JPH03503641A

JPH03503641A - 発現のための突然変異体ヒトアンギオゲニン（卓越したアンギオゲニン活性を有する血管形成誘導因子）遺伝子及び発現方法

Info

Publication number: JPH03503641A
Application number: JP1504312A
Authority: JP
Inventors: ハーパー，ジエフリイ　ダブリユー・; ヴアリー，バート　エル．
Original assignee: プレジデント　エンド　フエローズ　オブ　ハーヴアード　カレツジ
Priority date: 1988-03-28
Filing date: 1989-03-20
Publication date: 1991-08-15
Also published as: WO1989009277A1; DE68910354D1; AU3433189A; EP0335243A2; AU621358B2; US4900673A; KR900700609A; DK233390D0; EP0335243A3; ATE96844T1; DE68910354T2; PT90129A; DK233390A; CA1331356C; IE890954L; EP0335243B1; ZA892270B

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】発現のための突然変異体ヒトアンギオゲニン（卓越したアンギオゲニン活性を有する血管形成誘導因子）遺伝子及び発現方法発明の分野本発明は、部位特異的変異誘発及び組換えＤＮＡ技術により製造される突然変異体アンギオゲニン（血管形成因子）遺伝子に関し、さらに、増大した血管形成活性及びリボヌクレオリティック活性を有する突然変異体蛋白をコード化する突然変異体アンギオゲニン遺伝子に対するＤＮＡ配列を含む。更に、本発明は増大した血管形成活性及びリボヌクレオリティック活性を有する突然変異体°アンギオゲニン蛋白を発現させる方法及び生成した突然変異体アンギオゲニン蛋白に関する。

今や、予想外にも、アンギオゲニン遺伝子の部位特異的な突然変異誘発により、ヒトアンギオゲニンのｌ１６位又はこれに相当する部位のアスパラギン酸（Ａｓｐ−１１６）を他のアミノ酸、特に、アスパラギン（Ａｓｎ）、アラニン（Ａ　ｌａ）又はヒスチジン（Ｈｉｓ）で置換すると、アンギオゲニンの血管形成活性及びリボヌクレオリティック活性の両方を有意に高めることが見い出された。

背景技術血管形成、血管網目の発達過程は固定腫瘍の増殖に必須であり、かつ正常の傷治療及び増殖過程の一成分である。それは、また、アテローム発生、関節炎及び糖尿病性網膜症の病態生理学においても関係している。それは、特定の刺激に向けた、新たな毛細血管の方向付けられた増殖により特徴付けられる。この内皮細胞の移動により媒介される増殖は、内皮細胞有糸分裂とは独立に進行することがある。

血管形成過程の原因となる分子メツセンジャーは長いこと探究されてきた。グリーンブラット及びシュビック（Ｇｒｅｅｎｂｌａｔｔ　ａｎｄ　５ｈｕｂｉｋ）は、腫瘍誘発の新血管Ｎａｔ１．　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、　４１　：　ｌ　ｌ　１−１２４．１９６８）。次いで、種々゛の可溶性媒介物質が新車管形成の誘発に関連してきた。これらには、プロスタグランジン類（アウエルバ−／　ハ（Ａｕｅｒｂａｃｈ　）　、Ｐｉｃｋ　ａｎｄ　Ｌａｎｄｙ編「リンホカイン類（Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅｓ）　Ｊ　、６９−８８、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋｓ　　ｌ　９８１　）　、ヒトウロキナーゼ［ベルマン等（Ｂｅｒｍａｎ　ｅｔ　ａｌ）　、Ｉｎｖｅｓｔ、　Ｏｐ−ｔｈａｌｍ、　Ｖｉｓ、　Ｓｃｉ、　２２　：１９１−１９９．１９８２］、銅［ラジュ等（Ｒａｊｎ　ｅｔ　ａｌ、　）　、Ｊ、　Ｎａｔｌ、　ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ、　６９　：　１１８３−１１８８．１９８２］及び各種“血管形成因子”が含まれる。

血管血管因子は腫瘍細胞、創傷流体Ｃパンダ等（Ｂａ−ｎｄａ　　ｅｔ　　ａｌ）、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ　Ｓ　Ａ　７９　　ニア７７３ −７７７７．１９８２；パンダ等（Ｂａｎｄａ　ｅｔａｌ）、米国特許第４．５０３．０３８号明細書）］及び網膜細胞［ダモーレ（Ｄ’Ａｍｏｒｅ）　、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ７８：３０６８　３０７２．１９８１１に由来している。腫瘍由来の血管形成因子は、一般的にわずかに特徴付けられているにすぎない。フォークマン等（Ｆｏｌｋｍａｎ　ａｔ　ａｌ、）（Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　　１３３　：　２７５−２８８．１９７１）は、ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）２５６ラツト腹水腫瘍から腫瘍血管形成因子を分離した。この因子は毛細血管内皮細胞に対して有糸分裂誘発性であり、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）により不活性化された。チュアン等（Ｔｕａｎ　ｅｔ　ａｌ）　　（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１２　：　３１５９−３１６５．１９７３）は、ウォーカー２５６腫瘍の非ヒストン蛋白中に有糸分裂誘発性及び血管形成活性を見い出した。活性分画は、蛋白と炭水化物の混合物であった。種々の動物及びヒト腫瘍が血管形成因子を産生することが示されたが［フィリップ及びクマン（Ｐｈ１ｌｌｉｐｓ　ａｎｄ　Ｋｕｍａｎ）、Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ２３　：　８２−８８．１９７９］、これらの因子の化学的性質は決定されなかった。ウォーカー２５６腫瘍からの低分子量非蛋白成分も、又、血管形成性及び有糸分裂誘発性であることが示された［ワイス等（Ｗｅｉｓｓｅｔ　ａｌ）　、Ｂｒ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ　４０　：　４９３−４９６．１９７９１゜４００−８００ダルトンの低分子量の血管形成因子がファンセロ−等（Ｆｅｎ５ｅｌａｕ　ｅｔ　ａｌ）により均質になるまで精製されたが（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５６　：９６０５−９６１１，１９８１）、これはそれ以上特徴付けられなかった。ヒトの肺腫瘍の細胞が高分子量担体及び低分子量、恐ら゛く非蛋白、の活性成分から成る血管形成因子を分泌することが示された［クマール等（Ｋｕｍａｒ　ｅｔ　ａｌ）　、Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ　３２：　４５　ｌ　−４６４，１９８３］、バレー等（Ｖａｌｌｅｅ　ｅｔ　ａｌ）は、ウォーカー２５６腫瘍からの３つの分画に関連しＩ；血管形成活性を見出した（Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ　４１　：　Ｉ　 −１５，１９８５）、ｌ−ルバート等（Ｔｏｌｂｅｒｔ　ｅｔ　ａｌ）は、ヒト腺癌セルラインＨＴ−２９からの血管形成因子の産生を開示したが（米国特許第４，２２９．５３１号明細書）、この物質は部分的に精製されているにすぎず、化学的に特徴付けられなかつＩ；。上述の血管形成因子の製造に関連する遺伝子の単離は、少なくとも一部において、これらの因子の純度及び特徴付けの欠除のために今迄報告されていない。

血管形成因子の単離は、高性能液体クロマトグラフィー［パンダ等（Ｂａｎｄａ　ｅｔ　ａｌ）　、前記］　；溶媒抽出［フォークマン等（Ｆｏｌｋｍａｎ　ｅｔ　ａｌ）　、前記］；シリカゲル上クロマトグラフィ　［７アンセロー等（Ｆｅｎｓｅｌａｕ　ｅｔ　ａｌ）　、前記］　　、ＤＥＡＥセルロース［ワイス等（Ｗｅｉｓｓ　ｅｔ　ａｌ）　、前記］又はセファデックス［チュアン等（Ｔｕａｎ　ｅｔ　ａｌ）　、前記］及びアフィニティクロマドグラフィー［ワイス等（ｗｅｉｓｓ　ｅｔ　ａｌ）　、前記］を使用している。

最近バレー（ｖａｌ　ｌｅｅ　ａｔ　ａｌ）等は、ヒト腺癌のセルラインから血管形成性蛋白を精製しｌ；（米国特許第４．７２７，１３７号明細書、これは参考として本発明に組み込まれる）。この蛋白は、正常のヒト血漿中で同定された［シャピロ等（Ｓｈａｐｉｒｏ　ｅｔ　ａｌ）　、Ｂｉｏｃｈｅｍ。

２６　：５１４１−５１４６、ｌ　９８７］。このアンギオゲニンとして知られる精製蛋白は、化学的に特徴付けられ、かつそのアミノ酸配列が決定された。明らかに関連するものであるが、２個の顕著な生物学的活性がヒト腫瘍由来のアンギオゲニンに対して示された。

ｍｌに、これはインビボにおいて非常に強力な血管形成因子として作用することが報告された［フェット等（Ｆｅｔｔ　ａｔ　ａｌ）　、　’Ｂｉｏｃｈｅ＋ｎ、　２４　：　５４８０−５４５８．１９８５］。第２に、これは特徴的なりポヌクレオリティック活性を示すことが見い出された［シャロピ等（Ｓｈａｐｉｒｏ　ｅｔ　ａＪ）　、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　２５　：　３５２７−３５３２．１９８６］。

更に、バレー等（Ｖａｌｌｅｅ　ｅＬ　ａｌ）は最近ヒト腺癌セルラインから血管形成蛋白をコード化する遺伝子（ＣＤＮＡ及びゲノムの両方）をクローン化しく米国特許第４．７２１．６７２号明細書、これは参考として本発明にとり入れられる）、上記米国特許第４．７２７，１３７号明細書中で特許の保護を請求した。彼らは、遺伝子をベクター中でクローン化し、かつ、宿主細胞をアンギオゲニン遺伝子をコード化する組換えベクターで形質転換し、又、移入した。かかる形質転換された、又は、移入された細胞は、ヒトアンギオゲニン蛋白を発現する。

デネフル等（Ｄｅｎｓ’ｆｌｅ　ａｔ　ａｌ）は、ヒトアンギオゲニンをコード化する合成遺伝子を製造した（　Ｇｅｎｅ　５６：６１−７０．１９８７）。この遺伝子は、高度に発現されたＥ　、Ｃｏ１１蛋白中に見い出されたコドンを使用するために企画され、Ｅ、　Ｃｏ１１　トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターを含有するために製造されたｐＢＲ３２２由来の発現ベクターに結合された。

