JPS61500119A - ひとカルシトニン遺伝子関連ペプチド - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 ひとカルシトニン遺伝子関連ペプチド この発明は、新規ペプチド、特にひとカルシトニン遺伝子関連ペプチド、その製 造法およびその医薬用途に関するものである。

カルシトニンは、哺乳類を含めて広範囲のを索動物に見られる一連のペプチドホ ルモンを包含する。構造的関連性はあるが、カルシトニンは種に関連したペプチ ド配列の変化を示す。ひとを含む哺乳類では、カルシトニンは甲状腺のＣ細胞で 産生され、甲状腺から分泌される。カルシトニンは体内カルシウム平衡の維持に 重要な役割を果す。

最近、カルシトニンの遺伝子系が強力な研究の対象となっている。これにより、 ひとカルシトニン構造遺伝子の解明がなされ（ヨーロッパ特許出願公開ＥＰ−Ａ Ｉ−００７０６７５号）、ひとカルシトニン前駆体ペプチドのフランキング配列 に由来する、カタカルシンのようなペプチドそのものおよびカルシトニン前駆体 ペプチドの単離か行なわれるに至った（ヨーロッパ特許出願公開Ｅ　Ｐ　−Ａ　 １．−００７０１８６号）。

さらに、ラットのカルシトニン遺伝子に関する最近の研究から、この遺伝子に由 来する別のペプチドであってラットカルシトニン遺伝子関連ペプチドあるいはｒ −ＣＧＲＰと称されるものの存在が予言されるに至った。この想像上のペプチド の存在はヌクレオチド配列データに基づいて予言され、その存在についての確証 は免疫螢光配置およびイムノアッセイ技術によりもたらされた〔アマラ等、ネイ チャー２９８巻２４０−２４４頁（１９８２第）、ローゼンフエルド等、ネイチ ャー３０４巻１２９−１−３５頁（１９８３年）、およびフィッシャー等、ネイ チャー３０５巻５３４−５３６頁（１９８３年）〕。同様にヌクレオチド配列デ ータに基づき、ｒ−ＣＧＲＰは３７個のアミノ酸残基を含む配列からなり、２位 および７位の−Ｃｙｓ−残基間に推定ジスルフィド結合をもぢ、推定Ｃ末端アミ ド基を有するとされた。

この発明によると、ひとカルシトニン遺伝子関連ペプチドが単離、精製され、完 全な直接構造確認が行なわれ、例えば後記実施例に記載した゛特定の技術により 合成的に製造された。この発明′（よ、あらゆる動物種にオケルカルシトニン遺 伝子関連ペプチドについて最初の単離および直接構造確認をもたらしたものであ り、したがって従来推定上のものであったペプチドの存在について初めて不動の 証拠をもたらしたものである点が注目される。また、ｈ−ＣＧＲＰが（従来ｒ− ＣＧＲＰについて仮定されていたように）神経組織のみに見られるのでなく末梢 、例えば正常なひと甲状腺組織にも存在することが判明した点も注目に値する。

この発明により決定されたｈ−ＣＧＲ，Ｐの構造は式％式％ ］ 〔この明細書および請求の範囲において、ペプチドの構造／合成に関連して用い る略語と記号は、すべてＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ　の生化学命名法に関する合同委員 会の規定する標準命名法にしたがうものである（インターナショナル・ジャーナ ル・オブ・プロティン・アンド・ペプチド・リサーチ２４巻９頁、１９８４年参 照）。上記式中に示したアミノ酸残基はすべてＬ−配置を有する。〕 したがって、この発明はｈ　、−Ｃ（、ＲＰのアミノ酸配列を含むペプチド、ま たはその医薬的に許容される塩もしくは医薬的に許容される錯体を提供するもの である。

