JPS5951792A - Ｄｎａ配列、組換ｄｎａ分子およびヒト免疫インタフエロン様ポリペプチドの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の属する技術分野〕 本＠明は１）ＮＡ配列、組換ＤＮＡ分子およびヒト免疫
インタフエロン様ポリペプチドの製造方法に関するもの
である。さらに詳細には１本発明は適当な宿主生物にお
いて表現される１）ＮＡ配列に関するものである。ここ
に開示する組換１）ＮＡ分子は、ヒト免疫インタフエロ
ンの免疫学的または生物学的活性を有するポリペプチド
ｔ−暗号化するＤＮＡ配列を特徴とする。以１の記載か
ら判るように１本発明のＤＮＡ配タリりリ換Ｌ）ＮＡ分
子および方法は、抗ウィルスおよび抗腫瘍もしくは制癌
剤或いは免疫変鯛剤および方法に２いて肩出なポリペプ
チドの製造に使用することができる。

〔従来技術とその間ｋＧＩ点〕

本出願の明卸１曹においては、ネイチャー飴−第−ｇ６
巻％第２弘λ／頁（／り♂Ｑ年７月１０日）に発表さｎ
　７ｃインタフエロンの酪名法を使用する。「ｌｋ″Ｎ
Ｊ　ｑまイ／タフエロン忙ｉ５１．．（’ＩＦＮ−γ」
は免疫インタフエロンを意味する。

、２８類のインタフエロン（［ＩＦＮＪ　）がを在する
と知られている。ｍｌのインタフエロンは小型かつ酸安
定性の蛋白質であって、細胞をウィルス感染に対し、耐
性にするものである〔ニー・アイザツクスおよびジエー
・リンデンマン。

［ウィルス阻１１．ザ・インタフエロン］。

Ｐｒｏｃ　、　　Ｒｏｙａｌ、　Ｓｏｔ＋、Ｓｅｒ＋Ｂ
Ｊ　１４１７巻、第２３ｇ〜６７頁（／りｊ７）；　　
タブリュ・イー・スチュワートｎ、ｒザ・インタフエロ
ンーシステム」、スプリンガーー出版（第２版）　（／
りＪ／）（以下、ｒザ・インタフエロン・システム」ト
１う）〕。型Ｊのインタフエロンは酸不安矩性である。

机在、これらは良効に特性化ちれていない。ＩＦＮは菫
ろ細胞荷異性でるるか〔ザ・インタンエロンΦシステム
、７Ｍ／Ｊ！〜４ｔｊｊ（Ｊ、ウィルス脣異性でない。

ＩＦＮは、広範囲のウィルスに対し細胞ケ保護する。

型Ｂのインタフエロンは、自然に或いはたとえはウィル
ス、微生物、マイトジェン、ウィルスもしくは細菌性抗
原のような各種の誘発剤に呼応して、或いは抗生物質、
内複累またはその他の微生物生成物に呼応して生産され
うる〔ザ・インタフエロンφシステムｓ７Ａ”ざ〜弘り
貞〕。

極く普通には、たとえばスタフィロコッカス・エンテロ
トキシン、ガラクトースオキシダーゼ、フイトヘムアグ
ルチニン、コンカナバリン、コリネバクテリウム・バル
ブムおよび混合リンパ球培寮物のようなマイトジェンが
使用される。

さらに、型■のインタフエロンは種々の源泉において生
産されると報告ちれている。たとえば。

ＣＮＳ病における脳背髄液、フイトヘムアグルチニンに
より誘発される白血球、抗すンハ詠血清によｙ＋ｈ発δ
れるリンパ球、マクロファージおよびマイトジェンによ
り篩光込才しるリンパ球。

マイトジェンによシル！；発される扁桃リンパ球、マク
ロファージおよびヘルペスウィルスわＬ涼により誘発さ
れるヘルペス感作リンパｈ、　Ｉ曳疹ウィルスにより誘
発される風疹ウィルス感作リンパ球、リンバタ細）Ｉｔ
ｉｌ、多発ａ慣耐肺思名の骨髄。

白血病Ｔ細胞糸からのリンパ球およびバフィーコート、
人乳からまたはプラズマ７オレシスによυ短離されたリ
ンパ球などが芋げら才りる〔ザφインタフエロン・シス
テム、ｉ４／ｉ〜ｌ／１７頁；アイ・ナタン等、「ヒト
１゛−リンパ３１−鮒廁糸によシ生産される免疫（γ）
インク７エロン」、ネイチャー誌、第２２２巻、第どグ
λ〜≠３頁（／りざ／）；エム・ニー・ヘラ−等、「人
乳リンパ球によるリンフ才力インの生産」、インフェク
ション・アンド・インミュニティ＊　Ｍ’−３，２巻、
第６３２〜３６負（／り１ｒｌ）’、ジーΦアール・ク
リンベル等、［ヒト扁桃リンパＭによるインタフエロン
およびリンクオドキシンの分離生産」、セルラ轡◆イン
ミュニテイ、第２０巻、第１１７〜り６負（／り７ｊ）
；　エム轡プレイ等、「マイトジェンによりヒト白皿球
中ＶＣ誘発されるインク７エロン：生産、部分オＮ製お
よび％性化」、ヨーロピアン・ジャーナルーインミュノ
ロジー、ａｉ。

巻、第１１７７〜♂３頁（１５’ｒＯ）ｉエム・ウィラ
ノウスカースチュワートおよびダブリュ・イー・スチュ
ワートＩ１．ｒインタフエロンαおよびγの生産に開力
するヒト白血球数の演り定」、ジャーナル・インタ７エ
ロンーリサーチ、第１巻、第２３．９〜ケ≠負（／Ｐ♂
／））。この異質性金考謔し、マイトジェン刺戟の際の
型１のＩＦＮ生産は、リンパ球の供給源および使用する
単離法に依存すると思われる。

ウィルスおよび腫瘍もしくは癌に対するインタ７エロン
治療が、樵々の投与量および幾つかの投与方式で行なわ
れている〔ザ・インタ７エロン・システム％　ｍ３ｏｇ
〜３λλ頁〕。たとえば。

インタフエロンは経口的に、接種により（静脈内、筋肉
内、鼻孔内、皮内νよび皮下経路）、ならびに１桑、軟
骨およびスプレーの形態で刹効に投与されている。進′
畠、１０〜１０　単位の投与ＩＳにで毎日７〜３回投与
される。治掠佇度は、処置さｆＬ心、勧名２よひその状
態Ｖこ依存する。

たとえば、ウィルス感染（儂一般に数日１１１１乃至−
逸聞にわたり毎Ｈ′またはｍＦ−１，２回の投与で処置
され、まｆｃＢ！ａ瘍およびブ所は一般に数カ月１１こ
け数年にわた＃）４０日または毎日多数回の投与で処置
される。勿論、成る患者に対して最も〃ノ朱的な加法は
担当医によシ決定延れねばなしツー、たとえば病気経過
、従前の加法およびインク７エロンに対する。信者の反
応なと周知の因子を考慮して投与方式および投与量を選
択せねはならない。

抗ウィルス剤として、ｆｉｕＩＦＮは次のものケ装置す
るために使用されている：呼吸器感染〔テキサス・レポ
ート、第弘ざ６〜り６負〕；単純庖珍角膜炎〔テキサス
・レポート、第Ｖ７７〜！ｏＯＱ；　　アール・サンド
マツハ−、ｒｋｌｉにおける外因インタフェロ／」、イ
ンターナシヨナル・バイＯロシ−’ｆｉ１ザ番ハーグ、
７ブストラクト／％Ｗ、２／／／　、ｉタタ負（／９７
１）Ｊ　ｉ急性粘膜出血しテキサス・レボ−）ｋｆ４４
Ｊ’ｏ／〜／Ｑ負〕；アデノウィルス角結膜炎（ニー・
ロマノ等、ＩＳＭメモＩ−Ａ＃／ｊ（／Ｐ７Ｐ年ｉ。

力）」；水痘庖珍〔テキサス・レホート、第３１／〜／
ｊ負」；サイトメガロウィルス感染〔テキサス・レポー
ト、第！、２３〜．２７負）；およびＢｆｉ肝炎〔テキ
サス拳レポート、第ｓｉｔ〜λ２負〕。さらに、ザ・イ
ンタフェロン・システム、第３０７〜２１頁も参照する
ことができる。しかしながら、抗ウィルス剤としてのＩ
ＦＮの大規模な使用は、従来入手し得たよシも多倉のＩ
ＦＮを必要とする。

ＩＦＮは、抗ウィルス作用の他に他の作用ｔも有する。

たとえ＃−ｊ′、これはコロニー刺戟因子の作用に拮抗
し、造血性コｏニー形成糺胞の成長を阻止しかつ顆粒球
およびマクロファージ先駆体の正′ｇな分化を阻害する
〔テキサス・レポート＊　第７４’　３〜４４　Ｐ　負
）。サラニ、ＤＭＳＯ処Ｑ會阻止する〔テキサス・レポ
ート、第Ｖ２０〜．２♂負〕。

δらに、ＩＦＮは九反反ルし、の可振においても役割を
演する。たとえは、抗原に関する便用の射および時期に
依存し又、ＩＦＮは生体に２いても試蛤宍管内において
も兄疫強化作用および免役抑制作用の両省を示し９る〔
テキサス・レポート、第３５７〜６５？頁〕。葛らに、
９′雛異感作リンパ潔は、抗原との接触後にｌＦＮを主
座することが観察されている。したがって、この棟の抗
原防発されたＩＦＮｖｉ兄疫反応のＦＡ整剤となって、
循環抗原レベルと細胞免役の発現との両者に影／＃を与
えることができる〔テキサス・レポート、第３７０〜７
≠負〕。さらに、ＩＦＮはキラーリンパ球の粘性および
ａＣ体−依存性ｎＪ胞−媒介された細胞毎性を高めるこ
とも知られていル〔アール−アール・パーベルマン等、
ｒヒトにおける天然のおよび抗体−依存性細胞−媒介ち
れた細胞毎性のインタフ二ロンによる増強」、ネイチャ
ー誌、＃４ＪＪ７を、第２．２７〜．２３負（／り７り
）；ビーｅビバリーおよヒティーーナイト、「死亡は自
然にやって来る」、ネイチャｆＪｆ、、第一７１巻、第
ｌ／り〜２０頁（ｌり７Ｐ）　ｉテキサス・レポート、
第３７３〜ｇθ頁；ジェーΦアール・バドルストーン等
、１−インタフェロン僚沃後のヒトにおける天然キラー
ｈ胞の肪発および速度論」、ネイチャー誌、第、２Ｌ２
巻、第４１１７〜／り貞（ｌり７り）；ニス番フィンホ
ルン等。

［ヒトにおけるインタフェロンおよび自然細胞語注、１
１．外米白血球インタフェロンを受ケた患者の研究Ｊ　
、　ＡａｔａｏＭｅｄ、５ａａｎｄ、、ｙ７４．！ｏ４
を巻、纂≠７ｌ−ｆｆＪ頁（ｌり７１）〕。キラーリン
パ球および抗体−依存性細胞一媒介逼れた細胞毒性は、
ＩＩＩ！　ｉ　ｌｂＪ胞に対する免疫学的攻撃に直接的
にまたは間接的匹胸与することができる。

したがって、抗ウィルス剤として使用する他、）ｉｕｌ
ＦＮは抗腫瘍２よひ制癌僚法において、或いは兄疫ｉｆ
！１４剤およびその方法において有力な用途會廂するし
ザφインタフェ四ン・システム。

第ＪＡＹ〜、２／負％　第３り弘〜タタ頁］。机仕、Ｉ
ＦＮは、多くのＭ６ＩＪ！／ｌにおいて多くのａｆＡの
ｊ庫揚の成長に影響を与えゐことが知られているＬ−ｖ
′やインタフエロン嗜システム、４．２り２〜ｊ　０４
’　ｊＪ　〕。

他の抗腫瘍剤と同様、インクフエロンは小捕場に対して
使用ずれは丑に市゛幼でめると思わ７’Ｌる。

動物ＩＦＮのｔｙｌ、腫瘍幼果は投与鉦と時ルｊとに依
存するが、動性レベルより低い碇度で示されている。し
たがって、多くの研究２よび臨床試鮫が、ＨｕｌＦＮの
抗腫瘍および制ｍ　’Ｆ子性につき行なわれ続Ｇプてい
る。これらは、たとえは骨肉腫。

急性骨髄性白血病、多発性慣髄腫およびホドキンス病の
ような幾つかの悪性病の処振を包含する〔テキサス拳レ
ボ−）、ｇ４４グー２〜３！負〕。

これら臨床試験の結果は有望であるが、ＩＦＮの抗腫瘍
、制５市および免疫変調のための用途は精製ＩＦＮの光
分な供給源が欠如するため著しく　１ｔｉｌｌ約されて
いる。

生化学レベルにおいてＩＦＮは、少なくとも３極の蛋白
質、蛋白質キナーゼ〔ヒー・レフロ−％、　　Ｉ−イン
タ７エロン、二ｇ知ＤＮＡ１−よび鍬白負ヅ鼾酸化Ｊ　
、　）’ｒｏｅ、　Ｎａ１１．Ａａａｄ、　Ｓａｉ、Ｕ
ＳＡ。

