CH670451A5

CH670451A5 -

Info

Publication number: CH670451A5
Application number: CH4672/86A
Authority: CH
Inventors: Hans Marquardt; George J Todaro; Daniel R Twardzik
Original assignee: Oncogen
Priority date: 1985-11-22
Filing date: 1986-11-21
Publication date: 1989-06-15
Also published as: KR870005014A; PT83790A; DE3639796A1; AU6667590A; ES2002915A6; IT1207580B; LU86683A1; GB2185023A; US4731439A; AU6560986A; NL8602939A; BE905790A; GR862788B; DK560986A; YU199586A; SE8604991L; IT8622425A0; GB8627710D0; DK560986D0; CN86108593A

Description

BESCHREIBUNG

Toxische Mittel können in vielen Bereichen verwendet werden, insbesondere wenn das cytotoxische Mittel spezifisch ist oder so modifiziert werden kann, dass es für gewisse Stämme oder Zelltypen spezifisch ist, kann das cytotoxische Mittel für die Eliminierung von gewissen Stämmen oder Zelltypen aus einer Kultur oder aus Gewebe, eine Vielzahl von verschiedenen Typen von Zellen involvieren. Es ist beispielsweise bei bösartigen Tumoren wünschenswert, dass die bösartigen Zellen ohne ernsthafte Mortalität der normalen oder gesunden Zellen eliminiert werden können.

Eine Quelle von Toxinen ist Schlangengift. Eine Anzahl von Toxinen sind bekannt. Trotzdem ist es jedoch noch von Interesse zusätzliche Toxine zu finden, damit das Armamentarium von Toxinen für besondere Anwendungszwecke erhöht werden kann. Toxine können z.B. bezüglich der Immunantwort auf das Toxin, der Leichtigkeit der Kupplung mit Reagenzien oder des aktiven Zentrums des Toxins variieren. Zur Entdeckung von neuen Toxinen aus Schlangengift sind Verwendungsversuche, extensive Extraktionen, Reinigungen und Analysen erforderlich, um die Reinheit und die Bestimmung der Aminosäurensequenz zu gewährleisten.

Cytotoxische Peptide aus dem Gift von verschiedenen Klapperschlangenarten sind bis jetzt sequeniert, isoliert und beschrieben worden. Myotoxin wird aus dem Gift der Prärieklapperschlange Crotalus abgeleitet (Fox et al., Biochemistry [1979] 18,

5

10

15

20

25

30

J5

40

45

50

55

60

b"3

3

670 451

678-683); Crotamin wird aus dem Gift der südamerikanischen Klapperschlage Crotalus durissus terrificus abgeleitet (Lauree und Hoppe-Seyler, Physiol. Chem. [1975], 356,213-215); und das toxische Peptid C wird aus dem Gift der südpazifischen Klapperschlange Crotalus viridis helleri (Maeda et al., Toxicon [1978], 16, 431-441) abgeleitet.

Die vorliegende Erfindung stellt neue cytotoxische oder zellwachstumshemmende Peptide zur Verfugung, welche einem Peptid, das aus der «Western Diamondback»-Klapperschlange Crotalus atrox verwandt sind. Konjugate dieser Peptide mit spezifischen Bindungsglieden, zum Beispiel Liganden oder Rezeptoren, können für die selektive Entfernung von Zellen aus einer Zellmischung benutzt werden.

Es werden demzufolge cytotoxische Mittel zur Verfügung gestellt, welche Peptide mit einem Molekulargewicht von ungefähr 6 ku bzw. 6 Kilodalton (kD), die aus dem Gift der Crotalus atrox isoliert wurden, cytotoxische Analoge davon und Konjugate der cytotoxischen Mittel mit Peptiden, insbesondere Liganden und Rezeptoren für die spezifische Bindung an komplementäre Bindungsglieder, zur Verfügung gestellt. Der aktive Rest weist mindestens etwa 15 Aminosäuren auf, normalerweise mindestens 25 Aminosäuren und insbesondere mindestens etwa 35 Aminosäuren, aber nicht mehr als 60 Aminosäuren und in der Regel nicht mehr als 50 Aminosäuren. Diese aktiven Reste können mit einer grossen Zahl anderer Verbindungen, die nachstehend beschrieben werden, verbunden werden.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind demzufolge die Peptide der folgenden Formel pp1QCiaa4aa5aa6GGaa9C2aa11aa12aa13aa14C3aa16aa17aa18aa19SD-aa22GKaa25aa26C)aa2Saa29aa30WKC5C6Kaa36aa37aa38aa39pp2