この発明のペプチドは、１ｌ−ＣＧＲＰそれ自体（すなわち、記載されたペプチ ド配列のＮ末端が非置換でありＣ末端がアミド化されている式（Ｉ）の化合物） のみでなく、例えば合成ｈ−ＣＧＲＰ　プロドラッグ形を含めで、生理学的条件 下て解裂して１ｌ−ＣＧＲＰを生成し得る他の天然および合成前駆体ペプチドを も包含する。

好ましい実施態様において、この発明は、上記式（Ｉ）で示されるペプチドのｈ −ＣＧＲＰ、またはその医薬として許容される塩もしくは医薬として許容される 錯体を提供するものである。

この発明のペプチドの適当な医薬として許容される塩は、例えば医薬として許容 される酸付加塩である。

このような医薬として許容される酸付加塩は、例えば有機酸、ポリマー酸または 無機酸との間で形成させることができる。このような酸付加塩形には、例えば塩 酸塩および酢酸塩が含まれる。。

医薬として許容される錯体とは、ペプチドに無機物質、例えばカルシウム塩およ び亜鉛塩のような無機塩もしくは水酸化物を添加し、および／またはポリマー性 有機物質の添加により形成される既知タイプの錯体であって、所望の用量レベル で生理学的に認容性のあるものを意味する。

特定の実施態様を列記すると、この発明は、上に定義したペプチド、特に上記式 （Ｉ）で示されるｈ−ＣＧＲＰであって、 ａ）単離形または精製形 ｂ）純粋形または実質的純粋形 Ｃ）医薬用途に適当な形、または ｄ）確認された形 Ｃ）体外形 のちの２、またはその医薬的に許容される塩もしくは医薬的に許容される錯体を 提供するものである。

」１記「単離」の語は、他の物質、特に他の化学的存在であって、分離しない限 りペプチドが天然に随伴しているものから、分離されていることを意味する。

「精製」の語は、例えば化学的または物理的精製のような精製技術を受けたこと を意味する。したがって、この語は、天然源から単’；’ｑ＊され＠製手段に付 されたペプチド、および人工的、例えば合成的Ｏこ、例えば化学合成技術または 遺伝子工学により得られ、精製手段に付されたペプチドの雨音に適用される。

「純粋なまたは実質的に純粋な」の語は、少なくとも５０％またはそれ以上の純 度を有することを意味する。「医薬用途に適する」の語は、形態および特に純度 において、後述する方法により医薬として適用するに適当なことを意味する。

「確認された」の語は、例えば医薬適用を目的とした、例えば化学′的純度を含 めて、構造の同定または構造的同一性の制御に付されたことを意味する。

１体外性」の語は、体内またはあらゆる身体システム内、例えばあらゆる臓器、 組織もしくは体液内、またはあらゆる細胞もしくは機能的細胞内単位内に、含ま れていないことを意味する。したがって、この語は、天然源から得られたペプチ ド並びに人工的に、例えば化学合成または遺伝子工学技術により得られたペプチ ドの両省に適用される。