第７３巻、第３７０７〜／／負（／り７６）；　ニー・
シー彎ホバネシアンおよびアイ・エム・ケール、］°イ
ンタフエロン処理細胞からの（−２／　　Ｓ　／　）オ
リボアテニル（ｐｐｐＡコ’−ｊＡ、２’−ｊ’Ａ）合
成酵素および蛋臼買キナーセ」、ヨーロビ７ｙ・ジャー
ナル・バイオケミストリー、第２３巻、第！／ｊ−２６
負（ｌり７り）〕、（，２／　　ｓ　／　）オリゴ（Ａ
）合成酵素〔工−−ジーーホバネシアン等、１インタフ
エロン処理細胞からの酵素による蛋白賀合成の低分子掻
抑制創の合成」、ネイチャー誌、第、２６ｇ巻、第５３
７〜３り頁（ｌり７７）；ニー・ジー・ホバネシアンお
よびアイ・エム・ケール、ヨーロピアンやシャーナル−
ハ＃’；ｒミスドリー、上ｆｉαノおよびホスフォジェ
ステラーゼ〔ニー・シュミット等、［インタフエロン誘
発ホス７オジエステラーゼ分解（−４’−−１’）　、
ｄ−リコイソアデニレートおよびｔＲＮＡのＣ−Ｃ−Ａ
床端−１、Ｐｒｏｃ、Ｎａｋ　１．Ａａａｄ、　Ｓｃｉ
、　ＵＳＡ、第７６巻、第≠７ｇに〜９．２負（１５？
７り）ノの形成ｒ酷元する。

ヒトインタフｘ　ｔ：＋　ン（１’　ｒｌｕ　ＩＦ’Ｎ
　Ｊ　）　（ｒユ３つのグループ、すなわちα、βおよ
びγしこ分類６れている。これらの９ち、αおよびβイ
ンタフエロンｒＬ版安）ヱ１生の型１のインタ７エロン
でめル一方、γ−インクフエロンは敞不妥定憔の型１１
のインタフエロンである。さらに、こ扛ら３拙のＨｕｌ
Ｐ’Ｎはすし原性において互いに４１］違している。

ＨｕＩＦＮ−ａおよびＨｕ　Ｉ　Ｆ　Ｎ−βば、１４ｕ
ｌｌ”Ｎ−γより良好に上注化されている。ｆｉｕｌＦ
”Ｎ−γはクリコ蛋白質であると報告されている〔ニー
・ミズラミ令、］−インタフ二ロンのクリコシル化」、
ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー。

第、２５３巻、第７乙／、２−／Ｊｊ（／２７ｇ）；ザ
・インタフエロン・シスナノ１．第１０７〜／θｇ頁〕
。

芒らに、これは４ＬＯ９θＱＯ〜４１．乙、　ｏ　ｏ’
ｏタルトンの分子量′ｆ：有すると報告されており＋（
”のクリコシル化型はｉ、ｓ、ｏｏｏ〜７０．θθＱダ
ルトンの分子量を有するＥＪ能性がんる。敵不安定性（
ｐ１４．２において）である他、ＩＰＮ−ｒｒｉｓｌ、
ＣＶＣ”Ｃ／Ｑ１）Ｊｉ　Ｈに欠隔すると稽古されてい
る。みらに、仄の文ｍ１ｋｋ照することができる〔テレ
イーｆ、上６α；ワイ・クー・イツブ等、［ヒトγ（免
疫）インタフエロンの部分和装２よひ轡扛化」。

Ｐｒｏｃ、　　Ｎａ　ｔ　ｌ、　　ノ：Ｌｃａｄ　、　
Ｓａ　ｉ、　　ＵＳＡ　、　　第　７　δｌ、！、ｉ／
６０／〜１，０３頁（／ｙｌ／）；　　エムφビー・ラ
ングフォード等、１−ヒト免疫インタ７エロンの大規模
生産および物理化学的時性化」、インフエクション・ア
ンド・インミュニデイ、ｊ４Ｊ！：％、第３ｔ−グ／貞
（／り７９）〕。延らに、Ｉｆｉ″Ｎ−γはＩＦＮ−α
筺たはＩＦＮ−βとは異なる前１１月民レセプタを認識
するとも報告されている〔ニーーニーΦブランカおよび
シーーバグリオニ、［型１および■のインタフエロンが
異なるレセプタを鳴するという証明」、ネイチャー醍、
第コタＶ巻、第７６ｇ〜７０頁（／り♂／）〕。

抗ウつルス活性の他に、ＩＦＮ−γは抗腫瘍活性を示す
ことも報告されている。さらに、ｌ’Ｎ−αおよびＩＦ
Ｎ−βと比較して、ｌ’Ｎ−γのりＬ腫局泊性は少なく
ともねず与ｉ／ｃお・いで１１事瘍の佼退をも１こらず
と思わ７Ｌる。さらに、天然ヤラー細胞の７古性はｌ’
Ｎ−αおよび１１・゛へ一βにつき観察ちれたと同様な
水準に逢ぜず、　　Ｉｆｉ’Ｎ−γはＩＦ′１〜−αお
よびＩＦＮ−βよりもその子ｌｉＪけｊりがカンクリオ
シドの循環レベルにより低いものと思われる〔エッチ・
アンケル等、［ねずみの繊維芽卸１胞１（型Ｉ）および
免疫（型］）インタフエロン：ガングリオシドに対する
観和件およびねず与の白肌ｖ４Ｌ　−／−２／　０　、
Ｒ細側に対する抗ウィルスおよび抗成長効果における顕
著ｌ相違」。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ
、　第７７＠、　第Ｊ！、２ｇ〜３．２頁（／り１０）
〕、〕Ｉ、−１がって、ＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−βに
対し貧勃な反比・を示す〃（１１胞および腫瘍は、ＩＦ
Ｎ−ｒによって幼果的に処置されうると思われる〔たと
えは、フレイン％、Ｊ、Ｎａｔｌ、　Ｃａｎｃｅｒ、Ｉ
ｎ５ｔｉｔｕｔｅ　、　第６　／巻、第ｇり１頁（／り
７ｇ）逼　バルン等、アブストラクト拳エヌ９ワイ９ア
カデミ−・ザイエンス、第／／Ｍ（／り７り年ＩＱ月２
３〜２６日）；ブラロツク寺、セルラー・インミュノロ
ジー、第≠２巻、第ＪＹＯ〜２≠負（／りＩｔ））：ビ
ー・ワイ・ルピンおよびニス・エル番グプタ、「抗ウィ
ルスおよび抗繁殖剤としてのヒトの型ＩＪ？よひ型ｌの
インタフエロンの幼果の札違Ｊ　、　Ｐｒｏａ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｏｉ、　　ＵＳＡ　、　第７　
７　巻、　ｍｊ　タλｊ〜３−員（ｌりｔｏ））。

ＨｕｌＦＮ−７’は、多くのヒト蛋白質と同様に多形性
であってもよい。したがって、特定固体の細胞はよ多一
般的なＩＦＮ−ｒの種類におけるＩＦＮ−ｒの８ｉ類を
生産することができ、これらイ玉類はその一部であるａ
１類の原型と生理学的に類似しているが、構造上僅かに
異なっている。したがって、ＩＦＮ−γの蛋白質構造は
一般に明確であるが、特定の１体はそれとは僅かに異な
るＩＦＮ−γを生産するであろう。

）１ｕＩＦ’Ｎ−ａおよび）ｌｕｌＦＮ−βの両極類は
１組換ＤＮ人技術を用いて適当な宿主において生産笛れ
ている〔たとえｒよ、ニスφナガタ等、［イー・コリに
訃けるヒト目皿モ）、インタフエロンＹ占性をイアする
ポリペプチドの脅威」、イ・イチャー誌、第一ざグ巻、
第３７６〜コＯ負（ｌりｇｏ）（ＩＦＮ−α）およびア
ール・ナリンク等、１−人Ｉｉ３％菌におけるヒト繊組
１・Ｋ山ノｊ包インタフエロン遺伝子の六組」、ネイチ
ャー誌、第−ｒ７巷、第一り３〜コ０コ角（／りＬυ（
ＩＦＮ−β）〕。この株の技術は、δらにＨｕＩＦＮ−
αおよびＭｕＩｌ”Ｎ−βの的−性化および初ル」の臨
床臥験紮口」能にした。

現在、入手しうる極めて少ｉｆＥの１ｉｕｌＦＮ−γが
繊紙培養において増殖さｉｔたヒト細胞糸により、或い
はより一蚊的には廂徹試料から集められた白血球から生
産されている。これらの方法は低収率であゃ、かつ高価
なものである。これらは、さらＶこ特性化を行ない、或
いは臨床試験を行なって抗ウィルス活性、抗腫ＷＩ活性
ま／こは免疫変調活性のＩＦＮ−γを続開したり、或い
はこれらの活性をｆｉｕＩＦＮ−αお↓ひＭｕｌｋ’Ｎ
−βの抗ウィルスｈ　ＬＬ庖１ｋｌｔふ・よび免疫変調
活性に対して比較するには充分なＭｕＩＦＮ−ｒｆ与え
ていない。

〔発明の目的〕

本発明は、ｋＬｕｌＦＮ−ｒを暗号化するＤＮＡ配列を
位置決定しかつ分離し、これら配列により適当な宿主を
形負転挾させ、それによｐ　１）ＮＡ配配列２換換Ｄ８
分子ならびにヒト免疫インタフエロンの免疫学的もしく
ｔよ生物学的活性を示すポリペプチド、物にこれら活性
を示すグリコジル化ポリペプチドの生産におけるこれら
配夕１ｊおよび分子の使用方法全提供することにより上
記の間馳を解決する。

本発明によれは、抗ウィルス、抗膓瘍、制癌または免疫
変調剤および方法に使用するための免疫学的もしくは生
物学的ＨｕｌＦＮ−γの活性を示すポリペプチドを得る
ことができる。本発明は、これらポリペプチドを従来得
られなかったような量ならひに方法で生産することを可
能にする。

以下の記載から判るように、本発明の１）ＮＡ配列ｐよ
び組換ＤｊＱＡ分子は、過当なＮＮ主におい・てＨｕｌ
ＦＮ−１の免疫学的もしくは生物学的活性を下すポリペ
プチドの生Ｉｌｉ　ｋ　Ｔｈ令することができる。δら
に、過当なイＭ生におけるこれりＤＮＡ配列おまひ組換
ＤＮＡ号子の快表は、これらポリペプチド’／ｒ　ｆｋ
ｋ　＋：ｊ化する多りの遺伝子の生ｍｔ−”Ｊ能にする
。これらポリペプチドおよび遺伝子の分子構造および性
質は、したがって容易に決定することができる。これら
ポリペプチドおよび遺伝子は、細土中で生産きれたまま
で或いは適当に訪尋体化もしくは改変した伎にこれら生
産物目釘の生産を検出しかつ向上させ。

さらに抗ウィルス、抗腫瘍、制癌もしくｔよ免疫変調剤
および方法に使用するための組成物および方法において
有用である。

〔発明の散点〕

上記から明らかなように１本発明の基本的局面は、Ｈｕ
ｌＦＮ−ｒの免疫学けりもしくは生物学的活性を示すポ
リペプチドｅｌｌＫ号化し、或いは少なくともＤＮＡ配
列の収束物からこの柚のＬ）　Ｎ　Ａ配夕１」の選択に
口Ｊ能ＶＣする仁と會舟像とする１）　Ｎ　Ａ配列を提
供することであり、この１）ＮＡ配列はＤｈＮ　Ａ神入
吻γ０．γ１．γ２　＋　１５　＋γ４゜γ５．γ６＋
ｒ７＋ｒ８＋７”Ｐ＋ｒｊ［１１γｌ＋＋上記１）ＮＡ
挿入物のいずれにかヒブリド化するＤＮＡ配列。

天β１合成もしくは牛舎ｈｘ、　ＤＪ’−、突然変異、
年−もしくは多重の前ｔｉｉ　Ｄ　Ｎ　Ａ配列もしくは
仲人物のいずれかに対する塩基置侯、削除、押入および
逆転を宮め全ゆる供給踪から侍られるＤＮＡ配夕！Ｉ　
ｈ　ｉ’］　＝ｄ　１）ＮＡ配列のいずれかのコドンの
表現の隙暗号化されるポリペプチドに対し先膜学的もし
くは生物学的同様な活性を示すポリペプチドを暗号化す
るコドンの配列からなる１）ＮＡ配列よシなる群から選
択逼れることを特似とする。本発明の配列は、さらに宿
主においてＨｕ　Ｉｆ＋’Ｎ−ｆ”　ＡらひＶＣＨｕ　
Ｉ　Ｆ　Ｎ　−１２５９ポリペプチドの生産金ｂ」能に
することを待機とする。

実施例 以下、本発明ｔよりｉＩ＋軸に説明する。

本明細＠において次の用飴を使用する：ヌクレオチド；
糖部分（ペントース）と９．ｌ酸と言家系複弗項式塩基
とよりなるｉ）　Ｎ　ＡもしくはＲＮ　Ａのモノマ一単
位。」虱元はクリコシド炭系（ペントースの７′炭；も
）を弁して糖部分にボｄ合きれており、塩丞と楯とのこ
の組付せｒヌクレオチドと叶ぷ。この虹ｍｌユヌクレオ
テドを特性化する。≠柚のＤ五りＡ塙基はアテニン（ｒ
ＡＪ　）、グアニン（「ｕｌ　）、シトシン（１−ｅＪ
　）およびチミン（ｒＴＪ　）である。弘オ虫の１ｔＮ
Ａ上五−基はＡ、　Ｇ、Ｃおよびウラシル（ｒＵＪ　）
で６る。

