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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft rekombinant exprimierte, einkettige
Polypeptide, welche die Troponin-Untereinheiten I und C umfassen,
sowie ihre entsprechenden genetischen Sequenzen.
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TECHNISCHER
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Eine
frühe und
genaue Bestimmung eines vermuteten akuten Herzinfarktes hängt in kritischer
Weise von einer empfindlichen und spezifischen Bestimmung der Quantitäten von
freigesetzten intrazellulären
Herzmuskelkomponenten im Blut, Serum oder Plasma ab, um ein potentiell
tödliches
Ereignis, bei welchem ein Bedarf an Notfallmaßnahmen besteht, von nicht
lebensbedrohenden Erkrankungen wie Angina und nicht herzspezifischem
Brustschmerz wie z.B. Dyspepsie zu unterscheiden. Die frühen Veränderungen
im Elektrokardiogramm sind weder in adäquater Weise spezifisch oder
empfindlich genug und der medizinische Berufsstand vertraut mittlerweile
im Hinblick auf eine frühzeitige
Diagnose von Herzgewebeverletzungen auf biochemische Marker im Serum.
Anfänglich
wurden die Serummarker Kreatinkinase (CK) und insbesondere die herzspezifische
CK-MB-Isoform verwendet
und anschließend
Myoglobin als ein empfindlicherer Frühindikator einer Herzschädigung.
In jüngerer
Zeit wurden aufgrund ihrer hohen Spezifität der herzspezifische Troponinkomplex
und seine Untereinheiten zu bevorzugten Markern von Herzmuskelschädigung.
Diese Tests erlauben in Kombination mit anderen Markern für Skelettmuskelschädigung einen
hohen Grad an diagnostischer Genauigkeit. Falls diese Tests in einer
Krankenhaus-Notaufnahme durchgeführt
werden, stellt eine frühe
und genaue Diagnose einer Herzmuskelschädi gung einen großen Vorteil
für ein
vermutliches Opfer eines Herzanfalls dar.
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Diagnostische
Tests, welche herzspezifische Marker verwenden, werden beispielsweise
in den US-Patenten Nr. 5,604,105 und 5,290,678 beschrieben. Diese
und andere Verfahren erlauben eine rasche Diagnose eines Herzinfarktes
im Umfeld einer Krankenhaus-Notaufnahme und bringen signifikante
medizinische Vorteile für
die Patienten. In diagnostischen Tests, in welchen die Konzentration
von Troponin-Untereinheiten-Komplexen in Körperflüssigkeiten gemessen wird, werden
häufig
gereinigte Troponin-Untereinheiten oder -Komplexe als Antigene für die Herstellung
von Antikörpern,
welche in der Testprozedur verwendet werden, verwendet, sowie gereinigte
Untereinheiten oder Komplexe, welche als Kontrollsubstanzen und
zur Kalibrierung zur Durchführung
des Assays verwendet werden. Assay-Kalibrierungsmittel werden zur Herstellung
einer Verdünnungsserie
verwendet, in welcher eine Standardkurve über den Betriebsbereich des
Assays angefertigt wird; Assay-Kontrollen werden verwendet, um zu
bestätigen,
dass das Assay angemessen arbeitet, indem sichergestellt wird, dass
die Messwerte von im Voraus festgelegten Proben in akzeptierbarem
Abstand von den angegebenen Werten liegen. Um das Assay in annehmbarer
Weise zu kalibrieren, müssen
die Troponin-Kontrollsubstanzen und -Kalibratoren stabil bleiben
und in einer Form vorliegen, welche durch den Antikörper immunologisch
detektiert werden kann.
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WO-A97/39132
beschreibt ein Assay zur Messung der Troponin-Blutkonzentration unter Verwendung eines
rekombinanten Fusionsproteins, welches herzspezifisches Human-Troponin
I und herzspezifisches Human-Troponin C enthält, welche als ein einzelnes
Protein exprimiert werden, worin der N-Terminus herzspezifisches
Human-Troponin I und der C-Terminus herzspezifisches Human-Troponin
C ist.
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Troponin
ist ein Muskelprotein, welches in integraler Weise in der Kalzium
abhängigen
Regulierung der Muskelkontraktion involviert ist. Troponin liegt
sowohl im Herzmuskel als auch im Skelettmuskel als ein nicht kovalent
gebundener Komplex von drei Untereinheiten vor, nämlich den
Isoformen des Troponins C, d.h. der Kalzium bindenden Untereinheit,
dem Troponin I, d.h. der inhibierenden Untereinheit, und dem Troponin
T, welches den Troponin-Komplex am Tropomyosin lokalisiert. Unter
geeigneten Bedingungen assoziieren die Troponin-Untereinheiten in
vitro spontan unter Bildung von nicht kovalent gebundenen Komplexen
wie z.B. Troponin I und C sowie Troponin I, C und T. Es existieren
Unterschiede zwischen den Aminosäure-Sequenzen der
Troponin-Isoformen des Herzmuskels und des Skelettmuskels.