この発明のペプチドは、当技術で公知であり一般に用いられる任意の方法で製造 することができる。例えば、これらは部分的または完全化学合成により製造する ことができ〔例えはメリフィールドの固相法（ジャーナル・オブ・ジ・アメリカ ン　ケミカル・ソサイアテイ８５巻２１４９頁、１９６３年、およびアドバンシ ズ・イン・エンナ゛イモロジー３２巻２２１頁、１９６９年）、例えば後記方法 〕、また遺伝子工学技術（例えば組換えＤ　Ｎ　Ａ技術）により製造することが できる。このような技術はすべて好都合であり、したかって、この発明はまた、 ｈ−、ＣＧＲＰ　のアミノ酸配列を含むペプチド、特に前記式（Ｉ）で示される ＋１−ＣＧＲＰペプチド、またはその医薬として許容される塩もしくは医薬とし て許容される錯体の製造法において、上記方法は、ａ）ｈ−Ｃ（、ＲＰ　のアミ ノ酸配列を含むペプチド、特に前記式（Ｉ）で示されるｈ−ＣＧＲＰ　ペプチド であって保護された形のものから少なくとも１つの保護基を脱離させること、 ｂ）それぞれ少なくとも１つのアミノ酸残基を遊離形または保護形で含む２つの ペプチド単位であって、上記ペプチド単位はｈ−ＣＧＲＰのアミノ酸配列を含む ペプチド、特に前記式（Ｉ）で示されるｈ−ＣＧＲＰペプチドが遊、離形または 保護形で得られるものである、２つの単位をア°ミド結合により連結し、必要な 場合には方法ａ）を実施すること、 Ｃ）ポリマー樹脂支持体に結合した１１−　ＣＧ　ＲＰのアミノ酸配列を含むペ プチド、特に前記式（Ｉ）のｈ−ＣＧＮＰペプチドであって、遊離形または保護 形のものを、上記支持体から上記ペプチドを遊離させる解裂反応に付し、必要な 場合には方法ａ）を実施すること、ｄ）Ｃ末端配列がｈ−ＣＧＲＰのアミノ酸配 列を含みＣ末端残基が−Ｐｈｃ−ＯＨであるペプチド、特に前記式（■）、のペ プチドであってＣ末端残基の−Ｐ　ｈ　ｅ　ＮＨ２か−Ｐ　ｈ　ｅ　−ＯＨで置 きかえられたものであつ゛Ｃ１遊離形または保護形のものを、アミド化し、必要 な場合には方法ａ）を実施すること、 ｅ）ｈ−ＣＧＲＰ　のアミノ酸配列を含むペプチドにおいて上記配列の２位およ び７位の−Ｃｙｓ−残基間の−５−Ｓ−架橋が完成していないもの、特に前記式 （Ｉ）のペプチドにおいて２位および７位の−Ｃｙｓ−残基間の−５−Ｓ−架橋 が完成されていないものであって、遊離形または保護形のものを、」二記−Ｃｙ ｓ−残基間の−５−Ｓ−架橋を完成させる酸化反応に付し、必要な場合には方法 ａ）を実施すること、および、得られたペプチドをそのまままたは医薬として許 容される塩もしくは医薬として許容される錯体として回収することを含む方法を 提供するものである。

以下に示す実施例１は、ｈ−ＣＧＲＰが最初【こ単離され、精製され、直接構造 分析が初めてなされた方法を示す。続〈実施例２は、この発明のペプチド類の製 造法を説明する、 実施例１ ｈ−ＣＯＲＰの単離、精製および構造同定式（ＩＩ） Ｈ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ　−Ａｓｎ　−Ｖａｌ　−Ｇｌ　ｙ−５ｅ ｒ−Ｇｌ　ｕ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｎ’Ｈ２（ＩＩ） で示されるペプチドを、ペニンスラ・ラボラトリーズ（ベルモント、カリホルニ ア、アメリカ合衆国）に発注して入手した。このペプチドは、アマラ（前出）力 （推定したｒ−ＣＧＲＰのＣ末端デカペプチドユニ・ントを含み、さらにラジオ イムノアッセイ用の結合およびよう素化に用いるＮ末端チロシンを含む。式（Ｉ ［）のペプチドを卵アルブミンとコンジュゲートさせ、フロインドアジュバント （ダイワロ）中で乳化したコンジュゲートの多回皮下注射を家兎に行なって抗血 清を作らせた。式（■・）のペプチドに対して特異的な抗血清を、ラジオイムノ アッセイ技術の常法にしたがって、ひと髄質性甲状腺がん（ＭＴＣ）組織抽出物 中における免疫学的関連性ペプチドの存否をスクリーニングするために使用した 。交差反応性（すなわち、ｒ−ＣＧＲＰ様）ペプチドが、試験した７人全員の組 織抽出物中に見られた。ｒ　−Ｃ０ＲＰとの交差反応性は、このペプチドがｈ　 −ＣＧＲＰであるとの同定に役立った。

