JPH02291268A - ヒトリンホトキシンｎ末端欠失変異体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、遺伝子操作の手法を用いてＮ末端特定領域を
人為的に欠失させたヒトリンホトキシンＮ末端欠失変異
体、及び、該リンホトキシンＮ末端欠失変異体合成遺伝
子に関するものである。

Ｎ末端特定領域を欠失させることにより、天然のものよ
り強力な抗腫瘍を有するヒトリンホトキシンを大量に得
ることが可能になり、新規抗腫瘍剤としての利用が期待
できる。

従来の技術 ヒトリンホトキシン（以下、ｒＨＬＪとする。）及びこ
れをコードするｃＤＮＡは公知であり、第１図に示すア
ミノ酸配列及びｅＤＮＡ配列が報告されている（Ｎａｔ
ｕｒｅ，　ｖｏｌ．３１２，　ｐｐ．７２１−７２４，
（Ｉ９８４））　．この、天然のＨＬｍＲＮＡに対する
ＣＤＮＡ配列は、ヌクレオチドの部分配列の変換を可能
とする制限酵素切断部位をもたず、アミノ酸の改変等の
蛋白質工学の利用にそのまま用いることには不便な点が
あった。この点を克服するため、本発明者らは、コード
されるＨＬのアミノ酸配列が変わることなく、該ｃ　Ｄ
　Ｎ　Ａが、（Ｉ）制限酵素ＢｓｓＨＩ　，　ＥｃｏＲ
Ｉ　，　Ｋｐｎｌ　、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｘｈｏｌ　，　
Ｓａｃｌ　，　Ｓｍａｌ　、Ｈｐａｌ　　及びＢａｍＨ
　Ｉ　　の認識部位を、それぞれ１箇所だけ有する。

（２）コドンの変更により、１００ヌクレオチド鎖長を
１つのブロックとして、その中に存在するダイレクトリ
ピートが消去されている。

（３）連続したいずれの３０ヌクレオチドをとっても、
この中の６塩基対を超えるパリンドローム配列が消去さ
れている。

という特徴を有するように、ヌクレオチド配列を改変し
た。さらに、この遺伝子を大腸菌中で発現させ，抗腫瘍
活性を有するＨＬを得た（第１０回、日本分子生物学会
年会、プログラム・講演要旨集、１０４頁、（Ｉ９８７
）、特願昭　６２−２８７０３５号）。

また、遺伝子操作の手法を用いて、ヒト腫瘍壊死因子、
ＨＬ等のＮ末端欠失変異体を得ることが試みられ、Ｎ末
端側のアミノ酸を人為的に欠損させることにより、全ア
ミノ酸を有する完全な組換え体に比べて高い比活性を示
すＮ末端欠失変異体が得られることが報告されている（
Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．４７，　ｐｐ．１４
５−１４９，　（Ｉ９８７），生化学，第５９巻，第８
号，９３０頁，　（Ｉ９８７）等）。

特に、ＨＬに関しては、Ｎ末端から、１９個、２２個、
２４個及び２６個のアミノ酸を欠失したＮ末端欠失変異
体が得られ、これらは、全アミノ酸を有する完全な５Ｌ
とほぼ同等又はやや高い比活性を示すことが見出された
（上記生化学，第５９巻，第８号，９３０頁，　（Ｉ９
８７））。

発明が解決する課題 本発明者らは、上記（第１０回、日本分子生物学会年会
、プログラム・講演要旨集、１０４頁、（Ｉ９８７）、
特願昭　６２−２８７０３５号）に記載のｃＤＮＡを用
いて、より高い比活性を示すＨＬ−Ｎ末端欠失変異体を
得る研究を進めてきた。その結果、Ｎ末端から２７個の
アミノ酸を欠失したＮ末端欠失変異体を得て、該変異体
が、Ｎ末端側のアミノ酸を欠失させたＨＬとしては最も
高い比活性を示すことを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は、遺伝子操作の手法を用いてＮ末端
特定領域を人為的に欠失させたＨＬ−Ｎ末端欠失変異体
、並びに、その間効物，突然変異体、変異体及びその前
駆体に関する。

さらに詳しくは、次の一般式（Ｉ）で示されるＨＬ−Ｎ
末端欠失変異体： （Ｎ）　−Ｒ−ＬｙｓＰｒｏＡｌａＡｌａＨｉｓＬｅｕ
ＩｌｅＧｌｙＡｓｐＰｒｏＳｅｒＬｙｓＧｌｎＡｓｎＳ
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ｒＶａ　ｌＰｈｅＰｈｅＧｌｙＡ　ｌａＰｈｅＡ　ｌａ
Ｌｅｕ−（Ｃ） （式中、Ｎ及びＣは、アミノ末端及びカルボキシ末端を
それぞれ表わし、Ｒは、メチオニン、Ｎ一ホルミルメチ
オニン、リーダー配列、又は、水素原子を表わす。）、
並びに、その間効物、突然変異体、変異体及びその前駆
体に関する。