ＤＮＡ配タリりリ接するペントースの３′あ・よひ！′
炭素の間のホスホジエステル１ｌｉｌ”ｉｆにより互い
に接続されたヌクレオチドの枦状列。

コドン：　　ｍＲＮＡ１介してアミノ酸、し択開始信号
または翻訳停止１８号合暗号化する３個のヌクレオチド
（トリブレット）のＤＮＡ自己自己ウリとえば、ヌクレ
オテドトリブレントｉ”ｒ　Ａ　。

ＴＴＧ％ＣＴＴ％ＣＴＣ％ＣＴＡｚ−よひＣＴＧＩ、ｉ
７ミノ敵ロイシン（［ＬｅｕＪ　）を陥号化し、ＴＡＧ
、ＴＡＡおよびＴＧＡは翻訳停止信号であり、かつＡＴ
Ｇは翻訳開始信号でるる。

′Ｐ！１絖伜：　　ｍ１ｔＮＡをアミノば配夕ＩＪ筐で
翻訳する際のコドンのクルーフ化。翻訳の際１堰止な加
胱忰を維持せねばならない。たとえば、１ＪＮＡ６ｅ＋
１Ｊ（ｊｃｒｕＧＴＴＧＴＡＡＧはＪ　ッ（ＤｊＪｌｆ
、　％ｒ、枠、すなわち相として衣視する仁とができ、
そので〕しそれは異なるアミノ敵配列金与える： ＧＣＴ　ＧＵＴ　’Ｉ’ＧＴ　ＡＡＧ　−−Ａｌａ−Ｇ
ｌｙ−Ｃｙｓ−ＬｙｓＧ　Ｃ１’Ｇ　ＧＴＴ　ＧＴＡ　
ＡＧ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−ＶａｌＧＣ県警１−’ｐＵ　＄
−ＡＡ　Ｇ−−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−（停止）ポリペ７°チ
ド：　餉接するアミノ酸のα−アミン基とカルボキシ基
との間のベフテド精合によシ互いに接続されたアミノ酸
の線状列。

ゲノム：　細胞またはウィルスの完全ＤＮＡ。

これは、特に物質のポリペプチドを暗号化する構造遺伝
子、ならびにたとえばシャインーダルガルノ配列のよう
な配列を含むオペレータ、プロモータならびにリボンー
ム結合性および反工Ｌ１性配列を仮言する。

構造遺伝子ニーｆ：の雛型もしくはメツセンジャＲＮ　
Ａ　（［ｍＲＮＡｊ　）　ｆ介して！足ホリペプテドに
特徴的なアミノ酸のロｅ列ケ暗号化−する１ＪＮＡ配夕
’Ｊ。

転　′ｔｉｉ−：　　栴：ｉ１ｉ遺伝子からｍ　ＲＮ　
Ａ　５生丸する過程。

翻　訳：ｍＲＮＡからポリペグチトゲ生産する過程。

表　現：　ポリペプチドを生殖するため構造遺伝子によ
シ行なわれる過程。これは転みと翻訳との組合せでるる
。

プラスミド：　非染色体二ｉ　Ｉｔ　Ｄ　Ｎ　Ａ配列で
あって、プラスミドが宿王細廁において複製嘔れるよう
な完全「レプリコン」からなっている。

７ラスミドを単細胞生物中に入れると、この生物の特性
はプラスミドのＤＮＡの結果として笈化しまたは形質転
装される。たとえば、テトラサイクリン耐性（’Ｉ’ｅ
ｔ’）に対する遺伝子を有するプラスミドは、従前にテ
トラサイクリンに対し７感受性であった細胞をこ７Ｌｖ
ｃＩｆｌ・（性である細胞へと形買転換δせる。プラス
ミドにより形買転換δれた細胞金「形翼転換体」と叶ふ
。

ファージもしくはバクテリオファージ：細菌性ウィルス
であって、その多くは蛋白質エンベログもしくはコート
に包封されたＤＮＡ配列よシなっている（１カプシド」
）。

クローン化ベヒクル：　化１王細胞において被製しうる
グラスミド、ファージ１）ＮＡもしくはその他のＬ）Ｎ
Ａ配列であって、７個もしくは少数のエンドヌクレアー
ゼ認識部位を特徴とし、この部位においてＩＪＮＡ配列
は決定ｂ」能な方法で切断することができ、しかもＤＮ
Ａの必須の生物学的機能、たとえり；複製、コート蛋白
質の生産を喪失することがなく、またフロモータもしく
は結合部位の喪失を伴うことがなく、さらに形質転換細
胞の同定に使用するのに適した標識、たとえばラートラ
サイタリン的１１生もしく　ｉｌｌアンヒシリン劇性を
含む。クローン化ベヒクルはしばしばベクターと呼はれ
る。

クローン化：　剣性繁殖により生物またはこれら／ｌｆ
Ｍの生物から生ずるＤＮＡ配列の集洛を札侯１）ＮＡ分
子またぐよヒブリドｏ８”８　生体細胞の外部で南部ヌ
シ稍邸にて帖付さ扛、かつ生坏＃胞中に維持しうる、セ
、（々異なるクノムからのＤＮＡのトノＦ片よりなる分
子。

衣現制御配夕１」：　　これら遺伝子に作用粕会３れた
除、楢造遺伝子の訳机ｋ　ＩＩＩＩＪ飾２よひ調部する
ヌクレオチドの配タリ。これらは１−系、バージλの主
嶽オペレータおよびフロモータ官ｉ域、ｆｄ被核蛋蛋白
のｔＢＩＪ飼Ｊｖｔ城寂よひその他の原始核もしくは成
熟核卸１１剋秒よひそのウィルスり遺伝子の表現を制卸
することが知らｔした配夕１」またはそれらの組合せを
包もする。

第１図を番照して、ここには組換Ｄ　１’Ｊ　Ａ分子の
混合物の製造方法に卜する一共体例か示ちれてお９％こ
れら組換１）ＮＡ分子の炊つかは本発明を特徴化する挿
入１ＪＮＡ配列會乞んでいる。

本発明に使用したｋＬＮ入りよ、マイトジェン刺戟され
たヒト牌＃ＩＩＩＪ＠から抽出した。このｐＩ細廁は、
１人の提供者から多足の免役系細胞を与えかつ込らにイ
ンターロイキン１生殖細胞のＭ除により殆んど変動しな
い皿で免役インタフエロンを生産するというオリ点を与
える。例数なら、牌１１ｉ１！胞は主としてリンパ詠と
マクロファージとから傅成さｌしるからでめる。

本発明″４＃ｊ＝によシ、牌細胞の生存率およびインタ
フエロン測冗櫃は主として牌臓の除去と処理との間の時
間に依存することが見出された。

（ａ）　　ヒト牌＃ｔＩｉ胞の単離 外科部門から竹られたヒトの牌臓ｒ無菌ンシスチツク袋
に入れで央験室へ搬入し、央貌室中に持込まれた後、無
陶カラス皿ＶＣ移した。無菌解体鋏によって牌臓の外膜
を除去し、お−の牌臓組織を切除した。この７１ｉｌｉ
織を７２スチック製ヘトリ皿（直％／！ａｍ）に入れ、
ここでさらに−屑小ちい片１で切断した（〜０．ｊ・♂
）。

約１０ｍ１ノｋｔＰＭＩ　　／６４４０培地（ギフコ社
）（−２’／　／　ｌ　ｃＤＪＮｌ＆　ｋｉＣ０５と２
０　Ｗ　）１ｉ　Ｋ　Ｐ　ｌ＆　Ｓと全補充）を添加し
た佼、大部分の細胞か弛緩するまで２縮のプラスチック
表ａ豹器からのフランシャ端部により組社断片忙紋く漬
した。次いで、この愁濁物’、（ｉ４−９０ｍ１ｔ７）
　ＲＰＭＩ　／６４１０培地で布釈し、得られた懸濁物
を元金に混せした。

次いで、組織と軸側のｌｉν、濁吻ケ無凶の金ｌＡｔ１
中（Ｉ　ｘ　Ｏ１３ｕｍｌｏｔｎ　）に移し、そして液
体を別のプラスチック装ベトリ皿に拮赦した。次いで。

篩上の組織を原プラスチック皿に戻し、そして熟砕し、
かつＩ′ｉｉ１記と同様に１過した。最後に。

全糺胞懸濁物をｏ、ｚ　ｌのフ”ラスチック試験管に江
ぎ込んだ。この＋ｊ「Ｌ全ｊ痺ｊ滅力稲１司装されるま
で新たな片につき反彷した。

殆んどの夕り滅矛山川」（これらは凝集しかつグラスチ
ツク試験管の底部に厚い沈澱勿形成する）を金楓篩によ
り懸濁物全書ひ１過して除去した。

次いで＊　＋１１＋＋胞懸濁物ｆ　／　００　ｍ、ｌの
無―円錐状のシリコン処理したガラス遠心分離管に移し
、試験官の底部に葦たは島ミ濁１勿の衣面に１だイＪ在
する飯果物を全て除去した。

次いで、”１００ｘ　Ｉにて７０分間室温にて遠心分離
することにより細胞を來め、これら細胞７ｚ１０倍谷ｉ
の冷トリス−ＮＨ４Ｃｔ　（り部のＯＪ　ｊ　％　Ｎ）
１４ＣＪ　＋／部ノ）　１，１　、ｘ、　−ｋｌｃｌ　
（２ｏ、Ａ１ｉ／　／　ｌ　Ｓ　ＰＩｉ　７　、Ｊ　）
　）溶液中に軟和に懸濁させて亦白球を浴解させた。μ
℃にて７０分間後、紙部に凝集した全ての死細胞を除去
し、白色細胞を集め、かつ少なくともｋｔＰＭＩ　　／
Ａ≠Ｑ培地によってコ回洗浄した。次いで、これら細胞
を完全培地（０，０３％のし一グルタミンと／　００　
Ｕ／ａのペニシリンと１００μＩ／ｍｌのストレプトマ
イシンと２５μｇ／ＩＩＬ１３のネオマイシンとｊ×１
ｏ−５モルのβ−メルカプトエタノールとｌＯチの胎児
牛血清とを補充し九ＲＰＭＩ　／６１１０）中へλ〜ｔ
ｙ−ｘｉｏ６個の細胞／〜の龜度まで懸濁させた。

（ｂ）　　マイトジェンによるヒト牌細胞の刺戟上ロピ
細胞、懸濁物（〜３１！、／　ｘ　／　０１０細胞）を
攪拌フラスコに移し、スタフィロコッカスφエンテロト
キシンＡ　（ｒｓＮＡＪ　）　（イー・ジエテロトキシ
ンＡの精製ならひに幾つかの化与的および９勿理的性負
」、バイオケミストリー、第／／＠、ｇ３ＡＯ〜Ｇ４Ａ
（／り７．２）およびエル・スベロおよびジエー会エフ
聾メツガー、［スタフィロコッカス・エンテロトキシン
Ａ（ＳＥＡ）Ｊ、メソッド中イン嗜エンチモロジー、第
７２巻（ベストカ、ニス細）（／りざ−２）（出版中）
に災質的に記載されたスタフィロコッカス・アウレウス
菌株／３Ｎ、２りＯりからオｂ義〕をｏ、　ｓ　ｍｙ／
ｍｌの最Ｊｕｌになる壕で力１１え、さらにフイトヘム
アクルチニン（ｒＰ）ｌＡＪ　）　ｋ　／　Ｏｍ９／ｍ
ｌ　（ＤＳＬ筐で加えた。培養物の上方の雰四気をｊ％
Ｃ０２ガス混合物で飽和した後、懸濁物を３７℃にてコ
、ｊ日間ゆつくシ撹拌した。コ、ｊ日後、Ｔ−，２／細
胞に対する抗ウィルス分相を用いてＩＦＨにつき分相し
た（染色体、２／に対しトリソミツク）〔ワイ・エッチ
・タン等、「ヒト采色体、２／投与；インタフエロン誘
発抗ウィルス状態の表現に対する作用」、プイエンス誌
、第ｌ♂６巻。

第６７〜ｔ３負（／り７４０）。その際、攻撃ウィルス
としては脳心筋夫ウィルス（１−ｋＭｃＪ　）’ｅ　ｋ
用Ｌ　ｆｃ　（ニス・エル会ヘルガー等、「ナマルバ細
胞で合成されたインタフエロン令メツセ１ンジャＲＮＡ
のｈａ化」、ジャーナル・バイオロジーカル・ケミスト
リーｈ　ｍ　”　’　Ｇ　ｈ　　第一タｊｊ〜６／負（
／りｔｏ））。この分析において、Ｊ、Ｊ−−４’、　
０のインタフエロン測定値を得た（”Ｊ。

・　　Ｌａｂ、単位／Ｎ）。

この分相は、ＦＳ≠卸１胞を使用するものよｐも鋭敏で
ある。イーｊ故なら、ＮＩ）ｉ白血球−ＩＦＮ標準のｌ
単位はこの分析において約ｉ、７　（ｌｏｇ１３Ｌａｂ
単位／ｍ）を与えるからである。したがって、ｌ’−Ｌ
ａｂ単位」として示したこれらの結果は、［国際（白血
球）単位」に変換するには約３０の係数で割算せねばな
らない。

勿論、他のマイトジェンを使用して、牌組廁においてＩ
ＦＮ−γ生産を誘発嘔せうることも了解すべきである。

たとえば、５ＥＡ（０，ｊμｇ／ｍｔ）のみおよびＰ　
ｌ（Ａ　（／　０　μｇ／ＩＩＬＩ　）とｉ、２−ｏ−
テトラテカノイルーホルボールー１３−アセテ−ト（ｒ
ＴＰＡＪ　）との混合物ヶも使用した。それらの結果は
、生産δｊＬるＩｌ＝’Ｎの皺が主として牌Ｎｌ１１胞
の品質（すなわち細胞の外相除去と培養との間の時間）
Ｋ依存することを示唆している。