worin pp1 der N-Terminus ist und Wasserstoff, eine einzelne Aminosäure, insbesondere eine polare Aminosäure, vorzugsweise eine hyroxy-substituierte Aminosäure oder eine basische Aminosäure oder ein Polypeptid von 2-20, üblicherweise von 2-10 Aminosäuren sein kann und verschiedene Funktionen aufweisen kann, wie beispielsweise als Bindungs- oder Modifikationsgruppe;

pp2 der C-Terminus ist und die terminale Hydroxy-Gruppe, eine einzige Aminosäure, insbesondere eine polare Aminosäure, vorzugsweise eine Carboxamido-Gruppe, die eine Aminosäure enthält oder ein Polypeptid von 2-20, insbesondere von 2-10 Aminosäuren sein kann und die gleiche Funktionen haben kann wiepp1;

die individuellen Buchstaben besitzen ihre normale Bedeutung als Teil des Ein-Buchstaben-Aminosäurecodes, welcher nachstehend angegeben wird; bis zu 5, normalerweise nicht mehr als 3 der Aminosäuren, die durch die Buchstaben aa mit den Nummern bezeichnet sind, durch Bindungen ersetzt sein können, so dass sie Deletionen in der Struktur darstellen;

Ci mit Cs, C2 mit C4 und C3 mit Ce unter Bildung von Cystein-Brücken verbunden sein können;

aa4 eine aliphatische, saure oder aromatische Aminosäure, insbesondere D, E, H ist;

aa5 eine aliphatische, polare oder basische Aminosäure, insbesondere Carboxamido-substituiert oder basisch, bevorzugt N, 1, Q, K, Rist;

aa6 eine aliphatische, geladene Aminosäure, entweder sauer oder basisch, insbesondere D, E, K, R ist;

aa9 eine aromatische Aminosäure, insbesondere F, H, W, Y

ist;

aa11 eine aliphatische, basische Aminosäure, bevorzugt K, R

ist;

aa12 eine aromatische Aminosäure oder eine aliphatische, polare oder geladene Aminosäure, insbesondere eine saure oder neutrale, bevorzugt eine hydroxy-substituierte als eine neutrale, umfassend F, H, W, Y, D, E, S, T ist;

aa13 eine aliphatische, nicht-polare oder geladene Aminosäure, insbesondere eine nicht-polare oder basische, bevorzugt mit 4-6 C-Atomen und umfasst L, I, V, K, R ist;

aa14 eine aliphatische, nicht-polare Aminosäure, insbesondere mit 4-6 C-Atomen, nämlich L, I, V ist;

aa16 eine aliphatische, nicht-polare Aminosäure mit 4-6 C-Atomen, insbesondere P, I, L, V ist;

aa17 eine aliphatische, nicht-polare oder polare Aminosäure mit 3-5 C-Atomen, insbesondere hydroxy-substituiert, falls polar, insbesondere S, T, A, P, V ist;

aa18 eine aliphatische, nicht-polare oder basische Aminosäure mit 3-6 C-Atomen, die insbesondere basisch ist, wenn geladen, normalerweise mit 4-6 C-Atomen, insbesondere P, I, L, V, K, R darstellt;

aa19 eine aliphatische, polare Aminosäure mit 3-4 C-Atomen, insbesondere hydroxy-substituiert und bevorzugt S, T ist;

aa22 eine aliphatische, nicht-polare oder aromatische Aminosäure, falls sie aliphatisch ist, mit 5-6 C-Atomen, insbesondere F, I, L, V ist;

aa25 eine aliphatische, neutrale Aminosäure mit 3-6 C-Atomen, insbesondere mit 4-6 C-Atomen ist, polar oder nicht-polar, falls sie polar ist, weist sie ein Schwefelatom auf, insbesondere M, I, L, V darstellt;

aa26 eine aliphatische, geladene oder nicht-polare Aminosäure, wenn polar, insbesondere sauer, mit 2-5, normalerweise 2-4 C-Atomen, insbesondere G, A, P, D, E ist;

aa28 eine aliphatische, geladene Aminosäure mit 4-6 C-Atomen, die basisch oder sauer sein kann, insbesondere D, E, K, R ist;

aa29 eine aliphatische oder aromatische Aminosäure mit 3-5 C-Atomen, insbesondere A, P, V, F, H, W, Y ist;

aa30 eine aliphatische, nicht-polare oder basische Aminosäure mit 4-6 C-Atomen, z.B. eine neutrale und nicht-polare Aminosäure, normalerweise mit 5-6 C-Atomen, insbesondere I, L, V, K, Rist;

aa36 eine aliphatische, basische Aminosäure, insbesondere K, Rist;

aa37 eine aliphatische Aminosäure mit 2-3 C-Atomen oder eine aromatische Aminosäure, insbesondere G, A, F, H, W, Y ist;

aa38 eine aliphatische, neutrale Aminosäure mit 2-4 C-Ato-men ist, die polar oder nicht-polar sein kann, die insbesondere hydroxy-substituiert sein kann, wenn sie polar ist, und bevorzugt G, A, P, S, T ist;

aa39 eine aliphatische, nicht-polare Aminosäure mit 2-6 C-Atomen mit blockiertem oder unblockiertem N-Terminus, insbesondere mit 2-3 C-Atomen, insbesondere G, A, P, I, L, V ist.

