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Diese
Erfindung betrifft hydrolysierte Gelatine, spezieller mit Pepsin
zersetzte Gelatine, die als Stabilisator für injizierbare Trace-Protein-Stoffe
wie Impfstoffe verwendet werden kann.
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Wirksame
Trace-Protein-Stoffe wie injizierbare Impfstoffherstellungen und
Erythropoietin enthalten Gelatine in Form eines Extraktes aus Rinder-
oder Schweinegeweben als Stabilisator. Gelatine wirkt nicht nur als
Stabilisator wirksamer Trace-Protein-Stoffe, sondern auch zum Verhindern
der Koagulation von Proteinen in den Herstellungen und der Adsorption
der wirksamen Trace-Protein-Stoffe an Glasoberflächen und anderen Wandoberflächen von
Behältern.
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Gelatine
ist der Heißwasserextrakt
von Kollagen, welches im lebenden Organismus reichlich in Bindegeweben
vorkommt und weist im Allgemeinen ein geringeres Molekulargewicht
als Kollagen auf. Kollagen weist im Allgemeinen einen hohen Homologiegrad
der Aminosäuresequenz
zwischen Tierarten auf, mindestens 90 % bei Rind, Schwein und Mensch.
Daher weist aus Kollagen gewonnene Gelatine nur geringe allergene
Wirkung auf und wird seit langem als ein Stabilisator von Injektionen
verwendet.
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Kürzlich wurden
Fälle berichtet,
wenn auch sehr wenige, bei denen allergische Reaktionen bei Kleinkindern
nach Inokulation von Impfstoffen beobachtet wurden, und es wurde
gezeigt, dass es sich bei dem Allergen um die in den Impfstoffherstellungen
enthaltene Gelatine handelt. Da ein anti-Gelatine-Immunglobulin E-Antikörper (IgE)
in den Seren allergischer Patienten nachgewiesen wurde, wurde gezeigt,
dass die Allergie gegen Gelatine eine allergische Reaktion vom Typ
I darstellt. Menschliches Serumalbumin ist bekannt als Protein mit
dem gleichen Effekt wie Gelatine, aber bedenkt man das potentielle
Risiko einer Kontamination mit AIDS oder Hepatitis-Viren, so wird
angenommen, dass die bestehende Praxis der Verwendung von Gelatine sicherer
ist. Gelatine wird auch aus ökonomischen
Gesichtspunkten bevorzugt, da es für ziemlich niedrige Kosten
verfügbar
ist.
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In
der Ungeprüften
Veröffentlichten
Japanischen Patentanmeldung (kokai) Nr. 82299/1995 wurde über eine
weniger allergene Gelatine berichtet. Das heißt, wenn ein Ausgangsmaterial,
welches eine Kollagenkomponente oder eine Gelatinekomponente enthält, die
deren modifiziertes Produkt ist, spezifisch mit einer bakteriellen
Kollagenase zersetzt wurde, dann wurde eine Peptidzusammensetzung
mit einem Molekulargewicht von nicht mehr als 1.000 erhalten, welche
keine Antigenität
aufwies und mindestens 70 % Peptide mit der Aminosäuresequenz
(Gly-X-Y)n (n =
1–3) enthielt.
Die Gelatine, welche also durch das Kollagenase-abhängige Verfahren
hergestellt wird, könnte
in Lebensmitteln wirksam sein, aber ist mit einem Molekulargewicht
von nicht mehr als 1.000 sicherlich nicht als Impfstoffstabilisator
geeignet.
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In
der Ungeprüften
Veröffentlichten
Japanischen Patentanmeldung (kokai) Nr. 229932/1997 wird berichtet,
dass ein Mensch, der allergisch gegen Gelatine war, empfindlich
auf die α2-Kette
in Rindergelatine reagierte und dass Gelatinen aus anderen Tieren
in Impfstoffen verwendet werden könnten. Das Patent lehrt allerdings
nichts über
das Herstellen weniger allergener Gelatine aus Rindergelatinen im
allgemeinen.
