JPH0687890A - ヒトカルシトニン関連ペプチド - Google Patents
ヒトカルシトニン関連ペプチドInfo
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- JPH0687890A JPH0687890A JP5005267A JP526793A JPH0687890A JP H0687890 A JPH0687890 A JP H0687890A JP 5005267 A JP5005267 A JP 5005267A JP 526793 A JP526793 A JP 526793A JP H0687890 A JPH0687890 A JP H0687890A
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】 カルシトニン遺伝子関連ペプチド、その製造
法の提供。 【構成】 下記式（Ｉ）の構造を有するペプチド。 Ala-Cys-Asp-Thr-Ala-Thr-Cys-Val-Thr-His-Arg- -Leu-Ala-Gly-Leu-Leu-Ser-Arg-Ser-Gly-Gly- -Val-Val-Lys-Asn-Asn-Phe-Val-Pro-Thr-Asn- -Val-Gly-Ser-Lys-Ala-Phe-アミド （Ｉ） 上記ペプチドは、側面に位置する塩基性アミノ酸残基を
認識するタン白分解酵素により分泌経路内部で生体内特
異的に切断されるポリタン白質の一部として形成され
る。このペプチドは心血管機能の調整に潜在的生物学的
効果を有することが分った。特に、このペプチドは血圧
降下を誘因しかつ心搏度数と力を増進させることが分っ
た。
法の提供。 【構成】 下記式（Ｉ）の構造を有するペプチド。 Ala-Cys-Asp-Thr-Ala-Thr-Cys-Val-Thr-His-Arg- -Leu-Ala-Gly-Leu-Leu-Ser-Arg-Ser-Gly-Gly- -Val-Val-Lys-Asn-Asn-Phe-Val-Pro-Thr-Asn- -Val-Gly-Ser-Lys-Ala-Phe-アミド （Ｉ） 上記ペプチドは、側面に位置する塩基性アミノ酸残基を
認識するタン白分解酵素により分泌経路内部で生体内特
異的に切断されるポリタン白質の一部として形成され
る。このペプチドは心血管機能の調整に潜在的生物学的
効果を有することが分った。特に、このペプチドは血圧
降下を誘因しかつ心搏度数と力を増進させることが分っ
た。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はペプチド、医薬組成物、
ペプチドの製造法、ペプチドをコードする遺伝子、この
遺伝子を含むベクターとこのベクターで形質転換させた
宿主生物体、および診断に使用する遺伝子プローブと抗
体に関する。
ペプチドの製造法、ペプチドをコードする遺伝子、この
遺伝子を含むベクターとこのベクターで形質転換させた
宿主生物体、および診断に使用する遺伝子プローブと抗
体に関する。
【０００２】
【従来の技術】カルシトニン遺伝子系は近年かなりの研
究の首題であった。特に、ラットカルシトニン遺伝子発
現の研究により証明されたことは、単一遺伝子から各種
ペプチドホルモンを産生するために、明かに組織特異的
に選択的ｍＲＮＡ種の、ＲＮＡプロセッシングによる、
発生である（クレイグ・アール・ケイ等（１９８３）、
ジエネティック・エンジニアリング（Ｇｅｎｅｔｉｃ
Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）４，５７−１２５およびアマ
ラ等（１９８２）ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２９８，
２４０〜２４４）。各ｍＲＮＡ種はポスト翻訳プロセッ
シング結果により分裂したポリタン白質をコードし、ラ
ットカルシトニン又はラットカルシトニン遺伝子関連ペ
プチド（ラットＣＧＲＰ）を産生する。ラットＣＧＲＰ
は中枢神経系と末梢神経系の不連続領域に広く分布して
いることは公知であり、そこで潜在的生物活性を有する
ことが分った（フィッシャー等（１９８３）、ネイチャ
ー（Ｎａｔｕｒｅ），３０５，５３４〜５３６）。
究の首題であった。特に、ラットカルシトニン遺伝子発
現の研究により証明されたことは、単一遺伝子から各種
ペプチドホルモンを産生するために、明かに組織特異的
に選択的ｍＲＮＡ種の、ＲＮＡプロセッシングによる、
発生である（クレイグ・アール・ケイ等（１９８３）、
ジエネティック・エンジニアリング（Ｇｅｎｅｔｉｃ
Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）４，５７−１２５およびアマ
ラ等（１９８２）ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２９８，
２４０〜２４４）。各ｍＲＮＡ種はポスト翻訳プロセッ
シング結果により分裂したポリタン白質をコードし、ラ
ットカルシトニン又はラットカルシトニン遺伝子関連ペ
プチド（ラットＣＧＲＰ）を産生する。ラットＣＧＲＰ
は中枢神経系と末梢神経系の不連続領域に広く分布して
いることは公知であり、そこで潜在的生物活性を有する
ことが分った（フィッシャー等（１９８３）、ネイチャ
ー（Ｎａｔｕｒｅ），３０５，５３４〜５３６）。
【０００３】係属中のヨーロッパ特許出願ＥＰ−Ａ1 −
００７０１８６号とＥＰ−Ａ1 −００７０６７５号（ア
ール，ケイ，クレイグとアイ，マッキンタイア）には、
ヒトカルシトニンおよびＰＤＮ−２１と称するカルボキ
シ末端ペプチド（カタカルシン）の製造法が記載されて
いる。ヒトカルシトニンおよびカタカルシンはヒトカル
シトニンｍＲＮＡによりコードされるポリペプチドとし
て生成される（クレイグ等（１９８２）ネイチャー（Ｎ
ａｔｕｒｅ），２９５，３４５〜３４７）。
００７０１８６号とＥＰ−Ａ1 −００７０６７５号（ア
ール，ケイ，クレイグとアイ，マッキンタイア）には、
ヒトカルシトニンおよびＰＤＮ−２１と称するカルボキ
シ末端ペプチド（カタカルシン）の製造法が記載されて
いる。ヒトカルシトニンおよびカタカルシンはヒトカル
シトニンｍＲＮＡによりコードされるポリペプチドとし
て生成される（クレイグ等（１９８２）ネイチャー（Ｎ
ａｔｕｒｅ），２９５，３４５〜３４７）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明者は、ヒト髄質
癌腫細胞に転写されかつヒトカルシトニンｍＲＮＡの
３′翻訳領域末端に位置するヒトカルシトニン遺伝子領
域を見出した。この領域は転写イントロン領域、スプラ
イス接合部、従来未知のヒトペプチド配列をコードする
開放読み取り枠、およびポリＡ残基の域を末端とする
３′未翻訳領域から成る。このペプチドの１つは明かに
ラットＣＧＲＰの類似体であり、以後これをヒトカルシ
トニン遺伝子関連ペプチド（ヒトＣＧＲＰ）と呼ぶ。
癌腫細胞に転写されかつヒトカルシトニンｍＲＮＡの
３′翻訳領域末端に位置するヒトカルシトニン遺伝子領
域を見出した。この領域は転写イントロン領域、スプラ
イス接合部、従来未知のヒトペプチド配列をコードする
開放読み取り枠、およびポリＡ残基の域を末端とする
３′未翻訳領域から成る。このペプチドの１つは明かに
ラットＣＧＲＰの類似体であり、以後これをヒトカルシ
トニン遺伝子関連ペプチド（ヒトＣＧＲＰ）と呼ぶ。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明の第１特長によれ
ば、ヒトカルシトニン遺伝子関連ペプチドを供する。本
発明の第２特長によれば、構造：
ば、ヒトカルシトニン遺伝子関連ペプチドを供する。本
発明の第２特長によれば、構造：
【０００６】
【化７】
【０００７】を有するペプチドを供することである。こ
の新規ペプチドは、側面に位置する塩基性アミノ酸残基
を認識するタン白分解酵素により分泌経路内部で生体内
特異的に切断されるポリタン白質の一部として形成され
る。このペプチド（タテモトおよびマット（１９８１）
ＰＮＡＳ ７８，６６０３〜６６０７の命名によりＰＡ
Ｆ−３７と記述された）は心血管機能の調整に潜在的生
物学的効果を有することが分った。特に、このペプチド
は血圧降下を誘引しかつ心搏度数と力を増進させること
が分った。
の新規ペプチドは、側面に位置する塩基性アミノ酸残基
を認識するタン白分解酵素により分泌経路内部で生体内
特異的に切断されるポリタン白質の一部として形成され
る。このペプチド（タテモトおよびマット（１９８１）
ＰＮＡＳ ７８，６６０３〜６６０７の命名によりＰＡ
Ｆ−３７と記述された）は心血管機能の調整に潜在的生
物学的効果を有することが分った。特に、このペプチド
は血圧降下を誘引しかつ心搏度数と力を増進させること
が分った。
【０００８】本発明の第２特長において、このペプチド
は医薬として、望ましくは高血圧の治療に使用するのに
供される。主たる心臓外科（例えば開放心臓バイパス手
術）の手術後段階では、患者にとって、広範囲の血管収
縮により手術のストレスに感応するのが普通である。こ
のことは患者の血圧を上げる作用となるから、心臓を緊
張させる。本発明のペプチドは降圧剤として作用しかつ
心搏度の力を増すことが分った。これらの連結効果によ
り、手術後の処理に潜在的用途を有する。多くの人々は
高血圧症に罹っており、高発生率の心臓病には高い原因
ファクターとなっている。このペプチドは高血圧管理に
使用することができる。
は医薬として、望ましくは高血圧の治療に使用するのに
供される。主たる心臓外科（例えば開放心臓バイパス手
術）の手術後段階では、患者にとって、広範囲の血管収
縮により手術のストレスに感応するのが普通である。こ
のことは患者の血圧を上げる作用となるから、心臓を緊
張させる。本発明のペプチドは降圧剤として作用しかつ
心搏度の力を増すことが分った。これらの連結効果によ
り、手術後の処理に潜在的用途を有する。多くの人々は
高血圧症に罹っており、高発生率の心臓病には高い原因
ファクターとなっている。このペプチドは高血圧管理に
使用することができる。
【０００９】本発明の第３の特長において、構造（Ｉ）
のペプチドおよび医薬的に許容可能な賦形剤から成る医
薬組成物を供する。本組成物は注射可能なものがよい。
医薬組成物は体内に緩徐放出型の組成物又はペプチドの
系内に含有させることができ、あるいはその一部を形成
することもできる。斯様な緩徐放出型は長期間の高血圧
管理に使用される。
のペプチドおよび医薬的に許容可能な賦形剤から成る医
薬組成物を供する。本組成物は注射可能なものがよい。
医薬組成物は体内に緩徐放出型の組成物又はペプチドの
系内に含有させることができ、あるいはその一部を形成
することもできる。斯様な緩徐放出型は長期間の高血圧
管理に使用される。
【００１０】更に本発明は有効量の構造（Ｉ）のペプチ
ドを投与する、高血圧の治療法を供する。また、本発明
の第３の特長では、構造（Ｉ）のペプチドを医薬的に許
容可能な賦形剤と一緒にする医薬組成物の製造法を供す
る。構造（Ｉ）のペプチドは各種の方法により製造する
ことができる。当業界で公知の技術を使って、ペプチド
化学合成法によりこのペプチドを製造することができ
る。ペプチドの精製はイオン、逆相クロマトグラフィ技
術を使って行なうことができる。本発明の別の特長で
は、少なくとも下式のアミノ酸配列：
ドを投与する、高血圧の治療法を供する。また、本発明
の第３の特長では、構造（Ｉ）のペプチドを医薬的に許
容可能な賦形剤と一緒にする医薬組成物の製造法を供す
る。構造（Ｉ）のペプチドは各種の方法により製造する
ことができる。当業界で公知の技術を使って、ペプチド
化学合成法によりこのペプチドを製造することができ
る。ペプチドの精製はイオン、逆相クロマトグラフィ技
術を使って行なうことができる。本発明の別の特長で
は、少なくとも下式のアミノ酸配列：
【００１１】
【化８】 （式中、Ｒ′は−Ｈ又はアミノ酸残基である）を有する
ペプチド又は生体内あるいは試験管内でアミドに転換可
能なペプチドを供する。Ｒ′は−Ｇｌｙ−、−Ｇｌｙ−
Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ又は−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ
−Ｌｙｓ−Ａｒｇでよいが、−Ｇｌｙが望ましい。カル
ボキシ末端残基Ｒ′は生体内又は試験管内で隣接のフェ
ニルアラニンアミノ酸残基のアミドに酵素転換すること
ができる。Ｒ′が−Ｇｌｙの時、この転換に適する酵素
は酵母カルボキシペプチダーゼＹ又は哺乳動物アミド化
酵素である（ブラッドベリー，エイ，エフ、フィニー．
エム．デー．エイおよびスミス，ディー．ジー（１９８
２）ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），２９８，６８６〜６
８８）。
ペプチド又は生体内あるいは試験管内でアミドに転換可
能なペプチドを供する。Ｒ′は−Ｇｌｙ−、−Ｇｌｙ−
Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ又は−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ
−Ｌｙｓ−Ａｒｇでよいが、−Ｇｌｙが望ましい。カル
ボキシ末端残基Ｒ′は生体内又は試験管内で隣接のフェ
ニルアラニンアミノ酸残基のアミドに酵素転換すること
ができる。Ｒ′が−Ｇｌｙの時、この転換に適する酵素
は酵母カルボキシペプチダーゼＹ又は哺乳動物アミド化
酵素である（ブラッドベリー，エイ，エフ、フィニー．
エム．デー．エイおよびスミス，ディー．ジー（１９８
２）ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），２９８，６８６〜６
８８）。
【００１２】別法としておよび望ましくは、このペプチ
ドは組換えＤＮＡ技術により製造する。本発明の第４の
特長として、中間ペプチドが本発明の第４特長に係るペ
プチドである中間ペプチドをコードする遺伝子を含むベ
クターで形質転換させた宿主生物体を培養して、中間ペ
プチドを得、ついでＲ′をアミドに転換させる、構造
（Ｉ）のペプチドの製造法を供する。
ドは組換えＤＮＡ技術により製造する。本発明の第４の
特長として、中間ペプチドが本発明の第４特長に係るペ
プチドである中間ペプチドをコードする遺伝子を含むベ
クターで形質転換させた宿主生物体を培養して、中間ペ
プチドを得、ついでＲ′をアミドに転換させる、構造
（Ｉ）のペプチドの製造法を供する。
【００１３】中間ペプチドは形質転換された宿主生物体
に生成されたタン白質の少なくとも一部および上記（I
I）に記載したアミノ酸配列を含む融合タン白質である
のがよい。望ましくは、この融合タン白質は形質転換宿
主生物体により高レベルで産生されるタン白質を含む。
適当なタン白質は少なくとも一部分クロラムフェニコー
ルアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）タン白質又は
少なくとも一部β−ガラクトシダーゼタン白質を含む。
融合タン白質は形質転換宿主生物体に高レベルで産生し
たタン白質のカルボキシ末端基に結合した上記（II）に
記載のアミノ酸配列を有するペプチドを含むのがよい。
ペプチドは選択的化学又は酵素分解しうる結合を介して