さらに、正常なひと甲状腺組織抽出物についてアッセイを行なつ、た。それによ ると、普通のカルシトニンラジオアッセイで測定してカルシトニン９４Ｐ（ピコ ）モル／ｇ（湿潤重量）が存在したのに対して、抽出物中に交差反応性ペプチド （ｈ−ＣＧＲＰ　）が１．６８Ｐモル／ｇ（湿潤重量）存在することがわかった 。

交差反応性物質（すなわち、ｈ−ＣＧＲＰ　）の単離は次のように行なった（ｈ −ｃｃｉｐのラジオイムノアッセイは、何れの場合にも前記式（ｎ）の化合物を 用いて開発した系により行なった。

ＭＴＣ組織（１５ｇ）を、１５・％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、５％ぎ酸、１ ｊｇＮａＣｌ！、１．ＭＨＣｚ中でホモジネート化して抽出し〔ベネット等、バ イオケミカル・ジャーナル１７５巻１１３８−１１４１頁（１９７８年）〕、次 いでＣ１８セプパツク（５ｅｐ−Ｐａｋ　）カートリッジ（ウォーターズ・アソ シエーツ、ハートホード、チェシャー、英国）に吸着後、８０％メタノール、１ ％ＴＦＡで溶離した。溶離液を蒸留水で１：４に希釈し、シェル凍結し凍結乾燥 した。凍結乾燥済の抽出物を３０ｒｒｌｌの３０％酢酸、０．ＯＩＭβ−メルカ プトエタノール中で再構成し、Ｓｐ−セファデックスＣ−２５カラム（８３ｘ　 １．５　ｃｍ　）上へ送り込んだ。３０％酢酸中ＮａＣｌ！Ｏ−１，０Ｍの直線 勾配を溶離に用いた。流速は１０ｒｎｌ／時間であり、フラクションを３０分間 隔で集めた。各フラクションから少量（５μ２）をとり、希釈し、ラジオイムノ アッセイによりカルシトニン、カタカルシンおよびｈ　−ＣＧＲＰの存在を確認 した。

第１図は得られたクロマトグラムを示す。ｈ−ＣＧＲＰはフラクション６２．６ ３，６４に単一ピークとして溶離した（第１図）。フラクション６３．６４を、 ＨＰ　Ｌ　Ｃでさらに精製するのに用いた。これら２つのフラクション（ＣＧＲ Ｐ含量：　２８５μｇ）を合わせ、３部分（２ｍｌ、４ｍｌ、４イ）に分け、凍 結乾燥した。

各凍結乾燥部分を５ｍｌの４０％メタノール、０．２％ＴＦＡ中で再構成し、ス フエリンルブ５μ０ＤＳ（クイーンズフエリ、クルウィド、英国）カラム（１０ ×０、４６　ｃｍ　）に送り込んだ。

充填後、流出液を２１０皿で調べでＵＶ吸収がベースラインの値にもどるまで、 カラムを最初の溶媒で洗浄した。次いで、カラムを直線メタノール勾配４．０− ９０％、０．２％ＴＦＡで溶離した。各フラクションから５μｍ部分をとり、ｈ −ＣＯＲＰのラジオイムノアッセイに適′するように希釈した。第２図は、得ら れたＨＰＬＣ分析結果を示す。ｈ　−ＣＧＲＰ　ピークは主要なＵＶ可視ピーク に対応する。

２つのＨＰ　Ｌ　Ｃツｙラムからの精製物質を、蛋白質化学および質量スペクト ル法、特にＦＡＢマツピング法−６３１頁（１９８１年）、ネイチャー３０４巻 ６４３−６４５頁（１９８２年）、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル ・リサーチ・コミュニケーションズ１１７巻２９９−３０５頁（１９８３年）お よびバイオメディカル・マス・スペクトロメトリー８巻４６３−４７３頁（１９ ８１年）、並ひにバーバー等、ケミカル・コミュニケーションズ３２５−３２７ 頁（１９８１年）〕によるペプチド構造分析および配列決定に直接使用した。