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Bei
einer allgemeinen Tagung der Japanese Society for Immunology haben
die hier genannten Erfinder eine detaillierte Arbeit vorgestellt,
um zu zeigen, dass Patienten mit einer ausgeprägten allergischen Reaktion
gegen Gelatine empfindlich auf die α2-Kette in Kollagen oder Gelatine
waren (27. Annual Meeting of the Japanese Society for Immunology,
29.–31.Oktober,
1997).
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Daher
besteht immer noch die große
Notwendigkeit einer Gelatine, die als ein Stabilisator für Impfstoffe
verwendet werden kann und die Patienten mit ausgeprägten allergischen
Reaktionen gegen Gealtine sicher verabreicht werden kann.
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Die
vorliegende Erfindung wurde unter diesen Umständen vollendet und hat die
Aufgabe, eine weniger allergene, hydrolysierte Gelatine bereitzustellen,
die als ein Stabilisator für
injizierbare Trace-Protein-Stoffe wie Impfstoffe verwendet werden
kann.
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Um
die genannte Aufgabe zu erreichen, haben die hier genannten Erfinder
intensive Studien durchgeführt
und herausgefunden, dass ein Gelatine-Hydrolysat oder mit Pepsin
zersetzte Gelatine einen geringeren Grad an Allergenität aufwies.
Die vorliegende Erfindung wurde basierend auf diesem Befund vollendet.
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Daher
betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von mit Pepsin
behandelter, gering allergener Gelatine als Stabilisator für injizierbare
Trace-Protein-Stoffe,
wobei die Gelatine ein durchschnittliches Molekulargewicht von 3.500–20.000,
gemessen durch Hochleistungsgelpermeationschromatographie, und ein
Trennmuster mit charakteristischen Banden bei 15 kd, 17 kd, 36 kd
und 60 kd in der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese hat.
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Die
vorliegende Erfindung stellt auch eine Injektion, umfassend einen
injizierbaren Trace-Protein-Stoff, einen Stabilisator, der mit Pepsin
behandelte, gering allergene Gelatine umfasst, die ein durchschnittliches
Molekulargewicht von 3.500–20.000,
gemessen durch Hochleistungsgelpermeationschromatographie, und ein Trennmuster
mit charakteristischen Banden bei 15 kd, 17 kd, 36 kd und 60 kd
in der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese hat, und einen pharmazeutisch
verträglichen
Träger
bereit.
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Typischerweise
umfasst der injizierbare Trace-Protein-Stoff einen Impfstoff und
der Träger
umfasst Wasser.
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1 zeigt
anhand von Banden die Position hydrophober Aminosäuren (z.B.
Valin, Leucin, Isoleucin, Methionin, Phenylalanin und Tryptophan)
in den Sequenzen der α1-
und α2-Ketten
in Rinderkollagen;
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2 zeigt
das Trennmuster von nichtzersetzter Gelatine (hitzedenaturierte
SCE) in der Hochleistungsflüssigchromatographie;
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3 zeigt
das Trennmuster von mit Pepsin zersetzter Gelatine in der Hochleistungsflüssigchromatographie;
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4 ist
ein Foto, welches das Ergebnis einer SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese von Gelatine nach
Zersetzung mit verschiedenen Enzymen zeigt, wobei die Reaktivität mit IgE
qualitativ unter den entsprechenden Banden gezeigt ist, und
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5a und 5b sind
Fotos, welche die Ergebnisse einer 10 % SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese und einer
15 % SDS-Polyacrylamidgelelektro phorese zeigen, die mit der nicht
antigenen Kollagen α1-Kette
bzw. mit der antigenen Kollagen α2-Kette,
welche durch eine CM-Cellulose Säule
getrennt und später
mit Pepsin zersetzt wurden, durchgeführt wurden.