タン白質に連結するのがよい。この結合はメチオニン又
はグルタミン酸残基でよい。メチオニンは臭化シアンに
より選択的に切断することができかつグルタミン酸はソ
ルガム由来の酸プロテアーゼ（ＥＣ３．４．２３．１
４）、ウニプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２４．１２）又
は望ましくはスタフィロコッカスプロテアーゼ（ＥＣ
３．４．２１．１９）を使って選択的に切断することが
できる（ヒトＣＧＲＰ配列はＭｅｔ又はＧｌｕ残基を含
まない）。結合はリジン−アルギニンペプチド２官能基
でよい。この結合の切断はマウス顎下腺プロテアーゼ又
は望ましくはクロストリパン（ＥＣ３．４．２１．６）
を使って行なうことができる。
に生成されたタン白質の少なくとも一部および上記（I
I）に記載したアミノ酸配列を含む融合タン白質である
のがよい。望ましくは、この融合タン白質は形質転換宿
主生物体により高レベルで産生されるタン白質を含む。
適当なタン白質は少なくとも一部分クロラムフェニコー
ルアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）タン白質又は
少なくとも一部β−ガラクトシダーゼタン白質を含む。
融合タン白質は形質転換宿主生物体に高レベルで産生し
たタン白質のカルボキシ末端基に結合した上記（II）に
記載のアミノ酸配列を有するペプチドを含むのがよい。
ペプチドは選択的化学又は酵素分解しうる結合を介して
タン白質に連結するのがよい。この結合はメチオニン又
はグルタミン酸残基でよい。メチオニンは臭化シアンに
より選択的に切断することができかつグルタミン酸はソ
ルガム由来の酸プロテアーゼ（ＥＣ３．４．２３．１
４）、ウニプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２４．１２）又
は望ましくはスタフィロコッカスプロテアーゼ（ＥＣ
３．４．２１．１９）を使って選択的に切断することが
できる（ヒトＣＧＲＰ配列はＭｅｔ又はＧｌｕ残基を含
まない）。結合はリジン−アルギニンペプチド２官能基
でよい。この結合の切断はマウス顎下腺プロテアーゼ又
は望ましくはクロストリパン（ＥＣ３．４．２１．６）
を使って行なうことができる。
【００１４】本発明の第１と第２特長に係るペプチドは
体内にてポリタン白質として産生される。このポリタン
白質は体内で処理され、本発明の第１又は第２特長のア
ミド化３７アミノ酸ペプチドを残すアミノおよびカルボ
キシ末端基を切断する。本発明の第６の特長として、少
なくとも以下のアミノ酸配列：
体内にてポリタン白質として産生される。このポリタン
白質は体内で処理され、本発明の第１又は第２特長のア
ミド化３７アミノ酸ペプチドを残すアミノおよびカルボ
キシ末端基を切断する。本発明の第６の特長として、少
なくとも以下のアミノ酸配列：
【００１５】
【化９】
【００１６】を含む中間ペプチドをコードする遺伝子を
含むベクターで形質転換した真核宿主生物体を培養し
て、中間ペプチドを得、この中間ペプチドを宿主生物体
によりプロセッシングさせ、ついでペプチドを単離す
る、構造（Ｉ）を有するペプチドの製造法を供する。真
核宿主生物体はアミノ酸配列III を含むポリタン白質か
ら構造Ｉのペプチドを製造しうるタン白分解酵素とアミ
ド化酵素を含有しうる組織培養した哺乳動物のセルライ
ンであるのが望ましい。望ましくは中間ペプチドは融合
タン白質として生成される。
含むベクターで形質転換した真核宿主生物体を培養し
て、中間ペプチドを得、この中間ペプチドを宿主生物体
によりプロセッシングさせ、ついでペプチドを単離す
る、構造（Ｉ）を有するペプチドの製造法を供する。真
核宿主生物体はアミノ酸配列III を含むポリタン白質か
ら構造Ｉのペプチドを製造しうるタン白分解酵素とアミ
ド化酵素を含有しうる組織培養した哺乳動物のセルライ
ンであるのが望ましい。望ましくは中間ペプチドは融合
タン白質として生成される。
【００１７】ポリタン白質のプロセッシングにおいて、
テトラペプチドが製造される。このテトラペプチドも生
物活性を有し、本発明の特長でもあり、下式の配列：Ａ
ｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｌａ（IV）を有する。このペ
プチドはＰＤＡ−４と表示され、心血管機能の調整に関
し生物活性を有することが分った。特に、このペプチド
は血圧低下を誘発しかつ心搏度を増大させることが分っ
た。本発明の第８の特長として、配列IVのペプチドを医
薬として、望ましくは高血圧の治療に使用することであ
る。
テトラペプチドが製造される。このテトラペプチドも生
物活性を有し、本発明の特長でもあり、下式の配列：Ａ
ｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｌａ（IV）を有する。このペ
プチドはＰＤＡ−４と表示され、心血管機能の調整に関
し生物活性を有することが分った。特に、このペプチド
は血圧低下を誘発しかつ心搏度を増大させることが分っ
た。本発明の第８の特長として、配列IVのペプチドを医
薬として、望ましくは高血圧の治療に使用することであ
る。
【００１８】本発明の第９の特長として、配列（IV）の
ペプチドと医薬として許容可能な賦形剤から成る医薬組
成物を供することである。この組成物は注射可能である
のがよい。医薬組成物は生体中緩徐放出型の組成物又は
ペプチドの系内に含有させることができあるいはその一
部を構成することもできる。本組成物は構造Ｉのペプチ
ドと配列IVのペプチドの併用および医薬上許容可能な賦
形剤を含有してもよい。
ペプチドと医薬として許容可能な賦形剤から成る医薬組
成物を供することである。この組成物は注射可能である
のがよい。医薬組成物は生体中緩徐放出型の組成物又は
ペプチドの系内に含有させることができあるいはその一
部を構成することもできる。本組成物は構造Ｉのペプチ
ドと配列IVのペプチドの併用および医薬上許容可能な賦
形剤を含有してもよい。
【００１９】本発明の第９の特長として、ＰＡＦ−３７
をコードする遺伝子（構造Ｉ）、ＰＡＦ−３７−Ｒ′
（構造II）、ＰＤＡ−４（構造IV）又は「非プロセッシ
ング」ペプチド（構造III ）を供する。望ましくは、本
発明は次のアミノ酸、図２の下半分 i)１〜３７ ii)
−３〜−７、iii)＋６〜＋９又は iv) −７〜＋９のア
ミノ酸に相当するヌクレオチドにより記載される特定遺
伝子を供する。また本発明はヌクレオチド１〜１２５６
まで図２に実質的に示すヌクレオチド配列を供する。更
に本発明はこれらのいずれかの遺伝子を含むベクターお
よびこのベクターで形質転換した宿主生物体を供する。
適当な宿主生物体にはバクテリア（例えば大腸菌）、酵
母（例えばサッカロミセス・セレビジエ）および組織培
養の哺乳動物細胞である。
をコードする遺伝子（構造Ｉ）、ＰＡＦ−３７−Ｒ′
（構造II）、ＰＤＡ−４（構造IV）又は「非プロセッシ
ング」ペプチド（構造III ）を供する。望ましくは、本
発明は次のアミノ酸、図２の下半分 i)１〜３７ ii)
−３〜−７、iii)＋６〜＋９又は iv) −７〜＋９のア
ミノ酸に相当するヌクレオチドにより記載される特定遺
伝子を供する。また本発明はヌクレオチド１〜１２５６
まで図２に実質的に示すヌクレオチド配列を供する。更
に本発明はこれらのいずれかの遺伝子を含むベクターお
よびこのベクターで形質転換した宿主生物体を供する。
適当な宿主生物体にはバクテリア（例えば大腸菌）、酵
母（例えばサッカロミセス・セレビジエ）および組織培
養の哺乳動物細胞である。
【００２０】ヒトＣＧＲＰの生産は選択的仲介組織、ｍ
ＲＮＡプロセッシングによる組織である（エドブルッ
ク，エム．アール等、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）（１
９８４９−提起）。髄質甲状腺癌腫や肺癌にみられるよ
うなある細胞では、ヒトＣＧＲＰは各種レベルで産生さ
れる。したがって、ヒトＣＧＲＰの存在は異常組織の診
断となり得る。更に本発明はヒトＧＣＲＰ遺伝子発現と
異常遺伝子組織の試験に使用する診断薬（抗体と遺伝子
プローブを含む）を供する。
ＲＮＡプロセッシングによる組織である（エドブルッ
ク，エム．アール等、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）（１
９８４９−提起）。髄質甲状腺癌腫や肺癌にみられるよ
うなある細胞では、ヒトＣＧＲＰは各種レベルで産生さ
れる。したがって、ヒトＣＧＲＰの存在は異常組織の診
断となり得る。更に本発明はヒトＧＣＲＰ遺伝子発現と
異常遺伝子組織の試験に使用する診断薬（抗体と遺伝子
プローブを含む）を供する。
【００２１】本発明の第１１の特長として、本発明は構
造Ｉのペプチド、又は抗原性決定子を含むその一部（検
出可能なラベルを有する）を供する。このラベルは酵
素、発色団、発螢光団又は化学ルミネセンス群でよい。
しかし、最も望ましいのは放射性同位元素で、例えばペ
プチドのアミノ酸配列の５位のヒスチジンアミノ酸残基
に結合する１２５Ｉである。ラベルしたペプチドは構造
Ｉのペプチド又は１２５Ｉで任意にラベルしたチロシン
アミノ酸残基を含むその一部を含むのがよい。ペプチド
部分はアミノ酸２５〜３７（アミド化フェニルアラニ
ン）又はアミノ酸１〜８が望ましい。
造Ｉのペプチド、又は抗原性決定子を含むその一部（検
出可能なラベルを有する）を供する。このラベルは酵
素、発色団、発螢光団又は化学ルミネセンス群でよい。
しかし、最も望ましいのは放射性同位元素で、例えばペ
プチドのアミノ酸配列の５位のヒスチジンアミノ酸残基
に結合する１２５Ｉである。ラベルしたペプチドは構造
Ｉのペプチド又は１２５Ｉで任意にラベルしたチロシン
アミノ酸残基を含むその一部を含むのがよい。ペプチド
部分はアミノ酸２５〜３７（アミド化フェニルアラニ
ン）又はアミノ酸１〜８が望ましい。
【００２２】本発明の第１２の特長として、構造Ｉのペ
プチドの抗原性決定子に特異性を有する抗体を供するこ
とである。この抗体はポリクローナルでもモノクローナ
ル抗体でもよい。抗体は検出可能なラベルで標識するこ
とができる。本発明の第１１と第１２の特長の試剤は、
イムノアッセイ、望ましくはラジオイムノアッセイのも
の、試料中構造Ｉのペプチド、又は組織部分の免疫細胞
化学限定のものでよい。
プチドの抗原性決定子に特異性を有する抗体を供するこ
とである。この抗体はポリクローナルでもモノクローナ
ル抗体でもよい。抗体は検出可能なラベルで標識するこ
とができる。本発明の第１１と第１２の特長の試剤は、
イムノアッセイ、望ましくはラジオイムノアッセイのも
の、試料中構造Ｉのペプチド、又は組織部分の免疫細胞
化学限定のものでよい。
【００２３】ＰＡＦ−３７をコードするｍＲＮＡ又はそ
のｍＲＮＡを含むヌクレオチド配列について試験するこ
とも可能である。したがって、本発明の第１１の特長と
して、図２に示した１〜１２５６のヌクレオチド配列か
ら選んだ１５種以上のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ
ハイブリッドプローブを供することである。プローブは
固体相に固定化することもでき、あるいは検出可能なラ
ベルで標識することもできる。このようなプローブはＤ
ＮＡやＲＮＡのブロッティング技術により遺伝子組織や
遺伝子発現を試験し、あるいは遺伝子を発現する組織部
分の正常在位（ｉｎｓｉｔｕ）のハイブリッド細胞によ
り確認するのに使うことができる。
のｍＲＮＡを含むヌクレオチド配列について試験するこ
とも可能である。したがって、本発明の第１１の特長と
して、図２に示した１〜１２５６のヌクレオチド配列か
ら選んだ１５種以上のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ
ハイブリッドプローブを供することである。プローブは
固体相に固定化することもでき、あるいは検出可能なラ
ベルで標識することもできる。このようなプローブはＤ
ＮＡやＲＮＡのブロッティング技術により遺伝子組織や
遺伝子発現を試験し、あるいは遺伝子を発現する組織部
分の正常在位（ｉｎｓｉｔｕ）のハイブリッド細胞によ
り確認するのに使うことができる。
【００２４】本発明の第１３の特長の望ましいプローブ
は、図２に示した１〜７２５のヌクレオチド配列から選
んだ配列を有する。この望ましい型のプローブはヒトカ
ルシトニン遺伝子組織又は発現とは反対に、ヒトＣＧＲ
Ｐを試験するのに使うことができる。特に、このプロー
ブはヒトＣＧＲＰ ｍＲＮＡおよびヒトＣＧＲＰ構造遺
伝子にハイブリットする。本発明の第１３の特長の別の
望ましいプローブは図２に示した７２６〜１２５６のヌ
クレオチド配列から選んだ配列から成る。この望ましい
型のプローブはヒトカルシトニンＣＧＲＰ遺伝子の生物
体を試験するのに使うことができる。特に、このプロー
ブはヒトＣＧＲＰ構造遺伝子のイントロン領域にハイブ
リッドする。
は、図２に示した１〜７２５のヌクレオチド配列から選
んだ配列を有する。この望ましい型のプローブはヒトカ
ルシトニン遺伝子組織又は発現とは反対に、ヒトＣＧＲ
Ｐを試験するのに使うことができる。特に、このプロー
ブはヒトＣＧＲＰ ｍＲＮＡおよびヒトＣＧＲＰ構造遺
伝子にハイブリットする。本発明の第１３の特長の別の
望ましいプローブは図２に示した７２６〜１２５６のヌ
クレオチド配列から選んだ配列から成る。この望ましい
型のプローブはヒトカルシトニンＣＧＲＰ遺伝子の生物
体を試験するのに使うことができる。特に、このプロー
ブはヒトＣＧＲＰ構造遺伝子のイントロン領域にハイブ
リッドする。
【００２５】次の図面を参照しながら、本発明を次の記
述により説明する。図１は組換えプラスミドｐｈＴＢ
３、ｐｈＴＢ６およびｐｈＴＢ５８にてクローンした重
複ｃＤＮＡ配列の概略図である。図２は組換えプラスミ
ドｐｈＴＢ３、ｐｈＴＢ６およびｐｈＴＢ５８から誘導
した完全なヌクレオチド配列である。図３はプラスミド
ｐＣＴ２０１、ｐＣＴ２０２、ｐＣＴ２０３およびｐＣ
ＡＴ−ＣＧＲＰの構造の概略図である。図４はベクター
ｐＣＡＴ−ＣＧＲＰで形質転換した大腸菌ＨＢ１０１の
抽出物におけるクロラムフェニコールアセチルトランス
フェラーゼ（ＣＡＴ）とヒトＣＧＲＰの融合タン白質の
存在を示すポリアクリルアミドゲルである。
述により説明する。図１は組換えプラスミドｐｈＴＢ
３、ｐｈＴＢ６およびｐｈＴＢ５８にてクローンした重
複ｃＤＮＡ配列の概略図である。図２は組換えプラスミ
ドｐｈＴＢ３、ｐｈＴＢ６およびｐｈＴＢ５８から誘導
した完全なヌクレオチド配列である。図３はプラスミド
ｐＣＴ２０１、ｐＣＴ２０２、ｐＣＴ２０３およびｐＣ
ＡＴ−ＣＧＲＰの構造の概略図である。図４はベクター
ｐＣＡＴ−ＣＧＲＰで形質転換した大腸菌ＨＢ１０１の
抽出物におけるクロラムフェニコールアセチルトランス
フェラーゼ（ＣＡＴ）とヒトＣＧＲＰの融合タン白質の
存在を示すポリアクリルアミドゲルである。
【００２６】図５はｐＣＡＴ−ＣＧＲＰで形質転換した
大腸菌ＨＢ１０１のタン白質抽出物におけるヒトＣＧＲ
Ｐ抗原性決定子の存在を示すラジオイムノアッセイの結
果を証明するグラフである。図６はラットにおける心搏
度数および平均動脈圧の薬物感応曲線を示す（●＝食塩
水、○＝ヒトＣＧＲＰ、△＝ラットＣＧＲＰ、□＝ヒト