また、本発明は、次の配列を有する、ＨＬ−Ｎ末端欠失
変異体をコードするヌクレオチド配列：Ｍｅｔ　　Ｌｙ
ｓ　　Ｐｒｏ　　Ａｌａ　　Ａｌａ　　Ｈｉｓ　　Ｌｅ
ｕ　　Ｉｌｅ　　ＧｌｙＣＧＡＴ　ＡＴＧ　ＡＡＡ　Ｃ
ＣＴ　ＧＣＡ　ＧＣＴ　ＣＡＣ　ＣＴＣ　ＡＴＴ　ＧＧ
ＣＴＡ　ＴＡＣ　ＴＴＴ　ＧＧＡ　ＣＧＴ　ＣＧＡ　Ｇ
ＴＧ　ＧＡＧ　ＴＡＡ　ＣＣＧＡｓｐ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ
　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　
ＴｒｐＧＡＴ　ＣＣＧ　ＴＣＴ　ＡＡＧ　ＣＡＧ　ＡＡ
Ｔ　ＴＣＡ　ＣＴＡ　ＣＴＧ　ＴＧＧＣＴＡ　ＧＧＣ　
ＡＧＡ　ＴＴＣ　ＧＴＣ　ＴＴＡ　ＡＧＴ　ＧＡＴ　Ｇ
ＡＣ　ＡＣＣＡｒｇ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ａ．ｓ
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Ｇ　ＡＡＧ　ＡＧＧ　ＡＡＣ　ＡＧＧ７ｏ Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　ＧｌｙＣＴ
Ｇ　ＧＴＡ　ＣＣＧ　ＡＣＣ　ＡＧＴ　ＧＧＣＧＡＣ　
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ｎ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ ＡＡＣ　ＡＡＣ　ＴＣＴ　ＴＴＧ ＴＴＧ　ＴＴＧ　ＡＧＡ　ＡＡ．Ｃ Ｉ１ｅ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ ＡＴＣ　ＴＡＧ　ＴＴＣ　ＧＴＧ ＴＡＧ　ＡＴＧ　ＡＡＧ　ＣＡＣ Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｓ
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Ｇ　ＧＴＧ　ＧＴＴ　ＴＴＴ　ＡＧＣ　ＧＧＧ　ＡＡＡ
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ＣＴＣ　ＣＴＧＴＣＧ　ＧＴＴ　ＡＴＡ　ＧＧＣ　ＡＡ
Ｇ　ＧＴＧ　ＣＡＣ　ＧＧＴ　ＧＡＧ　ＧＡＣＧｌｎ　
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Ｇ　ＡＧＴ　ＡＣＴ　ＧＴＣ　ＴＴＣＧＴＧ　ＧＡＴ　
ＣＡＧ　ＧＡＧ　ＴＣＧ　ＧＧＣ　ＴＣＡ　ＴＧＡ　Ｃ
ＡＧ　ＡＡＧＰｈｅ　　Ｇｌｙ　　Ａｌａ　　Ｐｈｅ　
　Ａｌａ　　Ｌｅｕ　　＊＊＊　　木＊本ＴＴＴ　ＧＧ
Ａ　ＧＣＣ　ＴＴＣ　ＧＣＴ　ＣＴＧ　ＴＡＧ　ＴＧＡ
　ＧＡＡＡ　ＣＣＴ　ＣＧＧ　ＡＡＧ　ＣＧＡ　ＧＡＣ
　ＡＴＣ　ＡＣＴ　ＣＡＧ　ＣＴ及び、天然Ｉ−｛　Ｌ
の２７部位のロイシンをコードしない、該ヌクレオチド
配列の突然変異体、変異体、及び、該コードされてぃる
ＨＬ−Ｎ末端欠失変異体の少なくともＮ一末端領域をコ
ードするすべてのヌクレオチド断片、並びに、それぞれ
の相補配列に関するものである。

本発明のＨＬ−Ｎ末端欠失変異体は、天然ＨＬの２７個
のＮ末端アミノ酸残基を欠失しているが、さらに，好適
な方法により置換または変換することも可能である。

例えば、本発明のＨＬ−Ｎ末端欠失変異体は、遊離のア
ミノ末端を有していてもよく、この部位は好適に置換さ
れていてもよい。既に記載したように、２７残基を欠失
したＨＬ−Ｎ末端欠失変異体く以下、「Δ２７Ｎ」とす
る。）は、２６残基を欠失したＨ　Ｌ　−　Ｎ末端変異
体（以下、「Δ２６Ｎ」とする。）を含む、他のいかな
るＮ末端欠失ＨＬ変異体より高い活性を有する。従って
、Ｎ末端をロイシン又は置換ロイシン（天然ＨＬの残基
２７）で置換したものは好ましくなく，この残基を有す
るペプチド及びこの残基をコードするヌクレオチド配列
は、特に本発明から除外される。

好適なＮ末端の置換の例としては、メチオニン、Ｎ−ホ
ルミルメチオニン、リーダー配列、又は、投与前、投与
時、もしくは、投与後の好適な時に切断されて遊離の分
子を生じるか、又は、切断はされないが活性に影響を与
えないような、例えばエステルのような基等が挙げられ
る。

一般に、いかなるＮ末端の置換も、体内の標的部位に到
達する前、到達時、または到達後に切断されるか分解さ
れるものを選択するのがさらに好ましい。そのような置
換は、体内の環境において（ｐＨ条件／イオン強度等の
変化により）自然に分解または切断されるであろうし、
または、例えば、リン酸基を切断する脱リン酸化酵素の
ような酵素の作用により、切断されるであろう。

リーダー配列のような置換は、一般にＨＬを得るのに用
いられる発現系において副産物となる。

その様な置換は、一般には発現系において、もしくは投
与時に、切断されるか、または、ＨＬの生理活性に影響
を与えずに保持されるが、多くの場合はペプチドの発現
に有用である。本発明においてリーダー配列が用いられ
る場合には、天然に生じるリーダー配列（上記、Ｎａｔ
ｕｒｅ）を用いることが好ましいが、いかなる好適な配
列も用いられうる。

なお、本発明においてペプチドとは、ベプチド結合で結
合している２個以上のアミノ酸から成るすべての分子を
意味し、この術語には、オリゴペプチド、ポリペプチド
及び蛋白質が含有される。

本発明のＨＬ−Ｎ末端欠失変異体の基礎をなす完全なＨ
Ｌ分子は、すべての好適な分子を含むが、先行の参考文
献のいずれかにおいてＨＬとして記載されている抗腫瘍
活性を有する。さらに特異的には、本発明のＨＬ−Ｎ末
端欠失変異体は、図１または図２の、２８以降のアミノ
酸残基の配列と相同性を有するものである。