単離精製したｈ　−ＣＧＲＰの構造は、前記式（Ｉ）で示されるものであること がわかった。

ｈ　−ＣＧＲＰの構造は、公開されたｒ　−ＣＧＲＰの推定配列と、特に１．３ ．２５および３５位において本質的に異なっている。推測されていたーＣｙｓ− 間の−５−Ｓ−架橋の存在は２位と７位間に見られ、推測されていたＣ−末端ア ミド基の存在はｈ　−ＣＧＲＰで始めて証明され厳密に確認された。

実施例２ ｈ−ＣＧＲＰの合成 エニルアラニルーペンズヒドリルーコポリスチレンージビニルベンゼン樹脂（２ ，１ｇ、　０．５　ミリモル）を、下記の洗浄および反応サイクルに付す。（１ ）メチレンクロリド、（２）メチレンクロリド中、５０％トリフルチ オロ酢酸および５％エタンジオール、（３）メチレンクΔ ロリド、（４）メチレンクロリド中３３％ジオキサン、（５）メチレンクロリド 中５％ジイソプロピルアミン、（６）メチレンクロリド、（７）メチレンクロリ ド中２０％Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミドに予じめ製造したＢｏｃ−アラニン対 称無水物（１，５ミＩＪモル）を入れた溶液、（８）メチレンクロリド、（９） メチレンクロリド中３３％エタノール。

各工程を、反応完結または樹脂から上記試薬を完全除去するに必要な回数だけ反 復する。この反応サイクルを、式（Ｉ）の配列を得るに必要な全Ｂｏｃ−アミノ 酸について′くり返すが、Ｂｏｃ−アスパラギンの場合は例外として工程（７） で予じめ製造した１−ヒドロキシベンゾＩ−ＩＪアゾールエステルをＤＭＦ中で 用いて縮合させる。

Ｂｏｃ−基をすべてのアミノ酸のアルファアミン基の保護に用い、下記の基を側 鎖官能基の保護に用いる。

ＬｙＳ：２−クロロヘンシル、Ｓｅｒ：ベンジル、ＴｈｒＨベンジル、Ａｒｇニ ドシル、Ｈ１Ｓニドシル、Ｃｙｓ：４−メトキシベンジル、Ａｓｐ：ベンジル。

最後のＢｏｃ−アラニンの縮合後、樹脂をエタノールで洗浄し完全に乾燥する。

ペプチド樹脂の一部（２ｇ）をアニソール（３ｒｎｌ）およびふつ化水素（１５ ，＋７りと一２０℃で２０分間および０℃で３０分間処理し、ＨＦを０℃で減圧 除去する。残渣をエチルエーテルで洗浄し、１０％酢酸水で抽出する。溶液を脱 気水で２リツトルに希釈し、ＰＨを水酸化アンモニウムで６．８に調節し、フェ リシアン化カリウム（３ｇ／水１リットル）を黄色が１５分間持続するまで滴下 する。ｐＨを酢酸で５．０に調節し、弱塩基性アニオン交換樹脂（ＡＣ３−Ｘ２ 、バイオラド・ラボラトリーズ）のカラムを介して沖過し、弱酸性カチオン交換 樹脂（バイオレックス７０、酸形、バイオラド・ラボラトリーズ）に通し、水お よび５％酢酸水で洗浄する。ペプチドをバイオレックスのカラムから５０％酢酸 水で溶離し、溶液を減圧濃縮し、水にとかし、凍結乾燥する。セファデックスＧ ２５（ファルマシア・ファイン・ケミカルズ）のカラムを通すゲル透過クロマト グラフィーおよび例えばリバイヤー等、ジャーナル・オブ・クロマトグラフィー ２８８．３０３（１９８４年）記載の逆相調製用１（Ｐ　Ｌ　Ｃによりペプチド を精製する。クロマトグラフィのフラクションをＨＰ　Ｌ　Ｃでモニターシ、充 分生成物であるペプチド（式（Ｄのｈ−ＣＧＲＰ）の〔α〕　は−６６，３’。

