JPS62501470A - 腫瘍壊死因子の精製、製造および使用法 - Google Patents

腫瘍壊死因子の精製、製造および使用法

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 腫瘍壊死因子の精製方法並びに腫瘍壊死因子様化合物および腫瘍壊死因子をコー ドする組換D N A分子の裳造方法 発明の技術的分野 本発明は、腫瘍壊死因子(TNF)をコードする組換DNA分子並びに形質転換 細胞に対する向上した細胞毒性もしくは細胞静止)舌性を有する化合物に関する ものである。さらに詳細には本発明は、腫瘍壊死因子様のポリペプチドを高収率 で原核宿主内で産生ずる方法に関するものである。特に、本発明はTNFN王様 ペプチドの産生に関し、発現制御配列T4もしくはpL−T4のいずれかに結合 したこれらポリペプチドをコー ドするDNA配列からなる組換DNA分子によ って形質転換された原核宿主により産生され、さらに本発明はこれらTNFN王 様ペプチドを特徴とする処置方法および組成物に関するものである。これらの方 法および薬剤は、各種の抗腫瘍、抗癌および抗マラリャの用途および治療に有用 である。さらに、これらは、たとえばIFN−α、IFN−βおよびIFN−γ などのインクツユロンと組合せ、化学治療と組合せ、さらにたとえばアクチノマ イシンDのような抗生物質と組合せて、これら抗癌および抗I!ffi瘍治療に 有用である。
技術的背景 TNFは大食m胞および単核食細胞によって産生される。
これはインビトロにおける広範囲の動物およびヒト癌細胞に対し細胞毒性もしく は細胞静止活性を示し、かつインビボにおける成る種の動物腫瘍および異種移植 ヒト腫瘍にて溶血壊死を誘発する(K、ハラナカおよびN、サトミ、「インビト ロにおけるヒト癌細胞に対する腫瘍壊死因子(TNF)の細胞毒性活性」、ジャ パン・ジャーナル・エキスベリメンタル・メソッド、第51巻、第191〜19 4頁(1981);I6.オールド、[カンサー・イミュノロジー:特異性の検 討−G、 H,A、クロウス・メモリアル・L−クチャ−11、カンナ・−・リ サーチ、?@41巻、第361〜375頁(1981))。
TNF活性を示す化合物は、バチルスー力ルメーヂーゲうン(BCG)もしくは コリネバクテリウムが感染しかっ大■)菌のリポ多糖1i(LPS)で処理され たネズミおよびウサギの血ンπからj算られている(E、A。カルスウェルの壊 死を生ずるエンドトキシン誘発される血清因子」、プロシーディング・ナショナ ル・アカデミ−・サイエンス・[J S /’l 。
第72巻、第3666−3670頁(1975))。さらに、これらはBCGを 接種したネズミの大食細胞リッチな腹腔滲出細胞の培養培坤からも得られており 、さらにインビトロにて大食mtlζ増殖因子を発生させかっLPSで刺戟1, た予備処理ネズミの大食細胞様の腫瘍細胞(PU5−1.8)および腹腔大食細 胞からも得られ”ている〔D、マネル、R.ムーアおよびS.メルゲンハーゲン 、「殺腫瘍活性(let瘍壊死因子〕の源泉とし2ての大食細胞,1、インフェ クション・イミュノロジー、第30巻、第5 2 3−5 3 0頁(1 9  8 0) )。
さらに、大食細胞の先駆体であるヒト単核細胞をたとえばIJi庚なヒト供与体 の血液から分離してリンホキンおよび/またばLPSで刺戟すると、これら単核 細胞はネズミの標的細胞およびLl・形質転換細胞に対し細胞毒性もしくは細胞 静止作用を有する化学物質を産生する〔N、マチユース、「ヒト単核細胞による 抗腫瘍細胞毒素の産生:エンド1キシンとインクツユロンと誘発剤としての他の 薬剤との比較」、プリティッシュ・ジャーナル・カンサー、第45巻、第615 −617頁(1982);J・ハンマストローム、[ヒト単核細胞から遊離され る可溶性の細胞静止因子=1,産生並びに正常および形質転換されたヒト標的細 胞に対する作用」、スカンジナビア・ジャーナル・イミュノロジー、第15巻、 第311−318頁(1.982))、したがって、TNFは単核細胞由来の細 胞によって産生されるので(適当な処理の15i)、この物質はしばしば「単核 細胞サイトトキシン」と呼ばれる(D.S.ストン−ウルツ等、「ヒトγーイン クフェロンとリンホトキシンおよびヒトサイトトキシンとの相互関係」、ジャー ナル・エキスベリメンタル・メソッズ、第159巻、第820−843頁(19 84))。
正常なヒトの血清から得られるα,ーα2グロブリンのフラクションも、ネズミ における腫瘍に対し毒性でありがつインビトロにおけるヒト結腸癌、黒色腫およ び神経芽細胞腫の細胞ラインの増殖を阻止することが示されている〔米国特許第 4.309.418号;S。グリーン等、「カンサー・レタース」、第6巻、第 235−第240頁(1979);ジャーナル・セル・バイオロジー、第79巻 、第67頁(1978))。
しかしながら、現在、動物およびヒトのTNFは極めて少量しか生産されていな い。動物TNFの生産方法は、予備処理した多数のネズミもしくはウサギを殺し てその血清を精製することによりTNFを回収するか、或いはその大食細胞を集 め、インビトロで細胞を刺戟し、産生し,たTNFを上澄液から回収しかつ精製 することがらなっている。ヒト供与体から細胞を回収してインビトロで培養して 、TNFを産生させ、かつヒト供与体からの血清のα−グロブリンフラクション を精製して抗腫瘍剤を回収することも大規模には役立たない。
さらに、これらの方法は全て時間がかかり、高1面につきかつ極めて低収量のT NFLか生成しない。
発明の開示 本発明は、抗癌剤および抗lIffi瘍組成物.方法および治療に使用するのに 充分な純度のTNF様化合物およびTNFを工業的に′著量で製造する方法を提 供することにより、上記問題を解決する。したがって、本発明は、抗癌剤および 抗腫瘍剤並びにその方法に使用するため従来得られなかったような量および方法 でTNFまたはTNFN王様ペプチドの製造を可能にする。
本発明の他の目的は、TNF様ポリベグチドをコードするDNA配列の位置決定 および同定、T4およびpL−T4よりなる群から選択される発現制御配列に結 合したこれらDNA配列による各種の宿主の形質転換、並びtL7これら形質転 換宿主におけるTNFもしくはTNFN王様ペプチドの産生を包含する。本発明 により産生されるT N F様ポリペプチドおよびTNFとし2ては、たとえば ウサギ。ネズミおよびヒトTNFのような補乳動物のTNFが挙げられる。
以下の開示から明らかとなるように、本発明の他の目的は天然源からのTNFの 精製である。原T h.I Pが精製された後、そのアミノ酸配列を決定しで、 DNA試料をそのアミノ酸配列に基づき合成することができる.次いで、これら のI)NA試料を各種の天然および合成源からのDNA配列の回収物をスクリー ニングして、TNF関連DNA配列を選択し、次いで本発明の方法によりTNF およびTNF様化合物を発現させることができる。
この精製したTNFも本発明の他の面、づなゎち天然もしくけ組換TNFとたと えばアクチノマイシンDのような抗生物質との組合せ物を使用することによる腫 瘍細胞の増殖阻止もしくは死滅の向上にも有用である。本発明の方法によれば、 腫瘍を有する哺乳動物を医薬上有効9の′TNFとアクチノマイシンDとで処理 して腫瘍細胞に対するTNFの作用を高める。
以下の開示から明らかとなるように、T4またはpL−T4のいずれかの発現制 御配列に結合したD N A配列からなる本発明の組換DNA分子は、適当な宿 主においてTNFもしくはTNFN水様ペプチドの産生を指示することができる 。
適当な宿主におけるこれら組換DNA分子の複製も、これらポリペプチドをコー ドする遺伝子を多量に生産することを可能にする。これらポリペプチドおよび遺 伝子の分子構造および性質をかくして容易に決定することができる。これらポリ ペプチドおよび遺伝子は、適当な宿主で産生されたままで或いは適当に誘導化も しくは改変した後、これら生産物自身の産生を検出しかつ向上させる組成物およ び方法に使用することができ、さらに抗癌、抗腫瘍および抗マラリャ組成物およ び治療方法に使用することができる。
以下の記載から明らかとなるように、本発明の基本的局面は、TNFもしくはT NFN水様ペプチドをコードし或いは少なくともこの種のDNA配列を発現制御 配列に結合されたDNA配列の回収物から選択することを可能にする、DNA配 列からなる組換DNA分子を提供することである。これらDNA配列は、 (al p−mTNF 3のDNA#入物7(b) p−、hTNF−1のDN A挿入物;fcl これらDNA挿入物fa)および(′b)のいずれか一方ま たは両方にハイブリッド化しかつ発現に際しTNFN水様ペプチドをコードよる DNA配列;並び4二 +di 前記DNA挿入物および配列のいずれかにより発現に際しコードされた ポリペプチドを発現に際しコードすイhDNA配列よりなる群から選択される。
本発明によれば、DNA配列ばT4もしくはp L −74発現制御系に作用結 合される。
本発明の&1換DNA分:I−j、、jさfトに、これらで形質転換された適当 な宿主においてTNFもしくはTNFN水様ペプチドを高収量で産生じうろこと を特徴とする。
2種の代表的な蔗糖濃度勾配のOD−経過を示す特性曲線図であり、第1の濃度 勾配においては750pgのヒトポリA“mRNAを充填しかつ第2の濃度勾配 においては200μgのネズミボリA”RNAを充填し、アフリカ産カエル(X enopuslaevis )卵母細胞における各フラクションの生物学的活性 を分析し、 第2図は誘発したウサギ血清からのTNFfiポリペプチドを精製するための本 発明による方法の1具体例に対する工程略図であり、 第3図は本発明の精製方法の1例による誘発ウサギ血清から精製されたウサギT NFの5DS−PAGE (12%)分析を示し、 第4図および第5図は本発明の方法により精製されたウサギTNFの2つの部分 、すなわちTN Fi11片3および4のアミノ酸配列を示し、さらに 第4図および第5図はこれらアミノ酸配列部分をコードする各種のヌクレオチド 配列並びにこれらDNA配列から合成された各種のDNA試料のヌクレオチド配 列を示し、第6図はネズミTNF RNAの一般式構造並びにクローンp−mT NF 1、p −m T N F ” 2 bよびp −m T N F−3の cDNAの位置を示し、さらに第6図はこれら3種のクローンの部分制限マツプ を示し、また第6図は各種のDNA保存物を後にハイブリッド化スクリーニング するために使用したp−mTNF−1の2種の内部Rsalおよびpvu[制限 断片を示し、 第7図はネズミTNF cDNAのヌクレオチド配列およびこれから誘導された アミノ酸配列を示し、第8図はヒI−TNF RNAの一般的構造およびクロー ンp−hTNF−1のcDNAの位置を示し、さらに第8図はこのクローンの部 分制限マツプを示し、第9図はp−hTNF−1のcDNA挿入物のヌクレオチ ド配列およびこれから誘導されたアミノ酸配列を示し、第10図は誘発U−93 7ヒト細胞の培地から得られたTNFN水様ペプチドを精製するための本発明に よる方法の1具体例を示す略図であり、 第1L図は本発明の方法により精製されたヒI−TNF試料のアミノ酸配列決定 で決定されたN−末端アミノ酸配列を示し、 第12図は発現に際しヒトTNFをコードするDNA配列を特徴とする他の組換 発現ベクターの作成方法の他の例を示し略図であり、 第13図はヒトTNFを発現に際しコードするDNA配列を特徴とする組換発現 ベクター153−PL−T4−hTNF−CA3 (13)を示し、 第14図はヒトTNFを発現に際しコードするDNA配列を特徴とする組換発現 ベクター153−T4−4TNF−CA5−T4terを示し、 第15図は(A>プラスミドp236およびpTAK21ΔCK、ゴルスキー等 、セル(1985)(印刷中)〕からの〕プラスミドpL−pTAK−21へ− CLA”の作成;(B)hTNF (G)n誘導体の作成、並びに(C)T4− terおよびΔP L誘導体の作成を示し、第16図はDRAI AATTCE eoRI部位からT4−ter hTNF遺伝子の末端に位置するEcoR1部 位に到るプラスミド15l−T4−hTNF−CA5−T4−terのDNA配 列および誘導アミノ酸配列を示し、第17図はPstI部位からEcoR1部位 に到るプラスミド153 PL T4−CA3−ets−T4−terのDNA 配列および誘導アミノ酸配列を示し、第18〜19図はアクチノマイシンDとT NFとの組合せの1!瘍増殖に対する作用を示すグラフである。
発明の詳細な説明 本発明を充分理解しうるよう以下詳細に説明する。
説明において次の用語を使用する: ヌクレオチド:糖部分(ペントース)とV4酸と窒素含有複素環式塩基とよりな るDNAもしくはRNAのモノマー単位。
この塩基はグリコジル炭素(ペントースの1′炭素)を介して糖部分に結合され る。塩基とahの組合せをヌクレオシドと呼ぶ、各ヌクレオチドはその塩基を特 徴とする。4種のDNA塩基はアデニン(rAJ)、グアニン(r’GJ)、シ トシン(rcJ)およびチミン(rTJ)である、、4種のRNAはA、 G、  Cおよびウラシル(rUJ)である。
の間のホスポジエステル結合により互いに連結されたヌクレオチドの線状配列で ある。
コドン:+nRNAを介しアミノ酸、翻訳開始信号または翻訳停止信号をコード する3種のヌクレオチド(トリブレット)のDNA配列である。
遺伝子:メツセンジャーRNA (rmRNAJ)の雛型を介し特定ポリペプチ ドに特徴的なアミノ酸の配列をコードするDNA配列である。
千ドを産生ずる過程であり、これは転写と翻訳との絹合せである。
ブラスミドニ完全「レプリコン」からなる非染色体二重鎮D N A配列であっ て、このプラスミドは宿主細胞内で複製される。プラスミドが単細胞生物内に存 在すると、この生物の特徴はプラスミドのD N Aの結果として変化し或いは 形質転換される。たとえば、テトラサイクリン耐性(Tet”)に対する遺伝子 を有するグラスミドは、テトラサイタリンに対し感受性であった細胞をこれに耐 性の細胞に形質転換させる。
