JP4328019B2 - トロポニンiおよびトロポニンcを含む一本鎖ポリペプチド - Google Patents
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Description
(技術分野)
本発明は、トロポニンサブユニットIおよびC、およびそれらの対応する遺伝子配列を含む組換え型として発現される一本鎖ポリペプチドに関する。
【0002】
(背景技術)
急性心筋梗塞の疑いを早期にそして正確に評価するには、アンギナのような生命に脅威とならない状況や消化不良のような非心臓性胸痛から、緊急の処置を必要とする潜在的に致命的な発生を区別するために、遊離された心筋細胞内成分の血液、血清または血漿中における、感度の高い特異的な検出および定量することに臨界的に依存している。初期の心電図変化は充分に特異的でもないし感度が高くもない、それで医療専門家は、早期の診断に、心臓組織損傷の血清生化学マーカーを当てにせねばならなくなる。はじめは、血清マーカー、クレアチニンキナーゼ(CK)および、特に、心筋CK−MBアイソフォームが使われた、次いで、心損傷のより感度の高い早期インディケーターとしてミオグロビンが使われた。より最近には、心筋トロポニン複合体およびそのサブユニットが、それらの高い特異性のゆえに心筋損傷のマーカーとして好ましいとされた。これらの試験は、骨格筋損傷の他のマーカーに加えて、組合せて、診断の高い正確さをもたらした。もし救急室で実行されるなら、心筋損傷の早期かつ正確な診断は、心臓発作の犠牲となる恐れに対し、大きな利点をもたらすことになる。
【0003】
心筋マーカーを採用した診断テストは、例えば、米国特許No.5,604,105およびNo.5,290,678に記載されている。それらおよび他の方法は救急治療室設備において心筋梗塞を診断するに敏捷さを提供し、そして患者に医療上の利便を提供している。体液中のトロポニンサブユニットまたは複合体のレベルを測定する診断テストには、測定方法において使用される抗体調製物に対する抗原として、精製トロポニンサブユニットあるいは複合体が、また測定を行うために対照およびキャリブレーターとして使用される精製サブユニットあるいは複合体が、しばしば利用されている。測定キャリブレーターは、測定の操作範囲を横切る標準曲線がつくられるように稀釈系列をつくるのに使われる;測定対照は、前以て決められた試料の値がその値の周辺の許容範囲内になるように、測定が行われることを確認するのに使用される。測定が適正に検定できるように、トロポニン対照とキャリブレーターは安定に保たれねばならないし、抗体によって免疫検出される形でなければならない。
【0004】
トロポニンは、筋肉収縮のカルシウム依存性調節に一体的に関与している筋肉タンパク質である。トロポニンは、トロポミオシン上のトロポニン複合体として局在する、非共有結合複合体の3つのサブユニット、即ち、カルシウム結合性サブユニットであるアイソフォームトロポニンC、阻害性サブユニットであるトロポニンI、およびトロポニンT、として心筋および骨格筋の両者に存在している。適当な条件下のin vitroにおいて、トロポニンサブユニットは、自然に会合して、非共有結合複合体、例えば、トロポニンIおよびC、ならびにトロポニンI、CおよびT、を形成する。心筋と骨格筋トロポニンアイソフォームの間には相異がある。
【0005】
心筋損傷および壊死になると、トロポニンが心筋から循環へ漏出し、そこでのその敏感な検出は心臓発作の診断の助けとなり得る。トロポニンサブユニットの心筋と骨格筋アイソフォームの間のアミノ酸配列の相異は、トロポニンサブユニットおよび複合体の心筋アイソフォームを特異的に測定する診断テストにおいて、利用される。心筋トロポニンIの診断テストが得られる。
【0006】