（５％酢酸中、Ｃ＝０．３）である。

ペプチドの組成は、６ＮＨＣｚ含有減圧封管中１１５℃で１６時間加水分解して 確認した。

アミノ酸分析： Ａｓｐ、Ａｓｎ（４）３．９６、Ｔｈｒ（４）　３．６１．５ｅｒ（３）２．８ ９、Ｐｒｏ（１）１．０３、Ｇｌｙ（４）４．０６、Ａｌ　ａ　（４）　３．９ ５、Ｃｙｓ（２）ｉ、５７、Ｖａｌ　（５）　４．７９、Ｌｅｕ（３）２．９７ 、Ｐｈｅ　（２）２，０２、Ｈｉｓ　（１）１．０３、Ｌｙｓ（２）２．１０゜ Ａｒｇ　（２）　２．０８　Ｃかっこ内は理論値を示す〕ＨＰ　Ｌ　Ｃで定量し たところ、ペプチドの純度は約９８．８％であった。

合成ペプチドにＦＡＢマツピング法を適用したところ、それが実施例１で得た天 然ペプチドと同一であることを示した。

この発明のペプチド、特にｈ−（：ＧＲＰペプチド、並びにその医薬として許容 される塩および医薬として許容される錯体は、価値ある薬理活性を示し、したが って、例えば治療用途に用いる医薬として有用である。

特ニ、コレらは、例えば下Ｈｄ動物試、験モデルテ示すれるように、強力な血管 拡張活性を示す。

家兎皮ふにおける多部位１３３キセノンクリアランス法〔ウィリアムス、ジャー ナル・オブ・フィジオロジー２５４巻４−５頁（１９７６年）およびプリティシ ュ・ジャーナル・オブ・ファーマクロジー６５巻５１７−５２４頁（１９７９年 〕〕 試験物質、例えばｈ　−ＣＧＲＰを　Ｘｅ溶液（５−１０μＣｉ／注射）と混合 し、麻酔したニューシーラント白色家兎のクリップした背部皮ふ上のマーク部位 に種々の濃度の１００μｌ容量を急速に注入する。

庁内注射は、７処置／動物のそれぞれについて６反復づつ、予じめ定めたバラン スのとれた部位パターンにしたがってランダムブロックオーダーで行なう。ｈ− ＣＧＲＰ冬用量を、公知の血管拡張薬、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）の 標準用量、および燐酸緩衝食塩水対照と比較して試験する。

動物を〜１５分後に層殺し、背部皮ふを切りとり、注射部位を直径１７ｍｍの皮 ふ用パンチで切離す。皮ふ試料および注射液の試料の放射能を自動計数器で測定 し、試験物質によって誘発される血液流の変化を下式から上記対照に対する増加 率％として計算する。

１００（食塩水注射皮ふの　Ｘｅカウント−薬剤注射皮ふの１３３Ｘｅカウント ）／（注射液１ｒｒｌの１．３３　Ｘｅカウント−食塩水注射皮ふの１３３Ｘｅ カウント）上記の試験法において、この発明のペプチド、特にｈ　−ＣＧＲＰは 、２５℃モルおよび例えば２．５Ｐモル以下の用量で用量に依存して、対照との 比較上顕著な血液流増加を示す。ｈ　−ＣＧＲＰの観測効力はＰ　Ｇ　Ｅ　２の 値と同一まこは類似オーダーである。静脈内１２５Ｉ−アルブミンを用いた微小 血管漏洩の測定で明らかになったところでは、２．５Ｐモル以下の用量でｈ　− ＣＧＲＰの使用により血管の透過性上昇は見られない。

インビボ・ハムスターはお袋標本の直接顕微鏡観察〔タリンク、マイクロバスキ ュラー・リサーチ５巻４２３−４２９頁（１９７３年）〕 上記試験法で得られた結果が大抵抗血管である細動脈の拡大の結果起ったことの 確認は、インビボ・ハムスターはお袋標本の直接顕微鏡観察により得られる。