プラスミドにより形質転換された細胞を「形質転換体」と呼ぶ。
ファージもしくはバクテリオファージ:細菌性ウィルスであって、その多くは蛋 白エンベロブもしくはコート中にカプセル化されたDNA配列よりなっている( 「カプシド」)。
クローン化ベヒクル:宿主細胞内で複製することができ、たとえば複製コート蛋 白の産生のようなりNAの本質的な生物学的機能の喪失或いはプロモータもしく は結合部位の喪失を伴うことなくDNA配列を決定可能に切断しうる1個または 少数のエンドヌクレア・−ゼ認識部位を特徴とし、かつたとえばテトラサイクリ ン耐性もしくはアンピシリン耐性などの形質転換細胞の同定に使用するのに適し た標識を有するプラスミド3フアージDNAまたはその他のDNA配列であり、 クローン化ビークルはしばしばベクターと呼ばれる。
クロ・−ン化:無性増殖によって1種の生物もしくは配列から誘導される生物も しくはDNA配列の集団を得る過程である。
&!I換DNA分子すなわちハイブリッドDNA :互いに末端結合して成る種 の宿主′aJ胞に感染しかつそこに維持される能力を有する種々異なるゲノムか らのDNA断片、よりなる分子系、trp系、tac系、trc系、ファージλ Φ主オペレータおよびプロモータ領域、fdコ・−ト蛋白の制御領域。
SV40の初期およrj、後期プロモータ、ポリオーマから誘導されたプロモー タ、アデノウィルスおよび猿ウィルス、3−ホスホグリセレ−1・゛ドナーざも しくはその他の糖分解酵素のブロモ−・り、酵ffi酸ホスファターゼのプロモ ータ、たとえばPbo2.酵母α−結合ファクタのプロモータ、並びに原核もし くは真核細胞およびそのウィルスの遺伝子の発現を制御することが知られたその 他の配列、或いはその組合せを包含する。
リンホキン;刺戟したリンパ球を特定抗原と接触させた際、これらリンパ球によ り放出される可溶性の液素性媒体である。
リンホキンは、たとえばインクフェロンおよび大食細胞活性化因子を包含する。
TNF (腫瘍壊死因子):TNFは増殖阻止もしくは細胞毒性リンホキンであ る。本明細書に使用する場合、rTNFJは天然もしくは組換TNFまたはその 誘導体である全ての蛋白、ポリペプチドおよびペプチドを包含し、これらは殺腫 瘍活性或いはこれらTNFによる腫瘍生長の阻止を特徴とする。
これらは各種の源泉から得られるTNF様化合物、たとえば天然TN F、組換 TNFおよび合成もしくは半合成TNFを包含する。
TNFN水様ペプチド:TNFの生物学的活性を示すポリペプチドである。これ はたとえばウサギ、ネズミおよびヒトTNFのような哺乳動物TNF並びにTN FN水様ペプチドを包含する。
腫瘍:本明細書に使用する「腫瘍」という用語は全ゆる望ましくないm胞の増殖 を包含する。この種の増殖は悪性および非悪性の固形もしくは液状腫瘍、カルシ ノーマ、黒色腫。
肉腫、白血腫、リンパ腫並びにその他の発癌性、ネオプラスト性もしくは1!瘍 発生性の病気を包含する。
アクチノマイシン:アクチノマイシンはIFの抗生物質であって、RN Aポリ メラーゼの機能を阻止することによりDNA転写を阻害すると思われる。本明細 書に使用する「アクチノマイシン]という用語は、一般にアクチノマイシンとし て知られた種類の関連する抗生物質並びにその誘導体を全て包含する。この用語 は、たとえばアクチノマイシンDを包含する。
LPS:、イー・コリの細胞壁から得られるリポ多糖類よりなる内生毒素である (0.55: B 5) (ミシガン州、ブトロイI・所在のディフコ社)。
BC(、:バチルス・カルメソトーゲラン(バフスール・インスチチュート、ブ ラフセル)。
本発明は、原核宿主におけるTNFN水様ペプチドの高収量の発現に関するもの である。さらに本発明は、TNFN水様ペプチドを含有する組成物を陰イオン交 換体と接触させ、交換体に結合しない状態で残存する組成物の成分を除去し、か つTNFN水様ペプチドを交換体から溶出させることを特徴とする精製方法に関 するものである。
概要において、T’NF様ポリペプチドを精製する本発明の方法の1具体例は、 TNFの産生を誘発するよう特異的に処理した動物(好ましくはウサギ)の血清 を集め、この血清中の活性成分を塩基(好ましくは硫酸アン七ニウム)によりて たとえば約60%飽和まで沈澱させ、中性乃至弱塩基性緩衝液(好ましくはl・ リス−HC1)中にベレットをHp濁し、イオン交換カラムクロマトグラフィー ・(好ましくはDEAE−セファセル)を用いかつ塩濃度勾配を用いて蛋白を分 画し、TNF活性を有する集めたフラクションを好ま1.・くはアミコンTCI −2装置で濃縮し、この濃縮物をゲル濾過クロマトグラフカラム(好ましくはA cA34)にて分子量により分画し、TNF活性を有するフラクションを集めて これらを好ましくはモノQカラム(ファル′?シア社)に先ず弱塩基性rol+ でかつ次いで弱酸性pHでイオン交換クロマトグラフィーにかけることからなっ ている。勿論、このR’A法(特に陰・イオン交換体の使用)を用いてTNFN 水様ペプチドを広範な種類の天然源並びにこれらポリペプチドをコードするDN A配列で形質転換された各種の原核宿主から9裂し)ることを了解すべきである 。
上記工程でi−7られた積層TNFのアミノ酸配列を次いで決定することができ る。これらの得られたアミノ酸配列を本発明の各種の方法で使用することができ る。これらを使用して、本発明のTNFN水様ペプチドおよびTNFをコードす るDNA配列の存在下に天然および合成哺乳動物DNAの各種の保存物をスクリ ーニングするのに有用な一連のDNA試料を作成することができる。たとえば、 ウサギTNFのアミノ酸配列から得られたDNA配列を使用して、ウサギもしく はその他の@乳動物のTNFN水様ペプチドをコードする他のDN’A配列につ ぎDNA保存物をスクリーニングすることができる。さらに、このように選択さ れたDNA配列、より好ましくはウサギもしくはネズミDNA配列を使用して、 ヒトTNFlポリペプチドをコードするDNA配列につきスクリーニングするこ ともできる。何故なら、ウサギとネズミとヒトのTNF間には同属性が予想され るからである。
本発明の組換DNA分子を使用して、これらにより形質転換された各種の原核宿 主にてTNFN水様ペプチドを発現させる。これらのTNFN水様ペプチドは、 抗癌および抗腫瘍用途および治療に使用することができる。概要において、本発 明のこの具体例は、所望のTNFN水様ペプチドをコードするDNA配列を持っ た組換DNA分子により形質転換された適当な宿主を培養することからなり、前 記配列は組換DNA分子における発現制御配列T4または発現制御配列p L  −T4のいずれかに作用結合している。ここでもウサギTNFまたはその他の哺 乳動物TNFとヒトTNFとの間には類似性が予想されるので、ヒトの癌、腫瘍 およびマラリャ感染の治療に対し本発明において、これらは全て有用である。
さらに、天然もしくは組換原料から得られた精製TNFを、たとえばTNFとア クチノマイシンDとの組合せよりなる本発明の組合せ物に使用することができる 。より詳細には、本発明の方法とこよれば、これらを医薬上有効量のアクチノマ イシンDと組合せて医薬上有効量にて使用することtこより、腫瘍を処置するこ とができる。
慣用の!It瘍処5は、たとえば化学療法および照射線のような非外科的治療並 びに外科7治汝を回合する。典型的には、これらの治療は各種の望ましくない副 作用を伴う。免疫抑制作用を伴う非外科的治療は、二次的感染に対する患者の感 受性を増大させうる。形質転換した細胞を削出する外科治療は浸食過程を伴う危 険を有し、かつ全形大転換細胞を効果的に除去しまたは排除することができない 、癌および非悪性腫瘍に対する他の処置方法は、腫瘍特異性抗厘に対するモノク ローナル抗体を形質転換細胞の表面に使用することを含む。典型的にはネズミの モノクローナル抗体を含むこの種の治療の効果は、しばしばさらにネズミ抗体を 投与して得られる効果をIU!害するような反抗体反応を含む各種のファク々に より制限されるCG、 E、グツドマン等、「進行黒色腫を有する患者における ネズミモノクローナル抗体のバイロフト試験」、ジャーナル・オン・クリニカル ・オンコロジー、第3巻、第340−351頁(1985))。モノクローナル 抗体の治療に関する他の報告された副作用は過敏症0発熱および悪寒を伴う。
この種の治療の欠点に鑑み、腫瘍発生細胞に対する人体の免疫反応を人体の種々 のリンホキンレベルを増大させて開始させるため、各種の治療法が開発されてい る。たとえば、TNFのみがHt′瘍細胞の増殖を阻止し或いは死滅させること が知られている。さらに、ヒドリンホトキシンおよびヒトγ−インクフェロンの 絹合せは腫瘍増殖を阻l)二することが報告されている〔ヨーロッパ特許出願糸 128,009号〕。T N Fとヒトインクフェロンとの組合せは、さらにそ れらの個々の効果の合計よりも大きいヒト腫瘍に対する増殖抑制もしくは細胞毒 性作用を示すことが報告されている(L、フランセン等、「組換腫瘍壊死因子: 各種の正常および形質転換ヒトおよびネズミ細胞ラインに対するその作用並びに インクフェロンーγとの相乗作用」、ヨーロピアン・ジャーナル・オン・カンサ ー・アンド・クリニカル・オンコロジー(印刷中);ヨーロッパ特許出願第13 L789号〕。さらに、アクチノマイシンDとTNFとの組合せは、インビトロ におけるlit瘍細胞増殖の抑制を示すことが報告されている(J、M、オスト ロンおよびG、E、ギフオード、「ウサギ腫瘍壊死因子(40449)によるL −929細胞のDNA合成の刺戟J 、Proc、Soc。
Exp、Biol、Med、第161、第354−358頁(1978)。
M、R,ルフおよびG、E、ギフオード、「ウサギ腫瘍壊死因子二作用メカニズ ムj1インフェクション・アンド・イミユニティ」、第31巻、第380−38 5頁(1985))。
以下、本発明の組換DNA分子により産生されるTNFN水様ペプチドの製造に つき説明する。先ず最初に本発明の方法により精製されたウサギTNFの部分ア ミノ酸断片に基づいて作成された一連の合成りNA断片からなるDNA試料を用 いて、TNF関連DNA配列を選別した。TNFおよびTNFIポリペプチドを コードする本発明のDNA配列を位置決定しかつ同定するには、各種のクローン 化および選択技術を理論的に使用しうろことを了解すべきである。次いで、選別 したDNA配列自身を試料として使用することにより、TNFN水様ペプチドを コードする他のウサギおよび哺乳動物DNA配列を選択すると共に、これらによ りコードされるTNFN水様ペプチドを産生させるべく適当な原核宿主を形質転 換させた。さらに、ウナギDNA試料により選別されたDNA配列自身を使用し て、哺乳動物TNFおよびTNFN水様ペプチドをコードするDNAを選択し、 かつこれらDNA配列を使用して適当な原核宿主においてポリペプチドを産生さ せた。
本発明のDNA配列は、各種の宿主/ベクター組合せで使用して発現させること ができる。たとえば、有用なベクターは染色体、非染色体および合成のDNAI 2列、たとえば各種の公知細菌性プラスミド、たとえばcolEl、pcRl。
pBR322,pMB9およびその誘導体を含むイー・コリからのプラスミドの 各種の公知誘導体、広範囲の宿主プラスミド、たとえばRP4.ファージDNA 、たとえばファージλの多数の誘導体、たとえばNM989およびその他のDN Aファージ、たとえばM13並びにフィラメント状一本1mDNAファージ、並 びにプラスミドとファージDNAとの組合せから得られるたとえばファージDN Aもしくはその他の誘導体を使用すべく改変させたプラスミドで構成することが できる。
本発明のDNA分子は、pL−T4およびT4よりなる群から選択される特定の 発現制御配列を包含する。T4発現制御配列のみが本発明の組換DNA分子にお いて特に有用であることが判明した。たとえば、TNFN水様ペプチドの特に有 効な発現は、発現系の一部としてプロモータとリポソーム結合部位との両者を含 むバタテリオファージ]゛4から得られたDNA配列からなるプラスミドを使用 して得ることができる。この配列は、ファージT4蛋白32.(gp32)遺伝 子の欠失誘導体である(H,M、クリシおよびB、アレフト、rバクテ’):t フ1−ジT4遺伝子32に含まれるヌクレオチド配列:翻訳自己制御」、プロシ ーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエンス、第79巻、第4937−4 941頁(1982))。
本発明に使用するT4 DNA配列の断片が有効である少なくとも1りの理由は 、この断片内に3個もしくは4個の連続断片が存在し、そのそれぞれが順次にプ ロモータとして機能することができ(すなわちm RN Aの転写を開始させ) 、かつこれらのプロモータが数種のRNAポリメラーゼ分子を封鎖して単一のプ ロモータよりも多いm RN Aを開始させるからであると思われる。さらに、 T4 DNA配列で開始するmRNAはイー・コリにおいて異常に安定であるこ とが判明した(K、ゴルスキー等、セル(1985)(印刷中)〕。
本発明は次の発現制御配列からなる組換DNA分子に関する: 〔ここでXは存在しない(この場合最後の5個の塩基はAT八へGによって示す ことができ)か、またはXは1〜151固の塩基の群である〕。好ましくはXは CGATACT、CGCGATACT、ATACTAAA、ATACT、CGC GATACTAAAおよびCGATACTAAAよりなる群から選択される。
