LU86683A1

LU86683A1 - Venin peptidique de serpent arretant la croissance

Info

Publication number: LU86683A1
Application number: LU86683A
Authority: LU
Original assignee: Oncogen
Priority date: 1985-11-22
Filing date: 1986-11-21
Publication date: 1987-06-26
Also published as: BE905790A; FI864715A0; NL8602939A; AU6556386A; US4731439A; FI864715A; IT8622425A0; AU6667590A; FR2590576A1; GB8627710D0; KR900006575B1; GB2185023A; ES2002915A6; GB2185023B; CN86108593A; DE3639796A1; KR870005014A; IT1207580B; GR862788B; CH670451A5

Description

i

Venin peptidique de serpent arrêtant la croissance.

ARRIERE-PLAN DE L'INVENTION.

Domaine de l'invention.

Les agents toxiques peuvent trouver différentes applications. En particulier, lorsque l'agent cytotoxique est spécifique ou peut par modification être rendu spécifique de souches particulières ou de types de cellules, il peut trouver son application dans CD.YC.4F - 1 - ON-0010 t l'élimination d'une souche particulière ou d’un type de cellule hors d'une culture ou d'un tissu comprenant différents types de cellules. Par exemple, dans le cas de cellules malignes, il est souhaitable de pouvoir éliminer spécifiquement les cellules malignes sans induire de mortalité notable des cellules normales ou saines.

Une source de toxines est le venin de serpent. De nombreuses toxines sont connues. Toutefois, il reste intéressant de découvrir des toxines supplémentaires aux fins d'augmenter la panoplie des toxines disponibles pour des applications particulières. Les toxines peuvent différer les unes des autres par la réponse d'immunité, la facilité de combinaison avec d'autres réactants, le site d'action de la toxine et ainsi de suite. La découverte d'une nouvelle toxine de venin de serpent nécessite une épreuve d'utilité, des extractions détaillées, une purification et une analyse visant à établir la pureté de la toxine et la séquence de ses aminoacides.

Aperçu de la littérature compétente.

Les 'peptides cytotoxiques isolés du venin de différentes espèces de crotale ont fait l'objet d'une étude de la séquence et ont été isolés et décrits. La myotoxine dérive du venin du crotale de prairie, Crotalus (Fox et al., Biochemistry (1979) ljî : 678-83); la crotamine dérive du venin du crotale d'Amérique du Sud, Crotalus durissus terrificus (Lauree et Hoppe-Seyler, Physiol. Chem. (1975) 356 ; 213-15) et le peptide toxique C dérive du venin du crotale du Pacific Sud, Crotalus viridis helleri (Maeda et al., Toxicon (1978) 16 : 431-41).

APERCU DE L'INVENTION.

L'invention a pour objet de nouveaux peptides cytotoxiques ou inhibiteurs de la croissance des CD.YC.4F - 2 - ON-0010 cellules qui présentent une relation avec un peptide isolé du venin du crotale dit Western Diamondback Crotalus atrox. Les produits de conjugaison de ces peptides avec des membres de combinaison spécifique, par exemple des ligands et récepteurs, peuvent être utilisés pour éliminer sélectivement des cellules hors d'un mélange de cellules.

DESCRIPTION DES FORMES DE REALISATION SPECIFIQUES.

L'invention a pour objet des agents cytotoxiques comprenant un peptide d'environ 6 kilodaltons (kD) isolé du venin de Crotalus atrox, leurs analogues cytotoxiques et les produits de conjugaison des agents cytotoxiques avec des peptides, en particulier des ligands et récepteurs pour la combinaison spécifique avec un membre de combinaison complémentaire. La partie active comprend au moins environ 15 aminoacides, d'habitude au moins environ 25 aminoacides, plus souvent au moins environ 35 aminoacides, mais pas plus d'environ 60 aminoacides et d'habitude pas plus d'environ 50 aminoacides. Ces parties actives peuvent être unies â une grande variété d'autres composés décrits ci-après.