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Die
Erfindung wird nachstehend detaillierter beschrieben.
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Für die vernünftige Entwicklung
weniger allergener Gelatine, die einen breiten Bereich von Anwendungen
findet, würde
es nötig
sein, die Seren von möglichst
vielen Patienten, die allergisch gegen Gelatine sind, zu verwenden
und das Epitop für
Serum-IgE in der Gelatine zu identifizieren. Die hier genannten
Erfinder haben deshalb versucht, das Epitop für IgE in Patienten mit einer
Gelatineallergie zu identifizieren und den IgE-reaktiven Bereich
in Gelatine mit einem spezifischen Enzym zu zerstören, wodurch
ein Gelatine-Hydrolysat bereitgestellt wurde, welches niedrige Allergenität aufwies
und das hochtauglich war, injizierbare Trace-Proteine wie Impfstoffe
zu stabilisieren.
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Zu
Anfang sammelten die hier genannten Erfinder die Seren von Patienten,
welche eine allergische Reaktion gegen Gelatine zeigten und verwendeten
ein Fluoreszenz-ELISA-Verfahren, um die Sensitivität von IgE
gegenüber
Gelatine und deren Hydrolysat, welche durch verschiedene bekannte
Verfahren hergestellt wurden, zu beurteilen. Die Allergenität von Gelatine
kann beurteilt werden durch die Kenntnis, wie das Serum-IgE der
Patienten auf Gelatine reagieren würde. Kollagen ist an sich aus
zwei verschiedenen Polypeptiden zusammengesetzt, α1- und α2-Ketten, die ein Molekulargewicht
von 100.000 aufweisen: also ist Gelatine ein Gemisch dieser beiden
aus Kollagen gewonnenen Polypeptide. Wie nachstehend in Tabelle
1 gezeigt, reagierten die Seren von drei Patienten mit der aus Kollagen
gereinigten α2-Kette,
aber nicht mit der gereinigten α1-Kette
(Details dieses unterschiedlichen Verhaltens wurden in den Abstracts
zu den Arbeiten, welche beim 27. Annual Meeting of the Japanese
Society for Immunology vorgetragen wurden, berichtet, siehe oben).
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Von
den beiden Polypeptiden in Rinderkollagen, welches als Gelatinequelle
verwendet wurde, weist die α2-Kette
Antigenität
auf und deren vollständige
Aminosäuresequenz
wurde kürzlich
von den hier genannten Erfindern basierend auf ihrer cDNA-Sequenz
identifiziert (siehe Sirai, T. et al. „The complete cDNA coding sequence
for the bovine proα2(I)
chain of type I Procollagen",
Matrix Biol. 1998; DNA-Datenbank EMBL/GenBank AB008683).
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Gelatine
ist ein Protein mit einem sehr geringen Gehalt an hydrophoben Aminosäuren. Allerdings
zeigte ein Vergleich der kürzlich
identifizierten Aminosäuresequenz
der α2-Kette
mit der bereits bekannten Sequenz der α1-Kette, dass die erstgenannte
etwa zweimal soviele hydrophobe Aminosäurereste enthielt (62 der 1014
Reste waren von der α1-Kette
besetzt und 104 von der α2-Kette).
Es wurde auch aufgedeckt, dass die α2-Kette charakteristische Cluster
hydrophober Aminosäuren
nahe den N- und C-Termini aufwies (siehe 1). Ein
Peptidfragment der α2-Kette
wurde getrennt, gereinigt und auf Reaktivität mit Patienten-IgE getestet;
Antigenität
wurde in den Peptiden nahe Rest Nr. 750 in der C-terminalen Aminosäuresequenz
der α2-Kette gefunden,
offensichtlich in Übereinstimmung
mit der Position des Clusters hydrophober Aminosäuren nahe dem C-Terminus.
