JP2008505852A - プロキネチシン(prokineticin)2βペプチドおよびその使用 - Google Patents
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Abstract
プロキネチシン(prokineticin)受容体のアゴニストとして、PKR1活性によって媒介される肺および胃腸の疾病または障害のために有用であるPK2βペプチドが記述される。
Description
関連出願との関係
本出願は、2004年3月29日提出の米国暫定特許出願第60/557,733号に対する優先権を利益を請求する。
本出願は、2004年3月29日提出の米国暫定特許出願第60/557,733号に対する優先権を利益を請求する。
本発明はPK2βと命名されるペプチドに関し、これはPK2βプロペプチドからプロセスされた生産物である。PK2β、PKR1に対する選択的リガンドは、胃腸障害(例えば、便秘)、肺障害(例えば、肺および気道における不十分な繊毛運動)、およびPKR1が発現されるある種のがん(例えば、卵巣がんおよび睾丸がん)の処置において有用である。
2種のシステインに富むペプチド、プロキネチシン(prokineticin)1(PK1)およびプロキネチシン2(PK2)が同定されている。プロキネチシン(PK)は多機能性ペプチドであり、これは胃腸(GI)の平滑筋収縮を刺激することが分かっている(非特許文献1)。PK1は、また内分泌腺血管内皮成長因子(EG−VEGF)としても知られており、内分泌腺由来の細胞の増殖および移動を刺激し、そしてマウス卵巣において血管形成を促進する(非特許文献2)。PK2、もしくは哺乳類Bv8は、視交叉上核(SCN)における行動サーカディアンリズムに影響を与え、そして睾丸における血管形成を促進すると信じられている(非特許文献3;非特許文献4)。
PK1およびPK2は密接に関連していて、そしてマンバ(mamba)の腸のタンパク質(MIT)(非特許文献5;非特許文献6)およびカエル皮膚の分泌タンパク質、Bv8に対して有意な配列相同性を共有する。Bv8はGI平滑筋の収縮の強力なスチミュレーターであり(非特許文献7)、そして末梢侵害受容器の感作を刺激する(非特許文献8)。
PKは2種の密接に関連するGタンパク質共役受容体(GPCR)、プロキネチシン受容体1(PKR1)および2(PKR2)に結合し、そして活性化するが、これらは配列では87%同一である(Lin et al.,2002,後出;非特許文献9;非特許文献10)。PKは、PK受容体(PKR)を発現している細胞において、多分、受容体Gqタンパク質相互作用を介して、Ca2+可動化(mobilization)を刺激する(非特許文献11)。百日咳毒素(PTX)は、PK1誘導の分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ(MAPK)シグナル伝達を阻害する(非特許文献12)が、このことはPKRがまたGiタンパク質に共役できることを示唆している。
配列の整列は、PKが際立ったN−およびC末端ドメインを有することを示唆した(非特許文献13)。N末端ドメインは、哺乳類および非哺乳類種からのPK中に保存された6個のアミノ酸(AVITGA)を含有する(同上)。C末端領域は5対のジスルフィド架橋を形成する10個の保存されたシステインを含有する(同上)。エクソン2および3の間に挿入された21個の余分なアミノ酸を含有するPK2スプライス変異体の薬理学的活性もまた研究された(同上)。
Li et al.,"Identification of two prokineticin cDNAs:Recombinant proteins potently contract gastrointestinal smooth muscles,"Mol Pharmacol 59:692−698(2001). LeCoulter et al.,"Identification of an angiogenic mitogen selective for endocrine gland endothelium,"Nature 412:877−884(2001). Cheng et al.,"Prokineticin2 transmits the behavioural circadian rhythm of the suprachiasmatic nucleus,"Nature 417:405−410(2001). Lecroulter et al.,"The endocrine−gland−derived VEGF homologue Bv8 promotes angiogenesis in the testis:Localization of Bv8 receptors to endothelial cells,"Proc Natl Acad Sci USA 100:2685−2690(2003). Schweitz et al.,"Purification and pharmacological characterization of peptide toxin from the black mamba(Dendroaspis polylepis)venom,"Toxicon 28:847−856(1990). Schweitz et al.,"MIT(1),a black mamba toxin with a new and highly potent activity on intestinal contraction,"FEBS Lett 461:183−188(1999). Mollay et al.,"Bv8、a small Protein from frog skin and its homologue from snake venom induce hyperalgesia in rats,"Eur J Pharmacol 374:189−196(1999). Negn et al.,"Nociceptive sensitization by the secretory protein Bv8,"Br J Pharmacol 137:1147−1154(2002). Masuda et al.,"Isolation and identification of EG−VEGF/prokineticins as cognate ligands for two orphan G−protein−coupled receptors,"Biochem Biophys Res Commun 293:396−402(2002). Soga et al.,"Molecular cloning and characterization of prokineticin receptors,"Biochem.Biophys.Acta 1579:173−179(2002). Lin et al.,"Identification and molecular characterization of two closely related G protein−coupled receptors activated by prokineticin/endocrine gland vascular endotherial growth factor,"J Biol Chem 277:19276−19280(2002a). Lin et al.,"Characterization of endocrine gland−derived vascular endotherial growth factor signaling in adrenal cortex capillary endotherial cells,"J Biol Chem 277:8724−8729(2002b). Bullock et al.,"Structural determinants required for the bioactivities of prokineticins and identification of prokineticin receptor antagonists,"Mol.Pharmacology 65:582−588(2004).
Li et al.,"Identification of two prokineticin cDNAs:Recombinant proteins potently contract gastrointestinal smooth muscles,"Mol Pharmacol 59:692−698(2001). LeCoulter et al.,"Identification of an angiogenic mitogen selective for endocrine gland endothelium,"Nature 412:877−884(2001). Cheng et al.,"Prokineticin2 transmits the behavioural circadian rhythm of the suprachiasmatic nucleus,"Nature 417:405−410(2001). Lecroulter et al.,"The endocrine−gland−derived VEGF homologue Bv8 promotes angiogenesis in the testis:Localization of Bv8 receptors to endothelial cells,"Proc Natl Acad Sci USA 100:2685−2690(2003). Schweitz et al.,"Purification and pharmacological characterization of peptide toxin from the black mamba(Dendroaspis polylepis)venom,"Toxicon 28:847−856(1990). Schweitz et al.,"MIT(1),a black mamba toxin with a new and highly potent activity on intestinal contraction,"FEBS Lett 461:183−188(1999). Mollay et al.,"Bv8、a small Protein from frog skin and its homologue from snake venom induce hyperalgesia in rats,"Eur J Pharmacol 374:189−196(1999). Negn et al.,"Nociceptive sensitization by the secretory protein Bv8,"Br J Pharmacol 137:1147−1154(2002). Masuda et al.,"Isolation and identification of EG−VEGF/prokineticins as cognate ligands for two orphan G−protein−coupled receptors,"Biochem Biophys Res Commun 293:396−402(2002). Soga et al.,"Molecular cloning and characterization of prokineticin receptors,"Biochem.Biophys.Acta 1579:173−179(2002). Lin et al.,"Identification and molecular characterization of two closely related G protein−coupled receptors activated by prokineticin/endocrine gland vascular endotherial growth factor,"J Biol Chem 277:19276−19280(2002a). Lin et al.,"Characterization of endocrine gland−derived vascular endotherial growth factor signaling in adrenal cortex capillary endotherial cells,"J Biol Chem 277:8724−8729(2002b). Bullock et al.,"Structural determinants required for the bioactivities of prokineticins and identification of prokineticin receptor antagonists,"Mol.Pharmacology 65:582−588(2004).
