ist a Isoleucin und d Leucin.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst das Coiled-coil-Polypeptid zwei Polypeptidketten, die in einer parallelen Konfiguration angeordnet sind.
In einer noch weiteren Ausführungsform ist n zwischen ungefähr 3 und ungefähr 20 und besonders bevorzugt zwischen ungefähr 5 und ungefähr 10.
Die Epitope sind in einer noch weiteren Ausführungsform aus α-helikalen Oberflächenregionen eines zellulären Prion-Proteins oder alternativ aus exponierten Oberflächenregionen infektiöser Prionproteine ausgewählt. Die ausgewählten Epitope können beispielsweise die Epitope sein, die durch SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 oder SEQ ID NO:7 dargestellt sind.
Das zelluläre Prion-Protein kann aus irgendeiner Spezies stammen und ist in bevorzugten Ausführungsformen aus der Maus, Hamster, Rind, Schaf und humanen zellulärem Prion-Protein ausgewählt.
In einem weiteren Aspekt schließt die Erfindung ein Verfahren zum Stabilisieren und Darstellen eines Epitops in einem synthetischen α-helikalen Coiled-coil-Polypeptid ein. Das Verfahren schließt die Herstellung eines Coiled-coil-Polypeptids ein, das eine Matrize der oben beschrieben Form umfasst.
Gemäß eines noch weiteren Grundgedankens der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung von Antikörpern, die für eine spezielle Konformation eines Protein-Epitops spezifisch sind, beschrieben. Das Verfahren schließt die Herstellung eines Coiled-coil-Polypeptids ein, das in einer oben beschriebenen Matrize enthalten ist.
Gemäß eines noch weiteren Grundgedankens stellt die vorliegende Erfindung ein Coiled-coil-Polypeptid bereit, das die Formel (ab_ic_ide_if_ig_i)_n umfasst, wobei jedes (ab_ic_ide_if_ig_i) eine Heptad-Einheit bildet, wobei jede Heptad-Einheit eine unterschiedliche Aminosäuresequenz enthalten kann und n zumindest 3 ist, wobei das Polypeptid durch Folgendes hergestellt wird: (a) unabhängiges Einfügen einer Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe, die aus Leucin, Isoleucin, Valin, Phenylalanin, Methionin, Tyrosin und Derivaten hiervon besteht, in jeder der a- und d-Positionen; und (b) Auswählen einer Lösungsmittel-zugänglichen Region eines Epitops eines ausgewählten Proteins, wobei die Region in ihrem nativen Zustand nicht in einer Coiled-coil-Konformation vorliegt und Einfügen der Aminosäuren aus der Region in die b_i-, c_i-, e_i-, f_i- und g_i-Positionen; wobei (ab_ic_ide_if_ig_i)_n einen Coiled-Coil bildet.
Gemäß eines noch weiteren Grundgedankens stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Coiled-coil-Peptids bereit, das die Formel (ab_ic_ide_if_ig_i)_n umfasst, wobei jedes (ab_ic_ide_if_ig_i) eine Heptad-Einheit bildet, wobei jede Heptad-Einheit eine unterschiedliche Aminosäuresequenz enthalten kann und n zumindest 3 ist, das Folgendes umfasst. (a) Unabhängiges Einfügen einer Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe, die aus Leucin, Isoleucin, Valin, Phenylalanin, Methionin, Tyrosin und Derivaten hiervon besteht, in jede der a- und d-Positionen; und (b) Auswählen einer Lösungsmittel-zugänglichen Region eines Epitops eines ausgewählten natürlichen Proteins, wobei die Region in ihrem nativen Zustand nicht in einer Coiled-coil-Konformation vorliegt, und Einfügen der Aminosäuren aus der Region in die b_i-, c_i-, e_i-, f_i- und g_i-Positionen.
Diese und weitere Aufgaben und Merkmale der Erfindung werden klarer erkannt werden, wenn die nachfolgende ausführliche Beschreibung der Erfindung in Verbindung mit den begleitenden Zeichnungen gelesen wird.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine helikale Rad-Darstellung einer Heptad-Einheit in einem α-helikalen Coiled-coil;
2 ist eine schematische Darstellung eines Coiled-coil-Dimerisierungsmotivs, das als die α-helikale Matrize verwendet wird, um lineare native α-helikale Peptid-Sequenzen in einer α-helikalen Konformation zu stabilisieren;
3 ist eine lineare Darstellung einer Einzelkette der α-helikalen Coiled-coil-Matrize;
4a–4b zeigen synthetische Peptide, die aus Maus-Prion Helix-1 (4a) und Maus-Prion Helix-3 (4b) gebildet sind; und
5 zeigt ein zirkuläres Dichroismus (CD)-Spektrum des synthetischen Polypeptid-Coiled-coil-Konstruktes von 4B (geschlossene Kreise) und eines linearen, einkettigen (nicht Coiled-coil) Polypeptid-Konstruktes (offene Kreise).
Kurze Beschreibung der Sequenzen

SEQ ID NO:1 ist die Sequenz des 124-226-Fragmentes des humanen Prion-Proteins;
SEQ ID NO:2 ist die Sequenz des 124-226-Fragments des Maus-Prion-Proteins;
SEQ ID NO:3 ist die Sequenz des 124-226-Fragmentes des Schaf-Prion-Proteins;
SEQ ID NO:4 ist die Sequenz des 124-226-Fragmentes des Rinder-Prion-Proteins;
SEQ ID NO:5 ist die α-helikale-1 Region des Maus-Prion-Proteins;
SEQ ID NO:6 ist die α-helikale-2 Region des Maus-Prion-Proteins;
SEQ ID NO:7 ist die α-helikale-3 Region des Maus-Prion-Froteins;
SEQ ID NO:8 ist die Sequenz, die durch Einfügen der α-helikalen-1 Region des Maus-Prion-Proteins in die α-helikale Matrize gebildet wird; und
SEQ ID NO:9 ist die Sequenz, die durch Einfügen der α-helikalen-3 Region des Maus-Prion-Proteins in die α-helikale Matrize gebildet wird.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung
I. Definitionen
Die Begriffe „Peptid" und „Polypeptid", austauschbar verwendet, bezeichnen eine Kette von Aminosäure-basierten Polyamiden. Die Kette kann in ihrer Länge irgendwo von 2 Aminosäuren bis 100 oder mehr Aminosäuren variieren. Weiterhin betrifft der Begriff „heterodimeres Polypeptid" zwei verbundene nicht-identische Polypeptidketten. Der Begriff „Homodimerpolypeptid" betrifft zwei verbundene identische Polypeptidketten.
„Epitop", wie hierin verwendet, beschreibt die Aminosäurekomponente eines Moleküls und die Strukturkomponente eines Moleküls, das für spezifische Wechselwirkungen mit einem entsprechenden Antikörper (Immunglobulin)-Molekül verantwortlich ist, die vom selben oder einem verwandten Antigen hervorgerufen wird. Epitope können entweder linear oder konformational sein. Lineare Epitope betreffen benachbarte Aminosäurereste in einer Sequenz, wohingegen Konformationsepitope aus nicht-benachbarten Aminosäuren in der Sequenz gebildet werden, und sind sowohl von der Sekundär- als auch Tertiärstruktur des Moleküls abhängig.