遠心分１１１［によ５ＳＥＡ／Ｐ）ｌＡ訪発牌糺廁を集
め、これらを冷ＰＢＳで洗浄した。これら誘発牌雅胞か
ら全ＲＮＡｆ：単離するため、これらの細胞をクアニジ
ウムチオシアネートの溶液を直ちに浴解さぜた〔ジエー
・エム・チルブライン等、［リボヌクレアー化の豊掬°
な供給諒からの生物学的油性なリボ核酸の単離」、バイ
オケミストリー％第７ｇ巻、第Ｊ−タグ〜タタ頁（／２
７り月。

牌臓／個当り斗均３０１ｎ９の全ＲＮＡが侍られた。

次いで、クアニジニウム塩酸塩浴液から沈澱させ、かつ
万すゴ（ｄ’ｉ’）セルロース上でのクロマトグラフィ
によってＲＮＡを私製した（ジエー・エム・チルブライ
／？ｆ、上記〕。この段階において、豹／　ｍ９　（そ
の内６０％以上がｒ　ＲＮＡである）のＲＮＡが残存し
た。

得られたボＩＪＡ　　ＲＮＡ２無菌水中に浴解し。

混合物を６に℃にて７分間加熱し、そしてこれを／　Ｏ
ｍＭ　トリス−１４Ｃ１（ｐｈ＋　７．ｊ　）と／　ｍ
ＭのＥｌ）ＴＡとにおいで５〜コＯ％の蔗糖勾配にてｌ
ｌ−−２ＩＲのＲＮ　Ａを／勾配につき使用し、かつペ
ックマン５Ｗ４ｔ／Ｗ　Ｔｉロータにおいて、弘℃にて
７６時間、　ＩＩＩ、０００　ｒｐ＋ｎで遠心分離する
ことにより分画した。ｌ５ＣＯ勾配分別器において２３
個のフラクション（谷０．４ｔ　ｍｌ　）　ｆ集メる一
方、光学密度（λｊ４ｔｎｍ）を連続的に辿ｊ足した。

ＲＮＡＮ的中ＯＯμｇのオリゴ（ｄＴ）セルローズの平
行勾配にて遠心分離した後、よＳおよび／ｌ５７ＲＮＡ
ビーク（！ＪＳ　　ｒＲＮＡは試験管の底部に存在した
）の高さを側足することによシ単離ＲＮＡの輩を分相し
た。

４！ｒ７ラクシヨンにおけるＲＮＡ′ｆｔ少なくともコ
時間−，２１７℃にて沈澱させ、これを遠心分離（１０
，００Ｏｒｐｍ、ｊＯｍｉｎ、−，２０−Ｃ，ＨＢ４Ｌ
ｑツルバールロータ）によって集め、これを７Ｑ％エタ
ノールで洗浄した。ｌｃＮ　Ａ　’に乾課した後、これ
’ｉ、２．ｔ−ｊＯμ／１７）熱菌水申へ俗解させた。

ポリＡ″−ｆｔＮＡ蔗糖−勾ら己フラクションのそれぞ
れ全小′Ａ、胚芽抽出物（全容に１０μｊ）甲で８５５
−メチオニンの存仕下に翻訳し〔ヒー・ロバーツおよび
ビーφエム・パターンン、［市販小麦胚芽からの細胞を
含ｌない系におりるＴＭＶ　　ＲＮＡ　おＪ＝（ｊ％ｉ
ｏ　ビン１８　　ＲＮＡ（Ｄ効果的翻訳Ｊ　、　Ｐｒｏ
ｐ、　Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ。

第７０巻、第、２３３０〜ｊ４ｔＡ（／り７３）’Ｊ、
そして合成蛋白質を７２．５％の８１）Ｓ−ポリ−アク
リルアミドゲル上で分析した〔ニー・ケー争うエムリ、
「バクテリオファージＴ４ｔのヘラトラ組立てる際の構
造蛋白質の囲装」、ネイチャー誌、第、２２７巻、比べ
♂Ｏ〜ｔ！頁（／り７０）〕。

この糸における大型ホリペグチドの合成は、ここでＩＩ
Ｉ製されたＲＮＡフラクションがＲＮ　Ａを含有し、こ
のＲＮＡはに験管内の翻訳のいがなる抑制因子をも會壱
しないことを示した。

さらにポリＡ＋ＲＮＡフラクションを分析して、ｍＲＮ
Ａによシ暗号化された抗ウィルス活性を決定した。この
分析につき、ｊＯｎｌのホリＡ”　ＲＮＡ　（／１１７
９／ＩＩＵＩ）　ｆ／６〜．２０個ｃｖｖ＝ｙ７リカ腫
蛙（Ｘｅｎｏｐｕｓ　　１ａａｖｉｓ　）の卵母＃ｉｉ
Ｉ廁のそれぞれに注入し、そしてこれら卵母細胞を、２
０℃にて３日間培養した。次いで、培地を取出し、卵母
細胞を牌細胞培地について前記したと同様に分析するま
で一７０℃にて保存し１分泌された翻訳生成物をその抗
ウィルス活性につき分析した〔ニー・コールマンおよび
ジエー・そルサー、［Ｎアフリカ産蛙の卵母細胞からの
蛋白質の輸出」、セル誌、第１７巻％第ｊ／７〜２６負
（ｌり７り）〕。この分析の結果をグラフとして第２図
に示す。一般に、これらの分析は牌細胞培地の抗ウィル
ス活性よりも３０−１００倍低いＩＦＮ活性を示した。

しばしば、これらの分析はＩＦＮ−特異性ＲＮＡの異質
性の糺明を断水した。例数なら、しはしはショルダー、
すガわちずつと迅速に、移動する活８１．棟が存在した
からである。

ＩＦＮ活性７ラクシヨンにつ八、さらに卵母細胞により
分泌６れたＩＦＮの抗ｙＡ特性についても検査し、その
ＬこＱ　ｌ　ｋ’　Ｈの抗ウィルス活性金ヒトＩＦＮ−
βに対し調装された過刺Ｕ　ＬＪ）ｆ）’（。

血清（イー・デ・クラーク博士の奇賑による（抗−ＩＦ
Ｎ−β血清（山羊））で、或いはヒトＩ　ＦＮ−αに刻
し調製された抗血清（クー・カンチル博士によシ脣脂（
抗−ＩＦＮ−α（羊））およびジエ・ウィルセフ皓士に
よる狛舶（抗−ＩＦＮ−α血清（兎））、或いはそれら
の混合物で中和することを試みた（３７℃にで１時間）
。

卵母細胞ＩＦ’Ｎ試料はこれらの抗血清では中和されな
かったことが観察された。しかしながら、これら試料の
ＩＦＮ活性は、ＩＦＮ−、γに対し調ＪＲｓれた抗血清
（エムΦビ一番ラングフォード博士およびジー・ジエー
拳スタントン博士による寄贈（兎）または誘発牌細胞か
ら侍られた部分和製ＩＦＮ−γによシねすみ（Ｂａｌｂ
／ｃ）を免疫化することによシ調製した抗血清によって
中和さｎた。

ＩＦＮ−ｒ特異性ｍＲＮＡ以外らに精製するため、活性
蔗糖勾配フラクションからのＲＮ　Ａを集め、これをＳ
Ｏ％ホルムアミドと１００ｍＭＬｉ　Ｃ１とｔ＋ｎＭの
Ｅｌ）ＴＡと０．シ％　５ｉＪ８と１０ｍＭのトリｙ、
　−ＨＣＩ　（Ｐｉ″１７．４１　）とを含有する緩衝
液中に俗解させ、そして６０℃にて７分間加熱した。次
いで、これ２ｊ−，２ｏチ蔗糖勾配（０，／　Ｉｎ９Ｒ
ＮＡ／勾配）（上記緩衝液を官有）にてペックマン５Ｗ
ｊｔ型Ｔｉロータを用い６６．００Ｏｒｐｍにてｉ　、
ｒ　ｃ　−ｃ　ｊ　時間遠心分１１　シた。０．．２　
ｍｌずつの２０個のフラクションを集め、各７ラクシヨ
ンからこれを一λＯ℃にてｌ挽回容量の／ＭＮａＣＩ！
およびλ、！容童のｇＴａＨと共に静置することによ、
９ＲＮＡを沈澱させた。

卵母細胞におけると同様に、各フラクションにつきＲＮ
Ａを分析した。これらの分析において、ＩＦＮ活性はλ
つのピークに分割ちれると思われた（ｌｌ−１３Ｓおよ
び／ｊ−／４８）。

観察されたこの沈師異負性が変性における異なる工程に
よるものかど９〃≧、或いｒよポリＡ−木端の異なる投
込によるものかどうか、或いはその異負性が、２種の異
なるＩＦ″Ｎ　−＋ｎ　ＲＮ　Ａ柚類を示ずかどうか次
足することができなかった。

この点において、蔗糖勾自己から侍ら１しるポリ（Ａ）
ＲＮＡ生取物でさえ極めて多数の異なるｍ　ＲＮ　Ａを
金山することを認識ずべきで必る。

ＩＦＮ−γに対し軸！ｊ（的なｍＲＮＡ以外は、他のｍ
ＲＮＡは望１しくない汚染物である（第７図）。

残念ながら、これらの汚染ＲＮ　Ａは、不発１力のクロ
ーン化工柱の残余の部分においてＨｕＩＦＮ−γｍ　Ｒ
Ｎ　Ａと同様に４動する。したがって。

ボ！／　（Ａ）ＲＮＡにおけるそれらの存在は、ＩＦＮ
−ｒ以外のポリペプチドを暗号化するような遺伝子を含
む望ましくない＃Ｉ菌ツクローン多数を最終的にもたら
すであろう。この汚染は、Ｈ「望のＩＦＮ−γヒプリド
クローンの単離において複雑な選別問題全提起する。Ｉ
ＦＮ−γの場合、悠別間勉は、Ｐ）Ｔ望のクローンを同
定するだめの選別試料として作用するＨｕｌＦＮ−ｒ　
ｍＲＮＡもしく　ｒ：Ｌ　ＬＩ　Ｎ　Ａまたはその部分
の充分子＊ｈ葛れた試料が欠如するため、ちらに重大と
なる。したがって、ＩＦＮ−γクローンに対する選別過
相は極りて時間のかかる１離のものとなる。さらに、＆
めて少割合のＩＦＮ−ｒクローンのみが生物学的もしく
は免疫学的に宿性な形態でＩＦＮ−γ金我現すると予想
されるので、活性クローンの単離は「藁の中から釦を見
つける」ような選別過程となる。

南オリなことに、本出願人は組換ＤＮＡ技術を使用して
ＨｕｌＦＮ−ｒ　　ｍＲＮＡもしくはａ　Ｄ　Ｎ　Ａま
たはその部分の梢製試料を提供することができる。次い
で、この和製されたｍＲＮＡもしくはｏ　Ｄ　Ｎ　Ａを
使用して極めて多数の細閑クローンを連速に選別するこ
とができ、それにょシＩＦＮ−γをｉ古性型で入坑する
クローンを年しする可能性が著しく重大する。

Ｉ　Ｆ　Ｎ　−７”　　ａ　Ｌ）　Ｎ　Ａ　ｆ含廟する
二處ｇ　ａ　Ｄ　Ｎ　Ａ□今一１−−１−ト員−１−□
噌−１−１−１−ψ−軸１．１、―１１４．ｏｌ、、１
１ユ、い、、７．１□１゜の合成 ＩＦＮ−ｒ　　ｍＲＮＡ（０４菖なポリ（Ａ）ＲＮＡｋ
　ｈｒ、ｍとして使用し、釉光市ＤＮ　Ａ　（ｌ　ｃ　
Ｌ）ＮＡ　Ｊ　）ｔｃ　ｖｔ！ｌ製した〔主としてアー
ルーテボス等にょシ、［バクテリオファージＭＳλ　ｒ
ｔ　Ｎ　Ａのほぼ元金寸法のＤＮＡコヒーを宅するンラ
スミドの作成および特性化Ｊ　、　　Ｊ、ｂｉｏｌ、　
Ｂｉｏｌ　、第／−２８’　％、第！り！〜６／り負（
／り７り）、バクテリオファージＭＳ２　ＲＮＡ　（Ｄ
ＤＮＡコピーを廟するンラスミドの作成〕。

Ｖθμｇのボ！７Ａ”ＲＮＡ（第２図、保存勾配フラク
ション／／、／、２．／３）をｉｏｏμｌの６０ｍＭト
リ、（−ＭＣＩ！（ｐｌｉ　＆’、Ｊ　）とＪ　ＯｍＭ
のβ−メルカプトエタノールとｊＯｍｌｖｌのＨＣＩと
１０ｍＭのＭｇＣｌ２とそれぞｆＬ　Ｏ１Ｊ’　ｍ　Ｍ
　ｃ７）　ＩＩ　棟のｄＮＴＰと／　０１ｔＥｌ　（Ｄ
　ＰＴ＋２−＋ａと１００μＣｉのα−Ｐ”ｄＡＴＰと
１００１１Ｃｉのａ　−Ｐ３２ｄＣＴＰ（それぞれ２！
００　Ｃｉ／ｍｏｌ　）と４４＋ｎＭのＮ　ａ　４　Ｐ
　２　（）７と／　００　ｊ＄、位のＡＭＶ逆転与酵素
との混合物中において≠３℃で３０分間培太した。

