JPH10513484A - ヒト心臓ＣＮＢｒトロポニンＩアイソ型及びその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヒト組換えトロポニンＩから化学的切断によって作られるヒト心臓トロポニンＩフラグメントに関する。該フラグメントは、ヒト心臓トロポニンＩの一次構造の73％に相当し、そして組換えトロポニンＩよりも免疫学的に一層反応性である。該フラグメント、又はアイソ型は、心筋梗塞を経験した患者の血清中の天然の心臓トロポニンＩの主分解産物の分子量と同等である。このアイソ型は、心臓トロポニンイムノアッセイにおいて較正標準として使用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒト心臓ＣＮＢｒトロポニンＩアイソ型及びその使用 発明の背景 本発明は、心筋梗塞（「ＭＩ」）の診断の分野に関する。ＭＩの診断を補助す る生化学的試験の一つは、クレアチンキナーゼのＭＢアイソエンザイム（「ＣＫ −ＭＢ」）である。しかしながら、ＣＫ−ＭＢは心筋に完全には特異的でない。 すなわちそれは骨格筋に、また骨格筋損傷後の血中にも見いだされる。例えばCu mmins，et al.，(1987)，“Cardiac-Specific Troponin I Radioimmunoassay in the Diagnosis of Acute Myocardial Infarction”，American Heart Journal ，June 1987，Vol．113，No.6 を参照のこと。ＣＫ−ＭＢ試験の別の欠点の一つ は、骨格筋中のＣＫ−ＭＢの量が骨格筋再生の度合によって変化することであり 、その情報は、ＭＩについて試験を行い又は試験結果を解析する時にはしばしば 知られていないことがある。ＣＫ−ＭＢ試験の別の欠点の一つは、ＣＫ−ＭＢが 胸痛の発生後僅か２〜３日しか高まっていないことである。その時より後で入院 した患者では、ＣＫ−ＭＢ試験は、もしあるとしても限定された価値しかないで あろう。例えば、Cummins，et al．(1987)を参照。従って、ＣＫ−ＭＢ試験の特 異性の欠如のために、また診断の道具としてのそれを用いるための限られた枠の ために、ＣＫ−ＭＢは、えり抜きのＭＩ試験ではない。乳酸デヒドロゲナーゼ（ ＬＤＨ）及びグルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）等のよう な他の酵素アッセイもまた存在するが、胸痛発生後の非 常に初期に必要とされる頻繁な一連の測定は、絶対的な特異的診断のためには難 点となり得る。Larue，et al．(1992)，“New Monoclonal Antibodies as Probe s for Human Cardiac Troponin I: Epitopic Analysis With Synthetic Peptide s”，Molecular Immunology，Vol.29，No.2，pp.271-278(1992)を参照のこと。 従って、先行技術は、ＭＩの後非常に速やかに血清中に検出され得且つＭＩの発 生後２〜３日を超えて存在し続ける、正確な心臓特異的な生物学的パラメータの 必要を認識していた。 筋原繊維の収縮性タンパク質であるトロポニンＩ（「ＴｎＩ」）の心臓アイソ 型は、心筋に特異的に局在している。ＴｎＩは、細糸制御タンパク質複合体であ るトロポニンの阻害的サブユニットであり、心筋及び横紋筋にカルシウム感受性 を付与している。トロポニン複合体は、トロポニンＴ（「ＴｎＴ」）すなわちト ロポミオシン結合サブユニット、トロポニンＣ（「ＴｎＣ」）すなわちＣａ＋＋ 結合サブユニット、及びＴｎＩ（これはアクトミオシンＭｇ＋＋−ＡＴＰアーゼ を阻害する）という３つのサブユニットからなる。トロポニンＩは、３つのアイ ソ型で存在する。すなわち、２つの骨格筋ＴｎＩ（高速及び低速）アイソ型（分 子量＝19,800ダルトン）及び、Ｎ−末端に追加の31残基（ヒトＴｎＩ）を有しそ の結果分子量23,000ダルトンである心臓ＴｎＩ（「ｃＴｎＩ」）アイソ型である 。 心臓ＴｎＩは、ＭＩの後速やかに（約４乃至６時間以内に）ヒト血清中に見い だされる。それは約18〜24時間でピークレベルに達し、そして６乃至７日の間、 血流中に高レベルに留まる。従って、ヒトｃＴｎＴについて試験することを可能 にするイムノアッセイは、 医療社会及び公衆にとって価値がある。 ＭＩ患者血清中に検出されるのと同等の、免疫学的に反応性のヒトｃＴｎＩア イソ型を使用することが好ましい。我々は、ＭＩ患者血清が、ｃＴｎＩ分子のＣ 末端プロセシングの結果であるＴｎＩフラグメントを含有することを見いだした 。Ｃ−末端領域において心臓ＴｎＩと骨格筋ＴｎＩとの間に見いだされている高 い配列相同性（Larue et al．1992，Molec．Immunology 29，271-278，Vallins et al．1990 FEBS Lett．270，57-61，Leszky et al．1988 Biochemistry 27，2 821-2827）は、この領域に対して向けられた、心臓特異性を有しないＴｎＩ抗体 を製造する（Larue et al.，1992）。我々のデータ及びLarue et al．1992 は、 既知のｃＴｎＩ特異的抗体の大半が、ＴｎＩ分子の最初のほぼ75％の部分に位置 するエピトープを有することを示唆している。従って、ＴｎＩ分子のこの部分は 、大半のイムノアッセイ系において、ＭＩ特異的なｃＴｎＩアイソ型として機能 している筈である。 現在、ＴｎＩイムノアッセイはヒトｃＴｎＩを用いていない。デイドは現在、 較正標準に入れた合成ペプチドを及び対照を用いた、ｃＴｎＩイムノアッセイキ ットを欧州及び米国において販売してい 。天然のヒトｃＴｎＩは、ヒト心臓が少ないため、得るのが困難である。更には 、ヒトｃＴｎＩは、精製中にタンパク質分解による変性を非常に受けやすい。ヒ ト組換えＴｎＩ（「ｒ−ＴｎＩ」）の入手可能性は、このｃＴｎＩアイソ型の製 造を容易にすることができる。ｒ−ＴｎＩは、天然のヒトｃＴｎＩと異なって、 許容し得る量で製造し精製することが可能である。