1つの態様では、本発明は、AVITGACDKDSQCGGGMCCAVSIWVKSIRICTPMGKLGDSCHPLTRKNNFGNGRQE(配列番号:1)およびAVITGACDKDSQCGGGMCCAVSIWVKSIRICTPMGQVGDSCHPLTRKSHVANGRQE(配列番号:2)から選ばれるアミノ酸配列から本質的になるペプチドに対向される。1つの好適な態様では、本発明は、配列番号:1に対応するアミノ酸配列を有するヒトPK2βペプチドに対向される。その他の好適な態様では、本発明は、配列番号:2に対応するアミノ酸配列を有するマウスまたはラットPK2βペプチドに対向される。
その他の態様では、本発明は、また、実質的に純粋な形態におけるPK2βペプチドの製薬学的に活性な量を投与することを含んでなる、PK1活性によって媒介される疾病または障害をもつと診断された患者を処置する方法に対向される。1つの好適な態様では、疾病または障害は、消化管/腸の疾病または胃腸障害である。その他の好適な態様では、疾病または障害は肺の疾病または障害である。
本発明の種々の他の態様、特徴および利益は、詳細な記述および添付される図を参照することによってより完全に理解できる。
PK2Lとして本明細書で命名される、択一的にスプライスされたPK2 mRNAのためのcDNAは、PK2と比較して21個の余分のアミノ酸をコードしている。PK2Lの発現が、PK2βとして本明細書で命名される短い形態のペプチドの生産をもたらすことが、ここに発見された。
PK1およびPK2と比較してPK2βの機能的特徴は、PK2βが、PKR2に対するよりもPKR1への強い受容体選択性を現すことを示す。さらに、シグナル伝達の研究は、PKがPKR発現細胞においてアデニルシクラーゼを刺激することを現し、このことはPKRがまたGsタンパク質に共役されることを示している。
下記の実施例において記述されるように、PK2Lは、哺乳類細胞において組換え技術により発現され、そしてPK1およびPK2と比較して薬理学的に特徴決定された。生物化学的特徴は、分泌されたPK2Lタンパク質が、さらにタンパク質分解的切断、多分2つの推定フリン(furin)切断部位における切断によって、PK2βと呼ばれる、より小さいペプチドにプロセスされることを示している。PK2Lとともにフリンの同時発現は、PK2βプロセッシング効率を有意に増大した。機能的研究は、PK1、PK2およびPK2βペプチドが、類似の効力によりPKR1発現細胞において細胞内Ca2+応答を刺激することを示した。しかしながら、PKR2発現細胞におけるCa2+応答のPK2β刺激は、PK1およびPK2よりも約50倍低い効力である。PK2およびPK2Lの異なる発現パターンと合わせて、PKR1およびPKR2を発現する細胞におけるPK2に較べられるPK2βによるCa2+応答の相違する刺激は、これらのペプチドがイン・ビボでは異なる機能をもつであろうことを示している。以下に議論される結果は、PKが、PKR発現細胞においてCa2+可動化を刺激するのみならず、またcAMP蓄積も誘導することを示している。PK2βの機能的発現および精製は、イン・ビボでのPKR1の選択的活性化のために有用な作用物を提供する、かくして、PK2βは、PKR1
を選択的活性化するための治療剤として有用であるに違いない。また、PK2βによるPKR1の選択的活性化は、PK2βに結合するか、またはその活性を調節するか、あるいはPK2β結合のコンペティターであって、そのためにPKR1活性を上方調節または下方調節する化合物の同定およびスクリーニングを容易にし、これらの化合物はPKR1活性によって媒介される疾病または障害の処置において(例えば、PK2β活性のインヒビター、アゴニストまたはアンタゴニストとして)使用できるであろう。
を選択的活性化するための治療剤として有用であるに違いない。また、PK2βによるPKR1の選択的活性化は、PK2βに結合するか、またはその活性を調節するか、あるいはPK2β結合のコンペティターであって、そのためにPKR1活性を上方調節または下方調節する化合物の同定およびスクリーニングを容易にし、これらの化合物はPKR1活性によって媒介される疾病または障害の処置において(例えば、PK2β活性のインヒビター、アゴニストまたはアンタゴニストとして)使用できるであろう。
本発明のペプチドまたはその活性を調節する化合物により処置されてもよい代表的な医学的症状、疾病または他の適応症は、限定されるものではないが、胃腸(GI)の機能および運動、肺性および肺機能、免疫機能、胎盤機能、血管機能、出生前および出生後の栄養、サーカディアンリズム、および乳産生を含む。代表的な肺疾患は、喘息、類肉腫症、間質性肺疾患、間質性肺炎、シェーグレン(Sjogren)症候群、閉塞性細気管支炎症候群(BOS)、線維症性肺疾患、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、および急性呼吸困難症候群(ARDS)を含む(参照、例えば、Efthimiou et al.,2005,South Med.J.,98(2):192−204;Hachem et al.,2004,Semin.Thorac.Cardiovasc.Surg.,16(4):350−355;およびMedford et al.,2005,Thorax.,60(3):244−248)。代表的なGI疾患は、感応性腸症候群、糖尿病性軽症胃アトニー、手術後腸閉塞症、慢性便秘、胃食道逆流疾患、慢性消化不良、および軽症胃アトニーを含む(参照、例えば、Samsom et al.,1997,Dig.Dis.1997,15(4−5):263−274;Tonini et al.,1996,Pharmacol.Res.,33(4−5):217−226;Achem et al.,1998,Dig.Dis.16(1):38−46;およびBriejer et al.,1999,Trends Pharmacol.Sci.20(1):1−3)。代表的な妊娠および胎盤機能に関連する障害は、胎盤機能不全、子癇前症、胎児炎症性応答症候群、および抗リン脂質症候群(LPS)を含む(参照、例えば、Weissgerber et al.,2004,Med.Sci.Sport.s Exerc.,36(12):2024−2031;Arad et al.,2004,Isr.Med.Asoc.J.,6(12):766−769;およびHickey et al.,2000,Baillieres Best Pract.Res.Clin.Obstet.Gynaecol.,14(6):937−51)。血管形成の異常調節に関連する代表的な疾患は、ある種のがん、例えば、卵巣がん、頸部がん、睾丸がん、および副腎がんを含む(参照、例えば、LeCouter et al.,2002,Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol,67:217−221;Kisliouk et al.,2003,J,Clin.Endocrinol.Metab.88(8):3700−3707;LeCouter et al.,2003,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,100(5):2685−2690;Zhang et al.,2003,Clin.Cancer Res.,9(1):264−272;LeCouter et al.,2002,Nat.Med.,8(9):913−917;Ferrara et al.,2003,Am.J.Pathol.,162(6):1881−1893;およびLeCouter et al.,2003,Endocrinology,144(6):2606−2616)。そのような疾病、医学的症状または他の適応症を処置するために適当な用量または有効量は、適当な用量を決定するための既知の技術を用いて日常的に決定することができる。
治療剤として、または治療化合物を同定するために使用されてもよいPK2β材料の調製が以下に具体的に説明される。
材料および方法
PKR1およびPKR2のcDNAクローニング 両PKR1およびPKR2のための全長cDNAコーディング領域が、ヒト胎児脳cDNA(Clontech,Palo
Alto,CA)からPCR−増幅された。PKR1のために使用されたプライマーは、P1:5’ACG TGA ATT CGC CAC CAT GGA GAC CAC CAT GGG GTT CAT G 3’(配列番号:3)およびP2:5’ACG TAG CGG CCG CTT ATT TTA GTC TGA TGC AGT CCA CCT C 3’(配列番号:4)であった。PKR2のために使用されたプライマーは、P3:5’ACG CGA ATT CGC CAC CAT GGC AGC CCA GAA TGG AAA CAC 3’(配列番号:5)およびP4:5’ACG CAT GCG GCC GCG TCA CTT CAG CCT GAT ACA GTC CAC 3’(配列番号:6)であった。PCR(ポリメラーゼ連鎖反応)条件は、40秒間94℃、40秒間65℃および3分間72℃(40サイクル)であった。PCR生産物はpCIneo(Promega,Madison,WI)ベクター中にクローン化され、そしてインサート領域が自動DNAシーケンサー(ABI,Foster City,CA)を用いて配列決定された。