Xが存在しない発現制御配列は次のように示すこともできる: 好適発現制御配列はさらに次のように示すこともできる:この発現制御配列に対 する適当な改変を行なって、配列を発現系の1部として使用する際にずっと高レ ベルの蛋白発現を得ることができる。この配列は、たとえば(1)部位特異性の 突然変位CB、 A、オーストラ等、ネイチャー1第304巻、第456−45 9頁(1983)] ;(21C1a 1部位における部位操作〔たとえばヌク レオチドを充填するためのクレノー断片の使用、またはヌクレオチドを欠失させ るためのs1/Bal切断〕;および(3)合成オリゴヌクレオシド断片の挿部 位或いは断片ATXATGを改変しうろことが判明した。
この種の改変配列並びに同様に改変した配列を組換DNA分子におけるこの配列 、宿主および本発明の方法の代りに使用することができ、かつこれら全ては本発 明の範囲内に入ると思われる。同様に、この配列を改変させるため上記技術は、 この配列の特定配列を異なる配列に変換するために使用することもできる。また 、当業者は、Xの規定内における塩基の異なる組合せを選択して特定位置におけ る発現レベルを最適化させ、或いは本発明の組換DNA分子に対し他の所望の性 質を付与することもできる。
pL−74の使用は、TNFN水様ペプチドの高度の発現をもたらす、Pしプロ モータからなる組換DNA分子を使用して、有利にλリプレッサを有する宿主を 形質転換させることができる。本発明の1具体例において、上記発現制御配列は PLプロモータの下流に挿入される(H,ベルナート等、ジーン、第5巻、第5 9−76頁(1979)並びにヨーロッパ特許出願第81.301413.1号 、公告公報第0041767号〕。
本発明の組換DNA分子はpL−T4およびT4よりなる群から選択される発現 制御配列を包含するが、これらの配列と組合せて他の発現制御配列をも使用する ことができる。この種の発現制御配列の例は互土工系、trp系、と1玉系。
t r C系、7アージλの主オペレータおよびプロモータ領域。
fdコート蛋白の制御領域、酵母の糖分解プロモータ、たとえば3−ホスホグリ セレートキナーゼのプロモータ、酵母酸ホスファターゼのプロモータ(たとえば Pbo2)並びに酵母α−関連ファクタ並びに原核細胞およびそのウィルスの遺 伝子の発現を制御することが知られた他の配列のプロモータ或いはその組合せで ある。
有用な発現宿主は、T4およびpL−T4が作用する周知の原核宿主、たとえば イー・コリの菌株、たとえばイー・コリHB101.イー・コリX1776、イ ー・コリX2282゜イー・コリDHI(λ)およびイー・コリMRCI並びに シュードモナス、バチルスたとえばバチルス・ズブチリスおよびストレプトミセ スの苗株を包含する。本発明によるTNFの発現には、イー・コリ菌株W311 0が特に有用であることが判明した。
勿論、全ての宿主/発現ベクター組合せが本発明のDNA配列の発現或いは本発 明のTNFFIポリペプチドの産生に際し同等な効率をもって機能するとは限ら ない。しかしながら、宿主/発現ベクター組合せの特定の選択は、本発明の範囲 を逸脱することなく本明細書中に示した原理を考慮した後に当業者が容易になし うろことができる。たとえば、選択は多数のファクタのバランスに基づくべきで ある。たとえば、これらは宿主とベクターとの適合性、DNA配列によりコード された蛋白の宿主に対す毒性、所望蛋白の回収の8呂性、DNA配列およびこれ に作用結合された発現制御配列の発現特性、生物安全性、コストおよび重なり、 形態或いは所望蛋白の必要な他の発現後の改変などを包含する。
さらに、それぞれ特定の発現ベクタ・−内において、本発明のTNF開連DNA 配列を挿入するための各種の部位を選択することができる。これらの部位は、一 般にこれら部位を切断する制限エンドヌクレアーゼによって命名される。これら は当業者により充分認識されている。勿論、本発明に有用な発現ベクターは、選 択DNA断片を挿入するための制限エンドヌクレアーゼを必要としないことを了 解すべきである。寧ろ、このベクターは他の手段によって断片に結合することが できる。発現ベクタ・−1および特に選択DNA断片を挿入するよう選択した部 位および発現制御配列に対するぞの作用結合は、たとえば特定制限酵素に5受性 の部位の個数、発現すべき蛋白の大きさ、宿主細胞酵素による蛋白分解に対する 所望蛋白の感受性、精製の際に除去するのが困難な宿主細胞蛋白による発現蛋白 の汚染または結合、たとえばベクター配列に対する開始および停止コドンの位置 のような発現特性、並びに当業者に認識された他の多くのファクタによって決定 される。ベクターおよびDNA配列用の挿入部位の選択はこれらファクタのバラ ンスによって決定され、必ずしも全ての選択がそれぞれの場合に同等に有効であ るとは限らない。
本発明のDNA配列により形質転換された原核宿主を発酵させて産生させるTN FおよびTNF様ポリペプチド、並びに本発明の方法により産生されかつ精製さ れたTNF様ポリペプチドは、抗癌および抗腫瘍処理および治療のための各種の 組成物および方法に有用である。これらはさらに抗マラリャ治療および方法にも 有用である。
これらのポリペプチド或いは恐らくこれらからまたはそのアミノ酸配列を用いて 誘導されまたは合成されるペプチド或いはそれらの塩類またはその医薬上許容し ろる誘導体の投与は抗癌、抗腫瘍もしくは抗マラリャ活性を示す薬剤の投与につ き従来認められている任意の方式によって行なうことができる。これらは経口、 非経口、皮下、静脈内、病巣内もしくは局部投与を包含する6局部、病巣内もし くは静脈内注射が好適である。
これらの治療に使用する組成物も各種の形態とすることができる。これらはたと えば固体、半固体および液体の投与形態、たとえばタブレフト、ピル、粉末、溶 液もしくは懸濁液。
座薬、注射溶液および潅流溶液を包含する。好適形態は、目的とする投与方式お よび治療用途に依存する。さらに、これら組成物は好ましくは慣用の医薬上許容 しうるキャリヤを包含し、他の医薬品、キャリヤ、アジュバント、賦形部など、 たとえばビ]−血清アルブミンまたは血漿s′J剤を包含する。好まし2くは、 本発明の組成物は榮位投与の形態であって、−俄に1日1回もしくはそれ以上の 回数で投与する。、1回で或いは処置の期間にわたって投与する活性化合物の量 は処Wする愚考、病状および腫瘍もしくは癌またはマラリャ感染の経通。
投与方式および形態、並びに医者の)11断に(表作する。しかしながら、有効 投与量は約0.005〜約50g/kg/B、好ましくは約0.05〜約0.5  n g 、/ kg/口の範囲とすることができ、それより少量および多量の 投与も有用であることが認められる。
したがって、本発明は、ヒトを含むlIl!乳動物における癌もしくはIlt瘍 の処置方法を提供し、この方法はl!!瘍学上有効量の本発明による化合物或い はその医薬上許容しうる塩もしくは誘導体を投与することからなっている。勿論 、本発明の組成物および方法を他の癌もしくは腫瘍治療と組合せて、たとえばI FN−α、IFN−βおよびIFN−γのようなインクフェロンと一緒に或いは 哺乳動物における癌および腫瘍を治療するための化学療法と一緒に使用すること ができる。
本発明の他の面によれば、哺乳動物を医薬上有効グのTNFと抗生物質とを組合 せて、11ffi瘍増殖を抑制もしくは阻止し、好ましくは腫瘍細胞を死滅させ るのに充分な期間にわたって処置する。哺乳動物は、好ましくはTNFとアクチ ノマイシンDとの組合せからなる組成物で処置する。代案として、これら2種の 成分で順次に処置することもできる。しかしなから、選択する処置の特定順序は 重要でないど思われる。より詳細には、哺乳動物を皮下、静脈内、筋肉内もしく は病巣内注射により患者1人当り毎日約10μg〜100■のTNFで処置する ことができる。しかしながら、この投与量は認められた医療基串にしたがって医 者により患者の身体状態および許容レベルに応じて調節すべきである0本発明に よれば、さらにTNFで処置する前または同時に或いはその後に医薬上を動量の 抗生物質で処置することもできる〔八、グツドマン等、「治療の薬理基準」、第 1290−1291頁(1980))。アクチノマイシンDは、腫瘍中へ病巣内 注射として投与すべきである。
さらに本発明のTNF様化合物は抗マラリャ剤としても有用である。たとえば、 ヒトマラリャ寄生虫、すなわちプラスモジウム・ファルシパルム(Plasmo dium falciparua+ )は・TNFに感受性であることが知られ ている〔プレイフェア等、イミュノロジー・ツデイ、第5巻、第165−166 頁(1984))。
本発明をよりよく理解しうるよう以下実施例を示す、これらの実施例は例示の目 的であって、特定具体例のみに本発明を限定するものと解釈すべきでない。
実施tallFTNF様化合物のインビボ誘発および分析動物においてTNF産 生を誘発することが知られた多くの方法がある。たとえばBCG、コリネバクテ リヤおよびチモサン(酵母サン力ロミセス・セレビシーの細胞壁から)のような 物質を動物に感染させると、インビボにて細網内皮系(RES)の多量増殖を誘 発する1次いで、細菌の細胞壁から生じた内生毒素(たとえばイー・コリからの LPS)を使用して、活性化大食細胞によりTNFの放出を開始させることがで きる。
本発明の方法におけるその後の使用のためT N F様ポリ−(ブチドの産生を 誘発さ廿るべ(、ウサギを使用するよう選択した。しかしながら、たとえばネズ ミ、ラッチ、イヌ、サル・牛などの他の各種の動物を選択することができるであ ろう。
代案として、確定した細胞ライン(ヒト、ネズミなど)を使用することもできる (上記)、ウサギを使用する好適具体例において、これらウサギに4X10’の 生存BCG生物の接種物を静脈内に注入した。RES系の最大刺戟と内生毒素の 最大感作とを与えることが知られているためBCGを使用した(E、A、、カル スウェル等、「腫瘍の壊死を生せしめる内生毒素誘発の血清ファクタ」、プロシ ーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエンス・USA、第72巻、第36 66頁(1975))、RESが充分に刺戟された約14日後、各ウサギに10 0μgのLPSを静脈内注入して、TNFの産生を開始させた。2時間後に動物 を出血させて、処理動物の血清を集めた。
TNF分析用に適当な標的細胞を選択するため、インビトロで誘発したヒトTN Fおよびインビボで誘発したウサギTNFの細胞毒性作用につき各種のヒト細胞 ラインの感受性を検査した。第1表に要約したように、3試験した全てのヒト形 質転換細胞ラインは、試験した形質転換してないヒト細胞ラインよりもTNF活 性に対しより感受性であった。さらに、37℃にて全ての試験した形質転換して ない細胞ライン(182PE、215M、WISH,HEK>のヒトTNFに対 する感受性は、37℃にてL−929細胞の感受性より10%低くかった。さら に、正常な繊維芽細胞ラインと融合したヘラ細胞から生ずるハイブリッドの1つ の対応対(A)(tu−およびtu”)は、壊死因子に対する感受性に相関した 腫瘍発生性を示したことは興味がある。しかしながら、この種のハイブリッドの 第2の対(13)には差が見られなかった。さらに、1式験し、たヒト細胞はウ サギTNFに文Jするよりもヒ)TNFに対し感受性が大であるため、TNFの 作用において種類特異性の程度が存在すると思われる。
KB 10 100 15 125 SV80 2.4 200 3.7 150Hela 3.7 100 11. 1 150V A 4 7.5 25.6 3.75 12.8VA13 12 .5 75 25 50HO32,512,8538,4 MNNG−HO32,0254,250He p 1.9 12.8 t u−0,83,71,211,1 A tu” 1.2 100 1.2 100tu−1,211,13,710 0 B tu” 0.4 11.1 1.23 33.3182PF <0.05  <3.7 <0.05 <3.7F S 4 < 0.05 < 6.3 <  0.05 < 3.7EISM O,56,30,58,4 w r S H< 0.05 < 3.7 < 0.05 < 3.7HEM  O,56,30,56,3 a:L−929:ネズミ繊維芽腫瘍;KB:ヒト表皮腫瘍;SV80 : SV 40形質転換したヒト繊維芽細胞;He1a:ヒト表皮腫瘍、頚部[1VA−4 :5V−40−形質転換した人肺1VA−13jSV40−形質転換した人肺、 pros:ヒト有肉nFirMNNG HO3:化学形質転換した骨肉腫; H e I) :ヒト表皮腫瘍、喉頭癌;tu−:II!瘍抑圧ハイブリッド(He laxヒト繊維芽細胞(GMOO77)): tu” : tu−のインビボの 対応物(E、J、スタンプリッジ等、サイエンス、第215巻、第252〜25 9頁(1982)>; 182PF:結腸および直腸のヒト皮膚遺伝性腺腫(正 常なヒトのバイオブシ);FS4:ヒト2倍体繊維芽細胞;EISM:ヒト2倍 体繊維芽細胞;WISH:ヒト羊膜;HEK :ヒト未成熟腎臓。
b : BCG−およびLPS−注射したウサギの血清。
C:インビトロにてr−■FN(24時間)およびLPS(3時間)で刺戟した ヒト胎盤MOの成長培地。
d:37℃にてL−929細胞の感受性の%とじて表わす。
L=929細胞はTNF活性の証明となる壊死因子に対し最高の特異的腫瘍関連 感受性の1種を示したので、これらの細胞を本発明の分析用として選択した8分 析のため、実質的にランク等により記載された方法を用いた〔リンホキン・レポ ート、第■巻、(1980))。
先ず最初に、TNFを含有すると推定されたフラクションの一連の希釈物を作成 し、これらにL−929細胞(細胞50.00011g/穴部)とアクチノマイ シンDとを最終濃度1μg/mIまで加えた。この混合物を37℃または39. 5℃にて18時間培養した(高い方の温度にてL−929標的細胞は、低い方の 温度におけるよりも2.5〜3.0倍感受性が大であった)。
培養期間の後、細胞を染色しかつ計数した0代案として、染色細胞を33%HO Acに熔解し、かつ遊離した染料をコントロン型分光光度針(577nm)を用 いて測定した。