しかしながら、トロポニンIは本質的に貧弱な構造安定性を有しており、生物試料に存在するプロテアーゼによりタンパク質分解の開裂を受けることになる。体液マトリックスで調製されるトロポニンI標準品は、立体配座の変化および分解を受け、そしてキャリブレーターあるいは対照としては不安定である。更に、本質的により安定なトロポニン複合体は、保存において解離することが知られており、そしてそれゆえにタンパク質分解開裂に感受性となる。トロポニンIの場合において、その立体配座構造および安定性の保持を助けるために、トロポニンCと複合体とならねばならない。しかしながら、複合体におけるサブユニットの親和性の性質のゆえに、複合体の形で存在するトロポニンIの分画は濃度に依存する。このことは、測定キャリブレーターあるいは対照としての利用を限定することになる。サブユニット間の相互作用の程度は解離定数、Kd、から計算できる[例えば、Biochemistry 33:12729(1994)]。計算および実験的測定によれば、トロポニンIの限定された量だけがトロポニンCに結合、特に患者血清試料に見出される範囲、従ってキャリブレーターおよび対照を使わねばならないレベルを超えて結合する。例えば、大部分のトロポニンI測定の上限である50ng/mlにおいては、トロポニンIのほんの10%がトロポニンCと結合し、2つのサブユニットが1:1の比率で存在する。トロポニンIに対し10倍のトロポニンCの範囲で、しかも2価の陽イオンが存在するとき、冷時の複合体の安定性についての要求、(Larueら、米国特許5,583,200)は最小、即ち「少なくとも1日」である。複合体のより高い濃度を維持すると、会合の度合いが増加する。しかし、測定を検定するに必要なレベルまで稀釈した後は、サブユニットは解離し、そして免疫的に不安定になる。それで、解離はサブユニットにタンパク分解攻撃を受けやすくし、更に、そのようなキャリブレーターおよび対照の有用性を減じることになる。
【0007】
それゆえ、産業の要請に合った安定なトロポニンのキャリブレーターおよび対照に対する、必要性が存在する。
【0008】
多くの、天然および組換え源の両者からのトロポニン製剤が、トロポニンIとトロポニンCを含んで、記載されている。MalnicおよびReinach(1994,Eur.J.Biochem.,v.222,pp.49−54)は、全3つのニワトリ骨格筋トロポニンサブユニットを、1またはそれ以上の発現プラスミドにクローニングすることによって、in vivoで組換え複合体を製造している。発現ベクター内で、各トロポニン遺伝子はそれ自体のプロモーターを持っており、そしてタンパク質が個々のトロポニンサブユニットとして細菌内で発現され、次いで細菌内で複合体を生成する。Fujita−Beckerら(1993,J.Biochem.,v.114,pp.438−444)は、E.coli内で発現した組換えサブユニットからウサギ骨格筋トロポニン複合体の再構成を記載している。これらの組換え産物のいずれもが、診断テスト標準品またはキャリブレーターとして使用される適当な安定性を有することは記載されていない。上にあげたように、トロポニンサブユニットの複合体でさえ安定でなく、どのような程度にでも溶液中で、結合して残留することはないのである。
【0009】
以下で明らかになるように、本発明の主要な目的は、組換え構造体として調製され、単一のポリペプチドとして細菌発現系で発現する、一本鎖ポリペプチドとしてのトロポニンIおよびトロポニンCを含む、測定およびその他の用途用の安定なトロポニン調製物を提供するにある。本発明は、カルボジイミド架橋および光架橋化学のような方法、例えばJhaら(1996,Biochemistry,vol.35,pp.11026−11035)、Kobayashiら(1996,Biochem.Biophys.Acta,vol.1294,pp.25−30)およびKobayashiら(1995,Biochemistry,vol.34,pp.10946−10952)により記載されたような方法を使って生化学研究用の化学的に架橋されたトロポニンサブユニットおよびそれらの断片とは、異なっている。これらの文献において、異なったトロポニンタンパク質の特定の断片は、トロポニン複合体におけるサブユニットの立体配座およびそれらの天然の相互作用をしらべるために、化学的に架橋されたものである。