Les peptides faisant l'objet de l'invention répondent à la formule : pplQCiaa^aa^aa^GGaa^C2aaHaal2aa^3aa^^C3aa^^aal^ aal8aa19gDaa22QKaa25aa26Q^aa28aa29aa30 WKC5CôKaa2^aa27aa38aa39pp2 dans laquelle : ppl est l'extrémité N-terminale et peut être un atome d'hydrogène, un aminoacide unique, en particulier un aminoacide polaire, plus particulièrement un aminoacide hydroxy-substitué ou un aminoacide basique, ou bien un polypeptide de 2 à 20 et plus habituellement CD.YC.4F - 3 - ON-0010 de 2 à 10 aminoacides, qui peut remplir différentes fonctions, par exemple comme radical de liaison, comme radical de modification ou analogue; pp2 est l'extrémité C-terminale et peut être le radical hydroxyle terminal, un aminoacide unique, en particulier un aminoacide polaire, plus particulièrement un aminoacide contenant un radical carboxamido, ou bien un polypeptide de 2 à 20 et plus habituellement de 2 à 10 aminoacides, qui peut remplir les mêmes fonctions que pp-*·/ les lettres individuelles ont leur signification normale comme partie du code des aminoacides à une lettre, qui est indiqué ci-après? jusqu'à 5 et habituellement pas plus d'environ 3 des aminoacides peuvent servir de liaison, de façon qu'il y ait des délétions dans la structure;

Ci avec C5, C2 avec C4 et C3 avec Cß forment des ponts de cystéine, lorsque des ponts de cystéine existent; aa^ est un aminoacide aliphatique acide ou aromatique, en particulier D, E ou H; aa$ est un aminoacide aliphatique polaire ou basique, en particulier carboxamido-substitué ou basique, plus particulièrement N, Q, K ou R; aa^ est un aminoacide aliphatique chargé, soit acide soit basique, en particulier D, E, K ou R? aa^ est un aminoacide aromatique, en particulier F, H, W ou Y; aall est un aminoacide aliphatique chargé, en particulier un aminoacide basique, plus particulièrement K ou R; aai2 est un aminoacide aromatique ou un aminoacide aliphatique polaire ou chargé, en particulier acide ou neutre, plus particulièrement hydroxy-substitué en tant que neutre, notamment F, H, W, Y, D, CD.YC.4F - 4 - ON-0010 E, S ou T; aa!3 est un aminoacide aliphatique non polaire ou chargé, en particulier non polaire ou basique, plus particulièrement de 4 à 6 atomes de carbone, notamment L, I, V, K ou R; aa!4 est Un aminoacide aliphatique non polaire, en particulier de 4 à 6 atomes de carbone, à savoir L, I ou V; aa!6 est un aminoacide aliphatique non polaire de 4 à 6 atomes de carbone, en particulier P, I, L ou V; aa!7 est un aminoacide aliphatique non polaire ou polaire de 3 à 5 atomes de carbone, en particulier hydroxy-substitué lorsqu'il est polaire, plus particulièrement S, T, A, P ou V; aa18 est un aminoacide aliphatique chargé ou non polaire, en particulier basique lorsqu'il est chargé, et de 3 à 6, mais habituellement de 4 à 6 atomes de carbone, en particulier P, I, L, V, K ou R; aa^8 est un aminoacide aliphatique polaire de 3 ou 4 atomes de carbone, en particulier hydroxy-substitué, plus particulièrement S ou T; aa22 est un aminoacide aliphatique non polaire ou aromatique, de 5 ou 6 atomes de carbone lorsqu'il est aliphatique, en particulier, F, I, L ou V; aa25 est un aminoacide aliphatique neutre de 3 à 6 atomes de carbone, en particulier de 4 à 6 atomes de carbone qui est polaire ou non polaire, et qui contient un atome de soufre lorsqu'il est polaire, plus particulièrement Μ, I, L ou V; aa28 est un aminoacide aliphatique chargé ou non polaire, en particulier acide lorsqu'il est polaire, de 2 à 5 et habituellement de 2 à 4 atomes de carbone, plus particulièrement G, A, P, D ou E; aa28 est un aminoacide aliphatique chargé de 4

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à 6 atomes de carbone, qui peut être basique ou acide, en particulier D, E, K ou R? aa2^ est un aminoacide aliphatique ou aromatique, de 3 à 5 atomes de carbone lorsqu'il est aliphatique, en particulier A, P, V, F, H, W ou Y; aa33 est un aminoacide aliphatique neutre non polaire ou basique, de 4 à 6 et habituellement de 5 ou 6 atomes de carbone lorsqu'il est neutre non polaire, en particulier I, L, V, K ou R? aa33 est un aminoacide aliphatique basique, en particulier K ou R; aa3? est un aminoacide aliphatique ou aromatique, de 2 ou 3 atomes de carbone lorsqu'il est aliphatique, en particulier G, A, F, H, W ou Y; aa33 est un aminoacide aliphatique neutre polaire ou non polaire de 2 à 4 atomes de carbone, en particulier hydroxy-substitué lorsqu'il est polaire, plus particulièrement G, A, P, S ou T; aa33 est un aminoacide aliphatique non polaire de 2 à 6 atomes de carbone et en particulier de 2 ou 3 atomes de carbone, particulièrement G, A, P, I, L ou V.