デイドによって発現されたよ うに、ｒ−ＴｎＩ（配列番号１）の一次構造は、226 個のアミノ酸を含み；それ らのうち209 にＴｎＩ配列（配列番号２）が相当する（図１を参照）。ｃＴｎＩ の一次配列（配列番号２）に加えて、ｒ−ＴｎＩは、Ｎ−末端上に８個のアミノ 酸よりなるリーディング（leading)配列（MASMTLWM）を有し、そしてＣ末端上に ９個のアミノ酸(PMVHHHHHH)よりなる尾部配列を有する（配列番号１）（図１を 参照）。ｒ−ＴｎＩ分子の一次構造は、位置−７,−４，０，153 ，154 ，200 及び211 にメチオニン残基を有する（配列番号１）（図２を参照）。 ＭＩ患者血清中に検出されるのと同等の、免疫学的に反応性のヒトｃＴｎＩア イソ型を使用することが望ましい。ｒ−ＴｎＩの入手可能性は、このｃＴｎＩア イソ型の製造を容易にすることができる。更には、既知のＴｎＩ抗体の大半は、 ＴｎＩ分子の最初の約75％中に位置するエピトープを有していることから、Ｔｎ Ｉ分子のその部分は、殆どのイムノアッセイにおいてｃＴｎＩアイソ型として機 能するであろう。 本発明の要約 本発明は、化学的切断によってヒトｒ−ＴｎＩから産生された、ヒトｃＴｎＩ フラグメントの使用に関する。臭化シアン（ＣＮＢｒ）によるｒ−ＴｎＩの切断 は、153 個のアミノ酸よりなる主ポリペプチド（以下「ＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイ ソ型」という。）をもたらす（配列番号３）。ＣＮＢｒ−ｃＴｎＩは、ヒトｃＴ ｎＩの一次構造の73％に相当し、そしてｒ−ＴｎＩよりも免疫学的に一層反応性 である。放射型分配イムノアッセイによって測定したところによれば、精製され たＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ型は、ｒ−ＴｎＩに較べ て平均３〜４倍一層反応性であり、そして非特異的結合が少ない。図７に明らか にされているように、ＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ型の分子サイズは、分子量にお いて、ＭＩ患者血清中の天然の心臓ＴｎＩの主分解産物に相当する。ＣＮＢｒ− ｃＴｎＩアイソ型は、種々のｃＴｎＩイムノアッセイにおいて較正標準又は対照 として使用することができる。ＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ型は、デイドのＴｎＩ イムノアッセイにおいて現在使用されている合成ペプチドに比して高い安定性を 有する。 本発明はまた、ＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ型の免疫学的及び生物学的活性及び 非特異的結合に対する、ＴｎＣの効果にも関する。本発明は、更に、ＣＮＢｒ− ｃＴｎＩアイソ型、ＴｎＣ及びＴｎＴによって形成される複合体にも関する。 図面の記述 図１は、ヒト心臓トロポニンＩアミノ酸配列の並びを描いている。単一文字に よるコードが使用された。他のシンボルとしては次のものが含まれる：（ｒ）＝ ｒ−ＴｎＩ（配列番号１）；（ｈ）＝天然のヒトｃＴｎＩ（配列番号２）；（Ｉ ）＝ＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ型（配列番号３）；（ｃａｍ）＝Ｓ−カルボキシ アミドメチルシステイン 図２は、ｒ−ＴｎＩのＣＮＢｒ切断戦略を描いている。（Ｍ）＝メチオニン た、較正標準ベースにおけるｒ−ＴｎＩ及びＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ型の活性 を示す。 た、ヒト血清中のｒ−ＴｎＩ及びＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ型の活性を描いてい る。 た、種々のタブに対するｒ−ＴｎＩ及びＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ型の非特異的 結合／特異的結合比を示す。各ＴｎＩ型の特異的活性は、ＴｎＩ特異的抗体タブ 上で測定された。他のタブ（ＴｎＩ非特異的タブ）の略号は次の通りである： ＰＳＡ＝前立腺特異的抗原タブ；ＣＫＭＢ＝クレアチンキナーゼＭＢタブ；ＡＦ Ｐ＝α−胎児性タンパクタブ；ＰＡＰ＝前立腺酸ホスファターゼタブ；blank ＝ ブランクガラス繊維タブ；isoform ＝ＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ型。 図６は、ＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ型のＳＤＡ−ポリアクリルアミドゲル電気 泳動（15％）の結果を描いている。レーン１及び８は、分子量標準であり、レー ン２及び５はｒ−ＴｎＩであり、レーン３，４，６及び７は、ＣＮＢｒ−ｃＴｎ Ｉアイソ型である。 図７は、ＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ型のウエスタンブロット分析を描いている 。レーン１はＣＮＢｒ−ｃＴｎＩフラグメントであり、レーン２及び３はＭＩ患 者血清から抽出されたｃＴｎＩの分解フラグメントであり、そしてレーン４は分 子量標準である。 図８は、ＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ型（「ｃ」）（配列番号３）のＮ末端アミ ノ酸配列の並びを、ヒト心臓ＴｎＩ（「ｂ」）（配列番号２）及びｒ−ＴｎＩ（ 「ａ」）（配列番号１）のそれらと共に、示す。 図９は、ＴｎＩ：ＴｎＣ複合体のポリアクリルアミドゲル電気泳動（未変性ゲ ル）の結果を示す： レーン１はＴｎＣである。レー ン２はｒ−ＴｎＩ：ＴｎＣ（１モル：１モル）である。レーン３はｒＴｎＩ：Ｔ ｎＣ（２モル：１モル）である。レーン４はｒＴｒＩ：ＴｎＣ（３モル：１モル ）である。レーン５はＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ型：ＴｎＣ（１モ：：１モル） である。