【0010】
それゆえ、トロポニン測定において、抗原として、ならびに対照およびキャリブレーターとして使用される、安定性要件および精製が容易な調製物に合致するようなトロポニン物質に対する要望がある。普遍的に受け入れられる、トロポニンについての対照またはキャリブレーターはないので、研究室あるいは装置間の測定を標準化することは不可能であり、その対照およびキャリブレーターに沿った各々特定のトロポニン測定として、その研究室および測定成分の選択に独特の結果を生じることになる。それゆえ、全ての研究室および医師によって認められる、正常および異常の範囲を提供することは、今や、不可能である。これらに、全ての入手し得る市販の測定装置で使用することができる、普遍的なキャリブレーターおよび対照に対する必要性が存在する。
【0011】
ヒト心筋トロポニンIおよびヒト心筋トロポニンCを含む一本鎖ポリペプチドは安定であり、前記した目的について有用性を有することが、今や見出された。更に、製品は当業者によって容易に製造されねばならない。この製造の容易さは、本発明の製品の再現性を最大化するものである。
【0012】
(発明の概要)
本発明の主要な目的は、トロポニンIおよびトロポニンCを含む一本鎖ポリペプチドを提供するにある。同一ポリペプチド鎖にトロポニンIおよびトロポニンCが存在することは、産物に対する立体配座安定性および免疫的安定性を付与する。一本鎖ポリペプチドは、好ましくは、トロポニンIおよびトロポニンCの配座の間に挟まれた、リンカー配列を包含する。リンカーペプチドの配列は、製品の三次元構造を阻害しないで、それゆえ、前記した有用性を有するように選択される。トロポニンIおよびトロポニンCがつながって、所望によりリンカーペプチドを通してつながった、一本鎖ポリペプチドは、トロポニン測定の開発のための、安定で、再現性のある、そして容易に精製し得る物質、トロポニン抗体を調製するための抗原、ならびに、トロポニン測定のための対照およびキャリブレーターとして使用される物質、を提供する。
【0013】
本発明の一本鎖ポリペプチドは、一本鎖ポリペプチドの遺伝子配列をもったプラスミドのような複製し得るクローニングまたは発現ベヒクルを構築し、E.coliのような宿主細胞をベヒクルまたはプラスミドで形質転換し、そして宿主細胞によってポリペプチドを発現することによる、組換え技術によって最も容易に調整される。一本鎖構造は、好ましくは、組換え手段によって導入された配列のような、トロポニンIとトロポニンCアミノ酸配列の間にリンカーペプチド配列を含有する。宿主細胞でのポリペプチドの発現を改良するために、ポリペプチドのアミノ酸配列の結果において変更を加えまたは加えないで、トロポニン分子の遺伝子配列にある種の修飾がなされてもよい。これらの変化は、前記した目的における使用のための、一本鎖ポリペプチドの有用性を変更しない。
【0014】
本発明の別の目的は、トロポニンIおよびトロポニンCの遺伝子配列を含む一本鎖ポリペプチドの遺伝子配列を提供するにある。遺伝子配列は、トロポニンIとトロポニンCの遺伝子配列の間に挟まれたリンカー遺伝子配列を含むこともできる。宿主細胞は、前記した遺伝子配列を含有する複製し得るクローニングまたは発現ベヒクルで形質転換され得る。上記したように、トロポニンの遺伝子配列のいくつかの変化は宿主細胞における発現を促進するために行うこともできる。
【0015】
本発明の更に別の目的は、トロポニンIおよびトロポニンCの遺伝子配列を含む一本鎖ポリペプチドに対する遺伝子配列をもったクローニングまたは発現ベヒクルまたはプラスミドを含有し、そしてトロポニンIおよびトロポニンCを含む一本鎖ポリペプチドを発現することができる、宿主細胞を提供するにある。
【0016】
本発明の、これらおよびその他の観点は、以下の図面および詳細な説明を参照することによって、よりよく理解できるであろう。
【0017】