ＣＧＲＰ＋プロプラノロール、■＝ヒトＣＧＲＰ＋メピ
ラミン＋シメチジン）。図７はラットに静脈注射したＰ
ＤＡ−４（およびヒトＣＧＲＰ）の心搏度数と平均動脈
圧に及ぼす影響を証明するタコグラフトレースである。
図８はモルモットの心搏度数と力の薬物感応曲線を示
す。
大腸菌ＨＢ１０１のタン白質抽出物におけるヒトＣＧＲ
Ｐ抗原性決定子の存在を示すラジオイムノアッセイの結
果を証明するグラフである。図６はラットにおける心搏
度数および平均動脈圧の薬物感応曲線を示す（●＝食塩
水、○＝ヒトＣＧＲＰ、△＝ラットＣＧＲＰ、□＝ヒト
ＣＧＲＰ＋プロプラノロール、■＝ヒトＣＧＲＰ＋メピ
ラミン＋シメチジン）。図７はラットに静脈注射したＰ
ＤＡ−４（およびヒトＣＧＲＰ）の心搏度数と平均動脈
圧に及ぼす影響を証明するタコグラフトレースである。
図８はモルモットの心搏度数と力の薬物感応曲線を示
す。
【００２７】図９は髄質甲状腺癌組織、髄質甲状腺癌腫
患者の血漿の抽出液におけるヒトＣＧＲＰの存在および
肺癌セルラインによるＣＧＲＰの産生を示すラジオイム
ノアッセイ結果を証明するグラフである。図１０は髄質
甲状腺癌腫および肺癌腫セルラインにおけるカルシトニ
ンとヒトＣＧＲＰ ＲＮＡの各種発現を証明するＲＮＡ
ブロットを示す。図１１はヒト胎盤組織のＤＮＡを髄質
甲状腺癌腫組織又は単一患者のリンパ球のＤＮＡを比較
した時、ヒトＣＧＲＰ遺伝子と相同遺伝子の各種生物体
を証明するＤＮＡブロットを示す。
患者の血漿の抽出液におけるヒトＣＧＲＰの存在および
肺癌セルラインによるＣＧＲＰの産生を示すラジオイム
ノアッセイ結果を証明するグラフである。図１０は髄質
甲状腺癌腫および肺癌腫セルラインにおけるカルシトニ
ンとヒトＣＧＲＰ ＲＮＡの各種発現を証明するＲＮＡ
ブロットを示す。図１１はヒト胎盤組織のＤＮＡを髄質
甲状腺癌腫組織又は単一患者のリンパ球のＤＮＡを比較
した時、ヒトＣＧＲＰ遺伝子と相同遺伝子の各種生物体
を証明するＤＮＡブロットを示す。
【００２８】係属中のヨーロッパ特許出願第ＥＰ−Ａ１
−００７０６７５号には、ヒト髄質甲状腺癌組織から単
離した全細胞ポリ（Ａ）−含有ＲＮＡを使うｃＤＮＡラ
イブラリィーの構成（アリスン．ジェイ等、バイオケミ
ストリイ ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．）（１９
８１）１９９ ７２５〜７３１参照）およびこのライブ
ラリイー、ｐｈＴ−Ｂ３およびｐｈＴ−Ｂ６から単離し
た２つのプラスミド内でクローンしたヒトカルシトニン
ｍＲＮＡの大部分のヌクレオチド配列分析（クレイグ、
アール・ケイ等、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）（１９８
２）２９５、３４５〜３４７参照）が記載されている。
この研究中、約１６００ｂｐの挿入ｃＤＮＡ断片を含有
する１つの組換えプラスミドｐｈＴ−Ｂ５８が予備スク
リーニングを介して同定されたが、それ以上の分析はさ
れなかった。
−００７０６７５号には、ヒト髄質甲状腺癌組織から単
離した全細胞ポリ（Ａ）−含有ＲＮＡを使うｃＤＮＡラ
イブラリィーの構成（アリスン．ジェイ等、バイオケミ
ストリイ ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．）（１９
８１）１９９ ７２５〜７３１参照）およびこのライブ
ラリイー、ｐｈＴ−Ｂ３およびｐｈＴ−Ｂ６から単離し
た２つのプラスミド内でクローンしたヒトカルシトニン
ｍＲＮＡの大部分のヌクレオチド配列分析（クレイグ、
アール・ケイ等、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）（１９８
２）２９５、３４５〜３４７参照）が記載されている。
この研究中、約１６００ｂｐの挿入ｃＤＮＡ断片を含有
する１つの組換えプラスミドｐｈＴ−Ｂ５８が予備スク
リーニングを介して同定されたが、それ以上の分析はさ
れなかった。
【００２９】非常に大分子なのでカルシトニンｍＲＮＡ
を示すとは思われなかったからである。このプラスミド
に挿入されたｃＤＮＡの続く制限酵素分析（図１参照）
によれば、ｐｈＴＢ３に共通の位置を示し、更にｐｈＴ
−Ｂ５８内でクローンしたｃＤＮＡは予め確立された配
列から下流の配列を示し、ヒトカルシトニンｍＲＮＡの
完全な３′未翻訳領域を示すことを指摘した。図１は、
配列特異性ハイブリットプローブとして使われる配列の
領域を分離する制限部位およびカルシトニン、ＣＧＲＰ
および共通のアミノ末端ペプチドの相対位置を示す。垂
直の破線はｃＤＮＡとプラスミド配列を分離するＰｓｔ
Ｉ部位を示す。ｐｈＴ−Ｂ５８に挿入された全ｃＤＮＡ
配列のヌクレオチド配列分析は既述した方法（クレイグ
・アール・ケイ，ホール・エル，エドブルック・エム・
アール，アリスン・ジェイおよびマッキンタイア・アイ
（１９８２）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２９５，３
４５〜３４７）−図２参照を使って行なった。数値はヒ
トとラットカルシトニンおよびＣＧＲＡ ＲＮＡ転写の
公知ヌクレオチド配列と相同を最大化するのに導入され
たギャップとを比較する。ヒトヌクレオチド配列の直ぐ
上の数はｐｈＴ Ｂ５８にクローンしたポリ（Ａ）テイ
ルからのヌクレオチドの相対数を示す。ヒトタン白質配
列上の数はカルシトニン又はＣＧＲＰに対するアミノ酸
の位置を意味する。ヒト配列に対するラット内に存する
別の又は新たなアミノ酸又はヌクレオチドは問題のコド
ンの直ぐ下に示されている。潜在的ポリアデニール化記
号は下線が付されている。矢印（↑）は成熟カルシトニ
ンｍＲＮＡの３′末端を意味し、（▲）印はヒトゲノム
配列における付加イントロンの可能な位置を指す。破線
はラットカルシトニン遺伝子のないヒト配列の領域を示
す。挿入されたｃＤＮＡ配列は１６１５ｂｐを含み、
３′末端のポリ（Ａ）残基の域で終る。これらのうち、
５′末端から最初の３５６ｂｐは上記したものと同じ
で、カタカルシンをコードするヒトカルシトニンｍＲＮ
Ａの一部およびＡＡＴＡＡＡボックスと成熟カルシトニ
ンｍＲＮＡにおけるポリ（Ａ）テイルに先立つように示
した１２ヌクレオチドを含む３′未翻訳領域の全体を示
した。残りの配列の分析は５３アミノ酸、続いて末端コ
ドンをコードする単一開放読み取り枠を含むことを示し
た。
を示すとは思われなかったからである。このプラスミド
に挿入されたｃＤＮＡの続く制限酵素分析（図１参照）
によれば、ｐｈＴＢ３に共通の位置を示し、更にｐｈＴ
−Ｂ５８内でクローンしたｃＤＮＡは予め確立された配
列から下流の配列を示し、ヒトカルシトニンｍＲＮＡの
完全な３′未翻訳領域を示すことを指摘した。図１は、
配列特異性ハイブリットプローブとして使われる配列の
領域を分離する制限部位およびカルシトニン、ＣＧＲＰ
および共通のアミノ末端ペプチドの相対位置を示す。垂
直の破線はｃＤＮＡとプラスミド配列を分離するＰｓｔ
Ｉ部位を示す。ｐｈＴ−Ｂ５８に挿入された全ｃＤＮＡ
配列のヌクレオチド配列分析は既述した方法（クレイグ
・アール・ケイ，ホール・エル，エドブルック・エム・
アール，アリスン・ジェイおよびマッキンタイア・アイ
（１９８２）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２９５，３
４５〜３４７）−図２参照を使って行なった。数値はヒ
トとラットカルシトニンおよびＣＧＲＡ ＲＮＡ転写の
公知ヌクレオチド配列と相同を最大化するのに導入され
たギャップとを比較する。ヒトヌクレオチド配列の直ぐ
上の数はｐｈＴ Ｂ５８にクローンしたポリ（Ａ）テイ
ルからのヌクレオチドの相対数を示す。ヒトタン白質配
列上の数はカルシトニン又はＣＧＲＰに対するアミノ酸
の位置を意味する。ヒト配列に対するラット内に存する
別の又は新たなアミノ酸又はヌクレオチドは問題のコド
ンの直ぐ下に示されている。潜在的ポリアデニール化記
号は下線が付されている。矢印（↑）は成熟カルシトニ
ンｍＲＮＡの３′末端を意味し、（▲）印はヒトゲノム
配列における付加イントロンの可能な位置を指す。破線
はラットカルシトニン遺伝子のないヒト配列の領域を示
す。挿入されたｃＤＮＡ配列は１６１５ｂｐを含み、
３′末端のポリ（Ａ）残基の域で終る。これらのうち、
５′末端から最初の３５６ｂｐは上記したものと同じ
で、カタカルシンをコードするヒトカルシトニンｍＲＮ
Ａの一部およびＡＡＴＡＡＡボックスと成熟カルシトニ
ンｍＲＮＡにおけるポリ（Ａ）テイルに先立つように示
した１２ヌクレオチドを含む３′未翻訳領域の全体を示
した。残りの配列の分析は５３アミノ酸、続いて末端コ
ドンをコードする単一開放読み取り枠を含むことを示し
た。
【００３０】これはスプライス接合受容体部位（Ｃ）n
ＮＡＧ／Ｇ（マウント・エス・エム，ヌクレイックアシ
ッドリサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．）
（１９８２）１０ ４５０〜４６３）により５′側の直
前にあり、「イントロン」−様配列の６４５ヌクレオチ
ドは３つのアデノシン残基により公知のカルシトニンｍ
ＲＮＡ配列から分離した。しかし、認識可能なドナ−ス
プライス接合はイントロン−様配列とヒトカルシトニン
ｍＲＮＡに存在することが知られている配列の間には存
在しなかった。新規の開放読み取り枠は２つのポリアデ
ニール記号を含む４５１ヌクレオチドの域に続き、最初
の（ＡＡＴＡＡ）は末端コドンの下流の２６塩基および
第２の（ＡＡＡＡＴＴＡＡＡＡＡ）は末端ポリ（Ａ）域
前の１８ヌクレオチドに位置した。コード配列は対の塩
基性アミノ酸（−１，−２）、更には５つのアミノ酸
（−３〜−７）によりアミノ末端およびグリシン残基
（＋１）、４つの塩基性アミノ酸（＋２〜＋５）および
テトラペプチド（＋６〜＋９）によるカルボキシル末端
の側面にあるヒトＣＧＲＰ（３７個のアミノ酸のペプチ
ド）を含んだ。グリシンの存在はアミド化カルボキシル
末端フェニルアラニンの生体内要件を反映し（ブラドベ
リー・エイ・エフ等、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）（１
９８２）２９８，６８６〜６８８）、アミド化ヒトＣＧ
ＲＰについて３７８６の計算Ｍｒとなった。予言したヒ
トアノ酸配列とラットのそれとを比較（アマラ等、ネイ
チャー（Ｎａｔｕｒｅ）（１９８２）２９８，２４０〜
２４４）した結果、配列保存を示し、７つのアミノ酸は
５３のアミノ酸から変化し、４つはヒトＣＧＲＰ（アラ
ニン１、アスパラギン酸３、アスパラギン２５、リジン
３５）内にあり、残りの３つ（−７，−６，−５）は５
アミノ酸アミノ末端リーダー配列にある。後者のうち、
最初のアミノ酸（アルギニン−７）について、本発明者
はスプライス接合の位置に基づいてかつラットカルシト
ニン遺伝子との相同により指定した。有意な配列保存は
コード領域内のヌクレオチドレベルで明らかであるが、
ヒト配列と利用できるラットＣＧＲＰ ｍＲＮＡ配列と
の比較により３′非コード領域で顕著に減ずる。ヒトＣ
ＧＲＰアミノ酸配列と他のタン白質配列とを比較（ウィ
ルバー・エヌ・ジェイ等、ＰＮＡＳ（１９８３）８０，
７２６〜７３０）して、カルシトニンを含めて他の公知
のペプチドを有する有意な相同はないことを示した（ラ
ットのＣＧＲＰを除く）。精々、９つの匹敵するアミノ
酸がサケカルシトニンを有するヒトＣＧＲＰの整列によ
り同定された。
ＮＡＧ／Ｇ（マウント・エス・エム，ヌクレイックアシ
ッドリサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．）
（１９８２）１０ ４５０〜４６３）により５′側の直
前にあり、「イントロン」−様配列の６４５ヌクレオチ
ドは３つのアデノシン残基により公知のカルシトニンｍ
ＲＮＡ配列から分離した。しかし、認識可能なドナ−ス
プライス接合はイントロン−様配列とヒトカルシトニン
ｍＲＮＡに存在することが知られている配列の間には存
在しなかった。新規の開放読み取り枠は２つのポリアデ
ニール記号を含む４５１ヌクレオチドの域に続き、最初
の（ＡＡＴＡＡ）は末端コドンの下流の２６塩基および
第２の（ＡＡＡＡＴＴＡＡＡＡＡ）は末端ポリ（Ａ）域
前の１８ヌクレオチドに位置した。コード配列は対の塩
基性アミノ酸（−１，−２）、更には５つのアミノ酸
（−３〜−７）によりアミノ末端およびグリシン残基
（＋１）、４つの塩基性アミノ酸（＋２〜＋５）および
テトラペプチド（＋６〜＋９）によるカルボキシル末端
の側面にあるヒトＣＧＲＰ（３７個のアミノ酸のペプチ
ド）を含んだ。グリシンの存在はアミド化カルボキシル
末端フェニルアラニンの生体内要件を反映し（ブラドベ
リー・エイ・エフ等、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）（１
９８２）２９８，６８６〜６８８）、アミド化ヒトＣＧ
ＲＰについて３７８６の計算Ｍｒとなった。予言したヒ
トアノ酸配列とラットのそれとを比較（アマラ等、ネイ
チャー（Ｎａｔｕｒｅ）（１９８２）２９８，２４０〜
２４４）した結果、配列保存を示し、７つのアミノ酸は
５３のアミノ酸から変化し、４つはヒトＣＧＲＰ（アラ
ニン１、アスパラギン酸３、アスパラギン２５、リジン
３５）内にあり、残りの３つ（−７，−６，−５）は５
アミノ酸アミノ末端リーダー配列にある。後者のうち、
最初のアミノ酸（アルギニン−７）について、本発明者
はスプライス接合の位置に基づいてかつラットカルシト
ニン遺伝子との相同により指定した。有意な配列保存は
コード領域内のヌクレオチドレベルで明らかであるが、
ヒト配列と利用できるラットＣＧＲＰ ｍＲＮＡ配列と
の比較により３′非コード領域で顕著に減ずる。ヒトＣ
ＧＲＰアミノ酸配列と他のタン白質配列とを比較（ウィ
ルバー・エヌ・ジェイ等、ＰＮＡＳ（１９８３）８０，
７２６〜７３０）して、カルシトニンを含めて他の公知
のペプチドを有する有意な相同はないことを示した（ラ
ットのＣＧＲＰを除く）。精々、９つの匹敵するアミノ
酸がサケカルシトニンを有するヒトＣＧＲＰの整列によ
り同定された。
【００３１】ｐｈＴ−Ｂ３とｐｈＴ−Ｂ５８から単離し
たｃＤＮＡ断片を使って、本発明者はｐｈＴ−Ｂ５８に
クローンしたｃＤＮＡが部分的にプロセッシングしたポ
リアデニール化ＲＮＡ転写を示すことを制限ヒトゲノム
ＤＮＡのサザン法により確立した。ヌクレオチド配列分
析により同定した「イントロン」に加えて、１つのイン
トロンをＣＧＲＰコード配列の３′側にマップし、他は
ラットのカルシトニン遺伝子のものに酷似するゲノム構
成（ｇｅｎｏｍｉｃ ｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎ）を示
唆するカルシトニンコード配列の５′側にマップした
（ローゼンフェルト・エム・ジー、マーモッド・ジェイ
・ジェイ、アマラ・エス・ジー、スツンソン・エル・ダ
ブリュー、ソーチエンコ・ピー・イー、リビエール・ジ
ェイ、ベール・ダブリュー・ダブリューおよびエバンス
・アール・エム（１９８３）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒ
ｅ）、３０４、１２９〜１３５）。しかし、カルシトニ
ンエクソンとＣＧＲＰコード配列を分ける「イントロ
ン」様配列は実際ゲノム構成を示し、ｐｈＴ−Ｂ５８か
ら単離したカルシトニン、イントロンおよびＣＧＲＰ配