このＥ　、Ｃｏ１１産生アンギオゲニンは、不溶性で、容易に再生でき、かつ精製できることが見い出された。この精製されたアンギオゲニンは、バレー等（Ｖａｌｌｅｅ　ｅｔ　ａｌ）によりヒト腺癌細胞から精製された天然アンギオゲニンに対して記載されたもの（米国特許第４．７２７．１３７号明細書）と類似したアンギオゲニン活性及びリポヌクレオリティック活性を示した。

ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）　（西独特許出願第３７１６７２２．７号）は、バレー等（Ｖａｌｌｅｅ　ａｔ　ａｌ）により記載された（米国特許第４，７２１．６７２号明細書）天然アンギオゲニン遺伝子中の３０位のメチオニンに代えて３０位にロイシンを有するアンギオゲニンに対スル異なった合成遺伝子を製造した。更に、この合成遺伝子はＥ　、　Ｃｏ１１中で優先的に発現されるコドンを使用するために企図されＩ；。この遺伝子は、翻訳効率を増大させるために、修飾された　ｔｒｐプロモーター（ヨーロッパ特許出願第０１９８４１５号）と翻訳開始領域（ＴＩＲ）配列（Ｇｅｎｅ４１　：　２０１　２０６．１９８６；ＥＭＢＯＪ、４　：　５１９−５２６．１９８５）を含有するベクター中にサブクローン化された。合成遺伝子は」プロモーターの直接のコントロール下にあり、発現はインドール−３−アクリル酸の添加により、又は、トリプトファン飢餓処理により誘引される。ロイシン−３０アンギオゲニン蛋自は精製でき、かつ天然のアンギオゲニンと類似のアンギオゲニン活性及びリポヌクレオリティック活性を示すことが見い出されｔこ　。

既述のすべてのアンギオゲニン蛋白は、血漿由来のものであれ、腫瘍細胞由来であれ、又は組換えＤＮＡ由来（ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又は合成遺伝子由来のもの）のものであれ、すべてアンギオゲニン活性及びリポヌクレオリティック活性の両方を示す。この２個の活性は未だ分離されていない。事実、アンギオゲニンの最も興味のある特徴の１つは、哺乳動物の膵臓リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅｓ）と構造的に相同であることである。全体的に、ヒトの膵ＲＮａｓｅとアンギオゲニンの間には３５％の配列の同等性がある〔ストリドム等（Ｓｔｒｙｄｏｍ　６ｔ　ａｊ）　、旧ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２４　：　５４８６−５４９４．１９８５］、この構造の相関性は、アンギオゲニンの活性メカニズムの研究、並びにアンギオゲニンの血管形成性と酵素的（リポヌクレオリティック）活性の相関性のある研究を可能とする。

血管形成因子は創傷の治療に重要な役割を示し［レツラ（Ｒｅｔｔｕｒａ　ｅｔ　ａｊ）　、Ｆ　Ａ　Ｓ　Ｅ　Ｂ　Ａｂｓｔｒａｃｔ＃　４３０９．６１回年会、シカゴ、１９７７］そして、悪性度についてのスクリーニング試験の進展において適用性を見い出しうるのでＥクラゲスバーン等（Ｋｌａｇｓｂｕｒｎｅｔ　ａｔ）　、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　３６　：　ｌ　１０−１１４．１９７６：ブレム等（Ｂｒｅｗ　ｅｔ　ａｌ）　、５ｃｉｅｎｃｅ　１９５　：　８８０− ８８１．１９７７］、明らかに、治療及び診断における利用を可能にするための十分な量で血管形成性蛋白を製造することが有利である。遺伝子工学技術は、これらの蛋白の製造レベルを増大させるのに理想的に適している。米国特許第４．７２１，６７２号メカニズムに記載されているように、血管形成性蛋白をコード化する遺伝子のクローン化は、かかる大規模な製造において必要とされる第一段階である。血管形成性蛋白ノ製造レベルを増大することに加えて、野性型の活性よりもずっと増大した血管形成活性を有する突然変異体又は変異体血管形成蛋白を製造するためにクローン化された遺伝子を使用することは高度に有利であろう。部位特異的な突然変異誘発技術及び遺伝子工学技術は、かかる増大した活性をもつ蛋白を製造するのに理想的に適している。血管形成性蛋白のアミノ酸が変化した生物学的活性をもつ蛋白を製造するために、このような技術により修飾しうろことは明らかであるが、どのアミノ酸を変えるべきか、そして、かかる変更が生物学的活性を増大させるか、又は減少させるかを予想することは困難である。

米国特許第４．７２１．６７２号明細書は、２６．３９．５７．８１．９２及び１０７位のシスティン、及び、１３及び１１４位のヒスチジン、及び、４０位のリジンが、部位特異的突然変異誘発を使用して他のアミノ酸により置換するための好ましい部位であろうと述べている。

さらに、成る種の腫瘍生成物の混入が受は入れられず、かつ生物学的活性における増大が低用量レベルでの使用を可能とする場合等のヒトの治療の場合等にあっては、非腫瘍細胞から増大した血管形成活性をもつ突然変異体血管形成性蛋白を製造することが、ある場合には、望ましい。それゆえ、本発明は、部位特異的突然変異誘発及び組換えＤＮＡ技術を使用する、増大した血管形成活性をもつ非腫瘍細胞中における突然変異体血管形成性蛋白の製造を提供する。

発明の概要予想外にも、ヒトアンギオゲニンの１１６位又はこれに相当するアスパラギン酸をアンギオゲニン遺伝子の部位特異的突然変異誘発を使用して、他のアミノ酸、殊に、ＡＳｎｓ　Ａ　Ｉａ又はＨｉｓにより置換すると、（ＲＮＡ又はｒ　ＲＮＡに対するリポヌクレオリティック活性は８〜１５倍増大し、血管形成強さが１０〜１００倍増大することが今や見い出された。簡単に述べると、本発明はよりすぐれた血管形成活性をもつ突然変異体血管形成蛋白をコード化する突然変異体又は変異体ＤＮＡ配列を開示する。実質的にアンギオゲニンと同じ型の生物活性であるが、非変異又は野性型のアンギオゲニンの活性よりも一層高い活性をもつ突然変異体アンギオゲニン又は突然変異体アンギオゲニン蛋白をコード化するＤＮＡ配列も開示される。このＤ　Ｎ、　Ａ配列は、アンギオゲニン（野性型ＤＮＡ配列）をコード化するＤＮＡ配列の部位特異的突然変異誘発により製造しうる。突然変異誘発に適した野性型配列は、アンギオゲニンをコード化する如何なるＤＮＡセグメントでもよく、ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　％ゲノムＤＮＡ又は合成遺伝子がなりうる。

更に、本発明は、よりすぐれた血管形成活性を有する突然変異体又は変異体蛋白をコード化する突然変異体又は変異体ＤＮＡ配列から成るベクターを開示する。

非変異又は野性型のアンギオゲニンと実質的に同一であるが、増大した生物学的活性を有する蛋白をコード化するＤＮＡ配列から成るベクターも開示される。

このベクターは、さらに、ＤＮＡ配列の上流の、そして、ＤＮＡ配列に操作的に結合するプロモーター配列を含む。一般的に、このベクターも、選択しうるマーカーを含み、かつ使用された宿主細胞に依存して、調節配列、ポリアデニル化シグナル、エンハンサ−及びＲＮＡスプライス部位のような要素を含むことができる。本発明の付加的な面は、よりすぐれた血管形成活性をもつ突然変異体蛋白を製造するために移入されたか、又は形質転換された細胞を開示する。非変異又は野性型アンギオゲニンと実質的に同一であるが、増大された生物活性をもつ突然変異体又は変異体を製造するために移入されｔ；か、又は形質転換された細胞を開示する。非変換又は野性型アンギオゲニンと実質的に同一であるが、増大された生物活性をもつ突然変異体又は変異体を製造するために移入されたか、又は形質転換された細胞も開示される。細胞は、よりすぐれた血管形成活性をもつ突然変異体又は変異体蛋白をコード化するＤＮＡ配列を含む発現ベクターを含むように移入されるか、或いは、形質転換される。１１６変異体アンギオゲニン蛋白をコード化する遺伝子の発現はバクテリア中で示される一方、イースト及び哺乳動物細胞中での発現はアートーレコグナイズド（ａｒｔ　−ｒｅｃｏｇｎｉｚｄ）手法により実施され、かつ本発明により企図される。

本発明の他の面は、よりすぐれた血管形成活性をもつ突然変異体又は変異体蛋白を製造するための方法を開示する。この方法は、（ａ）部位特異的突然変異誘発により非変異又は野性型アンギオゲニン遺伝子の突然変異体又は変異体アンギオゲニン遺伝子を製造し；（ｂ）血管形成活性をもつ突然変異体又は変異体蛋白をコード化するＤＮＡ配列を含むベクターを宿主細胞中に導入し；（Ｃ）相応の媒質中で宿主細胞を増殖させ：かつ（ｄ）ＤＮＡ配列によりコード化され、かつ宿主細胞により製造された突然変異体又は変異体蛋白を単離することから成る。アンギオゲニンと実質的に同一であるが、実質的に増大した生物活性をもつ突然変異体又は変異体蛋白を製造するための方法も、開示される。これらの方法により製造される変異体蛋白も開示される。更に、変更された５ｓｐ−２１６に相応するアスパラギン酸をもつヒトアンギオゲニン蛋白の部分も、同様に本発明に包含される。野性型アンギオゲニンの１１２から１２１位又はこれに相当するアミノ酸に相当する領域（Ｐ　ｒｏ　−Ｖ　ａｌ　−Ｈｉｓ　−Ｌ　ｅｕ　−Ａ　ｓｐ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｓ　ｅｒ　−Ｉ　ｌｅ　−Ｐ　ｈｅ　−Ａ　ｒｇ）中のアスパラギン酸を変異させると、生成した突然変異体アンギオゲニン蛋白又はこれらの生物学的に活性なペプチド断片の血管形成活性は増大することが見い出された。

本発明の他の面は、詳細な記載及び図面を参照すれば明らかになるであろう。

図面の簡単な説明第１図は、アンギオゲニンに対するｐＨＡ２発現ベクターの造成を示す。

第２１図は、アンギオゲニン中のＡｓｐ−１１６の突然変異誘発のために使用される方法及び変異体アンギオゲニンに対する発現ベクターの造成を示す。

第３図は、基質としてのｔＲＮＡに関する野性型アンギオゲニン及びアンギオゲニンのＡｓｐ−１１６変異体のりボヌクレオリティック活性のグラフである。

ＷＣ４図は、ｐＨＡｌ及びｐＨＡ２におけるアンギオゲニンをコードするＤＮＡ配列を示す。アミノ酸配列も示される。矢印の実線は解析されたトリプシンペプチドの位置及び数を示す。