(発明の詳細な説明)
心筋関連タンパクトロポニンの循環における測定は、急性心筋梗塞の疑いのあり場合の早期かつ特異的インディケーターであることが証明されている。それで、血液中のトロポニンおよびそのサブユニットを迅速にそして正確に検出する方法は緊急の状態において心臓発作を診断するために開発されてきたし、されつつもあり、その結果として、数え切れない生命が救われたし、救われることになるであろう。しかしながら、正確な信頼できる診断測定を開発し、測定対照およびキャリブレーターを使用したこれらの測定の有効性を保証するために、安定した高品質のヒト心筋トロポニン対照およびキャリブレーターが得られることが、品質管理および試験目的、ならびに測定用の抗体を上昇するためのトロポニン抗原にとって重要な意味を持つ。更に、トロポニンを測定する商品は開発されてはいるが、また開発されつつあるが、これらの測定は、同じ試料でも異なった結果を与える。トロポニン用の種々の測定器および測定方法とトロポニンの普遍的な標準品がないというのが組み合さって、トロポニンレベルの広範に受け入れられる正常および異常範囲の開発を阻害してきた、かくして心筋マーカーを含む研究室の結果の解釈を不明確にし、研究室間の臨床研究を阻害してきたのである。これらの欠点は、普遍的なトロポニン対照およびキャリブレーターが得られれば解消できるであろう。普遍的な対照およびキャリブレーターは、全ての得られる測定により検出可能となり、全てのトロポニン測定によって読み出されたものを標準化するのに使用できるであろう。
【0018】
トロポニン測定用の安定なキャリブレーターおよび対照のために、本発明は、遊離トロポニンIの固有の立体配座の不安定さおよびタンパク分解に敏感であること、およびトロポニンI−トロポニンC複合体に伴う不安定さを改良する。改良は、ヒト心筋トロポニンIおよび心筋トロポニンCを含む一本鎖ポリペプチドからなる。トロポニンサブユニットは、ペプチド結合を通じて共有結合し、同じ直線ポリペプチドにある。このポリペプチドは工業の要求に合うように安定なトロポニンI−トロポニンC複合体を提供する。一本鎖ポリペプチドは、組換え技術によって調製され、好ましくは、トロポニンIとトロポニンCの間に挟まれたリンカーポリペプチド配列を包含する。このリンカー配列の長さおよび配列は、生成物の免疫検出およびその他の前記した有用性を妨害しない、ことにのみ限定されている。
【0019】
例えば、トロポニンI−トロポニンC一本鎖ポリペプチドの一実施態様は、トロポニンI配列のC末端がトロポニンC配列のN末端をペプチド結合で結ばれた、ポリペプチドのN末端にトロポニンI配列があるものを含む。リンカーペプチド配列がトロポニンIとトロポニンCの間に挟まれた、第二の好ましい実施態様においては、一つの好ましい配置は、ポリペプチドのN末端部にトロポニンI配列があって、そのC末端がリンカーペプチドのN末端とペプチド結合で結ばれており、そしてリンカーペプチドのC末端がトロポニンC配列のN末端とペプチド結合でつながれている、ことを含む。この構造の一例は、SEQ ID NO:4に描かれたアミノ酸配列である。この例では、リンカーのアミノ酸配列は、SEQ ID NO:2に代表される。このものは19アミノ酸を含有している。
【0020】
上記の例のアミノ酸配列は、これらポリペプチドに対するcDNAのヌクレオチド配列に対応する。第一の例の遺伝子配列は、cDNAの5′末端におけるトロポニンI遺伝子配列、その3′末端はトロポニンC遺伝子配列の5′末端に直ぐに続いている、ことを含んでいる。リンカーがトロポニンIとトロポニンC配列の間に挟まれた、好ましい実施態様においては、cDNA配列の5′はトロポニンI遺伝子配列で始まり、その3′末端に任意の挟まれたリンカー遺伝子配列の5′末端が続き、そしてその3′末端にトロポニンC遺伝子配列の5′末端が続き、cDNAの3′末端で終わる。上記の特別の例では、遺伝子配列はSEQ ID NO:3に代表されている。リンカーのcDNA配列はSEQ ID NO:1に示されている。