この分析において、■+11当りのTNF単位(U)は、アクチノマイシンDの 存在下で行なった死滅分析において18時間以内に細胞生存率を50%低下させ るのに必要とするTNFの希釈率の逆数を示す。
TNFもしくはTNF様活性は、インビトロにおいて確立tm++包ライシうイ ン発させることもできる。たとえばヒトTNFを誘発させるため、ヒト単核U− 93711[1胞ラインを選択した〔ヒト組織法のリンパ腫、C,サンドツトロ ームおよびK。
エルシン、インターナショナル・ジャーナル・カンサー、第17巻、第565− 577頁(1976))、Lかしながら、たとえば胎盤からの他のヒト前単核細 胞ライン(たとえば、HL−60,Ml−1) 、ヒト単核細胞ライン(たとえ ばTPH−1,J−111)またはヒト大食細胞をも使用して、ヒトTNF様ポ リペプチドを誘発させることができた。勿論、ヒトTNFのこれらの各インビト ロ原料は、TNFまたはTNF様化合物の最適産生には多かれ少なかれ特異的誘 発手段を必要とすることを了解すべきである。
ヒトTNFを誘発させるために選択した具体例において、5%の失活してない予 備選択した胎児牛血清のバッチ(Fe2、ギブコ社、スコツトランド、ベイスリ ー在)および5%の馬血清(ギブコ社)を添加したRPMI−1640培地にて 転勤瓶中でU−937細胞ラインを増殖させた。細胞が1.5×106個/1の 密度に達した際、これらを32nmのTPA(シグマ社、セントルイス、USA )にてRPMI−1640゜0、IU/+wlの牛結晶インシュリン(BDH社 、プール、英国)、50nMのレチノール酸(カルビオケム社、フランクフルト 、西ドイツ国)、1%の巨大腫瘍細胞(GTC)−状!3調節培地(ギブコ社) 、0.5■/mIのサイトデンクス3(ファルマシア社、ウプサラ、スエーデン 国)でI X 10’個/mlの細胞の密度にて回転フラスコ中で24時間誘発 させた。
ネズミTNFを誘発させるために選択した具体例においては、ネズミ1lff1 瘍大食細胞ラインPU、5.1.8を選択した〔カンサー・リサーチ、第37巻 、第546−550頁(1977) ) 。
しかしながら、たとえばJ−774、RAW309およびWR19Mのような他 のネズミ大食細胞ラインも選択しうるであろう、 PU、5.1.8細胞ライン を誘発させて、メネル等により実質的に記載されたようにTNFを産生させた〔 インフェクシッン・アンド・イミュノロジー、第30巻、第523−530頁( 1980))、概要において、これら細胞を10%FC3(309ギブコ 01 1−6309)を加えたRPMI−1640培地中で転勤瓶にて増殖させた0次 いで、これらの細胞を、RPMI−1640における5agのLPS/#llに より転勤瓶中で3.5X10@の濃度にて4時間誘発させた。
インビトロで誘発した細胞(ネズミもしくはヒト)を遠心分離によって集め、こ れらをTNFもしくはTNF様ポリペプチドをコードする遺伝情報を有するmR NA源として使用した。さらに、これらをネズミもしくはヒトTNF自身の原料 として使用した。
上記で作成したインビトロ誘発のU−937(ヒト)マタて使用した。細胞をノ ニデッt−p−40中で熔解させ、次いで熔解物をフェノール化することにより 、前記細胞から全細胞質RNAを抽出した。次いで、オリゴdT−セルロースク ロマトグラフィーによって溶解物からポリアデニル化RNA(ポリA” RNA )を単離した(3型、共同研究)、さらに、ベックマンSWA i型ロータを用 い4℃、40Kかつ19時間で15%凍結−解凍蔗糖濃度勾配(5%〜20%の 蔗糖勾配に相当する)にてポリA” RNAを分画した。
アフリカ産カエルの卵母細胞中へ所定量を微小注入することにより各フラクショ ンの生物学的活性を分析した(卵母細胞1個当り50pgのmRNA;1試料当 り15個の卵母細胞)。次いで、これら注入した卵母細胞を卵母細胞の浸漬培地 (0,1%のポリエチレングリコール6000と0.4%のアプロチニン(シグ マ社)と1mMのCu5O−とを含有する)中で24時間培養し、前記のインビ トロ分析系を用い39°5℃にてL−929細胞につき培地中でTNF活性を分 析した。
これらの分析において、ヒトおよびネズミTNF関連RNAにつきそれぞれ約1 65および17Sで沈降したmRNAに対応するフラクションにおいて再現性の あるTNF生物学的活性を観察した。第り図は、それぞれヒトおよびネズミrn RNA調製物の2種の代表的蔗糖勾配のOD−経過を示している。
実施例4:ネズミおよびヒ)cDNA保存物の作成ライケンス等により「リゾチ ーム、オボムコイドおよびオバルブミンmRNAに相補的な二重鎖DNAの合成 」、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第253巻、第2483−2 495頁(1978))に実質的に記載されたように、卵母細胞中への注入後に 最大TNF生物学活性を示したポリA4″RNAのフラクション±8μgを使用 して、ヒトおよびネズミのcDN八保へ物を作成し、た、勿論、これらのりr: I−ン化したcDトIA保存物は、伯のヒトもしくは動物源から或いは全細胞R NΔから」−記の事前の濃#?iまたは寸法選択なしにポリA”RNAから作成 し・)ることも了解されよう。
たとえば、ランド等、「真核mRNAの5−末端配列は高効率にてクローン化す ることができる」、ヌクレイツク・アシッド・リサーチ、第9巻、第2251− 2266頁(1981);オカヤマおよびベルブ、[全長C1DNAの高効率の クローン化J、モレキュラー・アンド・セル・バイオロジー、第2巻、第161 −170頁(1982);またはマニアチス等、[モレキュラ・クローニングJ 、(コールド・スプリング・ハーバ−・ラポラトり一出版、ニューヨーク)、第 229−第246頁(1982)に記載されたような他の慣用の方法も使用しう るであろうが、ここではcDNAクローン化につき次の方法を選択し7た。
(al 第1ストランドの合成 第1cDNAストランドを合成するため、±80μgのポリA″RNA/31と 50mMのトリス−HCI (pH8,3>と50mMのKCIと10mMのM gCl2と10mMのDTTと0.5mMの各dNTPとを使用し、1/100 0dCTPの代りにα” P−dCTPを±600Ci/ミリモル(アメルシャ ム社、パツキンガムシャー、英国)を使用し、さらにp (dT)、oを60μ g/ml(ファルマシアーPLバイオケミカルス社、ウプサラ、スエーデン国) にて使用し、また750単位/にlのヒト胎盤RNAアーゼ阻止剤(アメルシャ ム社)と1000単位/!11のAMV逆転写酵素(アングリアン・バイオテク ノロジー社、コルチェスター、英国)を使用した。
反応のため、100IJ!!の全量と41℃と1時間とを用いた0次いで、反応 混合物をフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール(25/24/1) の混合物で2回かつジエチルエーテルで2回抽出し、J容量の4M NH,OA eと4容量のエタノールとを添加してDNAを沈澱させた。この沈澱を2回反復 した。必要に応じ、さらに反応混合物へ酵母tRNAをキャリヤとしてエタノー ルの添加前に加えた。
fblRNA雛型の除去および第2ストランドの合成沈澱したDNAを60μl lの15mM燐酸カリウム(pl+6.9 )および0.25mMのEPTAに 再熔解させ、2pgのRNAアーゼA(イーリンガ−・マンハイム社、西ドイツ 国)と250単位のRNAアーゼTl (BRL社、ノイーアイゼンブルグ、西 ドイツ国)とを加え、この混合物を37℃にて30分間静置した。
次いで、この混合物を沸とう水浴中で2分間加熱し、次いで直ちに氷」二で急冷 した。次いで、燐酸カリウム緩衝剤(pH6,9) (最終濃度100mMまで )とMgCl2 (最終濃度10mMまで)とDTT(i終濃度10mMまで) とdNTP(最終濃度1mMまで)と330U/mlのイー・コリDNAポリメ ラーゼI (エンドヌクレアーゼを含有しない)(イーリンガ−・マンハイム社 、西ドイツ国)とを加えた。この第2ストランドの合成は15℃にて全容8!3 00 /、1 /!にて6時間行なった。次いで、最終濃度25mMまでEDT Aを添加して(pH8)反応を停止させ、上記と同様に混合物を抽出しかつ沈澱 させた。
ベレットを50mMのトリス−HCl (pH8,3)と50mMのKCIと1 0mMのMgCl2と10mMのDTTと1mMの各dNTPと650U/ml のAMV逆転写酵素(アングリアン・バイオテクノロジー社、コルチェスタ、英 国)との混合物80μl中に再溶解させ、かつ混合物を41℃にて90分間培養 することにより、第2ストランドのeDNA合成の効率を高めた0次いで、再び 上記と同様な抽出および沈澱によりDNAを単離した。
(CISIヌクレアーゼ処理 125mMのNaC1と25mMのNa0Acと1rnMの酢酸亜鉛(pH4, 5”J とを含有する緩衝液80it!l中にDNAベレットを溶解させ、20 単位の81〜ヌクレアーゼ(BRL社、ノイーアイセンブルグ、西ドイツ国)を 加え、かつ混合物を37℃にて20分間静置した。最終濃度20mMまでEDT A (pH8)を添加して反応を停止させ、かつ反応混合物を最終濃度200m Mまでのトリス−MCI (pi(8)の添加によって中和した0次いで、再び DNAを1記と同様に抽出しかつ沈澱させ、これを3OnIMのNaC1とto mMのトリス−HClと1mMのEDTA (pH8)とを含有する緩衝液中に 再溶解させ、そして同じ緩衝液に対し平衡化させたセファロ−・スCL4Bカラ ム(0,8X 12(J) (ファルマシア・ファイン・ケミカルス社、ウプナ ラ、スユーデン国)にて寸法分画した。それぞれ2滴のフラクションを集め、少 なくとも500塩基対もしくはそれより大のDNAを含有するワラクシ5ンを集 め、そして集めたフラクションを上記と同様に沈澱させた。
オリゴ−dC末端を有する前記二重鎖CD N Aを、次の反応混合物を用いて 処理した:±2.5μgの二重鎖cDNA/mlと100mM0カコジル酸カリ ウム(pH7,2)と2mMのCoC12と20 (luM(71DTTと40 i!M(Dデオキシ−(5−H’)−シチジン三燐酸(17Ci/ミリモル、ア メルシャム社、パツキンガムシャー、英国)と40(1位/mlの末端デオキシ ヌクレオチジルトランスフェラーゼ(ファルマシアーPLバイオケミカルス社、 ウプサラ、スエーデン国)。
12−18dC残基が3’ OHに対し組込まれるまで37℃にて反応を続け、 次いで最終濃度20mMまでEDTA(pl+8)の添加によって反応を停止さ せた0次いで、直ちにこの物質をフェノールによって抽出し、次いでジエチルエ ーテルで2回抽出し、かつ処理したcDNAを上記のように沈澱させた。
さらに、同様な条件下でヱ1ユ■制限プラスミドpAT153kにオリゴdG− 末端を付加したが、ただしく1)デオキシ−(5−H″)−シチジン−5″−三 燐酸の代りにデオキシ−(8−H3)−グア)シアー5’ −三燐m (25C i / ミ+) %ル、アメルシャム社、パツキンガムシャー、英国)を4μM の濃度で使用し、かっ(2)±16pモル/1の線状プラスミドDNAの濃度を 使用した。
* pAT153.(周知の入手しうるクローン化ベクター)を供給業者(イー リンガ・マンハイム社、西ドイツ国)の指示にしたがってL土±Iで制限し、た だし3倍多量の酵素単位を使用した。
dC−処理した二重鎖cDNA、!:dG処理した線状化プラスミドとをマニア チス等の方法〔「モレキュラ・クローニング」 (コールド・スプリング・ハー バ−・ラボラドリース出版、ニューヨーク)、第242頁(1982))に実質 的にしたがって融合させたが、ただし混合物を65℃まで加熱した後にこれを2 〜3時間かけて室温まで冷却した。
+1) イー・コリ菌株DHI(λ)の形質転僕次いで、イー・コリDHI(λ )〔ハナハン、「プラスミドによる大腸菌の形質ti−換に関する研究」、ジャ ーナル・モレキュラ・バイオロジー〕を前記の融合し九組換DNAにより、競合 細胞100μl当り10ngのベクターDNAを用いて形質転換させた0次いで 、形質転換した混合物をミリポアI(ATF (0,45μMの孔径)フィルタ (ミリボア・コーポレーション社、レッドフォード、マサチューセファ用)に移 植し、これらをlOμg/mlのテトラサイクリンを含有するルリアブロス寒天 板の表面に載置した。コロニーを発生させた後、20%のグリセリンを含有する 新たなプレートにフィルタを載置し、かつこれらを−20℃で保存した。
この手順を用いて、約60.000種のクローンよりなるヒトcDNA保存物と 約30,000[のクローンよりなるネズミeDNA保存物を得た。
実施例5:ウサギ血清からのTNFの精製第2図を参照して、ここには誘発した ウサギ血清からのTNFN水様ペプチドを精製するための本発明による方法の1 具体例を概略で示している。第2図に示した本発明の具体例で示したように、実 施例1に記載したと同様処理した50羽のウサギの血清を集めた。典型的実験に おいて、LPSを静脈内注射した後に、BCG処理したウサギの血清(1800 +ml)は約5.2 X 10” U TNF/mlを含有し、その比活性は約 5.3 X 10’ U TNF/蛋白■であった。
先ず最初に分離したウサギ血清を固体の硫酸アンモニウムで飽和させ、その際こ の硫酸塩を常に攪拌しながら4℃にてゆっくり(約6g/win)添加し、35 .9%の硫酸アンモニウム飽和に達せしめた0次いで、アンモニウムによりpH を7.0に維持し、かつ溶液を絶えず攪拌しながら4℃にて約18時間保った。