Die Gruppen für die verschiedenen Aminosäuren und die Ein-Buchstaben-Bezeichnungen werden nachstehend angegeben:

aliphatisch neutral nicht-polar G, A, P, V, I, L

polar

S, T, M, C, N, Q

geladen

sauer

D, E

basisch

K, R

aromatisch

F, H, W, Y

G - Glycin

N -

Asparagin

A - Alanin

Q -

Glutamin

P - Prolin

D -

Asparaginsäure

V - Vaiin

E -

Glutaminsäure

I - Isoleucin

• K -

I vsin

L - Leucin

R -

Arginin

S - Serin

F -

Phenylalanin

T - Threonin

H -

Histidin

M - Methonin

W-

Triptophan

C - Cystein

Y -

Tyrosin

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

670 451

4

Von besonderem Interesse sind die Peptide der folgenden Formel

S Q C E Q E G. G HF C ^ F ^ j

CTP SR^SD^GK^GCEPLWKCCK

L S L M

^ W G G

K

worin: wenn zwei Aminosäuren an der gleichen Stelle angegeben sind, an dieser Stelle eine von den beiden vorhanden sein kann, es wird jedoch bevorzugt, dass alle Aminosäuren, die oberhalb der Zeile stehen, zusammen vorkommen oder alle Aminosäuren, die unterhalb der Zeile geschrieben sind, gemeinsam vorkommen.

Es wird weiter daraufhingewiesen, dass konservative Substitutionen erlaubt sind. Unter konservativer Substitution wird verstanden, dass die nachstehenden Aminosäuren auf den gleichen Zeilen gegenseitig ersetzt werden können.

G, A V, I, L D, E K, R S, T F, H, W, Y

Der N-Terminus des Peptides kann blockiert oder unblockiert sein, blockiert enthält er normalerweise eine aliphatische Säure, z.B. Essigsäure oder Ameisensäure, Alkylierung usw. Die erfin-dungsgemässen Verbindungen haben sich in den Testverfahren, welche im experimentellen Teil beschrieben sind, als wärme- und säurestabil erwiesen. Von besonderem Interesse ist das natürlich vorkommende, wachstumsverhindernde Peptid, welches mindestens 90 Prozent, vorzugsweise 95 Prozent und besonders bevorzugt 99 Prozent rein ist. Es kann als solches oder in Kombination mit anderen Toxinen eingesetzt werden. D<e cytotoxischen oder wachstumshemmenden erfindungsgemässen Verbindungen können mit einer grossen Anzahl von Liganden und Rezeptoren durch konventionelle Techniken konjugiert werden. Die funktionellen Gruppen, die in die Bindungen involviert werden, können eine Anzahl saurer Gruppen, wie die Carboxyl-, Sulfonyl- und Phosphoiylgruppe, Kombinationen von Thiolen und Olefinen, Dithiogruppen, Aldehyden, Azogruppen oder Diazogruppen sein. Meistens werden difunktionelle Gruppen verwendet, welche stufenweise umgesetzt werden, obschon difunktionelle Gruppen, welche simultan reagieren, ebenfalls verwendet werden können. Typische Reagenzien sind beispielsweise Glutaraldehyd, Formaldehyd, p-Maleimidobenzoesäure, Methyldithioessigsäure, Diazo-benzoesäure oder dergleichen. Das besondere Verfahren, welches für die Verbindung von cytotoxischen Resten mit spezifischen Bindungsgliedern eingesetzt wird, ist in dieser Erfindung nicht kritisch.