Les groupes pour les différents aminoacides et les désignations par une lettre sont précisés ci-après : aliphatique neutre non polaire G,A,P,V,I,1

polaire S,T,M,C,N,Q

chargé

acide D,E

basique K,R

aromatique F,H,W,Y

G - glycine N - asparagine CD.YC.4F - 6 - ON-0010 A - alanine Q - glutamine P - proline D - acide aspartique V - valine E - acide glutamique I - isoleucine K - lysine L - leucine R - arginine S - sérine F - phénylalanine T - thréonine H - histidine M - méthionine W - tryptophane C - cystéine Y - tyrosine

Un intérêt particulier est offert par les peptides de la formule suivante :

F R LL

SQCEQEGG C F

H K VI

P T I L

C SR SD GK GCEPLWKCCK

L S L M

R

W G G

K

dans laquelle : lorsque deux aminoacides sont indiqués au même site, l'un ou l'autre peut être présent à ce site, mais il est préféré que les aminoacides indiqués au-dessus de la ligne aillent ensemble et que les aminoacides indiqués au-dessous de la ligne aillent ensemble.

Il convient d'entendre, en outre, que des substitutions conservatives sont tolérables. Par substitution conservative, on entend que les aminoacides ci-après sur la même ligne peuvent être remplacés les uns par les autres.

CD.YC.4F - 7 - ON-0010

G, A V, I, L D, E K, R S, T

P, H, W, Y

L'extrémité terminale du peptide peut être bloquée ou non bloquée, le blocage se faisant d'habitude à l'aide d'un acide aliphatique, par exemple l'acide acétique ou l'acide formique, à l'aide d'un agent d’alcoylation, etc. Les composés faisant l'objet de l'invention se sont révélés stables à la chaleur et aux acides lors des épreuves décrites dans la section expér imentale.

Un intérêt particulier est offert par le peptide arrêtant la croissance d'origine naturelle qui a une pureté d'au moins environ 90%, de préférence de 95% et plus avantageusement de 99%. Il peut être utilisé tel quel ou conjointement avec d'autres toxines.

Les composés cytotoxiques ou inhibiteurs de croissance qui font l'objet de l'invention peuvent être conjugués avec une grande variété de ligands et récepteurs suivant des techniques classiques. Les radicaux fonctionnels intervenant dans la liaison peuvent être divers radicaux acides, par exemple carboxyle, sul-fonyle et phosphoryle, des combinaisons de thiol et d'oléfines, des radicaux dithio, des aldéhydes, des radicaux azo, des radicaux diazo, etc. Pour la plupart, il convient d'utiliser des composés difonctionnels qui peuvent être mis à réagir à des stades successifs, bien que des composés difonctionnels qui réagissent simultanément puissent être utilisés aussi. Des exemples de réactants sont le g1utaraldéhyde, le formaldéhyde, CD.YC.4F - 8 - ON-0010 l'acide para-maléimidobenzoïque, l'acide méthyldithio-acétique, l'acide diazobenzoïque, etc. Le mode opératoire particulier qui est appliqué pour unir la partie cytotoxique à un membre de combinaison spécifique, n'est pas critique aux fins de l'invention.

Des membres de combinaison spécifique sont des ligands et récepteurs, auquel cas les membres de combinaison spécifique servent à établir une combinaison spécifique sur une cible particulière. Par exemple, les cellules portent normalement des antigènes de surface et des récepteurs qui sont caractéristiques pour un type de cellule particulier. Ainsi, au moyen de ligands ou récepteurs appropriés conjugués avec l'agent toxique, celui-ci peut être dirigé préférentiellement vers les cellules portant le membre de combinaison spécifique réciproque.