′Ｍ５図は、野性型アンギオゲニン及び１１６位又はこれに相当する位置での変異体のアミノ酸配列を示す。バクテリアにより発現されＩ；アンギオゲニンは一１位にメチオニン（ｍｅｔ）を有する。

詳細な記載発明を提示する前に、以下に用いる幾つかの用藷を定義する。

生物学的活性とは、生物学的関係において（即ち、生物体において或いはインビトロの複製において）分子により実施されるある機能又は機能の組である。アンギオゲニンについては、生物学的活性はその血管形成活性により特徴づけられる。それは、リボヌクレオリティック活性も含む。

血管形成活性は、組織における血管発達の化学的刺激である。それは、一般的に各種細胞タイプにより産生される拡散性物質と相関する。血管形成活性はヒョコ胚漿尿膜アッセイ　［ナイトン等（Ｋｎｉｇｈｔｏｎ　ｅｔ　ａｔ）、Ｂｒ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ　３５　：　３４７−３５６．１９７７］及び／又はウサギ角膜移植アッセイ　ｒランガー及びフォークマン（Ｌａｎｇｅｒ　ａｎｄ　Ｆｏｌｋｍａｎ）　、ｎａｔｕｒｅ　２６３：　７９７−８００．１９７６］における陽性反応により特徴付けられる。

リポヌクレオリティック活性は、アンギオゲニンに関連するりボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）酵素活性であり、特に、ｒＲＮＡ及びｔＲＮＡの限定的な触媒作用又は開裂を含む、成る種のＲＮＡ基質についての触媒活性である。

突然変異体遺伝子は、天然には存在しないような変化、組合わせ又は配置のＤＮＡ断片を含むように、ヒトの介入により修飾された、かかる分子のＤＮＡ分子又はクロニンである。

突然変異体アンギオゲニン蛋白は、１つ又はそれ以上のアミノ酸が他のアミノ酸により置換され、非突然変異体型又は野性型のアンギオゲニンと比較したときに変化した生物活性を有するアンギオゲニン蛋白、又はこの蛋白のあらゆるペプチド断片である。

アンギオゲニン蛋白は、腫ａｍ胞及び網ｗＸｍ胞を含む種々の細胞をにより製造される。最近まで、これらの蛋白はその化学的及び物理的特性を決定するのに十分な純度では得られなかった。

本明細書中に参照として組み入れられる米国特許第４．７２１．６７２号明細書中に詳細に論述されている種々の技術及び方法が、アンギオゲニン蛋白の単離とアッセイに関して、及び、種々のベクターシステム及び宿主細胞システムを含め、アンギオゲニン遺伝子のクローン化及び発現に関して、本発明の突然変異体アンギオゲニン遺伝子及び蛋白に同等に適用されるであ自は、突然変異体アンギオゲニン蛋白を発現させるために突然変異体ＤＮＡセグメントで形質転換され、又、移入された細菌、イースト及び哺乳動物細胞のような宿主細胞中で製造することができる。米国特許第４．７２１．６７２号明細書に記載されている技術及び方法に加えて、本分野での専門家は他の適当な技術及び方法も理解するであろう。

アンギオゲニン蛋白のアミノ酸は、部位特異的突然変異誘発により他のアミノ酸により置換しうる［シラー等（Ｚｏｌｌｅｒ　ａｔ　ａｌ）　、Ｍａｎｕａｌ　ｆｏｒ　Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｔｅｃｈ−ｎｉｑｕｅｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｃｏｕｒｓｅ、　Ｃｏ１ｄ　　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　１９８３　］　ｅこの部位特異的突然変異誘発は野性型アンギオゲニン中の１つ又はそれ以上のアミノ酸を置換するために使用することができ、生成した突然変異体ＤＮＡ配列は野性型アンギオゲニンと実質的に同じアミノ酸配列をもつが、変化した（減少した又は増大しＩ；）生物学的活性を有する突然変異体アンギオゲニン蛋白をコード化するであろう。減少した又は何らアンギオゲニン活性を有しないが、成る種の構造上の特徴を保持する突然変異体アンギオゲニンは内皮又は他の細胞上の受容体と依然として結合可能であり、こうして、細胞の受容体を阻止することにより、野性型アンギオゲニンの活性に対して拮抗剤となる。このような突然変異体は、血管形成に関連する疾病の状態の治療に有用である。ここに記載される方法は、このような突然変異体を得るｔ；めに利用できる。

野性型アンギオゲニンよりも高いレベルの生物学的活性を示す突然変異体アンギオゲニンも部位特異的突然変異誘発により得ることができる。増大した生物学的活性は低用量のレベルにおいてかかる高活性突然変異体アンギオゲニン蛋白の使用を可能とする。ここに記載された方法は、成果を収めてかかる突然変異体を得るために利用された。

アンギオゲニンとりポヌクレアーゼの間の相同性のために、成る種のアミノ酸は部位特異的な突然変異誘発による置換のための好ましい部位であることが示唆されている＝２６．３９．５７．８１，９２及び１０７位のシスティン、１３及び１１４位のヒスチジン、及び４０位のリジン。（バレー等、米国特許第４，７２１．６７２号明細書）。これらの示唆されている部位のいずれも本発明の突然変異体アンギオゲニンの産生のためには選択されなかったが、これらの示唆されたアミノ酸又は他のアミノ酸のいずれもアンギオゲニン遺伝子の部位特異的突然変異誘発により選択され、かつ置換することができる。本発明の好ましい態様において、１１６位のアスパラギン酸が突然変異誘発のための選択された部位であった。この残基を部位特異的な突然変異誘発により他のアミノ酸、特に、アスパラギン、アラニン又はヒスチジンで置換すると、予想外にもアンギオゲニンの血管形成活性及びリポヌクレティック活性の両方の顕著な増大を生じる。

本発明により製造された突然変異体アンギオゲニン蛋白は、これを適当な担体と結合させることにより、治療又は診断用組成物を製造するために使用することができる。治療用組成物は、例えば、心臓障害に続く側枝循還を引き起こすｔ；め、又は、例えば間接又は他の局在部Ｃごおける創傷治療を促進するための、哺乳動物における血管ネットワークの発達を促進するＩ；めに使用できる。

好ましくは、非毒性の薬学的に許容しうる担体中の突然変異体アンギオゲニン蛋白から成る、本発明により得られる治療用組成物は、静脈内又は、傷部への直接局所適用により投与されるであろう。例えば、スポーツに関連した傷害又は骨間接症においてしばしば生ずるように、もし傷がひざ又は肩の間接間軟膏に生ずるならば、傷部に８けるアンギオゲニン蛋白の埋込み又は注射は裂けたか又は傷ついた繊維軟膏物質の治癒を促進しうる。効果的な用量は状態のひどさ及びターゲット組織により変化するであろう。

更に、血管形成蛋白は抗体の存在のためのアッセイに蛋白を使用するか、又は免疫診断試薬として使用するＩ；めの抗体を産生するために蛋白を使用するかのいずれかにより、悪性腫瘍の存在をスクリーニングする際に診断上利用される。蛋白を含有する診断用組成物は、抗原−抗体複合体の形成に適した状態において生物学的試料とともに培養しうる。複合体の形成（すなわち、試料中に抗体が存在する）は、次いで検出される。かかるアッセイのための技術はこの分野で良く知Ｃボレー等（Ｖｏｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ　）　ｓ　Ｔｈｅ　Ｅｎｚｙｍｅ　　ＬｉｎｋｅｄＩｍｍｕｎｏｓｏｒ　ｂｅｎｔ　Ａｓ５ａｙ、　Ｄｙｎａｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ。

（１９７９’）又はＷｅｓｔｅｒｎ　ｂｏｌｔ　ａｓｓａｙ　（例えば、トウビン等（Ｔｏｗｂｉｎ　ｅｔ　ａｌ）　、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ７６．４３５０．１９７９を参照せよ）］。同様に、血管形成蛋白に対する抗体を含む診断用組成物は、生物学的試料中での蛋白の存在の検定のために使用しうる。また、血管形成蛋白は、血管形成に関連する障害を治療する際に使用しうる。組換えＤＮＡと部位特異的な突然変異誘発は、必要とする量で、及び治療用増大した生物学的活性を有するこれらの蛋白の製造のためのすぐれた方法を提供する。

実験材料及び方法制御１％エンドヌクレアーゼ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４キナーゼ、Ｍ　ｌ　３ｍｐｌ　８　（ＲＦ）は、Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ−５ｅａｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ’、又は　Ｉｎ−ｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から購入した。オリゴヌクレオチド指向性又は部位特異的突然変異誘発は、クンケル（Ｘｕｎｋｓｌ）の方法（Ｐｒｏｃ、　Ｎｅｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ８２　：　４８８−４９２．１９８５）により、ＢｉｏＲａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入したＭｕｔａ　−Ｇｅｎｅ　（商標）インビトロ突然変異誘発キットを使用してなされた。［ａ３５Ｓ］　　ｄＡＴＰはＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒから購入した。ヘキスト社ＪＭＩＯＩ細胞により提供されｔ；Ｅ、Ｃｏ１１株Ｗ３１１０細胞（Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｃ，２７３２５）は、Ｐｈａｒｍａｃｉａ又はＢｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏ−ｒａｔｏｒｙから得られた。

小規模プラスミドＤＮＡの製造は、マニアチス等（Ｍａｎｉａｔｓ　ｅｔ　ａｌ　）により記載されたアルカリ溶解法、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　、　Ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐ−ｒＩｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　　１９８２を使用して実施された。−末鎖及び二本鎖Ｍ１３ＤＮＡは、Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓのＭＩ３クローニング及びシーフェンシングマニュアル中に記載された方法を使用して製造された、ＪＭＩＯＩ細胞（２ｒｒｒＱ）の培養はＯ、Ｄ−６００が約０．１− ０．２になるまで増殖され、Ｍ１３プラークが添加され、かつファージは振盪しながら３７℃で６時間増殖させた。細胞は遠心分離により捕集され、アルカリ溶解法を使用して、二本鎖Ｍ１３ＤＮＡを製造するために使用された。７アージは２０％ポリエチレングリコール（６０００）中の２．５ＭＮａＣ１の　１１５容積による沈降により上澄みから得られ、１．０ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＴＥ）により、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８，０中に再懸濁され、かつＤＮＡはフェノール、フェノール／クロロホルム及びクロロホルム（２回）で連続抽出して得られｔ；。ＤＮＡは３Ｍの酢酸アンモニウム及び２容積のエタノールで沈澱され、ＴＥ緩衝液中に溶解された。一本ＮＤＮＡはアガロースゲル電気泳動を使用し、既知の濃度の標準を使用して臭化エチジウムで染色することにより定量された修飾Ｔ７：ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡの配列決定は、Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌから購入したシークエナーゼ（５ｅｑｕｅｎｏｓｅ）　　（商標）キットを［、３５Ｓ］　ＡＴＰと組合わせて使用するサンガー等（Ｓａｎｇｅｒｅｔ　ａｌ　）の読み終わり法［Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ７４　：　５４６３−５４６７　（１９７７）］　により実施された。オリゴヌクレオチド（４００ｐｍｏｌ）のリン酸化は、１００ｍＭのトリス、ｐＨ８，５ｍＭのＤＴＴ％　ＩＯ＋ｕＭのＭｇＣ＋２及び０．４３ｍＭのＡＴＰ中のＴ４キナーゼ（９単位）で達成された。培養は、３７°で４５分、次いで６５℃ で１０分間実施された。