列を含む１１２５ｂｐ Ｓｐｈ Ｉ／ＰｖｕII ＤＮＡ
断片（図１参照）は、「イントロン」特異性ハイブリッ
ドプローブに対するハイブリッドにより決定した様に、
Ｓｐｈ Ｉ／ＰｖｕIIで制限したヒト胎盤ＤＮＡのサザ
ン法分析後の同一サイズのゲノム断片で電気泳動する。
たｃＤＮＡ断片を使って、本発明者はｐｈＴ−Ｂ５８に
クローンしたｃＤＮＡが部分的にプロセッシングしたポ
リアデニール化ＲＮＡ転写を示すことを制限ヒトゲノム
ＤＮＡのサザン法により確立した。ヌクレオチド配列分
析により同定した「イントロン」に加えて、１つのイン
トロンをＣＧＲＰコード配列の３′側にマップし、他は
ラットのカルシトニン遺伝子のものに酷似するゲノム構
成（ｇｅｎｏｍｉｃ ｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎ）を示
唆するカルシトニンコード配列の５′側にマップした
（ローゼンフェルト・エム・ジー、マーモッド・ジェイ
・ジェイ、アマラ・エス・ジー、スツンソン・エル・ダ
ブリュー、ソーチエンコ・ピー・イー、リビエール・ジ
ェイ、ベール・ダブリュー・ダブリューおよびエバンス
・アール・エム（１９８３）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒ
ｅ）、３０４、１２９〜１３５）。しかし、カルシトニ
ンエクソンとＣＧＲＰコード配列を分ける「イントロ
ン」様配列は実際ゲノム構成を示し、ｐｈＴ−Ｂ５８か
ら単離したカルシトニン、イントロンおよびＣＧＲＰ配
列を含む１１２５ｂｐ Ｓｐｈ Ｉ／ＰｖｕII ＤＮＡ
断片（図１参照）は、「イントロン」特異性ハイブリッ
ドプローブに対するハイブリッドにより決定した様に、
Ｓｐｈ Ｉ／ＰｖｕIIで制限したヒト胎盤ＤＮＡのサザ
ン法分析後の同一サイズのゲノム断片で電気泳動する。
【００３２】組換えＤＮＡ技術によるヒトＣＧＲＰの産
生 組換えＤＮＡ技術によりヒトＣＧＲＰを産生するため
に、クロラムフェニコールアセチルトランフェラーゼタ
ン白質（ＣＡＴ）と所望の中間ペプチドの活性部分から
成る融合タン白質を産生し得るベクターを作った。（こ
のベクターは係属中の国際特許出願ＰＣＴ／ＧＢ８４／
００１７９号、英国特許出願第８４１３３０１号、１９
８４年５月２４日出願に開示されている）。プラスミド
は、クロラムフェニコール弱耐性Ｒ１００ Ｒ−プラス
ミド突然変位体のＤＮＡをＰｓｔ１消化し、続いて単一
Ｐｓｔ１断片をプラスミドｐＢＲ３２２のＰｓｔ１部位
に連結して単離した（イイダ等（１９８２）ＥＭＢＯ
Ｊ．１、７５５〜７５９）。プラスミド，ｐＢＲ３２
２：Ｃｎ１０４を得、欠失により除いたカルボキシ末端
の最後の７つのアミノ酸残基を有したＣＡＴI 酵素をコ
ードする。この除去は挿入エレメントＩＳ１を含む自然
発生的生体内変異によった。しかし、生成したＤＮＡ分
子はＣＡＴI 構造遺伝子の終りに末端コドンを有しな
い。したがって、リボソームはタン白質に翻訳し、相末
端コドンに適合するまで、ＲＮＡはＩＳ１ ＤＮＡから
転写した。正味の結果は自然の酵素より長いＣＡＴI タ
ン白質１９のアミノ酸残基であり、最後の２６個のアミ
ノ酸残基はＩＳ１ ＤＮＡ配列により向けられる。この
構造遺伝子も所望の融合タン白質を創製するのに有用な
適当な制限部位を欠くから、一連のＤＮＡ操作を行なっ
た。
生 組換えＤＮＡ技術によりヒトＣＧＲＰを産生するため
に、クロラムフェニコールアセチルトランフェラーゼタ
ン白質（ＣＡＴ）と所望の中間ペプチドの活性部分から
成る融合タン白質を産生し得るベクターを作った。（こ
のベクターは係属中の国際特許出願ＰＣＴ／ＧＢ８４／
００１７９号、英国特許出願第８４１３３０１号、１９
８４年５月２４日出願に開示されている）。プラスミド
は、クロラムフェニコール弱耐性Ｒ１００ Ｒ−プラス
ミド突然変位体のＤＮＡをＰｓｔ１消化し、続いて単一
Ｐｓｔ１断片をプラスミドｐＢＲ３２２のＰｓｔ１部位
に連結して単離した（イイダ等（１９８２）ＥＭＢＯ
Ｊ．１、７５５〜７５９）。プラスミド，ｐＢＲ３２
２：Ｃｎ１０４を得、欠失により除いたカルボキシ末端
の最後の７つのアミノ酸残基を有したＣＡＴI 酵素をコ
ードする。この除去は挿入エレメントＩＳ１を含む自然
発生的生体内変異によった。しかし、生成したＤＮＡ分
子はＣＡＴI 構造遺伝子の終りに末端コドンを有しな
い。したがって、リボソームはタン白質に翻訳し、相末
端コドンに適合するまで、ＲＮＡはＩＳ１ ＤＮＡから
転写した。正味の結果は自然の酵素より長いＣＡＴI タ
ン白質１９のアミノ酸残基であり、最後の２６個のアミ
ノ酸残基はＩＳ１ ＤＮＡ配列により向けられる。この
構造遺伝子も所望の融合タン白質を創製するのに有用な
適当な制限部位を欠くから、一連のＤＮＡ操作を行なっ
た。
【００３３】上記の変位ＣＡＴI 遺伝子を含有するＰｓ
ｔ１制限断片をプラスミドｐＢＲ３２２：Ｃｎ１０４か
ら単離し、プラスミドｐＡＴ１５３の脱リン酸化Ｐｓｔ
１部位に結合させた。この方向では、ＣＡＴI とβ−ラ
クタマーゼプロモーター双方は同一方向で転写するか
ら、プラスミドｐＡＴ／Ｃｎ１０４ｂ（図３）を選ん
だ。このクローニング手法はユニークなＴｔｈ ｌｌ1
Ｉ制限部位を有するプラスミドを主として構成すること
であった。この切断部位ＣＡＴI 構造遺伝子の末端に結
合したＩＳ１ ＤＮＡから誘導され、上記の２６個のア
ミノ酸残基エクステンションの１９個アミノ酸コドンに
ある。
ｔ１制限断片をプラスミドｐＢＲ３２２：Ｃｎ１０４か
ら単離し、プラスミドｐＡＴ１５３の脱リン酸化Ｐｓｔ
１部位に結合させた。この方向では、ＣＡＴI とβ−ラ
クタマーゼプロモーター双方は同一方向で転写するか
ら、プラスミドｐＡＴ／Ｃｎ１０４ｂ（図３）を選ん
だ。このクローニング手法はユニークなＴｔｈ ｌｌ1
Ｉ制限部位を有するプラスミドを主として構成すること
であった。この切断部位ＣＡＴI 構造遺伝子の末端に結
合したＩＳ１ ＤＮＡから誘導され、上記の２６個のア
ミノ酸残基エクステンションの１９個アミノ酸コドンに
ある。
【００３４】プラスミドｐＡＴ／Ｃｎ１０４ｂはＴｔｈ
ｌｌ1 Ｉで直線化され、ＢＡＬ３１エクソヌクレアー
ゼで消化した。一連の時点の試料を取り出し、過剰のＥ
ＤＴＡを使って反応をとめた。ＢＡＬ３１消化により生
じたどの非平滑末端もＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ
断片を使って充たした。ついでこれらのプラスミドＤＮ
Ａ分子を子牛の腸内ホスファヌーゼを使って脱リン酸化
した。次に、配列５′−ＴＣＡ ＧＡＴＣＴＧＧＡＧＣ
ＴＣＣＡＧＡＴＣＴＧＡ−３′を有するキナーゼ処理し
たリンカー、Ｒ１４０を各プラスミド時点試料（Ｐｌａ
ｓｍｉｄ ｔｉｍｅ ｐｏｉｎｔ ｓａｍｐｌｅ）に連
結した。連結後、プラスミドＤＮＡをＳｓｔＩ制限エン
ドヌクレアーゼで消化し、再連結して、唯一のリンカー
を各プラスミドに存在させた。
ｌｌ1 Ｉで直線化され、ＢＡＬ３１エクソヌクレアー
ゼで消化した。一連の時点の試料を取り出し、過剰のＥ
ＤＴＡを使って反応をとめた。ＢＡＬ３１消化により生
じたどの非平滑末端もＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ
断片を使って充たした。ついでこれらのプラスミドＤＮ
Ａ分子を子牛の腸内ホスファヌーゼを使って脱リン酸化
した。次に、配列５′−ＴＣＡ ＧＡＴＣＴＧＧＡＧＣ
ＴＣＣＡＧＡＴＣＴＧＡ−３′を有するキナーゼ処理し
たリンカー、Ｒ１４０を各プラスミド時点試料（Ｐｌａ
ｓｍｉｄ ｔｉｍｅ ｐｏｉｎｔ ｓａｍｐｌｅ）に連
結した。連結後、プラスミドＤＮＡをＳｓｔＩ制限エン
ドヌクレアーゼで消化し、再連結して、唯一のリンカー
を各プラスミドに存在させた。
【００３５】これら一組のＤＮＡ分子を大腸菌ＤＨ１に
形質転換させ、融合ベクタープラスミドを２０μｇ／ml
クロラムフェニコール含有のＬ−寒天に顕著に生育する
ことを根拠に選択した。小規模のプラスミド調整物を作
った。単一のＳｓｔ１制限部位（リンカーＤＮＡから誘
導）を有しかつ同時にＥｃｏＲＩとＢｇｌIIで消化した
時に比較的小さいＤＮＡ断片を生じた多くのプラスミド
を単離した。ＤＮＡ配列分析により、プラスミドｐＡＢ
７、ｐＡＢ８およびｐＡＢ１９では、リンカーＤＮＡは
各３つの読みとり枠のＣＡＴI 構造遺伝子の３′末端に
付着したことが分かった。
形質転換させ、融合ベクタープラスミドを２０μｇ／ml
クロラムフェニコール含有のＬ−寒天に顕著に生育する
ことを根拠に選択した。小規模のプラスミド調整物を作
った。単一のＳｓｔ１制限部位（リンカーＤＮＡから誘
導）を有しかつ同時にＥｃｏＲＩとＢｇｌIIで消化した
時に比較的小さいＤＮＡ断片を生じた多くのプラスミド
を単離した。ＤＮＡ配列分析により、プラスミドｐＡＢ
７、ｐＡＢ８およびｐＡＢ１９では、リンカーＤＮＡは
各３つの読みとり枠のＣＡＴI 構造遺伝子の３′末端に
付着したことが分かった。
【００３６】プラスミドｐＡＢ７、ｐＡＢ８およびｐＡ
Ｂ１９を各々制限酵素ＳｓｔＩで消化させ、Ｓｌエクソ
ヌクレアーゼでインキュベーションした。フェノール／
クロロホルム抽出及びエタノール沈澱後、これらの平滑
末端プラスミド分子をＴａｑＩで消化させ、約７５０塩
基対のＤＮＡ断片を単離した。これらの断片は３つの読
みとり枠中ＢｇｌII部位をもつ完全ＣＡＴ融合構造遺伝
子を含むが、ＣＴＡIプロモーターを欠く。
Ｂ１９を各々制限酵素ＳｓｔＩで消化させ、Ｓｌエクソ
ヌクレアーゼでインキュベーションした。フェノール／
クロロホルム抽出及びエタノール沈澱後、これらの平滑
末端プラスミド分子をＴａｑＩで消化させ、約７５０塩
基対のＤＮＡ断片を単離した。これらの断片は３つの読
みとり枠中ＢｇｌII部位をもつ完全ＣＡＴ融合構造遺伝
子を含むが、ＣＴＡIプロモーターを欠く。
【００３７】ついでこれらのＣＡＴI 遺伝子をプラスミ
ドｐＣＴ５４のｔｒｐプロモーターの調整下においた
（エムテージ等、プロシーディング・ナショナル・アカ
デミー・サイエンス、ユーエスエイ（Ｐｒｏ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）８０，３６７１〜３６
７５、１９８３）。このプラスミドは転写ターミネータ
ー配列を有する利点があるから、高レベルの発現はこの
配列の上流およびｔｒｐプロモーターの下流でクローン
した遺伝子に限定される。プラスミドｐＣＴ５４はＥｃ
ｏＲＩで消化し、５′粘着末端はＤＮＡポリメラーゼＩ
のクレノウ断片を使って充たした。この分子を酵素Ｃｌ
ａ１で制限し、続いて脱リン酸化して、上に単離したＣ
ＡＴI 融合ベクター遺伝子カートリッジを受容する分子
を得た。この分子を３倍モルの各ＣＡＴI 遺伝子カート
リッジで連結し、続いて大腸菌ＨＢ１０１を形質転換し
て、クロラムフェニコール耐性融合ベクタープラスミド
ｐＣＴ２０１、ｐＣＴ２０２およびｐＣＴ２０３（図
３）を得た。（これらの３つの場合、操作によりｐＣＴ
５４のＥｃｏＲＩ部位を再形成した）。
ドｐＣＴ５４のｔｒｐプロモーターの調整下においた
（エムテージ等、プロシーディング・ナショナル・アカ
デミー・サイエンス、ユーエスエイ（Ｐｒｏ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）８０，３６７１〜３６
７５、１９８３）。このプラスミドは転写ターミネータ
ー配列を有する利点があるから、高レベルの発現はこの
配列の上流およびｔｒｐプロモーターの下流でクローン
した遺伝子に限定される。プラスミドｐＣＴ５４はＥｃ
ｏＲＩで消化し、５′粘着末端はＤＮＡポリメラーゼＩ
のクレノウ断片を使って充たした。この分子を酵素Ｃｌ
ａ１で制限し、続いて脱リン酸化して、上に単離したＣ
ＡＴI 融合ベクター遺伝子カートリッジを受容する分子
を得た。この分子を３倍モルの各ＣＡＴI 遺伝子カート
リッジで連結し、続いて大腸菌ＨＢ１０１を形質転換し
て、クロラムフェニコール耐性融合ベクタープラスミド
ｐＣＴ２０１、ｐＣＴ２０２およびｐＣＴ２０３（図
３）を得た。（これらの３つの場合、操作によりｐＣＴ
５４のＥｃｏＲＩ部位を再形成した）。
【００３８】プラスミドベクターｐＣＴ２０３をＨｉｎ
ｄIII で切断した。これにより、ＨｉｎｄIII 粘着末端
を有するプラスミドＤＮＡを得、ついでＤＮＡポリメラ
ーゼで平滑にした。ついで生成したプラスミドＤＮＡを
更にＢｇｌIIで切断し、ＢｇｌII粘着末端と平滑末端を
有するＤＮＡ分子を得た。生成したＤＮＡプラスミドｐ
ｈＴ−Ｂ５８のＢｇｌII−ＰｖｕII断片と連結し（図１
と３参照）、プラスミド環状分子を得た。これらのプラ
スミド分子を大腸菌ＨＢ１０１細胞に形質転換させ、大
腸菌ＨＢ１０１／ｐＣＡＴ−ＣＧＲＰ形質転換体はアン
ピシリン（１００μｇ／ml）含有培地に生育させて選択
した。培養により、大腸菌ＨＢ１０１／ｐＣＡＴ−ＣＧ
ＲＰ細胞は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動と
コマツシイブルー染色（Ｃｏｍｍａｓｓｉｅ ｂｌｕｅ
ｓｔａｉｎｉｎｇ）（図４ａ）により、又は１分間35
Ｓメチオニンで細胞をパルスした後、ＳＤＳポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動続いてオートラジオグラフィ（図
４ｂ）により判断して、予期した大きさを有する融合タ
ン白質を産生した（エムテージ・ジェイ・エス等、ＰＮ
ＡＳ（１９８３）８０，３６７１〜３６７５）。
ｄIII で切断した。これにより、ＨｉｎｄIII 粘着末端
を有するプラスミドＤＮＡを得、ついでＤＮＡポリメラ
ーゼで平滑にした。ついで生成したプラスミドＤＮＡを
更にＢｇｌIIで切断し、ＢｇｌII粘着末端と平滑末端を
有するＤＮＡ分子を得た。生成したＤＮＡプラスミドｐ
ｈＴ−Ｂ５８のＢｇｌII−ＰｖｕII断片と連結し（図１
と３参照）、プラスミド環状分子を得た。これらのプラ
スミド分子を大腸菌ＨＢ１０１細胞に形質転換させ、大
腸菌ＨＢ１０１／ｐＣＡＴ−ＣＧＲＰ形質転換体はアン
ピシリン（１００μｇ／ml）含有培地に生育させて選択
した。培養により、大腸菌ＨＢ１０１／ｐＣＡＴ−ＣＧ
ＲＰ細胞は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動と
コマツシイブルー染色（Ｃｏｍｍａｓｓｉｅ ｂｌｕｅ
ｓｔａｉｎｉｎｇ）（図４ａ）により、又は１分間35
Ｓメチオニンで細胞をパルスした後、ＳＤＳポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動続いてオートラジオグラフィ（図
４ｂ）により判断して、予期した大きさを有する融合タ
ン白質を産生した（エムテージ・ジェイ・エス等、ＰＮ
ＡＳ（１９８３）８０，３６７１〜３６７５）。
【００３９】ｐＣＡＴ−ＣＧＲＰ構成では、ＣＡＴタン
白質単独と比較して、新規タン白質が得られる−図４
(a) ，４(b) 、レーン１，2)−図４(a) ，４(b) ，レー
ン３参照。レーンＭは分子量マーカータン白質とそれぞ
れの分子量を示す。産生した融合タン白質がＣＧＲＰタ
ン白質配列を含む証拠は、ＨＢ１０１／ｐＣＡＴ−ＣＧ
ＲＰ細胞抽出物のラジオイムノアッセイにより測定し
た。５００ml培養細胞をとり、リゾチーム／デオキシコ
ール酸ナトリウム混合物（５ml）で溶解させ、ＤＮアー