„Entspricht" und „abgeleitet von" betrifft eine Aminosäuresequenz, die auf einer ersten Aminosäuresequenz basiert, wobei einige Reste in der ersten Aminosäuresequenz durch andere Ami nosäurereste ersetzt oder substituiert werden, und wobei solche Substitutionen die biologische Funktion der Aminosäuresequenz nicht verändern.
Ein „Derivat", wie in einem Derivat einer Aminosäure, betrifft eine Aminosäure, die in einer solchen Weise modifiziert wurde, dass die chemische Struktur verändert oder ausgetauscht wurde, wobei eine solche Veränderung die Funktion oder Aktivität eines Polypeptids, das die veränderte Aminosäure anstelle der nativen Aminosäure einschließt, nicht merklich beeinträchtigt.
Der Begriff „Lösungsmittel-exponiert" und „Lösungsmittel-zugänglich" wird austauschbar verwendet und betrifft die Aminosäurereste in einem α-helikalen Coil- oder Coiled-coil-Polypeptid, die auf der Außenoberfläche des Coils dargestellt werden und zur Wechselwirkung mit einem Protein verfügbar sind.
Soweit nichts anderes angegeben ist, ist die Sequenz für Peptide und Polypeptide in der Reihenfolge vom Aminoterminus zum Carboxylterminus angegeben. Alle Aminosäurereste, die hierin identifiziert sind, liegen in der natürlichen oder L-Konfiguration vor, soweit nichts anderes angegeben ist. Unter Beibehaltung der Standardpeptid-Nomenklatur werden Abkürzungen für Aminosäurereste als Standard-3-Buchstaben- und/oder 1-Buchstabencode, die üblicherweise in der Technik verwendet werden, benutzt.
II. Allgemeine Coiled-coil-Zusammensetzungen
Die vorliegende Erfindung betrifft Polypeptid-Zusammensetzungen, bei denen die Lösungsmittel-zugänglichen Reste eines Epitops aus einer α-helikalen Region eines Proteins, das normalerweise nicht in einer Coiled-coil-Konformation vorliegt, in eine konformationell eingeschränkte, stabilisierte Coiled-coil-Matrize eingefügt wird. Wie unten beschrieben wird, ermöglicht die Matrize oder das Gerüst die Präsentation bzw. Darbietung der Lösungsmittel-zugänglichen Aminosäurereste des Epitops in einer fixierten Coiled-coil-Konformation. Das Coiled-coil weist eine Sequenz auf, die „invariante" Positionen und „variable" Positionen enthält. Die invarianten Positionen erhalten oder stabilisieren das Peptid in einer α-helikalen Coiled-coil-Konformation. In den variablen Positionen wird jede erwünschte Epitop-Sequenzen) eingefügt, wie beschrieben werden wird. Wie ebenfalls nachstehend beschrieben wird, können α-helikale Polypeptide, die auf Grundlage der Matrize gebildet werden, dazu verwendet werden, einen zweisträngigen Coiled-coil zu bilden, wobei die Stränge entweder homodimer oder heterodimer sind und in paralleler oder antiparalleler Orientierung vorliegen können. Eine einzelne Polypeptid-α-helikale Kette kann auch unter Verwendung der Matrize konstruiert werden, wobei die einzelne Polypeptidkette sich durch sich selbst in einer antiparallelen Weise zur Bildung der Coiled-coil zurückfalten kann.
Die Peptide in einer α-helikalen Coiled-coil-Konformation binden aneinander reversibel in einer charakteristischen Weise, die durch die Identität der Reste an den invarianten Positionen des Peptids bestimmt wird. Die Tertiärstruktur einer Coiled-coil-α-Helix ist derart, dass sieben Aminosäurereste in der primären Sequenz ungefähr zwei Drehungen bzw. Windungen des Coiled-coil entsprechen. Eine primäre Aminosäuresequenz, die eine α-helikale Coiled-coil-Konformation entstehen lässt, kann in Einheiten von sieben Resten, die als Heptade bezeichnet werden, zerkleinert werden.
1 zeigt eine helikale Rad-Darstellung einer α-Helix in einem Coiled-coil. Die Positionen der Seitenketten, die die Heptad-Einheit bilden, werden durch die Buchstaben a, b, c, d, e, f und g bezeichnet. In einer idealen α-Helix existieren 3,6 Reste pro vollständiger Umdrehung oder Drehung von 100° pro Rest. Wie aus der Zeichnung entnommen werden kann, liegen die a- und d-Seitenketten oder -Reste entlang einer Seite der Helix, die hierin als die Innen- oder hydrophobe Kernregion bezeichnet wird. Die Aminosäurereste an den Positionen b, c, e, f und g sollen an der externen, exponierten oder „Lösungsmittel-zugänglichen" Region der Helix liegen.
Diese Regionen werden klarer in 2 veranschaulicht, wobei zwei α-helikale Polypeptid-Ketten 12 und 14 in Kontakt in einer parallelen Konfiguration dargestellt sind. In einer parallelen Konfiguration werden zwei Polypeptidhelices derart aneinander ausgerichtet bzw. aligned, dass sie dieselbe Orientierung aufweisen, Amino-terminal (N) zu Carboxy-terminal (C). In einer antiparallelen Konfiguration werden die Helices derart angeordnet, dass das Amino-terminale Ende einer Helix mit dem Carboxy-terminalen Ende der anderen Helix ausgerichtet ist. In 2 sind die beiden Helices 12, 14 entlang der durch die a- und d- (oder a'- und d' auf der zweiten Helix) Positionen definierten Oberfläche in Berührung, beispielsweise Region 16, die hierin als die „innere" Region eines Coiled-coil bezeichnet werden. Die Reste in den a- und d-Positionen sind vorzugsweise sich regelmäßig wiederholende Aminosäurereste, die hydrophob sind, um die Dimerisierung anzutreiben und die Struktur zu stabilisieren. Diese hydrophoben Reste sind insofern in der Matrize „invariant", als sie aus den Aminosäuren Leucin, Isoleucin, Valin, Phenylalanin, Methionin, Tyrosin oder Derivaten hiervon ausgewählt sind. In einer bevorzugten Ausführungsform ist Position a Isoleucin und Position d Leucin.
Unter fortwährender Bezugnahme auf 2 liegen die Reste an den Positionen b, c, e, f und g, von denen einige in 2 durch 18, 20, 22, 24, 26 identifiziert sind, an der nach außen gerichteten Seite des Coiled-coil-Gerüstes und sind mit dem Lösungsmittel in Kontakt, in dem das Coiled-coil-Gerüst suspendiert ist. Diese Positionen werden hierin als „Lösungsmittel-zugängliche" Reste bezeichnet.
Die Matrize zur Verwendung in der Erfindung ist in 3 eher in einer linearen Anordnung als in einer Coiled-coil-Anordnung zu Zwecken der Vereinfachung der Ansicht dargestellt. Jede Polypeptidkette in der Coiled-coil liegt in der Form (ab_ic_ide_if_ig_i)_n vor. Die Variable n kann von ungefähr 3 bis ungefähr 50, besonders bevorzugt von ungefähr 3 bis ungefähr 20 sein und noch mehr bevorzugt ist n von ungefähr 5 bis ungefähr 10. In 3 sind die Heptade für n = 1 und n = 2 dargestellt. Die Positionen a und d in jedem Heptad des Polypeptids sind Aminosäuren, ausgewählt aus der Gruppe, die oben erwähnt wurde, und sind vorzugsweise Isoleucin bzw. Leucin. Die Positionen (b_ic_ie_if_ig_i)_n entsprechen den „Lösungsmittel-zugänglichen" Positionen einer Epitop-Sequenz aus einem ausgewählten Protein, wie nunmehr beschrieben werden wird.