レーン６はＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ型：ＴｎＣ（２モル：１モル）で ある。レーン７はＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ型：ＴｎＣ（３モル：１モル）であ る。 図１０は、種々のＴｎＩ調製物の活性及び非特異的結合を描いて II TnI Immunoassay Systemを用いて測定した。非特異的結合は、フェリチンタ ブを用いて測定した。 した、ＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ型の活性に対するＴｎＣの存在の効果を明らか にしている。 図１２は、ＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ型：ＴｎＣ：ＴｎＴ複合体（レーン３及 び４）、及びＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ型：ＴｎＣ複合体（レーン１及び２）の 複合体形成の結果のポリアクリルアミドゲル電気泳動（10％ＰＡＧＥ，トリス− トリシン緩衝液、ｐＨ8.3）（未変性ゲル）の結果を比較している。 図１３は、ｒ−ＴｎＩ：ＴｎＣ複合体、ＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ型：ＴｎＣ 複合体、及びＴｎＩのｃアイソ型II（「cIsoform II」）：ＴｎＣ複合体の複合 体形成の結果のポリアクリルアミドゲル電気泳動（未変性ゲル）の結果を描いて いる。レーン１はＴｎＣ対照であり、レーン２はモル比１：１におけるｒ−Ｔｎ Ｉ：ＴｎＣであり、レーン３はモル比１：１におけるＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ 型：ＴｎＣであり、レーン４はモル比１：１におけるcIsoform II：ＴｎＣであ り、レーン５はモル比１：２におけるｒ−ＴｎＩ：ＴｎＣであり、レーン６はモ ル比１：２におけるＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ型：ＴｎＣであり、そしてレーン ７はモル比１：２におけるcIsoform II ：ＴｎＣである。サンプルは何れも２ｍ ＭのＣａＣｌ₂を含有しそして室温にて30分間インキュベートされた。 図１４は、牛血清中におけるＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ型：ＴｎＣ複合体の安 定性を示す。ＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ型（１μｇ／ｍＬ）及びＣＮＢｒ−ｃＴ ｎＩアイソ型：ＴｎＣ複合体（１：１）の安定性は、４℃にて３週間にわたって 行った。ＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ型のみの、及び複合体中の最終濃度は0.25μ ｇアイソ型／ｍＬである。３つのロットの牛血清を使用した。Ｈ，Ｑ，Ｓは血清 ロット、Ｈｙｃ 2242、Ｑｕａｄ 9058及びＳｉｇｍａ Ｓ7140をそれぞれ表し ている。ＴｎＩ活性は、Stratus II TnI Immunoassay System を用いて測定した 。 図１５は、牛血清中におけるＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ型及びＣＮＢｒ−ｃＴ ｎＩアイソ型：ＴｎＣ複合体の非特異的結合を描いている。非特異的結合の測定 は、フェリチンタブを用いて、Stratus II TnI Immunoassay System によって行 った。牛血清ロットＨ，Ｑ，Ｓは、それぞれＨｙｃ 2242，Ｑｕａｄ 0958及び Ｓｉｇｍａ Ｓ7140を表す。 図１６は、ヒト血清中におけるＣＮＢｒ−ｃＴｎＣアイソ型及びＣＮＢｒ−ｃ ＴｎＣアイソ型：ＴｎＣ複合体の安定性を明らかにしている。ＣＮＢｒ−ｃＴｎ Ｉアイソ型のみの及び複合体（１：１）中における最終濃度は、0.25μｇ／ｍＬ である。ＴｎＩ活性は、St ratus II TnI Immunoassay System によって行った。 図１７は、ヒト血清中におけるＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ型及びＣＮＢｒ−ｃ ＴｎＩアイソ型：ＴｎＣ複合体の非特異的結合を示している。非特異的結合の測 定は、フェリチンタブ及びブランクタブを用いて、Stratus II TnI Immunoassay System によって行った。 図１８は、牛血清中における復元したＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ型：ＴｎＣ複 合体（１：１）の安定性を描いている。牛血清の２つのロット、ＢＴＩ及びＱｕ ａｄが、３通りのレベルで使用された。測定はStratus II TnI Immunoassay Sys tem を用いて行った。 図１９は、発現ベクターpTac/Gene 10/Troponin I/6x Hisのマップを描いてい る。 発明の詳細な記述 組換えヒトｃＴｎＩが、Dade Biology Skills CenterによってE.coli 中で発 現された（そして我々は、その提供に対しDade Biology Skills Centerに感謝す る）。ＴｎＩは、ヒト心臓ｃＤＮＡ（これは、Strategene等のような会社を通じ 商業的に入手可能である）より、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってクロ ーンされ、そして、図１９に示されているように、デイドが構成したベクターpT ac 102-2中のNcoI制限部位内へサブクローンされた。（ウシ又はヒトの心臓から の精製ＴｎＩもまた商業的に入手可能である。）ベクターpTac 102-2は、遺伝子 の転写を駆動する強力なハイブリッドプロモーターであるHindII-Bam Hi フラグ メント含有 p^tacを含むよう、慣用の手段により構成された（Vallins et al.