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Im
Falle einer Herzmuskelverletzung oder Nekrose tritt Troponin aus
dem Herzgewebe in den Blutstrom aus, wobei seine empfindliche Bestimmung
bei der Diagnose eines Herzanfalls hilfreich ist. Die Unterschiede
in den Aminosäure-Sequenzen
zwischen den Herzmuskel- und Skelettmuskel-Isoformen der Troponin-Untereinheiten
werden in diagnostischen Tests ausgenutzt, in welchen die herzspezifische
Isoform der Troponin-Untereinheiten
und -Komplexe gemessen wird. Es stehen diagnostische Tests für herzspezifisches
Troponin I zur Verfügung.
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Troponin
I weist indessen eine inhärent
schlechte strukturelle Stabilität
auf und unterliegt proteolytischer Spaltung durch Proteasen, welche
in biologischen Proben vorhanden sind. Ein Troponin I-Standard,
welcher in einer Körperflüssigkeitsmatrix
hergestellt ist, unterliegt daher strukturel len Veränderungen
und einem Abbau und ist daher als Kalibrator oder Kontrollsubstanz
ungeeignet. Darüber
hinaus ist bekannt, dass die inhärent
stabileren Troponin-Komplexe bei der Lagerung dissoziieren und somit
für einen
proteolytischen Abbau zugänglich
werden. Im Falle des Troponin I muss dieses mit Troponin C komplexiert
werden, um dessen Konformationsstruktur und Stabilität aufrecht
zu erhalten; aufgrund der Natur der Affinitäten der Untereinheiten im Komplex
ist jedoch der Anteil an Troponin I, welcher in Form eines Komplexes
vorliegt, konzentrationsabhängig.
Dies schränkt
seine Verwendbarkeit als Assay-Kalibrator oder -Kontrollsubstanz
ein. Das Ausmaß der
Interaktionen zwischen den Untereinheiten kann aus der Dissoziationskonstante
Kd [wie beispielsweise in Biochemistry 33:
12729 [1994] berichtet wird] berechnet werden. Gemäß Berechnung
und experimenteller Messung würde
nur eine begrenzte Menge von Troponin I an Troponin C gebunden sein,
was insbesondere in dem Bereich gilt, in welchem dieses in Patienten-Serumproben
gefunden würde,
und somit den Konzentrationen, für
welche Kalibratoren und Kontrollsubstanzen verwendet werden müssen. So
ist beispielsweise bei 50 ng/ml, was den oberen Bereich der meisten
Troponin I-Assays
darstellt, lediglich 10% des Troponin I an Troponin C gebunden,
wenn diese beiden Untereinheiten in einem Verhältnis von 1:1 vorliegen. Bei
einem 10fach höheren Verhältnis von
Troponin C zu Troponin I sowie in der Gegenwart von zweiwertigen
Kationen wurde lediglich die minimale Stabilität des Komplexes in der Kälte (Larue
et al., US-Patent 5,583,200) von "zumindest einem Tag" beansprucht. wenn höhere Konzentrationen des Komplexes
aufrecht erhalten werden, steigt der Assoziierungsanteil an; nach
einer Verdünnung
auf eine Konzentration, welche zur Kalibrierung eines Assays notwendig
ist, dissoziieren die Untereinheiten jedoch und werden immunologisch
instabil. Durch die Dissoziierung werden die Untereinheiten sodann
einem proteo nem proteolytischen Angriff ausgesetzt, welcher den
Nutzen solcher Kalibratoren und Kontrollsubstanzen verringert.
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Daher
besteht ein Bedürfnis
an stabilen Troponin-Kalibratoren und -Kontroll-substanzen, um den
Ansprüchen
der Industrie entgegen zu kommen.
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Es
wurden zahlreiche Troponin-Zusammensetzungen aus natürlichen
und rekombinanten Quellen beschrieben, welche Troponin I zusammen
mit Troponin C enthalten. Malnic und Reinach (1994, Eur. J. Biochem.,
v. 222, S. 49–54)
stellten in vivo einen rekombinanten Komplex her, in dem alle drei
Hühner-Skelettmuskel-Troponin-Untereinheiten
in ein oder mehrere Expressionsplasmide kloniert wurden. Innerhalb
dieses Expressionsvektors hatte jedes Troponin-Gen seinen eigenen
Promotor und die Proteine wurden innerhalb eines Bakteriums als
individuelle Troponin-Untereinheiten exprimiert, welche anschließend innerhalb
des Bakteriums Komplexe bildeten. Fujita-Becker et al. (1993, J. Biochem., Band
114, S. 438–444)
beschrieb die Rekonstitution eines Kaninchen-Skelettmuskel-Troponin-Komplexes
aus in E. coli exprimierten Untereinheiten. Es konnte bei keinem
dieser rekombinanten Produkte gezeigt werden, dass diese zur Verwendung
als Diagnosetest-Standard
oder -Kalibrierungssubstanz adäquate
Stabilität
aufweisen. Wie oben erwähnt
wurde, sind selbst die Komplexe aus Troponin-Untereinheiten nicht
stabil und werden in einer Lösung
nicht in großem
Umfang aneinander gebunden bleiben.