Epitope, d. h. die strukturellen Komponenten eines Moleküls wie beispielsweise eines Polypeptids oder Proteins, die für spezifische Wechselwirkungen mit entsprechenden Antikörpermolekülen verantwortlich sind, sind für eine breite Vielzahl von Proteinen hervorgebracht worden. Beispielsweise wurden Epitope von Proteinen aus pathogenen Mikroorganismen für den felinen Leukämievirus (Elder, J.H. et al., J. Virol. 61: 8–15, 1987), Hepatitis B (Gerin, J.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2365–2369, 1983), für Plasmodium falciparum (Cheung, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8328–8332, 1986), für Cholera-Toxin (Jacob, C.O. et al., Eur. J. Immunol. 16: 1057–1062, 1986) und andere identifiziert. Die Epitope zeigen eine spezifische Reaktion bzw. Antwort und solche, die eine erwünschte Antwort zeigen, können durch Methodologien identifiziert werden, die dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind. Beispielsweise beschreibt US-Patent Nr. 5 637 677 ein Verfahren zum Identifizieren spezieller linearer und eingeengter bzw. eingeschränkter diskreter Anteile biologisch aktiver Proteine, die in Protein-Protein-Wechelwirkungen mit involviert sind.
In der vorliegenden Erfindung werden die Aminosäuren in den Lösungsmittel-zugänglichen Positionen b, c, e, f und g eines ausgewählten Epitops in die Coiled-coil-Matrize in einer entsprechenden Position b_i, c_i, e_i, f_i, g_i eingefügt. Die a- und d-Positionen aus dem Epitop werden zugunsten ausgewählter hydrophober Reste, beispielsweise Isoleucin und Leucin, in der Matrize ersetzt. Somit wird das ausgewählte Epitop in die Matrize diskontinuierlich eingefügt, weil nur die Lösungsmittel-zugänglichen, exponierten Reste des Epitops in die Matrize eingefügt werden.
Die Sequenz der Lösungsmittel-zugänglichen Reste des Epitops werden, wenn sie einmal in die α-helikale Matrize eingefügt sind, in einer α-helikalen Konformation zur Präsentation des Epitops zur anschließenden Interaktion und Bindung stabilisiert. Als solches ist das synthetische Polypeptid biologisch aktiv und ahmt die biologische Aktivität und/oder Struktur des nativen α-helikalen Proteins nach. Wie unten ausführlicher beschrieben wird, können unter Verwendung der Matrize und eines erwünschten Epitops biologisch aktive Peptide konstruiert werden, die als Liganden fungieren, die durch Bindung an die Rezeptororte dieser Zellen auf Säugetierzellen einwirken, um ihre Funktion oder Verhalten zu verändern oder zu beeinflussen, oder um die Bindung des natürlichen biologisch aktiven Proteins an den zellulären Rezeptor zu verhindern wodurch das biologisch aktive Protein von einer Beeinflussung der Zelle gehindert wird. Zusätzlich können synthetische Peptide, die unter Verwendung der Matrize und eines erwünschten Epitops gebildet werden, zur Erzeugung von Antikörpern verwendet werden, die für ein Konformations-Epitop spezifisch und mit diesem reaktiv sind, das auf dem nativen Protein vorliegt, aus dem das Epitop abgeleitet ist.
Wie in den unten dargelegten Beispielen ersichtlich ist, wird in einer Ausführungsform ein einzelnes Epitop in die Matrize eingeführt. Das einzelne Epitop kann in die Matrize ein oder mehrmals eingefügt sein, abhängig von der Länge des Epitops und von der erwünschten Funktion. Beispielsweise besteht ein Epitop, das eine Sequenz aus 42 Aminosäureresten aufweist, was 6 Heptad-Einheiten entspricht, aus 12 Resten an den Positionen a und d und 30 Resten an den Positionen b, c, e, f und g. Die 30 Reste an den Lösungsmittel-zugänglichen Positionen b, c, e, f und g werden in die Matrize in-Phase eingefügt, d. h. in eine entsprechende b-, c-, e-, f- oder g-Position. Die a- und d-Reste des Epitops sind nicht notwendigerweise in die Matrize mit eingebaut, weil die Matrizen a- und d-Positionen fixierte, hydrophobe Reste sind, wie beispielsweise Isoleucin und Leucin. Multiple Peptide mit denselben Epitopen können konstruiert werden und zwei Ketten können wechselwirken oder können weiter in ihrer Wechselwirkung, beispielsweise durch eine Disulfid-Brücke, zur Bildung eines stabilisierten, homodimeren Coiled-coil-Polypeptids unterstützt werden.
Es wurden Studien durchgeführt, um die Erfindung zu unterstützen, wobei synthetische coiled-coil-Polypeptide unter Verwendung von Epitopen aus Mausprionen-Proteinen konstruiert wurden. Insbesondere wurden die Lösungsmittel-zugänglichen Reste der Epitope, die aus zellulä rem Prionen-Protein gewonnen wurden, PrP^c, in die Matrize eingefügt. Die so gebildeten synthetischen Polypeptide dienen als Peptidyl-Mimetika und sind beim Identifizieren von Liganden von Gebrauch, die selektiv Struktur-Epitope auf PrP^c unter nativen Bedingungen erkennen.
Prionen (Kurzbezeichnung für Protein-artige infektiöse Teilchen) sind in einer Vielzahl erblicher und infektiöser neurodegenerativer Erkrankungen bzw. Störungen in Vieh involviert, genauso wie in Menschen (s. Pruisner et al., 1998, und die darin genannten Bezugnahmen). Menschliche Erkrankungen, wie beispielsweise die Creutzfeldt-Jacob-Krankheit (CJD), die Gerstmann-Staussler-Scheinker-Krankheit und die fatale familiäre Insomnie sind möglicherweise Prionen-Erkrankungen. Die bovine spongiforme Enzephalitis (BSE) und Scrapie des Schafes sind Beispiele für Prionen-Erkrankungen bei Tieren, bei denen zu befürchten ist, dass ihre Übertragung auf Menschen durch Ernährung mit Fleischprodukten möglich ist. Die Prionen-Krankheiten sind alle fatal und tödlich und teilen ähnliche pathologische Veränderungen, wobei das Vorliegen von Plaque und Läsionen in den Gehirnen infizierter Individuen zu finden ist. In befallenen Menschen oder Tieren sind der Verlust einer physischen Koordination, gefolgt von Demenz und Tod für das Fortschreiten der Prionen-Erkrankungen charakteristisch.