次いで、遠心分離(30m1n 、 7500rpu、4℃、べ7クマンJA  7.5型ロータを用いる)によって沈澱物を溶液から除去した0次いで、同じ条 件下で61.6%の飽和に達するまで硫酸アンモニウムを上澄液に加えた。上記 の飽和血清を絶えず攪拌しながら5時間おいた後、再び上記と同様に沈澱物を集 め、かつこの第2沈澱からのベレットを4℃の50mM)リス−HCI (pH 7,5)の600m1中に再懸濁させた。次いで、この溶液を4X3000+1 の50mM)す7、−HCl (pH7,5)に対し40時間透析して硫酸アン モニウムを除去した。この工程により50mMトリス−HCI(pH7,5)に おける760m1の蛋白溶液を得た。この35.9%〜61.6%の硫酸アンモ ニウムフラクションをフラクションAと呼ぶ。
0〜35.9%の硫酸アンモニウムフラクシタンからのベレットも著量のTNF 活性を有するので、これを約200m1の50mMトリス−HC1(p)17. 5 )に再懸濁させ、かっこの溶液を2000m1の30.8%硫酸アンモニウ ム溶液に対し4℃にて絶えず攪拌しながら18時間透析した。前記と同様に遠心 分離により沈澱物を除去した後、上澄液を3X2000+wlの50mM)リス −HC1(p)17.5 )に対し4℃にて絶えず攪拌しtxカラs X 2. 5時間にわたり透析した。この透析により、50mM)リス−〇 C1(pH7 ,5)における270+++1の蛋白溶液が得られた。この30.8%〜35. 9%の硫酸アンモニウムフラクションをフラクションBと呼ぶ。
フラクションAとBとを合し、かつ遠心分!eI (30+sin 。
7500rpm、4℃、ペフクマンJA7.5型ロータ)の後、is液ヲ0.4 5μmのニトロセルロースフィルタ(ミリボア社、ペットフォード、マサチュー セッツ州)に通過させて、1025m1の30.8%〜61.5%硫酸アンモニ ウムフラクションを得た。この混合したフラクションは約8.0X10’UTN F/耐(ウサギ血清のTNF活性のほぼ全部)と、その全蛋白の55%のみを含 有した。このフラクションの比活性は8.8 X 10’ U TNF/蛋白■ であつた。
山) イオン交換クロマトグラフィー(緩和なアルカリ性pH)組合せたフラク ションにおけるTNF活性をそこに含まれる他の多くの蛋白から分離し7、その 際陰イオン交換樹脂に対するTNFの強力な結合親和性を利用した。多くの陰イ オン交換クロマトグラフ系が当業者に周知されているが、直径2.6eIIl× 48CIlのDEAE、セファセルカラム(ファルマシア社、ウプサラ、スエー デン国)を使用するよう選択した。勿論、本発明の範囲内において、他の陰イオ ン交換カラムも選択しうろことが了解されよう。
予め50mMのトリス−HCI (pH7,5)で平衡化させた選択カラムにT NF含有熔液を充分過剰に負荷させ、溶液を0.8 ml/ winの流速で通 した。TNFはカラム上において他の予め結合した蛋白と競合するので、この手 順は溶液中のほぼlのTNFが結合したカラムを与えた。このカラムを同容積の 50mM)リス−HCl (pH7,5)と50mM)リス−HC1(pH7, 5)における同容積の0.1MのNaC1とで0.8 ml/ winの流速に て洗浄した後、これを50mM)リス−HC1(pH7,5)における0、1M から0.4MのNaC1の直線的塩濃度勾配で同流速にて熔出させた。この溶出 は、0.IMのNacl洗浄工程の終りにTNF活性を有するフラクションの溶 出物を与えた。第2図に示したように、得られた溶液は2.8 X 10’ U  TNF/mlを合有し、比活性は1.6×10’U/蛋白■であった。したが って、この陰イオン交換工程は、99%以上の非TNF蛋白を除去することがで きると共に、TNF活性のほぼ全部を保持することができた。
(C) イオン交換物の濃縮 再び第2図を参照して、DEAEセファセルカラムから溶出させたTNF含有フ ラクションを集めかつ濃縮した。集めタフラクションを遠心分離しく30 mi n 、 13.50Orpm+ 、 4℃、ベツグマンノA14型ロータ)、次 いでアミコンTCP−2型装置を用いて上澄液を17倍に濃縮した(セルを1. 5気圧に加圧しかつシアフロUMIOF!(アミコン、ダンパー、マサチューセ ッツ州、USA)を使用した)、得られたm縮重は2.6 x 10’ U T NF/a+1を含有しかツ1.2 X 10’ U/■の比活性を有した(第2 図)。
(dl ゲル濾過 上記のように作成した濃縮物をゲル濾過により分子量にしたがって分画した。多 数の適当なゲル濾過系が当業者に周知されているが、20.000〜350.0 00ダルトンの分画範囲を有するAcA34ゲル(LKB社、ブロマ、スエーデ ン国)を選択した。ここでも、他の濾過系を使用しうろことが了解されよう。
選択したゲルをIMのNaC1と50mMのトリス−MCI(p)17.5)に 懸濁させ、このゲルをカラム(直径2.5c+aX89(2))中へ注ぎ込み、 かつこのカラムを同じ*jfJ?& i’ 0.5 ml/I+IXnc)流速 にて平衡化させた。TNFmNFm縮重されたA c A 34カラムに充iす る前に、アミコン濃縮物の塩濃度を、5QmMのトリス−HCI (pH7,5 )における5MのNaC1熔液によりカラム緩衝液の塩濃度で平衡化させた。
TNF活性を有するこの工程のゲル濾過フラクションは、約350.000ダル トンの分子量に相当した。
第2図に示したように、ゲル濾過後に残留する30m1の溶液は4.OX 10 ’ U TNF/mlを含有Lカッ9.3 x 10 ’U TNF/蛋白増の 比活性を有した。これは、血清から約20.000倍TNFが精製されたことを 示している。
(el イオン交接クロマトグラフィー(弱酸性pH)TNF活性を有する望め たゲル濾過フラクションを、20mMのヒスチジン−HC1緩衝液(pH5,8 )における2×750m1の0.1M NaC1t;対し4℃にて1晩透析した 。
次いで、調製用のモノーQカラム(直径1 caX l l oa、ファルマシ ア社、ウプサラ、スエーデン国)を同じ緩衝液で平衡化させた後、透析したTN F含有の溶液をこのカラムにて20mMヒスチジン−HC1緩衝液(pH5,8 )における0、1M〜0.4MのNaC1の直線的勾配により分画した。TNF 活性を有するフラクションは約0.26MのNaC1の濃度勾配で溶出した(フ ラクション15および16)、再び第2図を参照して、これらのクロマトグラフ 工程は、2.5X10’UTNF/mlを含有しかつ4.5 x 10’ U  TNF/蛋白■ノ比活性を有する溶液4mlを与えた。このフラクションは、血 清からの約100.000倍のTNF精製を示した。第2図に示した全TNF活 性における変動は、TNF活性分析における不正確さくファクター2まで)によ るものである。
酸性モノQカラムからの溶出フラクションを5DS−PAGE (12%)で分 析した0次いで、第3図を参照して、約18.000ダルトンの分子量に相当す る位置に単一の蛋白帯が活性カラムフラクション内に保持されることを観察した 。この蛋白帯におけるクーマシー・ブリリアント・ブルー(セルバ17250) の染色強度は、対応するカラムフラクシジンのTNF活性と正確に相関する。5 DS−PAGEは蛋白を変性させるが、非変性ゲルのゲルスライス物から溶出し たTNF活性は5DS−ポリアクリルアミドゲルにおける電気泳動に際し同じ蛋 白帯を示し、したがって18,000ダルトンのバンドはTNFN水様ペプチド を示すことが確認された。
誘発したウサギ血清からのこのTNFN水様ペプチドを精製した後、これを使用 してそのアミノ酸配列の部分を決定した。しかしながら、この精製TNFを臨床 的に用いて、癌および腫瘍並びにマラリャ感染に対するTNFの作用並びにこれ らに対する治療効果を研究しうろことも了解されよう。さらに、この精製したT NFを使用し、精製蛋白を適当な動物中へ注射してTNF抗体(ポリクローナル またはモノクローナル)を生成させることもできる〔たとえばB、ベナセラフお よびE、ウナヌエ、「テキストブック・オン・イミュノロジー」、ウィリアムス ・アンド・ウィルキンス(バチルモア、メリーランド州)、第12〜22頁(1 979))、これらの抗体は、たとえば分析或いはTNF自身の精製工程に有用 である。
これから誘導される蛋白およびペプチドのアミノ酸配列を決定する技術は当業界 で周知されている。これらの利用し・)る自動化技術の1つを選択して、実施例 5でti製されたウサギTNF様化合物の選択部分に関するアミノ酸配列を決定 した。先ず最初に、精製したウサギTNF0)CNBy断片を標準条件下で作成 した。次いで、これらの断片をゲル上で分離し、個々のバンドを電気溶出させ、 これらを透析しかつアプライド・バイオシステムス気相配列決定装置(モデル4 70型)に直接族こした。
第4図および第5図を参照して1、ここには精製したウサギTNFポリペプチド の2種の部分のアミノ酸配列が示されている(TNF CNBr−断片3および 4)、さらにこれらの図面には2種の断片における各アミノ酸をコードする各種 のDNAコドンも示されている。各コドンは、決定されたアミノ酸配列をコード する縮重群を示し、ている、遺伝子コードの縮正により、多くの存在しうるヌク レオチド変異を含む多くのDNA試料を所定のアミノ酸配列につき合成ずことが できる。勿論、DNA試料の合成には、少なくとも縮重コドンを有するアミノ酸 を含有したアミノ酸配列を選択するのが好適である。しかしながら、充分長い試 料を選択すれば、生じうる不整合は完全整合の@域によ、って補われ、高縮重群 の試料においてさえ構出可能なハイブリッド化が生ずるであろう。
この精製したウサギTNFから誘導したアミノ酸配列は、各種のDNA保存物を スクリ・−ニングしてハイブリッド化により関連DNA配列を選択する際使用す るためのヌクレオチド(DNA)試料の合成に有用である。次いで、これらの選 択した配列を夕J1理して、ごれらにより形質転換された原核宿主でTNF発現 させることができる。さらに、これらは、哺乳動物TNF、たとえばネズミおよ びヒトTNFをコードするその他の関連DNA配列を選択するためのスクリーニ ング試料としても有用である。
さらに、この精製TNFを用いかつそのアミノ酸配列に基づく合成ペプチドを用 いて、適当な動物においてTNFに対するポリクローナルもしくはモノクローナ ル抗体を作成することもできる。これらの抗体はTNFの精製およびTNFの放 射線免疫分析に有用であり、たとえは本発明の方法により作成されたTNF発現 性クローンの直接的選択に使用することができる。さらに、この楕!A蛋白およ び合成ペプチドは腫瘍、癌およびマラリャ治療並びにその関連方法においてTN F活性を臨床的に評価するにも有用である。
再び第4図および第5図を参照して、ここにはTNF断片3および4につき決定 したアミノ酸配列に基づき慣用のホスボアミドDNA合成技術を用いて作成した 各群の縮jtTNFDNA試料が示されている〔たとえばテトラヘドロン・レタ ース、第22巻、第1859−1862頁(1981) ) 。
たとえばLys(AA&2)からA ! a (AAFh 12)に到る範囲の TNF断片3におけるアミノ酸配列に基づき、位置4−6−!9−21にヌクレ オチド組換へを有する4種の32量体(RAB TNF3−1〜RAB TNF 3−IV)を合成した。第4図において組換部分には下線を施した。さらに、6 0オリゴヌクレオチドの長い重複試料を作成した(第4図参照)。
Trp (AAk3)からLeu(AA&9)に到る範囲のTNF断片4におけ るアミノ酸配列に基づき、4μMの縮重群の20僅体(RAB TNF4−Al 〜RAB TNF4−A4)を合成した(第5図参照)。これらの20僅体は位 置12にヌクレオチド組換えを存した(第5図において下線を施こす)、異なる 群の試料によるゲノムウサギDNへのサウザンプロット法における後のハイブリ ッド化パターンに基づき、RAB TNF4−A2試料を位置15におけるヌク レオチド組換えに基づいて3群に分けた(第5図において組換えに下線を施こす )、断片4のP h e (AAk 13)からASIIII(AAAlO2に 到る範囲のアミノ酸配列に基づき、第2群の6種の20僅体(RAB TNF4 −Bl〜RABTNF 4−B 6)を作成した。最後に、TNF蛋白のこの部 分におけるしまぼ仝邪の公知アミノ酸配列にわたる長い重複試料を作成した(第 5図参照)。
これらDNA試料を使用し−Cスクリーニングする前に、各一本鎖DNA試料を T4ポリヌクレオチドキナーゼによって5゛末端標識した。4種のαB2p−デ オキシヌクレオシド三燐酸全部の存在下でクレノ・−・ボリメラー・ゼを用いる 充填により、長い重複試料を長い高比活性(>10”/μg試料DNA)まで標 識した。
実施例7:ウサギゲノム保存物のスクリーニング1種もしくはそれ以上のDNA 試料を用いて全てのDNA収集物を有効にスクリーニングしうるが、一般に合成 り N A試料の基礎となるポリペプチドの分離に使用したと同じ動物から得ら れたDNA保存物を先ず最初にスクリーニングするのが好ましい。同じ動物から のDNA保存物の使用は、ハイブリッド化条件を一層厳格にすることを可能にす る。何故なら8、この試料とゲノムDNAにおける対応、領域との間の類似性が 高いからである。DNA試料とDNA保存物との両者につき同じ動物源を使用す ることは、短いDNA試料を使用する場合特に重要である。より長いDNA試料 を使用する場合には、それ程M要でない。この種の短い試料につきスクリーニン グしてDNAを選択した後、これを単独でまたは組換ファージもしくはプラスミ ドとして使用することにより、同じ動物から得られた或いはヒトを含む他の動物 から得られたDNA保存物においてハイブリッド化により関連DNAを選択する ことができる。選択したDNAはその分離に使用した初期の合成試料よりも長く 、したがって完全整合の領域を含む可能性が大きいので、短い合成試料を使用し て同じ動物からのDNA配列を使用すると共に、これらの試料につき選択された DNAを使用して種属間のDNAを選択するのが好ましい。
上記原理にしたがって、実質的にマニアチス等の方法により作成されたつ号ギゲ ノムDNAのクローン化保存物をスクリーニングした〔「真核DNAの保存物か らの構造遺伝子の分離」、セル、第15巻、第687−701頁(1978)) 。