カルボキシ末端の１６個のアミノ酸を欠失すると不活性
なＨＬが生じることが見出されている（上記、Ｎａｔｕ
ｒｅ）。そういった場合は、不活性なＨＬに、図１また
は図２に示された配列と物質的に類似の配列（特に最後
の１６残基）を供与することが好ましい。活性に影響が
なければ、この数は決定的なものではなく、目的に応じ
て、残基は同効物によっても置換されうる。末端のロイ
シン残基は、活性にとって重要であり、保持することが
好ましい。

一般に、いかなる蛋白質であっても、その活性はある保
存領域に依存し、他方で、他の領域は、その保存領域に
関してほとんど重要性を持たない。

従って、本発明は、その配列が依然として物質的にＨＬ
活性を示す、すべての変異体または突然変異体を含有す
る。そのような変異体及び突然変異体は、例えば、欠失
、挿入、置換を含むものである。一般に、変化が小さい
場合には、もしもその変化が分子の必須部分におけるも
のでなければ、活性にほとんど影響を与えず、目的に応
じて、例えば、それをコードする遺伝子上に新たな制限
酵素断片部位（以下、「制限部位」とする。）を生じる
ような、遺伝子操作に関する二次的な効果をもたらす。

コードされたアミノ酸配列は、ＨＬ活性に影響を及ぼさ
ないかぎり、目的に応じていかなる態様においても修復
され得る。点突然変異及び他の変化は、制限部位を付加
または除去すること、遺伝子操作または発現に他の効果
をもたらすこと、ＨＬ分子に他の有用性を授けるように
ように修復すること等に有効である。

本発明におけるＨＬ−Ｎ末端欠失変異体のＣ末端は、活
性に必須である場合を除いて、本発明の中核を構成して
いない。目的に応じて、カルボキシル基は、置換または
修復されうる。その置換は、例えば、塩やエステルの形
成や、他の好適な置換を含有する。修復は、活性に影響
を与えないかぎり、部分的であるかどうかを問わず、一
つまたはそれ以上のＣ末端のアミノ酸残基の欠損を含む
。

特に、末端のロイシンは活性に必須であり、欠失または
その他の変化は、末端のロイシン以外の残基にて行われ
るのが好ましい。末端のカルボキシル基の除去は、例え
ば好ましくない反応より防御するのに有用であり、さら
に好適な保護基で置換することによりこの目的は達成さ
れうる。修復は、一つまたはそれ以上の残基を他の好適
な残基と置換することを含む。

ＨＬ分子への置換又は修復は、暫定的または永久的なも
のである。例えば、Ｃ末端がエステル化されたＨＬは、
ｉｎ　ｖｉｖｏにおいて、標的器官への到達前または到
達時に脱エステル化されうる。

本発明のＨＬは、活性に影響のない範囲で、糖が付加さ
れうる。

糖の付加は、真核細胞の系、特に晴乳動物の系を用いる
か、または、産物を好適な酵素系で処理することにより
によって好適に行われうる。

分子の選択的な置換は、一般的には容易ではない。例え
ば、Ｃ末端のカルボキシル基だけを修復するためには、
同じ処理で修復を受けそうな他のすべての基を保護する
必要があろう。選択的な置換は、発現系の好適な選択、
及び／又は、コードするアミノ酸配列の好適な修復によ
って達成されうる。

以上、本発明のＨＬ−Ｎ末端欠失変異体の置換及び変換
について記載したが、これらの変化は、すべて、ＨＬ活
性に影晋のない範囲で行われる。

本発明の好適なＨＬ−Ｎ末端欠失変異体は次の式で表わ
され： （Ｎ）　−Ｒ−ＬｙｓＰｒｏＡ１ａＡｌａＨｉｓＬｅｕ
ＩｌｅＧ１ｙＡｓｐＰｒｏＳｅｒＬｙｓＧｌｎＡｓｎＳ
ｅｒＬｅｕＬｅｕＴｒｐＡｒｇＡｌａＡｓｎＴｈｒＡｓ
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　）ＨｉｓＧｌｕＶａｌＧ１ｎＬｅｕＰｈｅＳｅｒＳｅ
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ＨｉｓＬｅｕＶａｌＬｅｕＳｅｒＰｒｏＳｅｒＴｈｒＶ
ａｌＰｈｅＰｈｅＧｌｙＡｌａＰｈｅＡｌａＬｅｕ−（
Ｃ） （式中、Ｎ及びＣは、アミノ末端及びカルボキシ末端を
それぞれ表わし、Ｒは、メチオニン、Ｎ一ホルミルメチ
オニン、リーダー配列、又は、水素原子を表わす。）、
並びに、その間効物、突然変異体、変異体及び前駆体を
含有する。

ここで、同効物とは、活性に影響がない範囲で、Ｃ末端
、Ｎ末端または他の場所における、塩、エステル、糖等
が付加された配列を含む該ＨＬ−Ｎ末端欠失変異体をい
う。

突然変異体とは、活性に影響がない範囲でアミノ酸が置
換、挿入、欠損した該ＨＬ−Ｎ末端欠失変異体をいう。

変異体とは、自然集団に生じうる天然のＨＬで、かつ活
性に必須な保存領域のアミノ酸配列が図１。

に示された配列と共有部分を有するＨＬの、Ｎ末端より
図１の２６部位に相当するロイシンまでを欠失した変異
体のうち、ＨＬ活性を有するものをいう。この定義には
、相同遺伝子由来の変異体も含まれる。

前駆体とは、活性に影響を与えるかまたは与えないが、
ＨＬが活性を有するときには存在せず、その効果は標的
部位に到達する前又は到達時に打ち消される、リーダー
配列又は置換基等をいう。