【0021】
上記したように、任意のリンカーポリペプチドの長さ、および特異的配列の選択は、一本鎖ポリペプチドにおけるトロポニンIとトロポニンCの免疫検出性を阻害してはならないように限定されるだけである。適当なリンカー配列では、一本鎖ポリペプチドのトロポニンIおよびトロポニンCセグメントは、非共有結合トロポニンI−トロポニンC複合体におけると同様な様式で互いに会合し、そして一本鎖ポリペプチドにおけるサブユニットの付着は会合の立体配座およびその結果のトロポニンと矛盾しない免疫検出性が保持される、と信じられる。更に、このようにして安定化したトロポニンI−トロポニンC複合体は、体液およびその他の成分の存在でタンパク質分解攻撃に感受性でない。この好ましい実施態様内で、約6から約50アミノ酸(および対応するcDNAのコドンの数)のリンカーが、調製物の容易さおよび経済性のために、好ましい。
【0022】
本発明の一本鎖トロポニンI−トロポニンCポリペプチドは、比較的短いリンカーセグメントで製造することが好ましい、なぜなら、そのような製品では、産物の三次構造の阻害が少ないか、あるいは、ない、からである。それゆえ、既に得られている抗体との反応に対するエピトープの得られやすさに阻害が少ないか、ないことになる。通常のトロポニンI−トロポニンC複合体において、トロポニンI成分のアミノ末端はトロポニンC成分のカルボキシ末端に非常に接近している。しかしながら、もしそれらがリンカーなしに形成されたら、この接近は妨害され、得られた三次元構造の歪みは反応ができないようになるエピトープを生み出す。同様にして、長すぎるリンカーも三次元構造を修飾し、あるいはリンカーそれ自体がエピトープを隠すことになる。
【0023】
例えば、有用なリンカーポリペプチド配列は(Gly4Ser)3で、これは2つのサブユニットが会合するように柔軟なペプチド配列を提供する。リンカーと遺伝子配列を構築するために、所望の一本鎖ポリペプチドの遺伝子構造を創り出すのに独特の制限部位を提供するために必要とされる、2コドンが付加的にリンカーの各末端に存在している。一例として、リンカーのN末端にあるThr−SerおよびC末端にあるAla−Cysが含まれる。かくして、適当な19残基のリンカーが造られる(遺伝子配列SEQ ID NO:1およびペプチドSEQ ID NO:2)。
【0024】
組換え法がトロポニンサブユニットおよび任意のリンカー配列を含むDNA配列を調製するのに、および宿主細胞に配列を導入するのに使用され、そして標準的発現方法が、組換えポリペプチドを発現し精製するのに使用される。これらの方法は、2つの代謝共役酵母酵素、クエン酸シンターゼおよびリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、について記載された(Lindbladhら、Biochemistry,33:11692−11698[1994]);抗体の抗原結合部位を含む一本鎖ポリペプチドの調製において(米国特許4,946,778);およびファージ提示融合タンパク質の調製(米国特許5,516,637)のような、融合タンパク質の調製に使用されたのと類似の方法である。これらの方法は、当業者に知られている。
【0025】
リンカー配列を必要としない例においては、トロポニンIおよびトロポニンCcDNA配列は、例えば、ヒト心筋トロポニンTにおけるまれなコドンが同義主要コドンで置換される、Huら(1996,「タンパク質の発現と精製」、7:289−293)によって記載されたように、部分的に重複したプライマーのペアを使用するSOEing法のような公知の適当な技術で一致させられる。これらの方法も、また、当業者に知られている。
【0026】
組換え構築は、発現またはクローニングベヒクル、またはプラスミドとして調製され、そして発現のため宿主細胞に導入される。組換えタンパク質の発現方法は公知である。一度発現されると、一本鎖ポリペプチドは標準的タンパク質精製法により精製される。
【0027】