，M olecular cloning of human cardiac troponin I using PCR，FEBS Lett．270， 57-61（1990）を参照）。このプロモーターは、当業者に周知の方法及び技術で あるIPTGによって、E．coli中に誘導された。次の下流ＤＮＡ配列は、効率的な リボソーム結合部位（ＲＢＳ）でありそして、翻訳開始のための遺伝子10のＮ末 端の５個のアミノ酸であり、クローニング部位NcoIがこれに続いている。デイド が設計したＴｎＩ（開始メチオニンを含むアミノ酸１〜210 （配列番号４））は 、Ｎ末端と及びＣ末端の６個のヒスチジンコドン（HIS6）とフレームを合わせて NcoI中に挿入された。発現されたタンパク質は226 個のアミノ酸を含んでいた。 HIS6 Ｃ末端は、単一ステップの精製を容易にした。位置−４，０，153 ，154 ，200 及び211 にあるメチオニン残基におけるＣＮＢｒによるｒ−ＴｎＩ分子の 切断は、153 個のアミノ酸よりなる主ペプチドを与えた。（配列番号３） 得ら れたポリペプチドは、ヒトｃＴｎＩ一次構造（209アミノ酸）の73 おいて使用される抗体に対するエピトープを保持していた。（Vallins et al.， 1990 FEBS Lett．270，57-61を参照。） 臭化シアンは、酸性の条件下において高い特異性をもってメチオニン残基部位 で切断を行う。全てのメチオニン部位におけるＣＮＢｒによるｒ−ＴｎＩの切断 は、６個の種々のサイズのペプチドを与える筈である。 （配列番号５） （配列番号３） （配列番号８） （配列番号６） （配列番号７） （配列番号９） （図２を参照のこと。） 一般的に記述すると、第１のステップは、分子間又は 分子内のジスルフィド架橋によって２量体となるのを防止するために、位置79及 び96にあるシステイン残基をカルボキシ ル化することである（ＴｎＩ配列中には２つある）（配列番号１）。ＣＮＢｒ処 理は、カルボキシメチル化されたｒ−ＴｎＩに対して行われる。他の可能な切断 反応（例えば酵素的な）とは異なり、ＣＮＢｒ処理は、尾部配列、リーディング 配列及びＴｎＩのＣ末端領域の一部を、免疫原性部位の一次配列に影響を及ぼす ことなしに、除去する。 実施例Ｉ（ＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ型の調製） ＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ型の３つの試験調製を行った。100 ｍＭのリン酸ナ トリウム、10ｍＭのトリス、８Ｍの尿素、ｐＨ８（「ＰＴＵ緩衝液」）中の組換 えＴｎＩ（10〜20ｍｇ，0.25〜0.3 ｍＭ）を、同緩衝液（200 ｍＭ原液）中に新 たに調製した、ＤＴＴの最終濃度2.5 ｍＭを与えるに十分な量のジチオスレイト ール（ＤＴＴ）を加えることによって還元した。 混合物を室温にて（約23〜25℃）、ｒＴｎＩを還元するに十分な時間（約１時 間）インキュベートした。還元されたｒＴｎＩを、ヨードアセタミド（ＰＴＵ緩 衝液400 ｍＭの原液中に調製した）で、反応混合物中のヨードアセタミドの最終 濃度15ｍＭを与えるように処理した。混合物を次いで、カルボキシメチル化反応 を完了するに十分な時間及び条件にて、暗所において37℃で（約１時間）インキ ュベートした。 混合物を10×25ｍｍの広スペクトル／ｐｏｒ（12〜14ｋｄ ＭＷＣＯ）透析チ ューブに移し、２×１Ｌの25％酢酸に対して24時間室温にて攪拌しながら透析し た。 透析済みのｃＴｎＩを、室温乃至45℃にて真空下（＜１ｍｍＨｇ）に凍結乾燥 した。凍結乾燥したｒＴｎＩを、約1.4ｍＬの70％蟻 酸に溶解させ、次いでこのｒＴｎ１溶液にＣＮＢｒ（70％蟻酸中１μｇ／μＬ） を加えてＣＮＢｒの最終濃度を480ｍＭとした（約160 モルＣＮＢｒ／モル メ チオニン）。反応混合液を含んだ試験管を窒素でパージし、次いで、震盪しつつ 暗所にて室温で少なくとも16時間インキュベートした。消化物を１：10に希釈す るように蒸留水を加えることによって反応を停止させた。消化物を真空（＜１ｍ ｍＨｇ）下に室温乃至45℃にて凍結乾燥した。凍結乾燥済みの消化物を最小量の 88％蟻酸に溶解させた。この消化物を、25％酢酸で平衡化させたSephadex G-200 カラム（1.6×100 ｃｍ）にかけた。ＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ型を、25％酢酸 で溶出させた。最初の主ピーク（これはＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ型を表した） をプールし、 oassay System によって活性を、試験した。 では、この精製されたＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ型は、ｒ−ＴｎＩよりも３〜４ 倍高い免疫学的活性を有する（図３及び４を参照）。 次のデータは、図３にグラフ化されている。 これらの値は、ｍＶ／分で表されており、それは変化率を測定するために使用 される標準的単位である。ｒ−ＴｎＩ又はＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ型は、Calb ase 中へ総量１ｍＬとなる用スパイクさ れた。ＴｎＩ濃度は0.5 ｍｇ／ｍＬであった。ＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ型の非 特異的結合と特異的結合との間の比率はｒ−ＴｎＩより低かった（図５を参照） 。次のデータは、図５にグラフ化されている。 値は、ｍＶ／分で表されている。ｒ−ＴｎＩ又はＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ型 の部分量が、最終濃度20ｎＭを与えるようにCalbaseにスパイクされた（3.5 μ ＬのＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ型0.1 ｍｇ／ｍＬが996.5 μＬのCalbase 中にス パイクされ、5.2μＬのｒ−ＴｎＩ 0.1ｍｇ／ｍＬが994.8 μＬのCalbase 中に スパイクされる）。 