Spezifische Bindungsglieder sind Liganden und Rezeptoren, wobei die spezifischen Bindungsglieder dazu dienen, um eine spezifische Bindung an einem besonderen Ziel zu gewährleisten. Beispielsweise besitzen Zellen normalerweise Oberflächen-Anti-gene und Rezeptoren, die charakteristisch für einen besonderen Zelltyp sind. Demzufolge kann durch Verwendung von zweckmässigen Liganden oder Rezeptoren, die mit einem toxischen Mittel verbunden sind, das toxische Mittel vorzugsweise gegen diese Zellen mit den reziproken, spezifischen Bindungsgliedern gerichtet werden. Verschiedene Verbindungen, die als Liganden verwendet werden können, umfassen Steroide, Lipoproteine niederer Dichte, Wachstumsfaktoren, virale Proteine usw. Im Gegensatz dazu können entweder natürliche Rezeptoren oder vorzugsweise Immunoglobuline oder Fragmente davon verwendet werden, wenn die Rezeptoren gegen spezifische Oberflächen-Anti-gene gerichtet sind. Die Immunoglobuline von Interesse umfassen IgA, IgD, IgM, IgE und IgG, vorzugsweise IgG, einschliess lieh sämtlichen Subtypen. Die Immunoglobuline können von jeder konventionellen Quelle abgeleitet werden, insbesondere vi Mäusen oder Menschen. Die Immunoglobuline können von Hybridomen, von transformierten Zellen, z.B. EBV-transformie ten Lymphocyten oder durch rekombinante DNA-Technologie abgeleitet sein. Insbesondere können variable Regionen von MÉ sen mit konstanten Regionen von Menschen oder anderen Wirt verbunden werden, um chimerische Immunoglobuline herzustel len, welche eine niedrigere Antigeniziät aufweisen. Zusätzlich isi nicht das ganze Immunoglobulin notwendig, sondern nur Fragmente davon, wie Fab, F(ab')2, Fv oder dergleichen.

Ligand und Toxin können durch Bindungen verbunden werden, die in der Zielzelle stabil sind oder auch unstabil, so dass d Toxin in der Zelle abgetrennt werden kann. Gewünschtenfalls wird das Toxin in der Zelle eingeschlossen, so dass es seine Wirkung intra-cellulär ausübt. Wenn das zielende Mittel die Aktiviti des Toxins nicht in schädlicher Weise beeinflusst, besteht kein Bedürfnis nach einer spaltbaren Bindung. Wenn die spaltbare Bindung gewünscht ist, wird normalerweise eine Disulfid-Brück verwendet, welche in der Gastzelle reduziert werden kann.

Die Konjugate können eine grosse Vielfalt von Verhältnissen zwischen dem zielenden Mittel, dem spezifischen Bindungsgliec und dem Toxin umfassen. Üblicherweise wird mindestens ein Toxin pro zielender Wirkstoff eingesetzt, jedoch nicht mehr als etwa ein Toxin pro 500 u bzw. 0,5 Kilodalton (kD) zielendes Mi tel. Üblicherweise wird mindestens ein Toxinmolekül pro 100 ku bzw. 100 kD zielendem Wirkstoff vorhanden sein, in der Regel mindestens eines pro 50 kD zielendes Mittel. Wenn das zielende Mittel klein ist, wie etwa ein Hapten von niederem Molekulargewicht, sind zwei oder mehr Liganden pro Toxin vorhanden, normalerweise nicht mehr als etwa 5 Liganden pro Toxin.

Die erfindungsgemässen Verbindungen können in vitto oder in vivo verwendet werden. Für die in vitro-Verwendung können sie für die selektive Zerstörung von Zellen, die von anderen Zelle in einer Kultur oder im Gewebe unterschieden werden können, verwendet werden. Die erfindungsgemässen Verbindungen können in genügenden Anteilen zum Medium gegeben werden, um die unerwünschten Zellen zu zerstören. Müssen beispielsweise besonders gewebeverträgliche Antigene nachgewiesen werden, kann man Reagenzien, die spezifische Antikörper für das besondere gewebeverträgliche Antigen enthalten, zugeben. Durch Zugabe eines Farbstoffes, welcher nur durch tote Zellen absorbiert wird, weist die Gegenwart des Farbstoffes in den Zellen auf den besonderen gewebeverträglichen Typ hin. Der Anteil des toxinzie lenden Reagenz kann in breiter Weise variiert werden und kann durch die Verwendung in vitro für die besonderen Situationen optimiert werden. Zuviel auf das Toxin gerichtete Reagenz sollte nicht verwendet werden, da es zu nicht spezifischer Bindung und falschen Positiv-Reaktionen führt, während zuwenig nicht verwen det werden sollte, da es zu falschen Negativen fuhren kann, da niedere Bindungsstufen nicht leicht nachgewiesen werden können.