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Von
diesen Beobachtungen schlossen die Erfinder, dass ein weniger allergenes
Gelatine-Hydrolysat durch Unterbrechen des antigenen Bereiches auf
der α2-Kette
erhalten werden würde;
deshalb haben die Erfinder eine Auswahl Gelatinezersetzender Enzyme
getestet.
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Überraschenderweise
wurde unter verschiedenen zersetzenden Enzymen nur die Gelatine,
die mit Pepsin zersetzt wurde, als optimal für die Verwendung als Stabilisator
injizierbarer Trace-Proteine wie Impfstoffe befunden. Die vorliegende Erfindung
wurde basierend auf dieser Feststellung vollendet. Speziell anzuführen ist,
dass die Gelatineproben, welche mit Pepsin, Kollagenase (sowohl
aus C. histricum als auch aus dem Pankreas der Krabbe), Chymotrypsin,
Elastase, Bromelain, Ficin und alkalische Protease behandelt waren,
verringerte Reaktivität
mit IgE allergischer Patienten zeigten. Allerdings wiesen die Gelatineproben,
welche mit Nicht-Pepsin-Enzymen
behandelt waren, namentlich Kollagenase (sowohl aus C. histricum
als auch aus dem Pankreas der Krabbe), Chymotrypsin, Elastase, Bromelain,
Ficin und alkalische Protease, geringere Molekulargewichte auf als
3.500, welches notwendig war, um Trace-Proteine zu stabilisieren,
und waren daher ungeeignet zum Stabilisieren von Trace-Proteinen.
Dagegen wiesen die Gelatineproben, welche mit Pepsin behandelt waren,
ein durchschnittliches Molekulargewicht von 7.600, deutlich über 3.500,
was der benötigte Wert
zum Stabilisieren von Trace-Proteinen war, auf. Andere Enzyme konnten
keine zufriedenstellende Verringerung der Reaktivität mit IgE
erreichen, unabhängig
vom Molekulargewicht der behandelten Gelatine. Wenn Peptide mit
niedrigem Molekulargewicht durch Fraktionierung mittels Gelpermeationschromatographie oder
Mikrofiltration entfernt werden, kann man erfindungsgemäße, weniger
allergene Peptide mit höheren durchschnittlichen
Molekulargewichten, etwa 20.000, erhalten.
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Die
Gelatine, welche als Ausgangsmaterial zum Herstellen des erfindungsgemäßen Gelatine-Hydrolysats
verwendet werden kann, ist in keiner Weise beschränkt und
entweder die mit dem Säureverfahren
gewonnene Gelatine oder die mit dem alkalischen Verfahren gewonnene
Gelatine kann verwendet werden. Auch die Gelatine, welche aus der
thermischen Denaturierung von solubilisiertem Kollagen resultiert,
ist verwendbar. Das solubilisierte Kollagen kann das auf dem Fachgebiet
bekannte, mit Essigsäure
solubilisierte Kollagen (S.C.A) sein oder Kollagen, welches mit
einer von einem Organismus hergestellten Protease („PROCTASE", Meiji Seika Kaisha,
Ltd.) oder einer aus einem Tier gewonnenen Protease wie Pepsin solubilisiert
wurde.
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Jedes
käufliche
Pepsin kann verwendet werden, um Gelatine zu zersetzen und ein Beispiel
ist eine aus der Schleimhaut von Schweinemagen, die bei Sigma erhältlich ist.
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Zum
Zersetzen von Gelatine mit Pepsin werden die folgenden Bedingungen
bevorzugt. Die Konzentration von Pepsin relativ zu Gelatine ist
nicht kritisch und der geschulte Fachmann kann leicht einen geeigneten Wert
aus dem üblichen
Bereich von Proteasekonzentrationen, die ausreichen Proteine abzubauen,
auswählen.
Zum Beispiel reicht des Gewichtsverhältnis von Substrat zu Enzym
von 10.000:1 bis 10:1, vorzugsweise von 200:1 bis 50:1, stärker bevorzugt
100:1.