Es wird weithin akzeptiert, dass Prionen-Proteine selbst und nicht die Virusteilchen für die Prionen-Krankheiten verantwortlich sind. Es wird angenommen, dass das normale Prion-Protein, PrP^c, in eine infektiöse Form, nämlich PrP^sc, mittels einer Konformationsänderung des Proteins transformiert wird. Solche Konformationsänderungen von Proteinen wurden in vitro unter Verwendung zellfreier Systeme mit im Wesentlichen aufgereinigten Komponenten demonstriert (Kocisko, D.A. et al., Nature 370: 471–474, 1994) und in vivo unter Verwendung von Tiermodellen (Telling, G.C. et al., Science 274: 2079–2082, 1996). Eine Konformations-änderung scheint von der normalen α-helikalen Form des Proteins (PrP^c) in eine infektiöse β-Faltblattform des Proteins (PrP^sc) zu erfolgen. Fourier-transform Infrarot (FTIR) und Zirkulardichroismus-Studien (CD) zeigten, dass PrP^c ungefähr 40% α-Helix und 3% β-Faltblatt enthält, wohingegen PrP^sc aus ungefähr 30% α-Helix und 45% β-Faltblatt zusammengesetzt ist (Pan, K.M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10962–6, 1993, Pergami, P. et al., Anal. Biochem. 236: 63–73, 1996). Die beiden Formen haben getrennte physikalische Eigenschaften, wobei PrP^c löslich und gegenüber einem proteolytischen Verdau empfindlich ist und PrP^sc wasserunlöslich und gegenüber einer proteolytischen Verdauung resistent ist. Die Unlöslichkeit der PrP^sc-Form ist wahrscheinlich für die charakteristische Bildung von Plaques infizierter Individuen verantwortlich. Ein weiterer Beweis für die Rolle einer Konformations-änderung von α-Helix zu β-Faltblatt in der Prionen-Erkrankung kommt aus der Arbeit mit Peptiden, die aus dem Prionen- Protein gewonnen wurden (Zhang, L. et al., J. Mol. Biol. 250: 513–526, 1995). Diese Peptide können entweder in einer α-helikalen oder β-Faltblatt-Konformation vorliegen, abhängig von Lösungsmittelbedingungen wie beispielsweise Salz und organische Lösungsmittelkonzentration ebenso wie pH. Weiterhin können diese Peptide ebenfalls Plaque oder Fibrillen in vitro bilden. Es wurde kürzlich gezeigt, dass normales PrP^c in zwei unterschiedliche Formen von PrP^sc umgewandelt werden kann, abhängig vom Typ eines abnormalen Prions, das verwendet wurde, um die Umwandlung zu initiieren (Telling, G.C. et al., Science 274: 2079–2082, 1996).
Das Prionen-Protein ist aus ungefähr 250 Resten zusammengesetzt, die proteolytisch verarbeitet werden, um das 22 Reste N-terminale Signalpeptid und 23 C-terminale Aminosäuren nach Zusatz des Glycosylphosphatidylinositol-Ankers zu Ser-231 (Prusiner, S.B., Trends Biochem. Sci. 21: 482–487, 1996; Prusiner, S.B., Science 278: 245–251, 1997) zu entfernen. Das prozessierte Protein enthält eine Disulfid-Brücke (179 bis 214) und Glycosylierungs-Orte bei Asn-181 und Asn-197. Der Protease-resistente Kern des Prionen-Proteins ist aus den Resten 90–231 zusammengesetzt, das ausreichend ist, um die Infektivität zu übertragen. Die Sequenz eines Prionen-Proteins für viele Tierspezies wurde bereits ans Licht gebracht (Billeter, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 7281–7285, 1997) und Teilfragmente für einige der Spezies sind hier als SEQ ID NO:1-4 bereitgestellt. Es wurde gezeigt, dass ein trunkiertes Segment eines rekombinanten Maus-Prionen-Proteins, nämlich PrP^c (121–231) eine autonome Falteinheit ist (Hornemann, S. et a.., J. Mol., Biol. 262: 214–619, 1996). Vermutlich ist die Struktur dieses Segmentes derjenigen ähnlich, die in PrP^c zu finden ist. Diese Erkenntnis hat zur Hypothese geführt, dass die Konformationsänderung, die zur infektiösen Form PrP^sc führt, in diesem Segment auftritt. Die NMR-Struktur desselben Segments des Maus-Prionen-Proteins wurde gelöst (Riek, R., et al. Nature 382: 180–192, 1996). Die dreidimensionale Struktur enthüllt die Existenz von drei α-Helices und eines antiparallelen zweisträngigen β-Faltblatts (128–131 und 161–164). Helix-1 (Reste 144–154; SEQ ID NO:5) ist ein wenig isoliert, Helix-2 (Reste 179–193; SEQ ID NO:6) und Helix-3 (Reste 200–217; SEQ ID NO:7) interagieren enger miteinander und laufen antiparallel. Die Helix-2 und die Helix-3 sind zusammen durch eine Disulfid-Brücke verbunden. Das zweisträngige β-Faltblatt liegt auf der α-Helix.
Eine im Wesentlichen identische MNR-Struktur wurde für das syrische Hamster-Prion-Protein bestimmt (90–231) (James, T.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 10086–91, 1997). Die NMR-Lösungsstrukturen von rekombinanten Prionen-Protein in voller Länge von der Maus (Riek, R. et al., FEBS Lett. 413: 282–288, 1997) und vom syrischen Hamster (Donne et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 13452–7, 1997) wurden anschließend bestimmt und zeigen, dass die N-Ter mini dieser beiden Proteine keine definierten Elemente einer Sekundärstruktur aufweisen und unter den verwendeten experimentellen Bedingungen hoch flexibel sind. Obwohl diese Strukturen ähnlich sind, unterscheiden sie sich im Detail, was interessant ist und am wahrscheinlichsten die subtile Abhängigkeit demonstriert, die die Prion-Sequenz vom exakten wässrigen Milieu hat, in dem die Strukturen aufgezeichnet wurden. Diese Erkenntnis stützt die Behauptung, dass die hauptsächlichen strukturellen Veränderungen bei der Umwandlung von PrP^c zu PrP^sc in den Rest-121-231-Regionen auftreten.
In den in Unterstützung der Erfindung durchgeführten Studien wurden Peptidyl-Mimetika der drei α-Helices, der Helix-1 (SEQ ID NO:5), der Helix-2 (SEQ ID NO:6) und der Helix-3 (SEQ ID NO:7) entwickelt. α-Helices in Proteinen sind typischerweise 10–20 Aminosäurereste lang. Dieselben Segmente sind als isolierte Peptide im allgemeinen frei von Strukturen und nehmen unter wässrigen Bedingungen multiple zufallsartige Konformationen an. Die Segmente können unter Verwendung der hierin beschriebenen Matrize eingezwängt und stabilisiert werden, wie es noch weiter beschrieben werden wird.
Auf Grundlage der Lösungs- bzw. Auflösungsstruktur von Maus-PrP^c (123–231) und von Molekularmodell-Studien werden die Reste von jedem der drei α-helikalen Segmente, die Lösungsmittel-exponiert sind (zugänglich, um als Epitope zu dienen) ebenso wie solche, die nicht Lösungsmittel-zugänglich sind, identifiziert. Die Bestimmung der Lösungsmittel-zügänglichen und internen Reste ermöglicht die Insertion der Epitop-Reste in die Matrize auf einem solchen Weg, dass dieselbe Lösungsmittel-exponierte Oberfläche der Epitop α-Helix im synthetischen Polypeptid basierend auf der Matrize vorliegt.