ＥＤＴＡによ逆反応を停止させ、フェノールで抽出した
後、この混合物ｔセファデックスー０７５カラムに九項
した。−一θ℃にて／晩エタノールによ＃）空隙フラク
ション中に核酸を沈澱込せ、そしてこ扛らを遠心分離に
ょシ除去した。ベレットを７０％エタノールで抗がし、
乾採し、そして≠〇μｌの１（２０申に入れた。

上記で脅威されたｃ　ｉ）　Ｎ　Ａ果洛Ｑよ夾隙上、殴
厚なポリＡｍＲＮＡ中に存在した異なるｍ　ＲＮ　Ａか
ら生じた複雑なａ　Ｄ　Ｎ　Ａの混合物である（第７図
）。さらに、Ａ＋ＪＶ逆転写酵凧による早期の停止のた
め、ｃＤＮＡの多くがポリＡＲＮＡにおける各徨のｍＲ
ＮＡの不完全なコピーである（第１図に示さず）。

ａＤＮＡ’ｊ−二ｍ鋲にする前に、これを補完的ｍ型ｍ
ＲＮＡに対する結合から除去し、その際上Ｈ己の水性混
合物を７００℃にて３Ｑ抄ｔｌｊ加熱し１次いで直ちに
０℃にて冷却した。３μｇの膵ＨＲＮアーゼと３単位の
Ｔ、−ＫＮアーゼとを加え、そしてこの混合物を３７℃
にて３０分間培養した。

この温合物【Ｋ−ホスフェ−）（ｐＨＡ、り）（最Ｐ礫
＃　／　００　ｍ　Ｍ　）とジチオスレイトール（４４
ｍＭ）と”ｇｃ１２　（／　Ｏｒｒ＋ｆＶｉ）とμ値の
ｄＮＴＰ　（それぞ７１．２　ｊ　Ｏ＃　Ｍ　）とｓ　
ｏ　μｃｉのα−Ｐ　　ｄＡ’ｌ’Ｐと！Ｑμｌ、”ｉ
　Ｖ）Ｐ３２ｄＣＴＰ（七ｎそれ−６００Ｃｉ／ｍｏｌ
　）とのｋ　’ｃｔ？Ａのｉｊｊ加によｐｉｏｏμｌに
ｒＡ％し、１−・コリｏＮｈポリメラーゼｌ（ビオラブ
社、ｉｏｏ年位）を加え、そして得られた混合物’７／
ｊ℃にて３時間項％することによシ、　　＊　１ＪＮ　
Ａ　朗に二重鎖にした。反応をｋ　ｉ）　Ｔ　Ａ　ｉ／
ｃより１・？止させ、混合物をフェノール処理し、セン
アテックスーＧ７ｊカラムに通し、そして上記と同様に
空隙フラクション倉エタノールによ？）−２ｏ゛ｃにて
ｌ晩沈澱させた。

二重鎖ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ榴造に’Ａ存する単−類ヘアピン
ルーズを開くため、遠心分離によりＤ　Ｎ　Ａ　（Ｉ：
取出し、ペレットを丸味し、これ盆再びＨ２Ｏ甲に入ｆ
ｔ、そして温合物を０．コＭのＮａＣＪとｓ。

ｍＭのＮａ０Ａｃ　（ｐｉ’弘、ｊ　）と１ｍＮｉのＺ
ｎ　Ｃ１２と１０率位の８１ヌクレアーセ（シグマ社）
トのｉｏｏμｌ中において３７℃で３０分間培養した。

この混合ｖｌＪｊ＆ニア　ｊ−／　　ｋ　／　ＣＨＣＩ
　ｓ　／　イソアミルアルコールで抽出し、かつＩ）Ｎ
Ａｌｚ；１００μｌの２ＭのＮ　ｋｌ　４Ｕ　Ａｃと１
ｏｔｔｙのイー・コリｔＲＮＡと／／Ｘ６のエタノール
とのｍｋ　〃ＪによシーコＯ℃にて、２時間および一７
０℃にて７０分間沈澱させることにより反応を停止させ
た。遠心分離によシベレットを取出し、そしてこれを乾
蝶した。二重鎖ｃ　ｌ）　Ｎ　Ａのこの混合物はポリＡ
ＲＮＡ（第１図）全調製するため雛型として使用した前
記ポ１７　Ａ　　ＲＮ　Ａ　（Ｄ共買注の結末ならびに
ＡＭＶ転与酵糸によるａ　Ｄ　Ｎ　Ａ転写の恐らく早期
の停止のため（第７図に示さず）異質性となる。

この異質性の幼果を狗めるため、ペレットをＪ　ｏ　ｔ
ｔｔの１０ｍＭのトリス−ｆｌｃｌ　（ｐ）１７．６　
）と／ｍＭのＥＤＴＡとの中に浴解し、これ會ｓｒ“Ｃ
にてｊ分間培養し、プロそフェノールブルー−キシレン
シアノールＦＦと蔗糖とｔ刀１１え。

１３ＮＡＩ４ｔ％ホリアクリルアミドゲル（トリス−ホ
レート％、２０偏×参〇〇μ×０．３鴎、λ０ＯＶ−，
２０＋ｎＡ）において／晩屯気泳動にがｒ）ることによ
シ、二重鎖ｃ　Ｌ）　Ｎ　Ａ孔付物で寸法決定した。こ
の場合、ファージφ×／７≠ＬＩＮＡのｚ　ｔ−ｐ　２
　ｐ−標識ちれたｆｉａｅｌｌｌ消化物ｔも標識として
平行的に電気泳動δせた。このゲルおオートラジオグラ
フィーにかけた後、Ｉ）ＮＡをゲル上の位置に応じて各
フラクション、すなわちｇ４　　（１００〜／　　００
０　　ｂｐ　　）、　　ｇ５　　（１０００〜ン、２６
０ｂｐ）およびｇｚ　（／−２よθ〜／弘ｏｏ　ｂｐ　
）に分際した。各フラクションに対応するクルのスライ
スを切除し、これらを、２ＩＩＬｅの０．３　ＭのＮｆ
（４０Ａ　ｃと１０ｍＭのＭｇＣ／２とｏ、ｉ％の５ｉ
）Ｓとにょシ浴出させ、そしてＩＪ　Ｎ　’Ａ　′？ｆ
：λ倍谷量のエタノールにて沈殿もせた（−−２ｏ℃＞
。遠心分離の後、各ベレットを１０Ｏμｔの）ｉ２（Ｊ
中に入れ。

これ２りＱθμｌの１０ｍＭのＮａ−ホスフェート（ｐ
）＋７，４Ｌ）　（！：／　００１’ｌ　（９ｅ’１４
′６ｋ）（７）　ｋニー　トロキシルアパタイト、（ビ
オラブ社）との存狂下に３７℃にて１０分間培養した。

次いで、ヒドロキシルアバタイトヲセファテックスーＧ
７！カラムに光填し、カラムｆ　２　ｍ　ＭのＮａ−ホ
スフェ−）（ｐｉ−１７，グ〕で激しく洗伊した後、Ｄ
ＮＡ會θ、ｔ／ＬｊＭのＮａ−ホスフェート（ｐｉ−１
７，弘）にょジ浴出させ、でしてこれ？／＞θ谷−一の
２ＭのＮａＱＡａ　（ＰＩｉｊ）とλ容★のエタノール
とで沈澱δせた。

ここでも、谷ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａフラクション内に多数のＬ
）ＮＡが在任し、その内の極めて少数がＩｆｉ’Ｎ−γ
−関連ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａである（第１図）ことを認めねば
ならない。

二爪鎮ａＤＮＡのクローン化 本発明により調製された二単鎖ｃＤＮＡ奮クローン化さ
せ、或いは表現する際に、多種類の宿主／クローン化ベ
ヒクル組合せ物を使用することができる。たとえば、市
川なりローン化もしくは表現ベヒクルは染色体、非染色
体および合成のり、ＮＡ配タリのセクメントよυなるこ
とかで＠、たとえば５ｖ４ｔｏの各抛の公知訴４捧およ
び公知の卸」菌性ンラスミト、／ことえは　ｃｏｌＥｌ
、ｐＣＲＩ　、ｐＢＲＪ２Ｊ、ｐＭＢ？およびその誘導
体を含むイー・コリからのプラスミド、巾広い宿王軛囲
のプラスミド、たとえばＲＰ４Ｌ、ファージＤＮＡ、た
とえはンアーシλの多数の誘導体、たとえはＮＭ″／ざ
り２よひその他の１）ＮＡファージ、たとえばＭ／３お
よび繊維状単−頼１）　Ｎ　Ａファージおよびプラスミ
ドとファージＤＮＡとの組合せから得られるベクター、
たとえばファージＤＮＡもしくはその他の衣現制御卸配
列を使用丁べく改変させたプラスミドまたは酵母プラス
ミドたとえばλμの７ラスミトもしくはその誘導体が挙
げられる。有用なりローン化もしくは表現宿主は細囚性
宿主、たとえばイー・コリＨＢ１０／、イー・コリＸ／
７７１．％　イーΦコリＸ、２．２ｇ２％イー・コリＭ
ＲＣｉおよびシュードモナス、枯草菌、藺熱細菌および
その他の細菌類、＃母およびその他の真菌類の菌株。

動物性もしくは植物性宿主、たとえは動物（ヒトを含む
）もしくは殖物細側の培養物またはその他の宿主を包含
することができる。勿論、全ての９１主／ベクター組合
せ物が同等に上動であるとは限らない。特定の宿生／ク
ローン化ベヒクル組合せ物の選択は、本発明の乾曲から
逸脱することなく、示された原理を考慮して当業者によ
シ行なうことができる。

δらに、それぞれ付足のクローン化もしくは表現ベヒク
ル内において、二に鎖１）Ｎ’Ａの挿入のため棟々の部
位を選択することができる。これらの部位は、一般にそ
れらケ切断する制限エンドヌクレアーセによって命名さ
れる。これらの部位は当業者によって充分に認にちれて
いる。

勿論１本発明において有用なりローン化もしくは表現ベ
ヒクルは１選択されたＤＮＡ断片の挿入を行なうための
制限エンドヌクレアーゼ部位を有する必敦がないことを
了解すべきである。

むしろ、ベヒクルは他の手段によって断片に結合させる
ことができる。

ベクター、すなわちクローン化もしくは表現ベヒクル、
竹に選択ちれたＤＮＡ断片を句層δせて組換Ｌ）ＮＡ分
子を生成させるよう選択した部位は、種々の因子たとえ
？′ｆ、府定の制限酵素にかける部位の数、表現ずべ＠
蛋白質の寸法、　ＶＨ王細ノ抱ｒ欅素による蛋白質分館
に約する庚望蛋白黄の感受性、梢袈の際除去するのが困
鎚な？ｄ主＃Ｉ胞蛋蛋白による衣机すべき蛋Ｈ負の汚染
もしくは結合１次現前性、たとえばベクター配列に対す
る開始コドンおよび停止コド／の位餉、ならびに当業者
により認隊されたその他の因子によって決定される。特
定の遺伝子に対するベクターおよび押入部位の選択はこ
れら因子のバランスによシ決定され、必らずしも全ての
選択がＰ９［定の場合に同等に不動であるとは限らない
。

異種Ｄ　Ｎ　Ａをクローン化ベヒクルもしくは表現ベク
ター中へ挿入して組換ＤＮＡ分子を生成させるには幾つ
かの方法が当渠芥で知られているが、本発明による初Ｍ
のクローン化に好適な方法はｐｓＶｊ、２り１）ＮＡ（
下＝ｅ）をＢａｍＨＩによシ消化し、μ囲１４１部位に
充填し、そして末端転位酵素によりｄＣ末端を３′木端
へ加えることからなっている。次いで、二ｉ１　鎚ａ　
Ｄ　Ｎ　Ａを、先ずこれをｄＧ末編で処理した後ｐ８Ｖ
ｊ、２り１）ＮＡへ粕合さぜる。末端処理１）ＮＡおｊ
Ｏ木端処理ａＬ）ＮＡｙ久いで融合させてＤＮｈを７ラ
スミドの選択部位へ押入し、かつヒプリド１）ＮＡ２栴
壌化δせることかでき、ａＧ−ａｅ末端の補光的性質は
七の融合と動−千１４１部位の再−成と１ｉ−加能にす
る（第７図）。ここで得られた組換ＤＮＡ分子は、クロ
ーン化ベクター中の選択位置に挿入遺伝子を杢する（第
７区１）。

勿論、ＤＮＡ配クリをクローン化もしくは戎机ベヒクル
中へ挿入して組換ＤＮＡ分子を生成させるための、他の
公知の方法も本発明においてＮ％に有用である。これら
には、たとえばｄＡ−ｄＴ、末端処理、偵接的結合、合
成リンカ、エキソヌクレアーゼおよびホリメラーゼー栢
合修復反応にわヒく結合、また４−１１）　ＮＡポリメ
ラーゼおよび適当な単−馳雛脆によるＤＮＡ＠の処理に
続く結合などが包含される。

勿論、クローン化ベヒクルの選択部位に挿入沁れるヌク
レオチド自じ夕１」址７ヒはｃＬ）ＮＡ〜１片は、ｆ９
Ｔ望のポリペプチドに刈する′；Ａ際の粥造遺伝子の部
分でないヌクレオチドを色名することもでき、或いは／
３１ｒ望蛋白寅に刈する元金４４造遺伝子の〜１片のみ
を包含することもできる。と了′ｒ？１すべきである。