ゼで５℃／３０分間処理した（エムテージ・ジェイ・エ
ス等、ＰＮＡＳ（１９８３），８０，３６７１〜３６７
５）。等容量の０．１Ｍトリス塩酸pH８．０，０．１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ，５％（ｖ／ｖ）グリコールを加え、ヒト
ＣＧＲＰ配列の存在は抽出物にて測定した。ラジオイム
ノアッセイは０．０５Ｍリン酸バッファーpH７．４中最
終容量４００μｌで行なった（ガージス・エス・アイ
等、ジャーナル・エンドクリノロジー（Ｊ．Ｅｎｄｏｃ
ｒｉｎｏｌ．）７８，３７２〜３８２）。Ｔｙｒ−（Ｃ
ＧＲＰアミノ酸２５−３７）−アミドに対し、公知技術
を使って、抗血清をウサギで作り、１２５I Ｔｙｒ−
（ＣＧＲＰアミノ酸２５−３７）−アミドトレーサーに
対して、ヒナオボアルブミンに抱合させた（レイチリン
・エム、１９８０、メソッド・エンザイモロジー（Ｍｅ
ｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．）７０，１５９〜１６５）。ト
レーサーはハンターとグリーンウッドのクロラミンＴ法
を使って沃素化した。図５から分ることは、ＨＢ１０１
／ｐＣＡＴ−ＣＧＲＰタン白抽出物はヒトＣＧＲＰスタ
ンダード（化学合成した）のものに類似の置換曲線によ
り１：１００００血清稀釈を使ってトレーサー（５００
０ｃｐｍ）を置換した。トリプシン（０．５mg／ml）で
一晩３７℃で予め消化し、続いてトラシロールでトリプ
シンを不活性化したタン白抽出物を使って置換はみられ
なかった。ヤギ抗ウサギ血清を使って、ウサギ１ｇＧを
定量的に沈澱させ、キャリアーとして予備−免疫ウサギ
血清１μｌを添加後１２５I トレーサーを結合させ（ク
レイグ・アール・ケイ等、１９７６，バイオケミストリ
ー・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．）１６０，５７
〜７４）、そして沈澱１２５I をγ−カウントにより定
量した。これはＨＢ１０１／ｐＣＡＴ−ＣＧＲＰにより
ヒトＣＧＲＰペプチド配列の産生を証明する。
白質単独と比較して、新規タン白質が得られる−図４
(a) ，４(b) 、レーン１，2)−図４(a) ，４(b) ，レー
ン３参照。レーンＭは分子量マーカータン白質とそれぞ
れの分子量を示す。産生した融合タン白質がＣＧＲＰタ
ン白質配列を含む証拠は、ＨＢ１０１／ｐＣＡＴ−ＣＧ
ＲＰ細胞抽出物のラジオイムノアッセイにより測定し
た。５００ml培養細胞をとり、リゾチーム／デオキシコ
ール酸ナトリウム混合物（５ml）で溶解させ、ＤＮアー
ゼで５℃／３０分間処理した（エムテージ・ジェイ・エ
ス等、ＰＮＡＳ（１９８３），８０，３６７１〜３６７
５）。等容量の０．１Ｍトリス塩酸pH８．０，０．１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ，５％（ｖ／ｖ）グリコールを加え、ヒト
ＣＧＲＰ配列の存在は抽出物にて測定した。ラジオイム
ノアッセイは０．０５Ｍリン酸バッファーpH７．４中最
終容量４００μｌで行なった（ガージス・エス・アイ
等、ジャーナル・エンドクリノロジー（Ｊ．Ｅｎｄｏｃ
ｒｉｎｏｌ．）７８，３７２〜３８２）。Ｔｙｒ−（Ｃ
ＧＲＰアミノ酸２５−３７）−アミドに対し、公知技術
を使って、抗血清をウサギで作り、１２５I Ｔｙｒ−
（ＣＧＲＰアミノ酸２５−３７）−アミドトレーサーに
対して、ヒナオボアルブミンに抱合させた（レイチリン
・エム、１９８０、メソッド・エンザイモロジー（Ｍｅ
ｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．）７０，１５９〜１６５）。ト
レーサーはハンターとグリーンウッドのクロラミンＴ法
を使って沃素化した。図５から分ることは、ＨＢ１０１
／ｐＣＡＴ−ＣＧＲＰタン白抽出物はヒトＣＧＲＰスタ
ンダード（化学合成した）のものに類似の置換曲線によ
り１：１００００血清稀釈を使ってトレーサー（５００
０ｃｐｍ）を置換した。トリプシン（０．５mg／ml）で
一晩３７℃で予め消化し、続いてトラシロールでトリプ
シンを不活性化したタン白抽出物を使って置換はみられ
なかった。ヤギ抗ウサギ血清を使って、ウサギ１ｇＧを
定量的に沈澱させ、キャリアーとして予備−免疫ウサギ
血清１μｌを添加後１２５I トレーサーを結合させ（ク
レイグ・アール・ケイ等、１９７６，バイオケミストリ
ー・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．）１６０，５７
〜７４）、そして沈澱１２５I をγ−カウントにより定
量した。これはＨＢ１０１／ｐＣＡＴ−ＣＧＲＰにより
ヒトＣＧＲＰペプチド配列の産生を証明する。
【００４０】ｐＣＡＴ−ＣＧＲＰプラスミドの構成はＳ
ｃａｌ消化によりチェックした。これは予期した量によ
り、ｐＣＴ２０３から得た相当するバンドより大きいＤ
ＮＡバンドをゲル上に得た。プラスミドの構成はＨａｅ
II消化によってもチェックした。ｐｈＴ−Ｂ５８由来の
ＢｇｌII−ＰｖｕII ｃＤＮＡ断片はｐＣＴ２０３に存
しないＨａｅII部位を含み、ゲルは予期した大きさのｃ
ＤＮＡバンドを示した。ｐＣＡＴ−ＣＧＲＰにより産生
した融合タン白質はカルボキシル末端とアミノ末端に付
加的アミノ酸残基を有するＣＧＲＰのアミノ酸配列から
成る（図１）。アミノ末端はＣＧＲＰの直前に配列Ｌｙ
ｓ−Ａｒｇを含む。これはクロストリパイン切断部位を
供するが、ＣＧＲＰ内の潜在的クロストパイン部位から
みて、考慮されねばならない。他のユニークな切断部位
を使用することができる。
ｃａｌ消化によりチェックした。これは予期した量によ
り、ｐＣＴ２０３から得た相当するバンドより大きいＤ
ＮＡバンドをゲル上に得た。プラスミドの構成はＨａｅ
II消化によってもチェックした。ｐｈＴ−Ｂ５８由来の
ＢｇｌII−ＰｖｕII ｃＤＮＡ断片はｐＣＴ２０３に存
しないＨａｅII部位を含み、ゲルは予期した大きさのｃ
ＤＮＡバンドを示した。ｐＣＡＴ−ＣＧＲＰにより産生
した融合タン白質はカルボキシル末端とアミノ末端に付
加的アミノ酸残基を有するＣＧＲＰのアミノ酸配列から
成る（図１）。アミノ末端はＣＧＲＰの直前に配列Ｌｙ
ｓ−Ａｒｇを含む。これはクロストリパイン切断部位を
供するが、ＣＧＲＰ内の潜在的クロストパイン部位から
みて、考慮されねばならない。他のユニークな切断部位
を使用することができる。
【００４１】化学的合成によるヒトＣＧＲＰの産生 そのアミド形の断片又はその類似体のヒトＣＧＲＰおよ
びＰＤＡ−４はセロテック社２４４−２５０バスロー
ド、スロー、バークシャー、エスエルアイ、４０７英国
により、又はペニンスラ・ラボラトリー社、６１テイラ
ー・ウェイ、ベルモント、カリホルニア９４００２米国
により合成された。ペプチド合成の標準技術を使用する
ことができ、例えばメリフィールド固体相ペプチド合成
又は所謂ＦＭＯＣ操作（「固体相ペプチド合成−再評価
（Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔ
ｈｅｓｉｓ−Ａ Ｒｅａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ）」アール
・シー・シェパード−モンキュラー・エンドクリノロジ
ー版、マッキンタイヤとゼルケ、エンゼビアー（１９７
７）４３〜５６；イー・アサートン等、ジェー・シー・
エス・ケム・コム（Ｊ．Ｃ．Ｓ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍ
ｍ．）（１９８１）１１５１〜１１５２；およびジー・
バラニーとアール・ビー・メリフィールド、ザ・ペプチ
ド（Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）、イー・グロスとジェ
イ・ジェイエンホウファー、アカデミプレス、ニューヨ
ーク（１９８０）３参照）。
びＰＤＡ−４はセロテック社２４４−２５０バスロー
ド、スロー、バークシャー、エスエルアイ、４０７英国
により、又はペニンスラ・ラボラトリー社、６１テイラ
ー・ウェイ、ベルモント、カリホルニア９４００２米国
により合成された。ペプチド合成の標準技術を使用する
ことができ、例えばメリフィールド固体相ペプチド合成
又は所謂ＦＭＯＣ操作（「固体相ペプチド合成−再評価
（Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔ
ｈｅｓｉｓ−Ａ Ｒｅａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ）」アール
・シー・シェパード−モンキュラー・エンドクリノロジ
ー版、マッキンタイヤとゼルケ、エンゼビアー（１９７
７）４３〜５６；イー・アサートン等、ジェー・シー・
エス・ケム・コム（Ｊ．Ｃ．Ｓ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍ
ｍ．）（１９８１）１１５１〜１１５２；およびジー・
バラニーとアール・ビー・メリフィールド、ザ・ペプチ
ド（Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）、イー・グロスとジェ
イ・ジェイエンホウファー、アカデミプレス、ニューヨ
ーク（１９８０）３参照）。
【００４２】ヒトＣＧＲＰの心血管作用 ｐｈＴ−Ｂ５８のヌクレオチド配列分析により予期され
たアミノ酸配列を使って、アミド化ヒトＣＧＲＰを化学
的に合成しついでイオン・逆相クロマトグラフィの併用
により生成した。最終ヒトＣＧＲＰ調製物は質量分析で
判断して純粋であり、単一イオンが観察された（Ｍｒ３
７８６）。本発明者はこの調製物の心血管効果を類似純
度の合成ラットＣＧＲＰ調製物と比較した。
たアミノ酸配列を使って、アミド化ヒトＣＧＲＰを化学
的に合成しついでイオン・逆相クロマトグラフィの併用
により生成した。最終ヒトＣＧＲＰ調製物は質量分析で
判断して純粋であり、単一イオンが観察された（Ｍｒ３
７８６）。本発明者はこの調製物の心血管効果を類似純
度の合成ラットＣＧＲＰ調製物と比較した。
【００４３】スプレイグ−ドウリイラット（２８５〜３
１５ｇ）４〜６匹の雄群はペントバルビトン（６０mgkg
-1、腹腔内）で麻酔した。気管、左頸動脈および左頸静
脈にカニューレを挿入した。血圧はステイタム・Ｐ２３
ＩＤ圧力トランスジューサーによりガラスポリグラフ
上の頸動脈から記録し、平均動脈圧はトレースから誘導
した。心搏度数は血圧シグナルにより誘導させたタコグ
ラフ（ガラスモデル７Ｐ４）により測定した。ヒトＣＧ
ＲＰは樹脂から粗製し、ついで精製するかまたは後者で
はペニンシュラ・ラボラトリーから精製形で得た。精製
ラットＣＧＲＰは同一起源のものであった。すべての合
成調製物は質量分析にかけ（Ｍ−スキャン社）、使用す
る前に構造と純度を確認した。ヒトＣＧＲＰ、ラットＣ
ＧＲＰ、プロパノール塩酸塩（シグマ）、マレイン酸メ
ピラミン（シグマ）、シメチジン塩酸塩（エス・ケイ＆
エフ）、ヒスタミンジリン酸塩（シグマ）を０．９％ｗ
／ｖ食塩水に溶解した。すべての化合物はメピラミン
（エス・シー）を除いて静脈内に投与した。食塩水
（●）、ヒトＣＧＲＰ（○）およびラットＣＧＲＰ
（△）は２分間隔でラットに対し０．１ml容量で累積的
に投与した。
１５ｇ）４〜６匹の雄群はペントバルビトン（６０mgkg
-1、腹腔内）で麻酔した。気管、左頸動脈および左頸静
脈にカニューレを挿入した。血圧はステイタム・Ｐ２３
ＩＤ圧力トランスジューサーによりガラスポリグラフ
上の頸動脈から記録し、平均動脈圧はトレースから誘導
した。心搏度数は血圧シグナルにより誘導させたタコグ
ラフ（ガラスモデル７Ｐ４）により測定した。ヒトＣＧ
ＲＰは樹脂から粗製し、ついで精製するかまたは後者で
はペニンシュラ・ラボラトリーから精製形で得た。精製
ラットＣＧＲＰは同一起源のものであった。すべての合
成調製物は質量分析にかけ（Ｍ−スキャン社）、使用す
る前に構造と純度を確認した。ヒトＣＧＲＰ、ラットＣ
ＧＲＰ、プロパノール塩酸塩（シグマ）、マレイン酸メ
ピラミン（シグマ）、シメチジン塩酸塩（エス・ケイ＆
エフ）、ヒスタミンジリン酸塩（シグマ）を０．９％ｗ
／ｖ食塩水に溶解した。すべての化合物はメピラミン
（エス・シー）を除いて静脈内に投与した。食塩水
（●）、ヒトＣＧＲＰ（○）およびラットＣＧＲＰ
（△）は２分間隔でラットに対し０．１ml容量で累積的
に投与した。
【００４４】平均動脈圧力（ＭＡＰ）のピーク落ちと２
分後の心搏度数（ＨＲ）を測定した。食塩水の投与はＭ
ＡＰ又はＨＲを変えず、ヒットＣＧＲＰとラットＣＧＲ
Ｐ双方はＭＡＰの薬量依存性落ちとＨＲの増大を誘発し
た。ヒトＣＧＲＰ５分前、プロプラノロール、３．４μ
モルkg-1（□）は心摶度数の増大を妨げなかった。メピ
ラミン（１２．４μモルkg-1）とシメチジン（３０分間
注入として５９．５μモルkg-1）（■）はヒスタミンに
対する低血圧感応を有意に下げた（１０-8〜１０ -5モル
kg-1）が、ヒトＣＧＲＰの低血圧効果を有意に変えなか
った。実験期間中食塩水を７回注入しても、プロプラノ
ロール又はメピラミンとシメチジンの存在下ＭＡＰ又は
ＨＲを有意に変えなかった。
分後の心搏度数（ＨＲ）を測定した。食塩水の投与はＭ
ＡＰ又はＨＲを変えず、ヒットＣＧＲＰとラットＣＧＲ
Ｐ双方はＭＡＰの薬量依存性落ちとＨＲの増大を誘発し
た。ヒトＣＧＲＰ５分前、プロプラノロール、３．４μ
モルkg-1（□）は心摶度数の増大を妨げなかった。メピ
ラミン（１２．４μモルkg-1）とシメチジン（３０分間
注入として５９．５μモルkg-1）（■）はヒスタミンに
対する低血圧感応を有意に下げた（１０-8〜１０ -5モル
kg-1）が、ヒトＣＧＲＰの低血圧効果を有意に変えなか
った。実験期間中食塩水を７回注入しても、プロプラノ
ロール又はメピラミンとシメチジンの存在下ＭＡＰ又は
ＨＲを有意に変えなかった。
【００４５】ペントバルビトンで麻酔したラットでは、
静脈内のヒトＣＧＲＰは血圧の急速な薬物関連下落をひ
き起こし、１分以内で最大となり、０．２８ｎモルkg-1
の投与量で５０％の血圧低下を示した。これは図５のラ
ットＣＧＲＰ（０．２３ｎモルkg-1）で得た結果とは有
意に異ならなかった（ｐ０．０５、ｔ−テスト）。低血
圧は心搏度数の増大と少ないが有意な関係を示した。血
圧の低落はヒスタミンの放出を通じて塩基性ペプチドに
より間接的にひきおこされうる（ゴス・エイ（１９７
３）ヒスタミンと抗ヒスタミンにおいて（Ｉｎ Ｈｉｓ
ｔａｍｉｎｅ ａｎｄ ａｎｔｉｈｉｓｔａｍｉｎｅ
ｓ）（シャヒター・エム著）、第１巻、薬理と治療の百
科事典（Ｉｎｔ．Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐ
ｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔ
ｉｃｓ，セクション７４，２５〜４３ペルガモンプレ
ス、オックスフォード）しかつヒトＣＧＲＰは比較的塩
基性ペプチドであるから、本発明者はヒトＣＧＲＰを投
与する前に、ヒスタミンＨ1 −レセプター拮抗剤メピラ
ミンとヒスタミンＨ2 −レセプター拮抗剤シメチジンに
よる予備処理効果を試験した。拮抗剤はヒトＣＧＲＰに
対する低血圧感応（図６）又は関連の頻脈（データは示
してない）に対し有意な効果はなかった。増大した交感