衷】１１土Ｅ、Ｃｏ１１発現ベクター組換えヒトアンギオゲニンの製造 −Ｌ」」プロモーターのコントロール下で合成［Ｌｅｕ−３０］　−７ンギオゲニンコ一ド化配列を含有しかつアンピシリンマーカーを含有するＥ、Ｃｏ１１発現ベクターｐＨＡｌを使用した。クンケル（Ｋｕｎｋｅｌ　）の方法、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　　８２　：　４ｇｇ−４９２，１９８５により、Ｍｕｔａ　−Ｇｅｎｅ　（商５ｌＬ）突然変異誘発キットを使用するオリゴヌクレオチド−指向性突然変異誘発により天然アンギオゲニン中で見い出されるように、３０位のロイシン残基はメチオニンに戻されＩ；。この遺伝子（ｐＨＡｌ）によりコード化されたアンギオゲニンのアミノ酸配列は、これが３０位がメチオニンの代わりにロイシン（Ｉ　ｅｕ）をコード化シ、第５図に示すように、−１位にメチオニン（ｍｅｔ）を含有することを除いて、米国特許第４．７２１，４７２号明細書に定義された配列と同一である。ｐＨＡ１　（４７１ｇ）はＫｐｎＩ及びＰｖｕｌＩ、次いでＥｃｏＲＩで消化され、Ｋ　ｐｎｌ［／　Ｅ　ｃｏＲＩ断片はＥｃｏＲＩとＫ　ｐｎ　Ｉ末端を含有する　Ｍ１３ｍｐ１８に結合されＩ；。ＣａＣ１２処理ＪＭＩＯＩ細胞への形質転換の後［マニアチス等（Ｍａ−ｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ　）　、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　　ｌ　９３３り同定した。

ファージ（１，３Ｘ１０’ｐｆｕ）は、ＣＪ２３６　（ｄａｔ−、ｕｎｇ−）細胞の２０．峠の培養物を感染させるために使用し［クンケル等（Ｋｕｎｋｅｌ　ｅｔ　ａｌ）、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　ｌ　５４　：　３６７−３８２．１９８７〕、かつ７アージを３７℃で１晩増殖させた。

上澄みを含有する７アージは、ＣＪ２３６及びＭＶ１１９（ｌクンケル等（ＫｕｎｋｅＪ　ｅｔ　ａｌ　）　、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　ｌ　５４　：　３６７−３８２．１９８２　］　セルラインへの感染性において２Ｘ１０５の差異を示しＩ；。ウラシル含有Ｍ　１３ｍｐｌ　８−ＨＡ　１−末鎖ＤＮＡは、ＰＥＧ／ＮａＣ１沈澱、続いての７エノール／クロロホルム抽出により単離され、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，４２ｍＭ　ＭｇＣｌ２及び５０ｗ＋ＭＮａＣ１中で２００ｎｇのこのＤＮＡは変異原性のプライマーｐＧＡＡＴＣＧＡＴＴＡＴＧＡＧＡＣＧＣＣＧ　　（２−７ａＭ）とアニールされた。二本鎖の合成はＭ　ｕｔａ　−Ｇ　ｅｎｅマニュアル中に記載されているように、１．５ｍＭ　　ＤＴＴ、５＋ｏＭ　ＭｇＣｌ２．０．５ｍＭ　　ｄＮＴＰ’Ｓ及び０．７５ｍＭＡＴＰを含有する２３ｍＭ）リス−ＨＣＬ　ｐＨ７，４中にて、Ｔ４　　ＤＮＡポリメラーゼ（ｌ単位）及びＴ４　　ＤＮＡリガーゼ（３単位）を使用して実施された。二本鎖Ｍ１３ｎ＋ｐ１８−ＨＡ（Ｉｏｎｓ）がＭＶ１１９０細胞を形質転換するために使用され、かつプラークは寒天皿上で３７℃にて１晩増殖させた。４個のプラークから得られたＤＮＡの配列は、３０位にＭｅｔをコード化するＡＴＧを含有する３個のクローン（Ｍｌ　３ｍｐｌ　８−ＨＡ２）を同定した。二本鎖Ｍ１３ｍｐ１８−ＨＡ２はＫｐｎｌ及びＥｃｏＲＩで消化され、アンギオゲニンをコード化する配列を含有する４２８−６ｐ断片は３．５％の低融点アガロース（ＮｕＳｉｅｖｅ　Ｇ　Ｔ　Ｇ　、　Ｆ　Ｍ　ＣＢｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）による電気泳動により精製された。Ｋｐｎｌ　／　ＥｃｏＲＩ末端を含有するゲル精製発現ベクターへ結合させた後で、生成したｐＨＡ２　　ＤＮＡはＣａＣ１２処理ＪＭｌＯ１細胞を形質転換させるために使用されｌ；。

形質転換体はプラスミドＤＮＡの制限酵素切断地図によりスクリーンされた。ｐＨＡ２を含有する個々のコロニーは、５０μｇ／ｒｔｒＱのアンピシリンを含有するルリアブイヨン（Ｌｕｒｉａ　ｂｒｏｔｈ　：　Ｌ　Ｂ　）中で１晩増殖させ、次いで、細胞を一７０℃で１５％グリセロール中にて凍結保存した。°上述したＰＨＡ２の製造は、第１図に示されている。プラスミドｐＨＡ２はアメリカタイプカルチューコレクションにＡ、Ｔ、Ｃ，Ｃ，６７６６０の寄託番号で寄託された。

ｐＨＡＱ中で新しく合成されたこのアンギオゲニン遺伝子は、Ｍｅｔ−３０及びＡｓｐ−１１６を含め、米国特許第４．７２１．４７２号明細書中で定義されているものと同様のアミノ酸配列をコード化しているが、発現された蛋白、は第５図に示すようにマイナス１の位置にメチオニンを有する（Ｍｅｔ−１）点で相異する。

実施例２アンギオゲニン中のＡｓｐ−１１６の突然変異誘発アンギオゲニンのＡｓｐ−１１６の突然変異誘発は、Ｍ　ｕｔａ　−Ｇ　ｅｎｅ（商標）試験管内突然変異誘発キットを使用して、クンケル（Ｋｕｎｋａｌ）のオリゴヌクレオチド指向性突然変異誘発法（Ｐｒｏｃ　、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、Ｕ　Ｓ　Ａ８２　：　４８８−４９２．１９８５）により実施した。

突然変異体アンギオゲニン遺伝子の製造は第２図に示されており、以下に記述する。突然変異誘発のために使用した野性型アンギオゲニンのＤＮＡ及びアミノ酸配列は第５図に示されている。

Ｍｌ　３＋ａｐｌ　８−ＨＡ２ｙアージはＣＪ２３６細胞（２０ｒｔｒＱの培養）中で増殖させ、ウラシル含有−末鎖ＤＮＡがＰＥＧ／ＮａＣ１沈降ｌ；次ぐフ沈降−ル／クロロホルム抽出によって得られた。この物買はＣＪ２３６細胞への感染に対してＭＶ１１９０細胞に比べて６×１０５の優先性を示した。−末鎖Ｍ１３＋ｏｐ１ｇ−ＨＡ２（８８０ｎｓ、０．４４　ｐｍｏｌ）を、２ｍＭのＭｇＣ＋２と５０＋ａＭのＮａＣ１を含む２０ｍＭのトリス−ＭＣＩ％ｐＨ７，４、中で、合成オリゴヌクレオチドｐＧＴＣＣＡＴＣＴＡ　（Ａ／　Ｇ／　Ｃ）　（Ｃ／　ＡＸＴ／　Ａ）　ＣＡＧＴＣＴＡＴＣ（１，１ｐ＋＊ｏｌ）（これはアンギオゲニンのＡｓｐ−１１６の位置において各種の突然変異をコード化する）とアニールさせた。二本鎖の合成とＭＶｌ１９０細胞の形質転換は、上述のようにＭ１３ａ＋ｐ１８−１（Ａ２に対して実施した。２４個のプラークを選択し、そしてプラ−りを精製した。突然変異ＤＮＡは、鎖成長停止反応法を使用し、かつアンギオゲニンのＡｓｐ−１２６に対するコドンへ約４０のヌクレオチド５′二本錆合成を開始する合成オリゴヌクレオチドを用いるＤＮＡ配列決定法により同定した。５個の突然変異体すべてが得られた：１つはＡｓｎ−１１６（コドン＝ＡＡＴ）をコードしており、２個はＡｌａ−１１６（コドン−ＧＣＡ）をフードしており、かつ２個がＨｉｓ−１１６（コドン−ＣＡＴ）をコードした。Ａｓｎ −１１６突然変異体はＤ１１６Ｎ−アンギオゲニンと命名し；Ａｌａ−１１６突然変異体はＤ１１６Ａ−アンギオゲニンと命名し；かつＨｉｓ−１１６突然変異体はＤ１１６Ｈ−アンギオゲニンと命名された。いかなる意図しない突然変異の存在も除外するために、全コード化領域の配列を決定した。これらの突然変異体の各々に対する二本鎖Ｍ１３ＤＮＡ　（１−２７７９）を、ＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、３．５％低融解アガロースゲル電気泳ａ　（ＮＬＩＳ−ｉｅｖｅＧＴＧ）上で精製し、かつＦ　Ｍ　ＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃＬｓプロトコールに従がって、ＫｐｎＩ　／　ＥｃｏＲＩ末端を含むゲル精製発現ベクター（２５ｎｇ）に結合させた。Ｗ３１１０！ｍ胞の形質転換は２．５５−１Ｏｎの結合プラスミドを用いて実行した。各形質転換から８個のコロニーを選択し、−濁期の再度の載置を実施した。各コロニーを５０μｇ／ｕｒ（ｌのアンピシリンを有するＬＢ中にて１晩増殖させ、かつ１５％グリセロール中７０℃で細胞を凍結保存させた。突然変異体アンギオゲニンＤＮＡの製造は第２図に図示されている。Ｄ１１６Ｎ−アンギオゲニンに対する突然変異遺伝子を含有する、Ｗ３１１０ｍ胞中） ’ｊう７．ミ）’ｐＨＡ２−Ｄ　１１６Ｎは、Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｃ，６７６６２という寄託番号でアメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託され；Ｄｌ１６Ａ −アンギオゲニンに対する突然変異遺伝子を含有する、Ｗ３１１０細胞中のプラスミドｐＨＡ２−Ｄｌ１６Ａは、Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｃ，６７６６１の寄託番号でアメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託され；Ｄ１１６Ｈ−アンギオゲニンに対する突然変異遺伝子を含むＷ３１１０細胞中のプラスミドｐＨＡ２−Ｄ　ｌ　ｌ　６Ｈは、Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｃ，６７６５９め寄託番号で、アメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託された。