4A bis 4B zeigen synthetische Polypeptide, die unter Verwendung von Helix-1 (SEQ ID NO:5) (4A) und Helix-3 (SEQ ID NO:7) (4B) von Maus-PrP^c gebildet wurden. 4A illustriert die Einfügung der Lösungsmittel-zugänglichen Reste der Maus-PrP^c-Helix-1 in die Coiled-coil-Matrize. Die Lösungsmittel-nicht-zugänglichen Reste an den a- und d-Positionen in der inneren Region der α-Helix wurden jeweils zugunsten von Ile- und Leu-Resten ersetzt. Das in 4 zur Verwendung in der Bildung einer Coiled-coil gezeigte Konstrukt ist hierin als SEQ ID NO:8 identifiziert.
In ähnlicher Weise, wie in 4B für Helix-3 dargestellt, wurden molekulare Modellstudien durchgeführt, um zu bestimmen, welche Lösungsmittel-unzugänglichen Reste im PrP^c durch geeignete hydrophobe Reste für a und d ersetzt werden könnten, während sichergestellt wird, dass Lösungsmittel-exponierte Reste in den nativen α-Helices nach wie vor auf den exponierten Oberflächen des Mimetikums (Positionen b, c, e, f, und g) zugänglich sind. Das Konstrukt in 4B wurde in einem kovalenten zweisträngigen Coiled-coil bzw. gerollten Knäuel durchgeführt, verbunden durch eine Disulfid-Brücke, die zwischen den N-Termini Cystein-Resten gebildet waren. Alanin-Reste wurden an den N- und C-Termini des Konstruktes eingebracht, weil sie eine hohe helikale Neigung aufweisen. Arginin-Reste wurden dem C-Terminus zugesetzt, um die Ladung und Löslichkeit zu erhöhen, und ein Cystein-Rest wurde am N-Terminus eingebracht, um eine zusätzliche Stabilität für die zwei Helix-3 Coiled-coil-Domänen bereitzustellen. Diese Sequenz ist hierin als SEQ ID NO:9 definiert.
Die Sekundärstruktur der entwickelten Mimetika vor der Bildung einer Disulfid-Brücke wurde durch Zirkulardichroismus(CD)-Spektroskopie evaluiert. Das CD-Spektrum einer α-Helix ist durch zwei große negative Banden einer vergleichbaren Magnitude nahe 208 und 222 nm gekennzeichnet. Für ein vollständiges helikales 14-Reste-Peptid wird ein molarer Elliptizitätswert von ungefähr –30,700 deg cm² dmol^–1 bei 222 nm erwartet. 5 zeigt das CD-Spektrum für das nicht-Disulfid-verbrückte H3-Konstrukt in 4B. Das Spektrum zeigt, dass das Coiled-coil-Dimerisierungsmotiv beim Stabilisieren der α-helikalen Struktur aller Konstrukte hoch effektiv war, wie es durch die große negative Elliptizität bei 222 nm und durch Vergleich mit der linearen Sequenz von Aminosäuren beurteilt wurde, die in der Matrize nicht einbezogen waren (offene Kreise). Der α-helikale Gehalt an Helix-Teil 3 Coiled-coil-Konstrukt wurde als 81% berechnet, auf Grundlage eines Wertes von –34,600 deg cm² dmol^–1 bei 222 nm für ein vollständig α-helikales 33-Reste-Peptid. Der α-helikale Gehalt des Disulfid-verbrückten Helix-3-Konstruktes nähert sich 100% an, weil die Disulfid-Brücke die Konzentrationsabhängigkeit eliminiert, die bei der nicht-Disulfid-verbrückten Form ersichtlich ist (Daten nicht dargestellt). In ähnlicher Weise wurden hohe α-helikale Gehalte für die Helix-1 und Helix-2 Coiled-coil stabilisierten Konstrukte herausgefunden (Daten nicht dargestellt).
Weil die Struktur von mehreren dimeren Coiled-coil-Domänen bekannt ist, wurde ein molekulares Modell für das Helix-3-Konstrukt in einem Coiled-coil-Gerüst durch Homologie-Modellierung erzeugt. Die Modelle zeigten, dass die α-helikalen Bedingungen, die durch das Coiled-coil-Motiv dem Helix-3-Konstrukt auferlegt wurden, eine Struktur zur Folge hat, die derjenigen der nativen Helix-3 identisch ist, mit einer Positionierung von Lösungsmittel-exponierten Nebenketten im Helix-3-Konstrukt, das mit denjenigen in der nativen Helix-3- übereinstimmt. Diese Ergebnisse zeigen, dass die entwickelten Peptide, die den drei α-Helices von PrP^c entspre chen, effektiv in einer α-helikalen Konformation mit einer Positionierung der Lösungsmittel-exponierten Seitenketten effektiv stabilisiert wurden, die solchen der nativen Struktur entsprechen, und sollten deswegen geeignete Peptidyl-Mimetika für diese Elemente einer Sekundärstruktur sein.
III. Verwendungsverfahren
Peptidyl-Mimetika, die unter Verwendung eines ausgewählten Epitops aus einem α-helikalen Protein und der oben beschriebenen Matrize gebildet wurden, finden in einer Vielzahl von Anwendungen Verwendung, beispielsweise als Peptide, gegen die Antikörper erzeugt werden, die gegen eine spezielle Proteinkonformation spezifisch sind. Diese Anwendungen werden nunmehr beschrieben.
A. Antikörpererzeugung
Gemäß eines weiteren Aspektes der Erfindung werden wie oben beschriebene Coiled-coil-Polypeptide dazu verwendet, Antikörper gegen ein spezifisches Epitop, und insbesondere gegen eine spezifische α-helikale Konformation eines Epitops zu erzeugen. Dieser Aspekt wird bezüglich der Prionen-Proteine, die oben diskutiert werden, beschrieben, es wird jedoch klar sein, dass das Konzept in einfacher Weise auf andere Proteine ausgedehnt werden kann.
Gegenwärtige Nachweisverfahren für PrP^c und PrP^sc beruhen auf polyklonalen und monoklonalen Antikörpern, die beide Formen von PrP erkennen können. Die meisten Antikörper im Stand der Technik sind bis jetzt gegen lineare Epitope gerichtet, die sowohl in denaturiertem PrP^c als auch PrP^sc vorliegen. Um zwischen PrP^c und PrP^sc zu unterscheiden, ist es deswegen notwendig, ein Verfahren zu verwenden, das die Protease-Behandlung, gefolgt von einem Immunnachweis auf Western Blots einschließt. Während PrP^c durch Proteolyse abgebaut wird, ist PrP^sc in großem Maße gegenüber einer Proteolyse beständig und ergibt einen Zeichensatz unverdaubarer Produkte PrP27-31, die durch Immunnachweis nachgewiesen werden können. Weil diese Antikörper lediglich denaturierte Formen von PrP erkennen, können sie nur zum Nachweis von PrP unter denaturierenden Bedingungen verwendet werden, wie beispielsweise solche, die zur Immunhistologie verwendet werden oder zum Nachweis von PrP in Extrakten von verschiedenen Geweben oder Flüssigkeiten. Um Assays für native Formen von PrP^c und PrP^sc durchzuführen, ist es notwendig, Liganden zu entwickeln, die selektiv die jeweiligen Formen dieser Proteine erkennen.