本発明のヌクレオチド配列は、本発明のＩ｛　Ｌ　−Ｎ
末端欠失変異体の全部または部分をコードするヌクレオ
チド配列である。ヌクレオチド配列がＨＬ−Ｎ欠失変異
体の部分のみをコードする場合は、この部分は少なくと
もＨＬ−Ｎ末端欠失変異体のＮ一末端部分を含有するも
のであるが、天然に存在するＨＬの２７部位のロイシン
残基は含有しない。この配列については特に限定はなく
、また、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。本発
明のＨ　Ｌ　−　Ｎ末端欠失変異体をコードする遺伝子
は、ここで開示される情報を元に、図１および図２に示
される配列より、周知の技術を用いて容易に逆構築され
うる。

図２に示される配列は、天然に生じるペプチド配列をコ
ードしているので、好適な配列である。

ハイブリダイゼーションは、配列の相同性の指標として
は最適ではないが、図２の配列の５０％以上の相同性、
好ましくは８０％以上の相同性を有する配列が、好適に
用いられる。

それぞれの場合において、ヌクレオチド配列は、ＨＬ−
Ｎ末端変異体の配列，少なくとも、そのＮ−末端部分を
コードしているものである。

完全なＨＬ−Ｎ末端欠失変異体をコードするものより短
い配列も、他のペプチドのＮ末端部を修復するか、ＨＬ
をコードするプラスミドの修復の為に用いられうる。い
ずれの場合も、結果としてのペプチドは，本発明のＮ末
端を有する。

本発明のヌクレオチド配列は、目的に応じて他の制限部
位を供するように改変されうる。この場合は、コードさ
れているＨＬのアミノ酸配列を変えないか、または、目
的に応じてアミノ酸配列を変えたとしても、ＨＬの活性
に影響を与えないように改変されうる。

本発明のヌクレオチド配列は，好適にはＤＮＡの配列で
ある。このような配列は、例えばプローブとして単独で
も用いられるが、一般的には発現系の一部を形成するの
が好ましい。

好適な発現ベクターは、ファージ又はプラスミドである
が、コスミド、レトロウイルス、又は他のベヒクルも用
いられる。さらに、発現に必須又は有用である、プロモ
ーター、オペレーター、インドゥーサー、ターミネータ
ー等のコントロール配列が、使用されるベクターに組み
込まれて用いられる。用いられるベクターは、目的に応
じて好適な態様に改変されうる。

好適な二本鎖のヌクレオチド配列は、以下に示され、： Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ａｌａ．Ａｌａ　Ｈｉｓ　Ｌ
ｅｕ　Ｉｌｅ　ＧｌｙＣＧＡＴ　ＡＴＧ　ＡＡＡ　ＣＣ
Ｔ　ＧＣＡ　ＧＣＴ　ＣＡＣ　ＣＴＣ　ＡＴＴ　ＧＧＣ
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ｒ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　ＬｅｕＴＡＣ　ＡＧＣ　ＣＣＧ　
ＡＡＧ　ＧＣＣ　ＡＣＣ　ＴＣＴ　ＴＣＣ　ＣＣＧ　Ｃ
ＴＧＡＴＧ　ＴＣＧ　ＧＧＣ　ＴＴＣ　ＣＧＧ　ＴＧＧ
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ｅ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ
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ＣＣ　ＡＡＣ　ＡＡＣ　ＴＣＴ　ＴＴＧＣＴＡ　ＣＣＧ
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ＣＴＧ　ＧＣＧ　ＣＡＴ　ＧＡＧ　ＧＴＣ　ＣＡＡ　Ｃ
ＴＧ　ＴＴＣ　ＴＣＧＡＴＡ　ＧＡＣ　ＣＧＣ　ＧＴＡ
　ＣＴＣ　ＣＡＧ　ＧＴＴ　ＧＡＣ　ＡＡＧ　ＡＧＣＬ
ｅｕ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｉｌ
ｅ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　ＶａｌＣＴＧ　ＧＴＡ　ＣＣＧ　
ＡＣＣ　ＡＧＴ　ＧＧＣ　ＡＴＣ　ＴＡＣ　ＴＴＣ　Ｇ
ＴＧＧＡＣ　ＣＡＴ　ＧＧＣ　ＴＧＧ　ＴＣＡ　ＣＣＧ
　ＴＡＧ　ＡＴＧ　ＡＡＧ　ＣＡＣＳｅｒ　Ｇｉｎ　Ｔ
ｙｒ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｈｉｓ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｌｅ
ｕ　ＬｅｕＡＧＣ　ＣＡＡ　ＴＡＴ　ＣＣＧ　ＴＴＣ　
ＣＡＣ　ＧＴＧ　ＣＣＡ　ＣＴＣ　ＣＴＧＴＣＧ　ＧＴ
Ｔ　ＡＴＡ　ＧＧＣ　ＡＡＧ　ＧＴＧ　ＣＡＣ　ＧＧＴ
　ＧＡＧ　ＧＡＣＴｙｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｖａｌ　Ｖ
ａｌ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　ＡｌａＴＡＣ
　ＴＣＴ　ＣＡＧ　ＧＴＧ　ＧＴＴ　ＴＴＴ　ＡＧＣ　
ＧＧＧ　ＡＡＡ　ＧＣＴＡＴＧ　ＡＧＡ　ＧＴＣ　ＣＡ
Ｃ　ＣＡＡ　ＡＡＡ　ＴＣＧ　ＣＣＣ　ＴＴＴ　ＣＧＡ
Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　Ｍｅｔ　Ｖａｌ　Ｔ
ｙｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　ＬｅｕＡＧＣ　ＴＣＣ　ＣＡＧ
　ＡＡＧ　ＡＴＧ　ＧＴＴ　ＴＡＣ　ＣＣＣ　ＧＧＧ　
ＣＴＴＴＣＧ　ＡＧＧ　ＧＴＣ　ＴＴＣ　ＴＡＣ　ＣＡ
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ｙｒ　ＨｉｓＣＡＡ　ＧＡＡ　ＣＣＧ　ＴＧＧ　ＣＴＧ
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ＴＧＡ　ＧＡＡＡ　ＣＣＴ　ＣＧＧ　ＡＡＧ　ＣＧＡ　
ＧＡＣ　ＡＴＣ　ＡＣＴ　ＣＡＧ　ＣＴＧｌｙ　Ａｌａ
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Ｇｌｙ　ＡｓｐＧＧＧ　ＧＣＧ　ＧＣＧ　ＴＴＴ　ＣＡ
Ｇ　ＴＴＡ　ＡＣＣ　ＣＡＡ　ＧＧＴ　ＧＡＣＣＣＣ　
ＣＧＣ　ＣＧＣ　ＡＡＡ　ＧＴＣ　ＡＡＴ　ＴＧＧ　Ｇ
ＴＴ　ＣＣＡ　ＣＴＧＧｌｎ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ
　Ｈｉｓ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　ＰｒｏＣ
ＡＡ　ＣＴＡ　ＴＣＴ　ＡＣＴ　ＣＡＣ　ＡＣＡ　ＧＡ
Ｃ　ＧＧＧ　ＡＴＣ　ＣＣＧＧＴＴ　ＧＡＴ　ＡＧＡ　
ＴＧＡ　ＧＴＧ　ＴＧＴ　ＣＴＧ　ＣＣＣ　ＴＡＧ　Ｇ
ＧＣＨｉｓ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ
　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　ＰｈｅＣＡＣ　ＣＴＡ　Ｇ
ＴＣ　ＣＴＣ　ＡＧＣ　ＣＣＧ　ＡＧＴ　ＡＣＴ　ＧＴ
Ｃ　ＴＴＣＧＴＧ　ＧＡＴ　ＣＡＧ　ＧＡＧ　ＴＣＧ　
ＧＧＣ　ＴＣＡ　ＴＧＡ　ＣＡＧ　ＡＡＧ及び、天然Ｈ
Ｌの２７部位のロイシンをコードしない、該ヌクレオチ
ド配列の突然変異体、変異体、、及び、該コードされて
いるＨＬ−Ｎ末端欠失変異体の少なくともＮ一末端領域
をコードするすべてのヌクレオチド断片、並びに、それ
ぞれの相補配列が含まれる。