例しかのＬ）ＮＡ配タリが最終的に仰入され、形質転換
された宿主がｊｌｕｌＦＮ−γの生物学的もしくは免疫
手的活性勿肩するホリベプヶドを生産し、或いは１１　
Ｎ　Ａ配列そのものをｋＬ　ｕ　Ｉ　Ｆ　Ｎ−γの免疫
学的もしくは生物学的粘性を有するポリペプチドの生産
に４用なりＮＡ配列金含有するクローンヲ選択するため
のヒプリド化試料として使用しうろことのみが必要とさ
れる。

異質遺伝子を含鳴するクローン化ベヒクルもさせ、それ
によりこのに’７主がヒブリド遺伝子の暗号化するＨｕ
ｌＦＮ−ｒの免疫学的もしくは生り学的活性を示すポリ
ペプチドを？ｍしうるようにする。適当な宿主のふ択も
、当莱昇で認識された多くの因子によって４′に理チ扛
る。こ往らには、たとえは選択ベクターに対する適合性
、ヒブリドプラスミドによって暗号化される蛋白質の物
性、Ｂ１望蛋白負の回収の谷易さ、表現特性、生物安全
性およびコスト等が包含される。

これら因子のバランスを行なわねばならないが、必らず
しも全ての宿主が付定組換１）ＮＡ分子のり四−ン化も
り、＜は表現のいずれかに対しＩｍ”］　ｅに有効であ
るとは限らないことを了解すべきである。

本発明の合成において、好適な初期クローン化ベヒクル
はｐｓＶｊ、２りであり、かつ好適な初期制限エンドヌ
クレアーセ部位はＢａｍＨＩである。好適な初期宿主は
イー・コリＤｌ（Ｉ（、りである。

ｐｓｖ、ｔλりはキメラ５ｖｔ−ｏプラスミド表現ベク
ターであって、これからは多くのシーＨ＆域が除去され
ている。構造はんんどのＶＰＩ遺伝子（Ｏ，ハリ〜０．
／グｊｍａｐ卑位）忙欠如しているが、複製、転写の開
始および終了、ならびに／４８およびｌり８　ｍＲＮＡ
の切ｌＩ／ＩＢよひホリアデニル化に関与する全ての領
域忙保持する。

ｐ８Ｖよλ２はシー）ＳＶ４ＬＯ仏写電１」御の下で遺
伝子？ｉ−表机するよ′）ｔｃ、設訂されている。

ｐＳＶｊ２りの楢成ｆ：第３凶に示す。キメラグラスミ
ドｐｓＶｊ（シー・ジエー・ライ博士の寄贈による）は
Ｂａｔｎｉｉ１部位ＶＣ押人されたＳＶ４／ＬＯＤＮＡ
悄＠＋　＆　肩するｐＢＲｊ、２．２　よｃＺっている
。ｐｓＶｊにおけるＳＶ　１）ＮＡは位置０．２≠！（
今回ＢａｍＭＩ部位に亥換させた！！ｊすｍ部位）から
反時酊方向へ独特の５ＶＩＩＯＢａ四ＨＩ部位（位置ｏ
、１ｙｚ）まで処理する。

スーパーコイルのプラスミドｐｓｖｔ　ＤＮＡを臭化エ
チジウムの存在下に尺す、Ｕによって部分消化し、そし
て・フェノール化および沈鹸の後、δらにこれ全１片り
−１によって消化妊せ、次いでゲル上でｐｓＶｊの弘Ｊ
ＪＯｂＰｊ３にさのドナーＤＮＡＩｒ片を和装した。次
いで、ｊμｙのｐＢＲｊコ、２　Ｌ）ＮＡｆ真１田およ
びどｓ−４ｌによって先金に消化ざぜ、グル上で／ｊ４
Ｌ２ｂｐ長さのｐ　ＢＲＪ　２．２−　Ｐｓｔ　ｌ　−
Ｐｖｕ　ｌ　　アクセフ“ｌ断片を和装した（第３凶）
。これらλつの鞘製断片（ドナーおよびアクセプタ）を
等モル比にて混会し、これらをＴ弘すカーゼによって７
４℃で結合さ一＋！：／ζ。この結合混合物の／／ｊｔ
使用してイー・コリに／２菌体ＨＢ１０／’＜形質転換
させ、それにより推足１００個以上のｐＢＲ３λλ−Ｓ
Ｖ＋θ組換体を得た。これらクローンの１棟、すなわち
ｐｓＶ、ｔ、２は制限分析の際、予想の＆すＩｌ断片を
もたらした。さらに、これをＨｉｎｄｌおよび傷−１川
での消化により特性化を行ない、これは独特の旦さｍ　
Ｈ１部位を鳴した（第３図）。

次いで、ｐｓＶ７．２をＣ１ｍ　ｌおよヒバ竺ＨＩによ
って消化し、そして生じたｊｊ２０ｂｐ長さの断片を低
融点の７ガロースから回収した。さらに、８Ｖ４４０１
）ＮＡ　ｆ　Ｂａｍｋｌｌ　オヨびＨａｐＱによって消
化し、そして３０２６個の塩基対を宅スルＢａｔｎ　Ｈ
１−キソ■防片倉回収し、この切片は５ｖａｏケノムの
初ルＪＷｔ域を分船する（マツプ年ｉｉＯ，／　ＩＩ　
ｊ　〜０．７２６　　）。　Ｃ，ｉａ、　ｌ　　（Ａｉ
”ＣＧＡ’ｆ’　）および）ｉａｐ　１１　（ＣＣＧＧ
）のエンドヌクレアーセ識別部位は相違している′Ｘ）
へ　これらエンドヌクレアーゼによシ生する融合木Ｍ（
ＣＧ）ｔよ１ＴｉＪ　−である。したがって、ｊｊ２０
ｂＰ＊ＧのＣ，１−ａ　ｌ一部、！ｌ！！ＨＩは、グル
和装された３０り４ｂｐ長さの小ＰＵ−μＹ障１片に結
合することができた（第３図）。

イー中コリに／λ（菌株ＨＢ１０／）をＪし質転換させ
た後、！θ０　（１！＋以上のカルベニシリン耐性クロ
ーンを得た。アガロースゲル上で分析したざ柚の組換ク
ローンの内６ａＩはＰ、ｖ−ｕ　ｌで消化した際、Ｐ９
ｒ望の〜す片ずなわち、２３４Ｌ／　ｂｐ、２２１ｓ３
ｂｐおよび、２０ＯＡｂｐ陣ｒ片のλモル等量を生成す
ることが判明した。これは、大型′ｒ−抗原遺伝子およ
び初期のＳＶ≠００配列のｊ′−近位の手分＊＊、間す
る２０ＩＯｂｐの５Ｖａ０１Ｕ＋片（ＰｖｕＱ　（０，
３３）　〜、１Ｑ−ｐ　ｌ　（０，７，Ｚｊ　）まで）
の予想の反復と一致する。

これら組換ン゛ラスミドの／柚會辿択し、これをｐｓＶ
Ｊ−２２と部名した（第３凶および第弘凶）。

ＰＳｖハｄの主たる時機は次の通りである：（ａ）　Ｓ
　ＶりＯゲノムの児全な初期領域が存在し、これはスモ
ール−屯仇原と２−ジーＴ抗原とを亀号化し、さらに猿
の細胞における複製に必教な領域か存在し、また項のレ
ート領域に位置する「エンハンサ」配列も存在し；（ｂ
）主たる構造蛋白質ＶＰＩに対する遺伝子が削除葛れて
お夛（０，り４’ｊ〜０．７≠！マツプ単位のＨｉｎｄ
ｔｌｌ−４狸１１１〜［片；（Ｃ）独特の部用Ｈ１部位
がキメラプラスミド上に存在して、ここに異種配列を挿
入してＳｖ≠Ｏレートシーモータの制御下に表視を行な
うことができ、このＢａｍＨＩ部位はＶＰＩ遺伝子の翻
始コドン（これは境在除去されている）の前に７２個の
ヌクレオチドと７４８ｍ　ＲＮ人アクセプタ切除部位の
後の３２個のヌクレオチドとが存在し；（ｄ）主たる／
ｚＳレートメツセージに対するドナーおよびアクセクタ
切除部位が存在し；　１６）　Ｓ　Ｖ≠Ｑレーシー域か
らのホリアデニル化郡位が存在しくＳｖ≠Ｏマツプ単位
００１７）；かつ１ｆ）ＳＶ４ｔＱｉ）ＮＡのコＱざＯ
ｂｐ期片（マツ７位ｍ、　０．３　ｊ〜０．７２３）の
複埃ｒｔ猿の細胞における同質組供ｋｉ’Ｊ龍にすると
共（ｃ、ＳＶ弘Ｑレフリコンを祐生させ、このレフリコ
ンからはプラスミド１じ列か除去き７しているがウィル
ス構造這伝子ｖＰｌの代ジに伸入屯伝子金含有している
。

ｊ　（７Ｂ　１１　（ｌＪ　ｐ　ＳＶ　ｊ　−２５’　
Ｄ　１’Ｊ　Ａ　ｆ　４’　Ｏ本位］辞、、！旦Ｈ１制
限酵素により、６ｏμＥの♂ｒｎｉＶｉのＭｇＣ７２と
弘Ｏｍ　＆ｉ　（１）　Ｎａ　Ｃｌと１００ｍＭのトリ
ス−１１ｃ／　（Ｐｔｉ　７．弘）とにおいて３７℃で
２時間消化した。ＥＤＴＡによシ反応を竹・止葛せ、そ
して混合物をフェノール処理しく３回）、エーテル抽出
しく、２回）、そして、／／１０　’！４ｋｃ／）、２
　ｙｔのＫＯＡ　ａ　（Ｐ１４３　）と、２谷址のエタ
ノールとで沈澱させた。

次いで、沈澱されかつ腺秋化した（すａｍｌ（１）ｐｓ
ＶｊＪタ　υＮＡ全分除し、これを７θ装エクノールで
コ回ｆｋ、即し、礼法し、ｈ２０中に入れ。

そしてｊＯｍＭのトリス−）１ＵＩ！（ｐ）ｉｆｆ、ｊ
　）とｊＯｍｋｌのＫｃｚと１０ｍＭのＭｇＣＪ２と３
０ｍＭのβ−メルカプトエタノールとそれぞれ、２　ｊ
　Ｏ／ＪＭ　（Ｄ　４’　個（Ｄ　ｄ　Ｎ　Ｔ　Ｐ　ト
ｊ　ＯＪ＄位（ｊり　ＡｈｌＶ逆転与酵系との混合物５
０μｌにおいてＪ７’Ｃにて３０分間培養した。反応を
ＥＤＴＡによシ停止させ、混合物をフェノール／ＣＨＣ
ｊ、／イソアミルアルコールで抽出した。ｉＴｈ液と混
合物とをセファテックス−Ｇ７！カラム（ｊＱ礪ｘＯ６
ｊ　Ｏａ　）　ヘ／　Ｏｍｈｌのトリス−ＭＣＩ　（ｐ
）ｉ　’／、ｊ　）と１ｍＭの１！；ｌ）　ＴＡとにお
いて充填し、そして、２ＭのＫＯＡ　ａ　（ｐＨｔ　）
とエタノールとにょシを１！Ｊ７ラクシヨンｆ−，２０
’Ｃにて７時間沈澱させた。

１）ＮＡを遠心分゛離により分離し、乾燥し、３０ａｔ
の１０ｍＭのトリス−）ｉＣｌ　（ｐ）１７．３　）と
１ｍＭのＥｌ）ＴＡとの中に入れ、これをｉ”ｃにて３
０秒間カロ熱し、次いで氷上で急冷した。次いで、ＤＮ
Ａを０．／　ｌ／−Ｍのに一カコジル敵と３０ｍＭのト
リスＭｆ＃　＊　（ｐｌ−１６，Ｉ　）と７ｍＭのＣ０
８Ｕ４と／　ＩＩ亀Ｍのジチオスレイトールと０．１ｍ
ＭのｄｃＴＰと／　００　ｐｃｉのａ　−Ｐ”ｄ　ＣＴ
Ｐ（２ｊ００　Ｃｉ　／ｍｏｌ　）と／　００　＊位’
Ｄ　木ＷＷａデオキシヌクレオチジル転位酵′、Ａ（Ｐ
　−１，ビオケミカルス社）との混合物、２００μｔに
おいて３７℃で培養した。５分間および７０分間の後、
１００μｌずりを抜取り、　）ｙＬｓし・をＥ　１１１
”　Ａ　／こよシ停止させた。

これら部位をフェノール／ＣＨＣｌ、／イソアミルアル
コールで抽出し、ＤＮＡ１上記と１１ｊ」様にセファデ
ックス−Ｇ７！カラムによるクロマトクラフイによって
和製した。空隙フラクションにおけるＤ　ＮＡ７！ｉ−
エタノールにより沈澱させ、違心分離し、乾燥させ、そ
して３Ｑμｌのｉ。

ｍＭのトリス−ＨＣｌ：　（ｐｌ−１７，ｊ　）と７ｍ
ＭのＥＤＴＡとに入れた。平均−！コおよび３ｚ個のｄ
ｃＭＰ残渣が５分間およびｉｏ分間の培簀の後それぞれ
線状化されたｐｓＶｊ、２りＬ）ＮＡの３′末端に句加
された。さらに、尤す〕消化されかつｄｃ−末端処理さ
ｎｆｃｐｓＶ−ｔ−２りＩＪＮＡの７カロースゲル電気
ｖＫ勘によって示、されるように、殆んど内部切面は生
じなかった。