PKR1およびPKR2のcDNAクローニング 両PKR1およびPKR2のための全長cDNAコーディング領域が、ヒト胎児脳cDNA(Clontech,Palo
Alto,CA)からPCR−増幅された。PKR1のために使用されたプライマーは、P1:5’ACG TGA ATT CGC CAC CAT GGA GAC CAC CAT GGG GTT CAT G 3’(配列番号:3)およびP2:5’ACG TAG CGG CCG CTT ATT TTA GTC TGA TGC AGT CCA CCT C 3’(配列番号:4)であった。PKR2のために使用されたプライマーは、P3:5’ACG CGA ATT CGC CAC CAT GGC AGC CCA GAA TGG AAA CAC 3’(配列番号:5)およびP4:5’ACG CAT GCG GCC GCG TCA CTT CAG CCT GAT ACA GTC CAC 3’(配列番号:6)であった。PCR(ポリメラーゼ連鎖反応)条件は、40秒間94℃、40秒間65℃および3分間72℃(40サイクル)であった。PCR生産物はpCIneo(Promega,Madison,WI)ベクター中にクローン化され、そしてインサート領域が自動DNAシーケンサー(ABI,Foster City,CA)を用いて配列決定された。
プロキネチシンの発現および精製 ヒトPK1成熟ペプチドコーディング領域が、2種のプライマーP5:5’ TCA TCA CGA ATT CGA TGA CGA
CGA TAA GGC TGT GAT CAC AGG GGC CTG TGA
GCG GGA TG 3’(配列番号:7)およびP6:5’ACG ATA GGA TCC CTA AAA ATT GAT GTT CTT CAA GTC CAT G 3’(配列番号:8)を用いてヒト胎児脳cDNA(Clontech)からPCR増幅された。シグナルペプチドコーディング領域を有しないヒトPK2およびPK2LcDNAは、2種のプライマーP7:5’CAT CAC GAA TTC GAT GAC GAC GAT AAG GCC GTG ATC ACC GGG GCT TGT GAC AAG 3’(配列番号:9)およびP8:5’ACG ATA GGA TCC TTA CTT TTG GGC TAA ACA AAT AAA TCG 3’(配列番号:10)を用いてヒト胎児脳cDNA(Clontech)からPCR増幅された。PCR条件は、40秒間94℃、40秒間65℃および1分間72℃(40サイクル)であった。PK1、PK2およびPK2LのためのPCR生産物は、改変pCMV−sport1(Invitrogen)発現ベクター中にクローン化されたが、これはαペプチドシグナル配列とそれに続くFLAGタグをコードしている。PKcDNAは、FLAGコーディング配列の後にイン・フレームにクローン化され、そしてインサート領域が同一性を確認するために配列決定された。得られる発現ベクターは、哺乳類の分泌タンパク質シグナルペプチドと、それに続いてFLAGペプチド、エンテロキナーゼ切断部位、および天然のシグナルペプチド配列を有しないそれぞれPK1、PK2およびPK2Lを含有するキメラペプチドをコードしていた。PK1、PK2およびPK2Lプラスミドは、LipofectAmine(Invitrogen)を用いてCOS−7細胞中にトランスフェクトされた。トランスフェクション3日後に、細胞培養上澄液が回収され、そしてANTI−FLAG M2アガロース(Sigma,St.Louis,MO)アフィニティーカラムを通過させた。カラムはリン酸バッファー生理食塩水(PBS)で洗浄され、そして0.1mMグリシンHCl,pH3.0により溶出された。溶出されたタンパク質画分は、直ちに1MTris−HCl,pH8.0で中和され、そしてエンテロキナーゼ(Novagen,Madison,WI)により切断された。次いで、切断されたタンパク質は、さらに、C4カラム(Vydac,Hispevia,CA)を用いて逆相高速液体クロマトグラフィー(HPLC)によって精製された。
CGA TAA GGC TGT GAT CAC AGG GGC CTG TGA
GCG GGA TG 3’(配列番号:7)およびP6:5’ACG ATA GGA TCC CTA AAA ATT GAT GTT CTT CAA GTC CAT G 3’(配列番号:8)を用いてヒト胎児脳cDNA(Clontech)からPCR増幅された。シグナルペプチドコーディング領域を有しないヒトPK2およびPK2LcDNAは、2種のプライマーP7:5’CAT CAC GAA TTC GAT GAC GAC GAT AAG GCC GTG ATC ACC GGG GCT TGT GAC AAG 3’(配列番号:9)およびP8:5’ACG ATA GGA TCC TTA CTT TTG GGC TAA ACA AAT AAA TCG 3’(配列番号:10)を用いてヒト胎児脳cDNA(Clontech)からPCR増幅された。PCR条件は、40秒間94℃、40秒間65℃および1分間72℃(40サイクル)であった。PK1、PK2およびPK2LのためのPCR生産物は、改変pCMV−sport1(Invitrogen)発現ベクター中にクローン化されたが、これはαペプチドシグナル配列とそれに続くFLAGタグをコードしている。PKcDNAは、FLAGコーディング配列の後にイン・フレームにクローン化され、そしてインサート領域が同一性を確認するために配列決定された。得られる発現ベクターは、哺乳類の分泌タンパク質シグナルペプチドと、それに続いてFLAGペプチド、エンテロキナーゼ切断部位、および天然のシグナルペプチド配列を有しないそれぞれPK1、PK2およびPK2Lを含有するキメラペプチドをコードしていた。PK1、PK2およびPK2Lプラスミドは、LipofectAmine(Invitrogen)を用いてCOS−7細胞中にトランスフェクトされた。トランスフェクション3日後に、細胞培養上澄液が回収され、そしてANTI−FLAG M2アガロース(Sigma,St.Louis,MO)アフィニティーカラムを通過させた。カラムはリン酸バッファー生理食塩水(PBS)で洗浄され、そして0.1mMグリシンHCl,pH3.0により溶出された。溶出されたタンパク質画分は、直ちに1MTris−HCl,pH8.0で中和され、そしてエンテロキナーゼ(Novagen,Madison,WI)により切断された。次いで、切断されたタンパク質は、さらに、C4カラム(Vydac,Hispevia,CA)を用いて逆相高速液体クロマトグラフィー(HPLC)によって精製された。
ウエスタン・ブロット 組換えPKタンパク質の発現は、ウエスタンブロットによって追跡された。1.5mlチューブにおいて、ANTI−FLAG M2アガロースビーズスラリー20μlが、PK1、PK2、PK2Lを発現するか、PK2Lとフリンを同
時発現するCOS−7細胞、または対照のCOS−7細胞からの細胞培養培地1mlに添加された。同時に、対応する細胞サンプルが、溶解バッファー(100mMTris−HCl,pH8.0、150mMNaCl、1%TritonX−100、1%プロテアーゼ阻害剤カクテル,Sigma)を用いて溶解され、そしてANTI−FLAGビーズと混合された。チューブは振動する台の上で一夜4℃でインキュベートされた。ビーズが遠心分離され、そして氷冷TBST(50mMTris−HCl,pH7.5、150mMNaCl、0.05%Tween20)により2回洗浄された。免疫沈降されたタンパク質が、還元条件下で4〜20%SDS−PAGEゲル上に展開され、そしてPVDFメンブラン(Invitrogen)上に転写された。メンブランは最初に、ANTI−FLAG M2抗体(Sigma)により、次いでヤギ−マウスIgG(西洋ワサビペルオキシダーゼ共役、Sigma)によりブロットされた。ウエスタンブロットメンブランは、次いでAmershamECLキットを用いて現像された。
時発現するCOS−7細胞、または対照のCOS−7細胞からの細胞培養培地1mlに添加された。同時に、対応する細胞サンプルが、溶解バッファー(100mMTris−HCl,pH8.0、150mMNaCl、1%TritonX−100、1%プロテアーゼ阻害剤カクテル,Sigma)を用いて溶解され、そしてANTI−FLAGビーズと混合された。チューブは振動する台の上で一夜4℃でインキュベートされた。ビーズが遠心分離され、そして氷冷TBST(50mMTris−HCl,pH7.5、150mMNaCl、0.05%Tween20)により2回洗浄された。免疫沈降されたタンパク質が、還元条件下で4〜20%SDS−PAGEゲル上に展開され、そしてPVDFメンブラン(Invitrogen)上に転写された。メンブランは最初に、ANTI−FLAG M2抗体(Sigma)により、次いでヤギ−マウスIgG(西洋ワサビペルオキシダーゼ共役、Sigma)によりブロットされた。ウエスタンブロットメンブランは、次いでAmershamECLキットを用いて現像された。