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Gelatine
wird vorzugsweise in 5–500
mMol Essigsäure
oder Salzsäure
gelöst,
wobei die Gelatinekonzentration vorzugsweise von 0,01 bis zu einigen
zehn Prozent reicht. Die Zersetzungstemperatur reicht vorzugsweise
von 37°C
bis 60°C
und die Zersetzungszeit reicht vorzugsweise von einigen Stunden
bis zu einigen Tagen, bis die α-Kette
mit einem Molekulargewicht von 100.000 nicht mehr in der Elektrophorese
nachgewiesen wird. Jede Fraktion der α-Kette mit einem Molekulargewicht
von 100.000, die unzersetzt bleibt, kann durch Gelpermeationschromatographie
und Ultrafiltration abgesondert werden.
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Das
Pepsin, welches zum Zersetzen von Gelatine verwendet wird, kann
durch Behandlung mit einem Ionenaustauschharz oder einem Harz mit
einem immobilisierten anti-Pepsin Antikörper entfernt werden. Wenn gewünscht, kann
mit Harz immobilisiertes Pepsin verwendet werden, um Gelatine zu
zersetzen, um so eine Pepsinkontamination zu vermeiden.
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Das
so erhaltene Gelatine-Hydrolysat hat ein durchschnittliches Molekulargewicht
von 3.500–20.000, vorzugsweise
4.000–10.000,
stärker
bevorzugt etwa 7.600, wie gemessen durch Hochleistungsgelpermeationschromatographie.
Es zeigt außerdem
ein Trennmuster mit charakteristischen Banden bei 15 kd, 17 kd,
36 kd und 60 kd in der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese und es
wird keine Komponente nachgewiesen, die von der Kollagen α2-Kette stammt.
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Der
erfahrene Fachmann kann leicht bestimmen, wie viel Gelatine-Hydrolysat
als Stabilisator injizierbarer Trace-Protein-Stoffe verwendet werden
sollte.
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Die
folgenden Beispiele werden bereitgestellt, um die vorliegende Erfindung
weiter zu veranschaulichen, sollen aber nicht als einschränkend betrachtet
werden.
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Beispiel
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Typ
I-Rinderkollagen (Handelsname: SCE), welches durch Behandlung mit
Protease, die von Aspergillus hergestellt wird (erhältlich von
Meiji Seika Kaisha, Ltd. unter dem Handelsnamen „PROCTASE"), solubilisiert wurde, wurde durch
Behandlung bei 100°C
für 2 Minuten
thermisch denaturiert, um Gelatine herzustellen, welche mit verschiedenen
Enzymen, z.B. Pepsin, bakterieller Kollagenase (C. histricum),
Kollagenase (aus dem Pankreas der Krabbe), Chymotrypsin, Elastase,
Bromelain, Ficin, alkalischer Protease, Actinase, V8-Protease, bakterieller
Kollagenase (Vibrio sp.), Trypsin und Papain, zersetzt wurde. Das
Pepsin wurde von Sigma als ein aus der Schleimhaut von Schweinemagen
gewonnenes Produkt bezogen und die anderen Enzyme wurden entweder
von Sigma oder Wako Pure Chemical Industries, Ltd. bezogen. Die
Zersetzungsbedingungen waren wie folgt: durch Vorbehandlung bei
100°C für 2 Minuten
wurde SCE thermisch denaturiert, um Gelatine zu ergeben; zu 0,1
% Gelatine (in 0,5 M Essigsäurelösung) wurde
Pepsin in einer Endkonzentration von 0,001 % zugegeben; die Lösung wurde
dann für
24 Stunden bei 37°C
inkubiert. Für
die anderen Enzyme wurden auf dem Fachgebiet als optimal bekannte
Lösungsmittel
verwendet, die anderen Verdauungsbedingungen waren die gleichen,
wie vorstehend festgelegt.