さらに、トロポニンIおよびトロポニンCの遺伝子配列は、細菌の発現系において一本鎖ポリペプチドの発現を改良するために修飾される。これら遺伝子変換は、ポリペプチドのアミノ酸配列を変更したりしなかったりする。よく知られているように、発現ベヒクルに存在するある種のまれなコドンは、発現効率を減じる、そしてこれらコドンを同義の主要なコドン(遺伝子配列SEQ ID NO:5)に変更することによって、細菌の発現が改善される(例えば、トロポニンIについて米国特許第5,834,210号に記載;更に上記Huらの方法参照)。また、トロポニンIcDNAの5′末端への短いヌクレオチド配列を含む(例えば、米国特許第5,834,210号)と細菌の発現を増加し、6つのN末端アミノ酸(ペプチド配列SEQ ID NO:6)を付加したトロポニンIポリペプチドを提供する。細菌の発現を増加するこれら任意の修飾は、前記の目的の一本鎖ポリペプチドの有用性を減じることはない。
【0028】
いくつかのトロポニンI測定は、市販されており、これらの全ては異なったフォーマット、装置、および測定対照およびキャリブレーターを用いて操作する。例えば、Dade社からのストレイタス(Stratus)(R)トロポニンI測定は、モノクローナル捕捉体およびモノクロ−ナル検出抗体を利用する。キャリブレーター/対照物質はヒト心筋トロポニンIからのN末端ペプチドである。測定の操作範囲は、0−50ng/ml、感度0.6ng/ml、カットオフ値1.5ng/ml。Sanofi社からのアクセス(Access)(R)トロポニンI測定は、また、モノクローナル捕捉体およびモノクロ−ナル検出抗体を利用する、しかし、そのキャリブレーター/対照物質は、天然の心筋トロポニンIおよびトロポニンCの複合体である。この測定では、測定範囲0−50ng/ml、感度0.03ng/ml、およびカットオフ値0.1ng/ml。Behring社からのオーピーユーエス(Opus)(R)トロポニンI測定では、捕捉体および検出体としてポリクローナル抗体を利用し、測定範囲0−300ng/ml、感度1ng/mlおよびカットオフ値2ng/ml。
【0029】
上にあげた測定法の間の方法論および成分における相異のゆえに、キャリブレーター/対照は測定間で相互交換性がない。例えば、心筋トロポニンIからのN末端ペプチドを使用する、Stratus(R)キャリブレーター/対照はAccess(R)およびOpus(R)測定では検出できない、と云うのは、後者の測定の抗体は対照/キャリブレーターに使用されたトロポニンIの同じN末端ペプチド部分に向けられていないからである。反対に、Access(R)測定の対照は、これはAccess(R)測定において、3つの測定系のなかで最高の感度のレベルとカットオフ値を有して検出されるが、Opus(R)測定におけるより約4倍高く測定できる。対照的に、Opus(R)測定対照はStratus(R)測定によっては貧弱にしか検出されない。これらの結果は、測定間で測定キャリブレーター/対照に相互交換性は不可能であり、一つの製造会社の測定の対照によって提供された価は、同じ測定において動く測定を解釈するのにしか使えない。この貧弱な関係は、更に、図2に示したグラフによって支えられる、それは、Access(R)、Stratus(R)およびOpus(R)測定を使って心臓発作を受けている患者において、一連のトロポニンIレベルを測定したものを描いている。図示したように、3測定とも全て、1時間目と6時間目の間のトロポニンIレベルにおいて顕著な上昇と下降を示しているが、各時間点でのトロポニンIの絶対値は非常に異なっている。これらの広い相異は、上に詳述したように、測定の個性とそれらのキャリブレーター/対照に帰せられる。
【0030】