C末端にFLAGタグを付されたPK2の発現、精製およびヨウ素化 C末端にFLAGタグを付されたPK2(PK2−f)が記述のように構築された(Soga et al.,2002)。2種のプライマーP9:ATC GAG AAT TCG CCA
CCA TGA GGA GCC TGT GCT GCG CCC(配列番号:11)およびP10:GGA TCC CTA CTT ATC GTC GTC ATC CTT ATA ATC CTT TTG GGC TAA ACA(配列番号:12)が、使用されてヒト全脳cDNA(Clontech)が増幅された。PCR増幅されたPK2−fは、発現ベクターpCMV−sport1(Invitrogen)中にクローン化された。得られるクローンは配列決定されて同一性が確認され、そしてLipofectAmine(Invitrogen)を用いてCOS−7細胞中にトランスフェクトされた。トランスフェクション3日後に、細胞培養上澄液が回収され、そしてANTI−FLAG M2アガロース(Sigma)アフィニティーカラムを通過させた。カラムはPBSで洗浄され、そして0.1mMグリシンHCl,pH3.0により溶出された。溶出されたタンパク質画分は、直ちに1MTris−HCl,pH8.0で中和され、そしてさらに、C4カラム(Vydac)を用いて逆相HPLCによって精製された。精製された組換えPK2−fタンパク質は、Pierceによる記述のようにIodogen試薬(Pierce,Rockford,IL)および125I−NaI(PerkinElmer,Boston,MA)を用いてヨウ素化された。ヨウ素化PK2−fはG−50(Amersham Pharmacia Biotech)ゲル濾過カラムによって精製された。
CCA TGA GGA GCC TGT GCT GCG CCC(配列番号:11)およびP10:GGA TCC CTA CTT ATC GTC GTC ATC CTT ATA ATC CTT TTG GGC TAA ACA(配列番号:12)が、使用されてヒト全脳cDNA(Clontech)が増幅された。PCR増幅されたPK2−fは、発現ベクターpCMV−sport1(Invitrogen)中にクローン化された。得られるクローンは配列決定されて同一性が確認され、そしてLipofectAmine(Invitrogen)を用いてCOS−7細胞中にトランスフェクトされた。トランスフェクション3日後に、細胞培養上澄液が回収され、そしてANTI−FLAG M2アガロース(Sigma)アフィニティーカラムを通過させた。カラムはPBSで洗浄され、そして0.1mMグリシンHCl,pH3.0により溶出された。溶出されたタンパク質画分は、直ちに1MTris−HCl,pH8.0で中和され、そしてさらに、C4カラム(Vydac)を用いて逆相HPLCによって精製された。精製された組換えPK2−fタンパク質は、Pierceによる記述のようにIodogen試薬(Pierce,Rockford,IL)および125I−NaI(PerkinElmer,Boston,MA)を用いてヨウ素化された。ヨウ素化PK2−fはG−50(Amersham Pharmacia Biotech)ゲル濾過カラムによって精製された。
放射標識リガンド結合アッセイ 発現ベクターpCIneo(Promega)におけるPKR1およびPKR2は、LipofectAmine(Invitrogen)を用いてCOS−7細胞中にトランスフェクトされた。トランスフェクション2日後に、細胞が、PBS中10mMEDTAによって培養皿から脱離され、Dulbeccoの改変Eagle培地(DMEM)により洗浄され、そして96穴の不透明なポリリジン被覆プレート(BD Biosciences,San Jose,CA)中に1ウェル当たり50,000細胞の密度で接種された。接種2時間後、競合結合アッセイが、100pM125I標識PK2−fおよびコンペティターとしての種々の濃度の無標識PK1、PK2またはPK2βの存在下で96穴プレートにおいて実施された。結合アッセイは、100μlの最終容量においてDMEM+50mMHEPES,pH7.2および1%ウシ血清アルブミン中で実施された。結合アッセイは室温で1時間実施された。プレートが氷冷PBSで3回洗浄された後、Microscint−40(Packard,Meriden,CT)が添加され、そしてプレートがTopcount(Packard)においてカウントされた。
細胞内Ca 2+ 可動化アッセイ 発現ベクターpCIneo(Promega)にお
けるPKR1およびPKR2は、LipofectAmine(Invitrogen)を用いてHEK293細胞中にトランスフェクトされた。トランスフェクション2日後に、細胞が10mMEDTAを含有するPBSを用いて脱離され、そしてポリ−D−リジン被覆された96穴の黒色の組織培養プレート(BD Biosciencesに接種された。リガンドに刺激されるCa2+の可動化は、既に記述されているようにFLIPR(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)においてFluo−3 Ca2+染料(TEF Labs,Austin,TX)を用いてアッセイされた(Liu.et al.,“Comparison of human,mouse,rat and guinea pig histamine H4 receptors reveals substantial pharmacological species variation,”J Pharmacol Exp Ther 299:121−130(2001a))。
けるPKR1およびPKR2は、LipofectAmine(Invitrogen)を用いてHEK293細胞中にトランスフェクトされた。トランスフェクション2日後に、細胞が10mMEDTAを含有するPBSを用いて脱離され、そしてポリ−D−リジン被覆された96穴の黒色の組織培養プレート(BD Biosciencesに接種された。リガンドに刺激されるCa2+の可動化は、既に記述されているようにFLIPR(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)においてFluo−3 Ca2+染料(TEF Labs,Austin,TX)を用いてアッセイされた(Liu.et al.,“Comparison of human,mouse,rat and guinea pig histamine H4 receptors reveals substantial pharmacological species variation,”J Pharmacol Exp Ther 299:121−130(2001a))。
PKによるPKR発現細胞におけるcAMP蓄積の刺激 PKで刺激されるcAMP蓄積のアッセイが、CREプロモーターの制御下でβ−ガラクトシダーゼ受容体遺伝子を担持する、PKR1およびPKR2を安定して発現するSK−N−MC細胞を用いて実施された。安定な細胞系は、PKR1またはPKR2発現ベクターのトランスフェクションに続いて400mg/L G418(Sigma)の選択下で生成された。細胞内cAMP濃度の増大は、より高いβ−ガラクトシダーゼ発現をもたらし、この活性が基質としてクロロフェノールレッド−β−D−ガラクトピラノシド(CPRG)を用いて測定される。細胞が96穴組織培養プレートに接種され、種々の濃度のPK1、PK2またはPK2βにより刺激された。細胞内cAMP濃度は、記述されたように細胞におけるβ−ガラクトシダーゼ活性をアッセイすることによって直接測定された(Liu et al.,“Cloning and pharmacological characterization of a fourth histamine receptor(H4)expressed in bone marrow,”Mol Pharmacol 59:420−426(2001b))。
異なる実験では、発現ベクターpCIneo(Promega)におけるPKR1およびPKR2が、LipofectAmine(Invitrogen)を用いてHEK293細胞中にGs発現プラスミドとともにコ・トランスフェクトされた。トランスフェクション2日後に、細胞が、PBS中10mMEDTAによって脱離され、Dulbeccoの改変Eagle培地/F12(DMEM/F12)培養中に再懸濁され、次いで、96穴プレート上に1ウェル当たり50,000細胞の密度で塗布された。接種2時間後、細胞培養培地が2mMイソブチルメチルキサンチン(Sigma)を含有するDMEM/F12により置換され、そして30分間インキュベートされた。種々の濃度のPK1、PK2またはPK2βが細胞に添加され、200μl/ウェルの最終容量において、さらに30分間インキュベートされた。各ウェルに0.5NHCl 20μlを添加することによって反応が停止され、cAMPが抽出された。細胞培養培地は、製造者による記述のようにcAMP[125I]FlashPlate Assayキット(PerkinElmer)によってcAMP濃度について試験された。
