JPH04316598A - 新規ペプチド、その塩及びこれを有効成分とする血圧降下剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、配列表で示される新規
ペプチド、その塩、及びこのペプチドを有効成分とする
血圧降下剤に関する。さらに、本発明のペプチドは、動
脈弛緩活性、オピオイド活性、オピオイドアンタゴニス
ト活性など種々の活性を有しており、医薬品、生化学試
薬などに利用可能である。

【０００２】

【従来の技術】従来から、ペプチド化合物が動脈弛緩活
性を有することは広く知られている。例えばブラジキニ
ン、サブスタンスＰ、ニューロテンシンはその代表的な
ものである。近年食品由来のペプチドに種々の生理活性
が存在することが知られてきており、食品由来の多くの
ペプチドが発表されている。本発明者らは、人乳カゼイ
ンのアミノ酸配列を研究する過程において、カゼインの
アミノ酸配列の一部を構成するペプチドが血圧降下など
種々の生理活性を有することを見出し、本発明を完成す
るにいたった。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明により提供され
るペプチドは、その構造中に、人乳カゼインの構造の一
部であるＴｙｒ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｐ
ｒｏ−Ｐｈｅ　の構造を持つことが特徴である。従って
、本発明は上記構造を有する新規なペプチド及びその塩
の提供、及びこのペプチド及びその塩を有効成分とする
新規血圧降下剤を提供することを課題とする。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明における新規なペ
プチドは、人乳カゼイン由来の下記構造を有している。 Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐ
ｈｅ本ペプチドは、精製人乳カゼインを酵素分解とする
ことにより、入手可能であるが、さらにより簡便には、
市販のペプチドシンセサイザー等を用いることにより化
学合成することができる。この化学合成により、天然の
人乳カゼイン中に存在しない配列を含んだペプチドも合
成することができる。化学合成においては以下の方法で
実施可能である。合成装置として、バイオサーチ社製の
ＳＡＭ２ペプチド合成装置を用いてペプチドの合成を行
う。 すなわち、樹脂に活性基を保護したアミノ酸を吸着させ
、これにデブロッキング液を注入して保護基を除去し、
活性基を保護したアミノ酸を注入し、両者を反応させ、
ジペプチドを合成する。この操作を順次くり返すことに
よってペプチドを合成する。ペプチドの担体としての樹
脂からの脱離と保護基の除去は、１０％アニソールを含
む無水フッ化水素中で、０℃の温度条件下に１時間撹拌
することにより行う。上記フッ化水素を留去した後、樹
脂をエーテルで洗浄し、３０％酢酸によりペプチドを抽
出する。抽出により得られたペプチドは、３０％酢酸で
平衡化したバイオゲルＰ−２カラム（２．６×８０ｃｍ
）を用いてゲル濾過した後、オクタデシルシリル（ＯＤ
Ｓ）カラム（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ　　５Ｃ１８，２×２５
ｃｍ）による逆相高速液体クロマトグラフィにより精製
する。目的とするペプチドは、０．１％トリフルオロ酢
酸を含むアセトニトリルの直線的濃度勾配による展開の
際に、３６％アセトニトリルの濃度付近でカラムから溶
出される。

【０００５】Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ
−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ　は、次の方法でカゼインを酵素加水
分解することにより調製することもできる。人乳カゼイ
ンより長沢らの方法（長沢他、Ｊ．　Ｄａｉｒｙ　Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ　５３，　１３６〜１４５Ｐ　１９７０）に
より抽出した粗κ−カゼイン画分をペプシンを用いて酵
素加水分解し、加熱により酵素を失活させた後、遠心を
行い上清を得る。この上清を上述したカラムと同じ条件
でＨＰＬＣ処理に付す。目的とする画分は３９％アセト
ニトリルの濃縮で溶出される。

【０００６】このようにして得られたペプチドをプロテ
インシーケンサーによる配列分析、アミノ酸組成を確認
することで、特定することができる。

【０００７】本発明の塩としては、ナトリウム塩、カリ
ウム塩などがある。

【０００８】本発明の新規ペプチド及びその塩は、血圧
降下作用を有することが特徴であるが、これ以外に、オ
ピオイドアゴニスト活性、オピオイドアンタゴニスト活
性、動脈弛緩活性、アンジオテンシ変換酵素阻害活性な
どの活性のうち、いくつかをあわせもっている。このよ
うにして得られたペプチドまたはその塩の投与量は、化
合物の種類、投与方法、患者の症状、年令などにより異
なるが、通常１回０．００１〜１０００ｍｇ、好ましく
は０．０１〜１０ｍｇを１日当り１〜３回投与すること
ができる。