Für die Verwendung in vivo kann das Konjugat parenteral oder durch Injektion, insbesondere intravenös, verabreicht werden. Der Anteil des verwendeten Konjugates kann in breiter Weise variiert werden, je nach der Natur der abzutötenden Zelle, dem Ausmass der Zellpopulation, der Widerstandsfähigkeit der Zelle gegenüber des Konjugates, der Wirksamkeit des Konjugates und dergleichen. Wenn an einer Stelle verabreicht wird, die verschieden ist von der spezifischen Stelle, wird normalerweise der Anteil Protein zwischen 1 jig bis 10 mg variieren, normalerweise bis zu 2 mg pro kg des Körpergewichtes des Wirtes. An einer spezifischen Stelle kann der Proteinanteil im kleineren Teil des Konzentrationsbereiches liegen. Das Konjugat kann in einem physiologisch annehmbaren Medium, wie phosphatgepufferte Kochsalz5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

670 451

lösung, oder in einem anderen zweckmässigen Trägermedium verabreicht werden. Pulverförmig kann das Konjugat mit anderen Materialien kombiniert werden, welche beispielsweise den Transport der Zusammensetzung zu einem bestimmten Organ oder eine verzögerte Freisetzung bewirken können. Die Art, in welcher proteinhaltige Zusammensetzungen, an einen Wirt verabreicht wird, ist im Stand der Technik durch zahlreiche Beispiele dokumentiert und wird an dieser Stelle nicht im einzelnen diskutiert.

Von besonderem Interesse als Zielzellen sind Tumorzellen und pathogene Mikroorganismen. Von ganz besonderem Interesse, wegen ihrer grossen Verbreitung, sind Lungenkarzinome, kolonale und rektale Krebszellen, Brustkrebs, Karzinome am Uterus, Karzinome an der Prostata, Blasen- und Nierenkrebs, Lymphome, Leukämie und die Hodgkins-Krankheit. Beispiele von-pathogenen Mikroorganismen sind Protozoen, und Plasmodium vivas, P. maleriae, P. ovale und P. falciparum, gramnegative Bakterien, wie Pseudomonas, Klebsiella und Neisseria, grampositive Bakterien und dergleichen.

Experimenteller Teil Materialien und Methoden

Reinigung von wachstumsunterbrechenden Peptiden vom Gift der Crotalus atrox

Die rohe Peptidverbindung wurde erhalten durch Melken der Crotalus atrox und Klären vor Niedergeschwindigkeits-Zentrifu-gation vor einer Gefriertrocknung. Das gefriergetrocknete Gift wurde in (10 mg/ml) 1 M Essigsäure aufgelöst und das unlösliche Material durch Niedergeschwindigkeits-Zentrifugation entfernt.

Die Anfangsreinigung wurde durchgeführt, indem die Probe in Mengen von 7,5 ml auf eine Bio-Gel PlO-Säule appliziert wurde, die mit 1 M Essigsäure equilibriert war und sammeln der Fraktionen (3,5 ml) und aliquote Anteile wurden entfernt und gefriergetrocknet. Die aliquoten Anteile wurden ursprünglich auf die Hemmung der DNA-Synthese in humanen Lungenkarzinom-Zellkulturen A549 getestet. Kurz ausgedrückt, wurden 2x10" A549-Zellen in 96-Loch-Platten angesetzt, und nach der Befestigung der Zellen wurden diese mit zweckmässigen Säulenfraktionen behandelt. 5 Tage später wurden die Veniefungen mit 125I-Desoxyuridin stossmarkiert, und die DNA-Synthese wurde bezüglich der Kontrollvertiefungen auf Basis der Einverleibung von 125I-Desoxyuridin bestimmt. Es wurden zwei Hauptpeaks mit Hemmung festgestellt. Ein erster Peak mit einem niederen Molekulargewicht und Hemmaktivität wurde in der Nähe des 6000 Mr-Markiermittels Insulin festgestellt und wurde weiter unter Verwendung der Hochdruck-Flüssigchromatographie (HPLC) gereinigt.

Die Probe wurde lyophilisiert und wieder in 0,05 Prozent Tri-fluoressigsäure (TFA) in Wasser von HPLC-Reinheitsgrad (Water's Associates) suspendiert. Das unlösliche Material wurde durch Zentrifugation entfernt, und die Probe wurde in eine Ci8-Novapak-Säule eingespritzt. Die Probe wurde mit einem linearen Gradient von 20 bis 60 Prozent Acetonitril in 0,05 Prozent TFA mit einer Fliessgeschwindigkeit von I ml/min bei 22 ° C eluiert. Jedes Aîu-absorbierende Peptid wurde separat gesammelt, und aliquote Anteile wurden auf die Hemmung der DNA-Synthese getestet. Das Peptid, welches bei 54 Prozent Acetonitril eluiert wurde, hemmte die DNA-Synthese der A549-Zellen; bei anderen Säulenfraktionen konnte keine Hemmung festgestellt werden. Die SDS-PAGE dieser Aktivität zeigte ein'einzelnes silbergefärbtes Band; es konnten keine anderen Banden auf diesem Gel sichtbar gemacht werden, was anzeigte, dass dieses Peptid bis zur Homogenität gereinigt worden war.