種々のヒト組織におけるPK2L mRNA発現のRT−PCR検出 ヒト組織からの11種のヒトcDNAプール(Clontech)が、PCR増幅法を用いてPK1、PK2、PK2β、PKR1およびPKR2のmRNA発現について解析された。反応において使用されるプライマーは、PK2およびPK2βについては前述されたP7およびP8;PK1についてはP11:5’ACG TAA GAA TTC GCC ACC
ATG AGA GGT GCC ACG CGA GTC TCA3’(配列番号:13)およびp12:5’ACG TAA GAA TTC CTA AAA ATT GAT GTT CTT CAA GTC CAT GGA3’(配列番号:14);P
KR1についてはP13:5’CAA CTT CAG CTA CAG CGA CTA TGA TAT GCC TTT GG3’(配列番号:15)およびP14:5GAC GAG GAC CGT CTC GGT GGT GAA GTA GGC GGA AG3’(配列番号:16);ならびにPKR2についてはP15:5’TCT CCT TTA ACT TCA GTT ATG GTG ATT ATG ACC TC3’(配列番号:17)およびP16:5’CGA TGG GAT GGC AAT GAG AAT GGA CAC CAT CCA GA3’(配列番号:18)である。すべてのPCR反応は、Platinum Taq DNAポリメラーゼ(Invitrogen)を用いて、40秒間94℃、30秒間65℃、1分間72℃で40サイクルの間実験された。PCR生産物はアガロースゲル上で展開され、ニトロセルロースメンブラン上に転写され、そしてそれぞれPK1(5’ACC TGT CCT TGC TTG CCC AAC CTG CTG TGC TCC AGG TTC3’−配列番号:19)、PK2およびPK2β(5’TGG GCA AAC TGG GAG ACA GCT GCC ATC CAC TGA CTC GTA3’−配列番号:20)、PKR1(5’CTG ATT GCC TTG GTG TGG ACG GTG TCC ATC CTG ATC GCC ATC C3’−配列番号:21)、およびPKR2(5’CGG ATG AAT TAT CAA ACG GCC TCC TTC CTG ATC GCC TTG G3’−配列番号:22)に対して特異的な32P−標識オリゴプローブとハイブリダイズされた。ヒトβ−アクチン遺伝子発現についてのPCR検出が、cDNAの品質のための対照として全組織について使用された。ヒトβ−アクチンmRNA発現のPCR検出のためのプライマーは、5’GAG AAG AGC TAC GAG CTG CCT GAC GGC CAG GTC3’(配列番号:23)および5’AAG GGT GTA ACG CAA CTA AGT CAT AGT CCG CCT A3’(配列番号:24)であった。
ATG AGA GGT GCC ACG CGA GTC TCA3’(配列番号:13)およびp12:5’ACG TAA GAA TTC CTA AAA ATT GAT GTT CTT CAA GTC CAT GGA3’(配列番号:14);P
KR1についてはP13:5’CAA CTT CAG CTA CAG CGA CTA TGA TAT GCC TTT GG3’(配列番号:15)およびP14:5GAC GAG GAC CGT CTC GGT GGT GAA GTA GGC GGA AG3’(配列番号:16);ならびにPKR2についてはP15:5’TCT CCT TTA ACT TCA GTT ATG GTG ATT ATG ACC TC3’(配列番号:17)およびP16:5’CGA TGG GAT GGC AAT GAG AAT GGA CAC CAT CCA GA3’(配列番号:18)である。すべてのPCR反応は、Platinum Taq DNAポリメラーゼ(Invitrogen)を用いて、40秒間94℃、30秒間65℃、1分間72℃で40サイクルの間実験された。PCR生産物はアガロースゲル上で展開され、ニトロセルロースメンブラン上に転写され、そしてそれぞれPK1(5’ACC TGT CCT TGC TTG CCC AAC CTG CTG TGC TCC AGG TTC3’−配列番号:19)、PK2およびPK2β(5’TGG GCA AAC TGG GAG ACA GCT GCC ATC CAC TGA CTC GTA3’−配列番号:20)、PKR1(5’CTG ATT GCC TTG GTG TGG ACG GTG TCC ATC CTG ATC GCC ATC C3’−配列番号:21)、およびPKR2(5’CGG ATG AAT TAT CAA ACG GCC TCC TTC CTG ATC GCC TTG G3’−配列番号:22)に対して特異的な32P−標識オリゴプローブとハイブリダイズされた。ヒトβ−アクチン遺伝子発現についてのPCR検出が、cDNAの品質のための対照として全組織について使用された。ヒトβ−アクチンmRNA発現のPCR検出のためのプライマーは、5’GAG AAG AGC TAC GAG CTG CCT GAC GGC CAG GTC3’(配列番号:23)および5’AAG GGT GTA ACG CAA CTA AGT CAT AGT CCG CCT A3’(配列番号:24)であった。
結果
PK2LcDNAの同定およびPK2LmRNA組織発現パターンの分子特徴の決定
RT−PCRを用いてPK2mRNA発現プロフィルを特徴決定する過程において、予想されたPK2のPCR生産物よりもやや大きいサイズをもつPCR生産物が同定された。そのPCR生産物の分子クローニングとDNA配列決定は、それがPK2のコーディング領域に対して63塩基対のインサートを有し、これが21残基さらに長いタンパク質をもたらし(図1A)、そしてPK2Lと命名されることを示した。Genbankの検索では、本配列が、NCBIタンパク質データベースにおけるタンパク質配列と同一であるタンパク質をコードしていることが示された(Genbank Association Number Q9HC23,Wechselberger et al.,“The mammalian homologues of frog Bv8 are mainly expressed in spermatocytes,”FEBS Lett 462:177−181(1999))。類似の方法を用いて、ラットPK2LcDNAがまたラットの肺cDNAプールから単離された。ヒトおよびラットのPK2Lの完全cDNA配列は、Genbankに付託されている(Genbank Accession Number:AY349131;AY348322)。タンパク質配列の比較では、ラットとマウス(Genbank Accession Number:NP 056583)PK2Lタンパク質が、シグナル配列を除いては本質的に同一であり、そして90%のアミノ酸同一性をもつヒトPK2Lに高度に関連していることを示している(図1B)。
PK2LcDNAの同定およびPK2LmRNA組織発現パターンの分子特徴の決定
RT−PCRを用いてPK2mRNA発現プロフィルを特徴決定する過程において、予想されたPK2のPCR生産物よりもやや大きいサイズをもつPCR生産物が同定された。そのPCR生産物の分子クローニングとDNA配列決定は、それがPK2のコーディング領域に対して63塩基対のインサートを有し、これが21残基さらに長いタンパク質をもたらし(図1A)、そしてPK2Lと命名されることを示した。Genbankの検索では、本配列が、NCBIタンパク質データベースにおけるタンパク質配列と同一であるタンパク質をコードしていることが示された(Genbank Association Number Q9HC23,Wechselberger et al.,“The mammalian homologues of frog Bv8 are mainly expressed in spermatocytes,”FEBS Lett 462:177−181(1999))。類似の方法を用いて、ラットPK2LcDNAがまたラットの肺cDNAプールから単離された。ヒトおよびラットのPK2Lの完全cDNA配列は、Genbankに付託されている(Genbank Accession Number:AY349131;AY348322)。タンパク質配列の比較では、ラットとマウス(Genbank Accession Number:NP 056583)PK2Lタンパク質が、シグナル配列を除いては本質的に同一であり、そして90%のアミノ酸同一性をもつヒトPK2Lに高度に関連していることを示している(図1B)。