実施例３野性型及び突然変異アンギオゲニンの発現大規模の発現のために、相応の発現プラスミドが存在するＷ３１１０細胞の１晩培養物を、１０％カザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ）　２０　ｒｎＱ、　２０％グルコース１ＯＩＩＩ２及び１肩αのアンピシリン（２５ｍ＋９／　＋１１２）を補充したＭ９媒質５００ｍ１２［マニアチス等（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ａｔ　ａｌ）　、Ｍｏ１−ｅｃｕｉａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｖｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　ｌ　９３２］中にて１００倍に希釈し、激しく振盪しながら３７℃で４時間細胞を増殖させｔ：、　（０、Ｄ−ｅｏｏは約１．２）　ｏ　インＦ−ルー３−７クリル酸（０、５ｍＱｓ　２０１Ｒ９／　ｒｎＱ　；　Ａｌｄｒｉｃｈ）及び２０％グルコース１０ｍＱを添加し、細胞を更に４時間増殖させｔ；。

最初に、６〜８個のコロニーからの細胞について、以下のイムノプロット分析により発現レベルを調べた。

培養物（ｌ　ＯｍＱ）を上述のようにして増殖させ、培養物１ｍρから遠心分離により細胞を捕集し、かつ細胞のペレットを０．２％ＳＤＳを含有する４００μ ｇの試料緩ｉ　液中ｉ：　Ｎ懸濁サセｆ：、ＤＴＴ　（１５０＋ａ４．０．２Ｍ）を添加し、混合物を１００”Ｃで３〜５分加熱した。

ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）は、積層されたゲル５％、及び１５％の分離ゲルを使用して実施した。ゲル平板を２５ｍＭトリス、０．２Ｍグリシン、０．１％ＳＤＳを含有する２０％メタノール中で２回洗浄し、蛋白を上記トリス−グリシン緩衝液中２７Ｖで０．４５μ ｍニトロセルロースに１晩移した。ニトロセルロースフィルターをＰＢＳｌｏ、２％Ｔｗｅｅｎ　−２０界面活性剤（Ｔｗ−ｅｅｎ　）で２時間洗浄し、次いで実施例５に記載のようにして製造されたアフイニティｍｉ抗アンギオゲニンとともに２時間培養した。ニトロセルロースフィルターをＰ　Ｂ　Ｓ　／　Ｔｗｅｅｎで３０分間洗浄し、さらにアルカリホスファターゼでラベルしたヤギー抗ウサギ　エｇＧ（２、５ＩＩ　９／　ｒｎＱ、　Ｋｉｅｒｋｅｇａａｒｄ　ａｎｄ　Ｐｅｒｒｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ−ｉｅｓ、　Ｉ　ｎｃ）とともに１．２時間培養した。ＰＢＳ／Ｔｗ−ｅｅｎで３０分間洗浄した後で、プロットを４ｍＭ　　ＭｇＣｌ２を含有する０、１Ｍバルビタール緩衝液（Ｓｉｇｍａ）中にてニトロブルーテトラゾニウム（０，１ｍｙ／ｍＱ　）及び５−ブロモ−４−クロロ３− インドリル−ホスフェートｐ−トルイジン（０、５ｍｇ／　ｒｎＱ）で展開しｔ；。発現のレベルをアンギオゲニン標準と比較して評価した最もよく発現したレベルを示しｔ；コロニーを捕集し、実施例４に記載のようにして大規模培養中で増殖させ、かつ精製した野性型及び突然変異体アンギオゲニン（実施例４）をさらにリポヌクレオリティック活性に対するアッセイ及び血管形成活性に対するアッセイにおいて、それぞれ実施例７及び８に従って特徴付けに。

実施例４野性型及び突然変異体アンギオゲニンの精製実施例３に記載したようにして、野性型及び突然変異体アンギオゲニンの発現のために増殖させた５００ｍＱの培養からの細胞を遠心分離により集め［５５００ｒｐｍ（ＧＳＡローター）、ｌＯ分］、かつｌＯ％ショ１１と２．５ｍＭフェニルメタンスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）を含有する２０　ｍＭトリス−ＨＣＩ（ｐＨ７，４）５４ｍｆｆ中に再懸濁させた。リゾチーム（３ｒｎＱ、トリスーシＢ糖緩衝液２　Ｂ／ｍ１２）　、ＮａＣＩ　（２，４ａ＋＋Ｑ、５Ｍ）及びエチレンジアミン四酢酸（１，２＋＋ＩＬ０゜５Ｍ）を添加し、この混合物を氷水浴上で４５分間培養した。ＰＭＳＦ　Ｃ０，４ａＯ，０，４５Ｍ）を添加し、プランソンモデル３５０ソニ７アイアー、パワーセット７を使用して、この混合物を、２５１／２パルス／周期で３〜７周期の間、氷上で音波地理した。音波処理時間の最後に、さらに０．４ｒａＱのＰＭＳＦ　（０，４５Ｍ）を添加した。不溶性の物質を遠心分離［１２，００Ｏｒｐｍ　（Ｓ　Ｓ　３４０−ター）、２５分］により捕集し、このペレットを２ｍＭＰＭＳＦを含有するトリス／ショ糖６０−６０−９Ｏで洗い、かつ遠心分離によりペレットを捕集した。ペレットを水８０ｒｔｒＱに再懸濁し、不溶性物質を遠心分離（１７，０００ｒｐｍ（ＳＳ３４０−ター）、３０分］により捕集した。このペレットを５．０＋ｉ１２の７Ｍグアニジン−塩酸、Ｏ，１Ｍの β−メルカプトエタノールを含む１００ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ７。

５に溶解し、３７℃で３時間培養した。この混合物を、撹拌せずに、１００ｍＭのＮａＣ１と５ｔｔｙ／ｌｎｎリゾチーム（担体として）を含有する５０ｍＭ）リス−ＨＣｌ６００ｒｔｒＱ、　ｐＨ８，５に４°Ｃで滴下により添加し、２０〜２５時間放置した。８−１Ｏ時間撹拌した後、１５０ｒａＱのＮａＣ１（５Ｍ）を添加し、不溶性物質を遠心分離［１１０００ｒｐｍ（ＧＳＡｏ−ター）、３０分コにより取り出し、粗アンギオゲニンをアミコン（Ａｍ１ｃｏｎ）起源縮機とＹＭ５膜を使用する膜濾過により１００倍に濃縮した。６容積の１０ｍＭトリス、ｐＨ８，０を加え、次いで５−８　ｍＱに濃縮した。

次いで、Ｏ，１５Ｍ　　ＮａＣ１を含有する１０ｍＭのトリス−ＨＣ１，ｐＨ８，０で平衡にした陽イオン交換カラム（Ｍｏｎｏ　−Ｓ　％Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に粗アンギオゲニンを適用し、線型勾配のＮａＣ１（０，１５Ｍから０．５５Ｍまで５０分）で溶出した。シャピロ等（５ｈａｐｉｒｏ　　ａｔａｌ）　、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２６　：　５１４１−５１４６　（１９８７）。次に、ピーク分画を高圧液体クロマトグラフ（−（ＨＰＬＣ）カラム（５ｙｎｃｈｒｏｐａｋ　Ｃｌ　８　）に適用し、線形勾配の溶媒ＡとＢ（３０−５０％溶媒Ｂ１３０分、０．８ｒａＱ１分）で溶出したが、ここで溶媒Ａは０．１％トリフルオロ酢１ｍ（ＴＦＡ）であり、かつ溶媒Ｂは０．０８％ＴＦＡを含有する２− プロパツール：アセトニトリル：水（３：　２　：　２）であった。ある場合には、ピーク分画は水に対して徹底的な透析を行う前に、同じカラムで再度クロマトグラフを行った。精製された蛋白の濃度はＰｉｃｏｔａｇ　　（商標）方法（ＷａｔｅｒｓＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ）を使用して、ビドリングマイヤー等（Ｂｉ −ｄｌｉｎｇｍｅｙｅｒ　ｅｔ　ａｌ）　、Ｊ　、Ｃｈｒｏｍｏｔｏｇｒａｐｈｙ　３３６　：　９３−１０４、（１９８４）により記載されたアミノ酸分析法により検定した。野性型又は突然Ｒ異体アンギオゲニンの最終回成度は培養物Ｉｆｆ当たり０．１−２゜０ＩＩｇの範囲に亙っていた。

実施例５アフィニティー精製されたウサギ抗アンギオゲニンの製造抗−アンギオゲニン抗体に対するアフィニティー樹脂を以下のようにして製造した：米国特許第４．７２１．６７２号明細書においてバレー及びクラチ（Ｖａｌｌｅｅａｎｄ　Ｋｕｒａｃｈｉ　）の記載と同様にして製造した組換えアンギオゲニン（１，２５ｍｇ）を０．１ＭのＮａＨＣ，０ｓ（ｐＨ９，０）０．５ｇに溶解し、臭化シアン（ｃＮＢｒ）で活性化したアガロースビーズ（ｃ　Ｎ　Ｂ　ｒ　−ａｃｔｉｕａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂ、　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）　Ｏ−５９（２，５ｍｆｆ）とともに４℃で１６時間培養した。この樹脂を　０．１ＭＮａＨＣ０３，２Ｍ　　ＮａＣ１及び水のそれぞれｌｏｏ＋ｎＱで順次洗った。ウサギ抗アンギオゲニンの精製のために、血漿由来のアンギオゲニン（５ｈａｐｉｒｏ　ｅｔ　ａｌ　、　Ｂｉ−ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２６：５１４１−５１４６．１９８７）又は組換えアンギオゲニン（米国特許第４，７２１，６７２号明細書）のいずれかを注射したウサギより抗血清を得た。この抗血清１ｍａを１ｍ（２のＰＢＳで希釈し、ＰＢＳで平衡化した樹脂に適用した（流速− ０，５ｍＱ／分）。溶出は２８０ｎｍでモニターした。ＰＢＳで徹底的に洗った後（Ａ　２ａＯが０．Ｏ１以下）、抗体を１０％ジオキサン含有３．５　Ｍ　ＭｇＣＩ２で溶出し、次いでＰＢＳで再度洗浄した。この精製した抗−アンギオゲニン抗体は、実施例３Ｉ；記載した宿主細胞による野性型及び突然変異体アンギオゲニンの発現のための試験に使用した。