上記保存物につき、全部で約6X10’lllのファージをプレート培養し、次 いでこれらを2個のナイロンフィルタ(PAL)に釣上げた(それぞれ5分およ び8分の吸着時間を用いる)、フィルタ上でのファージDNAの変性、中和およ び固定の後、高比活性標識した(0.5−1.OX 10’ c pm/pモル DNA)合成ヌクレオチド試料RAB TNF3−■を用いて保存物をスクリー ニングした(第4図) (この試料はサウザン切断およびハイブリッド化による 予備分析に基づいて選択した)、これらのフィルタを4xSSC115mMの燐 酸ナトリウム(pH7) 、10 Xデンハルト溶液、250μg/+mlのt −RNAおよび7%のSDSにおいて50℃で2時間予備ハイブリッド化した。
洗浄した後、これらを10%デキストラン硫酸塩、5xSSC,10xデンハル ト溶液、20mM燐酸ナトリウム(pH7) 、500 pg / ml t  −RNAおよび7%SDSにて標;A試料と50℃にて1晩ハイブリツド化させ た。2xSSCS1%SDS中で50℃にてこれらフィルタを洗浄した後、光学 分析にかけた。
このスクリーニングの結果、16種の二ff[性ハイブリッド化クローンを得た 。これらの16僅の陽性クローンから対応のプラークを分離し、かつTNF断片 3および4の両者から得られたDNA試料を用いてサウザンブロフトによりそれ らのDNAを分析した。それらの分析の1つにおいて、オリゴヌクレオチド試料 RAB TNF3−mおよびRABTNF4−A2−3による16種のファージ DNAのEc。
R1制限切断に関するサウザンプロットは、両試料に対しハイブリッド化するE coRIバンドを持った1種のファージを与えることを観察した。この特定クロ ーンはDNA断片を含有してTNF関連ポリペプチドの両断片3および4に対応 する試料にハイブリッド化するので、これはウサギTNF遺伝子のほぼ全部を含 有する可能性が極めて高いと結論された。
このスクリーニング法は、2種のヒトおよびネズミDNA試料を並行して使用す ることに基づいており、一方は卵母細胞注射の後に最大TNF生物学活性を示し たポリA” RNAの蔗tS濃度勾配フラクションから合成されたcDNA(実 施例3)であり、他方は非誘発培養物から得られた同等なフラクションで合成さ れたcDNAである。前者をプラス試料と呼び、後者をマイナス試料と呼ぶ。
実施例4の!a1部に実質的に記載したと同様にプラス試料およびマイナス試料 につきcDNAを合成し、ただし0.2mMのデオキシヌクレオシド三燐酸だけ を使用しかつα32P−dATP (7000Ci/ミリモル、アメルシャム社 、パツキンガムシャー、英国)を2μMの濃度まで添加した。
プラスおよびマイナスのネズミおよびヒト試料を併用して、2群のランダム選択 したネズミおよびヒト原料から得られたcDNA保存物の複製物をそれぞれスク リーニングした(実3%例4)、ハナハンおよ2びメセルソンの方法(「高コロ ニー密度におけるプラスミドスクリ・−ニック」、ジーン、第10巻、第63− 67頁(1980))にしたがってeDNA保存物の複製を作成した。マニアチ ス等により「モレキュラ・クローニング」 (コールド・スプリング・ハーバ− ・ラボラドリース出版、ニューヨーク)、第326−328頁(1982)に実 質的に記載されたように、フィルタ(ミリボア、HATF、0.45μm)にて 細菌コロニーを溶菌させた。
これら保存物のハイブリッド化スクリーニングを行なうため、同圧試料を使用し 、すなわちネズミのプラスおよびマイナス試料を使用して、ネズミのcDNA保 存物をスクリーニングし、かつヒトのプラスおよびマイナス試料を使用してヒト の保存物をスクリーニングした。さらに、これらのクローンをプラス試料につき 陽性であるがマイナス試料については陽性でない各保存物において検査した。
30.000種のクローン保存物からランダム選択された5、000゛種のクロ ーンよりなるネズミ保存物を上記のようにプラス/マイナススクリーニングした 結果、さらに分析するための55種の陽性クローンを選択した。ヒト保存物のプ ラス/マイナススクリーニングの結果は不明瞭であった。したがって、ヒ1−c DNA保存物のこのプラス/マイナススクリーニングについてはもはや行なわな かった。その代りに、下記するヒトc DNA保存物をスクリーニングした。
フ゛ラス/マイナススクリーニングにおいて、」ゴ己したiM !R55cDN Aクローンを釣上げ、かつこれらを個々に増殖させた。次いで、1晩培ffl、 た培養物(5mlのルリャブロス、10μH/mlのテトラサイクリンにおいて 増殖)からプラスミドDNAを、実質的にH,C。バーンボイムおよび6y。ド リー、ヌクレイツク・アシド・リサーチ、第7巻、第1513−1523頁(1 979)に実質的に記載されたように分離し、かつ11群の5種のクローンをそ れぞれその後の研究に使用した。これらの群のプラスミドから挿入DNAを、ヱ st1制限および次いでアガロースゲル電気泳動によって分離した。次いで、こ れら11群のクローンからの挿入物DNAをニトロセルロース膜フィルタ(0, 45μm、ミリボア社)に移して固定した〔これは実質的にE、M、サウザー〉 ・により、ジャーナル・モレキュラー・バイオロジー、第98巻、第503−5 17頁(1975)に記載されている〕。
次いで、前記したウサギTNF断片3および4からfaられた長い重複試料を使 用し2て、フィルタ結合したDNAをスクリーニングした(第4図および第5図 参照)、このハイブリッド化スクリーニングのため、先ず最初にこれらフィルタ を20%ホルムアミド(混合床樹脂を用いて脱イオン化したもの) 、5XSS C,5Xデンハルト溶液、5mMのEDTA。
50mMの燐酸す;・リウム緩衝液(pD、5 )および20μg/mlのイー ・コリDNA (7分間煮沸して変性させかつMSEソニブレブ150型音波処 狸器により3 X 1111in % 25−30μにて音波処理したもの)で 42℃にて1晩予備ハイブリツド化した0次いで、これらフィルタを、42℃に て標識法1′4DNA (実施例6参照)(7分間煮沸して変性したもの)と2 0%のホルムアミド(混合床樹脂ムこて脱イオン化したもの)と5XSSCと5 ×デンハ月/トン容液と5mMのEDTAと25mMの燐酸ナトリウム緩衝液( pH6°5)と20μg/mIのニー・コリDNA (前記と同様に作成)との 存在下に40時間培養した。フィルタを2XSSCおよび0.1%のSDSの存 在下に35℃にてそれぞれ1時間2回洗浄した後、これらを光学分析した。
1つの群(群6)は、断片3から得られた試料を用いて1種のプラスのクローン を与えた。したがって、この群の5ftの個々の膜を実質的に上記したようにス クリーニングし、かつ両者とも同一の2種のプラスクローンを分離した。このク ローンをp−mTNF 1と呼ぶ。
次いで、予めニック翻訳によって放射能標識したp−mTNF−1のRsaI断 片によって55種のプラス/マイナスクローンの収集物をスクリーニングし、他 の2種の陽性クローン、すなわちp−mTNF 2およびp−mTNF 3を選 択した。
次いで、これら3種のクローンの全てがポリA”RNAからTNF−活性mRN Aを選別しうろことを確認した。これを行なうため、選定したクローンを釣上げ かつこれらを個々に増殖させた0次いで、プラスミドDNAを1晩培養しまた培 養物(400μEのルリアブロス、10μg/mlのテトラサイクリン)から分 離した〔これについてはプレイブランク等、[均質熔解およびポリエチ!ノンー グリコール沈澱によるイー・コリプラスミドDNAの精製方法」、モレキュラ・ バイオロジカル・レポート、第9巻、第191−195頁(1983)に実質的 に記載されて:る〕。
次いで、約3011gの各調製物をNAC332ブレバツクカラム(BRL社、 ノイーアイセンベルク、西ドイツ国)にて業者により11i=Jされた条1′− Fを用いて積替し、エタノールでDNAを沈澱させ、これを再熔解させると共に 、EeoRl(イーリンガ−・マンハイム社、西ドイツ国)で切断し、これをフ ェノール抽出して再沈澱させた6次いで、この切断されたプラスミドDNAを実 質的にカファトス等「ドツト・ハイブリッド化法による核酸配列同属性および相 対的濃度の決定」、ヌクシーi−/す・アシッド・リサーチ、第1541−15 52頁(1979)に実質的に記載されているように膜に結合させ1、ただしこ の場合+11ニトロセルロースフイルタの代りに遺伝子スクリーンにニー・イン グランド・ヌクレア社、ボストン、マサチュセッツ州)を使用し;(2)酢酸ア ンモニウム濃度をIMから2Mまで増大させ、かつ(3)これらフィルタを減圧 下で処理せずに、チャーチおよびギルバートによりプロシーディング・ナショJ ・ル・アカデミ−・サイエンス・USA、第81巻、第1991−1995頁( 1984)に実質的に記載されているようにUVで処理した。
次いで、フィルタ結合したE e o RI切l折ブ)スミドDNAを、ポリ八 ″RNA (卵母細胞の注射の後に予め最大TNF活性を示した蔗糖濃度勾配) うクシ3ンからのもの、実施例3参!すとのハイブリッド化によってスクリー・ ニックした。
この結合し7たRNAをパルボス等、「ネズミβZマイクログロブリンcDNA クローン:1ンアmRNAに対応するc DNAクローンのスクリーニング方法 」、プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエンス・U SA1、第 7;(巻、第22532257頁(I981)に実質的に記載されているように 溶出させ、ただしこの場合[11RN八を51μgのポリA−RNA (オリゴ dTセルロー・ス)の存在下に溶出させ、かつ(2)フェノール化する代りにR NAを2回沈澱させた。
回収したRNAを実施例3に記載したと同様にアフリカ産カエルの卵母細胞中へ 注入し、かつ適当な培養期間の後(同じ〈実施例3参照) 、TNF活性につき 培地を分析した(実施例3参照)、上記ハイブリッド選択を用いて、p −m  T N F−1、p −m T N F −2およびp −m T N F − 3の挿入物のそれぞれがポリA“RNAからTNF活性RNAを選択することを 確認した。
次いで、制限分析によって3種のネズミTNFクローンを分析した(第6図参照 )、これらの分析は、3種のクローンが同じRNAから生じ、したがって同じ遺 伝子から由来するεとを示した。これらクローンの詳細な制限マツプを第6図に 示す、これら3種のクローンは、それぞれ約±1550、±350および±10 00塩基対のTNF関連挿入物を有した。
さらに、p−mTNF−1およびp−mTNF−3からの複合挿入物における完 全cDNA配列をマキサム−ギルバートの技術(A、M、マキサムおよびW、ギ ルバート、プロシーディング・ナシシナル・アカデミ−・サイエンス・USA。
第74巻、第560−564頁(1977))を用いて決定した。これから得ら れた配列およびアミノ配列を第7図に示す。
第7図を参照して、ここにはクローンp−mTNF−1およびp−mTNF−3 の配列決定から得られた複合TNF関連DNA配列における1644ヌクレオチ ドのヌクレオチド配列が示されている(クローンp−mTNF−10CD N  A挿入物は3′非コード化領域を有しかつATG開始コドンまで延在している( 第7図参照))、 p−mTNF−3のcDNA挿入物はネズミブレTNFに対 する全ツー 1部間列と5′非コード化領域の1部とを存する(第6図参照)、 この配列についてはヌクレオチド1から1644まで番号付けされている。
全枠内(ATCおよびTGA)は、推定ネズミプレーTNFの開始および停止コ ドンを意味する。破線で示した枠(ヌクレオチド1614−1619および16 30−1635)は、推定のAAUAAAポリアデニル化信号を示している。連 続する読み枠が、開始コドン(AT(1;)と停止コドン(TGA)との間に存 在する。この読み枠におけるコドンによってコードされるアミノ酸は、慣用の1 文字記号を用いてこれらのコドンの下に示されている。ネズミTNFの推定信号 配列(下記するヒトTNFの部分N−末端アミノ酸配列と比較して決定)を、こ れらアミノ酸の下に破線で示す。しかしながら、ネズミTNFはヒトTNFに比 較して成熟蛋白のN−末端にまたはその近くに2個のアミノ酸欠失部を有するの で、成熟ネズミTNFの第−N−末端アミノ酸としてのロイシンの確認はヒ)T NFについてと同様に精製された原ネズミTNFの蛋白配列決定にしたがうこと を了解すべきである。第7図におりる推定の成熟TNF配列は実線で示されてい る。このアミノ酸配列における実線枠は、グリコジル化信号(N−X−3/T) と21!itのシスティン(C)残基とを示し、これらはジスルフィド結合に関 与すると思われる。
−) ヒトTNF−特異性cDNAクローンの分離ヒトTNF−特異性cDNA クローンを選択するため、先ず最初に1群のヒトTNFcDNAクローン(上記 eo、ooo種のcDNAクローンの保存物からのランダムに選択したもの)を ニトロセルロースフィルタ(直径0.45μm1ミリボア社)で増殖させかつこ れらを熔解させると共に、D、ハナハンおよびM、メセルソン、ジーン、茅10 巻、第63−67頁(1980)に実質的に記載されているようにフィルタへ固 定した。この保存物をネズミTNFcDNA (p−rnTNF−1) (この 断片は成熟ネズミTNFに対するコード領域の1部と重複する、第6図および第 7図参照)からのPvuII−PvuIr制限断片によってスクリーニングした 。このDNA断片をアガロースゲル電気泳動によって精製し、かつこれをP、W 、J、 リグビー等、ジャーナル・モレキュラ・バイオロジー、第13巻、第2 37−251頁(1977)に実質的に記載されているようなニック翻訳によっ て放射能標識した。このハイブリッド化のため、ネズミTNF−特異性c DN Aクローン(p−mTNF−1)を分離するために使用したと実質的に同じ条件 を使用した。