ここで、突然変異体又は変異体とは、ペプチドの突然変
異体又は変異体をコードするすべてのヌクレオチド配列
、及び、ペプチドのアミノ酸配列に影響を与えずに配列
の変化したものを意味する。

本発明のＨＬ−Ｎ末端欠失変異体合成遺伝子及びＮ末端
欠失変異体は、以下に記載する方法で製造することがで
きる。

一般には、本発明のペプチド及びヌクレオチド配列を産
生ずるためには幾つかの方法がある。簡単な方法として
は、図２に示されたヌクレオチド配列を合成し，それを
好適な発現プラスミドに挿入し、好適な宿主を形質転換
し、細胞に破砕、遠心等を行い、本発明のＨＬ−Ｎ末端
欠失変異体を得ることである。図２における「Ｕ」及び
「Ｌ」の表示は、完全なコード配列を作成するために好
適なオリゴヌクレオチドの分割を示している。

逆に、制限酵素を用いて、ρＴＬｙｍよりＰｓｔ　Ｉ　
−Ｓａｌ　Ｉ断片、または、Ｐｓｔ　Ｉ　−　ＥｃｏＲ
Ｉ断片を得て、アミノ酸を欠失させる形でコードするよ
うに、５′一末端に好適なオリゴヌクレオチドをライゲ
ーションすることもできる。

すなわち、ＨＬ合成遺伝子を含有するプラスミドｐＴＬ
ｙｍ　　（第１０回、日本分子生物学会年会、プログラ
ム・講演要旨集、１０４頁、（Ｉ９８力、特願昭　６２
−２８７０３５号）を制限酵素　ＣｌａＩ　　及びＳａ
ｌｌ　　で切断し、二つの断片を回収する。この二つの
断片のうち、ＨＬｆｉ伝子を含む短い方の断片をさらに
制限酵素Ｐｓｔ　Ｉで切断し、Ｎ末端からＰｓｔ　Ｉ部
位（第２図参照）まで欠失したＰｓｔｌ−ＳａｌＩ断片
を回収する。

次に、目的のＮ末端領域のアミノ酸を欠失し、残りのア
ミノ酸をコードし、かつ５′末端にＣｌａ１　部位を有
するようなＨＬ−Ｎ末端欠失変異体合成遺伝子を作成す
るために、３′末端にＰｓｔ　Ｉ部位、５′末端にＣｌ
ａ　Ｉ部位を有するようにあらかじめ設計したオリゴヌ
クレオチド、及び、該オリゴヌクレオチドに相補的なオ
リゴヌクレオチドを混合し、アニーリングする。このも
のを上記記載したＰｓｔ　Ｉ　−Ｓａｌ　Ｉ　　断片と
混和させて、目的のＮ末端領域を欠失したＨＬをコード
する遺伝子を含んだ、Ｃｌａ　Ｉ　−Ｓａｌ　Ｉ　　断
片を得ることができる。

制限酵素Ｓａｌ　Ｉで処理した後に、この断片の５′末
端をポリスクレオチドキナーゼを用いてリン酸化し、こ
れとは別にｐＴＬｙｍをＣｌａＩ　　及びＳａｌｌ　　
で切断して得られる長い方の断片とライゲーションを行
なうことにより、ＨＬ−Ｎ末端欠失変異体合成遺伝子を
含有するプラスミドを作成することができる。目的の遺
伝子が挿入されていることは、プラスミドのヌクレオチ
ド配列を調べることにより確認できる。

また逆に，上記Ｐｓｔ　Ｉ　−　Ｓａｌ　Ｉ断片に図４
に示す０２７Ｎ断片をアニールし、このものを上記の長
い方のＣｌａ　Ｉ　−　Ｓａｌ　Ｉ断片にアニールして
、リガーゼとポリメラーゼを用いてプラスミドの構築を
完成させることもできる。