In Studien, die in Unterstützung der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden, wurden Coiled-coil-Polypeptide unter Verwendung der drei α-helikalen Regionen von Maus-PrP^c und der Matrize, wie oben beschrieben, bezüglich der 4A bis 4B hergestellt. Die durchgeführte Studie unter Verwendung von Helix-3 (H3) wird beschrieben werden. Die Lösungsmittel-exponierten Reste der Helix-3 wurden in den b-, c-, e-, f- und g-Positionen der Matrize eingefügt, wodurch das H3-Konstrukt von 4B gebildet wird. Das Heterodimer von 4B wurde hergestellt, wobei die Sequenzen der beiden Polypeptidketten identisch waren, außer dass eine der Ketten Glycin (G), Norleucin (Nle) und Benzoylbenzoesäure (BBA) enthielt. Norleucin wurde zugesetzt, um das Peptid/Protein-Trägerverhältnis nach Koppeln des Peptids an einen Träger zu bestimmen, wie es beschrieben werden wird. Die BBA-Gruppe wurde als unspezifisches, photolabiles Vernetzungsmittel zugesetzt, um das Konstrukt mit dem Carrier-Protein kovalent zu verbinden.
Das H3-Heterodimerkonstrukt (4B) wurde an Keyhole Limpet Hämocyanin (KLH) und an Rinderserumalbumin konjugiert, wie es in Beispiel 1A beschrieben ist. Das KLH-Polypeptidkonjugat wurde in Gegenwart von Freund'schem Adjuvants Kaninchen gemäß des in Beispiel 1B dargelegten Verfahrens injiziert. Jedes Testtier empfing eine erste Injektion des KLH-Polypeptids in vollständigem Freund'schem Adjuvants, gefolgt von zwei Wochen später, einer zweiten Injektion des KLH-Polypeptidkonjugats in unvollständigem Freund'schem Adjuvants. Zwei Wochen nach der zweiten Injektion wurden die Serumantikörpertiter unter Verwendung von ELISA, wie in Beispiel 1C beschrieben, bestimmt.
Die Seren aller Testtiere erkannten in starker Weise das Coiled-coil-Polypeptidkonstrukt, das die H3-α-Helix, gekoppelt an BSA, enthielt, in Titern von 1:100.000. Somit erzeugten alle Kaninchen mit dem KLH-Polypeptidkonjugat ausgezeichnete Titer von Antikörpern gegen das Peptid.
Als Vergleichskontrolle wurde die BBA-Nle-Gly-Polypeptidktte an BSA gekoppelt. Die einzelne Polypeptidkette formt keine α-Helix oder Coiled-coil-Struktur, und es hat sich herausgestellt, dass Antikörper an die einzelne Polypeptidkette nicht banden. Dieses Ergebnis beweist, dass Antikörper nur an die H3-Sequenz binden können, wenn sie in einer α-helikalen Konformation vorliegt, die nur auftritt, wenn es eine zweisträngige Coiled-coil-Struktur bildet.
Im Lichte dieser Ergebnisse ist klar, dass Coiled-coil-Polypeptidkonstrukte, die wie hierin gebildet werden, mit den Lösungsmittel-zugänglichen Resten in die Coiled-coil-Matrize eingefügt, ein Verfahren zum Festhalten des Epitops in der notwendigen Konfiguration zur Erzeugung von Antikörpern bereitstellen, die die α-helikale Konformation spezifisch erkennen. Die Antikörper können als diagnostische Liganden verwendet werden. Beispielsweise binden die Antikörper im Falle von Prion-Proteinen zurück an das Coiled-coil-Konstrukt ebenso wie an das native Maus-PrP^c. Somit sind die Antikörperliganden zum Nachweis der Gegenwart von PrP^c und zur Definierung struktureller Veränderungen, die in PrP^sc auftreten, von Nutzen. Liganden, die an PrP^c binden und nicht an PrP^sc, werden darauf hinweisen, welche Helix eine strukturelle Veränderung durchgemacht hat (vielleicht in die β-Faltblattstruktur). Liganden, an die sowohl PrP^c als auch PrP^sc binden, zeigen an, dass diese Helix keine strukturelle Veränderung durchgemacht hat. Diese Information, zusammen mit dem vorgeschlagenen Modell von PrP^c (Huan, Z. et al., Folding & Design 1: 13–19, 1995) ermöglichen die Bestimmung, welche Helices in einer β-Faltblattkonformation festgehalten werden sollen, um PrP^sc-Mimetika zu erzeugen.
Aus dem Vorhergehenden ist ersichtlich, wie verschiedene Aufgaben und Merkmale der Erfindung erfüllt werden. Die Zusammensetzung der Erfindung, die ein ausgewähltes Epitop aus einer α-helikalen Region eines Proteins in einer speziellen Konformation umfasst, wird in eine Coiled-coil-Matrize zum Darstellen bzw. zum Display eingefügt. Es wird für den Fachmann auf dem Gebiet klar sein, dass Epitope aus einem weiten Bereich von α-helikalen Proteinen in die Matrize eingefügt werden können. Die Tertiärstruktur und die Sequenz tausender von Proteinen ist leicht verfügbar. Zusätzlich ermöglichen verschiedene Softwareprogramme die Vorhersage von α-helikalen Epitopen in Proteinen. Somit ist eine breite Vielzahl von Proteinen geeignet und wird zur Anwendung ins Auge gefasst. Insbesondere werden Proteine wie die Prionen, die mehr als eine Konformation aufweisen und in ihrem nativen Zustand nicht in einem Coiled-coil vorliegen, bevorzugt. Epitope aus solchen Proteinen können in die Matrize eingefügt werden, um das Epitop in einer α-helikalen Konformation stabil und fest zu halten. Das Konstrukt wird dann dazu verwendet, Antikörper zu erzeugen, die gegen die α-helikale Konformation spezifisch sind. Diese spezifischen Antikörper weisen einen Wert in diagnostischen und therapeutischen Anwendungen auf, wie es vom Fachmann auf dem Gebiet gewürdigt werden wird.
IV. Beispiele
Die folgenden Beispiele veranschaulichen weiterhin die hierin beschriebene Erfindung und sind keinesfalls eine Einschränkung des Umfangs der Erfindung.
Beispiel 1
Herstellung von Antikörpern gegen das Prion-Helix-3-Konstrukt
A. Konjugation des Heterodimer-H3-Konstruktes an BSA und KLH
10 mg Rinderserumalbumin (BSA; Sigma RIA Güte) und Keyhole Limpet Hämocyanin (KLH; Sigma) wurden in getrennten Reagenzröhrchen eingewogen (10 mm × 75 mm). 8 mg des Coiled-coil-Heterodimerkonstruktes, das in 4B dargestellt ist (SEQ ID NO:9) wurde jedem Reagenzglas zugesetzt.
Dem Glas, das BSA enthielt, wurden 75 μl 100 mM Bicarbonat bzw. Hydrogencarbonat zugesetzt. Dem Reagenzglas, das KLH enthielt, wurden 100 μl Guanidin-HCL (6 mM) zugesetzt. Die Reagenzgläser wurden mit einer Kapillarröhre gerührt, und die Paste wurde auf die Seite des Reagenzglases aufgetragen. Das Gemisch in jedem Rohr wurde dann für 1 Stunde in einem präparativen Rayonet Reaktor photolysiert.