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Prüfung von
IgE-Antikörper
gegen Gelatine: mit Enzym behandelte Gelatineproben wurden auf einer ELISA-Platte
adsorbiert und der IgE Antikörpertiter
in den Seren von Patienten, die mit jeder Gelatineprobe reagierten,
wurde gemessen. Als Kontrolle wurde der IgE Antikörper gegen
die unbehandelte Gelatine geprüft.
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Bestimmung
des durchschnittlichen Molekulargewichtes: Die durchschnittlichen
Molekulargewichte der mit Enzym behandelten Gelatineproben wurden
durch Hochleistungsflüssigchromatographie
bestimmt. Die Trennsäule
bestand aus Shodex OHpak SB803, seriell verbunden mit Shodex OHpak
SB802,5 (beide hergestellt von Showa Denko K.K.). Das Lösungsmittel
war eine Calciumphosphat-Pufferlösung
(pH 6,9), die Durchflussrate war 1 ml/min, die Säulentemperatur betrug 40°C. Der Molekulargewichtsmarker
für Polyethylenoxid
wurde als Standard verwendet. Wie im Falle der Prüfung von
IgE-Antikörper
gegen Gelatine wurde auch das Molekulargewicht der unbehandelten
Gelatine bestimmt.
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Tabelle
2 zeigt die Reaktivitäten
der mit Enzym behandelten Gelatineproben mit IgE in den Seren von Patienten,
die allergisch gegen Gelatine waren.
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Wie
aus Tabelle 2 ersichtlich ist, zeigten die Gelatineproben, welche
mit Pepsin, Kollagenase (C. histricum und eine aus dem Pankreas
der Krabbe gewonnene), Chymotrypsin, Elastase, Bromelain, Ficin
und alkalischer Protease behandelt waren, geringere Reaktivität mit dem
IgE in den allergischen Patienten. Allerdings waren diese Gelatineproben,
außer
denen, welche mit Pepsin und Elastase behandelt wurden, nicht geeignet
für die
Verwendung zum Stabilisieren von Trace-Proteinen, da ihre Molekulargewichte
niedriger waren als der benötigte
Wert von 3.500. Die mit Pepsin behandelte Gelatine hatte ein durchschnittliches
Molekulargewicht von 7.600, deutlich über 3.500. Die anderen getesteten
Enzyme waren nicht in der Lage, die Reaktivität von Gelatine mit IgE angemessen
zu verringern, unabhängig
davon, ob das Molekulargewicht der zersetzten Gelatine größer war
als 3.500 oder nicht.
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Die
unbehandelte Gelatine (d.h. thermisch denaturiertes SCE) und die
mit Pepsin zersetzten Gelatineproben wurden einer Hochleistungsflüssigchromatographie
unterworfen und die erhaltenen Trennmuster sind in 2 und 3 gezeigt.
Der Bandenpeak, welcher bei der unbehandelten Gelatine bei einer
Retentionszeit (RT) von 20,63 Minuten auftrat, wurde den Gelatineketten
mit einem Molekulargewicht von mehr als 200.000 zugeordnet und der
Peak bei einer RT von 21,95 Minuten wurde der Gelatinekette mit
einem Molekulargewicht von 100.000 zugeordnet (2).
Die mit Pepsin behandelte Gelatine zeigte Peaks über einen breiten Molekulargewichtsbereich
von weniger als einigen zehntausend. Ein Maximalpeak erschien bei
einer RT von 28,6 Minuten und das berechnete durchschnittliche Molekulargewicht
betrug 7.600 (3).