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Wie
weiter unten gezeigt wird, besteht eine prinzipielle Aufgabe der
vorliegenden Erfindung darin, eine stabile Troponin-Zubereitung für Assays
und andere Verwendungen zur Verfügung
zu stellen, welche Troponin I und Troponin C in einer einzelnen
Polypeptid-Kette umfasst und als ein rekombinantes Konstrukt hergestellt wird,
welches in einem bakteriellen Ex pressionssystem als einzelnes Polypeptid
exprimiert wird. Die vorliegende Erfindung unterscheidet sich von
Troponin-Untereinheiten
und ihren Fragmenten, welche für
biochemische Studien chemisch vernetzt wurden, wobei Verfahren wie
z.B. Carbodiimid-Vernetzung und photochemische Vernetzungschemie
verwendet wurden, wie z.B, von Jha et al. (1996, Biochemistry, Band
35, S. 11026–11035), Kobayashi
et al. (1996, Biochem. Biophys. Acta, Band 1294, S. 25–30) und
Kobayashi et al. (1995, Biochemistry, Band 34, 5. 10946–10952)
beschrieben wurden. In diesen Literaturstellen wurden spezifische
Fragmente von unterschiedlichen Troponin-Proteinen chemisch zur
Untersuchung der Konformation der Untereinheiten und ihrer natürlichen
Wechselwirkungen in Troponin-Komplexen chemisch vernetzt.
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Daher
besteht ein Bedürfnis
an einem Troponin-Material, welches die Stabilitätsanforderungen erfüllt, leicht
herzustellen und zu reinigen ist, und welches als ein Antigen und
als Kontrollsubstanz und Kalibrator für Troponin-Assays verwendet
werden kann. Da keine allgemein akzeptierte Kontrollsubstanz oder
Kalibrator für Troponin
existiert, ist es nicht möglich,
diese Assays zwischen den einzelnen Laboratorien oder auch nur zwischen
den einzelnen Instrumenten zu standardisieren, weil jedes bestimmte
Troponin-Assay zusammen mit seinen Kontrollsubstanzen und Kalibratoren
Ergebnisse produziert, welche dem Laboratorium und der Auswahl der
Assay-Komponenten zu eigen sind. Daher ist es gegenwärtig nicht
möglich,
normale und abnormale Bereich anzugeben, welche von allen Laboratorien
oder Ärzten
anerkannt würden.
Daher existiert ein Bedürfnis
an universellen Kalibratoren und Kontrollsubstanzen, welche für alle verfügbaren kommerziellen
Assay-Instrumente verwendet werden können.
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Es
wurde nun gefunden, dass ein einkettiges Polypeptid, welches herzspezifisches
Human-Troponin I und herzspezifisches Human-Troponin C umfasst,
stabil und für
die oben genannten Zwecke geeignet ist. Darüber hinaus muss dieses Produkt
vom Fachmann leicht herstellbar sein. Die Leichtigkeit der Herstellung maximiert
die Reproduzierbarkeit der erfindungsgemäßen Produkte.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Es
ist eine prinzipielle Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein einkettiges
Polypeptid bereitzustellen, welches Troponin I und Troponin C umfasst.
Die Anwesenheit von Troponin I und Troponin C in derselben Polypeptid-Kette
verleiht dem Produkt Konformationsstabilität und Immunostabilität. Das einkettige
Polypeptid kann vorzugsweise eine Linker-Sequenz enthalten, die
zwischen den Sequenzen von Troponin I und Troponin C positioniert
ist. Die Sequenz des Linker-Peptids ist so gewählt, dass sie nicht die Tertiär-Struktur
des Produktes und somit dessen im Vorgehenden benannten Anwendungen
behindert. Ein einkettiges Polypeptid, in welchem Troponin I und
Troponin C verbunden sind, wahlweise mittels eines Linker-Peptids,
ergibt ein stabiles, reproduzierbares und leicht zu reinigendes
Material zur Entwicklung von Troponin-Assays, ein Antigen zur Herstellung
von Troponin-Antikörpern
sowie Material zur Verwendung als Kontrollsubstanzen und Kalibratoren für Troponin-Assays.
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Das
einkettige Polypeptid der vorliegenden Erfindung wird besonders
einfach mittels Rekombinationsmethoden hergestellt, indem ein replizierbares
Klonierungs- oder Expressionsvehikel wie z.B. ein Plasmid, welches
die genetische Sequenz des einkettigen Polypeptids trägt, hergestellt
wird und eine Wirtszelle wie z.B. E. coli mit dem Vehikel oder Plasmid
transfor miert wird und das Polypeptid mittels der Wirtszelle exprimiert wird.
Das einkettige Konstrukt enthält
vorzugsweise eine Linker-Peptidsequenz zwischen der Troponin I und Troponin
C-Aminosäure-Sequenz,
wobei diese Sequenz mittels Rekombinationsmethoden eingeführt wird.
Es können
bestimmte Modifikationen in der genetischen Sequenz der Troponin-Moleküle vorgenommen
werden, und zwar mit oder ohne Veränderungen der nachfolgenden
Aminosäure-Sequenz
des Polypeptids, um die Expression des Polypeptids in der Wirtszelle
zu verbessern. Diese Veränderungen
haben keinen Einfluss auf die Anwendung des einkettigen Polypeptids
zur Verwendung für
die oben genannten Zwecke.