神経ドライブを通じて、ラットＣＧＲＰは心搏度数を増
大しうることも示唆された（フィッシャー・エル・エ
イ、キツカワ・ディー・オー、リビエール・ジェイ・イ
ー、アマラ・エス・ジー、エバンス・アール・エム、ロ
ーゼンフェルド・エム・ジー、ベイル・ダブリュー・ダ
ブリュ＆ブラウン・エム・アール（１９８３）、ネイチ
ャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３０５、５３４−５３６）。本
発明者は、α−アドレノセプター拮抗剤プロプラノロー
ル（２ｌｏｇ単位により右側にイソプレナリン薬物−感
応曲線をシフトするに十分な量で）で予備処理した後、
ヒトＣＧＲＰの静脈内投与によりこの可能性を研究し
た。プロプラノロールより、基礎心搏度数は有意に減じ
たが、ヒトＣＧＲＰは頻脈をおこし続け、更に食塩水対
照処理（図６）と比較して、この効果の制限薬量は未変
化のままであった。これらの結果から、ヒトＣＧＲＰに
よりおこる血圧の低下と心搏度数の増大は、ヒスタミン
やセタコールアミンの放出により間接に仲介しない。ヒ
トＣＧＲＰに対する感応期間は単一薬投与により測定し
た。ヒトＣＧＲＰ１ｎモルkg-1は動脈圧を１２５±７．
６mmHgから６８．３±９．３mmHgに低下させ、血圧を５
０％まで回復するに要する時間は３．８±０．５分であ
った。
静脈内のヒトＣＧＲＰは血圧の急速な薬物関連下落をひ
き起こし、１分以内で最大となり、０．２８ｎモルkg-1
の投与量で５０％の血圧低下を示した。これは図５のラ
ットＣＧＲＰ（０．２３ｎモルkg-1）で得た結果とは有
意に異ならなかった（ｐ０．０５、ｔ−テスト）。低血
圧は心搏度数の増大と少ないが有意な関係を示した。血
圧の低落はヒスタミンの放出を通じて塩基性ペプチドに
より間接的にひきおこされうる（ゴス・エイ（１９７
３）ヒスタミンと抗ヒスタミンにおいて（Ｉｎ Ｈｉｓ
ｔａｍｉｎｅ ａｎｄ ａｎｔｉｈｉｓｔａｍｉｎｅ
ｓ）（シャヒター・エム著）、第１巻、薬理と治療の百
科事典（Ｉｎｔ．Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐ
ｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔ
ｉｃｓ，セクション７４，２５〜４３ペルガモンプレ
ス、オックスフォード）しかつヒトＣＧＲＰは比較的塩
基性ペプチドであるから、本発明者はヒトＣＧＲＰを投
与する前に、ヒスタミンＨ1 −レセプター拮抗剤メピラ
ミンとヒスタミンＨ2 −レセプター拮抗剤シメチジンに
よる予備処理効果を試験した。拮抗剤はヒトＣＧＲＰに
対する低血圧感応（図６）又は関連の頻脈（データは示
してない）に対し有意な効果はなかった。増大した交感
神経ドライブを通じて、ラットＣＧＲＰは心搏度数を増
大しうることも示唆された（フィッシャー・エル・エ
イ、キツカワ・ディー・オー、リビエール・ジェイ・イ
ー、アマラ・エス・ジー、エバンス・アール・エム、ロ
ーゼンフェルド・エム・ジー、ベイル・ダブリュー・ダ
ブリュ＆ブラウン・エム・アール（１９８３）、ネイチ
ャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３０５、５３４−５３６）。本
発明者は、α−アドレノセプター拮抗剤プロプラノロー
ル（２ｌｏｇ単位により右側にイソプレナリン薬物−感
応曲線をシフトするに十分な量で）で予備処理した後、
ヒトＣＧＲＰの静脈内投与によりこの可能性を研究し
た。プロプラノロールより、基礎心搏度数は有意に減じ
たが、ヒトＣＧＲＰは頻脈をおこし続け、更に食塩水対
照処理（図６）と比較して、この効果の制限薬量は未変
化のままであった。これらの結果から、ヒトＣＧＲＰに
よりおこる血圧の低下と心搏度数の増大は、ヒスタミン
やセタコールアミンの放出により間接に仲介しない。ヒ
トＣＧＲＰに対する感応期間は単一薬投与により測定し
た。ヒトＣＧＲＰ１ｎモルkg-1は動脈圧を１２５±７．
６mmHgから６８．３±９．３mmHgに低下させ、血圧を５
０％まで回復するに要する時間は３．８±０．５分であ
った。
【００４６】上記したフェノバルビトンで麻酔したラッ
トにおける静脈内ＰＯＡ−４の心血管作用の試験は小で
あるが、有意な効果を示した。図７から分るように、７
ＰＤＡ−４はヒトＣＧＲＰより５０〜１００倍低い能力
を有した。したがって、１μｇ／キロヒトＣＧＲＰは平
均動脈圧において急な５０mmHg低下と心搏度数の２５〜
３０bpm の増大となった。一方、１０μｇ／キロＰＤＡ
−４は平均動脈圧の１５〜２０mmHgの低下と心搏度数の
１５〜２０bpm の増大の原因となった。ＰＤＡ−４の作
用機構は試験しなかった。
トにおける静脈内ＰＯＡ−４の心血管作用の試験は小で
あるが、有意な効果を示した。図７から分るように、７
ＰＤＡ−４はヒトＣＧＲＰより５０〜１００倍低い能力
を有した。したがって、１μｇ／キロヒトＣＧＲＰは平
均動脈圧において急な５０mmHg低下と心搏度数の２５〜
３０bpm の増大となった。一方、１０μｇ／キロＰＤＡ
−４は平均動脈圧の１５〜２０mmHgの低下と心搏度数の
１５〜２０bpm の増大の原因となった。ＰＤＡ−４の作
用機構は試験しなかった。
【００４７】生体内の血圧低下をおこす反射又はその他
の因子の影響の可能性を除くために、ヒトＣＧＲＰの心
臓作用も試験管内で研究した。ダンキン・ハートレイモ
ルモット雄（２８０〜４００ｇ）は頸部をひねって殺
し、除血した。心臓を取り出し、右心房を細断し、クレ
ブス溶液（mM）：ＮａＣｌ１１８，ＫＣｌ４．７，Ｃａ
Ｃｌ2 ２．５，ＫＨ2 ＰＯ4 １．１８，ＮａＨＣＯ3 ２
５，ＭｇＳＯ4 １．１８およびグルコース１１．１に３
４℃、０．５ｇの張力で取りつけ、９５：５ Ｏ2 ：Ｃ
Ｏ2 で泡立てた。ガラスＦＴ０３トランスジューサーに
より等測的に心房力と心房速度を測定し、ガラスポリグ
ラフに記録した。ヒト（●）又はラット（▲）ＣＧＲＰ
をランダムに単一投与した。予備実験では、ＣＧＲＰに
対する２つの連続投薬−感応曲線は再現可能な結果を示
した。
の因子の影響の可能性を除くために、ヒトＣＧＲＰの心
臓作用も試験管内で研究した。ダンキン・ハートレイモ
ルモット雄（２８０〜４００ｇ）は頸部をひねって殺
し、除血した。心臓を取り出し、右心房を細断し、クレ
ブス溶液（mM）：ＮａＣｌ１１８，ＫＣｌ４．７，Ｃａ
Ｃｌ2 ２．５，ＫＨ2 ＰＯ4 １．１８，ＮａＨＣＯ3 ２
５，ＭｇＳＯ4 １．１８およびグルコース１１．１に３
４℃、０．５ｇの張力で取りつけ、９５：５ Ｏ2 ：Ｃ
Ｏ2 で泡立てた。ガラスＦＴ０３トランスジューサーに
より等測的に心房力と心房速度を測定し、ガラスポリグ
ラフに記録した。ヒト（●）又はラット（▲）ＣＧＲＰ
をランダムに単一投与した。予備実験では、ＣＧＲＰに
対する２つの連続投薬−感応曲線は再現可能な結果を示
した。
【００４８】３０分間平衡したプロプラノロール（○）
（３００nM）又はシメチジン（１００μM ）は同一実験
でそれぞれイソプレナリン（３−３０nM）又はヒスタミ
ン（５００nM）の効果を中和した。これらの拮抗剤はＣ
ＧＲＰによりひきおこされた増大した心房速度と心房力
を有意に減じなかった。拮抗剤単独は単離した心房の基
礎率（１８７±９ｂ．分-1）又は力（２６４±３４mg）
を有意に変えなかった。
（３００nM）又はシメチジン（１００μM ）は同一実験
でそれぞれイソプレナリン（３−３０nM）又はヒスタミ
ン（５００nM）の効果を中和した。これらの拮抗剤はＣ
ＧＲＰによりひきおこされた増大した心房速度と心房力
を有意に減じなかった。拮抗剤単独は単離した心房の基
礎率（１８７±９ｂ．分-1）又は力（２６４±３４mg）
を有意に変えなかった。
【００４９】モルモットの右心房調製物では、ヒトＣＧ
ＲＰは収縮時の率と力において濃度依存性増大を示した
（図８）。生体内で得た結果と一致して、プロプラノロ
ール又はヒスタミンＨ2 −レセプター拮抗剤シメチジン
のβ−アドレノセプター有効ブロック濃度はヒトＣＧＲ
Ｐに対する感応を変えなかった。興味のあることは、ラ
ットＣＧＲＰは心房力（ａｔｒｉａｌ ｆｏｒｃｅ）の
増大をおこす上でヒトＣＧＲＰと等能力であったが、増
大する心房速度では約１０倍の能力があった（図８）。
ラットＣＧＲＰにより生ずる心房速度又は力の増加はプ
ロプラノロールによりブロックされなかった。したがっ
て、ラットとヒトＣＧＲＰは単離した心房に直接作用す
るようであり、その作用はカテコールアミンとヒスタミ
ン受容体機構に依存しない。
ＲＰは収縮時の率と力において濃度依存性増大を示した
（図８）。生体内で得た結果と一致して、プロプラノロ
ール又はヒスタミンＨ2 −レセプター拮抗剤シメチジン
のβ−アドレノセプター有効ブロック濃度はヒトＣＧＲ
Ｐに対する感応を変えなかった。興味のあることは、ラ
ットＣＧＲＰは心房力（ａｔｒｉａｌ ｆｏｒｃｅ）の
増大をおこす上でヒトＣＧＲＰと等能力であったが、増
大する心房速度では約１０倍の能力があった（図８）。
ラットＣＧＲＰにより生ずる心房速度又は力の増加はプ
ロプラノロールによりブロックされなかった。したがっ
て、ラットとヒトＣＧＲＰは単離した心房に直接作用す
るようであり、その作用はカテコールアミンとヒスタミ
ン受容体機構に依存しない。
【００５０】本発明者の研究で証明したことは、麻酔し
たラットにおけるヒトとラットＣＧＲＰの末梢心血管作
用は意識のある動物に末梢的に投与したラットＣＧＲＰ
について報告した点を類似しているが、ラットＣＧＲＰ
は本発明者の実験で麻酔により心血管の反射の多分鈍さ
により意図的な調製物において心搏度数が大幅に増大し
た（モリスン・ジェイ・エル、ウォーカー・エイチ・エ
イ＆リチャードスン・エイ・ピー（１９５０）アーチ、
インター・ファーマコダイン）Ａｒｃｈ．Ｉｎｔ．Ｐｈ
ａｒｍａｃｏｄｙｎ．）８２，５３−６２）。拮抗剤に
よる研究では、ＣＧＲＰの血管拡張作用はヒスタミン又
はカテコールアミンにより仲介されないことが証明され
ている。したがって、ＣＧＲＰは新しいリセプター機構
により直接心血管系に作用し、他のメジエーターの放出
により作用しないことを証明している。同様に、プロプ
ラノロールやシメチジンにより影響されなかった単離心
房に対するＣＧＲＰの活性は血管系に加えて心組織にお
けるＣＧＲＰリセプター機構の概念を支持している。
たラットにおけるヒトとラットＣＧＲＰの末梢心血管作
用は意識のある動物に末梢的に投与したラットＣＧＲＰ
について報告した点を類似しているが、ラットＣＧＲＰ
は本発明者の実験で麻酔により心血管の反射の多分鈍さ
により意図的な調製物において心搏度数が大幅に増大し
た（モリスン・ジェイ・エル、ウォーカー・エイチ・エ
イ＆リチャードスン・エイ・ピー（１９５０）アーチ、
インター・ファーマコダイン）Ａｒｃｈ．Ｉｎｔ．Ｐｈ
ａｒｍａｃｏｄｙｎ．）８２，５３−６２）。拮抗剤に
よる研究では、ＣＧＲＰの血管拡張作用はヒスタミン又
はカテコールアミンにより仲介されないことが証明され
ている。したがって、ＣＧＲＰは新しいリセプター機構
により直接心血管系に作用し、他のメジエーターの放出
により作用しないことを証明している。同様に、プロプ
ラノロールやシメチジンにより影響されなかった単離心
房に対するＣＧＲＰの活性は血管系に加えて心組織にお
けるＣＧＲＰリセプター機構の概念を支持している。
【００５１】生体内の血圧の低下および試験管内の心房
の収縮力を増大させた、ヒトとラットＣＧＲＰの類似能
力は、心房の収縮速度を上げた場合のそれらの各種能力
と対照的である。試験管内で得た結果では、ラットＣＧ
ＲＰは多分使われた異なる種又は麻酔薬の存在により、
生体内で明らかでなかった性質、望ましい変時性効果
（変力性と比較して）を有することを示唆している。本
発明者はＰＤＡ−４を静脈投与した時、同時の頻脈と共
に低血圧効果を有することを証明している。
の収縮力を増大させた、ヒトとラットＣＧＲＰの類似能
力は、心房の収縮速度を上げた場合のそれらの各種能力
と対照的である。試験管内で得た結果では、ラットＣＧ
ＲＰは多分使われた異なる種又は麻酔薬の存在により、
生体内で明らかでなかった性質、望ましい変時性効果
（変力性と比較して）を有することを示唆している。本
発明者はＰＤＡ−４を静脈投与した時、同時の頻脈と共
に低血圧効果を有することを証明している。
【００５２】診断用途 図２においてヒトＣＧＲＰで予期したアミノ酸配列を使
って、アミド化ＣＧＲＰおよびチロシン化類似物；オボ
アルブミンに接合したＴｙｒ−（ＣＧＲＰ−アミノ酸２
５−３７）−アミドに対してウサギに抗体を作った（レ
イチリン・エム（１９８０）、メソロド・エンザイム
（Ｍｅｔｈｏｄ．Ｅｎｚｙｍ．）７０，１５９−１６
５）。１２５I Ｔｙｒ−（ＣＧＲＰ−アミノ酸２５−３
７）−アミドを結合する能力により測定して、両方共抗
原性を証明した。本発明者は、上記した様に、１：１２
５００の血清稀釈と４００μｌ試験における１８００cp
m １２５I −Ｔｙｒ−（ＣＧＲＰ−アミノ酸２５−３
７）−アミドトレーサーを使って、イング（Ｉｎｇ）Ｃ
ＧＲＰ／管に感受性のラジオイムノアッセイを行なうた
めに、Ｔｙｒ−（ＣＧＲＰ−アミノ酸２５−３７）−ア
ミドに対する抗体を使用した。この試験（図９）を使っ
て、この抗体はヒトカルシトニン、チロシン化ＰＤＡ−
４、カタカルシン、Ｔｙｒ−ＣＧＲＰ−（アミノ酸１−
８）又はサケカルシトシンとは交差反応しないが、抗体
はラットＣＧＲＰにおける抗原決定子を認識しかつヒト
ＣＧＲＰの増加量で滴定した時、予期した置換曲線を示
すことを本発明者は証明している。この試験を使って、
ヒト髄質甲状腺癌組織からの抽出物（ベネット・エイチ
・ピー等、１９７８、バイオケミストリイ・ジャーナル
（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．）１７５，１１３９−１１４
１）およびヒト小細胞癌セルライン（ＤＭＳ１５３）か
ら誘導した組織培養媒質および低レベルのカルシトニン
を生成することが分っている剖検による肝転移（肺初
期）から誘導したセルライン（ペッテンジル等（１９８
０）キャンサー（Ｃａｎｃｅｒ）４５，９０６−９１
８）において本発明者はヒトＣＧＲＰの存在を同定し
た。組織培養媒質単独では抗血清と反応せず、ＤＭＳ５
３細胞から取り出した媒質、高レベルのカルシトニンを
産生することが知られている小細胞癌セルライン（ソレ
ンソン等、１９８１、キャンサー（Ｃａｎｃｅｒ）４
７，１２８９−１２９６）はほんのわずかのヒトＣＧＲ
Ｐを有した。平衡置換曲線はＭＣＴ抽出物とＤＭＳ１５
３媒質について観察された。正常なヒト血漿は試験の範
囲内で検出可能量のＣＧＲＰを含まず、何人かのＭＣＴ
患者の血漿は測定可能量を含有した。
って、アミド化ＣＧＲＰおよびチロシン化類似物；オボ
アルブミンに接合したＴｙｒ−（ＣＧＲＰ−アミノ酸２
５−３７）−アミドに対してウサギに抗体を作った（レ
イチリン・エム（１９８０）、メソロド・エンザイム
（Ｍｅｔｈｏｄ．Ｅｎｚｙｍ．）７０，１５９−１６
５）。１２５I Ｔｙｒ−（ＣＧＲＰ−アミノ酸２５−３
７）−アミドを結合する能力により測定して、両方共抗
原性を証明した。本発明者は、上記した様に、１：１２
５００の血清稀釈と４００μｌ試験における１８００cp
m １２５I −Ｔｙｒ−（ＣＧＲＰ−アミノ酸２５−３
７）−アミドトレーサーを使って、イング（Ｉｎｇ）Ｃ
ＧＲＰ／管に感受性のラジオイムノアッセイを行なうた