ＴｎＣとの複合体については、次の通りにして反応混合物が調製された。ｒ− ＴｎＩ：ＴｎＣ複合体については、5.2 μＬのｒ−ＴｎＩ（0.1ｍｇ／ｍＬ）＋3 .65μＬのＴｎＣ（0.165 ｍｇ／ｍＬ）＋２μＬのＣａＣｌ₂（25mＭ）＋14.15μ ＬのＰＴＵ緩衝液。全量25μＬであった。反応物を、室温にて約15分間インキュ ベーションし、次いで975 μＬのCalbase 中にスパイクした。ＣＮＢｒ−ｃＴｎ Ｉアイソ型：ＴｎＣ複合体について、3.5 μＬのＴｎＩ（0.1 ｍｇ／ｍＬ）＋3. 65μＬのＴｎＣ（0.165 ｍｇ／ｍＬ）＋２μＬのＣａＣｌ₂（25ｍＭ）＋15.85 μＬのＰＴＵ緩衝液。総量は25μＬ であった。反応物を、室温にて約15分間インキュベートし、次いで975μＬのCal base 中にスパイクした。 精製ＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ型は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動で、単一 バンドとして、見かけの分子量21,000ダルトンをもって移動する。ＣＮＢｒ−ｃ ＴｎＩアイソ型のウェスタンブロット解析は、ＭＩ患者血清中のｃＴｎＩの主分 解フラグメントに近い分子量を有する。（図７を参照）。アイソ型のＮ−末端配 列解析は、Ala-Asp-Gly-Ser-Ser-Asp-Ala-Ala-Ala-Arg-Glu を与え、これは、ヒ トｃＴｎＩ（配列番号２）（図８を参照）のＮ末端配列と同一である。アミノ酸 分析（表１を参照）は、精製ＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ型がｃＴｎＩ分子（配列 番号１を参照）の最初の153 個のアミノ酸に相当することを確認した。家兎の骨 格筋ＴｎＣが、Methods Enzymology 85，241-263においてPotter，J.D．（1982 ）によって記述されたようにして精製された。他の組織源からのＴｎＣも使用す ることができる。ＴｎＴは商業的に入手した。 ＣＮＢｒ処理は特異的であり、副反応や非特異的反応がないことが判明した。 他の化学的及びタンパク分解的手段は、特異性に欠け、また実験条件を管理する ことが困難である。非常に特異的なタン ystem において使用されるものを含む種々のｃＴｎＩ抗体のエピトープに影響す る可能性が非常に高い。別の一手順は、複雑であり且つコスト高であるが、ｃＤ ＮＡ及び、所望によりCys コドンの変更の後、E．coli その他の発現系中での発 現によって、この153 アミノ酸のｃＴｎＩアイソ型（配列番号３）を作ることで あろう。システイン残基のカルボキシメチル化は、153 アミノ酸のアイソ型（配 列番号３）の産生にとって必須ではない。そうではなくて、カルボキシメチル化 は、ＣＮＢｒ消化中又はその後の複雑化を最小にすることによって工程を効率化 するものである。 ＣＮＢｒ切断手順を用いると、ＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ型は、ヒトｃＴｎＩ 又はヒトｒ−ＴｎＩのみからしか得ることができない。他の源（ウシ、家兎等） からのｃＴｎＩのＣＮＢｒ切断は、153アミノ酸のアイソ型を生じない。なぜな らばそのような種においては、非ヒトｃＴｎＩは、アミノ酸配列の位置53にメチ オニン残基を有し、それもまたＣＮＢｒによる切断反応を受けてしまうからであ る。ひとｃＴｎＩ又はｒ−ＴｎＩにおいては、この位置53のメチオニンに、ロイ シンが置き換わっている。 ＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ型のより長い又はより短い型を、ＴｎＩアイソ型配 列のＮ末端、Ｃ末端又は任意の部分に又はそこから２、３個のアミノ酸を付加し 又は削除することによって、製造することができる。ベクター中にクローンした ヒトｃＴｎＩ ｃＤＮＡは、位置特異的突然変異形成（オリゴヌクレオチド）に よって、及び／又はＰＣＲ(Guo et al.，1994，J．Biol．Chemistry 269，15210 -15216，Farah et al.，1994，J．Biol Chem．269，5230-52140，Sheng et al. ，1992，J．Biol．Chem．267，25407-25413)によって修正して、ＣＮＢｒ−ｃＴ ｎＩアイソ型又はその修正型を得ることができる。修正されたｃＤＮＡは、ＣＮ Ｂｒ−ｃＴｎＩアイソ型又はその修正型の発現構造物を産生させるためにベクタ ー中にサブクローンすることができる。タンパク質発現は、E．coli 又は他の発 現系中で行うことができる。ＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ型配列中の幾つかのアミ ノ酸の変更は、特異的アッセイ抗体が結合する部位で あるエピトープにおいて起こったものを除き、その性能には影響を与えないこと もあり得る。 ｒ−ＴｎＩのカルボキシメチル化のために使用する緩衝液は、ｐＨ約８の他の 緩衝液で置き換えることができる。ジチオスレイトールは、他の還元剤、特にｐ Ｈ８の付近において有効且つ最も作用の大きい還元剤、例えばＤＴＥ、アセチル システインで置き換えることができる。システイン残基をブロックするためには 、ヨードアセタミド以外のアルキル化剤を使用することができる（例えば、ヨー ド酢酸、ＮＥＭ等）。ＣＮＢｒによるＴｎＩの切断に必要な時間は、室温暗所に て10〜24時間の間で変動しうる。ＣＮＢｒ切断は、酸性条件下に行われなければ ならない。なぜなら、アミノ酸とＣＮＢｒの反応の選択製はｐＨに依存するから である。蟻酸以外の酸、例えばトリフルオロ酢酸を使用することができる。アイ ソ型の精製の方法は決定的に重要ではない。それは種々のクロマトグラフィー法 によって精製されてよい。