Différents composés qui peuvent être utilisés comme ligands sont notamment les stéroïdes, la lipoprotéine de basse densité, les facteurs de croissance, les protéines virales, etc. Au contraire, les récepteurs naturels ou de préférence les immunoglobulines ou leurs fragments peuvent être utilisés lorsque les récepteurs sont dirigés vers des antigènes de surface spécifiques. Des immunoglobulines offrant de l'intérêt sont notamment IgA, IgD, IgM, IgE et IgG, de préférence IgG, y compris l'un quelconque des sous-types. Les immunoglobulines peuvent provenir d'une source appropriée quelconque, en particulier la souris ou l'être humain. Les immunoglobulines peuvent provenir d'hybridomes, de cellules transformées, par exemple de lymphocytes transformés par le virus d'Epstein-Barr, ou bien s'obtenir par la technologie de 1'ADN recombinant. En particulier, des régions variables de la souris peuvent être unies à une région constante de l'être humain ou d'un autre hôte pour donner des immunoglobulines

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chimères qui peuvent offrir un pouvoir antigénique plus faible. De plus, il n'est pas nécessaire d'utiliser l'immunoglobuline complète, mais plutôt les fragments de celle-ci, par exemple Fab, F(ab')2» Fv» etc.

Le ligand et la toxine peuvent être unis par des liaisons qui sont stables dans la cellule cible ou qui sont instables de fagon que la toxine et le réactant de ciblage puissent se séparer au sein de la cellule. Il est souhaitable que la toxine soit endocy-tosée pour exercer son effet à l'intérieur de la cellule. Lorsque l'agent de ciblage n'a pas d'effet nuisible sur l'activité toxique de la toxine, il n'est pas nécessaire de prévoir une liaison propre à se rompre. Lorsqu'une liaison propre â se rompre est souhaitée, un pont disulfure qui peut être réduit dans la cellule hôte peut être utilisé avec avantage.

Les produits de conjugaison peuvent présenter une grande variété de rapports entre l'agent de ciblage, le membre de combinaison spécifique et la toxine. D'habitude, il y aura au moins une toxine par agent de ciblage, mais pas plus d'environ une toxine pour 0,5 kilodalton (kD) d'agent de ciblage. D'habi tude, il y aura au moins une molécule de toxine pour 100 kD de l'agent de ciblage et plus habituellement au moins une pour 50 kD de l'agent de ciblage. Lorsque l'agent de ciblage est petit, comme un haptène de bas poids moléculaire, il peut y avoir deux ou plusieurs ligands par toxine, mais habituellement pas plus d'environ cinq ligands par toxine.

Les composés faisant l'objet de l'invention peuvent être utilisés in vitro ou in vivo. Pour une application in vitro, ils peuvent être utilisés pour détruire sélectivement des cellules qui peuvent être distinguées d'autres cellules dans une culture ou dans un tissu. Les composés faisant l'objet de l'invention CD.YC.4F - 10 - ON-0010 peuvent être ajoutés au milieu en quantité suffisante pour détruire les cellules non désirées. Par exemple, pour la détection d'antigènes d'histocompatibilité particuliers, on peut ajouter des réactants contenant des anticorps spécifiques à l'égard de l'antigène d'histocompatibilité particulier. En conséquence de l'addition d'un colorant qui est absorbé uniquement par les cellules mortes, la présence du colorant dans les cellules est révélatrice du type d'histocompatibilité particulier. La quantité de toxine à effet de cible peut varier beaucoup et est portée à l'optimum dans chaque cas particulier pour le travail in vitro. Il convient de ne pas utiliser une trop grande quantité de la toxine à effet de cible parce qu'il peut en résulter des combinaisons non spécifiques et des faux positifs, mais il convient de ne pas en utiliser une quantité trop faible qui peut conduire à de faux négatifs à cause d'un faible degré de combinaison qui ne peut être détecté aisément.

Pour une application in vivo, le produit de conjugaison peut être administré par voie parentérale ou bien par injection, en particulier intraveineuse. La quantité du produit de conjugaison utilisée varie beaucoup suivant la nature de la cellule qu'il faut tuer, l'abondance de la population cellulaire, la résistance de ces cellules au produit de conjugaison, l’efficacité du produit de conjugaison, etc. Lors de l'administration en un site autre que spécifique, la quantité de protéine varie habituellement d'environ l^u.g à 10 mg et d'habitude jusqu'à 2 mg par kilo de poids du corps de l'hôte. A un site spécifique, la quantité de protéine tombe dans la partie inférieure de l'intervalle de concentration. Le produit de conjugaison peut être administré dans un milieu physiologiquement acceptable, comme de la solution physiologique CD.YC.4F - 11 - ON-0010 salée tamponnée au phosphate, de la solution physiologique salée ou tout autre véhicule approprié. A l'état de poudre, le produit de conjugaison peut être mis en composition avec d'autres agents qui peuvent assurer l'apport de la composition à un organe particulier, un dégagement prolongé ou un effet semblable. La façon dont les compositions protéiniques peuvent être administrées à un hôte est amplement illustrée dans la littérature spécialisée et n'est pas envisagée plus en détail ici.