トロポニンIおよびトロポニンCを含む本発明の一本鎖ポリペプチドは、トロポニンIまたはトロポニンCに対し親和性を有する、抗体をふくめたタンパク質およびその他の物質の生成に使用することができる。例えば、本発明の一本鎖ポリペプチドは、不溶性マトリックスまたはポリマーに共有結合させ、クロマトグラフィカラムに位置される。トロポニンに結合する物質を含むと思われる細胞または組織抽出物、あるいはトロポニンに対してあげられた抗体調製物、をカラムに通過させ、共有結合したポリペプチドに吸着させる。マトリックスを洗浄後、吸着した物質は濃塩類溶液、カオトロピック試薬、あるいはタンパク質精製に使われる他の標準方法、を用いて溶出され得る。
【0031】
本発明の一本鎖ポリペプチドは、動物の免疫またはハイブリドーマ調製の標準的方法を使用して、モノクローナルまたはポリクローナル抗トロポニン抗体の調製に使用することができる。
【0032】
トロポニンIおよびトロポニンCを含む本発明の一本鎖ポリペプチドは、感度のあるトロポニン測定のための調製物、およびそのような測定の補正に有用である。以下の非限定的実施例からみられるように、一本鎖ポリペプチドは、他のトロポニンキャリブレーターに比較するとき優れた性能を示す。
【0033】
実施例1
E.coliでの一本鎖ヒト心筋トロポニンI−トロポニンCポリペプチドの発現
ヒト心筋トロポニンIおよびトロポニンCcDNAsを、公知の心筋トロポニンIcDNA配列(Vallinsら、FEBS Letters,270,57−61[1990])およびトロポニンC配列(GenBank AC:X07897)からデザインしたプライマーを使用してポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によってクローニングした。トロポニンIcDNAのC末端を、各末端に独特の制限部位を遺伝子工学処理した(Gly4Ser)3をコードする合成リンカー[それぞれ、SEQ ID NO:1およびSEQ ID NO:2の遺伝子およびペプチド配列]を通じてトロポニンCcDNAのN末端に連結した。一本鎖トロポニンI−CcDNA構造体は、DNAシーケンシングによって確認し、発現ベクターpET21(Novagen)にクローニングされた。Novagenから得たE.coliBL21(DE3)細胞を、得られたプラスミドで形質転換し、タンパク質発現をSDS−PAGEおよびイムノアッセイの両者によって実証した。上記した一本鎖ポリペプチドは分子量43,700ダルトンを有する。遺伝子およびポリペプチド配列は、それぞれSEQ ID NO:3およびSEQ ID NO:4に示す。
【0034】
一本鎖トロポニンI−トロポニンCポリペプチドを発現するE.coli株はアメリカン タイプ カルチャー コレクションに寄託済である。
【0035】
実施例2
トロポニン測定におけるポリペプチドの安定性および有用性
実施例1記載の一本鎖トロポニンI−Cおよび天然の心筋トロポニンIおよびトロポニンCから形成した複合体を、Stratus(R)、およびAccess(R)測定法で、各測定の製造者の指示手順に従って、評価した。結果は、以下の通りであった。
【0036】
【表1】
【0037】
これらの結果は、トロポニンIおよびトロポニンCを含む一本鎖ポリペプチドは、天然の心筋トロポニンI−トロポニンC複合体と類似した測定結果を与え、そこにおいて、Stratus(R)測定は類似した高値を、そしてAccess(R)測定は同様の低値をつくった。
【0038】
実施例3
一本鎖トロポニンI−Cポリペプチドの安定性
トロポニンIを含む3つの調製物の安定性を4℃、7日間貯蔵の間、行った。調製物は、(1)標準法で調製した組換えトロポニンI;(2)組換えトロポニンIおよび組換えCの非共有結合複合体、および(3)SEQ ID NO:4に示すような、間に挟まれたリンカーペプチドを有するトロポニンIおよびトロポニンCを含む一本鎖ポリペプチドであった。簡単に云うと、ヒト心筋トロポニンCおよび修飾トロポニンIをE.coliで発現させた。トロポニンIは、その発現を増加させるために、6つの付加的N末端アミノ酸残基と組替え産物として遺伝子工学処理した。尿素の存在下、修飾トロポニンIは、トロポニンC、CaCl2およびMgCl2と結合させた、そしてトロポニンI−トロポニンC複合体の形成を促進するためゆっくりと振とうした。