【０００９】本発明のペプチドまたはその塩は、通常、
製剤用担体と混合して調製された製剤として一般には使
用される。製剤化にあたって使用される担体は、通常、
医薬品の製剤化に使用され、かつ、本発明のペプチド、
またはその塩と反応しない物質であればどのようなもの
でも使用することができる。例えば、乳糖、ブドウ糖、
マンニット、デキストリンなどの糖類、結晶セルロース
、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセ
ルロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ソルビ
タン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸エステル、脂肪酸グ
リセリンエステル、植物油、ワセリン、蒸留水などが挙
げられるが、これ以外のものも使用可能である。。剤型
としては、錠剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤などの経口
剤、坐剤、貼付剤、吸入剤、注射剤などを例示すること
ができるが、これ以外の投与型も可能である。注射剤に
おいては、使用時に生理食塩水、ブドウ糖液などに溶解
させても良く、またｐＨ調整のための緩衝剤や保存剤を
添加してもよい。

【００１０】以下に実施例及び実験例を示し、さらに本
発明を詳細に説明する。

【実施例１】　　（人乳カゼインよりＴｙｒ−Ｖａｌ−
Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ　の調製）人
乳全カゼインをＳｅｐｈａｄｅｘ　　Ｇ１５０にて長沢
らの条件〔ジャーナルオブ　　ディリー　　サイエンス
（Ｊ．　Ｄａｉｒｙ　Ｓｃｉ）　　誌５３、１３６−１
４５，　１９７０　〕で画分し、ｖｏｉｄ　　ｖｏｌｕ
ｍｅに溶出される画分を得た（ここにはκ−及びαＳ１
−カゼイン、ラクトフェリンが含まれている）　。この
画分をＨＣｌでｐＨ２とし、その濃度を１０ｍｇ／ｍｌ
とし、ペプシンを２００μｇ／ｍｌとなるように添加し
、３７℃で５時間反応を行い、１Ｎ−ＮａＯＨでｐＨ７
．５とした後、５０μｇ／ｍｌとなるようカルボキシペ
プチターゼＡを添加し３７℃で５時間反応させた。得ら
れた分解物を１０分間煮沸し、１０，０００ｒｐｍ１０
分の遠心にて不溶物を除いた後、上清をオクタデシルシ
ラン（ＯＤＳ）カラム（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ　　５Ｃ１８
，２５０×２０ｍｍ、ナカライテスク社製）を装着した
高速液体クロマトグラフ（Ｍ６００型、日本ウォーター
ズ社製）により、０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセ
トニトリルグラジュエント（０〜６０％／６０分、１０
ｍｌ／ｍｉｎ）にて展開した。アセトニトリル約３９％
にて溶出するピークに腸管収縮活性が認められた。

【００１１】このペプチドをプロテインシーケンサによ
り分析したところＴｙｒ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｐ
ｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ　の構造を有する人乳αＳ１−カ
ゼインに由来するペプチドであった。又、このペプチド
のアミノ酸組成を分析したところＰｈｅ：Ｐｒｏ：Ｔｙ
ｒ：Ｖａｌ＝２．１０：３．０６：０．９０：１．００
　の組成比を示し、理論値と一致した。さらに、このペ
プチドをシリカゲル薄層クロマトグラフィを行った。展
開溶媒としてブタノール：酢酸：ピリジン：水＝１５：
３：１０：１２を使用し、展開させたところ、Ｒｆ値は
０．８７であった。

【００１２】

【実施例２】　　（合成によるＴｙｒ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ
−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ　の製造）Ｓａｍ　
　ｔｗｏペプチド合成装置（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ社製）
により、同装置の標準プロトコールに従って合成した。 即ち１ｇ当り０．５ｍｍｏｌのｔ−Ｂｏｃ−Ｐｈｅ　を
結合したアシルオキシメチル樹脂２ｇをペプチド合成装
置の反応容器にセットし、４５％（ｖ／ｖ）トリフルオ
ロ酢酸、２．５％（ｖ／ｖ）アニソール、５２．５％（
ｖ／ｖ）ジクロロメタンを含むデブロック液と２０分間
接触させｔ−Ｂｏｃ　基を除いた。ジクロロメタンによ
る洗浄の後、１０％（ｖ／ｖ）ジイソプロピルエチルア
ミンを含むジクロロメタンにて樹脂中和し、ジクロロメ
タンにより洗浄した。その後６．７ｍｍｏｌのｔ−Ｂｏ
ｃ−Ｐｒｏ　及び６．７ｍｍｏｌのジイソプロピルカル
ボジイミド（それぞれ理論当量の６．７倍）を含む３４
ｍｌのジクロロメタン、ジメチルフォルムアミド混合液
中で２時間室温にて反応せしめた。ジメチルフォルムア
ミド及びジクロロメタンにて順次洗浄した後０．４ＭＮ
−アセチルイミタジールを含むジメチルフォルムアミド
中で未反応のα−アミノ基をアセチル化した。