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Es
ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine genetische
Sequenz für
ein einkettiges Polypeptid bereitzustellen, welche die genetischen
Sequenzen von Troponin I und Troponin C umfasst. Die genetische
Sequenz kann weiterhin eine genetische Linker-Sequenz beinhalten,
welche zwischen den genetischen Sequenzen von Troponin I und Troponin
C positioniert ist. Es kann eine Wirtszelle mit dem replizierbaren Klonierungs-
oder Expressionsvehikel transformiert werden, welches die oben genannte
genetische Sequenz enthält.
Wie weiter oben erwähnt
wurde, können
bestimmte Veränderungen
der genetischen Sequenz der Troponine vorgenommen werden, um die
Expression der Wirtszelle zu erleichtern.
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Es
ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Wirtszelle
bereitzustellen, welche ein Klonierungs- oder Expressionsvehikel
oder ein Plasmid enthält,
das die genetische Sequenz für
eine einkettige Polypeptid-Kette trägt und die genetischen Sequenzen
von Troponin I und Troponin C umfasst und zur Expression eines einkettigen
Polypeptids, welches Troponin I und Troponin C umfasst, befähigt ist.
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Diese
und weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden unter Bezugnahme
auf die nachfolgenden Zeichnungen und die detaillierte Beschreibung
näher erläutert.
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KURZBESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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1 zeigt die DNA- und Aminosäure-Sequenz
(SEQ-ID-NR: 3 bzw. SEQ-ID-NR: 4) eines einkettigen Polypeptids,
welches Troponin I und Troponin C umfasst, die durch eine Linker-Peptidsequenz von
19 Aminosäureresten
getrennt sind. Die Nukleotide 1 bis 630 umfassen Troponin I, die
Nukleotide 631 bis 687 umfassen die Linker-Peptidsequenz und die
Nukleotide 688 bis 1170 umfassen Troponin C.
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2 zeigt
die Ergebnisse von stündlich
durchgeführten
Troponin I-Assays eines Patienten, der einen Herzanfall durchmacht.
Das Troponin I wurde unter Verwendung der Stratus (R)-, Access(R)-
und Opus(R)-Assays gemessen.
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3 zeigt
die bei 4°C
gemessene zeitliche Stabilität
von verschiedenen Präparaten,
welche Troponin I, d.h. rekombinantes Troponin I, einen nicht kovalenten
Komplex von Troponin I und Troponin C und ein einkettiges Polypeptid
der vorliegenden Erfindung, welches Troponin I und Troponin C umfasst,
enthalten.
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DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Die
Messung des mit dem Herzmuskel assoziierten Proteins Troponin im
Blutstrom hat sich als ein früher
und spezifischer Indikator für
einen vermuteten akuten Herzinfarkt erwiesen. Verfahren zur raschen
und genauen Bestimmung von Troponin und seiner Untereinheiten im
Blut wurden und werden als solche zur Diagnose von Herzanfällen unter
Notfallbedingungen entwi ckelt, wodurch zahllose Leben gerettet wurden
und auch in Zukunft gerettet werden. Um indessen genaue und verlässliche
diagnostische Assays zu entwickeln und um die Validität dieser
Assays unter Verwendung von Assay-Kontrollsubstanzen und -Kalibratoren
sicher zu stellen, ist die Verfügbarkeit
von stabilen, qualitativ hochwertigen herzspezifischen Human-Troponin-Kontrollsubstanzen
und -Kalibratoren kritisch für
die Zwecke der Qualitätskontrolle
und der Tests sowie als Troponin-Antigene zur Entwicklung von Antikörpern für die Assays.
Darüber
hinaus ergeben, obwohl kommerzielle Assay für Troponin entwickelt wurden
und noch entwickelt werden, diese Assays unterschiedliche Ergebnisse für dieselben
Proben. Die verschiedenen Instrumente und Assay-Methoden für Troponin
im Zusammenhang mit dem Fehlen eines universellen Troponin-Standards hat die
Entwicklung von allgemein akzeptierten Normalbereichen und abnormalen
Bereichen der Troponin-Konzentrationen
verhindert, so dass die Interpretation von Laborergebnissen verdunkelt
wurde und klinische Tests unter Einbeziehung verschiedener Laboratorien, welche
herzspezifische Marker involvieren, verhindert wurde. Diese Probleme
können
durch die Verfügbarkeit von
universellen Troponin-Kontrollsubstanzen
oder -Kalibratoren gelöst
werden. Universelle Kontrollsubstanzen und Kalibratoren wären in allen
verfügbaren
Assays bestimmbar und könnten
verwendet werden, um die von allen Troponin-Assays zur Verfügung gestellten
Messergebnisse zu standardisieren.
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Zum
Zwecke als stabile Kalibratoren und Kontrollsubstanzen von Troponin-Assays
verbessert die vorliegende Erfindung die inhärente Konformationsinstabilität und proteolytische
Empfindlichkeit des freien Troponin I sowie die Instabilität der Assoziierung
im Troponin I-Troponin C-Komplex. Diese Verbesserung besteht in
einem einkettigen Polypeptid, welches herzspezifisches Human-Troponin
I und herzspezifisches Troponin C umfasst. Die Troponin-Untereinheiten
sind somit kovalent durch eine Peptid-Bindung verbunden und sind
in dem selben linearen Polypeptid angeordnet. Dieses Polypeptid
stellt einen stabilen Troponin I-Troponin C-Komplex zur Verfügung, um
dem Bedürfnis
der Industrie entgegenzukommen. Das einkettige Polypeptid kann mittels
Rekombinationsmethoden hergestellt werden und beinhaltet vorzugsweise
eine Polypeptid-Linker-Sequenz,
die zwischen den Troponin I- und Troponin C-Sequenzen positioniert
ist. Die Länge
und Sequenz dieser Linker-Sequenz ist nur durch die Forderung limitiert,
dass sie nicht die immunologische Detektierbarkeit des Produkts
und seine weiteren oben genannten Anwendungen behindert.