ｐＴＬｙｍをＨＬ遺伝子の原料として用いられた場合、
ＡｍｐＲにおけるＰｓｔ　Ｉ部位を消去することにより
操作行程を減らすことも可能である。この場合には、合
成オリゴヌクレオチドとライゲーションする前に、Ｐｓ
ｔ　Ｉと他の好適な酵素で切断すればよい． 本発明のＭＬをコードしているヌクレオチド断片は、目
的に応じて、いかなる好適なベクターへも挿入しつる。

理想的にはそのベクターは，挿入を容易にするためにＣ
ｌａ　Ｉ部位とＳａｌ　Ｉ部位を有していることが好ま
しいが、そうでない場合でも、プラントエンド・エンド
ライゲーション法による挿入が可能である。この方法に
おいては、形質転換体の発現を試験するべきである。

得られたプラスミドを用いて大腸菌を形質転換し、アン
ピシリンにより形質転換体を選択し、インドールアクリ
ル酸等のトリプトファンプロモーターの誘導剤を添加す
ることにより、目的のＨ　Ｌ−Ｎ末端欠失変異体を発現
させることができる。

発現の程度は、菌体をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電
気泳動法（Ｎａｔｕｒｅ，　ｖｏｌ．２２７，　ｐｐ．
６８０−６８５，（Ｉ９７０））で泳動することにより
解析できる。

他のベクターを用いた時は、その選択マーカーに依存し
た選択方法が用いられうる。

さらに、この形質変換体を培養した後に集菌し、超音波
処理により菌体を破砕し、遠心操作を行なう。その遠心
上清の抗腫瘍活性を測定し、同時に、該遠心上清のＨＬ
−Ｎ末端欠失変異体の含量をＳＤＳポリアクリルアミド
ゲル電気泳動法で測定することにより、目的のＨＬ−Ｎ
末端欠失変異体の比活性を算出することができる。

また、この遠心上清について通常用いられる蛋白精製操
作を行ない、ＨＬ−Ｎ末端欠失変異体を得ることができ
る。

本発明のＨＬ−Ｎ末端欠失変異体は、天然のＨＬと同一
の生物学的活性を有しており、ヒトをはじめとする晴乳
動物に投与することにより、極めて有効な抗腫瘍効果を
示す。

本発明のＨＬ−Ｎ末端欠失変異体を投与するための方法
は、非経口投与（例えば、静注、筋注、皮下注又は腹腔
内注）であり、投与される組成物には、治療上有効量の
生成物が、薬理上許容される希釈剤、担体及び／又はア
ジュバントとともに通常含有されている。

ヒト血清アルブミンのような標準的希釈剤が本発明の医
薬組成物として考えられ、生理的食塩水のような標準的
担体が同様に考えられる。

投与形態としては、皮下注射、静脈内注射、筋肉注射、
座刑などの非経口投与法、または、錠剤、カプセル剤、
散剤、顆粒剤などによる経口投与法が挙げられる。投与
量は、投与経路または投与回数などによって異なるが、
例えば成人に対しては、通常は一日１　−　１，０００
μｇ／Ｋｇ体重を一日に一回又は数回に分けて投与する
のが好ましい。

以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが
、これらは本発明の範囲を制限するものではない。

実施例 本発明では、ＨＬのＮ末端側よりそれぞれ、２６個、２
７個、２８個のアミノ酸を欠失した変異体（以下それぞ
れ、Δ２６Ｎ、Δ２７Ｎ、Δ２８Ｎとする。）をコード
する遺伝子を含有するプラスミド（以下そ九ぞれ、ｐＴ
ＬｙｍΔ２６Ｎ、ｐＴＬｙｍΔ２　７　Ｎ，　ｐＴＬｙ
ｍ△２８Ｎとする。）を構築した。構築の手順は、第３
図に示すフローチャートにしたがった。以下にｐＴＬｙ
ｍ△２６Ｎの構築方法について記載する。

ｐＴＬｙｍプラスミド（第１０回、日本分子生物学会年
会、プログラム・講演要旨集、１０４頁、（Ｉ９８７）
、特願昭　６２−２８７０３５号）をＣｌａ　Ｉ　　及
びＳａｌ　Ｉ　　で切断して得られる二つの断片を電気
泳動法により回収した。ＨＬ遺伝子を含む短い方の断片
（　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ配列を第２図に示す。）をざらにＰ
ｓｔ　Ｉ　　で切断し、Ｎ末端からＰｓｔ　Ｉ　ｓｉｔ
ｅ　　（第２図参照）までを欠失したＰｓｔ　Ｉ　−Ｓ
ａｌ　Ｉ断片を電気泳動法にて回収した。

第４図に示す、ＵΔ２６Ｎと、５′末端をリン酸化した
　Ｌ△２　６　Ｎを　０，０１　Ａｚｓｏ　　（　７５
−１００ｐ　ｍｏｌ）ずつ混合し、アニーリングを行な
った後、上記のＰｓｔ　１　−Ｓａｌ　Ｉ　　断片を０
．５　ｐ　ｍｏｌ加え、さらにＴ４ＤＮＡリガーゼを３
５０単位加えて、１５℃で１２時間、ライゲーション反
応を行なった。

熱処理をし、エタノール沈澱を行なった後、Ｓａｉｌ　
　を２５単位加え、３７℃で１２時間切断反応を行ない
、さらに、このものについて５％ゲルを用いたポリアク
リルアミドゲル電気泳動を行ない、単離、精製の後にΔ
２６ＮをコードするＣｌａｌ−Ｓａｌ　Ｉ　　断片を得
た。

この断片０．３　ｐ　ｍｏｌにポリヌクレオチドキナー
ゼを１０単位加え、３７℃で１時間反応を行ない、５′
末端をリン酸化した。この反応液と、先にｐＴＬｙｍを
Ｃｌａ　Ｉ　　及びＳａｌＩ　　で切断して得られた長
い方の断片（Ｃｌａ　Ｉ　−Ｓａｌ　ｌベクター）０．
１ｐ　ｍｏｌを混合し、ＤＮＡリガーゼ３５０単位を加
え、２０℃で１２時間ライゲーション反応を行なった。