サイズ排除カラム、例えばSepghacryl S-200，Sephar ose 12，及びSephadex G 100，150 及び200 は、大きなスケールでは有用である 。アイソ型はまた、ＴｎＣアフィニティーカラム、例えばＴｎＣ−セファロース アフィニティーカラム並びに他のＴｎＣアフィニティーカラムによっても精製す ることができる。 実施例 II（ＴｎＣとＣＮＢｒ−ｃＴｎＩとの結合特性） ＴｎＩは、カルシウムイオンの存在下にＴｎＣと結合する。ＣＮＢｒ−ｃＴｎ Ｉ：ＴｎＣ複合体の完全な形成のためには、ＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ型１モル 当たり少なくとも１モルのＴｎＣが必要である。複合体を形成するために必要な 時間は、変化し得る。ＣＮ Ｂｒ−ｃＴｎＩアイソ型は、様々な種からのＴｎＣと複合体を形成させるために 使用することができる。複合体は、尿素の不存在下又は存在下に、４〜8.5 とい うｐＨ範囲において最もよく形成できる。ＴｃＣとのＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ 型の結合特性は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（未変性ゲル）を用いて研究 された。ＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ型は、モル比１：１、２：１及び３：１で、 ＰＴＵ緩衝液（100 ｍＭのリン酸ナトリウム、８Ｍの尿素を含有する10ｍＭのト リス緩衝液、ｐＨ８）中においてＴｎＣとインキュベートされた。何れのサンプ ルも、最高２ｍＭまでのＣａＣｌ₂の存在下に室温にて30分間インキュベートさ れた。（より短い時間、例えば15分又はおそらくは更に短い時間でも、十分かも しれない）図９のレーン６に描かれているように、１モルのＣＮＢｒ−ｃＴｎＩ アイソ型が、ＴｃＣの１モルと結合するのに必要である。ＣＮＢｒ−ｃＴｎＩア イソ型：ＴｎＣ複合体の形成は、ＴｎＣ（レーン６）の消失を伴う。しかしなが ら、図９に描かれているように、ｒ−ＴｎＩ：ＴｎＣ複合体（レーン４）の形成 のためには、少なくとも２モルのｒ−ＴｎＩがＴｎＣの１モルと結合するのに必 要である。これらの結果は、ＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ型が、ｒ−ＴｎＩよりも 一層効果的にＴｎＣと結合することを示唆している。 実施例 III （ＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ型：ＴｎＣ複合体の免疫学的活性） ＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ型：ＴｎＣ複合体の免疫学的活性は、 −ｃＴｎＩアイソ型を、２ｍＭのＣａＣｌ₂の存在下にモル比（１：１）でＴｎ Ｃと共にＴＰＵ緩衝液中において30分間室温にてイン キュベートした。複合体を次いで較正標準基剤に加えて最終ＴｎＩ濃度20mＭと した。（複合体を測定するために使用したこの較正標準基剤は、ＥＤＴＡを含ま ず、２ｍＭのＣａＣｌ₂を有している。） ＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ型のみを 、較正標準基剤に加え、ＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ型の最終濃度を20ｍＭとし、 別にインキュベートした。同様に、ｒ−ＴｎＩを、２ｍＭのＣａＣｌ₂の存在下 にモル比（１：１）でＴｎＣと共に30分間室温にてインキュベートした。次いで 複合体を較正標準基剤に加えて最終ＴｎＩ濃度を20ｍＭとした。組換えＴｎＩの みを、較正標準基剤に加えて最終ＴｎＩ濃度を20ｍＭとし、別にインキュベート した。図１０に示されているように、カルシウムイオンの存在下におけるＴｎＣ へのＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ型の結合は、ＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ型の活性 を、ＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ型のみのときより数倍に高める。ＣＮＢｒ−ｃＴ ｎＩアイソ型：ＴｎＣ複合体の非特異的結合は小さく、全活性の５％未満である 。これに比して、ｒ−ＴｎＩのＴｎＣへの結合は、その活性を高めるものの、Ｃ ＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ型：ＴｎＣ複合体について観察された程ではない。 ＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ型の活性に対するＴｎＣの効果を、St −ｃＴｎＩアイソ型を、２ｍＭのＣａＣｌ₂を含有するＰＴＵ緩衝液中において ＴｎＣと共に室温にて30分間インキュベートした。ＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ型 ：ＴｎＣ複合体を、１：４，１：２，１：１，１：0.5 ，１：0.25，及び１：0. 00（モル／モル）の比率で調製した。各反応混合物の部分量を、較正標準基剤（ ＥＤＴＡを含まず、２ｍＭのＣａＣｌ₂を含む）にスパイクして、ＣＮＢｒ−ｃ I Immunoassay Systemによって行った。図11に示されているように、ＣＮＢｒ− ｃＴｎＩアイソ型：ＴｎＣ複合体の１：１の比率が、最大の活性を与える。より 多くのＴｎＣの添加は、ＴｎＩ活性を僅かに増大させるが、しかし複合体の非特 異的結合には影響を与えない。図９は、比１：１において、ＣＮＢｒ−ｃＴｎＩ アイソ型がＴｎＣと完全に複合体形成されることを示している。 