【００１３】この樹脂をジクロロメタンにて洗浄した後
、上記と同様にデブロッキングを行い、以下同様にＣ末
端側からｔ−Ｂｏｃ−Ｐｒｏ，　ｔ−Ｂｏｃ−Ｐｈｅ，
ｔ−Ｂｏｃ−Ｐｒｏ，　ｔ−Ｂｏｃ−Ｖａｌ，　ｔ−Ｂ
ｏｃ−Ｔｙｒ（Ｃｌ２　Ｂｚｌ）を順次結合せしめ、ｔ
−Ｂｏｃ−Ｔｙｒ（Ｃｌ２　Ｂｚｌ）−Ｖａｌ−Ｐｒｏ
−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ樹脂を得た。この樹
脂を１０％アニソールを含む無水フッ化水素中で１時間
０℃にて反応させた後、フッ化水素の留去及びエーテル
による洗浄を行った。得られたペプチド及び樹脂の混合
物から３０％酢酸にてペプチドを抽出し凍結乾燥によっ
て約８００ｍｇの粗ペプチドを得た。

【００１４】粗ペプチドを０．１％トリフルオロ酢酸に
溶解した後、オクタデシルシラン（ＯＤＳ）カラム（Ｃ
ｏｓｍｏｓｉｌ　　５Ｃ１８，２５０×２０ｍｌ、ナカ
ライテスク社製）を接続した高速液体クロマトグラフ（
Ｍ６００型、日本ウォータース社製）により、０．１％
のトリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルの直線的濃度
勾配（０〜５０％／５０分、１０ｍｌ／分）にて展開し
た。目的とするペプチドは図１に示すようにアセトニト
リル濃度約３９％にてブロードなピークとして溶出され
た。このようにして得られた物質がＴｙｒ−Ｖａｌ−Ｐ
ｒｏ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ　であることは
アミノ酸分析（Ｐｈｅ：Ｐｒｏ：Ｔｙｒ：Ｖａｌ＝２．
０６：３．００：０．９０：１．００）及びプロテイン
シーケンサ（アプライドバイオシステムズ製４７７Ａ）
により確認された。なお、ペプチドの純品はＯＤＳカラ
ム（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ５Ｃ１８，１５０×４６ｍｌ、ナ
カライテスク社製）　から０．１％トリフルオロ酢酸を
含むアセトニトリルの直線的濃度勾配（０〜５０％／５
０分、１ｍｌ／分，５０℃）では図２に示すように約３
９％アセトニトリル濃度においてシャープな単一ピーク
を与えた。

【００１５】

【実施例３】（１）　　注射製剤の調製実施例２の方法
で得た合成ペプチド各１ｇを１０００ｍｌの生理食塩水
に溶解し、溶解後、０．２２μｍのフイルターを使用し
、無菌濾過し、１ｍｌずつアンプル中に封入した。 （２）　　錠剤の調製 実施例２の方法で得た合成ペプチド各１ｇにヒドロキシ
プロピルセルロース５ｇを含む６０％エタノール１７．
７ｍｌ、乳糖８８．５ｇを加え、充分混練する。次いで
減圧下で乾燥し、乾燥物にポテトスターチ５ｇ、ステア
リン酸マグネシウム１．５ｇを加え打錠器にて製錠し、
１錠当り、実施例２のペプチドを１ｍｇ含有する錠剤を
作製した。

【００１６】

【実験例】本発明によるペプチドは上述した血圧降下作
用に加え、オピオイドアンタゴスト活性、オピオイドア
ゴニスト活性、動脈弛緩作用、アンジオテンシン変換酵
素阻害活性などの効果を示す。実施例２により得た合成
ペプチドを用いた作用効果を下記の実験例により示す。 ■　　オピオイドアンタゴニスト活性、アゴニスト活性
モルモット回腸縦走筋神経叢標本のオピオイド作用薬（
アゴニスト）による収縮抑制を解除または増強する作用
により測定した。 測定方法：体重３００〜３５０ｇのモルモットにより抽
出した回腸から縦走筋神経叢標本を調製し、該標本の一
端を糸を介して等長性トランスジューサに接続し、他端
を内容積２ｍｌのマグナス管の底に固定した。マグナス
管にはクレプスーリンゲル液を満し、３７℃の温度に保
ち、Ｏ２　／ＣＯ２　混合ガス（９５：５）を通気した
。マグナス管内の電極には１０秒に１回の割合で電気刺
激（１０Ｖ、０．５ｍｓｅｃ）を与え、筋収縮の張力を
電気的に記録した。なお、収縮は、検体（ペプチド）の
オピオイドアンタゴニストによって抑制されアゴニスト
により増強される。本ペプチドは強いアンタゴニスト活
性を示した。