実施例６野性型及び突然変異体アンギオゲニンの特徴付は第１表に示されている精製した野性型及び突然変異体アンギオゲニンのアミノ酸組成は、アンギオゲニンの第一次構造に基づいて期待された構造に著しく一致している。これらの組成も提示された突然変異と合致している。

アンギオゲニン中の３個のジスルフィド結合の適切な形成が還元した蛋白の再生中に生ずることを確認するために、トリプシンペプチドマツプが実施された。

野性型又は突然変異体アンギオゲニン（１−５＋ｎｍｏｌ）を　、　　　３　７　℃　、　　　ｌ　　ＯｍＭ　　ト　　リ　　ス　、　　ｐＨ８，０、０，３５ＭＮａＣ１中で１晩、ＨＰＬＣ精製トリプシン（２−４％）とともにインキュページコンした。ペプチドは、流速０．８ａＯ１分で水中に０．１％ＴＦＡを含有する線形勾配の２−プロパツール／アセトニトリルを使用して、ＨＰＬＣカラム（ＵＪｔｒａｓｐｈｅｒｅ　Ｃ１８）上で逆相ＨＰＬＣにより精製した。溶出は、２１４ｎｍでモニターした。ペプチドの組成は、フェニルイソチオシアネートによる変形法を使用する酸加水分解及びＰｉｃｏｔａｇ　　（商標）方法（Ｗａｔｅｒｓ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ）ビドリングマイヤー等（Ｂｉｄｌｉｎｇｍｅｙｅｒ　ｅｔ　ａｌ　）　、　Ｊ、　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ３３６　：　９３−１０４　（１９８４）に記載のとおりの逆相ＨＰＬＣにより決定した。

第１表　　野性型アンギオゲニンと突然変異体アンギオゲニンのアミノ酸組成アミノ酸　野性型　　　Ｄ１１６Ｈ−Ｄ１１６Ａ−Ｄ１１６Ｎ−アンギオゲニン、　　　アンギオゲニン　　　　アンギオゲニン　　　　アンギオゲニンＡｓｐ　　　　１５．３（１５）　　　　１４．５（１４）　　　　１４．７（１４）　　　　１５．５（１５）Ｇｌｕ　　　　１０．０（１０）　　　　１０．４（１０）　　　　１０．１（１０）　　　　１０．０（１０）Ｓｅｒ　　　　　８．４（９）　　　　　８．６（９）　　　　　８．６（９）　　　　　８．７（９）Ｇｌｙ　　　　　８．０（８）　　　　　９．１（８）　　　　　８．３（８）　　　　　８．６（８）Ｈｉｓ　　　　　５．９（６）　　　　　６．６（７）　　　　　５−８（６）　　　　　５．６（６）Ａｒｇ　　　　１３．０（１３）　　　　１２−８（１３）　　　　１３．１（１３）　　　　１３．０（１３）Ｔｈｒ　　　　　６．７（７）　　　　　６．８（７）　　　　　７．０（７ン　　　　７．ＩＣ７）Ａｌａ　　　　　５．１（５）　　　　　５．３（５）　　　　　６−２（６）　　　　　５．３（５）Ｐｒｏ　　　　　８．１（８）　　　　　７．８（８）　　　　　８．０（８）　　　　　７．９（８）Ｔｙｒ　　　　　３．９（４）　　　　　３．９（４）　　　　　３．９（４）　　　　　３．８（４）Ｖａｌ　　　　　４−１（５）　　　　　４−３（５）　　　　　４．２（５）　　　　　４−４（５）Ｍｅｔ　　　　　２．１（２）　　　　　２．１（２）　　　　　２．１（２）　　　　　２．１（２）ＩＩｅ　　　　６．５（７）　　　　　６．６（７）　　　　　６．７（７）　　　　　６−９（７）Ｌｅｕ　　　　　５．９（６）　　　　　６．１（６）　　　　　５．９（６）　　　　　５．９（６）Ｐｈｅ　　　　　４．９（５）　　　　　４．９（５）　　　　　５．０（５）　　　　　５．０（５）Ｌｙｓ　　　　　７．０（７）　　　　　７．１（７）　　　　　７．３（７）　　　　　７．３（７）分析されたｐｍｏｌ　　２５０　　　　１２２　　　　１１０　　　　９６突然変異体アンギオゲニンの各々のトリプシンペプチドマツプは、実質的に野性型アンギオゲニンのマツプとは区別できなかった。特に、３個のジスルフィド結合したペプチドは全て、すべての消化物中に存在しており、適切な折りたたみ（ｆｏｌｄｉｎｇ）を示している。

純粋な形で得られたトリプシンペプチドのいくつかの組成は、第２．３及び４表に示されている。第４図は、突然変異誘発に使用されたアンギオゲニン遺伝子のＤＮＡ中の各トリプシンペプチドの位置及びアミノ酸配列を示している。

第２表　組換えＤ１１６Ｈ−アンギオゲニン１からのトリプシンペプチドのアミノ酸組成ペプチド　　Ｔ−２Ｔ−５Ｔ−７Ｔ−９Ｔ−１１Ａｓｐ　　Ｏ，３５１，１７（１）　　１．２４（１）　　４．６０（５）　　３．０４（３）Ｇｌｕ　　Ｏ，４９１，２８（１）　　２．１３（２）　　２．１０（２）　　３−３７（３）Ｓｅｒ　　Ｏ，５９０，７２０，４８３，０８（３）　　２．５３（１）Ｇｌｙ　　１．０５　　１．２４　　１．５２（１）　　２．０４（１）　　３．７４（１）Ｈｉｓ　　Ｏ，１８０，２１１，７５（２）　　１．３１（１）　　１．６５（２）Ａｒｇ　　１．０４（１）　０．９８（１）　　１．０２（１）　　２．５１（３）　　１．３３（１）Ｔｈｒ　　Ｏ，２４０，２５１−８３（２）　　２．８０（３）　　０．８７Ａｌａ　　Ｏ，２１０，２４１，１５（１）　　０．３６　　１．９５（２）Ｐｒｏ　　１．００（１）　　　　　　１．０１（１）　　０−２３　　１．２９（１）Ｔｙｒ　　Ｏ，１９０，１５１，６７（２）　　０．９４（１）　　０．６１Ｖａｌ　　０−２４　　０．１７　　０．１９　　　１．０７（１）　　２．６４（４）Ｍｅｔ　　Ｏ，２８０，１９０，１９１，１７（１）１１ｅ　　Ｏ，１６０，１５０，１６２，６５（３）　　１．７９（２）Ｌｅｕ　　Ｏ，２７０−９６（１）　　１．０６（１）　　０．３６　　２．０９（２）Ｐｈｅ　　Ｏ，１７０−１７０，９６（］）　　１．８８（２）　　１．１４（１）Ｌｙｓ　　Ｏ，３１０，３６１，２２（１）　　２．１８（２）　　１．５０（１）分析されたｐｍｏｌ　１０５　　１００　　　９５　　　　３５　　　５３１２２−１２３　６７−７０　６−２１　　４１−５１　　５５−６０＋配列の位置　　　　　　　　　　２２−３１＋１０２−１２１ａ、アミノ酸の相対モル量が記載される。ＨＰＬＣ分画の幾つかにあっては、この量で存在するＱ　Ｉｙ、　Ｓｅｒ、Ａｌａ及びＡｓｐについては、分析は補正されていない。０内の数字は、配列に基づいて期待される残基の数を示している。０．１０当量より小さい量は示されていない。

ｂ、ペプチドＴ−８及びＴ−９は、この分離システムにおいて一緒に移動する。

このＩ；め、与えられｔ；組成は、両方のペプチドの組成である。

第３表　Ｄ１１６Ｎ−アンギオゲニン・からのトリプシンペプチドのアミノ酸組成ペプチド：　　　Ｔ−Ｉ　　　　　　Ｔ−２Ｔ−３ａ’　　　　　Ｔ−３ｂ　　　　　　Ｔ−４ａ’Ａｓｐ　２．６６（２）　　０．２１　　０．８０　　０．５９　　２．０　（２）Ｇｌｕ　１．０６（１）　　０−３１　　　　　　　０．４３　　０．３１Ｓｅｒ　１．２８（１）　　０．３６　　０．９８（１）　　１．３１（１）　　０．４６Ｇｌｙ　Ｏ，４３０，６４０，５１０，２０２，２５（１）Ｈｉｓ　Ｏ，３１０，４５１，０９（１）Ａｒｇ　１．３０（１）　　１．０４（１）　０．４３　　０．３２　　４．６１（１）Ｔｈｒ　Ｏ，１１ ’　　　０．１８　　０−１３　　０．１３　　１．１５Ａｌａ　　　　　　０４３　　　　　　　　　　　０．２６Ｐｒｏ　０．２８　　０．９９（１）　０．４２　　０．１３　　４．５５（１）Ｍｅｔ　１．００（１）　　　　　　　　　　　０．２８　　０．５８１１ｅ　Ｏ，３１０，９９（１）　　１．００（１）　　０．１５Ｌｅｕ　　　　　　０８１６　　　　　　　　　　　０．２１ｈｅＬｙｓ　Ｏ，３５０，１７１，０５（１）　　１．００（１）　　０．４７分析された第３表　　Ｄ１１６Ｎ−アンギオゲニン典からのトの続き　　リプシンペプチドのアミノ酸組成Ａｓｐ　Ｏ，４６１，１４（１）　　２．８０（３）　　２．２７（２）　　４．３８（４）（１；ｌｕ　Ｏ，１８２，１４（２）　　　　　　２−０６（２）　　３．０６（３）Ｓｅｒ　　　　　Ｏ，１４０，１１３，１１（３）　　１．２２（１）Ｇｌｙ　１．３４（１）　１．３７（１）　　１．８２（１）　　０．４９　　２．００（１）Ｈｉｓ　Ｏ，１９２，０４（２）　　０．９８（１）　　０．１３　　１．１５（１）Ａｒｇ　１．２８（１）　１．１２（１）　　０．９７（１）　　２．１８（２）　　１−３４（１）Ｔｈｒ　１．０９（１）　２．０４（２）　　１．０６（１）　　２．２２（２）　　０．３７Ａｌａ　２．０８（２）　１．０８（１）　　０−１２　　　　　　　１．９１（２）Ｐｒｏ　Ｏ，１８１，０９（１）　　　　　　　　　　　１．５６（１）Ｔｙｒ　　　　　１．９７（２）　　　　　　１．００（１）　　０．１１Ｖａｌ　　　　　　　　　　　　　　　Ｏ，９Ｂ（１）　　２．７２（４）Ｍｅｔ　　　　　Ｏ，１４０，２０１，０９（１）　　０．１９１ｉｅ　Ｏ，１６１，６４（２）　　１．０７（１）　　１．８６（２）Ｌｅｕ　　　　　１．００（１）　　０．１５　　　　　　　２．１３（２）Ｐｈｅ　Ｏ，９９（１）　１．００（１）　　０．８４（１）　　１．０３（１）　　１．００（１）Ｌｙｓ　Ｏ，０７１，０７（１）　　１．００（１）　　１−１４（１）　　１．２７（１）分析されたｐｍｏｌ　　２４０　２６３　　　９０　　　１５０　　　１４３ａ　アミノ酸の相対モル量が与えられる。ペプチドは先に記載したように、かつ第４図に示されているように命名される（　Ｓｔｒｙｄｏｍ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２４　：５４８６−５４９４．１９８５）、ＨＰＬＣの幾つかの分画にあっては、このレベルで存在するＧ　ＩＶ。