コロニーに対する比較的大きいバックグランドを認めたが、1つのクローンは極 めて大きい信号を発生した。この結果を前記と同様にサウザンハイブリッド化に よって確認し、このクローンをp−hTNF−1と名付けた。ゲノムヒトDNA 保存物(上記ウサギゲノム保存物につき実質的に上記したと同様に作成)から、 同じ旦vuI[−PvulI試料につき多数の陽性クローンを選択した。
第8図を参照して、ここにはp−hTNF−1の部分制限マンフ゛が示されてい る。 p−hTNF−1におけるTNF−関連挿入物は長さ約1650塩基対で あり、16Sヒ)TNFmRNAフラクションから得られた全cDNA寸法に対 応するのに必要な寸法を有する。
次に第9図を参照して、ここにはp−hTNF−1のc DNA挿入物における 1606個のヌクレオチドのヌクレオチド配列が示されている。この配列にはヌ クレオチド1〜1606まで番号付けした。実線枠(ATGおよび70人)は、 flI定のヒトプレーTNFの開始および停止コドンを示している。
連続読み枠が、開始コドン(ATC)と停止コドン(TGA)との間に存在する 。この読み枠におけるコドンによってコードされるアミノ酸は、慣用の3文字記 号によってコドンの下に示す、ヒトTNFの推定信号配列(誘発U937t[胞 (後記)から精製された原ヒ)TNFの部分N〜末端アミノ酸配列と比較して決 定)を、これらアミノ酸の下に破線で示す。
成熟しトTNFについては実線で示す、成熟しトTNFはグリコジル化さ、れて いないと思われる。これは、ヒI−TNFコード配列にグリコジル化信号が存在 しないことにより裏付けられる。しかしながら、成熟ヒトTNFアミノ酸配列に は2個のシスティン(C)が存在する。これらのシスティンはジスルフィド結合 の形成に関与すると思われる。
実施例1O:ヒト細胞からのTNFの精製第10図は、TNF産生につき誘発さ れたU−937細胞の培地からTNF様ポリペプチドを精製するための本発明に よる方法の1具体例を略図で示している(実施例2参照)。
第10図に示した本発明の具体例におけるように、数種のU−937誘発培地を 65,000耐がflられるまで一80℃にて集め、この量はアミノ酸配列決定 および抗体作成につき充分量のヒトTNFを与える量であると思われる。この収 集した溶液は約3.0 X 10’ U TNF/a+1を含有しかつ約2.7 X10’U TNF蛋白蛋白比活性を有し、TNF活性は前記と同様に測定した (実施例1参照)。
(alTNF含有培地の濃縮 37℃の温室で培地を解凍させ、かつ解凍した後直ちにこれを冷室(4℃)に移 した。この65.0OOa+1の収集物をベリコンカ七ノド系(ミリポア社、ペ ンドフォード、マサチューセッツ州)により約80倍濃縮した。この培地を10 0.000ダルトンの公称分子層範囲(nmwl)を有するベリコン膜力セット および30,000ダルトンのnmwlを有するペリコン膜力セットに順次に通 過させた。殆んどのTNF活性は100,000ダルトンのカセットを通過した が、30.000ダルI・ンのカセットにより保持された0次いで、透析濾過に よって30,000ダルトンの保持培地を20mMのエタノールアミン−HCI (EA−CI) (pt19.0 )緩衝液で置換した。濃縮および透析濾過の 後、81OI111ノ溶液は6.0 X 10’ U TNF/mlを含有しか つ約6.8 x 10’ U TNF/蛋白■の比活性を有した。
山ン イオン交換クロマトグラフィー a縮培地のヒ)TNF活性をその他糸(の蛋白から分熟し、その際陰イオン交換 カラムに対するTNFの結合親和性を利用した。多くの陰イオン交換クロマ)・ グラフ装置が当業者に周知されているが、調製用モノ−Qカラム(直径lemx 11国、ファルマシア社、ウプサラ、スエーデン国)を選択した。
この寸法のカラムは約200蜜の蛋白の1荷容量を有する。
このカラムを20mMのEA−CI (pH9,0)で平衡化させた後、200 m1の濃縮物を2 ml/ winの流速で加えた0次いで、10 mM EA −CI (pH9,0)において0〜0.4MのNaC1の範囲の直線濃度勾配 を用いて結合蛋白を分画した。
溶出したTNF活性はフラクション24近傍にピークを有し、これを約0.16 MのNaC1の塩濃度で溶出させた。この装填と濃度勾配とを3回反復して、T NF活性を有するフラクションを集めた。これらの集めたフラクションは3.6 X10’U TNF/mlを含有しかつ1.I X 10@U TNF/蛋白■ の比活性を有した(第10図参照)。
各試験に使用した蛋白の量はモノーQカラムの装填範囲に丁度一致したので、分 離は最適ではない、したがって、最初のモノーQカラムからのTNF含有収集物 を他のモノーQカラムにi1M遇させることC,7決定した。先ず最初に収集物 を2×10100Oの10mM EA−CI (pH9,0)に対し4℃にて1 晩透析し、た。次いで1、”のカラムを同じ緩衝液で平衡化さ一1J、−た後、 カラム上の収集物を20mMF、Δ−CI (pi(9,036=おけるO−0 ,2MのN、aCIの直線的埃濃度勾配で溶出さセることにより分画した。得ら れた溶液は1.1X10’U’T N F / mlを含有しかつ2.3 X  10’ IJ TNF/蛋白■の比活性随有したく第10図参照)。
(C) ゲル濾過 次いで、分子量の差を利用して前記溶液を分画し2だ。多数の適当なゲル濾過系 が当業者に周知されているが、500=60、000ダノトトンの蛋白の分画範 囲を有するTSK−G2000SWGカラム(LKB社、ブロマ、スエーデン田 )を選択した。七ノーQ収集物を50mMのトリス−HC1(pH7,4)にお ける2X1000mlのIM NaC1に対し4℃にて1晩透析192、かつ透 析物の容積をスビー」′・バック濃縮装置(サバント社、ヒフクスビル、二1− ヨーク)を用い【急速茅発により0.851slまで濃縮した。ゲル濾過カラム を5QrlIMトリスーHCl <pH1,4)におけるIM NaC1で平衡 化させた後、収集物をこのカラムに1ml/11inの流速で通過させた。約4 0.000ダルトンの蛋白が溶出した領域にTNF活性を検出した。この分画の 後、TNF含有溶液は3.4 X 10 UTNF/mlを含有しかつ約1.1  X 10’ tJ TNF/蛋白■の比活性を有した(第10図参照)、この 精製は、U−937細胞培地からほぼ400倍にTNFli製したことに相当す る。
この分画した収集物を5O3−PAGE (12%)で分析した。約17,00 0ダルトンの分子量に相当する位置に主たるバンドが観察された。ざらに、約1 8,000ダルトンの分子量には、ゆっくり移動する弱いバンドがH察された。
これらのことは、Jウヒ)TNFが2種の蛋白単位で構成されていることを強く 示唆している。
この精製されたヒトTNFを用いて、部分N−末端アミノ酸配列を決定した。こ の配列を第11図に示す、上記の付加が存する推定信号配列および成熟コード配 列を決定した。
第12図を参照して、APLに基づく発現制御配列を用いることにより、本発明 の’r N F様ポリペプチドを産生させるための組換DNA分子を作成した( 第10図参照)。この作成のため、先ずヒトrNFをコードするDNA配列の5 78塩基対Aval−Hindm断片を作成しかつ精製した。この断片は、成熟 配列(第12図)のアミノ酸8から出発してヒトjNFをコードする(アミノ酸 8(Pro)に対するコドンは、6.va−1−制限部位の5′末端に位置する )。このTNF DNA断片はλgtlOcDNA保存物(上記)におけるeD NAクローンから分離したが、同じ断片をp−hTNF−、xから7%v、、王 !およびシュR1を用い°C分離することもできるである・)(実施例9(b) 参照)。
次いで、欠失TNFアミノ酸をコードするC1al−AV3■合成リンカを作成 した(第12図参照)。この断片は578塩基対のAva r−H8ndlTI  TNPII片に相補的なIn複Avalの5′末端を有した、さらに、pBR 322−trp−IFN−γと称するプラスミドの大きい方のC1al−Hi  n d Ii1断片を作成しかつ精製11.た(第12図参照)。
これら3種のDNAI!fT片を結合させた後、得られたpBR322−trp −hTNF111換Qmベクターによってイー・コリC600菌株を形質転換さ せた(第12図)1次いで、形質転換宿主を燐酸塩c街された栄養培+1! ( グリセリン、酵母抽出物、力号゛ミノ酸)に上jい′7′1.振七うフラスニj 中で37℃にて1晩発酵さセ゛た。発酵後、m体をS N) S−尿素緩衝液中 で溶菌させ、かつ菌体産すされた蛋白を3 [) 3−ボリアクリルアt!’ゲ ル電気泳勃によ、って分析り、六、。ごのゲルにはhTNF活性に対応するバン ドが観察さね1か1、Zlの活性は全イー・コリ産生蛋白の約10%に相当し1 人・い次いで、pB R322t r ph T h! Fにおけるtrp配列 の代りにp i、−14発現制御3I!配列を使用し、pBR322−P 1. 、−・]゛4・−HI L −2と名付けたプラスミドの小さい方のPs t  1−C1a 11111断片(1200tj[対)を分離しかつ精製し、た(第 12図)、第12図に示したA′、うに、この断片はアンピシリン耐性を:l− ドする1人伝j−の1部と完全PL−74制御配列トを自する。同時に、p B  R322−t r p−hrNp苓Pst頁およびC1alで制翫すると共に 、h TN Fツー 1・′配列を有する人きい方の断片を分!しかつ端製し・ たや次いで、これら2種の断片を合してpB+’2322−pL−T4−hTN Fを作成した(第12図)。
発現につき分析するため、イー・コリC600菌株をλcts、Ka♂の低コピ ー数ブラフ、ミドを合するpBR322−pL−T4−hTNFで形質転換させ た9発酵(1°51128°C124時間、次いで♂12℃、5時間)の後、こ れは全イー・コリ蛋白の約30%のTNFi性を生じたやpL−74系において 、TNF様ポリペプチドの高発現が観察されたが、この生成物は環アルギニンの 代りにヒスチジンを第2アミノ酸としてf]する変異TNFであった。変異TN Fを生ずる単一の塩基対突然変異がどうして生じたかは明らかでない、しかしな がら、原TNF(arg)配列に対する部位特異性変位(虫−塩基の変異)の後 、この手順ではもはやTNF発現が観察されなかった。恐らく、RNAの二次構 造における何らかの形態がこの現象に関与するものと思われる。
したがって、幾つかの新たな作成を行なった。第13図を参照して、pAT−1 53欠失(r o p−)を有するプラスミド153−pL−T4−hTNF− CA3 (13)を作成した。このプラスミドは、発現に際し正確なアミノ酸配 列(すなわち、Hisでなく A r g)をコードするC1al−Ava I  (rcAJ )合成リンカ−を有する(第13図参照)、。
これは、上記のようにλctsリプレンサ遺伝子と共に、またはそれなしに存在 する。
第13図に示したように、pBR322のヌクレオチドO位置にはECCR1部 位が欠失している。このプラスミドは、形質転換宿主イー・コリW3110にお いてTNFの高収量を示した(第1表参照)、シかしながら、発酵の結果は、こ の作成物が貯蔵条件下にて不安定であることを示した。
第1表 Ki2λ 1.581 37℃ 24時間 4.3%HBIOI (BA) 1 .5 ;l 37°C1晩 8.6%HBIOI 1.5:1 37’C1晩  7.3%λ4C10611,5:1 37℃ 1晩 8.3%イー・コリB 1 .5:1 37℃ 1晩 9.9%W3110 1.5:1 28℃ 1晩 2 2.0%溶菌 W3110 i、s:i 37℃ 1晩 18.0%溶菌 W3110 1°5:1 40℃ 1晩 工1.7%W311Ot、s:t 4 3℃ 1晩 10.2%W3110 10.01 37℃ 1晩 1054%W 31!0 50°0:1 40℃ 1晩 11.3%W3110 1.5:1  37℃ 1晩 15.1%37℃ 1晩 0 % 37℃ 1晩 5 % 37℃ 1晩 0 % さらに、プラスミド153−IL−T4−hTNF−CA3−ets−T4−t er (DSM3460)を作成し、こレバλεエユレブレッザ遺伝子を有した 。このプラスミドを作成するため、3′非コード領域を欠失させ、かつH4nd ■位置に合成T4末端を加えた。このプラスミドは高発現を示したが、T4末端 の結果として153−pL−T4−hTNF−CA3 (13)よりも安定性が 大きがった。(第17図参照)。このプラスミドは28℃で増殖させねばならず 、培地の添加後に42℃tこて熱誘発させねばならない。
好適具体例において、153−T4−hTNF−CA5−T4ter (DSM 3461)を作成し、これは欠失したpL部分を有し、発現ベクターのT4部分 のみを残す(第14図、第15図および第16図参照)、欠失の結果、アンピシ リンに対する抗生物質耐性を示す配列の部分が喪失した。したがって、遺伝子の 末端にテトラザイクリン耐性を示す抗生物質耐性の標識を加えた後、pL配列を 除去した。より好適なプラスミドは05合成リンカーを有する。このリンカ−は 、原TNFの最初の7個のアミノ酸(Avar部位まで)をコードすると共に、 次の配列を有する: さらに、T4末端は発現レベルに対する作用をも有する。
この結果、宿主菌株WA802において25%以上のTNFを産生ずる高発現ベ クターが得られた(第2表参照)。
W3110 1.581 37℃ 1晩 25.0%W3110 1°ski  37℃ 1晩 6.9%WA802 i、s:i 37℃ 1晩 27.5%W A802 i、s:i 37℃ 1晩 14.3%WA802 1.58! 3 7℃ 1晩 19.0%WA802200.0 : 1 37℃ 1晩 16° 3%上記し7た方式を用いて他のT N I”を作成することができる。