ヒトのPK2、PK2LおよびゲノムDNAにおけるDNA配列の比較は、PK2遺伝子がPK2によって使用されない推定上のエクソン領域を含有する(図1C)ことを表し、このことは、PK2LmRNAがPK2遺伝子からの択一的にスプライスされたイソ型であるかもしれないことを示している。PK2LのmRNA発現プロフィルが、RT−PCR法を用いて11種の異なるヒト組織におけるPK1、PK2、PKR1およびPKR2のそれと平行して解析された。図2で示されるように、その結果は、それらの各々がその独特な発現パターンを有することを示している。PK1mRNAは胎盤において主に発現されることが分かり、一方、PK2mRNAは全組織において見いだされる。PK2LmRNAは試験されたほとんどの組織において検出され、そして肺および脾臓において最も高いことが見いだされたが、脳ではわずかに検出され、そして腎臓では検出されず、ここではPK2mRNAが検出される。PKR1mRNAは脳、肺、肝臓、脾臓、脾臓および乳腺において検出された。PKR2mRNAは、脾臓および乳腺における比較的低レベルの発現とともに、脳では非常に顕著な発現を有する。
PKの発現、精製および生化学的特徴決定 PK1、PK2およびPK2Lが、COS−7細胞からN末端FLAGタグをもつ分泌される融合タンパク質として発現された。細胞培養上澄液中の分泌された融合タンパク質は、ANTI−FLAG M2アフィニティーカラムを用いて精製された。アフィニティー精製されたタンパク質は、エンテロキナーゼにより切断され、さらに逆相HPLCによって精製された。HPLC精製されたタンパク質は98%超の純度である。PK1(10kDa)およびPK2(9kDa)のサイズは本研究者らの予想と一致する。しかしながら、PK2L(6〜7kDa)を発現するCOS−7細胞から精製されたタンパク質のサイズは、PK2LcDNAコーディング領域により推定されたサイズ(11.5kDa)よりもはるかに小さい。PK2Lコーディング領域はPK2と比較して21個のさらなるアミノ酸をコードしているので、本発明者らは、PK2LはPK2より高い分子量を有するに違いないと予測した。しかしながら、PK2LcDNAをトランスフェクトされたCOS−7細胞から精製されたタンパク質は、PK2より小さいMWを有し、このことは、PK2Lタンパク質のためのプロ・タンパク質切断プロセスが存在することを示唆している。
PK2L発現細胞溶解物および細胞培養培地のウエスタン・ブロット解析では、FLAG−PK2Lが、FLAG−PK1(11.7kDa)およびFLAG−PK2(10.8kDa)より大きい予想されたサイズ(13.5kDa)として細胞において生成されたことを示した(図3)。痕跡量のFLAG−PK2Lが培養培地において検出されたけれども、順化培地に存在する多くのFLAG−PK2Lは、より小さい形態物、すなわちPK2β(8〜9kDa)にプロセスされると考えられる(図3)。PK2βのサイズに基づいて、プロテアーゼ切断部位が、FLAG−PK2Lに存在する21個のさらなるアミノ酸の範囲中に予測される。それらの21個のアミノ酸の多くは塩基性アミノ酸であり、したがって2個のフリン部位を含む、数個の推定プロ・ホルモン変換酵素切断部位をもつ配列を形成している。プロセスされたFLAG−PK2βの二重バンドは、2種の異なるフリン切断部位におけるFLAG−PK2Lの別なプロセスを示している。フリンはCOS−7を含む多くの異なる細胞において発現されるので、フリンがPK2Lの切断に関与しているのであろう。PK2Lとともにさらなるフリンの同時発現は、PK2βへのPK2Lの完全なプロセッシングをもたらす(図3)。PK2βの比較的低いバンドはプロセスされた形態物の主たるものであり、そして逆相HPLCによりさらに精製され、薬理学的特徴決定のために使用された。
プロキネチシンは異なる親和力によりPKR1およびPKR2に結合する 利用できる精製PK2βを用いて、PK1およびPK2と比較して、PK2βがPKR1またはPKR2に結合するか否か調査された。C末端FLAGタグを付したPK2が125Iで標識され、そして放射性リガンドとして使用されたが、これは高い親和力においてプロキネチシン受容体に結合することが報告されている(Soga et al.,2002)。PKR1およびPKR2を一過性に発現するCOS−7細胞からの膜が競合結合アッセイにおいて使用された。結果(図4A)は、PK1、PK2およびPK2βすべてが、能力PK2>PK2β≡PK1のランク順の高い親和力によりPKR1に結合することを示し
ている。PKR2では、PK1およびPK2のみが結合アッセイにおいて高い親和力を表し、これに対してPK2βは高濃度において限界的な活性があった(図4B)。PKR2の能力のリガンドランク順はPK2>PK1>>PK2βである。PKR1およびPKR2に対するPK1、PK2およびPK2βのIC50値が表1に列挙される。
ている。PKR2では、PK1およびPK2のみが結合アッセイにおいて高い親和力を表し、これに対してPK2βは高濃度において限界的な活性があった(図4B)。PKR2の能力のリガンドランク順はPK2>PK1>>PK2βである。PKR1およびPKR2に対するPK1、PK2およびPK2βのIC50値が表1に列挙される。
PK2βは選択的にPKR1を活性化する PK1およびPK2は、PKR発現細胞においてCa2+の可動化を刺激すると報告されている(Lin et al.,2002a;Soga et al.,2002)。この研究は、PKR発現細胞におけるCa2+の可動化の刺激においてPK1、PK2およびPK2βを比較するために計画された。結果は、PK1、PK2およびPK2βがPKR1発現HEK293細胞においてナノモル濃度においてCa2+の可動化を刺激することを表している(図5A)。両受容体に対して高い能力を有するPK1とPK2とは異なり、PK2βは、結合の結果と一致して、PKR1においてのみ活性がある(図5A、5B)。全Ca2+アッセイに関するEC50が表2において総括される。
プロキネチシン受容体は多数のシグナル伝達経路に共役している PTXはPKに刺激されるMAPキナーゼシグナル伝達を阻害することが報告されている(Lin et al.,2002b)が、このことは、PKRがGi関連タンパク質の活性化を介してMAPキナーゼを活性化することを示唆している。Ca2+可動化アッセイの進行において、PKR2発現細胞における最大のリガンド刺激されるCa2の+可動化が、PKR1発現細胞におけるそれよりも一貫して有意に低いことが観察されたが、これは報告されたこと(Lin et al.,2002a)と一致している。しかしながら、PKR2が、受容体/GiカップリングをCa2+可動化のシグナル伝達にシフトするキメラGタンパク質Gqi5(Conklin et al.,“Substitution of three amino acids swicthes receptor specificity of Gqα to that of Giα,”Nature 363:274−280(1993))と同時に発現された場合には、PKR2発現細胞における最大のリガンド刺激されるCa2の+可動化は、PKR1発現細胞からのそれのほぼ同じレベルまで増大した(図6)が、このことは、PKR2がまた、Lin et al.(2002b)による初期の報告と合致して、Gi関連のGタンパク質と共役されることを示唆する。得られた他のデータは、PKR1発現細胞におけるCa2の+可動化が、Gqi5の同時発現によって有意に影響されないことを表した。
PKR1およびPKR2によって使用されるシグナル伝達経路をさらに探求するために、PKR1およびPKR2発現細胞においてcAMP蓄積の刺激に及ぼすPKの影響が試験された。PKR1およびPKR2細胞系は、CREプロモーターの制御下でβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を保持しているSK−N−MC細胞において確立された(Liu。et al.2001b)。宿主細胞では、cAMP濃度の増加はβ−ガラクトシダーゼ発現の増大をもたらし、細胞におけるcAMP濃度を反映するこの酵素活性が、基質としてCPRGを用いて測定された。この結果は、PK1およびPK2が用量依存方式でPKR発現細胞におけるβ−ガラクトシダーゼ活性を刺激することを示した(図7A、7B)。得られた他のデータは、PKR発現のない場合、SK−N−MC細胞がPKに対する応答を現さないことを例証した。PKR発現細胞におけるβ−ガラクトシダーゼ活性を刺激するPKのEC50値が表3において示される。
cAMP蓄積アッセイが、PKR1またはPKR2を一過性に発現するHEK293細胞において実施された。結果は、PKがPKR発現細胞においてcAMP蓄積を刺激することを示した。リガンドに刺激されるcAMP蓄積は、Gsタンパク質がPKRと同時発現される場合、有意に増大される(図8A)。cAMP蓄積アッセイでは、PK1、PK2およびPK2βの能力のランク順は、Ca+2アッセイからのそれに類似する。全PKはPKR1に対して高い能力を示した(図8B)。PKR2発現細胞では、PK1およびPK2のみが高い能力のリガンドであると考えられ、PK2βは高い濃度において限界的な活性を示すだけであった(図8C)。PKR発現のないHEK293はPK刺激に応答しなかった。PKR1またはPKR2発現細胞HEK293におけるcAMP蓄積の刺激においてPKのEC50値が表3において示される。