この試験では、インドメタシン（２，６ｘ　１０−６Ｍ　）含有修正クレブス食 塩水で微小血管床をかん流する。この発明のペプチド、例えばｈ−ＣＧ’ＲＰを 例えば２．５Ｐモル／１０μｌで高細動脈トーンの標本（自発性またはノルアド レナリンかん流で誘発）に局所適用すると、１２．８±３５μｍ〜３９．３±６ ３μｍの細動脈拡大が起った。このような試験の１つでｈ　−ＣＧＲＰに応答し て見られた細動脈拡大は、適用２分後で最大となり、少なくとも５分間続いた。

この発明のペプチド、特にｈ−ＣＧＲＰは、また、下記試験モデルの示すところ によると、心拍速度および心筋収縮力に強力な作用を示す。

分離ラット耳介モデル ラットの分離耳介を、３７℃の１０７ｎ！器官浴中で酸素化タイロード溶液中に 等長トランスデユーサ−（レクトロメドＵＦＩ）からけん垂する。標本の休止張 力を１ｇに調節し、組織を試験開始Ｆｒ１１９０分間平衡させる。収縮速度はレ クトロメド４５２２計数率計により等尺張力の変化から換算し、収縮速度および 収縮力の両者をワタナベＷＲ３１０１ペンレコーダーで記録スる。試験物質例え ばｈ　−ＣＧＲＰを直接浴に加えて最終濃度１−５０　ｎＭにする。プロプラノ ロールを７．７×１０−６Ｍの濃度で浴に加える。この濃度は約４０拍／分の収 縮減少を招く。標本が新らしい速度で安定したとき（プロプラノロール添加約９ ０分後）試験物質を加える。

この発明のペプチド、特にｌｌ−Ｃ０ＲＰは、上記試験法においで、約１−２５ １Ｍの濃度で収縮速度および収縮力の増加をもたらす。

分離ラット心臓モデルの心室収縮に対する影響ラットの分離心臓のランゲンドル フ標本においで、この発明のペプチド、特にｈ−ＣＧＲＰは、１Ｏ−５００Ｐモ ルの用量をかん流液へのホーラス注射て投与すると、冠血流量の増加と心室収縮 速度および収縮力の増加をもたらす。

したがって、この発明のペプチド、特にｈ−ＣＧＲＰ。

並ひにその医薬として許容される塩および医薬として許容される錯体は、例えは 心臓血管薬として、特に末梢性血管病の処置（例えば間欠性波性を含めた四肢に おける如き、末梢循環障害の予防または処置）並びに冠血管疾患の処置（例えば 冠動脈不全の予防または処置）に用いる医薬として有用である。別の適用領域は 、例えば冠動脈のトーンの測定試験、例えば他の薬剤療法または冠動脈バイパス 療法のような冠動脈外科の適応（（関連する試験のような患者試験°である。

上記の用途ｔこおいて、使用用−量は勿論個々の使用化合物、投与法、処置すべ き状態および目的とする効果により異なる。しかし、一般に例えばｎ　−ＣＧＲ Ｐを１日約０．００１５−約０．１５、好ましく□は約０．００７５−約０．０ ７５、最適には約０．０１５１ｎ９／ｋｇ　（動物体重）の用量で例えば静脈注 射により好便に投与すると満足すべき結果が得られる。大形＠乳類に対しでは、 適当な１日用量は約０．１−約１０．０、好ましくは約０゜５−約５．０１最適 には約１．０　’Ｘ９であり、これを、例えば１日１回または１日２−４回の分 割用量として静脈注射により、または持効性製剤として投与し、静脈投与または 皮下投与の適当な単位用量形態は、約０．０２５−約１０、好ましくは約０．０ １２５−約５，０、最適には約０．２５”＋７のペプチド、例えばｎ　−ＣＧＲ Ｐ　、またはその医薬として許容される塩もしくは医薬として許容される錯体を 、適当な医薬として許容される希釈剤または担体との混合物として含むものであ る。