上記の二に勉ｃｌ）ＮＡ（フラクションｇ２＊　ｇｂお
よびｇ＜）ｆｒ遠心分離し、乾ＶζさせコＱμｌのＩＯ
＋ｎ１Ｗｉトリス−ＭＣＩ　（Ｐ）１７．６　）と／ｍ
ｈ／１０Ｅｌ）ＴＡとに入れ、そしでＯ０／弘ＭのＩ（
−力コジル酸とＪＯｍＭのトリス綾衝故（ｐＨ４，ざ）
と１ｍＭのＣｏ３Ｏ４と／＋ｎＭのジチオスレイトール
と０．２ｍＭの１１’　−ｄｃＴＰ　（ｊ、７　Ｃｉ　
１ｍＭ。

／、ｔ　弘ＩＩ／ｍＣｉ　）と、２０４位の末端テスオ
キシヌクレオチジル転位酵素とをも有する混合物３０ｒ
ＩＬｔ中において３７℃で１０分間培養した。

反応をＥＤＴＡにより停止場せた。

次いで１反応混合物をフェノール７ｃＨｃｚ。

／イソアミルアルコールで抽出し、これをセファテック
ス−ａ７ｓカラムに通した。空謙フラクションにおける
Ｄ　Ｎ　Ａ　ｆ　ＫＯＡ　ｃおよびエタノールによシ／
晩沈厳させ、そしてＪＩＮＡ’＃北心分１１ｆｍｌｌこ
より除去した。目」収もｔしたＤＮＡ紮早・４燥し、こ
れｆｌｏｍＭのトリス−ＨＣＪ　（ｐｉ１７．ｊ）と／
　ｍＭのＥＤＴＡとθ、／ＭのｈａＣｔとの混合物３０
μｔに入れた。平ＪｔＯＪｊ　Ｏｄ　ＧＡｉＰの残漬が
ｄ　ｓ　Ｌ）ＮＡ　（各フラクションｇ２、ｇ、お↓ひ
ｇ４）の３′末９Ｒ＋ｆに付加ち扛た（　６ｏ　ｎｇ、
−ｔｔＬぞれ約０．ｉ　ｐ＋ｎｏｌ　）。

各フラクションｇｚｈ　ｇｓおよびｇ４からのｄＧ−末
端処理されたｄ　ｓ　Ｊ）ＮＡ　　／　、ｔμｌ（０，
０３ｐｍｏｌ　）　ｔ−ＢａｍＨＩによりｂｉ状化され
かツｄＣ−末端処理されたλμｌ　（０，／　ｊ　ｐｍ
ｏＬ　）のｐｓＶｊ、２５’と混合した。７０分後、／
ｒｊｔｔｌの１０ｍＭのトリス−１−１ｃ／　（ｐｌｉ
　７．ｊ　）と１ｍＭのＥｌ）ＴＡと０．／　ＭのＮｎ
Ｃ１とを加え、この混合物を６♂”Ｃにて５分１ｈ１、
弘３℃にて２時間それ（Ｊ牡培養し、そしてこれを徐々
に呈温（−２５搬まで参時間かけて冷却した。

勿論、アニーリングの後に得られるヒブリドＤＮＡは、
挿入ＬＩＮＡ配列金伴わない兵なる組換１）　Ｎ　Ａ分
子と焼柚かのクローン化ベヒクルとの大混合物で必る。

しかしながら、谷ＡＭ１挨１）ＮＡ分子は艷思）１１部
位にｃ　Ｌ）　Ｎ　Ａ断片ｒ金山する。

この槓の各ｃ　Ｄ　ＲＡ　ＩＰｌｒ片は、遺伝子または
そり断片からなることもできる。悦めて少数のｃ　Ｄ　
Ｎ　Ａ　ｌｄｉ片のみが、　Ｉ（ｕ　ＩＦｉ（−γ％し
くしよその一部を暗号化する（第７図）。大多数のもの
は、本発明の方法で使用さｇたホ１７　（Ａ）　ＲＮＡ
の一部であるｍ　）！　Ｎ　Ａ　７Ｌ有する他の蛋白質
もしくはその部分の１つに貼号化する（第１図ジ。べら
に、上ｄＣで調製さｎた保存クローンのいずれもＩＦＮ
−γの免疫学的もしくは生物学的活性を示すポリペプチ
ドの表現を行ないえないことを理解すべきでめる。むし
ろ、これらはこの極のクローン′ｆ：迫別する際に刹用
な７ピけてるる。

必要に応じ遇尚ｌ閉じ込め施設を用いてトラ／スフエク
ションエ札および全ての七の仮の工程全竹ない、生じ７
ヒ形％Ｌ　Ｑ’ｉ：俣俸電ここで処理し１こ。

アニールさイシ１ζＬ）　Ｎ　Ａ　（そ２Ｌぞれンフク
７ヨンｇ２ｉｇ６およびｇａ）のｕ付物３３μｌ電それ
ぞれ１０ｏｔｔｌの競合イー・コリυｆ１１（λ）ＫＩ
Ｉｌ胞へ刀日えた。ＯＣで３Ｑ分１ｔｉ」ｉｆ匝した埃
、泊月ＪＩＢ　ｔ　≠／−Ｃにてｊ分ｎＪ　ｘｉ　簑し
、／　Ｊｎ＆のＬＢ−培地全冷力１ｊシ、そし′て６Ｌ
合′ｉ勿乞−さらに３７℃にて弘！分間培児した。次い
で、廿混合物の乙（〜３！Ｏμり７＜１００μＳＩ／μ
ｌのカルベニシリンを含有する寒天板上に接柱し、でし
でこれら板体を３’７’Ｃにて／晩培養した。

プラスミドｐ　Ｓ　Ｖ　ｊ−タはペニシリン釦付用の遺
伝子をもむので、この迫伝子金元芋な状悪で弔するプラ
スミドにより形り４転換されたイー・コリ栢主は、形質
転換さ扛でいないような細菌を除いてすし生ｖＩＪ個ケ
葛む培養物においてｊ１’４殖するであろう。し１こか
つて、カルベニンリン包′−ｈ培寮物における謂殖ｒＪ
、ｂ　ｆｌ且侯１）　Ｎ　Ａ分子または揚壌化ベクター
でＪし質私換さｎた宿主のあ択忙町龍にする。

１−々の果落を釣上け、そしてこれらｔミクロ測定板に
おける２００μｆ　（１）　Ｌ　Ｂ−培地（カルベニシ
リンを含胸する）にて／晩増殖させた。ジメチルスルホ
キシド？！−７０％の最Ｉ（コ碌度マで刃口えた後、プ
レートｔ−λＯ℃で貯蔵し１ヒ。

谷フラクション（ｇ４１．　ｇ’およびｇ２）のカルベ
ニシリン４性のクローンは各種の組換１）ＮＡ分子を含
有し、鹸発牌細胞から得られたポリＡＲＮＡにおけるｍ
　ＲＮ　Ａの混合物の寸法次定された完全もしくは部分
コピーを示す（第７１）。

これらクローンの大多数は単一の組換ＤＮＡ分子を含有
する。しかしながら、これら組換１）ＮＡ分子の極く少
数のみがＨｕＩＦＮ−γに関係する。したがって、クロ
ーンはＨｕＩＦＮ−ｒ完全クローンを他のものから辿択
するように選別せねはならない。

の選別 ＨｕｌＦＮ−Ｔ　　ａｌＪＮＡ　　７．（君、ｉｌする
Ａａ　ｍクローンを選別するには幾つかの方法がある。

これらには、たとえばＲＮＡ、４択ヒブリド化（アルウ
ィン寺、下ＭＬ　）　＊分画ヒプリド化（ティー・ヒー
拳セント・ジョンおよび）′−ル・タプリュ・テビス、
「分画ンランクフィルタヒンリド化によるザツカロミセ
スセレヒシイからのカシクトースｂ発性Ｌ）ＮＡ配列の
単離」、セル藺、第７６巻、第ダ弘３〜弘よλ負（ｌり
７り））１台底試料によるヒプリド化（ビー・ノイエス
等、［オリゴデオキシヌクレオチド試料を用いることに
よるガストリンｍＲＮＡの検出および部分１番（部分ｋ
Ｊ　ｂＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ
、　第７６巻、第７７７０〜７ダ頁（ｌり７り））、ま
たは免疫学的分析（エル−ヴイラーカマロ７等、「プロ
インシュリンを合成する細菌クローンＪ　、　　Ｐｒｏ
ｏ、ＮａｔｌＡａａｄ、Ｓｏ　ｉ、Ｕ　Ｓ　Ａ　、　第
７　、を巻、第３７．２７〜３／負（ｌり７ｇ）入また
は生物学重分ルｆ（ニー０シー・ワイ・チャンク等、［
ねずみのジヒドロホレイトレダクターゼを暗号化するＤ
ＮＡ配タリのイーもコリにおける表視」、ネイチャー誌
、第２７３％、第６／７〜２’ｉＬ負（／ｙｙｒ））　
　によるＤ１望蛋白質を生皮するクローンの送別が包色
°ちれる。不発明石等は、Ｍも便利かつ有望な王女クロ
ーンの泗別方法としてＲＮＡ選択ヒブリド化を迭択した
。

第３図を参照して、組換ＤＮＡ分子を、クローンの上記
貯蔵物のうちカルベニシリンに感受性の約ｚｏａ！のり
ｐ−ンの貯瓶培髪物から単離した（−２つのクローンの
、２棟混合物を紀よ因に示す）（工程Ａ）。組換ＤＮＡ
分子を開裂させ（ル、ｍＨＩ）、それらの挿入物を稍裟
し、そして前記と同様に調製したＩｌｕ　Ｉ　ＦＮ　−
ｒ　ｍＲＮＡを雷鳴する全１ｔＮＡヘヒブリド化した（
工程Ｂ）。

全１）ＮＡ−挿入物一全ＲＮＡ−ヒプリドをヒプリド化
ちれていない全ＲＮＡから分ｋＬ、そしてヒプリド化さ
れたＱ　ＲＮ　Ａ　金ヒプリドから回収した（工程Ｃ）
。回収さ３７１ＣＲＮ　Ａを上記としｆｃ（工＆Ｄ）。

もし、組換ＤＮＡ分子の組付’ｔａが全ＲＮＡ中Ｋ＞−
ける１ｉｕ　Ｉ　ｋ’Ｎ　−ｒ　ｍＲＮＡに対し厳格な
ヒプリド化条件下でヒブリド化しうるＢａｔｎＨＩ仲人
ヌクレメテド配タリを南する組換Ｌ）ＮＡ分子を３南す
ＩＬば、このヒプリドから遊離された＋ｎ　ＲＮ　Ａは
卯母ん」胞において）１ｕｌＦＮ−ｒの生成忙もたらす
でめろ９゜イＬＩｊ故なら、他の組換ＤＮＡ分子−全Ｒ
Ｎ　Ａヒブリドから遊離されるｍ　ＲＮ　ＡはＩＦＮ−
ｒ−関連性でないからである。

ｊＴＯ極のクローンからなるグループは陽性反応を与え
九ので、これらクローンを６袖のツブグルー７に再分類
しく♂クローンの参つのサブグループおよびタフローン
の一つのサブグループ）、そして各サブグループを前記
と同様に分析した。この過＆ｌ　この分析に対応する年
−のクローンが同定されるまで続けた。

このように１ｉ５」足された組換ＤＮ人分子およびそれ
によシ形負転俟されｆｃ軸菌培誉物が完全なＩＦＮ−γ
　ｃｌ）ＮＡ配列を市するという保証はなく、１だ実際
に１）ＮＡ配タリがＩＦＮ−γを暗号化し、またはＩＦ
Ｎ−γの免疫学的もしくは生物学的油性を示すポリペプ
チドをこのクローンに表視させうるとは保証されない。

しかしながら、組換１）ＮＡ分子は、！！かに１１ｉ’
Ｎ　−ｒ　ｎ５ＲＮＡｌＩＩｔ号化配列に補完的な広範
なヌクレオチド配列を含有する。したがって、仁の組換
１）ＮＡ分子鉱少なくとも他の組換ＤＮＡ分子およびそ
れにより形質転換されたクローンを迅速に選別して標準
もしくは完全なＩＦＮ−ｉヌクレオチド輻号化配列を有
するような他・のクローンを同定する試料の供給源とし
て使用することができる。

次いで、これらクローンをＩＦＮ−１の生物学的もしく
は免疫学的活性を示すポリペ１チドの可能な総状につき
分析することができる。さらに、これらヒプリドプラス
ミドの挿入１３ＮＡ１９ｒ片およびそのアミノ酸翻訳生
成物のヌクレオチド配列を決定しかつ使用して、ＩＦＮ
−７の収率および活性を向上させることができる。