Das BSA-Polypeptidkonjugat wurde mit 6 M Urea (5 ml) gelöst und danach auf einen Dialysebeutel übertragen und für 24 Stunden in 6 M Urea, 24 Stunden in 1 M Urea, 24 Stunden in 1 mM Hydrogencarbonat und 24 Stunden in 10 mM Hydrogencarbonat dialysiert. Das KLH-Polypeptidkonjugat wurde in 6 M Guanidin-HCl (5 ml) gelöst und auf einen Dialysebeutel übertragen und gemäß des Verfahrens des BSA-Polypeptidkonjugats dialysiert.
Nach der Dialyse wurde jedes Konjugat auf 5 ein Dram Vial übertragen und die Dialysebeutel wurden mit Wasser bis zu einem Endvolumen von 7 ml gespült. Eine 30-μl-Probe wurde aus jeder Zubereitung zur Aminosäureanalyse entfernt und der Rückstand wurde bis zur Verwendung eingefroren.
B. Verabreichung eines KLH-Polypeptidkonjugats an Kaninchen
Eine kleine Probe des Blutes der fünf Testkaninchen wurde zur Verwendung als Prä-Immunserum entnommen, um zu bestätigen, dass keines der Kaninchen Antikörper gegen das Testantigen vor der Immunisierung aufwies. Die Blutprobe wurde in einem Zentrifugierröhrchen bzw. Zentrifugenröhrchen angeordnet und bei Raumtemperatur auf Gerinnung eingestellt. Die Seren wurden aus den geronnenen roten Blutzellen durch Zentrifugation bei 3.600 upm für 3–5 Minuten abgetrennt. Die Seren wurden dekantiert und das geronnene Blut wurde verworfen. Die Seren wurden gefroren bis zur Verwendung durch Einfrieren zunächst bei –20°C für 24 Stunden und danach bei –70°C bis zur Verwendung aufbewahrt.
Das KLH-Polypeptidkonjugat wurde zur Injektion durch Mischen von 500 μg des Konjugats in 0,5 ml steriler Phosphat-gepufferter Salzlösung hergestellt. Das Konjugat wurde in eine 3- oder 5-ml-Glasspritze aufgezogen und eine Mikroemulsifikationsnadel wurde aufgesetzt. Eine weitere Spritze mit 0,5 ml vollständigem Freund'schen Adjuvants wurde befestigt, und das Konjugat wurde in das Adjuvants als Bolus gegeben. Das Gemisch wurde zwischen den verbundenen Spritzen hin und her geschüttelt, bis das Gemisch eine weiße Farbe aufwies und die Konsistenz von Mayonnaise hatte.
Das Gemisch wurde subkutan oder intramuskulär in jedes Testkaninchen injiziert, wobei die maximale verabreichte Menge 0,25 ml × 4 Stellen s. c. oder 0,5 ml IM war. Zwei Wochen nach dieser ersten Injektion wurden die Kaninchen mit dem KLH-Polypeptid, vermischt mit unvollständigem Freund'schen Adjuvants, injiziert, hergestellt wie oben beschrieben.
Zwei Wochen nach der zweiten Injektion wurde den Kaninchen eine Blutprobe entnommen und der Antikörpertiter wurde unter Verwendung von ELISA bestimmt.
C. Nachweis der Serumantikörper durch ELISA
Die ELISA-Platten wurden mit BSA-Polypeptidkonjugaten (100 μl pro Well) in einer Peptidkonzntration von 0,2 μg/ml in 100 mM Natriumcarbonat-Fuffer bei pH 9,5 beschichtet. Die Platten wurden über Nacht bei 4°C inkubiert und danach fünfmal mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) bei pH 7,5 (200 μl/Well) gewaschen. Die Platten wurden mit 5% BSA in TPBS, pH 7,5, für 1 Stunde bei 37°C (100 μl/Well) blockiert, wonach die Platten erneut fünfmal mit PBS-Puffer gewaschen wurden.
Seren von allen fünf Testtieren wurden in Puffer bis zu Konzentrationen von 1/1.000; 1/10.000; 1/100.000 und 1/1.000.000 verdünnt. Dieselben Konzentrationen von Prä-Immunseren wurden als Kontrollen verwendet. 100 μl jeder Verdünnung wurden einem Well zugesetzt und die Platte wurde für 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wurde ungebundener Antikörper unter Verwendung von PBS-Puffer (3 ×) gewaschen. Ein zweiter Antikörper, Ziegenanti-Kaninchen-IgG-Meerrettich-Peroxidase-Konjugat (Jackson Labs) wurde 1:5.000 in PBS verdünnt und 100 μl wurden jedem Well zugesetzt. Die Platte wurde für 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wurde ungebundener Antikörper unter Verwendung von PBS-Puffer ausgewaschen (3 ×).
Ein zweiter Antikörper, Ziegen-anti-Kaninchen IgG-Meerettichperoxidase-Konjugat (Jackson Labs) wurde 1:5000 in PBS verdünnt und 100 μl wurden jedem Well zugesetzt. Die Platte wurde für 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Nach Inkubation wurde der Antikörper aus den Wells durch 5 maliges Spülen mit PBS gewaschen.
Die Farbentwicklung wurde bei Raumtemperatur für 30 Minuten unter Schütteln durchgeführt. 2,2-Azino-di-(3-ethylbenzthiazoninsulfonsäure) (ABTS; 24 mg) wurde in 40 ml 100 mM Citratpuffer gelöst, pH 4,2, der 30% Wasserstoffperoxid (40 μl) (150 μl/Well) enthielt. Die Platten wurden bei 405 nm bei 30 Minuten abgelesen. Der Hintergrund-Cut-off wurde durch Entnahme des durchschnittlichen Volumens der Kontroll-Wells und unter Zusatz von 3 × der Standardabweichung des Mittelwerts, berechnet für 30 Wells, berechnet.

Claims

Coiled-coil-Polypeptid-Zusammensetzung, die eine Aminosäuresequenz umfasst, die durch (ab_ic_ide_if_ig_i)_n repräsentiert wird, wobei: jedes (ab_ic_ide_if_ig_i) eine Heptad-Einheit bildet, wobei jede Heptad-Einheit eine andere Aminosäuresequenz enthalten kann und n zumindest 3 ist; a und d Aminosäuren sind, ausgewählt aus der Gruppe, die aus Leucin, Isoleucin, Valin, Phenylalanin, Methionin, Tyrosin und Derivaten hiervon besteht; (b_ic_ie_if_ig_i)_n eine Sequenz von Aminosäuren aus einer Lösungsmittel-zugänglichen Region eines Epitops aus einem ausgewählten Protein ist, wobei die Region in ihrem nativen Zustand nicht in einer Coiled-coil-Konformation vorliegt; und (ab_ic_ide_if_ig_i)_n einen Coiled-coil (gewundenes Knäuel) bildet.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei a Isoleucin ist und d Leucin ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid zwei Polypeptidketten umfasst, die in einer parallelen Konfiguration angeordnet sind.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei n zwischen ungefähr 3 und ungefähr 20 beträgt.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei n zwischen ungefähr 5 und ungefähr 10 beträgt.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Epitope aus α-helikalen Oberflächenregionen zellulärer Prionen-Proteine ausgewählt sind.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Epitope aus exponierten Oberflächenregionen infektiöser Prionen-Proteine ausgewählt sind.