Ｓｅ「、Ａｌａ及びＡｓｐに対しては分析は補正されていない。０内の数字は配列に基づいて期待される残基の数を示す０．１０当量以下の量は示されない。

ｂ　、　　４０　ｐｍｏｌｅのＴ−４ａを含む。

ｃ　、　　１００ｐｍｏｌｅのＴ−２を含む。

第４表　　Ｄ１１６Ａ−アンギオゲニン１からのトリプシンペプチドのアミノ酸組成ペプチド：　　　Ｔ−Ｉ　　　　　Ｔ−２Ｔ−３ａ’　　　　　Ｔ−３ｂ　　　　　　Ｔ−４ａｈｓｐ　２．１０（２）　　　　　　１．５０　　０．６２　　１．４４（２）Ｇｌｕ　Ｏ，９２（１）　　　　　　０．４２　　０．３４　　０．２３Ｓｅｔ　１．３８（１）　０．１１　　１．２６（１）　　１．３９（１）　　０．３２Ｇｌｙ　Ｏ，４５０，４３１，０００，６２１，２７（１）　　　　　・Ｈｉｓ　Ｏ，１９０，５１０，１４０，６６（１）Ａｒｇ　１．０２（１）　０．９７（１）　　Ｑ、７４　　０．３１　　１．１３（］）ｈｒ１ａＰｒｏｏ、２０　　　ＬＯＯ（１）　　０．５５　　　　　　　１．１６（１）ＴｙｒａｌＮｅｔ　０．７５（１）　　　　　　０．１８　　０．２５１ｉｅ　Ｏ，５９１，０７（１）　　１．０７（１）　　０．１６Ｌｅｕ　　　　　　　　　　Ｏ，１３０，１１ｈｅＬｙｓ　Ｏ，４６０，８７（１）　　０．８２（１）　　０．２４分析されたｐｍｏｌ　　２００　２７０　　　１８０　　　９５　　　７５１４表　　Ｄ１１６Ａ−アンギオゲニン・からのト（ＩＲさ）　　リプシンペプチドのアミノ酸組成ペプチド：　　　　　　Ｔ−５７−６７−１１Ａｓｐ　　　１．１６（１）　　　０．３６　　　３．００（３）Ｇｌｕ　　　ｌ　、２５（１）　　　０．２６　　　３．２７（３）Ｓｅｒ　　　Ｏ，４６０，２３１−９５（１）Ｇｌｙ　　　Ｏ，９６１，６８（１）　　３．４８（１）Ｈｉｓ　　　　　　　　　Ｏ，１７０，８２（１）Ａｒｇ　　　０−９７（］）　　　１．１７（１）　　１．３８（１）Ｔｈｒ　　　Ｏ，１２０，９５（１）　　０．６５Ａｌａ　　　０ −１５　　　　２−０１（２）　　２−７０（３）Ｐｒｏ　　　１．１６（１）　　　０．１５　　　１．４３（１）Ｔｙｒ　　　Ｏ，１２０，２４Ｖａｌ　　　’０．１３　　　　　　　　　２．５６（４）Ｌａｕ　　　１．０．０（１）　　　０．１８　　　２．３６（２）Ｐｈｅ　　　Ｏ，１１１，００（１）　　１．０２（１）Ｌｙｓ　　　Ｏ，１４０，１５０，９０（１）分析されたｐｍｏｌ　　１８０　　　　１３０　　　９０ａ、アミノ酸の相対モル量が与えられる。ペプチドは先に述べたように（Ｓｔｒｙｄｏｍ　ｅｔ　ａｌ、Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ　ｉ　ｓ　ｔ　ｒｙ２４　：　５４８６−５４９４．１９８５）、かつ第４図に示されるように命名される。幾っがのＨＰＬＣ分画において、このレベルで存在するＧ　ｌｙ、　Ｓ　ｅｒ。

Ａｌａ及びＡｓｐに対しては分析は補正されない。０内の数字は、配列に基づいて期待される残基の数を示している。０．ｌＯ当量以下の量は示されない。

ｂ　、　　１００μｍｏｌのＴ−４ａを含有し、これはこの分析におけるＡＳｐｚ　Ｇ　ｌｕ及びＡｒｇのレベルに実質的に寄与する。

第２．３及び４表に示されているように、突然変異体アンギオゲニン蛋白からのＴ−１１ペプチド（Ｔ−１１’及びＴ−１１“）の組成は、所望の突然変異と一致する。構造中に他の変異がないことは明らかであった。ペプチドＴ−１０は、これはシス−トランスプロリン残基の存在のために２個の相互変換可能な形として存在するが、これはすべての消化物中に観察されｔ；。［Ｔ−１１はペプチドＴ−１１“（残基１０２−１２１）にジスルフィド結合したペプチドＴ−１１’ （残基５５−６０）から構成されていることに注意されＩ；い；また、ペプチドＴ−９は、ペプチドＴ−９“（残基７４−８２）にジスルフィド結合したペプチドＴ−９’（残基２２−３１）から構成されており：さらに、ペプチド１０は、Ｔ−１０″（残基８３−９５）にジスルフィド結合するペプチドＴ−１０’（残基３４−４０）から構成される〕。これらのペプチドは第４図に示されている。

突施例７酵素アッセイｔ　ＲＮＡに対する活性は、シャピロ等（５ｈａｐｉｒｏ　ａｔａ＋　）により記載された沈降アッセイ、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ８４　：　８７８３−８７８７　（１９８７）を使用して決定された。３００μ Ｑの容積中に３３ｍＭのＨｅｐｅｓ、　ｐＨ７、Ｏｓ　３３　ｍＭのＮａＣ１，０，６ｒｌｒ９のｔ　ＲＮＡ　（Ｓｉｇｍａ　ｔｙｎｅ　ｘ）及び３０μりのヒト血清アルブミンを含有する反応混合物を３７°Ｃで２．５〜４時間培養した。

反応は氷で冷やした３、４％の過塩素酸７００μＱを添加して停止させ、１０分間氷上に置いた後で、試料を４℃で１５６００ｇにて遠心分離した。次いで、２６０ｎｍにおける上澄み液の吸収を測定した。

ｒ　ＲＮ　Ａ　（１８Ｓ及び２８Ｓ）に対する活性は、ゲル電気泳動［シャピロ等（Ｓｈａｐｉｒｏ　ｅｔ　ａｌ）　、Ｂｉｏｃｈｅ−ｍｉｓｔｒｙ２５　：　３５２７−３５３２．１９８６］で検定した。

ＲＮａｓｅ基質シチジル（３′→５′〕アデノシン（ＣｐＡ　）及びウリジル（３’−５’）アデノシン（ＵｐＡ）に対する活性は、前記した敏感なＨＰＬＣ法［シャピロ等（Ｓｈａｐｉｒｏ　ｅｔ　ａｌ）　、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２５　：　３５２７−３５３２及び７２５５−７２６４．１９８６］を使用して決定された。３０ｍＭの２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（Ｍｅｓ）　、ｐＨ６，０、３０ｍＭＮａＣＩ及びＯ，１ｍＭジヌクレオシドリン酸を含有する反応混合物を３７℃でアンギオゲニン（０，７−３゜０μＭ）とともに培養した。各時間においてアリコツト（１５〜２０μＱ）を取り出し、’１０ｍＭのリン酸カリウム、９Ｈ７，０で平衝化した）（ＰＬＣカラム（ラジカルＰａＫＣｌ８、Ｗａｔｅｒｓ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ）に注入した。反応剤及び生成物の溶出は０．８ｒａＱ１分の流速度で１００ｏ＋Ｍのリン酸カリウム中の線形勾配メタノールｐＨ７，０を使用して完了させた。溶出は２５４ｎｍでモニターし、反応剤と生成物の積算された面積を式％式％］を使ってＫｃａｔ／Ｋｍを計算するために使用した。

アンギオゲニンのＡｓｐ−１１６突然変異体のりボヌクレオリティック活性における変化は、初めに、上述のとおりｐＨ７，０で基質としてｔＲＮＡを使用して試験した。結果は第３図（Ａ及びＢ）に示されている。

第３Ａ図は、２６０ｎｒａに８ける吸光度の変化（△Ａ２６０）を、突然変異体又は野性型アンギオゲニン蛋白濃度（０−１０μｙ／　ｒａ＜１）の関数として示している。第３Ｂ図は、単に、０と１．２μｇ／１ｎ（ｌの間の濃度に対する第３Ａ図の一部分の拡大図を示している。Ｄｌ１６Ｈ−アンギオゲニン（第３図において閉じた四角で示され、Ｈｉｓ−１１６として記載されている）及びＤ１１６Ａ−アンギオゲニン（第３図において開放の四角で示され、Ａｌａ−１１６と記載されている）は、野性型アンギオゲニン（第３図において閉じた丸として示され、かつ野性型、Ａｓｐ−１１６と記載されている）よりも１５倍活性であるのに対して、Ｄ１１６Ｎ−アンギオゲニン（第３図において開放の丸で示され、Ａｓｎ　−１１６と記載されている）は野性型よりも８倍活性である。このアッセイにおいて、野性をアンギオゲニンに関して有意な湾曲がみられ、これは明らかにｔＲＮＡ中の限定された数の開裂部位を反映している。