【0039】
3つの調製物は普通のヒト血清に貯蔵した。トロポニンはDadeStratusII(R)測定を使って測定した。
【0040】
図3に示すように、組換えトロポニンIおよび組換え複合体は、7日間の期間に亙って変化しやすい測定性を示し、前者は最初上昇し、そして下降した、および後者は試験期間中に亙ってゆっくりと上昇した。これらの調製物は、それゆえ、不安定である。対照的に、一本鎖トロポニンI−トロポニンCペプチドは、試験期間中に亙って、一定した免疫検出性を保ち、物質の安定性を明らかに示した。
【0041】
本発明は、特定の実施態様、種々の特定の物質、方法および実施例を参照することによって、ここに記載され、説明されたが、本発明は、特定の物質、物質の組み合わせ、およびその目的のために選択された方法、に制限されるものではないと理解される。実際、ここに記載されたのに加えて本発明の種々の変形は、先の記載および付属する図から当業者に明らかになるであろう。そのような変形は付属する特許請求の範囲内にあるものと意図される。
【0042】
先行文献にたいする種々の引用は、本明細書を通してあげられてきたが、それらはここにその全部を参照することによってとり入れられている。
【図面の簡単な説明】
【図1】 図1は、19アミノ酸残基のリンカーペプチドによって分離されたトロポニンIおよびトロポニンCを含む一本鎖ポリペプチドの、DNAおよびアミノ酸配列(それぞれSEC ID NO:3およびSEQ ID NO:4)を示したものである。ヌクレオチド1から630はトロポニンIを含み、ヌクレオチド631から687はリンカーペプチド配列を含み、そしてヌクレオチド688から1170はトロポニンCの配列を含む。
【図2】 図2は、心臓発作を受けた患者からのトロポニンIについて、1時間ごとの測定結果を示す。トロポニンIはStratus(R)、Access(R)およびOpus(R)測定法を使用して測定された。
【図3】 図3は、トロポニンIを含有する、異なった調製物の4℃における、時間に亙る安定性を示す:組換えトロポニンI、トロポニンIとトロポニンCの非共有結合複合体、およびトロポニンIおよびトロポニンCを含む本発明の一本鎖ポリペプチド。
Claims (10)
- 配列番号2(SEQ ID NO:2)で特定されているペプチドリンカー配列によって、そのN末端側に心筋トロポニンIが、C末端側に心筋トロポニンCが連結された配列を含む一本鎖ポリペプチド。
- 配列番号4(SEQ ID NO:4)で特定されるアミノ酸配列を有する一本鎖ポリペプチドである請求項1記載の一本鎖ポリペプチド。
- 請求項1記載の一本鎖ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- 配列番号4(SEQ ID NO:4)で特定された配列を含む一本鎖ポリペプチドをコードする請求項3記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号3(SEQ ID NO:3)で特定された配列を含むポリヌクレオチドである請求項4記載のポリヌクレオチド。
- 請求項3記載のポリヌクレオチドを含むクローニングまたは発現ベクター。
- 請求項6記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
- E.coliである請求項7記載の宿主細胞。
- 請求項1記載の一本鎖ポリペプチドを含むトロポニンI測定用の対照またはキャリブレーター組成物。
- 試料中のトロポニンIを定量するための方法であって、以下のステップを含む方法:
a) 標準として請求項1記載の一本鎖トロポニンIの既知量を検出し、
b) 試料中のトロポニンIの未知の量を検出し、
c) 試料中のトロポニンIの未知の量を、標準としての一本鎖ポリペプチドの既知の量で補正する。
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