Zusammensetzung nach Anspruch 6, wobei die Sequenz, die durch die Positionen (b_ic_ie_if_ig_i)_n gebildet wird, den Lösungsmittel-zugänglichen Resten eines Epitops entspricht, das eine Sequenz aufweist, ausgewählt aus der Gruppe, die aus SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 7 besteht.
Zusammensetzung nach Anspruch 6, wobei das zelluläre Prionen-Protein aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Maus-, Hamster, Rind-, Schaf- und humanen zellulären Prionen-Protein besteht.
Verfahren zum Stabilisieren und Darstellen eines Epitops in einem synthetischen Polypeptid, das das Herstellen eines Coiled-coil-Polypeptids, das eine Matrize der Form (ab_ic_ide_if_ig_i)_n umfasst, wobei n zumindest 3 ist, a und d Aminosäuren sind, ausgewählt aus Leucin, Isoleucin, Valin, Phenylalanin, Methionin, Tyrosin und Derivaten hiervon, und wobei die Sequenz, gebildet durch die Positionen (b_ic_ie_if_ig_i)_n eine Sequenz von Aminosäuren aus einer Löslichkeits-zugänglichen Region eines Epitops aus einem ausgewählten Protein ist, wobei die Region in ihrem nativen Zustand nicht in einer Coiled-coil-Konformation vorliegt, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Herstellen das Herstellen des Polypeptids umfasst, das eine Matrize aufweist, wobei a Isoleucin und d Leucin ist.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Herstellen ein Herstellen von zumindest zwei Polypeptidketten umfasst, die dasselbe Epitop aufweisen.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Herstellen ein Herstellen des Polypeptids umfasst, das ein Epitop aufweist, ausgewählt aus α-helikalen Oberflächenregionen eines zellulären Prionen-Proteins.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei das zelluläre Prionen-Protein aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Maus-, Hamster-, Rind-, Schaf- und humanem zellulären Prionen-Protein besteht.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die durch die Positionen (b_ic_ie_if_ig_i)_n gebildete Sequenz aus den Lösungsmittel-zugänglichen Resten eines Epitops abgeleitet ist, das eine Sequenz aufweist, ausgewählt aus der Gruppe, die aus SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 7 besteht.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Herstellen das Herstellen des Polypeptids einschließt, das ein Epitop umfasst, ausgewählt aus Lösungsmittel-zugänglichen Regionen infektiöser Prionen-Proteine.
Verfahren zur Herstellung von Antikörpern, die für ein ausgewähltes Epitop aus einem ausgewählten Protein spezifisch sind, umfassend die Herstellung eines Coiled-coil-Polypeptids, das eine Matrize der Form (ab_ic_ide_if_ig_i)_n umfasst, wobei n zumindest 3 ist, a und d Aminosäuren sind, ausgewählt aus der Gruppe, die aus Leucin, Isoleucin, Valin, Phenylalanin, Methionin, Tyrosin und Derivaten hiervon besteht und die Sequenz, die durch die Positionen (b_ic_ie_if_ig_i)_n gebildet wird, eine Sequenz von Aminosäuren aus einer Lösungsmittel-zugänglichen Region eines Epitops aus einem ausgewählten Protein ist, wobei die Region in ihrem nativen Zustand nicht in einer Coiled-coil-Konformation vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Herstellung die Herstellung des Polypeptids einschließt, das eine Matrize umfasst, wobei a Isoleucin und d Leucin ist.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Herstellung eine Herstellung des Polypeptids einschließt, das ein Epitop umfasst, ausgewählt aus α-helikalen Oberflächenregionen eines zellulären Prionen-Proteins.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei das Herstellen ein Herstellen des Polypeptids einschließt, das ein Epitop umfasst, ausgewählt aus Oberflächen-exponierten Regionen infektiöser Prionen-Proteine.
Ein Coiled-coil-Polypeptid, das die Formel (ab_ic_ide_if_ig_i)_n aufweist, wobei jedes (ab_ic_ide_if_ig_i) eine Heptad-Einheit bildet, wobei jede Heptad-Einheit eine andere Aminosäuresequenz enthalten kann und n zumindest 3 ist, wobei das Polypeptid durch Folgendes hergestellt wird: (a) unabhängig Einfügen einer Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe, die aus Leucin, Isoleucin, Valin, Phenylalanin, Methionin, Tyrosin und Derivaten hiervon besteht, in jede der a- und d-Positionen; und (b) Auswählen einer Lösungsmittel-zugänglichen Region eines Epitops eines ausgewählten Proteins, wobei die Region nicht in einer Coiled-coil-Konformation in ihrem nativen Zustand vorliegt, und Einfügen der Aminosäuren aus der Region in die b_i, c_i, e_i, f_i und g_i Positionen; wobei (ab_ic_ide_if_ig_i)_n einen Coiled-Coil bildet.
Polypeptid nach Anspruch 21, wobei a Isoleucin ist und d Leucin ist.
Polypeptid nach Anspruch 21, wobei das Polypeptid zwei Polypeptidketten umfasst, die in einer parallelen Konfiguration angeordnet sind.
Polypeptid nach Anspruch 21, wobei n zwischen ungefähr 3 und ungefähr 20 ist.
Polypeptid nach Anspruch 21, wobei n zwischen 5 und ungefähr 10 ist.
Polypeptid nach Anspruch 21, wobei die Epitope aus α-helikalen Oberflächenregionen eines zellulären Prionen-Proteins ausgewählt sind.
Polypeptid nach Anspruch 21, wobei die Epitope aus exponierten Oberflächenregionen eines infektiösen Prionen-Proteins ausgewählt sind.
Polypeptid nach Anspruch 26, wobei die durch die Positionen (b_ic_ie_if_ig_i)_n gebildete Sequenz den Lösungsmittel-zugänglichen Resten eines Epitops entspricht, das eine Sequenz aufweist, ausgewählt aus der Gruppe, die aus SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 7 besteht.
Polypeptid nach Anspruch 26, wobei das zelluläre Prionen-Protein aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Maus-, Hamster-, Rinder-, Schaf- und humanen zellulären Prionen-Proteinen besteht.
Verfahren zur Herstellung eines Coiled-coil-Polypeptids, das die Formel (ab_ic_ide_if_ig_i)_n umfasst, wobei jedes (ab_ic_ide_if_ig_i) eine Heptad-Einheit bildet, wobei jede Heptad-Einheit eine andere Aminosäuresequenz enthalten kann und n zumindest 3 ist, das Folgendes umfasst: (a) unabhängig Einfügen einer Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe, die aus Leucin, Isoleucin, Valin, Phenylalanin, Methionin, Tyrosin und Derivaten hiervon besteht, in jede der a- und d-Positionen; und (b) Auswählen einer Lösungsmittel-zugänglichen Region eines Epitops eines ausgewählten natürlichen Proteins, wobei die Region nicht in einer Coiled-coil-Konformation in ihrem nativen Zustand vorliegt, und Einfügen der Aminosäuren aus der Region in die b_i, c_i, e_i, f_i und g_i Positionen.
Verfahren nach Anspruch 30, wobei das ausgewählte Protein ein Prionen-Protein ist.