Les cellules des tumeurs et les microorganismes pathogènes offrent un intérêt particulier comme cellules cibles. Du fait qu'elles sont fort répandues, les cellules du carcinome pulmonaire, les cellules du cancer du côlon et du rectum, les cellules du cancer mammaire, les cellules du carcinome utérin, les cellules du carcinome de la prostate, les cellules du cancer de la vessie et des reins, les cellules du lymphome, les cellules de la leucémie et celles de la maladie de Hodgkin offrent un intérêt particulier.

Des exemples de micro-organismes pathogènes sont des protozoaires, comme Plasmodium vivas, P. malariae, P. ovale et P. falciparum, des bactéries Gram-négatives, comme Pseudomonas, Klebsiella et

Neisseria, des bactéries Gram-positives, et ainsi de suite.

PARTIE EXPERIMENTALE.

MATERIELS ET PROCEDES.

Purification du peptide inhibiteur de croissance du venin de Crotalus atrox.

On isole le composé peptidique brut en collectant du venin de Crotalus atrox qu'on clarifie par centrifugation à basse vitesse avant la lyophilisation. On dissout le venin lyophilisé (10 mg/ml) dans de l'acide acétique IM et on sépare les insolubles par CD.YC.4F - 12 - ON-0010 centrifugation à basse vitesse.

On exécute la purification initiale en déposant l'échantillon par quantités de 7,5 ml sur une colonne de Bio-Gel P10 mise à l'équilibre avec de l'acide acétique IM, puis on recueille les fractions (3,5 ml) et on en prélève des aliquotes qu'on lyophilise. On vérifie initialement sur les aliquotes l'inhibition de la synthèse de 1'ADN dans des cultures de cellules du carcinome pulmonaire humain A549. En résumé, on dépose 20.000 cellules A549 dans des plaques à 96 cupules et après y avoir immobilisé les cellules, on traite celles-ci à l'aide des fractions appropriées de la colonne. Cinq jours plus tard, on compte les impulsions des cupules avec de la 125i_34SOXyuridine et on mesure la synthèse de 1'ADN par rapport aux cupules témoins, sur base de l'incorporation de la 125χ-désoxyuridine. On observe deux pics majeurs d'inhibition. On purifie davantage, en appliquant la chromatographie liquide sous haute pression (HPLC), un premier pic d'activité inhibitrice de bas poids moléculaire qui s'élue au voisinage du marqueur insuline 6.000Mr.

On lyophilise l'échantillon et on le remet en suspension dans de l'acide trifluoroacétique (TFA) à 0,05% dans de l'eau purifiée de qualité HPLC (Water's Associates). On sépare les insolubles par centrifugation et on injecte l'échantillon dans une colonne Ci8-N°vopak. On élue l'échantillon avec un gradient linéaire de 20 jusqu'à 60% d'acétonitrile dans le TFA à 0,05%, avec un débit de 1 ml par minute à 22°C. On recueille séparément chaque peptide absorbant A214 et on vérifie l’inhibition de la synthèse de l'ADN sur des aliquotes. Le peptide élué à 54% d'acétonitrile inhibe la synthèse de l'ADN des cellules A549 et aucune inhibition n'est observée sur d'autres fractions de la CD.YC.4F - 13 - ON-0010 colonne. L'analyse SDS-PAGE de cette activité révèle une Lande unique colorée par l'argent et aucune autre bande n'est visualisée sur le gel, ce qui suggère que le peptide a été purifié jusqu'à homogénéité. Morphologie des cellules inhibées.

Les cellules inhibées manifestent une altération morphologique frappante 24 heures après le traitement au moyen de ce peptide, qui est appelé "peptide inhibiteur de croissance" (GAP). Tant les cellules de tumeurs humaines que les fibroblastes non transformés sont inhibés lors de cet essai (50% de cellules ensemencées) à une concentration en peptide d'environ 100 ng/ml. Après le traitement, les cellules deviennent rondes et la plupart des protubérances dendritiques sont perceptiblement absentes, mais les cellules continuent d'adhérer sur la plaque. Cet effet est irréversible du fait que le lavage des cellules traitées et un nouvel apport de milieu frais contenant 10% de sérum ne permettent pas aux cellules de reprendre leur phénotype d'origine.