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So
kann beispielsweise eine Ausführungsform
des einkettigen Troponin I-Troponin C-Polypeptids die Troponin I-Sequenz
am N-Terminus des Polypeptids umfassen, wobei der C-Terminus der
Troponin I-Sequenz mittels einer Peptid-Bindung mit dem N-Terminus der Troponin
C-Sequenz verbunden ist. In einer zweiten, bevorzugten Ausführungsform,
in welcher eine Peptid-Linker-Sequenz
zwischen den Troponin I- und Troponin C-Aminosäure-Sequenzen positioniert
ist, umfasst eine bevorzugte Anordnung die Troponin I-Sequenz am N-Terminus
des Polypeptids, deren C-Terminus mittels einer Peptid-Bindung mit
dem N-Terminus des Linker-Peptids verbunden ist, wobei der C-Terminus des Linker-Peptids
dann mittels einer Peptid-Bindung mit dem N-Terminus der Troponin
C-Sequenz verbunden ist. Ein Beispiel dieses Konstrukts ist die
Aminosäure-Sequenz,
welche in SEQ-ID-NR: 4 abgebildet ist. In diesem Beispiel ist die
Aminosäure-Sequenz
des Linkers in der SEQ-ID-NR: 2 repräsentiert. Diese enthält 19 Aminosäuren.
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Die
Aminosäure-Sequenzen
in den obigen Beispielen entsprechen den Nukleotid-Sequenzen der
cDNA, die für
diese Polypeptide kodiert. Die genetische Sequenz im ersten Beispiel
umfasst die genetische Sequenz von Troponin I am 5'-Ende der cDNA, wobei
sich an dessen 3'-Ende
unmittelbar das 5'-Ende
der genetischen Troponin C-Sequenz anschließt. In der bevorzugten Ausführungsform,
in welcher ein Linker zwischen den Troponin I- und Troponin C-Sequenzen
positioniert ist, beginnt das 5'-Ende der cDNA-Sequenz
mit der genetischen Troponin I-Sequenz, auf dessen 3'-Ende das 5'-Ende der optionalen,
dazwischen positionierten genetischen Linker-Sequenz folgt, auf
dessen 3'-Ende das 5'-Ende der genetischen
Troponin C-Sequenz folgt, die am 3'-Ende der cDNA endet. Die genetische
Sequenz des oben genannten spezifischen Beispiels wird in der SEQ-ID-NR:
3 wiedergegeben. Die cDNA-Sequenz des Linkers wird in SEQ-ID-NR: 1 wiedergegeben.
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Wie
oben beschrieben wurde, ist die Auswahl der Länge und der spezifischen Sequenz
des optionalen Linker-Polypeptids nur dadurch limitiert, dass es
nicht die immunologische Detektierbarkeit des Troponin I und Troponin
C im einkettigen Polypeptid behindert. Es wird angenommen, dass
die Troponin I- und
Troponin C-Segmente des einkettigen Polypeptids bei einer geeigneten
Linker-Sequenz untereinander in ähnlicher
Art und Weise assoziieren wie sie dies in einem nicht kovalenten
Troponin I-Troponin C-Komplex tun, und das die Befestigung der Untereinheiten
im einkettigen Polypeptid die Konformation der Assoziierung und
damit eine konsistente immunologische Detektierbarkeit des Troponins
beibehält.
Darüber
hinaus ist ein Troponin I-Troponin C-Komplex, welcher auf diese
Art und weise stabilisiert ist, gegenüber einem proteolytischen Angriff
in der Anwesenheit von Körperflüssigkeiten
und anderen Komponenten weniger empfindlich. In dieser bevorzugten
Ausführungsform
wird ein Linker von ungefähr
6 bis ungefähr
50 Aminosäuren
(und einer entsprechenden Anzahl von Kodons in der cDNA) im Hinblick
auf eine einfache und ökonomische
Herstellung bevorzugt.
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Es
wird bevorzugt, das einkettige Troponin I-Troponin C-Polypeptid der vorliegenden
Erfindung mit einem relativ kurzen Linker-Segment herzustellen,
da bei solchen Produkten eine geringe oder keine Interferenz mit
der Tertiärstruktur
des Produktes vorliegt. Daher besteht eine geringe oder keine Interferenz
mit der Verfügbarkeit
von Epitopen für
eine Reaktion mit leicht erhältlichen
Antikörpern.
Es ist bekannt, dass im gewöhnlichen
Troponin I-Troponin C-Komplex der Amino-Terminus der Troponin I-Komponente relativ
nahe am Carboxy-Terminus
der Troponin C-Komponente angeordnet ist. Falls sich diese Einheiten
jedoch ohne einen Linker bilden, kann diese Nähe gestört werden und die resultierende
Spannung in der Tertiärstruktur
führt dazu,
dass einige Epitope nicht mehr für
eine Reaktion zur Verfügung
stehen. In ähnlicher
Weise können
Linker, welche zu lang sind, die Tertiärstruktur modifizieren oder
der Linker selbst kann einige Epitope verdecken.