実施例 IV （ＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ型を用いたトロポニン複合体の復元） ＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ型、ＴｎＣ及びＴｎＴの間の複合体は、各サブユニ ットの化学量論的量を、10ｍＭのトリス、１ｍＭのＣａＣｌ₂、７ｍＭのメルカ プトエタノール及び４Ｍの尿素を含有する100 ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液ｐ Ｈ7.5 中において混合することによって形成された。混合物を室温にて３時間イ ンキュベートし、次いで分析に用いるか又は貯蔵用の緩衝液へと透析した。ＣＮ Ｂｒ−ｃＴｎＩアイソ型：ＴｎＣ：ＴｎＴ複合体の形成を、ポリアクリルアミド ゲル電気泳動（未変性ゲル）を用いることによって調べた。図１２は、レーン３ 及び４のＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ型：ＴｎＣ：ＴｎＴ複合体が、レーン１及び ２のＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ型：ＴｎＣ複合体とは異なった移動性を有するこ とを示している。ＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ型：ＴｎＣ：ＴｎＴ複合体は、Stra ｃＴｎＩアイソ型：ＴｎＣ：ＴｎＴ複合体の活性は、ＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ 型の活性より数倍高く、そして、ＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ型：ＴｎＣ複合体の 活性と同等であった。これらの結果は、 ＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ型はＴｎＣ及びＴｎＴの双方と３成分複合体を形成す ることができるということを示唆している。更に、これらの結果は、ＣＮＢｒ− ｃＴｎＩアイソ型：ＴｎＣ複合体へのＴｎＴの添加は、Stratus II TnI Immunoa ssay System におけるＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ型活性を妨害しないということ を示唆している。これらの結果はまた、ＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ型：ＴｎＣ： ＴｎＴ複合体の高いＴｎＩ活性は、ＴｎＣの結合によるものであるということを も示唆している。 実施例 Ｖ （ＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ型：ＴｎＣ複合体の安定性） 血清中のＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ型の安定性に対するＴｎＣの存在の効果を 試験した。ＴｎＣの存在は、ＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ型の安定性を高めること が見出された。ＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ型及びＴｎＣを、２ｍＭのＣａＣｌ₂ を含有するＰＴＵ緩衝液中において１：１の比で30分間インキュベートした。安 定性は、３つの異なった供給業者から得た３つのロットの牛血清ロット(Hyc 224 2，Quad 9058 及びSigma S7140)、ヒト血清プール（図15）中において調べ、そ して３週間の期間にわたって追跡した。一旦血清に加えた後は、温度を４℃に維 持した。血清中におけるＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ型及びＣＮＢｒ−ｃＴｎＩア イソ型：ＴｎＣ複合体の最終濃度は、１μｇ／ｍＬであり、そしてそれぞれ0.25 ：0.25μｇ／ｍＬであった。 図１６は、３つの別々のレベル（製造範囲）で血清中にスパイクされ小型のバ イアル（３ｍＬ）中で凍結乾燥されそして４℃にて使用時まで貯蔵されたＣＮＢ ｒ−ｃＴｎＩアイソ型：ＴｎＣ複合体（ １：１）の安定性を示している。凍結乾燥されたＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ型： ＴｎＣ複合体調製物を復元し、そして図１６に示した時間間隔でアッセイした。 実施例 ＶＩ （ＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ型：ＴｎＣ複合体の非特異的結合） 血清中におけるＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ型の非特異的結合に対するＴｎＣの 存在の影響を調べた。図５は、ＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ型がｒ−ＴｎＩに比し て非特異的結合が少ないことを示している。図１７に示されているように、ＣＮ Ｂｒ−ｃＴｎＩアイソ型：ＴｎＣ複合体の牛血清中における非特異的結合は、Ｃ ＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ型のそれよりも低い。ヒト血清中においても同様な結果 が得られた（図１８）。 実施例 ＶII （ＴｎＩ88アミノ酸の調製及び性質−−ｃアイソ型II） ｃアイソ型IIを、エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ（「EndoAsp」）を用いて ｒ−ＴｎＩ（図１を参照）から産生させた（図１を参照）。メタロプロテアーゼ （metalloprotease ）であるEndoAsp は、アスパラギン酸よりなるＮ末端におい て切断を行う。組換えＴｎＩを、１Ｍの尿素を含有する50ｍＭのリン酸ナトリウ ム、ｐＨ８中において100：１の比（ｒ−ＴｎＩ：EndoAsp， w/w）でEndoAspと 共に37℃にて20時間インキュベートした。主切断産物は、位置６（アスパラギン 酸、Ｄ）に始まりそして位置95（グルタミン、Ｑ）に終わる88アミノ酸よりなる ものであった（図１）（配列番号１０）。