検討
PK2の遺伝子構造の解析は、推定される択一的スプライシングがPK2遺伝子の第3エクソンにおいて生じることを示している。PK2に較べて、PK2LmRNAは、PK2タンパク質のLys47とVal48との間に21個のアミノ酸インサートをもたらすさらなるエクソン(63bp)を有した。また非常に類似するスプライスバリアントがラットにおいて発見され、そしてマウスにおいて報告され(Wecheselberger
et al.,1999)、したがって、PK2Lの機能は種の中において保存されていると考えられる。PK2LのmRNA発現の解析は、PK2LmRNA発現パターンがPK2のそれとは異なり、したがってPK2Lが異なって機能するであろうことを示している。PKR1mRNAがまた発現される肺および脾臓における比較的豊富なPK2LmRNA発現は、PK2Lが、何かの肺機能と免疫機能に関与しているであろうことを示している。PKは平滑筋の収縮を刺激することが知られている。高レベルのPK2LmRNA発現は、肺から塵粒子と流体を排出するための肺における繊毛運動の活性化に関係しているのであろう。PKの化学誘引(chemoattractive)効果が、PKRを
発現する副腎皮質毛管内皮(ACE)細胞について示されている(LeCouter et al.,2003)。脾臓における高レベルのPK2L発現は、免疫細胞がPKRを発現し、そしてPKに対する応答において化学誘引するか否かを知る興味を起こす。
PK2の遺伝子構造の解析は、推定される択一的スプライシングがPK2遺伝子の第3エクソンにおいて生じることを示している。PK2に較べて、PK2LmRNAは、PK2タンパク質のLys47とVal48との間に21個のアミノ酸インサートをもたらすさらなるエクソン(63bp)を有した。また非常に類似するスプライスバリアントがラットにおいて発見され、そしてマウスにおいて報告され(Wecheselberger
et al.,1999)、したがって、PK2Lの機能は種の中において保存されていると考えられる。PK2LのmRNA発現の解析は、PK2LmRNA発現パターンがPK2のそれとは異なり、したがってPK2Lが異なって機能するであろうことを示している。PKR1mRNAがまた発現される肺および脾臓における比較的豊富なPK2LmRNA発現は、PK2Lが、何かの肺機能と免疫機能に関与しているであろうことを示している。PKは平滑筋の収縮を刺激することが知られている。高レベルのPK2LmRNA発現は、肺から塵粒子と流体を排出するための肺における繊毛運動の活性化に関係しているのであろう。PKの化学誘引(chemoattractive)効果が、PKRを
発現する副腎皮質毛管内皮(ACE)細胞について示されている(LeCouter et al.,2003)。脾臓における高レベルのPK2L発現は、免疫細胞がPKRを発現し、そしてPKに対する応答において化学誘引するか否かを知る興味を起こす。
PK2Lの機能的役割を探求するために、PK2LcDNAが、PK1およびPK2と平行して哺乳類細胞において発現され、そして発現されたタンパク質が精製された。組換えペプチドは、FLAGタグを付したタンパク質を発現させ、タグを切り離し、そしてHPLCによって最終生産物を精製することによって作成された。PK1およびPK2発現についての最終生産物は期待されたとおりであったが、PK2LcDNAを発現する細胞からの精製ペプチドは期待されたものよりも有意に小さかった。細胞溶解物(未分泌)と培地(分泌)におけるPK2Lペプチドの比較は、PK2Lが期待されたように細胞において生成されるが、タンパク質分解的切断によってさらに小さいものにプロセスされることを示した。PK2Lのタンパク質配列解析は、2種のフリン切断部位(Arg−Arg−Lys−Arg60およびArg−Ser−Lys−Arg65)が存在し、これがフリン切断部位についてのArg−X−Lys−ArgまたはArg−X−Arg−Argモチーフ(Steiner et al.,“The new enzymology of Precursor processing endoproteases,”J
Biol Chem 267:23435−23438(1992);Nakayama,“Furin:a mammalian subtilisin/Kex2p−like endoprotease involved in processing of a wide variety of precursor proteins,”Biochem J 327:625−635(1997))と一致することを示した。また類似するフリン切断部位がマウスおよびラットのPK2Lにも存在するが、PK1およびPK2ペプチドには不在である。フリンはCOS−7細胞を含む多数の異なる細胞によって発現される(Yanagita et al.,“Processing of mutated proisulin with tetrabasic cleavage sites to mature insulin reflects the expression of furin in nonendcrine cell lines,”Endocrinology 133:639−644(1993))ので、PK2Lは、多分COS−7細胞から分泌する間に内因性フリンによって切断されるのであろう。事実、フリンの同時発現は切断プロセスを促進する。
Biol Chem 267:23435−23438(1992);Nakayama,“Furin:a mammalian subtilisin/Kex2p−like endoprotease involved in processing of a wide variety of precursor proteins,”Biochem J 327:625−635(1997))と一致することを示した。また類似するフリン切断部位がマウスおよびラットのPK2Lにも存在するが、PK1およびPK2ペプチドには不在である。フリンはCOS−7細胞を含む多数の異なる細胞によって発現される(Yanagita et al.,“Processing of mutated proisulin with tetrabasic cleavage sites to mature insulin reflects the expression of furin in nonendcrine cell lines,”Endocrinology 133:639−644(1993))ので、PK2Lは、多分COS−7細胞から分泌する間に内因性フリンによって切断されるのであろう。事実、フリンの同時発現は切断プロセスを促進する。
PK2βがPK2Lの成熟形態であるので、本明細書に記述された研究はPK2βに焦点を絞った。PK2βの薬理学的性質がPK1およびPK2のそれと比較された。その結果は、両PK1およびPK2が両PKR1およびPKR2発現細胞においてCa2+可動化を強く活性化するのに対して、PK2βはPKR2よりもPKR1を一層強く刺激することを示す。またPK2βは、放射性リガンド結合アッセイにおいてPK1およびPK2と比較して試験された。放射性リガンドとしてヒトPK1のTyr75において125Iを用いてPK1を標識する試みにより、得られる放射性リガンドは、PKR1またはPKR2発現細胞のいずれかを用いる結合アッセイにおいて、非常にわずかしか特異的結合を起こさなかった。PK2はTyrを有しないので、FLAGタグにTyrをもつC末端FLAGタグ付きのPK2が発現され、そして125Iで標識された。125I−PK2−FLAGは、高い親和力によりPKR1およびPKR2に結合し、そして結合アッセイにおいて8:1のノイズ比まで平均的シグナルを生じる。したがって、125I−PK2−FLAGは、無標識のPK1、PK2およびPK2βを特徴決定するために、競合アッセイにおけるトレーサーとして使用された。結合結果は、PK2βがPKR2よりもPKR1に優先的に結合することを示しており、このことはCa2+可動化実験と一致する。PK2は、結合アッセイにおいてPK1またはPK2βよりも、両PKR1とPKR2に対するはるかに大きい親和力を示した。PK1はCa2+アッセイでは高い能力を示したが、結合アッセイでは非常に低い能力しか示さなかった。結合アッセイにおけるPK1の能
力の減少は、放射性リガンドとして125I−PK1を用いた場合に観察される低下した結合を説明できる。EC50およびIC50値の相違は、アッセイメカニズムにおける相違の結果であろう。
力の減少は、放射性リガンドとして125I−PK1を用いた場合に観察される低下した結合を説明できる。EC50およびIC50値の相違は、アッセイメカニズムにおける相違の結果であろう。