Morphologie der inhibierten Zellen

Die inhibierten Zellen zeigten einen auffalligen morphologischen Wechsel 24 Stunden nach ihrer Behandlung mit diesem Peptid, welches als «wachstumsunterbrechendes Peptid» (GAP) bezeichnet wird. Sowohl die humanen Tumorzellen als die nicht transformierten Fibroblasten wurden in diesem Versuch inhibiert (50 Prozent der gezüchteten Zellen) mit einer Peptid-Konzentration von etwa 100 mg/m 1. Nach der Behandlung wurden die Zellen rund, und die meisten dendritenartigen Ausbuchtungen waren 5 abwesend. Die Zellen hielten sich jedoch noch an der Platte fest. Diese Wirkung war irreversibel, das Waschen der behandelten Zellen und das Wiederzuführen von Medium, welches 10 Prozent Serum enthielt, ermöglichte es nämlich nicht, Zellen des ursprünglichen Phenotypes zu gewinnen.

10

Chemische Struktur des GAP

Die Aminosäure-Sequenz des GAP wurde durch Mikro-sequenz-Analyse von Peptiden durchgeführt, welche durch eine enzymatische Verdauung des reduzierten und S-carboxyamidome-i5 thyliertem GAP erhalten wurden, (a) der Endoproteinase Lysin-C, (b) TPCK-Trypsin (L-[l-Tosylamido-2-phenyl]ethyl-chlormethyl-keton); und (c) Staphylokokkus aureus V8. Die Pep-tid-Fragmente wurden durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt, wobei flüchtige Lösungsmittel verwendet wurden. Die aminoter-2o minalblockierten Peptide wurden in 12N HCl bei Zimmertemperatur während 16 Stunden inkubiert. Proben wurden dann durch Lyophilisation getrocknet. Die Peptide wurden einem automatischen Edman-Abbau unterworfen, in einem Gasphasen-Protein-sequenator, Modell 470A (Applied Biosystems, Inc.). Die Phe-25 nylthiohydantoin-Aminosäuren wurden durch rpHPLC analysiert.

Die Aminosäure-Sequenz des GAP ist die folgende:

SQÇEQEGGFÇRFI., LCPSRTSDIGKL

ÎCI1 J i

30 GCEPLWKCCKRWGC

Die Struktur wurde durch Mikrosequenz-Analyse bestimmt. Kurz gesagt, wurde das GAP mit Dithioeiythrit reduziert, S-car-boxamidomethyliert mit Jodacetamid und ein 10 Prozent aliquo-35 ter Anteil wurde einem automatischen Edman-Abbau unterworfen. Es wurde keine N-terminale Aminosäure entdeckt, sogar als mehrere Zyklen des Edman-Abbaus durchgeführt wurden, woraus geschlossen werden kann, dass die terminale Aminogruppe des GAP blockiert ist.

40 Ein 45 Prozent aliquoter Anteil von S-carboxamidomethylier-tem GAP wurde mit Lysin-C-Enzym verdaut. Die Peptide Kl-24 und K25-32 wurden durch rpHPLC getrennt. Die Peptide K33-35 und K36-39 wurden durch die Säule nicht zurückgehalten und wurden als Mischung eluiert. Es wurde kein Versuch 45 unternommen, diese Peptide zu reinigen. Ein 50 Prozent aliquoter Anteil der Peptide Kl-24, bzw. K25-32, wurden einem automatischen Edman-Abbau unterworfen. Es wurde keine N-terminale Aminosäure entdeckt, als Kl-24 sequentiell wurde. Der verbleibende 50 Prozent aliquote Anteil des Kl-24 wurde anschlies-5o send mit TPCK-Tiypsin verdaut. Die tryptischen Peptide Tl-11, T12-18 und T19-24 wurden durch ipHPLC getrennt und einem Edman-Abbau unterworfen. Es wurde keine N-terminale Aminosäure entdeckt, als ein 50 Prozent aliquoter Anteil des Peptides Tl-11 sequeniert wurde, woraus geschlossen werden kann, dass 55 Tl-11 das N-terminale Peptid von Kl-24 war. Der verbleibende 50 Prozent aliquote Anteil von Tl-11 wurde anschliessend mit 12N HCl deblockiert und die Sequenz des behandelten Tl-11 wurde bestimmt. T12-18 enthielt einen C-terminalen Argininrest, während Kl-24 einen terminalen Lysinrest enthielt, und demzu-bo folge konnte angenommen werden, dass es das carboxy-terminale Peptid von Kl-24 war. Das Peptid K25-32 wurde vollständig sequeniert. Die ermittelten Daten unterstützen die vorgeschlagene Aminosäure-Sequenz des GAP aus den Resten 1-32.