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Eine
nützliche
Polypeptid-Linker-Sequenz ist beispielsweise (Gly4Ser)3, welche eine flexible Peptid-Sequenz darstellt,
die es den beiden Untereinheiten erlaubt zu assoziieren. Um die
genetische Sequenz mit einem Linker zu konstruieren, sind an beiden
Enden des Linkers zwei zusätzliche
Codons anwesend, welche benötigt
wurden, um eindeutige Restriktionsstellen zu schaffen, um das genetische
Konstrukt des gewünschten
einkettigen Polypeptids zu schaffen. In einem Beispiel können Codons,
welche am N-Terminus des Linkers Thr-Ser und am C-Terminus Ala-Cys
entsprechen, beinhaltet sein. Somit kann ein geeigneter Linker mit
19 Resten hergestellt werden (genetische Sequenz: SEQ-ID-NR: 1 und
Peptid-SEQ-ID-NR: 2).
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Es
können
rekombinante Verfahren verwendet werden, um die DNA-Sequenz herzustellen,
welche die Troponin-Untereinheiten und die optionale Linker-Sequenz
umfassen, und um diese Sequenz in eine Wirtszelle einzuführen, und
es werden standardisierte Expressionsverfahren verwendet, um das
rekombinante Polypeptid zu exprimieren und zu reinigen. Diese verfahren ähneln Verfahren,
welche zur Herstellung von Fusionsproteinen verwendet werden, welche
beispielsweise für
zwei metabolisch gekoppelte Hefeenzyme, nämlich Citrat-Synthase und Malat-Dehydrogenase
(Lindbladh et al., Biochemistry 33: 11692–11698 [1994]), beschreiben
werden; bei der Herstellung von einkettigen Polypeptiden, welche
Antigen-Bindungsstellen von Antikörpern umfassen (US-Patent 4,946,778);
sowie bei der Herstellung von Fusionsproteinen zum Phargen-Display (US-Patent
5,516,637). Diese Verfahren sind dem Fachmann bekannt.
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Für den Fall,
dass keine Linker-Sequenz gewünscht
wird, können
die Troponin I- und Troponin C-cDNA-Sequenzen mittels geeigneter
Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, miteinander verbunden werden,
wie z.B. dem SOE-Verfahren, in welchem Paare von teilweise überlappenden
Primern verwendet werden, das beispielsweise von Hu et al. (1996,
Protein Expression and Purification 7: 289–293) beschrieben wird, in
welchem seltene Codons im herzspezifischen Human-Troponin T durch
synonyme, verbreitete Codons ersetzt wurden. Diese Verfahren sind
ebenfalls dem Fachmann bekannt.
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Das
rekombinante Konstrukt wird als ein Expressions- oder Klonierungsvehikel
oder Plasmid hergestellt und zur Expression in eine Wirtszelle eingeführt. Verfahren
zur Exprimierung von rekombinanten Proteinen sind im Stand der Technik
bekannt. Sobald das einkettige Polypeptid exprimiert ist, kann es
mittels standardisierten Protein-Reinigungsverfahren gereinigt werden.
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Darüber hinaus
können
die genetischen Sequenz von Troponin I und Troponin C modifiziert
werden, um die Expression des einkettigen Polypeptids in einem bakteriellen
Expressionssystem zu verbessern. Diese genetischen Veränderungen
können
aber brauchen nicht die Aminosäure-Sequenz
des Polypeptids verändern.
Wie im Stand der Technik bekannt ist, verringern seltene Codons,
welche in einem Expressionsvehikel vorhanden sind, die Effizienz
der Expression; durch einen Austausch dieser Codons durch synonyme,
verbreitete Codons wird die bakterielle Expression verbessert (was
beispielsweise im Hinblick auf Troponin I in der gleichzeitig anhängigen,
am 23. Mai 1997 hinterlegten Anmeldung mit der Serien-Nr. 08/862,613
und in den oben erwähnten
Verfahren von Hu et al. beschrieben wird). Zusätzlich verbessert der Anschluss
einer kurzen Nukleotid-Sequenz
am 5'-Ende der Troponin
I-cDNA (wie dies in der Anmeldung mit der Serien-Nr. 08/862,613 beschrieben
wird) die bakterielle Expression und stellt ein Troponin I-Polypeptid
mit sechs zusätzlichen
N-terminalen Aminosäuren
zur Verfügung.
Diese optionalen Veränderungen
zur Verbesserung der bakteriellen Expression schmälern nicht
den Nutzen des einkettigen Polypeptids für die oben genannten Zwecke.
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Es
sind mehrere Troponin I-Assays kommerziell erhältlich, welche alle unter Verwendung
verschiedener Formate, Instrumente und Assay-Kontrollsubstanzen
und Kalibratoren operieren. So verwendet beispielsweise das Stratus(R)-Troponin
I-Assay von Dade
einen monoklonalen Einfang- und einen monoklonalen Detektor-Antikörper. Das
Kalibrator/Kontroll-Substanz-Material
ist ein N-terminales Peptid aus herzspezifischem Human-Troponin
I. Der Operationsbereich des Assays liegt bei 0 bis 50 ng/ml, wobei
die Empfindlichkeit 0,6 ng/ml beträgt und der cutt-off-Wert 1,5
ng/ml beträgt.