めに、Ｔｙｒ−（ＣＧＲＰ−アミノ酸２５−３７）−ア
ミドに対する抗体を使用した。この試験（図９）を使っ
て、この抗体はヒトカルシトニン、チロシン化ＰＤＡ−
４、カタカルシン、Ｔｙｒ−ＣＧＲＰ−（アミノ酸１−
８）又はサケカルシトシンとは交差反応しないが、抗体
はラットＣＧＲＰにおける抗原決定子を認識しかつヒト
ＣＧＲＰの増加量で滴定した時、予期した置換曲線を示
すことを本発明者は証明している。この試験を使って、
ヒト髄質甲状腺癌組織からの抽出物（ベネット・エイチ
・ピー等、１９７８、バイオケミストリイ・ジャーナル
（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．）１７５，１１３９−１１４
１）およびヒト小細胞癌セルライン（ＤＭＳ１５３）か
ら誘導した組織培養媒質および低レベルのカルシトニン
を生成することが分っている剖検による肝転移（肺初
期）から誘導したセルライン（ペッテンジル等（１９８
０）キャンサー（Ｃａｎｃｅｒ）４５，９０６−９１
８）において本発明者はヒトＣＧＲＰの存在を同定し
た。組織培養媒質単独では抗血清と反応せず、ＤＭＳ５
３細胞から取り出した媒質、高レベルのカルシトニンを
産生することが知られている小細胞癌セルライン（ソレ
ンソン等、１９８１、キャンサー（Ｃａｎｃｅｒ）４
７，１２８９−１２９６）はほんのわずかのヒトＣＧＲ
Ｐを有した。平衡置換曲線はＭＣＴ抽出物とＤＭＳ１５
３媒質について観察された。正常なヒト血漿は試験の範
囲内で検出可能量のＣＧＲＰを含まず、何人かのＭＣＴ
患者の血漿は測定可能量を含有した。
【００５３】本発明者は、パーオキシダーゼ−抗パーオ
キシダーゼ法（スタンバーガー・エル・エイ、１９７
９、免疫細胞化学（Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ）第２版、ジェイ・ワイリイ＆サン、Ｎ．Ｙ．）
による免疫染色を使って、ヒト髄質甲状腺癌組織を包埋
したパラフィンワックス中ライトレベルで免疫細胞化学
法によりヒトＣＧＲＰ産生細胞をおき、ヒト腫瘍病理学
の分類上これらの抗体の診断上の応用を立証した。全ポ
リ（Ａ）含有ＲＮＡを２つの異なる髄質甲状腺癌腫とＤ
ＭＳ５３と１５３セルラインから単離した（アリスン
等、（１９８１）バイオケム・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．Ｊ．）１９９，７２５−７３１およびホール等、
１９７９、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２７７，５４−
５６）。カルシトニン、ＣＧＲＰおよびイントロン特異
性転写（図１参照）の分布は、１．１％（ｗ／ｖ）アガ
ロースゲルで電気泳動にかけ、続いてバイオデイン（Ｂ
ｉｏｄｙｎｅ）膜に移して分離を含むＲＮＡブロッティ
ングにより研究した（テイラー・ジェイ・ビー等、１９
８４、バイオケム・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｊ．）２１９，２２３−２３１）。別の実験では、Ｂｇ
ｌII／Ｐｓｔ１３２ｐ−ラベルカルシトニン特異性ｃＤ
ＮＡ断片（Ｓｐ．Ａｃ．３．２×１０8 cpm ／μｇ）、
ＢｇｌII／ＰｓｔＩ ＣＧＲＰ特異性ｃＤＮＡ断片（Ｓ
ｐ．Ａｃ．７．９×１０8 cpm ／μｇ）およびＢｇｌII
／ＢｇｌII“イントロン”特異性ｃＤＮＡ断片（Ｓｐ．
Ａｃ．２．８×１０8 cpm ／μｇ）を使ってこの膜をプ
ローブした−図１参照。フィルターを洗ってから、オー
トラジオグラフィにかけた。この結果はＲＩＡデータと
一致し、カルシトニンとＣＧＲＰ ｍＲＮＡ種がセルラ
インと腫瘍中各種レベルで発現されかつカルシトニンと
ＣＧＲＰ ｍＲＮＡは多分各種プロセッシング経路によ
り通常の写しからプロセッシングされたことを立証した
（図１０）。また、イントロン特異性配列は成熟したプ
ロセスカルシトニン又はＣＧＲＰ ｍＲＮＡ種に存在し
なかった。
キシダーゼ法（スタンバーガー・エル・エイ、１９７
９、免疫細胞化学（Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ）第２版、ジェイ・ワイリイ＆サン、Ｎ．Ｙ．）
による免疫染色を使って、ヒト髄質甲状腺癌組織を包埋
したパラフィンワックス中ライトレベルで免疫細胞化学
法によりヒトＣＧＲＰ産生細胞をおき、ヒト腫瘍病理学
の分類上これらの抗体の診断上の応用を立証した。全ポ
リ（Ａ）含有ＲＮＡを２つの異なる髄質甲状腺癌腫とＤ
ＭＳ５３と１５３セルラインから単離した（アリスン
等、（１９８１）バイオケム・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．Ｊ．）１９９，７２５−７３１およびホール等、
１９７９、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２７７，５４−
５６）。カルシトニン、ＣＧＲＰおよびイントロン特異
性転写（図１参照）の分布は、１．１％（ｗ／ｖ）アガ
ロースゲルで電気泳動にかけ、続いてバイオデイン（Ｂ
ｉｏｄｙｎｅ）膜に移して分離を含むＲＮＡブロッティ
ングにより研究した（テイラー・ジェイ・ビー等、１９
８４、バイオケム・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｊ．）２１９，２２３−２３１）。別の実験では、Ｂｇ
ｌII／Ｐｓｔ１３２ｐ−ラベルカルシトニン特異性ｃＤ
ＮＡ断片（Ｓｐ．Ａｃ．３．２×１０8 cpm ／μｇ）、
ＢｇｌII／ＰｓｔＩ ＣＧＲＰ特異性ｃＤＮＡ断片（Ｓ
ｐ．Ａｃ．７．９×１０8 cpm ／μｇ）およびＢｇｌII
／ＢｇｌII“イントロン”特異性ｃＤＮＡ断片（Ｓｐ．
Ａｃ．２．８×１０8 cpm ／μｇ）を使ってこの膜をプ
ローブした−図１参照。フィルターを洗ってから、オー
トラジオグラフィにかけた。この結果はＲＩＡデータと
一致し、カルシトニンとＣＧＲＰ ｍＲＮＡ種がセルラ
インと腫瘍中各種レベルで発現されかつカルシトニンと
ＣＧＲＰ ｍＲＮＡは多分各種プロセッシング経路によ
り通常の写しからプロセッシングされたことを立証した
（図１０）。また、イントロン特異性配列は成熟したプ
ロセスカルシトニン又はＣＧＲＰ ｍＲＮＡ種に存在し
なかった。
【００５４】正常の胎盤ＤＮＡおよび患者のＭＴＣ組織
ＤＮＡと血液リンパ球ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼ
で消化した後（図１１）、ヒトＣＧＲＰ遺伝子配列のゲ
ノム生物体の研究も遺伝子構成（ｇｅｎｅ ｏｒｇａｎ
ｉｓａｔｉｏｎ）の差を生んだ。したがって、各ＤＮＡ
試料２０μｇをＢａｍＨＩで制限し、断片を１％（ｗ／
ｖ）アガロースゲルで電気泳動して大きさ別に分け、遺
伝子スクリーンプラス膜（ＮＥＮ）にブロットし、つい
で１０8 cpm ／μｇの比活性にラベルしたＢｇｌ II／
ＰｓｔＩ ＣＧＲＰ特異性ｃＤＮＡプローブを使ってプ
ローブした。ハイブリッド化は５０mmトリス−ＨＣｌ
pH７．５中５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、１％（ｗ／
ｖ）ＳＤＳ、１０％（ｗ／ｖ）デキストランサルフェー
ト中一晩行なった。フィルターは順次２×ＳＳＣ／ＲＴ
Ｐ、２×ＳＳＣ、１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、６５℃／３０
分、および０．１×ＳＳＣ、６５℃／１５分で洗い、つ
いで４８時間オートラジオグラフにかけた。これはすべ
てのＤＮＡ試料においてハイブリッドの単一主バンド
（２．８Kb）とマイナーバンド（２．６Kb）を証明した
（図１１）が、胎盤ＤＮＡでは付加マイナーバンド
（３．０Kb）であった。したがって、ＣＧＲＰ特異性ｃ
ＤＮＡプローブを使って、本発明者は遺伝子再配列を確
認した。この場合遺伝子は相同であるとは反対に、プロ
ーブとの相同を示す。このような知見は腫瘍組織の遺伝
子再配列の研究において配列特異性プローブの診断上の
価値を示すものである。この場合、髄質甲状腺癌の一族
に特有な形の結合制限酵素多形性を研究するためにＣＧ
ＲＰ遺伝子プローブを使用する可能性を示すものであ
る。
ＤＮＡと血液リンパ球ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼ
で消化した後（図１１）、ヒトＣＧＲＰ遺伝子配列のゲ
ノム生物体の研究も遺伝子構成（ｇｅｎｅ ｏｒｇａｎ
ｉｓａｔｉｏｎ）の差を生んだ。したがって、各ＤＮＡ
試料２０μｇをＢａｍＨＩで制限し、断片を１％（ｗ／
ｖ）アガロースゲルで電気泳動して大きさ別に分け、遺
伝子スクリーンプラス膜（ＮＥＮ）にブロットし、つい
で１０8 cpm ／μｇの比活性にラベルしたＢｇｌ II／
ＰｓｔＩ ＣＧＲＰ特異性ｃＤＮＡプローブを使ってプ
ローブした。ハイブリッド化は５０mmトリス−ＨＣｌ
pH７．５中５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、１％（ｗ／
ｖ）ＳＤＳ、１０％（ｗ／ｖ）デキストランサルフェー
ト中一晩行なった。フィルターは順次２×ＳＳＣ／ＲＴ
Ｐ、２×ＳＳＣ、１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、６５℃／３０
分、および０．１×ＳＳＣ、６５℃／１５分で洗い、つ
いで４８時間オートラジオグラフにかけた。これはすべ
てのＤＮＡ試料においてハイブリッドの単一主バンド
（２．８Kb）とマイナーバンド（２．６Kb）を証明した
（図１１）が、胎盤ＤＮＡでは付加マイナーバンド
（３．０Kb）であった。したがって、ＣＧＲＰ特異性ｃ
ＤＮＡプローブを使って、本発明者は遺伝子再配列を確
認した。この場合遺伝子は相同であるとは反対に、プロ
ーブとの相同を示す。このような知見は腫瘍組織の遺伝
子再配列の研究において配列特異性プローブの診断上の
価値を示すものである。この場合、髄質甲状腺癌の一族
に特有な形の結合制限酵素多形性を研究するためにＣＧ
ＲＰ遺伝子プローブを使用する可能性を示すものであ
る。
【００５５】概 要 分子レベルでヒトカルシトニン遺伝子発現に関する本発
明、および合成ヒトＣＧＲＰの心血管活性の研究はモデ
ル系としてラットカルシトニン遺伝子を使う他人による
研究を確認しかつ拡げるものである（アマラ・エス・ジ
ー、ジョナス・ヴィー、ローゼンフェルド・エム・ジ
ー、オング・イー・エス＆エバンス・アール・エム（１
９８２）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２９８，２４
０−２４４）（ローゼンフェルド・エム・ジー、マーモ
ッド・ジェイ・ジェイ、アマラ・エス・ジー、スワンソ
ン・エル・ダブリュー、ソウチエンコ・ピー・イー、リ
ビエール・ジェイ、ベール・ダブリュー・ダブリュ＆エ
バンス・アール・エム（１９８３）ネイチャー（Ｎａｔ
ｕｒｅ），３０４，１２９−１３５）（フィッシャー・
エル・エイ、キツカワ・ディー・オー、リビエール・ジ
ェイ・イー、アマラ・エス・ジー、エバンス・アール・
エム、ローゼンフェルド・エム・ジー、ベール・ダブリ
ュー・ダブリュー＆ブラウン・エム・アール（１９８
３）ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３０５，５３４−５
３６）。本発明者はヒト甲状腺および肺癌におけるＣＧ
ＲＰ ｍＲＮＡ配列とカルシトニンを同定した。
明、および合成ヒトＣＧＲＰの心血管活性の研究はモデ
ル系としてラットカルシトニン遺伝子を使う他人による
研究を確認しかつ拡げるものである（アマラ・エス・ジ
ー、ジョナス・ヴィー、ローゼンフェルド・エム・ジ
ー、オング・イー・エス＆エバンス・アール・エム（１
９８２）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２９８，２４
０−２４４）（ローゼンフェルド・エム・ジー、マーモ
ッド・ジェイ・ジェイ、アマラ・エス・ジー、スワンソ
ン・エル・ダブリュー、ソウチエンコ・ピー・イー、リ
ビエール・ジェイ、ベール・ダブリュー・ダブリュ＆エ
バンス・アール・エム（１９８３）ネイチャー（Ｎａｔ
ｕｒｅ），３０４，１２９−１３５）（フィッシャー・
エル・エイ、キツカワ・ディー・オー、リビエール・ジ
ェイ・イー、アマラ・エス・ジー、エバンス・アール・
エム、ローゼンフェルド・エム・ジー、ベール・ダブリ
ュー・ダブリュー＆ブラウン・エム・アール（１９８
３）ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３０５，５３４−５
３６）。本発明者はヒト甲状腺および肺癌におけるＣＧ
ＲＰ ｍＲＮＡ配列とカルシトニンを同定した。
【００５６】その知見はヒトＣＧＲＰ又はその断片、肺
癌セルラインおよび髄質甲状腺癌組織と血漿のＣＧＲＰ
に対する抗体を使って同定された。したがって、血漿Ｃ
ＧＲＰレベルの測定、現場でのハイブリッド又は免疫細
胞化学技術を使う歴史的組織試験、又はＤＮＡやＲＮＡ
ブロッティングを使う遺伝子構造および発現の試験は髄
質甲状腺癌の管理上有用なものである（ヒル・シー・エ
ス、イバネツ・エム・エル、サマーン・エヌ・エイ、ア
ハーン・エム・ジェイ＆クラーク・アール・エル（１９
７３）、メディシン（Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、５２，１４
１−１７１）、また肺癌や異常なカルシトニン遺伝子発
現と関係があることが分っている病気、例えば骨粗鬆症
の管理上も有用である。
癌セルラインおよび髄質甲状腺癌組織と血漿のＣＧＲＰ
に対する抗体を使って同定された。したがって、血漿Ｃ
ＧＲＰレベルの測定、現場でのハイブリッド又は免疫細
胞化学技術を使う歴史的組織試験、又はＤＮＡやＲＮＡ
ブロッティングを使う遺伝子構造および発現の試験は髄
質甲状腺癌の管理上有用なものである（ヒル・シー・エ
ス、イバネツ・エム・エル、サマーン・エヌ・エイ、ア
ハーン・エム・ジェイ＆クラーク・アール・エル（１９
７３）、メディシン（Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、５２，１４
１−１７１）、また肺癌や異常なカルシトニン遺伝子発
現と関係があることが分っている病気、例えば骨粗鬆症
の管理上も有用である。
【００５７】アミド化ヒトＣＧＲＰペプチドＰＤＡ−４
が心血管系に作用を有し、心臓収縮速度や力の増大をお
こし、かつ血圧低下効果を有するという本発明の知見は
高血圧の臨床管理においてこのペプチドの役割を示唆し
ている。ＣＧＲＰの末梢作用はカテコールアミンβ−リ
セプターおよびヒスタミンリセプターに依存しないこと
を本発明は立証している。ペプチドによる低血圧感応の
急速な開始からみて、ＣＧＲＰが他のメディエーターに
依存しない新しいリセプター機構を通じて心血管系に直
接作用しうるという見解と本発明の効果は一致する。
が心血管系に作用を有し、心臓収縮速度や力の増大をお
こし、かつ血圧低下効果を有するという本発明の知見は
高血圧の臨床管理においてこのペプチドの役割を示唆し
ている。ＣＧＲＰの末梢作用はカテコールアミンβ−リ
セプターおよびヒスタミンリセプターに依存しないこと
を本発明は立証している。ペプチドによる低血圧感応の