【００１７】■　　モルモット回腸収縮作用体重３００
〜５００ｇのモルモットより摘出した回腸縦走筋切片を
高木らの方法（高木他編、薬物学実験、９４〜９９Ｐ，
１９７２年南山堂）に従って処理し、上述のオピオイド
アンタゴニスト活性測定と同様に測定をした。但し、本
測定においては、回腸収縮反応を最大値の５０％誘起す
る値を求めた。ＥＣ５０は５０μＭであった。

【００１８】■　　イヌ腸管膜動脈弛緩作用イヌ腸管膜
動脈のらせん状切片をモルモット回腸収縮試験の場合同
様に、マグナス管中で等長性トランスジューサーに接続
した。０．５μＭのプロスタグランジンＦ２　αによっ
て収縮させた腸間膜動脈に対して本ペプチドは弛緩作用
を示した。ＥＣ５０値は２μＭであった。

【００１９】■　　血圧降下作用 脳卒中易発生高血圧ラット（ＳＨＲ−ＳＰ）を使った非
観血法により血圧降下を確認した。ウエダ製作所製ＵＲ
−１０００型小動物血圧測定装置を用いて同機の説明書
に従って測定を行った。即ち、４００ｇの雄脳卒中易発
生高血圧ラットを用い、無麻酔下で尾部にカフを装置し
血圧を測定する。サンプルの生理食塩水を静脈内に投与
して、３０分ないしは６０分ごとに血圧の変動を測定す
る。実施例２のペプチドを５ｍｇ／ｋｇ静脈より１回投
与した際の血圧降下の変動を図３に示す。

【００２０】■　　アンジオテンシン変換酵素阻害活性
まず、５ｇのラビットラングアセトンパウダーを５０ｍ
ｌの０．１Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．３）に
溶かし、４０００Ｇ、４０分の条件下で遠心処理し、そ
の上澄液をさらにに上記緩衝液で５倍に希釈し、アンジ
オテンシン転換酵素液を得た。本発明のペプチドを含む
試料を試験管に０．０３ｍｌ入れ、これに基質として、
０．２５ｍｌのヒプリルヒスチヂルロイシン（最終濃度
５ｍＭ、ＮａＣｌ　　３００ｍＭを含む）を添加し、３
７℃で１０分間保温後、上記酵素液を０．１ｍｌ添加し
、３７℃で３０分間反応させた。その後、１Ｎ塩酸０．
２５ｍｌを添加して反応を停止させた後、１．５ｍｌの
酢酸エチルを加え、酢酸エチル中に抽出されたヒプリル
酸の吸収２２８ｎｍの値を測定し、これを酵素活性とし
た。なお、この条件でペプチドを含まない場合の２２８
ｎｍ吸収値はほぼ０．２５である。このような実験を複
数行い、阻害率を次の式より算出した。

【数１】 ５０％阻害率を惹起する各ペプチド量（ＩＣ５０）を求
めたところ、ＩＣ５０は２６０μＭであった。

【００２１】

【発明の効果】本発明により、新規なペプチド及びこれ
を有効成分とする持続性のある新規血圧降下剤が提供さ
れる。また本発明による新規ペプチドはオピオイドアン
タゴニスト活性、オピオイドアゴニスト活性、回腸収縮
作用、動脈弛緩作用などさまざまな生理活性を示し、、
医薬あるいは生化学試薬に利用することができる。

【配列表】配列の長さ：７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 配列

【図面の簡単な説明】

【図１】高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）による実
施例２のペプチド、Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−
Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ　の室温における溶出曲線（Ｈ
ＰＣＬパターン）を示す。↓で示された画分が目的のペ
プチドを含む。

【図２】ペプチド、Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−
Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ　の純品の５０℃におけるＨＰ
ＣＬパターンである。

【図３】実施例２のペプチドのＳＨＲ−ＳＰに対する降
圧効果を示す。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　配列表に示されるペプチドまたはその
   塩
2. 【請求項２】　　請求項１記載のペプチドまたはその
   塩を有効成分とする血圧降下剤