Das Access(R)-Troponin I-Assay von Sanofi verwendet ebenfalls einen
monoklonalen Einfang- und einen monoklonalen Detektor-Antikörper, wobei indessen
der Kalibrator/die Kontrollsubstanz ein Komplex aus nativem herzspezifischem
Troponin I und Troponin C ist. Dieses Assay hat einen Betriebsbereich
von 0 bis 50 ng/ml, eine Empfindlichkeit von 0,03 ng/ml und einen
cut-off-Wert von 0,1 ng/ml. Das Opus(R)-Troponin I-Assay von Behring
verwendet polyklonale Anitkörper
sowohl als Einfang- und Detektor-Antikörper und hat einen Bereich
von 0–300
ng/ml, eine Empfindlichkeit von 1 ng/ml und einen cut-off-Wert von
2 ng/ml.
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Aufgrund
der Unterschiede in den Methoden und Komponenten der oben genannten
Assays sowie der Kalibratoren/Kontrollsubstanzen können diese
nicht zwischen den Assays ausgetauscht werden. So sind beispielsweise
die Kalibratoren/Kontrollsubstanzen des Stratus(R), welche ein N-terminales
Peptid des herzspezifischen Troponin I verwenden, in den Access(R)-
und Opus(R)-Assays nicht detektierbar, da die Antikörper der
letztgenannten Assays nicht auf denselben N-terminalen Peptidanteil des in den Kontrollsubstanzen/Kalibratoren
verwendeten Troponin I gerichtet sind. Andererseits ergeben die
Kontrollsubstanzen des Access(R)-Assays, welche im Access(R)-Assay
mit der höchsten
Empfindlichkeit und dem höchsten
cut-off-Wert aller drei Assays detektierbar sind, einen etwa vierfach
höheren
Messwert im Opus(R)-Assay. Im Gegensatz dazu werden die Kontrollsubstanzen
des Opus(R)-Assays im Stratus(R)-Assay nur schlecht nachgewiesen. Diese
Ergebnisse zeigen, dass es nicht möglich ist, die Kalibratoren/Kontrollsubstanzen
der Assays zwischen den Assays untereinander auszutauschen, und
dass die Werte, welche von den Kontrollsubstanzen des Assays eines
Herstellers erhalten werden, nur zur Interpretation von Messungen,
die auf dem selben Assay durchgeführt werden, herangezogen werden
können.
Das Vorliegen dieser schlechten Relation wird weiterhin durch die
in 2 gezeigte grafische Abbildung untermauert, welche
die unter Verwendung der Access(R)-, Stratus(R)- und Opus(R)- Assays bei einem
einen Herzanfall durchmachenden Patienten nacheinander gemessenen
Troponin I-Konzentrationen zeigt. Obwohl, wie gezeigt wird, alle
drei Assays einen unterscheidbaren Anstieg und Abfall der Troponin
I-Konzentrationen innerhalb der ersten und der sechsten Stunde anzeigen, sind
die absoluten Troponin I-Werte zu jedem Zeitpunkt höchst unterschiedlich.
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Diese
großen
Unterschiede können
der Individualität
der Assays sowie ihrer Kalibratoren/Kontrollsubstanzen zugeordnet
werden, wie oben ausgeführt
wurde.
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Ein
einkettiges Polypeptid nach der vorliegenden Erfindung, welches
Troponin I und Troponin C umfasst, kann außerdem zur Reinigung von Proteinen
und anderen Substanzen einschließlich Antikörpern mit einer Affinität zur Bindung
an Troponin I oder Troponin C verwendet werden. Das einkettige Polypeptid
der vorliegenden Erfindung kann beispielsweise kovalent an eine
unlösliche
Matrix oder ein Polymer gebunden und in einer Chromatographiesäule angeordnet
werden. Man kann einen Zell- oder
Gewebeextrakt, bei welchem der Verdacht besteht, dass er ein Material,
welches Troponin bindet, oder ein gegen Troponin herangezogenes Antikörper-Präparat enthält, durch
die Säule
durchlaufen lassen, wobei dieses am kovalent gebundenen Polypeptid
anhaften würde.
Nach einem waschen der Matrix kann das anhaftende Material unter
Verwendung einer konzentrierten Salzlösung, eines chaotropen Mittels
oder unter Anwendung von bei der Proteinreinigung verwendeten standardisierten
Verfahren eluiert werden.
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Ein
einkettiges Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann außerdem für die Herstellung
von monoklonalen oder polyklonalen, gegen Troponin gerichteten Antikörper nützlich sein,
wo bei standardisierte Verfahren zur Immunisierung von Tieren oder
zur Herstellung von Hybridoma-Zellen verwendet werden.
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Das
einkettige Polypeptid der vorliegenden Erfindung, welches Troponin
I und Troponin C umfasst, kann für
die Herstellung empfindlicher Troponin-Assays und die Kalibrierung
solcher Assays verwendet werden. Wie in den nachfolgenden, nicht
limitierenden Beispielen gezeigt wird, zeigt das einkettige Polypeptid
eine im Vergleich zu anderen Troponin-Kalibratoren überlegene
Leistung.