一旦精製し、このｃアイソ型IIを、Ｓ ＤＳ−ポリアクリルアミド 純度及び活性につきそれぞれ試験した。図１０に示されているように、ｃアイソ 型IIは、ＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ型に比して高い活性（２倍）及び高い非特異 的結合（２倍）を有している。しかしながら、２ｍＭのＣａＣｌ₂の存在下にＴ ｎＣとインキュベートしたとき、ｃアイソ型IIのＴｎＩ活性には殆ど増大が見ら れなかった。 ｃアイソ型IIの、ＴｎＣとの複合体形成能力を調べた。図１３は、ｃアイソ型 IIとＴｎＣとの間の結合は、ＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ型とＴｎＣとの間のそれ に比して弱いことを示している。ｃアイソ型II：ＴｎＣ複合体に相当する微かな バンドがレーン４に見られる。過剰のＴｎＣの添加は、ｃアイソ型II：ＴｎＣ複 合体の形成を高めない。この結果は、ｃアイソ型IIの活性に対するＴｎＣの効果 が最小であるのは、ｃアイソ型IIがＴｎＣと安定な複合体を形成する能力がない ことによるものである、ということを示唆している。図１３レーン３は、ｒ−Ｔ ｎＩ及びｃアイソ型IIに比して、よりよい効率でＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ型が ＴｎＣと効果的に結合するということを示している。 実施例 ＶIII （較正標準及び対照としてのＣＮＢ「−ｃＴｎＩアイソ型） 対照の調製： ポリプロピレン試験管を用いて、10ｍＭのトリス及び８Ｍの尿 素を含有する100 ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ８中に、ＣＮＢｒ−ｃＴｎ Ｉアイソ型の原液（１ｍｇ／ｍＬ）を調製する。プラスチック製の実験器具を用 いて、希釈した血清又は基剤中に、ＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ型を含有する３つ のレベルのアッセイ対照液を調製する。対照のレベルは次の通りである： ＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ型範囲 製造範囲 （ｎｇ／ｍＬ） レベル１ ３−６ レベル２ 17−22 レベル３ 35−44 これら示されたレベルで、ＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ型を、血清、希釈血清、 血漿、希釈血漿又は基剤にスパイクした。混合物を濾 System によって試験した。各レベルの調製物を、プラスチックのバイアル中に 入れ（各３ｍＬ）、４℃にて貯蔵するか又は凍結乾燥した。凍結乾燥した材料は 、使用に際して３ｍＬの水を用いて復元した。 較正標準の調製： 較正標準は、ＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ型原液の十分量を 血清、血漿又は基剤に加えて最終濃度範囲２乃至50ｎｇ／ｍＬとすることによっ て作ることができる。ＣＮＢｒ−ｃＴｎＩアイソ型較正標準の濃度は、０ｎｇ／ ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬ、８ｎｇ／ｍＬ、15ｎｇ／ｍＬ、25ｎｇ／ｍＬ及び50ｎｇ／ ｍＬである。各レベルの較正標準を濾過し、ＴｎＩイムノアッセイを用いてStra て一致させる。次いで較正標準をそれぞれ指定されたバイアルに濾過して入れ、 そして凍結乾燥するか又は４℃にて貯蔵する。凍結乾燥した較正標準は、水を用 いて凍結乾燥前液量へと復元される。 ここに提示した実施例は、説明のためのものに過ぎず、本発明の範囲の限定を 意図したものではない。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 実質的に次の配列の約153 個のアミノ酸を有する、ヒトの天然の心臓トロ ポニンＩ又はヒト組換え心臓トロポニンＩの、ヒト心臓トロポニンＩフラグメン ト： ２． 実質的に次の配列の約153 個のアミノ酸を有する、ヒトの天然の心臓トロ ポニンＩ又はヒト組換え心臓トロポニンＩの、ヒト心臓トロポニンＩフラグメン トを製造するための方法であって、 ａ） ヒト天然心臓トロポニンＩ及びヒト組換え心臓トロポニンＩよりなる 郡より選ばれたヒト心臓トロポニンＩを還元し、 ｂ） ステップａ）の該ヒト心臓トロポニンをＣＮＢｒによっ て切断し、そして ｃ） 得られたヒト心臓トロポニンＩフラグメントを回収することを含む方 法。 ３． ＴｎＩイムノアッセイのための較正標準であって、 ａ） 実質的に次の配列の約153 個のアミノ酸を有するヒトの天然の心臓ト ロポニンＩ又はヒト組換え心臓トロポニンＩの、ヒト心臓トロポニンＩフラグメ ントの既知量と、 ｂ） 血清又は較正標準基剤と を含む較正標準。 ４． 既知量のトロポニンＣを更に含む、請求項３の較正標準。 ５． ＴｎＩイムノアッセイのための対照であって、 ａ） 実質的に次の配列の約153 個のアミノ酸を有するヒトの天然の心臓ト ロポニンＩ又はヒト組換え心臓トロポニンＩの、ヒト心臓トロポニンＩフラグメ ントの既知量と、 ｂ） 血清又は較正標準基剤と を含む対照。 ６． 既知量のトロポニンＣを更に含む、請求項５の対照。 ７． ＴｎＩに対する抗体に対して免疫学的活性を有する天然又は組換えのヒト 心臓ＴｎＩより誘導されるペプチドであって、 ａ） ヒト心臓トロポニンＩを還元し、 ｂ） ステップｂ）のヒト心臓トロポニンＩをＣＮＢｒで切断し、そして ｃ） 得られたヒト心臓トロポニンＩペプチドを回収する ことを含む方法によって作られるペプチド。 ８． ＴｎＩイムノアッセイのための較正標準であって、請求項７の方法によっ て作られるペプチド及び血清又は較正標準基剤を含む較正標準。 ９． 既知量のトロポニンＣを更に含む、請求項８の較正標準。 １０． 請求項７の方法によって作られるペプチド及び血清又は較正標準基剤を 含む、Ｔｎｉイムノアッセイのための対照。 １１． 既知量のＴｎＣを更に含む、請求項１０の対照。