Der verbleibende 45 Prozent aliquote Anteil des S-carboxami-b5 domethylierten GAP wurde mit dem Staphylokokkus aureus V8 verdaut. Die Peptide E1-6, E7-21 und E22-39 wurden durch rpHPLC getrennt. Ein 50 Prozent aliquoter Anteil der Peptide E1-6, E7-21 und E22-39 wurden dem automatischen

670 451

6

Edman-Abbau unterworfen. Beim Peptid E1-6 wurde keine N-terminale Aminosäure entdeckt. Die vollständigen Sequenzen von E7-21 und E22-39 dehnten sich über die vorgeschlagenen Strukturen des GAP von den Resten 1-39 aus und bestätigen die Vorschläge, welche für die Peptide T12-18, T19-24 und K25-32 gemacht wurden. Ein 50 Prozent aliquoter Anteil des Peptides El-6 wurde anschliessend mit 12N HCl deblockiert, möglicherweise durch eine säurekatalysierte N-O-Acetylverschiebung beim Ser-1. Es wurde die Sequenz des säurebehandelten El-6 bestimmt. Es blieb die Möglichkeit, dass zusätzliche Peptide in der Struktur über dem Rest Gly-39 hinaus vorhanden waren, da keine carboxypeptidase Behandlung des GAP das Gly-39 als C-terminale Aminosäure bestätigte. Die extensive Sequenzhomologie zwischen GAP und Crotamin, Myotoxin A und dem toxischen Peptid C macht die vorgeschlagene Struktur glaubhaft.

Strukturell gehört GAP zu der Familie der Klapperschlangen-toxine, einer Gruppe von Polypeptiden, welche eine Muskeldegeneration verursacht, indem das endoplasmische Reticulum als erstes Ziel geschädigt wird. Der Vergleich des GAP mit allen Pro-teinsequenzen, in der Protein Sequence Database (PIR Release 5,0, Mai 1985) enthüllte keine extensive Homologie mit anderen bekannten Sequenzen. Die Sequenzen des GAP und des Klap-perschlangentoxins können so aufgereiht werden, dass die Çysteinreste homologe Reihen zeigen, indem zwei Deletionen zwischen den Resten 10 und 11 des GAP eingesetzt werden. Die 5 Gegenwart von sechs Halb-Çystinresten in GAP lassen auf drei Disulfid-Brücken im Polypeptid schliessen. Die oben angegebene Aminosäuresequenz kann bezüglich der Aminosequenz unter Beibehaltung der Konformation und der cytotoxischen Aktivität -variiert werden.

io Die erfindungsgemässen Toxine können anstelle von Toxinen wie Ricin, Diphterie-Toxin oder Abrin in Übereinstimmung mit der bekannten Methodologie verwendet werden. Vergleiche zum Beispiel Jansen et al., Recept.-Mediated Binding Intern. Toxins Horm. (Proc. Symp.) 1980 (Pub. 1981) 351-356 (C.A. 95: 15 26185u); Masuho et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. (1979) 90:320-326; U.S. Patent No. 4 340 535.

Obschon die vorliegende Erfindung zum besseren Verständnis in Form von Beispielen erläutert wurde, ist es für den Fachmann naheliegend, dass gewisse Änderungen innerhalb der Erfmdungs-2o définition gemäss den beiliegenden Ansprüchen möglich sind.

G

Claims

670 451

2

PATENTANSPRÜCHE

1. Toxisches Peptid der Formel ppIQCiaa4aa5aa6GGaa9C2aauaa12aa13aa14C3aa16aa17aa18aa19SD aa22GKaa25aa26Giaa28aa29aa30WKC5 CeKaa36aa37aa38aa39pp2

worin pp1 den N-Terminus bedeutet und Wasserstoff oder eine Aminosäurekette von 1-20 Aminosäuren darstellt;