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Beispiel 1
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Expression eines einkettigen
herzspezifischen Human-Troponin I-Troponin C-Polypeptids in E. coli
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Es
wurden cDNAs für
herzspezifisches Human-Troponin I und Troponin C mittels der Polymerase-Kettenreaktion
(PCR) kloniert, wobei Primer verwendet wurden, welche an Hand der
veröffentlichten
herzspezifischen Troponin I-cDNA-Sequenz (Vallins et al., FEBS Letters
270, 57–61
(1990]) und der Troponin C-Sequenz (GenBank AC: C07897) entwickelt
wurden. Der C-Terminus
der Troponin I-cDNA wurde mit dem N-Terminus der Troponin C-cDNA über einen
synthetischen Linker verbunden, welcher für (Gly4Ser)3 kodiert [Gen- und Peptid-Sequenz nach SEQ-ID-NR:
1 bzw. SEQ-ID-NR: 2] mit einer an jedem Ende konstruierten eindeutigen Restriktionsstelle.
Das einkettige Troponin I-C-cDNA-Konstrukt wurde mittels DNA-Sequenzierung
bestätigt und
in den Expressionsvektor pET21 (Novagen) kloniert. E. coli-BL21(DE3)-Zellen,
welche auch von Novagen erhältlich
sind, wurden mit dem resultierenden Plasmid transformiert und die
Protein-Expression wurde sowohl mit SDS-PAGE und Immunoassays verifiziert.
Das oben beschriebene einkettige Polypeptid hat ein Molekulargewicht
von 43.700 Dalton. Die Gen- und Polypeptid-Sequenzen sind in SEQ-ID-NR:
3 bzw. SEQ-ID-NR:
4 wiedergegeben.
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Beispiel 2
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Stabilität und Nutzen
des Polypeptids im Troponin-Assay
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Das
in Beispiel 1 beschriebene einkettige Troponin I-C sowie ein aus
nativem herzspezifischem Troponin I und Troponin C gebildeter Komplex
wurden mit den Assays Stratus(R) und Access(R) ausgewertet, wobei
bei jedem Assay die jeweiligen, vom Hersteller angegebenen Verfahren
befolgt wurden. Die Resultate sind wie folgt:
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Diese
Ergebnisse zeigen, dass das einkettige Polypeptid, welches Troponin
I und Troponin C umfasst, Resultate ergab, welche den Resultaten
für den
nativen, herzspezifischen Troponin I-Troponin C-Komplex ähnelten,
wobei das Stratus(R)-Assay sich ähnelnde
höhere
Werte und das Access(R)-Assay sich ähnelnde niedrigere Werte produzierten.
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Beispiel 3
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Stabilität des einkettigen
Troponin I-C-Polypeptids
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Die
Stabilität
von drei Präparaten,
welche Troponin I enthielten, wurde während einer 7-tägigen Lagerung
bei 4°C
verfolgt. Die Präparate
waren (1) rekombinantes, mittels standardisierter Verfahren hergestellte Troponin
I; (2) ein nicht kovalent gebundener Komplex von rekombinantem Troponin
I und rekombinantem Troponin C und (3) das in SEQ-ID-NR: 4 gezeigte
einkettige Polypeptid, welches Troponin I und Troponin C mit einem
dazwischen positioniertem Linker-Peptid umfasst. Der nicht kovalent-gebundene
Komplex von rekombinantem Troponin I und rekombinantem Troponin
C wurde mittels den in unseren US-Patenten Nr. 5,834,210 und 6,060,278,
hinterlegt am 31. Oktober 1997, veröffentlichten Verfahren hergestellt.
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Kurz
gesagt, es wurde herzspezifisches Human-Troponin C und modifiziertes
Troponin I in E. coli exprimiert. Das Troponin I war als rekombinantes
Produkt mit sechs zusätzlichen
N-terminalen-Aminosäure-Sequenz
konstruiert, um seine Expression zu erhöhen; das Troponin C wurde in
seiner nativen Aminosäure-Sequenz
exprimiert. Das modifizierte Troponin I wurde in Gegenwart von Harnstoff
mit Troponin C, CaCl2 und MgCl2 kombiniert
und vorsichtig geschüttelt,
um die Bildung des Troponin I-Troponin C-Komplexes zu fördern.
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Die
drei Präparate
wurden in normalem Humanserum gelagert. Das Troponin wurde unter
Verwendung des Stratus II (R)-Assays von Dade bestimmt.
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Wie
in 3 gezeigt wird, weisen das rekombinante Troponin
I und der rekombinante Komplex innerhalb einer 7-tägigen Periode
unterschiedliche Detektierbarkeiten auf, wobei die Detektierbarkeit
des ersteren zunächst
ansteigt und dann ab fällt
und die Detektierbarkeit des letzteren im Verlauf der Testperiode
langsam ansteigt. Diese Präparate
waren somit instabil. Dem gegenüber
blieb die immunologische Detektierbarkeit des einkettigen Troponin
I-Troponin C-Peptids innerhalb der Testperiode konstant, was die
Stabilität
dieses Materials demonstriert.