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SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese:
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Die
mit Enzym behandelten Gelatineproben wurden in einem 10%igen Polyacrylamidgel
aufgetrennt und die resultierenden Proteinbanden wurden mit Coomassie-Brilliantblau
sichtbar gemacht (siehe 4, worin die Reaktivität mit IgE
qualitativ unter jeder Bande angezeigt ist). Wie aus 4 ersichtlich
ist, wiesen die Gelatineproben, welche mit Kollagenase (C. histricum
und eine aus dem Pankreas der Krabbe gewonnene), Bromelain, Ficin,
alkalischer Protease und anderen Enzymen (außer Pepsin) behandelt waren
und verringerte Reaktivität
mit IgE aufwiesen, derart geringe Molekulargewichte auf, dass sie
aus dem Polyacrylamidgel liefen und in der Elektrophorese kaum Banden
nachgewiesen werden konnten. Die mit Trypsin und Papain behandelten
Gelatineproben waren in solchem Maße aufgebrochen, dass keine
Banden nachgewiesen werden konnten und dennoch hielten sie die Reaktivität mit IgE
aufrecht. Die mit V8-Protease und Kollagenase (Vibrio sp.) zersetzten
Gelatineproben wiesen ausreichend große Molekulargewichte auf, um
in der Elektrophorese klar sichtbare Banden zu zeigen, aber ihre
Reaktivität
mit IgE viel nicht ab. Die mit Pepsin behandelte Gelatine zeigte
ein Trennmuster, umfassend Hauptbanden bei 15 kd, 17 kd, 36 kd und
60 kd plus geringere Anteile von Peptidbanden mit Molekulargewichten
größer als
10.000.
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Andere
Gelatineproben wurden mit einer aus Kaulquappen gewonnenen Matrix-Metalloprotease
behandelt, welche Kollagen ohne Verlust der Antigenität nur an
einer Stelle durchtrennen konnte, und wurden später in einer CM-Cellulose-Säule (Pharmacia)
in zwei Gruppen von Peptiden getrennt. Die erste Gruppe bestand
aus den aus der α1-Kette
gewonnenen Peptiden (α1TCa
und α1TCb)
und die zweite Gruppe bestand aus den aus der α2-Kette gewonnenen Peptiden
(α2TCa und α2TCb). Diese
Peptide wurden bei 37°C
für 24 Stunden
mit Pepsin (Sigma) in einem Substrat:Enzym-Gewichtsverhältnis von
10:1 in 0,1 M Essigsäure
behandelt. Danach wurden die entsprechenden Proben durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese
analysiert, wobei die Gelkonzentration zwischen 10% und 15% variierte
(siehe 5). Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt;
Spur 1 ist ein Molekulargewichtsmarker, der von oben nach unten
Banden für
103 kd, 77 kd, 48 kd, 34 kd, 28 kd und 20 kd zeigt, Spur 2 ist eine
Fraktion der Kollagen α1-Kette, die in 75
kd und 25 kd getrennt wurde; Spur 3 ist eine Fraktion der Kollagen α2-Kette,
die in 75 kd und 25 kd getrennt wurde; Spur 4 ist die mit Pepsin
behandelte α1-Kette
von Kollagen und Spur 5 ist die mit Pepsin behandelte α2-Kette von
Kollagen. 5 zeigt deutlich, dass das Trennmuster
der mit Pepsin behandelten Gelatine mit Hauptbanden bei 15 kd, 17
kd, 36 kd und 60 kd aufweist und einem geringeren Anteil von Peptidbanden
mit Molekulargewichten über 10.000
(siehe 4) von der α1-Kette
stammt (Spur 4 in 5). Andererseits wurde die antigene α2-Kette mit Pepsin
vollständig
zersetzt und es wurden keine sichtbaren Banden nachgewiesen (Spur
5 in 5).
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Die
mit Pepsin zersetzte, erfindungsgemäße Gelatine weist ein ausreichendes
Molekulargewicht auf, um Trace-Protein-Stoffe zu stabilisieren,
und ist dennoch ein schwaches Allergen. Daher ist sie als ein Stabilisator
für Medikamente,
Lebensmittel, Kosmetika und vor allem für injizierbare Trace-Protein-Stoffe wie Impfstoffe
verwendbar.