野性型及び突然変異体アンギオゲニンの曲線に沿った相対酵素活性の比較は、野性型及び突然変異体アンギオゲニンに対する同一の程度の湾曲を示している。これに対して、膵ＲＮａｓｅをアッセイにおいて使用すると、類似の湾曲はなく、その範囲において△Ａ２６０は線状である。

ｔ　ＲＮＡの開裂に対する　ｐＨのグラフをアンギオゲニン突然変異体及び野性型酵素について試験した。最適の活性はｐＨ約７．０において観察された。ｐＨ５からｌＯにおいて、突然変異体に対するｐＨグラフの形は、Ｄ１１６−アンギオゲニンを除いて、野性型のアンギオゲニンの形とは実質的に区別できない。この場合、野性型酵素と比べると、至適ｐＨは類似しているが、幾分高い活性が観察された。

Ｄｌ１６Ｈ−アンギオゲニン活性も、シャピロ等のＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２５：３５２７　３５３２　（１９８６）の記載のようにしてｐＨ７，０においてｒＲＮＡ（１８Ｓ及び２８Ｓ）で検定した。１５倍低い突然変異体アンギオゲニン濃度において、野性型アンギオゲニンにより産生される特徴的なポリヌクレオチド生成物の生成に関する経時変化は、極めて類似している。このように、１２〜１５倍のりポヌクレオリティック活性の増大が観察され、ｔＲＮＡアッセイにおける結果と一致した。慣用のＲＮａｓｅ基質のＣｐＡとＵｐＡに対する突然変異体アンギオゲニン蛋白の活性を決定し、第５表において、野性をアンギオゲニンの活性と比較する。基質としてｔ　ＲＮＡとｒＲＮＡの両方を使用したときの顕著な増大に反して、基質としてＣｐＡをＤ１１６Ｈ−アンギオゲニン及びＤ１１６Ａ−アンギオゲニンに対して使用するとそれぞれ３．３倍及び１．３倍の増大が観察された。Ｄ１１６Ｎ−アンギオゲニンは野性型アンギオゲニンよりも約４５％弱い活性である。ＵｐＡに対する活性は少くとも一桁低いものであり、再び、野性型と突然変異体アンギオゲニン蛋白の間でわずかな差異が見られるだけである。ここで用いられた条件下で測定したとき［ハーバ−等（Ｈａｒｐｅｒ　ｅｔ　ａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２７：２１９−２２６　（１９８７）　］　。

ＣｐＡ及びＵｐＡに関するウシＲＮａｓｅＡのＫｃａｔ／Ｋｍ値は、比較のために示すと、それぞれ、６Ｘ１０’Ｍ″″１Ｓ−１及び４　Ｘ　１０Ｂ　Ｍ−Ｉ　Ｓ−１である。このように、これらの突然変異体の新規な特徴は、ＣｐＡやＵｐＡのような慣用のＲＮａｓｅ基質に対しては顕著な活性の変化を生ずることなく、アンギオゲニンに特徴的なりボヌクレオリティック活性において劇的に増大することである。

第５表　アンギオゲニン及びＡｓｐ−１１６アンギオゲニン突然変異体によるジヌクレオシドリン酸の開裂Ｋｃ　ａ　ｔ　／Ｋｍ　（Ｍ−１ｓ−１）基質　野性型　　Ｄｌ１６Ａ−Ｄ１１６Ｈ−Ｄ１１６Ｎ−アンギオゲニン　　　アンギオゲニン　　　アンギオゲニン　　　　アンギオゲニンＣｐＡ　　　　１２　　　　　　　　　１６　　　　　　　　４０　　　　　　　　　　７ＵｐＡ　　　　Ｏ，５０，９２，９０，５実施例８生物学的アッセイ血管形成活性は、７エツト等（Ｆｅｔｔ　ｅｔ　ａｌ）のＢｉｏ−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２４　：　５４８０−５４８６　（１９８５）に記載されているように、ナイトン等（Ｋｎｉｇｈｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ）のＢｒ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ　３５　：　３４７−３５６　（１９７７）のヒョコ胚漿尿膜（ＣＡＮ）アッセイを使用して検定した。一定の濃度に対する個々のセットのアッセイにおいて使用した卵の数は、１０−１５の間であった第６表に示されるように、Ｄ１１６）（−アンギオゲニンから得たＣＡＭ活性のデータは、８個の別個の実験から集められ、同時に各実験において野性型のアンギオゲニンを使用して活性データを集めた。データはＡｓｐ−１１６をＨｉｓ−１１６に突然変異させることにより、血管形成の強さが１０〜１００倍増大することを示している。例えば、変異体アンギオゲニン蛋白は０．０５ｎｇにおいて最大の活性を示しているのに対しく即ち、６０％の陽性反応に接近している）、野性型のアンギオゲニンの活性は実質的に減少した。１ピコグラムにおいてさえ、Ｄｌ１６Ｈ−アンギオゲニンは、アッセイにおいて有意な活性を示している。今まで研究したすべてのアンギオゲニン蛋白において、血管形成活性及びリボヌクレオリティック活性は相関しておりかつ突然変異体アンギオゲニン蛋白の各々は有意に増大したりポヌクレオリティック活性を示しているので、Ｄｌ１６Ａ−アンギオゲニン及びＤ１１６Ｎ−アンギオゲニンがＤ１１６Ｈ−アンギオゲニンと類似の血管形成活性、すなわち、野性型の活性よりも実質的に増大した活性を示すであろうと期待される。

第６表　Ｄ１１６Ｈ及び野性型アンギオゲニンの血管形成活性試　料　　　　用量Ｃ＋＋＋９）　　陽性％（全卵数）Ｄ１１６）！−アンギオゲニン　　　　　　２０　　　　　　　　５９　　（２２）ｌｏ　　　　　５３　（２６）０．５　　　５８　（３６）０．０５　　４５　（４０）０．００５　　４２　（３５）０．００１　　３６　（１１）野性型アンギオゲニン　　　　　　１０　　　　　　　　６０　　（４７）０．５　　　　　　３３　　（２４）０．０５　　　　　２４　　（２５）０．００５　　　　２７　　（１１）実施例９Ｅ　、　Ｃｏ１１で発現された野性型又は突然変異体アンギオゲニンからのＭｅｔ（１）の除去Ｅ　、　Ｃｏ１１内での発現により得られた野性型又は突然変異体アンギオゲニンは血漿アンギオゲニンとは、前者がＮ末端メチオニン［Ｍｅｔ（１）］　を含むのに対し、後者がピログルタミン酸（環状グルタミン）を有する点で相異する。Ｅ、Ｃｏ１１由来の野性型アンギオゲニン（Ｎ−末端メチオニンを含む）のりポヌクレオリティック及び血管形成活性は、血漿由来のアンギオゲニンの場合［シャピロ等（５ｈａｐｉｒｏ　ａｔ　ａｌ）　、Ｂｉｏｃｈｅ−ｍｉｓｔｒｙ２５　：　３５２７　３５３２．１９８７］及びヒナハムスターの腎（Ｂ　ＨＫ）細胞中で発現されたアンギオゲニンの場合（米国特許第４，７２１．６７２号明細書）とは区別できない。

それにもかかわらず、ある応用においては、Ｎ−末端メチオニンを除去して、Ｎ −末端ピログルタミン酸をもつアンギオゲニンを提供することが好都合である。

これは、次のようにしてなされる。３７℃で、２００ｍＭのリン酸カリウムｐＨ７，２中にてｌｎＭのアエロモナスアミノペプチダーゼでＭｅｔＣ−１）アンギオゲニン（５−７μＭ）を２４時間処理すると、自発的かつ定量的なグルタミン（ｃｔｎ−１）のどログルタミン酸への環化を伴なって、９５％以上のＭｅｔ（ −１）が除去される。これらの結果は、ペプチダーゼ処理の後に精製した野性型アンギオゲニンの逆相ＨＰＬＣＮ末端配列決定法及びアミノ酸分析法に基づいて得られた。この物質は血漿又はＢＨＫ細胞由来の物質に同等の活性を示した。突然変位体アンギオゲニンを同様に処理すれば、Ｍｅｔ（−１）を除去して、Ｎ− 末端ピログルタミン酸を産生ずるように作用するであろう。

上述のことから、本明細書で本発明の特別の態様を例示の目的で記載したが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、種々の変形がなされうろことは明らかであろう。従って、本発明は付言しＩ；請求の範囲によって限定された場合を除き限定されるものではない。

国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．１１６位又はこれに相当するアスパラギン酸が他のアミノ酸で置換された突然変異体アンギオゲニン蛋白であって、増大した血管形成及びリボヌクレオリティック活性を有する突然変異体アンギオゲニン蛋白。
２．１１６位又はこれに相当する位置のアスパラギン酸を置換するアミノ酸がアスパラギン、アラニン又はヒスチジンである請求の範囲第１項記載の突然変異体アンギオゲニン蛋白。
３．請求の範囲第１項の突然変異体アンギオゲニン蛋白に対するコード配列を有するＤＮＡ配列。
４．請求の範囲第２項の突然変異体アンギオゲニン蛋白に対するコード化配列を有するＤＮＡ配列。
５．請求の範囲第３項のＤＮＡ配列を含むバクテリア性の宿主細胞を形質転換又は移入しうるベクター。
６．トリプトファンプロモーター及び翻訳開始領域配列をさらに含有する請求の範囲第５項記載のベクター。
７．請求の範囲第４項のＤＮＡ配列を有するバクテリア性の宿主細胞を形質転換又は移入しうるベクター。
８．トリプトファンプロモーター及び翻訳開始領域配列をさらに有する請求の範囲第７項のベクター。
９．薬学的に許容しうる担体中に請求の範囲第１項の血管形成に有効な量の突然変異体アンギオゲニン蛋白を含有する医薬組成物。
１０．薬学的に許容しうる担体中に請求の範囲第２項の血管形成に有効な量の突然変異体アンギオゲニン蛋白を含有する医薬組成物。
１１．請求の範囲第１項の蛋白をコード化するＤＮＡ配列を含有し、これを発現するために形質転換又は移入された宿主細胞。