PK2β成熟ペプチドは、PK2のN末端の47個のアミノ酸のみを保持しており、そしてPKR1に対する強力な完全アゴニストとしてなお作用するが、このことは、PKの機能性ドメインがN末端に置かれていることを示す。事実、PK1、PK2、MITおよびRv8における配列比較は、それらがC末端におけるよりもN末端においてはるかに高い保存配列を共有していることを示している。
若干のGタンパク質共役受容体は、Gq、GiおよびGsタンパク質を含む、種々のGタンパク質と相互作用することが示されており(Chabre et al.,“Coupling of the alpha 2A−adrenergic receptor to multiple G−proteins.A simple approach for estimating receptor−G−protein coupling efficiency in a transient expression system,”J Biol Chem 269:5730−5734(1994);Liu et al.,“Involvement of both Gq/11 and Gs protein in gonadotropin−releasig hormon receptor−mediated signaling in LβT2 cells,”J Biol Chem 277:32099−32108(2002);Lin et al.,2002a,supra;Sago et al.,2002,supra)、したがって、PKRはGqタンパク質と共役されると考えられる。MAPKのPKに誘導される活性化がPTX感受性である(Lin et al.,2002b,supra)という事実は、PKRがまたGiタンパク質と共役されるであろうことを示す。事実、本発明者らの結果は、Gqi5のPKR2との同時発現が、PKR2発現細胞においてPKに刺激されるCa2+応答を増大することを示す。
PKがPKR発現細胞においてcAMPを刺激するか否かを探求した結果は、PK1、PK2およびPK2βが、PKR発現細胞においてcAMPの蓄積を用量依存方式で刺激したことを示している。首尾一貫した結果は、安定なSK−N−MC細胞またはPKR1とPKR2を一過性に発現するHEK293細胞においてcAMP蓄積アッセイを実施する場合に得られた。PKRとGsタンパク質の同時発現は、PKに刺激されるcAMP蓄積を増進し、このことはPKRがGsタンパク質と共役できることを反映している。
PK受容体は、異なる種類のGタンパク質を介して種々のシグナル伝達経路に共役できるので、PKRを発現するが異なるGタンパク質発現パターンをもつ天然細胞は、PKに対して異なって応答し、そのために、それらの細胞に異なる生理学的機能を遂行させるであろう。
PK2βはPKR1に対するアゴニストとして作用し、したがってPKR1活性によって媒介される疾病または障害を処置するために有用である。本発明のペプチド化合物は、ペプチドのための慣用調合物、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Published Company(Easton,PA)の最新版に記述されているような調合物において投与されてもよい。好ましくは、ペプチドは、この投与経路に適当な調合物を用いて、注射、好ましくは静脈内の注射によって投与される。あるいはまた、ペプチドは、所望の治療利益が得られるまで長時間にわたって定常的な注入によって投与されてもよい。他の投与様式は、例えば、坐剤、鼻内エアゾル剤および適当であれば経口調合物を含む。
本発明の組成物は、好ましくは、PK2βペプチドの有効量、すなわち、PKR1調節を介して所望の治療効果を達成するのに有効な量を含有する。代表的な用量レベルは、熟練技術者の理解範囲内にある適当な用量の選択により、約0.001〜1000μg/kg被験者、より好ましくは0.001〜100μg/kgである。
かくして、本発明はまた、有効量の本発明のペプチドまたはその非毒性の付加塩、アミドもしくはエステルを含んでなる製薬学的組成物を提供する。製薬学的に許容できる、非毒性の塩は、例えば、塩酸もしくはリン酸のような無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などのような有機酸を用いて、遊離アミノ基と形成される酸付加塩を含む。遊離カルボキシル基と形成される塩は、水酸化ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは第2鉄のような無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、2−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩基から得られてもよい。
好ましくは、組成物はペプチド化合物に加えて1種以上の生理学的に許容できるか、または製薬学的に許容できる液体、ゲルまたは固体希釈剤、補助剤、賦形剤、媒体および/または担体を含有する。適当な希釈剤および賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロールなど、およびそれらの組み合わせ物を含む。さらに、所望であれば、組成物は少量の補助成分、例えば湿潤剤または乳化剤、安定剤またはpH緩衝剤などをさらに含有してもよい。場合によっては、組成物は他の成分を含有してもよく、またはその他の製薬学的組成物と同時に投与されてもよい。
また本発明のペプチドは、標識された試薬、例えば抗体を用いる免疫アッセイにおいて使用する抗血清を調製するために使用されてもよい。ペプチド化合物は、ジアルデヒド、カルボジミドによるか、または市販のリンカーを用いて、適当であるように抗原性付与担体に複合されてもよい。化合物および免疫学的試薬は、種々の標識、例えば、発色団、、蛍光団(例えばフルオレセインもしくはローダミン)、ラジオアイソトープ(例えば125I、5S、14Cもしくは3H)または磁化粒子により当該技術分野において既知の手段を用いて標識されてもよい。これらの標識された化合物および試薬、またはそれを認識し、特異的に結合できる標識された試薬は、診断試薬としての用途を見い出すことができる。生物標本由来のサンプルは、本発明の化合物を用いて共通の抗原決定基をもつ物質の存在もしくは量についてアッセイすることができる。さらに、モノクローナル抗体が既知の技術を用いて調製されてもよく、この抗体は、例えば、イン・ビボで免疫学的に関連する化合物の過剰生産を中和するために治療上の用途を有するであろう。
本発明は詳細な説明およびその好適な態様を参照して記述されたが、本発明の範囲は先の記述によってではなく、特許法の原則の下で適当に解釈されるような付随する請求項によって限定されることが理解できる。
Claims (10)
- AVITGACDKDSQCGGGMCCAVSIWVKSIRICTPMGKLGDSCHPLTRKNNFGNGRQE(配列番号:1)および
AVITGACDKDSQCGGGMCCAVSIWVKSIRICTPMGQVGDSCHPLTRKSHVANGRQE(配列番号:2)
からなる群から選ばれるアミノ酸配列から本質的になる単離されそして精製されたペプチド、またはその塩、アミドもしくはエステル。 - 配列番号:1に対応するアミノ酸配列を有する単離されそして精製されたPK2βペプチド。
- 配列番号:2に対応するアミノ酸配列を有する単離されそして精製されたPK2βペプチド。
- AVITGACDKDSQCGGGMCCAVSIWVKSIRICTPMGKLGDSCHPLTRKNNFGNGRQE(配列番号:1)および
AVITGACDKDSQCGGGMCCAVSIWVKSIRICTPMGQVGDSCHPLTRKSHVANGRQE(配列番号:2)
からなる群から選ばれるアミノ酸配列から本質的になるPK2βペプチド、または該ペプチドの塩、アミドもしくはエステルの製薬学的に活性な量を投与することを含んでなる、PK1活性によって媒介される疾病または障害をもつと診断された患者を処置する方法。 - ペプチドが配列番号:1に対応するアミノ酸配列を有する、請求項4に記載の方法。
- ペプチドが配列番号:2に対応するアミノ酸配列を有する、請求項4に記載の方法。
- 疾病または障害が肺の疾病または障害である、請求項4に記載の方法。
- 肺の疾病または障害が、喘息、類肉腫症、間質性肺疾患、間質性肺炎、シェーグレン(Sjogren)症候群、閉塞性細気管支炎症候群、線維症性肺疾患、慢性閉塞性肺疾患および急性呼吸困難症候群からなる群から選ばれる、請求項7に記載の方法。
- 疾病または障害が胃腸の疾病または障害である、請求項4に記載の方法。
- 胃腸の疾病または障害が、感応性腸症候群、糖尿病性軽症胃アトニー、手術後腸閉塞症、慢性便秘、胃食道逆流疾患、慢性消化不良および軽症胃アトニーからなる群から選ばれる、請求項9に記載の方法。
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