Structure chimique du GAP.

On détermine la séquence des aminoacides du GAP par analyse de la microséquence des peptides obtenus par digestion enzymatique de GAP réduit et S-car-boxamidométhylé avec (a) 1'endoprotéinase Lysine-C, (b) la TPCK-trypsine (L-(l-tosylamido-2-phényl)-éthyl-chlorométhylcétone) et (c) V8 de Staphylococcus aureus. On purifie les fragments peptidiques par HPLC à inversion de phase en utilisant des solvants volatils. On met à incuber à la température ambiante pendant 16 heures dans du HCl 12N les peptides dont la fonction amino terminale est bloquée. On sèche ensuite les échantillons par lyophilisation. On soumet les peptides à la dégradation d'Edman dans un appareil automatique d'étude de la séquence des protéines dit "Gas Phase CD.YC.4F - 14 - ON-0010

Protein Sequencer", modele 470A (Applied Biosystems, Inc.). On analyse par HPLC à inversion de phase les aminoacides sous forme des phénylthiohydantoïnes.

*

La séquence des aminoacides du GAP est la suivante :

SQCEQEGGFCRFLLCPSRTSDIGKL

—i

GCEPLWKCCKRWGG

Cette structure se détermine par analyse de la microséquence. En résumé, on réduit le GAP au moyen du dithio-thréitol, on forme le dérivé S-carboxamidométhylé au moyen d1iodoacétamide, et on soumet une aliquote de 10% à la dégradation d'Edman sur appareil automatique. On ne décèle pas d'aminoacide N-terminal, même après exécution de plusieurs cycles de dégradation d'Edman, ce qui suggère que le radical amino terminal du GAP est bloqué.

On met une aliquote de 45% du GAP S-carboxamidométhylé à digérer avec l'enzyme Lysine-C. On sépare par HPLC à inversion de phase les peptides Kl-24 et K25-32. Les peptides K33-35 et K36-39 ne sont pas retenus sur la colonne et s'éluent à l'état de mélange. On n'essaie pas de purifier ces peptides. On soumet une aliquote de 50% des peptides Kl-24 et K25-32, respectivement, à la dégradation d'Edman sur appareil automatique. On ne décèle pas d'aminoacide N-terminal par établissement de la séquence de Kl-24. On soumet 1'aliquote restante de 50% de Kl-24 ensuite à la digestion avec de la TPCK-trypsine. On sépare par HPLC à inversion de phase les peptides tryptiques Tl-11, T12-18 et T19-24 et on les soumet à la dégradation d'Edman. On ne décèle pas d'aminoacide N-terminal sur une aliquote de 50% du peptide Tl-11 lorsqu'on en CD.YC.4F - 15 - ON-0010 détermine la séquence, ce qui suggère que Tl-11 est le peptide N-terminal de Kl-24. On déprotège ensuite , 1'aliquote restante de 50% de Tl-11 dans le HCl 12N et on détermine la séquence du Tl-11 traité en milieu acide. T12-18 contient un résidu d'arginine C-terminal, tandis que Kl-24 contient un résidu de lysine C-terminal, ce qui le fait présumer être le peptide carboxy-terminal de Kl-24. On détermine la séquence complète du peptide K25-32. Les résultats confirment la séquence proposée pour les aminoacides de GAP à partir des résidus 1-32.

On met 1'aliquote restante de 45% de GAP S-carboxamidométhylé à digérer avec du V8 de Staphylo-coccus aureus. On sépare par HPLC à inversion de phase les peptides El-6, E7-21 et E22-39. On soumet une aliquote de 50% des peptides El-6, E7-21 et E22-39 à la dégradation d'Edman sur appareil automatique. On ne décèle pas d'aminoacide N-terminal pour le peptide El- 6. Les séquences complètes d'E7-21 et E22-39 prolongent la structure proposée du GAP à partir des résidus 1-39 et confirment les attributions faites pour les peptides T12-18, T19-24 et K25-32. On déprotège ensuite une aliquote de 50% du peptide El-6 dans du HCl 12N, éventuellement à l'intervention d'un déplacement d'acétyle N-O à Ser-1 sous catalyse acide. On détermine la séquence d'El-6 traitée en milieu acide. La possibilité subsiste que des peptides supplémentaires puissent être présents dans la structure au-delà du résidu Gly-39 du fait qu'aucun traitement par la carboxypeptidase sur le GAP ne confirme GLY-39 comme l'aminoacide C-terminal. Toutefois, l'ample homologie de séquence entre le GAP et la Crotamine, la Myotoxine A et le peptide toxique C donne de la crédibilité à la structure proposée.