この反応液を用いて、通常の方法にしたがって大腸菌Ｈ
Ｂ１０１株を形質転換し、得られた形質転換体から目的
とするプラスミドｐＴＬｙｍΔ２６Ｎを回収した。目的
とする遺伝子が挿入されていることは、ＤＮＡの塩基配
列を決定することにより確認した。

ｐＴＬｙｍ△２　７　Ｎ，　ｐＴＬｙｍΔ２８Ｎについ
ても、それぞれ第４図に示す、Ｕ△２７ＮとＬ△２７Ｎ
、ＵΔ２８ＮとＬ△２８Ｎを用いて同様に構築した。

（２）各種Ｎ末端欠失変異体の発現 ｐＴＬｙｍΔ２　６　Ｎ，　ｐＴＬｙｍΔ２７Ｎ及びｐ
ＴＬｙｍΔ２８Ｎで形質転換させた大腸菌ＨＢ１０１株
を、４０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬ　Ｂ培地５
　ｍｌ中で培養した。培養条件は、３７℃で８〜１０時
間とした。このうち５０μ１を、０．２％　（ｗ／ｖ）
カザミノ酸及び４０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＭ９
培地５　ｍｌに植え継ぎ、３７℃で１０〜１６時間培養
した。このうち２　ｍｌを上記のカザミノ酸及びアンピ
シリンを含むＭ９培地Ｚｏｏ　ｍｌに加え３７℃で培養
し、■。５時間後にインドールアクリル酸（以下ＩＡＡ
とする。）を終濃度４０μｇ／ｍｌになるように加えて
トリプトファンプロモーターを誘導した。さらに２４時
間培養を続けたのち集菌し、この菌体をＳＤＳ含有サン
プルバッファ−　（Ｓａｍｐｌｅ　Ｂｕｆｆｅｒ）で充
分煮沸し、１５％のポリアクリルアミドのゲルに供与し
てＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を行なった。

△２６Ｎ及びΔ２７Ｎ１こついての結果を第５図に示す
。Ｎ末端領域を欠失した場合の分子量より算定した結果
より、ＩＡＡで誘導されたバンド（図中の矢印：１はＮ
末端を欠失していない組換え体、５はΔ２６Ｎ、６は△
２７Ｎを示し、１６Ｋは分子量を示す。）がそれぞれの
、Ｎ末端を欠失していない組換え体又はＮ末端欠失体を
示す。

（３）粗抽出液の調製 培養後集菌した大腸菌を、２０ｍｌの３０ｍＭＮａＣ１
を含む、２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８．０）
で洗浄し、破砕緩衝液（２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ
（ｐＨ８．０），　３０　ｎｉＭ　ＮａＣ１，１　ｍＭ
　ＥＤＴＡ，　５　ｍＭ　β−メルカプトエタノール）
に懸濁した。超音波処理を１分間隔で１２回行ない、菌
体を破砕した。１５，０００　ｒｐｍで１時間遠心し、
その上清を粗抽出液として回収した。

（４）粗抽出液中のＩ｛Ｌ−Ｎ末端欠失変換体の定ｊ１ 上記の粗抽出液を１５％ゲルを用いてＳＤＳポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動法で泳動した。Ｎ末端を欠失して
いない組換え体、Δ２６Ｎ及び△２７Ｎについての結果
を第６図に示す。（図中の矢印＝１はＮ末端を欠失して
いない組換え体、４は△２６Ｎ、５はΔ２７Ｎを示し、
１６Ｋは分子量を示す。） 次に、ＨＬ一末端欠失変異体のバンドの濃度をＤｕａｌ
−ｗａｖｅ　ｌｅｎｇｔｈ　ＴＬＣ　ｓｃａｎｎｅｒ　
ＣＳ−９００　（島津製作所社製）で測定し，粗抽出液
中の各ＨＬ−Ｎ末端欠失変異体の相対比を算出した。こ
の値は、Ｎ末端を欠失していない組換え体が約２．逐で
あったのに対して、Δ２６Ｎは約　６．８％、Δ２７Ｎ
は約６．５％、Δ２８Ｎは約７．６％であった。

また、同時に、ウサギにＮ末端を欠失していないＨＬ組
換体を免疫して血清より調製した抗ＨＬ抗体を用いて、
上、記粗抽出液中の、該抗体と反応する抗原の検出を行
った。実施例（２）で記載した大腸菌ＨＢ１０ｉ／ｐＴ
Ｌｙｎ＋形質転換体の粗抽出液中には多量の抗原が見出
されたが、コントロールとしてのｐＢＲ３２２．を含有
する大腸菌の粗抽出液中には、全く見出されなかった。

（５）ＨＬ−Ｎ末端欠失変異体の部分精製Δ２７Ｎにつ
いて部分精製を行なった。

ｐＴＬｙｍΔ２７Ｎ形質転換させた大腸菌ＨＢＩＯ１株
を、０．２％（Ｗ／Ｖ）カザミノ酸及び４０　ｐｇ／ｍ
ｌアンピシリンを含むＭ９培地５１で２４時間培養した
。培養後集菌した菌体を、実施例（３）記載の破砕緩衝
液に懸濁した。この懸濁液を超音波処理して上滑を得て
、このものに、４℃で３０分間、終濃度が１％になるよ
うにストレプトマイシンを加えた。その後３０分間放置
し、このものを７．０００　ｒｐｍで２０分間遠心して
沈澱を除くことにより、除核酸処理を行なった。

この上清に、水冷下で３０分間、終濃度が６０ｘになる
ように硫酸アンモニウｌ１を加えた。水冷下で３０分間
放置後、７，０００　ｒｐｍで２０分間遠心して沈澱を
回収した。