この発明のペプチド、例えばｈ　−ＣＧＲＰは、この発明で使用を考慮する用量 で充分な忍容性を有する。

すなわち、正常な健康人志願者に約１０分間にわたり０．５”ｌＰ／ｋｇ以下の 用量で前腕掌側面に合成ｈ−ＣＧＲＰを皮肉投与した実験では、僅かｏ、１ｍｇ ／ｋｇの用量でも局所性末梢血管拡張が見られたが不都合な作用は全く見られな かった。

この発明の方法で用いる医薬組成物は、例えば注射または鼻内投与のためのペプ チド製剤の製造技術で公知の標阜的製剤法にしたがって製造することができる。

例えば静脈注射剤は、有効成分、例えばｈ　−ＣＧＲＰを適当な媒質例えば水性 媒質中の溶液またはけんたく液として含むのが適当である。

したがって、この発明は、さらに ａ）＠に定義したこの発明のペプチド、例えばｈ−ＣＧＲＰ　、またはその医薬 として許容される塩もしくは医薬として許容される錯体を、医薬として許容され る希釈剤または担体と共に含有してなる医薬組成物、ｂ）処置をする必要がある 対象に、前に定義したこの発明のペプチド、例えばｈ　−ＣＧＲＰ　、またはそ の医薬上許容される塩もしくは医薬上許容される錯体の有効−量を投与すること からなる、上□記対象における心臓血管病の処置方法、および Ｃ）医薬として使用する（例えば医薬用途に適した純度をもつ）、例えば面記の ゛ような心臓血管病の処置に使用する、前に定義し′たこの発明のペプチド、例 えばｈ　−ＣＧＲＰ、またはその医薬として許容される塩もしくは医薬として許 容される錯体 を提供するものである。

ＦＩＧ、　１ 甲ヤシ垢＠寸力＼ん、丘Ω−胆戊抄ヒナ勿的η手オン梵挟２０７トプ′ラム　（ ｓｐ−ぞ）、デ、ンλＣ−２５）Ｆ旧２ フランシッフｊｔｒ＋ 国際調査報告

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）ｈ−ＣＧＲＰのアミノ酸配列を含むペプチド、またはその医薬として許容 される塩もしくは医薬として許容される錯体。
2. （２）式（Ｉ） 【配列があります】 で示されるｈ−ＣＧＲＰである、請求の範囲第１項記載のペプチド。
3. （３）単離もしくは精製形である請求の範囲第１項記載のペプチド、またはその 医薬として許容される塩もしくは医薬として許容される錯体。
4. （４）純粋もしくは実質的純粋形である請求の範囲第１項記載のペプチド、また はその医薬として許容される塩もしくは医薬として許容される錯体。
5. （５）確認された形である請求の範囲第１項記載のペプチド、またはその医薬と して許容される塩もしくは医薬として許容される錯体。
6. （６）体外形である請求の範囲第１項記載のペプチド、またはその医薬として許 容される塩もしくは医薬として許容される錯体。
7. （７）請求の範囲第１項記載のペプチド、またはその医薬として許容される塩も しくは医薬として許容される錯体を、医薬として許容される希釈剤または担体と 共に含有してなる、医薬組成物。
8. （８）処置を必要とする対象に、請求の範囲第１項記載のペプチド、またはその 医薬として許容される塩もしくは医薬として許容される錯体の有効量を投与する ことからなる、上記対象における心臓血管病処置法。
9. （９）医薬用の、例えば医薬として用いるに適した純度をもつ、請求の範囲第１ 項記載のペプチド、またはその医薬として許容される塩もしくは医薬として許容 される錯体。
10. （１０）心臓血管病の処置用のものである、請求の範囲第９項記載のペプチド。