Du point de vue de la structure, le GAP

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appartient à la famille des toxines de crotale, qui est un ensemble de polypeptides qui provoquent la dégénérescence musculaire en endommageant le réticulum endoplasmique comme cible principale. La comparaison entre le GAP et toutes les séquences de protéines contenues dans la banque de données dite Protein Sequence Database (PIR Release 5.0, Mai 1985) ne révèle aucune homologie étendue avec toute autre séquence connue. Il est possible d'aligner les séquences du GAP et des toxines de crotale de façon que les résidus de cystéine occupent des positions homologues en insérant deux délétions entre les résidus 10 et 11 du GAP. La présence de six résidus d ’hémicystine dans le GAP suggère la présence de trois points disulfure dans le polypeptide. La séquence d'aminoacides exposée ci-dessus est susceptible d'importantes modifications pour ce qui est de la succession des aminoacides tout en conservant la structure conformationnelle et l'activité cytotoxique.

Les toxines faisant l'objet de l'invention peuvent être utilisées au lieu de toxines telles que la ricine, la toxine diphtérique, l'abrine et d'autres semblables suivant la méthodologie connue. On peut consulter, par exemple, Jansen et al., Recept.-Mediated Binding Intern. Toxins Horm. [ Proc. Symp. J 1980 (Pub. 1981) 351-356 (C.A. 95 : 126185u); Masuho et al.,

Biochem. Biophys. Res. Comm. (1979) 90 : 320-326 et brevet E.U.A. 4.340.535.

Bien que divers modes et détails de réalisation aient été décrits pour illustrer l'invention, il va de soi que celle-ci est susceptible de nombreuses variantes et modifications sans sortir de son cadre.

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Claims

2. Peptide toxique suivant la revendica tion 1, dans lequel l'extrémité N-terminale est non bloquée.
3. Peptide toxique suivant la revendication 1, dans lequel ppl est un atome d'hydrogène et pp2 est un radical hydroxyle.
4. Peptide toxique suivant la revendica- CD.YC.4F - 19 - ON-0010 » tion 3, dans lequel l'extrémité N-terminale est bloquée.
5. Peptide toxique de la formule : k P R LL SUCEQEGG C F H K VI P T I L C SR SD GK GCEPLWKCCK L S L M R W G G K dans laquelle : lorsque deux aminoacides sont indiqués au même site, l'un ou l'autre arainoacide peut être présent.
6. Peptide toxique suivant la revendication 5, dans lequel seuls les aminoacides supérieurs sont présents.
7. Peptide toxique suivant la revendication 5, dans lequel seuls les aminoacides inférieurs sont présents.
8. Produit de conjugaison de peptide toxique comprenant un peptide toxique suivant la revendication 1, uni par covalence à un membre d'une paire de combinaison spécifique.
9. Produit de conjugaison de peptide toxique 1 suivant la revendication 8, dans lequel le membre de la paire de combinaison spécifique est un ligand. " 10,- Produit de conjugaison de peptide toxique suivant la revendication 8, dans lequel le membre de la paire de combinaison spécifique est un récepteur. Il·- Produit de conjugaison de peptide toxique suivant la revendication 10, dans lequel le récepteur CD.YC.4F - 20 - ON-OOIO ¥ * * est un anticorps.
12. Produit de conjugaison de peptide toxique comprenant une toxine de Crotalus atrox unie par covalence à un membre d'une paire de combinaison spécifique.
13. Procédé pour inhiber la croissance d'un groupe déterminé au préalable de cellules dans un mélange de cellules, caractérisé en ce qu'on combine le mélange de cellules avec un produit de conjugaison de peptide toxique suivant la revendication 10, dans lequel le récepteur est spécifique pour un antigène à la surface des cellules du groupe, en une quantité suffisante pour arrêter la croissance de ces cellules, de façon que la croissance de ces cellules se trouve inhibée. CD.YC.4F - 21 - ON-OOIO