pp2 den C-Terminus bedeutet und Hydroxy oder eine Aminosäurekette von 1-20 Aminosäuren darstellt; die einzelnen Buchstaben C, D, G, K, Q, S und W ihre normale Bedeutung haben, wie sie im Ein-Buchstaben-Aminosäurencode vorgesehen sind; bis zu 5 deijenigen Aminosäuren, welche durch die Buchstaben aa mit Nummern bezeichnet sind, durch Bindungen ersetzt sein können, so dass sie Deletionen in der Struktur darstellen; wenn Cystein-Brücken vorhanden sind, Ci mit Cs, C2 mit Ca und C3 mit Cö unter Bildung von Cystein-Brücken verbunden sein können. aa4 eine aliphatische, saure oder aromatische Aminosäure ist; aa5 eine aliphatische, polare oder basische Aminosäure ist; aa6 eine aliphatische, geladene Aminosäure ist;

aa9 eine aromatische Aminosäure ist;

aa11 eine aliphatische, basische Aminosäure ist;

aa12 eine aromatische Aminosäure oder eine aliphatische, polare oder geladene Aminosäure ist;

aa13 eine aliphatische, nicht-polare oder geladene Aminosäure ist;

aa14 eine aliphatische, nicht-polare Aminosäure ist;

aa16 eine aliphatische, nicht-polare Aminosäure von 4-6 C-Atomen ist;

aa17 eine aliphatische, nicht-polare oder polare Aminosäure mit 3-5 C-Atomen ist;

aa18 eine aliphatische, nicht-polare oder basische Aminosäure mit 3-6 C-Atomen ist;

aa19 eine aliphatische, polare Aminosäure mit 3-4 C-Atomen ist;

aa22 eine aliphatische, nicht-polare oder aromatische Aminosäure ist;

aa25 eine aliphatische, neutrale Aminosäure mit 3-6 C-Atomen ist;

aa26 eine aliphatische, geladene oder nicht-polare Aminosäure mit 2-5 C-Atomen ist;

aa28 eine aliphatische, geladene Aminosäure mit 4-6 C-Atomen ist;

aa29 eine aliphatische Aminosäure mit 3-5 C-Atomen oder eine aromatische Aminosäure ist;

aa30 eine aliphatische, nicht-polare oder basische Aminosäure mit 4-6 C-Atomen ist;

aa36 eine aliphatische, basische Aminosäure ist;

aa37 eine aliphatische Aminosäure mit 2-3 C-Atomen oder eine aromatische Aminosäure ist;

aa38 eine aliphatische, neutrale Aminsoäure mit 2-4 C-Atomen ist und aa39 eine aliphatische, nicht-polare Aminosäure mit 2-6 C-Atomen ist, deren N-Teiminus blockiert oder unblockiert sein kann.
2. Toxisches Peptid gemäss Anspruch 1, worin der N-Terminus unblockiert ist.
3. Toxisches Peptid gemäss Anspruch 1, worin pp1 Wasserstoff ist und pp2 Hydroxy ist.
4. Toxisches Peptid gemäss Anspruch 3, worin der N-Terminus blockiert ist.
5. Toxisches Peptid gemäss Anspruch 1 der Formel

SQCEQEGG Je JF}} cpsr^sdtigk^gceplwkcck

Li S J-I M

W G G

i\

worin, wenn zwei Aminosäuren an der gleichen Stelle angegeben sind, eine der beiden Aminosäuren vorhanden sein kann.
6. Toxisches Peptid gemäss Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass nur die oberen Aminosäuren vorhanden sind.
7. Toxisches Peptid gemäss Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass nur die unteren Aminosäuren vorhanden sind.
8. Toxisches Peptid-Konjugat, dadurch gekennzeichnet, dass es ein toxisches Peptid gemäss Ansprach 1, welches kovalent mit einem Glied eines spezifischen Bindungspaares verbunden ist, enthält.
9. Toxisches Peptid-Konjugat gemäss Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Glied des spezifischen Bindungspaares ein Ligand ist.
10. Toxisches Peptid-Konjugat gemäss Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Glied des spezifischen Bindungspaares ein Rezeptor ist.
11. Toxisches Peptid-Konjugat gemäss Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Rezeptor ein Antikörper ist.
12. Toxisches Peptid-Konjugat gemäss Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass es als toxisches Peptid ein Toxid von Crota-lus atrox enthält.
13. Verfahren zur Hemmung des Wachstums einer vorbestimmten Gruppe von Zellen in einer Mischung von Zellen in vitro, dadurch gekennzeichnet, dass die Mischung von Zellen mit einem toxischen Peptid-Konjugat gemäss Anspruch 10, worin der Rezeptor für ein Antigen auf der Oberfläche der Gruppe von Zellen spezifisch ist, in einer solchen Menge kombiniert wird, die ausreichend ist, um das Wachstum der Zellen zu unterbrechen, wobei das Wachstum der Zellen gehemmt wird.