急速な開始からみて、ＣＧＲＰが他のメディエーターに
依存しない新しいリセプター機構を通じて心血管系に直
接作用しうるという見解と本発明の効果は一致する。
【図１】組換えプラスミドｐｈＴＢ３、ｐｈＴＢ６およ
びｐｈＴＢ５８にてクローンした重複ｃＤＮＡ配列の概
略図である。
びｐｈＴＢ５８にてクローンした重複ｃＤＮＡ配列の概
略図である。
【図２】組換えプラスミドｐｈＴＢ３、ｐｈＴＢ６およ
びｐｈＴＢ５８から誘導した完全なヌクレオチド配列で
ある。
びｐｈＴＢ５８から誘導した完全なヌクレオチド配列で
ある。
【図３】プラスミドｐＣＴ２０１、ｐＣＴ２０２、ｐＣ
Ｔ２０３およびｐＣＡＴ−ＣＧＲＰの構造の概略図であ
る。
Ｔ２０３およびｐＣＡＴ−ＣＧＲＰの構造の概略図であ
る。
【図４】ベクターｐＣＡＴ−ＣＧＲＰで形質転換した大
腸菌ＨＢ１０１の抽出物におけるクロラムフェニコール
アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）とヒトＣＧＲＰ
の融合タン白質の存在を示すポリアクリルアミドゲルで
ある。
腸菌ＨＢ１０１の抽出物におけるクロラムフェニコール
アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）とヒトＣＧＲＰ
の融合タン白質の存在を示すポリアクリルアミドゲルで
ある。
【図５】ｐＣＡＴ−ＣＧＲＰで形質転換した大腸菌ＨＢ
−１０１のタン白質抽出物におけるヒトＣＧＲＰ抗原性
決定子の存在を示すラジオイムノアッセイの結果を証明
するグラフである。
−１０１のタン白質抽出物におけるヒトＣＧＲＰ抗原性
決定子の存在を示すラジオイムノアッセイの結果を証明
するグラフである。
【図６】ラットにおける心搏度数および平均動脈圧の薬
物感応曲線を示す（●＝食塩水、○＝ヒトＣＧＲＰ、△
＝ラットＣＧＲＰ、□＝ヒトＣＧＲＰ＋プロプラノロー
ル、■＝ヒトＣＧＲＰ＋メピラミン＋シメチジン）。
物感応曲線を示す（●＝食塩水、○＝ヒトＣＧＲＰ、△
＝ラットＣＧＲＰ、□＝ヒトＣＧＲＰ＋プロプラノロー
ル、■＝ヒトＣＧＲＰ＋メピラミン＋シメチジン）。
【図７】ラットに静脈注射したＰＤＡ−４（およびヒト
ＣＧＲＰ）の心搏度数と平均動脈圧に及ぼす影響を証明
するタコグラフトレースである。
ＣＧＲＰ）の心搏度数と平均動脈圧に及ぼす影響を証明
するタコグラフトレースである。
【図８】モルモットの心搏度数と力の薬物感応曲線を示
す。
す。
【図９】髄質甲状腺癌組織、髄質甲状腺癌腫患者の血漿
の抽出液におけるヒトＣＧＲＰの存在および肺癌セルラ
インによるＣＧＲＰの産生を示すラジオイムノアッセイ
結果を証明するグラフである。
の抽出液におけるヒトＣＧＲＰの存在および肺癌セルラ
インによるＣＧＲＰの産生を示すラジオイムノアッセイ
結果を証明するグラフである。
【図１０】髄質甲状腺癌腫および肺癌腫セルラインにお
けるカルシトニンとヒトＣＧＲＰＲＮＡの各種発現を証
明するＲＮＡブロットを示す。
けるカルシトニンとヒトＣＧＲＰＲＮＡの各種発現を証
明するＲＮＡブロットを示す。
【図１１】ヒト胎盤組織のＤＮＡを髄質甲状腺癌腫組織
又は単一患者のリンパ球のＤＮＡを比較した時、ヒトＣ
ＧＲＰ遺伝子と相同遺伝子の各種生物体を証明するＤＮ
Ａブロットを示す。
又は単一患者のリンパ球のＤＮＡを比較した時、ヒトＣ
ＧＲＰ遺伝子と相同遺伝子の各種生物体を証明するＤＮ
Ａブロットを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｎ 9284−4Ｃ Ｃ０７Ｋ 5/10 8318−4Ｈ 7/06 Ｚ 8318−4Ｈ 7/08 7537−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 1/21 7236−4Ｂ 15/16 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 7823−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｐ 7055−2Ｊ 33/531 8310−2Ｊ 33/58 7055−2Ｊ // Ａ６１Ｋ 37/30 8314−4Ｃ Ｃ０７Ｋ 7/36 7306−4Ｈ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ０７Ｋ 99:46 (72)発明者 エドブルツク，マーク ロバート イギリス国ダブリユ１ピー ７ピーエヌ, ロンドン，モーテイマー ストリート（番 地なし）ミドルセツクス ホスピタル メ デイカル スクール，ザ コートウルド インスチチユート オブ バイオケミスト リイ内
Claims (25)
- 【請求項１】 ヒトカルシトニン遺伝子関連ペプチド。
- 【請求項２】 構造： 【化１】 を有する請求項１記載のペプチド。
- 【請求項３】 少くとも下記の如きアミノ酸配列： 【化２】 （式中、Ｒ′は−Ｈ又はアミノ酸残基である）又は生体
内あるいは試験管内でアミドに転換可能なペプチドを有
する請求項１記載のペプチド。 - 【請求項４】 Ｒ′は−Ｇｌｙである、請求項３記載の
ペプチド。 - 【請求項５】 構造（Ｉ）を有するペプチドの製造法に
おいて、請求項３記載のペプチドである中間ペプチドを
コードする遺伝子を含むベクターで形質転換させた宿主
生物体を培養して、中間ペプチドを得、ついでＲ′をア
ミドに転換させることを特徴とする、上記方法。 - 【請求項６】 中間ペプチドは、形質転換された宿主生
物体にて高レベルで産生された少なくとも一部のタン白
質および請求項３記載のペプチドを含む融合タン白質で
あり、この融合タン白質を分解して、請求項３記載のペ
プチドを得る、請求項５記載の方法。 - 【請求項７】 少なくとも下記のアミノ酸配列： 【化３】 を含む中間ペプチドをコードする遺伝子を含むベクター
で形質転換した宿主真核生物体を培養して、中間ペプチ
ドを得、この中間ペプチドを宿主生物体によりプロセッ
シングし、ついでペプチドを単離することを特徴とす
る、請求項５記載の上記方法。 - 【請求項８】 形質転換された宿主生物体にて産生しう
る少なくとも一部のタン白質および請求項３記載のペプ
チドを有し、このタン白質とペプチドは化学的又は酵素
的選択分解しうる結合により連結されている、融合タン
白質。 - 【請求項９】 結合は−Ｍｅｔ−、−Ｇｌｕ−および−
Ｌｙｓ−Ａｒｇ−から選択される、請求項８記載の融合
タン白質。 - 【請求項１０】 次のアミノ酸配列： 【化４】 を有するテトラペプチド。
- 【請求項１１】 請求項１０記載のテトラペプチドおよ
び医薬的に許容しうる賦形剤を含む、医薬組成物。 - 【請求項１２】 請求項１、２、３、８及び１０のいず
れか１項に記載のペプチドをコードする遺伝子。 - 【請求項１３】 i) アミノ酸１〜３７、 ii) アミノ酸−３〜−７、 iii) アミノ酸＋６〜＋９又は iv) アミノ酸−７〜＋９ をコードする、図２の低部に記載の遺伝子である請求項
１２の遺伝子。 - 【請求項１４】 請求項１２又は１３記載の遺伝子を含
むベクター。 - 【請求項１５】 請求項１４のベクターで形質転換され
た宿主生物体。 - 【請求項１６】 抗原性決定子を含む構造（Ｉ）のペプ
チド又はその部分であり、そのペプチド又はその部分は
それらに付着した検出可能なラベルを有する、上記ペプ
チド。 - 【請求項１７】 抗原性決定子を有する構造（Ｉ）のペ
プチド又はその部分であり、ペプチド又はその部分は１
２５I で任意にラベルされたチロシンアミノ酸残基を含
む、請求項１６のペプチド。 - 【請求項１８】 １２５I でＴｙｒを任意にラベルし
た、構造： 【化５】 を有する、請求項１６記載のペプチド。 - 【請求項１９】 １２５I でＴｙｒを任意にラベルし
た、構造： 【化６】 を有する、請求項１６記載のペプチド。 - 【請求項２０】 １２５I でチロシンを任意にラベルし
た、チロシン化ＰＤＡ−４である請求項１６記載のペプ
チド。 - 【請求項２１】 構造（Ｉ）のペプチドの抗原性決定子
に特異性を有する抗体。 - 【請求項２２】 配列（IV）のペプチドの抗原性決定子
に特異性を有する抗体。 - 【請求項２３】 図２に示した１〜１２５６のヌクレオ
チド配列から選んだ１５以上のヌクレオチド配列を有す
るＤＮＡハイブリッドプローブ。 - 【請求項２４】 図２に示した１〜７２５のヌクレオチ
ド配列から選んだ配列を有する、請求項２３記載のＤＮ
Ａハイブリッドプローブ。 - 【請求項２５】 図２に示した７２６〜１２５６のヌク
レオチド配列から選んだ配列を有する、請求項２３記載
のＤＮＡハイブリッドプローブ。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB838316296A GB8316296D0 (en) | 1983-06-15 | 1983-06-15 | Peptides |
| GB8316296 | 1983-06-15 | ||
| GB838329093A GB8329093D0 (en) | 1983-11-01 | 1983-11-01 | Peptides |
| GB8329093 | 1983-11-01 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59502557A Division JPS60501562A (ja) | 1983-06-15 | 1984-06-15 | ヒトカルシトニン関連ペプチドおよび医薬組成物 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8262196A Division JPH09183798A (ja) | 1983-06-15 | 1996-10-02 | ヒトカルシトニン関連ペプチド |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0687890A true JPH0687890A (ja) | 1994-03-29 |
| JPH0759597B2 JPH0759597B2 (ja) | 1995-06-28 |
Family
ID=26286369
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5005267A Expired - Lifetime JPH0759597B2 (ja) | 1983-06-15 | 1993-01-14 | ヒトカルシトニン関連ペプチド |
| JP8262196A Pending JPH09183798A (ja) | 1983-06-15 | 1996-10-02 | ヒトカルシトニン関連ペプチド |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8262196A Pending JPH09183798A (ja) | 1983-06-15 | 1996-10-02 | ヒトカルシトニン関連ペプチド |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5374618A (ja) |
| EP (1) | EP0134631B1 (ja) |
| JP (2) | JPH0759597B2 (ja) |
| AU (1) | AU570600B2 (ja) |
| DE (2) | DE134631T1 (ja) |
| DK (1) | DK167814B1 (ja) |
| WO (1) | WO1985000043A1 (ja) |
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| US9855332B2 (en) | 2011-05-20 | 2018-01-02 | Alderbio Holdings Llc | Use of anti-CGRP antibodies and antibody fragments to treat diarrhea in subjects with diseases or treatments that result in elevated CGRP levels |
| US10266587B2 (en) | 2011-05-20 | 2019-04-23 | Alderbio Holdings Llc | Use of anti-CGRP antibodies and antibody fragments to prevent or inhibit photophobia or light aversion in subjects in need thereof, especially migraine sufferers |
| US11639380B2 (en) | 2019-01-08 | 2023-05-02 | H. Lundbeck A/S | Acute treatment and rapid treatment of headache using anti-CGRP antibodies |
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| CH657858A5 (de) * | 1983-06-27 | 1986-09-30 | Ciba Geigy Ag | Substanz aus der gruppe der calcitonine. |
| US6319685B1 (en) | 1984-09-27 | 2001-11-20 | Unigene Laboratories, Inc. | Alpha-amidating enzyme compositions and processes for their production and use |
| ATE78040T1 (de) * | 1985-01-16 | 1992-07-15 | Ciba Geigy Ag | Oligopeptide sowie zwischenprodukte und verfahren zu ihrer herstellung. |
| GB8523156D0 (en) * | 1985-09-19 | 1985-10-23 | Celltech Ltd | Polypeptide production |
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| JP2535398B2 (ja) * | 1989-01-17 | 1996-09-18 | サントリー株式会社 | アミド化ペプチドの製造方法 |
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| WO1993011787A1 (en) * | 1991-12-12 | 1993-06-24 | Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha | Blood pressure regulator |
| US5331684A (en) * | 1993-02-17 | 1994-07-26 | Itt Corporation | Helmet mounting for night vision assembly |
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