この沈澱を３０　ｍｌのＱ緩衝液（２０　ｍＭ　Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣＩ　（ＰＨ８．５）　）に溶解し、次いでＱ緩
衝液に対して充分透析を行なった。透析後、この試料を
Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ　　（フ
ァルマシア社製）カラム（φ２．４　ｘ　１３．５　ｃ
ｍ）に供与した．ＯＭ〜２Ｍの食塩勾配（Ｑ緩衝液：　
３００　０１１　Ｘ　３００　ｍｌ）をかけて溶出し、
流速は１ｍ１７分とした。

各両分のＨＬ活性を測定し、Δ２７Ｎが約０．１κの食
塩濃度付近の両分に溶出されていることを確認した。

次にこの両分に、水冷下で３０分間、終濃度が６０ｘに
なるように硫酸アンモニウムを加えた。水冷下で３０分
間放置後、１５，０００　ｒｐｍで２０分間遠心し、沈
澱を得た。この沈澱をＧＭ衝液（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−
ＨＣＩ（ｐＨ８．０），　０．Ｉ　Ｍ　ＮａＣｌ）　１
０　ｍｌに溶解し、さらにＧ緩衝液に対して充分透析を
行なった。

透析後、試料をＳｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−７５　　（ファ
ルマシア社製）カラム（φ２．２　ｘ　８７　ａｍ）に
供与し、ゲル濾過を行なった。各両分について実施例（
２）で記載したＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動
を行ない、△２７Ｎが１４５〜１７２　ｍｌ　（Ｋｄ＝
０．２６１）の両分に溶出されていることを確認した。

最終標品として約１４　ｍｇ、純度９囲のΔ２７Ｎが得
られた。

発明の効果 試験例 （Ｉ）抗腫瘍活性の測定 Ｂ．Ｂ，Ａｇｇａｒｗａｌらの方法（Ｊ．Ｂｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．，　　ｖｏｌ．２６０，　Ｎｏ．４，　ｐｐ．２
，３４５−２，３５４）に基づいて行なった。

実施例（３）で記載した、各ＨＬの粗抽出液を０．１ｍ
ｇから１０−６ｍｇまで段階希釈し、９６　ｗｅｌｌマ
イクロプレートに分注した。これに０．１　ｍｌのＬ−
９２９細胞（３　ｘ　１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）と、１
　μｇ／ｍｌのアクチノマイシンＤを加え、５％　ｃ０
２存在下、１８時間培養した。上清を廃棄した後、９６
　ｗｅｌ１マイクロプレートを生理食塩水（　　０．９
％　（Ｗ／Ｖ）のＮａＣ１）で２回洗浄した後、０．５
％　（Ｗ／いのクリスタルバイオレット（メタノール：
水　Ｉ：４）を１００μ１ずつ分注し、２０分間放置し
た。

クリスタルバイオレット液を廃棄した後、生理食塩水で
３回ミクロプレートを洗浄し、次いで１％　（Ｗ／Ｖ）
　（７）　Ｓ　Ｄ　Ｓ水溶液を２００μ１加え３０分間
放置した。

放置した後、この液を５９０　ｎｍで吸光度を測定し、
これより活性を測定した。なお、対照の５０％の吸光度
を示すＨＬ活性を１ユニットと定義した。

同時に、各粗抽出液中の全蛋白量を通常の方法で測定し
た。

粗抽出液中の全蛋白量当たりの活性を算出し、さらに、
実施例（４）の結果より、各ＨＬの比活性を求めた。こ
の結果を表１に示す。

Δ２７Ｎは、Ｎ末端を欠失していない組換え体に比べて
、１３．５倍の比活性を有していた。

表１ 粗抽出液中の全 蛋白質の活性 （ｌニット／ｍｇ蛋白） 比活性 （ユニット／ｍｇ蛋白） 完全体本 ６．Ｏ　ｘ　１０５ ２．８　Ｘ　１０７ Δ２６Ｎ １．９　Ｘ　１０７ ２．８　Ｘ　　１０８ Δ２７Ｎ ２．５　Ｘ　１０７ ３．８　Ｘ　１０８ Δ２８Ｎ 検出できず 本完全体は、Ｎ末端を欠失していない組換え体を表す。

【図面の簡単な説明】

第１図は、公知のＨＬｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示
し、第２図は、本発明に用いた、Ｎ末端を欠失していな
い組換え体をコードする遺伝子ヌクレオチド配列を示す
。 第３図は、ＨＬ−Ｎ末端欠失変異体をコードする遺伝子
を含有する、ブラスミド構築のフローチャートを示す。 第４図は、該プラスミド構築に用いた合成オリゴヌクレ
オチドを示す。 第６図は、ＨＬの、末端を欠失していない組換え体、及
び、Ｎ末端欠失変異体を発現する大腸菌の、ＳＤＳポリ
アクリルアミド電気泳動における泳動パターンを示す。 第６図は、上記各大腸菌の粗抽出液の、ＳＤＳポリアク
リルアミド電気泳動における泳動パターンを示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次の一般式（ I ）で示されるアミノ酸配列を有す
   るヒトリンホトキシンＮ末端欠失変異体：【アミノ酸配
   列があります】（ I ） （式中、Ｎ及びＣは、アミノ末端及びカルボキシ末端を
   それぞれ表わし、Ｒは、メチオニン、Ｎ−ホルミルメチ
   オニン、リーダー配列、又は、水素原子を表わす。）、
   並びに、その同効物、突然変異体、変異体及び前駆体。 ２、次の配列を有する、ヒトリンホトキシンＮ末端欠失
   変異体をコードするヌクレオチド配列：【遺伝子配列が
   あります】 及び、天然ヒトリンホトキシンの２７部位のロイシンを
   コードしない、該ヌクレオチド配列の突然変異体、変異
   体、及び、該コードされているＮ末端欠失変異体の少な
   くともＮ−末端領域をコードするすべてのヌクレオチド
   断片、並びに、それぞれの相補配列。