たとえば、成熟TNFの最初の2個の”rミノ酸−val−arg−を欠失し、 かつイー・コリで発現させた場合には−metSer−から出発するhTNF誘 導体を作成した。
この誘導体をpBR322pL−T4 iへ2 hTNFと呼ぶ。その構造は、 その他の点については」二記pBR322−pL−Tl−hTNFと同じ゛(コ ある(第12図)、。
p B R322−p I、−1゛4 A2 hTNF篭作成するため、合成リ ンカ−断片: を作成した。この断片をpBR322〜pi、−T4 hTNF片の存在下で結 合させた。
上記の作成物pBR322−pL−T4−hTNF、153−pL−T4−hT NF−CA3 (13)、153−pL−T4−hTNF−CA3−CTS−T 4 t e rおよび153−T4−hTNF CA5−T4t、srは全て、 成熟し1・TNFを開始させる最初のバリンコドンに直接融合しまたATG開始 コドンを有する(第12図2第X6図および第17図参照)、pBR322−p +、、−T4−・Δ2−h T N F’は、△2−TNFの最初のセリンコド ンに融合し7六:ATG:*トンを有する6、したがって、これらの作成物によ り産71:、される生成物は恐ら(Met−成phTNi’ (或いはl) B  II 322− pL−T、l△2 hTNFの場合にはM e t、 l− △2−itTNF)であると思われるいしかしながらN宋端メ(・オニンはイー ・コリによってその増殖または産生に際し切断され、或いi、!:所望ならば必 要に応し入手可能な酵素および切断技術を用いて産生蛋白からその後に切1折す ることもできる。
勿論、他のTNF産生宿主も本発明の方法に使用しうろことが了解されよう。た とえば、前記した発現ベクターおよび原核宿主のいずれも本発明の範囲内で使用 することができ、?)。
さらに、本発明のT N F I3ポリベブヂドをコードするDNA配列を改変 して、その発現もしくは生産物の4rl製特性を向」−させることもできる、た とえば、化学的もしくは酵素的に作成したオリゴヌクレオチドをTNFN水様ペ プチドの開始コドンの前に挿入したり、或いはこれを使用して、このポリペプチ ドをコードするDNA配列のN末端にてコドンを置換することもできる。この手 順により、一層好通な一次および高次の構造のmRNAを得ることもできる。よ り詳細には、開始AUGコドンがヘアピンの頂部或いは他の一本鎖領域のいずれ かに容易にアクセスしうる位置(すなわち二次構造によって遮蔽されていない) に生ずるように配列を設計することもできる。さらに、シャインーダルガルノ断 片の位置および配列も同様に最適化させることができる。この種の構造改変の重 要性は、たとえばり、イセレンタントおよびW、フプイエルス、rmRNAの二 次構造および翻訳開始の効率」、ジーン、第9巻、第1〜12頁(1979)に 記載されている。
本発明によるTNFN水様ペプチドの細胞生産における向上は、さらに細胞内で 使用しうる遺伝子の開数を増大させて、たとえば高コピープラスミドを用いて達 成することができる〔たとえば、B、ウーリン等、「クローン化遺伝子の増尤に 対する温度依存性コピー数を有するプラスミ1゛およびその生産物」、ジーン、 第6巻、第91−106夏ct979))。
Lまたがって、本発明の各種のTNF閃iI D N A配列を上記ベクターか ら除去j−て1thのベクターt?よび宿主に挿入し、これらによりコードされ イ)生産物の最終的産」二を向上さC′うろことが了解されようゎ さらに、本発明による’INF様ボリベノ°チドは庸;合蛋白(たとえば原核も j、(は組合−t、’; N未配置断片に結合して分泌を1:i示すると共に、 安定性を向−にさ中かつ精製を改善し7、或いはN、、を端、メy−オニンも1 .<は伯のN末端断片の切断をも向」−させる)の形態、或いはグL、−’1− NF(たとえばl乳類TNFのブL、−配列または(−の使、のIO私倍信号配 列1部;トたは全部から出発ケる)の形態、或いは成熟’T N F様ポリペプ チドの形態、或い!:J: f −m e L−TN F ll;fリベブチド の形態の産生物を全て包含1.うろこ吉を了解4″べきである。
本発明によるTNFN水様ペプチドの特に有用な1形態、或いは少なくともその 先駆体は、容易に切断されるアミノ酸或いはそのN末端に結合17だ一連のアミ ノ酸を有する成熟T N Fである。この構造は適当な原核宿主における蛋白の 合成を可能にし、この場名成71!TNFに存在しない開始信号が必要とされ、 次いで、過剰のアミノ酸をインビボもしくはインビトロで切断して成熟TNFを 産生させる。この種の方法は、たとえば米国特許第4.332.892号、第4 ,338.391号、第4.366.346号および第4,425,437号に 見られる。
さらに本発明のTNFポリペプチドは、]二記DNA配列のコドンの幾つかまた は全部につき異なる1ド/を特徴とするDNA配列によって発現に際しコードさ れるTNFN水様ペプチドをも包含する。これらの置換コドンは、これら置換コ ドンによりコードされるものと同一のアミノ酸をコードすることができる。或い は、I Jffiもしくはそれ以上のアミノ酸変化をもたらす、或いはより長い または短いTNFN水様ペプチドをもたらして産生化合物の性質を有益に変化さ せうる(たとえば、安定性の向上、熔解性の向上、治療活性の向上または半減期 の増大)をもたらすようなコドンの18:もしくは組合せを面接し、或いは欠失 させることも本発明の1部である。
r−hTNFと臨床上許容しうる投与量のアクチノマイシンDとの組合せがイン ビボにおける11ffi瘍の増殖速度に対する作用を示した。1群当り8種から なる3群の裸ネズミに5×10’ JAMA (卵巣蓬)細胞/ネズミ1匹を皮 下注射し、かつ腫瘍を7日間増殖させた。第1群には1X10sUのT−hTN Fのみを毎日病巣内(ri、IJ)接種し、第2群には同じ1日当り投与量のγ −hTNFを0.3μgのアクチノマイシンDと組合せて接種しくri、IJに て)、第3群には同じ1日投与fiのr−hTNF ←11)を0.3μg(7 )アクチノマイシンDと組合せて腹腔内(ri、pJ)注射した。8匹のネズミ よりなる比較群には処理を施こさなかった(群■)、最後に、6匹のネズミより なる群(群■)には0.3μsの1日投与量のアクチノマイシンDをネズミ1匹 当りに接種し、3匹のネズミには病巣内注射し、残り3匹のネズミには腹腔内注 射した。
毎日の注射を3週間続けた。各1!f瘍を処理前に毎日測定した。第18図およ び第19図に示すように、第■群には顕著なI!瘍増殖抑制および腫瘍の減退さ え観察され、この群はTNFとアクチノマイシンDとにより病巣内注射で処理し たものである。他の全ての群1才、比較21°tにより示されると同様な腫瘍増 殖を示した。
本発明に使用した微生物および組!fiDNA分子はドイツチェ・ヂンムルング ・ホン・ミクロオルガニスメン、ゲソチンゲン、西トイ゛ン国に1984年12 月17Fj付けで(AおよびB)並びに1984年12月270付け(C)で寄 託し7た培養物で例示され、かつ下記TNF−A−Cとして同定された: A、イー・コリDH!(λ)(p−mTNF−3)B、イー・コリDHI(λ) (p−hTNF−1)C,イー・コリC600(pt3R322−pL−T4− hTNF)。
これらの培養物にはそれぞれ受託番号DSM3159゜3160および3175 が付与された。
さらに、下記の微生物および組換i)Nへ分子をドイツチェ・ザンムルング・ホ ン・ミクロオルガニスメンに1985年8月29日付けで寄託した。
D、イー・コリW3110 (153−pL−T4−CA3−ets −T4− ter) E、イー・コリW3110 (153l−4−CA5−T4〜ter)惨 これらの寄託物には次の受託番号がそれぞれ付与された203M3460および 3461゜ 以上、本発明を好適具体例を特に参照して説明したが、本発明の意思および範囲 を逸脱することなく多くの改変をなしうろことが当業者には明らかであろう。
FIG、/ F/θB ”’ −/” ”4 h rA/F (y 3θjつ凡σ。/3 5σ74

Claims (26)

    【特許請求の範囲】
  1. 1.哺乳類の腫瘍壊死因子様ポリペプチドをこれらポリペプチドを含有する組成 物から精製するに際し、この組成物を陰イオン交換体と接触させ、陰イオン交換 体に結合せずに留まる組成物の成分を除去し、かつ前記陰イオン交換体から腫瘍 壊死因子様ポリペプチドを溶出させることを特徴とする哺乳類の腫瘍壊死因子様 ポリペプチドの精製方法。
  2. 2.腫瘍壊死因子様ポリペプチドがウサギTNF様ポリペプチド,ネズミTNF 様ポリペプチド,ヒトTNF様ポリペプチド,猿TNF様ポリペプチドおよび牛 TNF様ポリペプチドよりなる群から選択される請求の範囲第1項記載の方法。
  3. 3.腫瘍壊死因子様ポリペプチドを含有する組成物がTNF様ポリペプチドの産 生を誘発させた哺乳動物の血清,哺乳動物のプレ単核細胞ラインの媒体,TNF 様ポリペプチドの産生を誘発させた哺乳動物の単核細胞ラインおよび哺乳動物の 大食細胞、並びに哺乳類のTNF様ポリペプチドをコードし、かつ形質転換宿主 における発現制御配列に作用結合する少なくとも1種のDNA配列によって形質 転換させた宿主細胞の発酵により産生される組成物よりなる群から選択される請 求の範囲第1項記載の方法。
  4. 4.TNF様ポリペプチドを含有する組成物におけるTNF活性を分析するに際 し、前記組成物をネズミの繊維肉腫L−929細胞の存在下で約37℃〜39. 5℃にて培養することを特徴とするTNF活性の分析方法。
  5. 5.培養温度が約39.5℃である請求の範囲第4項記載の方法。
  6. 6.(a)p−mTNF−3のDNA挿入物;(b)p−hTNF−1のDNA 挿入物;(c)DNA挿入物(a)および(b)の一方もしくは両方にハイブリ ッド化しかつ発現に際しTNF様ポリペプチドをコードするDNA配列;並びに (d)前記DNA挿入物および配列のいずれかにより発現に際しコードされるポ リペプチドを発現に際しコードするDNA配列 よりなる群から選択され、T4およびpL−T4よりなる群から選択される発現 制御配列に作用結合しているDNA配列を特徴とする組換DNA分子よりなる群 から選択される組換DNA分子。
  7. 7.DNA配列が配列: 【配列があります】 よりなる群から選択される請求の範囲第6項記載の組換DNA分子。
  8. 8.DNA配列が配列: 【配列があります】および【配列があります】よりなる群から選択される請求の 範囲第6項記載の組換DNA分子。
  9. 9.pBR322−pL−T4−hTNF,pBR322−pL−T4−△2  hTNF,153−pL−T4−hTNF−CA3(13),153−pL−T 4−hTNF−CA3−CTS−T4terおよび153−T4−hTNF−C A5−T4terよりなる群から選択される組換DNA分子。
  10. 10.請求の範囲第6項乃至第9項のいずれかに記載の組換DNA分子により形 質転換された原核宿主を培養することを特徴とするTNF様ポリペプチドの産生 方法。
  11. 11.TNF様ポリペプチドが、配列:【配列があります】および【配列があり ます】よりなる群から選択される配列を有する請求の範囲第10項記載の方法。
  12. 12.TNF様ポリペプチドが配列: 【配列があります】および【配列があります】よりなる群から選択される配列を 有する請求の範囲第10項記載の方法。
  13. 13.宿主をイー・コリ,バチルスおよびストレプトミセスの菌株から選択する 請求の範囲第10項,第11項または第12項記載の方法。
  14. 14.形質転換宿主をイー・コリC600λcts KanR(pBR322− pL−T4−hTNF),イー・コリW3110(153−pL−T4−hTN F−CA3(13),イー・コリW3110(153−pL−T4−hTNF− CA3−CTS−T4ter),イー・コリW3110(153−T4−hTN F CA5−T4ter)およびイー・コリWA802(153−T4−hTN F CA5−T4ter)よりなる群から選択する請求の範囲第10項,第11 項または第12項記載の方法。
  15. 15.抗癌剤,抗腫瘍剤または抗マラリヤ剤として有効な量の請求の範囲第11 項または第12項記載のTNF様ポリペプチドと医薬上許容しうるキャリヤとか らなる医薬組成物。
  16. 16.IF−α,IFN−βおよびIFN−τよりなる群から選択されるインタ フエロンをさらに含む請求の範囲第15項記載の医薬組成物。
  17. 17.請求の範囲第15項または第16項記載の医薬組成物で哺乳動物を処理す ることを特徴とする癌,腫瘍またはマラリヤの処置方法。
  18. 18.化学療法またはインタフェロン療法によって癌または腫瘍を処置する工程 をさらに含む請求の範囲第17項記載の方法。
  19. 19.医薬上有効量のTNFと医薬上有効量のDNA転写を阻止する抗生物質と を哺乳動物に投与することを特徴とする腫瘍を有する哺乳動物の処置方法。
  20. 20.抗生物質がアクチノマイシンDであることを特徴とする請求の範囲第19 項記載の方法。
  21. 21.TNFの量が約10μg〜100mgの範囲である請求の範囲第19項記 載の方法。
  22. 22.TNFが組換TNFである請求の範囲第19項記載の方法。
  23. 23.腫瘍を処置するための医薬上許容しうる組合せ物を製造するため、蛋白合 成を抑制しまたは阻止するのに医薬上有効量のTNF医薬上有効量の抗生物質と の使用。
  24. 24.抗生物質がアクチノマイシンDであることを特徴とする請求の範囲第23 項記載の使用。
  25. 25.TNFの量が約10μg〜100mgの範囲である請求の範囲第23項記 載の使用。
  26. 26.TNFが組換TNFである請求の範囲第23項記載の使用。
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