２、初期分析の夾施 工程Ａ：「押入物−ＤＮＡＪの軸装および乙の「伸入物
−ＤＮＡＪ勿名治するニ トロセルロースフィルタの〜４製 上ｄピで８８ｍした株存Ｗ　（ｇ２．　ｇ！ｒ＞ヨヒｇ
４　）のそれぞれ′ｔ−よＱ柚のクローンよりなるクル
ーズに分割し、ｊＰ−の緑大赦上に２いて谷組を／晩増
殖させた。次いで、これらクローンから得られたバクテ
リヤｆ　ｊ　ｔｔｒ、ｌのＬｌｌ−培地へ懸濁させ、こ
の懸濁’＠）ｔ−０，６１のＬＢ−培地に接種し、細菌
懸濁物を／晩増ルさせた（ンラスミドの５９殖を伴わな
い）。リノチウムートリトンＸ１００の溶菌、透Ｅ！Ａ
な溶菌物のポリエチレングリコール沈澱、および具化エ
チジウムの存在下ｆＣおりるＣｓＣ１の勾配遠心分離に
よって、これら培養物からＤＮＡｔ−単離した。次いで
＊ｓｏｍのクローンの各混合物のスーパーコイル１）Ｎ
Ａ　（〜、２ｔｏａｌｌ）４ｅａｏｏａｌの１０ｍＭト
リス−上ｆＣ／ＣｐＨ７，３）と／ｍＭのＥｌ）ＴＡと
にと夕、そしてこの浴液／ｊＯＡ！ｆμツＨｊで消化し
て「Ｌ）ＮＡ−挿入物」を切断した。Ｌ）ＮＡの開裂が
完結した後（ｌ／Ｌ％ホリアポリノヒアミドゲルにおけ
るｚｔｔｉの電気泳動によって横置する）−このＬＩＮ
ＡｙＩ５合ｖ／Ｊ’ｆ：、７−Ｌ／　−ル処Ｊ’Ａ　シ
Ｈ”−−チルで抽出し、そしてｉｉＪ口Ｃと同様にＤＮ
Ａ’ｉエタノールによって沈澱させた。

込心分離しかつ旅しく乾燥し７ｃ後、ｊ）ＮＡベレット
を２００μｌの／　ＯｒｌｌＭ　トリス−）１ｃｚ（ｐ
）（７，５）と１ｍ１ＶＩのＥＤＴＡにトシ、ｘ、ｒ’
ｃにて５分間加熱し、冷却し、そして１０ｍＭのトリス
−ＭＣＩ！（−１７，ｊ）と／ｍＭの、ｔ！；ＤＴＡと
におけるｊ−２０％蔗抛勾配置１ｒｒ３ｅ上に光填した
。

これをペックマンＳＷ≠ｌロータにおいて≠ＯＫ。

μ℃にて７６時間遠心分離した。

次いで、これら政友勾配を分別し、そして切断された［
挿入物−ＤＮＡＪの混合物（〜λＱμｇ）を含櫓する７
ラクシヨンを２□答量の２ＭのＫＯＡ　ｏ　（ｐｉ（ｊ
　）と、２谷祖のエタノールとにより一部Ｏ℃にて少な
くとも３時間沈ｆＩｉ妊せた。

沈澱した混合物？ｒ：急心分離して［挿入物−Ｌ）ＮＡ
Ｊ勿分陥分離仄いてこのベレットを全部でｉ６ｏμノの
１０ｏｕνｌトリス−１ｉｅ　ｚ　（ｐｔｉ　７．ｓ　
）と／　ｍＭ　Ｅｌ）１”Ａとにと９（１０μＪｋ１史
月」して弘羨ポリアクリルアミドクール上で電気泳動δ
せた）、この混合’ｍｔ１０ｏｃにて５分１１１」刀１
４左〜し、そして１ｓｏｔｔｚの／　ＩＶｉ　　Ｎａ０
ｆｉ　’１））ｌＩχた。

次いで、／、Ｊ−ＭのＮａＣ１と０．／　ｊ　ｉｖｌ　
ｃｐ　Ｎａ−クエン酸塩と０．．２！　ＩＶＩのトリス
−ｆｉｅｆ　（ｐＨＬＯ）と０．１　ｊ　Ｍ（Ｄｌｉｃ
ｋとｔ　’６　廟−ｆる混合−ＩＶりｏ。

μｊを姫加することによシ混合？ｋ　’Ｉ」イ１し、そ
してこれ金ニトロセルロースフィルタ（内径７闘、ミリ
ホ７ＨＡＷＰ　０１ｔｌｓ　ｔｔ　）　にゆッ＜　ｔ）
　、ｉ＋ｌしてＩＰ逃し、四Φ入物−ＤＮＡＪｉフィル
タへ吸着させた。これらフィルタ１１乾し、０１２Ｍの
ＮａＣＪとｏ、ｏりＭＬ　＜／）　Ｈａ−クエン酸塩と
で抗浄した後、礼法しかつ秋圧下でｚｏ′Ｃにて１時間
焼成した。

工程Ｂ：伸大人物ＬＪＮＡと芋ＲＮ　Ａとのヒブリド化 Ａｊ％ホルムアミド（アンバーライトＭＨＩによシ脱イ
オン化、セルバ社）とＯｏ、２％の８１１８と２０ｍＭ
のＨＥＰｇＳ（ｐｔｌＡ、４ｔ）とＯＪＭのＮａＣＪと
ポリＡ　ＲＮＡ　（ｊＯ〜１００ｐＨ，５ＥＡ−ｂ発牌
細胞かＬ：）得られ、かつｇ’１Ｊｉｉｃ：と同様にｊ
〜２０％蔗勧勾配にて１ト）表したもの）との温合物２
００μｌを１７．ｌ製した。この混合物を、シリコン処
理されたエツベンドルフ試鹸１において４１℃にて１分
間加熱した。仄いで、この混合物ヲニトロセルロースフ
ィルタ（鉛組で１１ｔＬ、かつＯｏりＭのＮａＣＪと０
．ＯＰ　ＭのＮａ−クエン酸塩とで截らしたもの）の半
裁物２０枚をち゛む／！〃ｕの試験管に加えた。これら
２０枚のニトロセルロースフィルタは、それぞれｇ５の
クローン保存物の一部から調製されたｊＯ禎のクローン
よりなる。２０グループを示した。この温合物において
、これらフィルタを１０℃で、２局・間培養した。

工程Ｃ：ヒブリド化さ扛た全ＲＮＡ−挿入物−Ｌ）ＮＡ
の非ヒプリド化全ＲＮＡか らの分離 ヒブリド化された全ＲＮ　Ａ　−（４１人５Ｂ　−１Ｊ
　Ｎ　Ａを９櫓する２０枚のフィルタ２ｓｏαのプラス
チックチューブへ移し、これらｆｌｏｍＭのトリス−）
１ｃＪ　（ｐ）１７ｊ　）と０．／　ｊ　ＩＶＩのＮａ
ＣＪと７ｍＭのＥｌ）ＴＡと０．５チの５ＬＩＳとの浴
７ｉ！Ｏａでり回ならびに５Ｌ）８　ｔ−ち址ない上＝
ｅの級餉液で２回それぞれｉ、ｓｃにて仇浄した。仄い
で。

各フィルタを／３０μｌの１１２０とｄμ、ｇ（４μｙ
）のポリＡ＝ＲＮＡ（オリゴ（ｄＴ）セルロースを通過
した牌細胞のＲＮＡ）を官有するシリコン処理されたエ
ツベンドルフチューブへ移した。これらチューブをｉｏ
ｏ”ｃにて７分間加熱し、そして直ちにＣＯ２／エタノ
ール浴甲で凍結させた。

これらチューブを室温１で解凍させた稜、チューブから
フィルタを取出し、そして浴出ちれたＲＮＡ７．２０μ
／の、２ＭのＮａ　ＯＡａ　（ｐ）Ｉ　ｊ　）とグＯＯ
μＥのエタノールとで一２０℃にて７晩沈澱させた。遠
心分離によ！ＪＲＮＡを集め、ペレットｆ７０％エタノ
ールで２回洗沖し、そしてこれｔ乾脈した。

工程Ｄ：１に１１１−ｒ　ｍＲＮＪ＄性の測定、２０枚
のフィルタに対応し、したがってフジクションｇ３から
のｊＯ独のクローンの初メツ、２０グループに相当する
。２０ｔ１ｉ！のＲＮＡペレットのそれぞれ全一μｌ　
（ＤＨ２０中にとり、そしてＲＮＡを前記と１ＩＩＩＪ
様に７５〜２０個の闇ア７す力産蛙の卵母細胞のそれぞ
れに注入した。、２３℃にて３日間の仮、卵母細胞の培
地′（ｉｌ−取出し、そしてｉＨピと同様にＩＦＮ抗ウ
ィルス活性につき分析した。

３、　ＲＮＡ選択選択リブリド化分析呆ｏＤＮＡフラク
ションｇ、３（ｉｏｏθ〜／コＪ′Ｏｂｐ　）からの１
０種のクローンからなる。２（７グループの内、グルー
プ／、ｌ、、３，１０．／！およびｉｔは、初期分析に
おいて卵母細胞中で測定されたＩＦＮ活性ｆ、１ｆＥｔ
号化するｍＲＮＡ　（訪発牌細胞のポリＡ　　ＲＮＡか
ら）へヒブリド化する「押入物−ＤＮＡＪを含有した。

上記のように第一のヒブリド化および分相の後、クルー
ズ／。

グループλの５０種のクローンを６種のツブグループ、
すなわちそれぞ７’Ｌサブグループコーｌ〜２−Ａ（、
ｒ４Ｍｔのクローンからなる弘グループおよびＰ侃のク
ローンかりなる２クルーズノに分割し、そして上記のヒ
プリド化と分相＋胴とをこれら６檎のサングループから
の４車入物−１）ＮＡ’ｉ含有するニトロセルロースフ
ィルタにつき反復した。このヒブリド化の後、サブグル
ーフノーコおよびλ−６は初期外信においてインタフエ
ロン活性を示した。サブグループ２−７〜Ｊ−Ｊの第一
の送別において、サブグループ２−Ｊは強力なＩＦＮ抗
ウィルス活性をポし続けた。

したがって、サブグループ、２−６をその個々のｔ種の
クローン（Ｊ　−、ｇ、、／〜ココ−，１ｒと命名）に
分割し、そして上すじのようにして、ｂ旦Ｈ１によシ切
助しうる押入物−ＤＮＡ２有するこれらｌｒ柚のクロー
ンの内５種につき上Ｂピのようにニトロセルロースフィ
ルタに対する３申入物／ＤＮＡの結合、ＲＮＡヒブリド
化および分析を反復した。これら手順の後、クローンコ
ー６０．２、−一６．３および、２−６．７はインクフ
エロン分釘において陽性でめった。ここでも、第一のヒ
プリド化は、これらクローンがＩｋ″Ｎ油性を暗号化す
るｍ　ＲＮ　Ａ葡結合しうる挿入物ＤＮＡτ含街したこ
とを示している。

制限分析はクローン、！　−６，λ、−一６．３および
−−Ａ、７から切晧された挿入物ＤＮＡが同一であるこ
とを示したので、これら３ｍのクローンを７つとして処
理し、これをイー−コリＤｋ１１（λ）（ｐｓＶｊ２り
（シ悪Ｍｌ　）／）ＩＩ　ＩＦ−０、その組挨ＤＮＡ分
子ｐｓＶｊコタ（桓Ｈ１）／）ＩＩＩＦ−０，「ｐ）Ｉ
ＩＩＦ−８Ｖ−ｒｏＪおよびその挿入物ＤＮＡｒｏ）と
合名した。この命名は、このクローンおよび組換ＤＮＡ
分子が垣Ｈ１部位にｌＬｕ１ＦＮ−ｒ−関連ａＤＮＡ（
「ｆ（ＩＩＦ’Ｊもしくは「ｒ」）を含有するフラスミ
ドｐｓＶ７．２りかうなることを示し、この臀定分子は
同定さ１Ｌ７ＩＣ最初のものでるる（「０」、［ｒｏＪ
）。

γ０に対し父差ヒプリド化する組侠ＤＮ人分上記のよう
に単離したｐ）１１１Ｆ−８Ｖ−ｒＤ金使用して集落ヒ
プリド化によジクルーフ−ｇ５（１０００−％−１ｉｓ
ｏｂｐ）ｂ−よひｇ２（／＋２ｊＯ〜／４’００ｂｐ）
のｃＤＮＡから上ｉｃのよりにｖａｎしたクローンの休
符９勿を送別した〔エム・グルシンスタインおよびブイ
−・ニスーホグネス、［ｑ＋定遺伝子を含１′ｊするク
ローン化ＩＪＮＡ（Ｄ単離方法Ｊ　、ＰｒｏＣｏＮａｔ
ｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ　。

第７コ巻、第３り６／〜６よ負（／り７ｊ）〕。この方
法は、ｐ）ＩＩＩＦ−８Ｖ−γＯから作成した放射＆！
活活性試料ユニトロセルロースフィルタ１履さ・れた浴
菌細菌呆洛のｊＪＮＡヘヒブリド化させて、１連クロー
ンの迅速な同定を１」能にする。

上記のようにミクロ測矩仮に貯蔵し、たクローンの保存
物を、予め洲ムさせて洗剤を除去した同様な寸法のニト
ロセルロースシート（孔径０８ａＳμｍ％シュライシャ
およびシュウエルまたはミリボア）上で複表し、そして
これらシートヲカルペニシリン（１０Ｑμｇ／μｌ）ｋ
も有するＬＢ−寒天板上に振袖した。細藺集落全３７′
Ｇにて７晩増殖６せた。電画およびニトロセルロースシ
ートに対テる細菌の固定ケ行ない、この場合１１仄に０
１．ｔ　ＮのＮａ（Ｊ４ｉ（約７分間λ回）、７Ｍのト
リスーハＣＪ　（ｐＨ７、ｔ　）　（ボリア分間）。

０．３　Ｍのトリス−ＨＣＪ　（ｐＨ７，！；　）およ
び／、ｔＭのＮａＣ１（約７分間）、、２ｘ　８８Ｃ（
０，／′ＭのＮａＣ１、０，０／　ｊ　Ｍツク−”−７
ｋｔ　ト１，１　ウＡ（ｐｌ（７，−２））　（約７分
間）で洗浄した。エタノールで充分にゆすぎ、かつ風乾
した後、こ扛らシートを減圧１にｇＯＣで、２時間短、
成し、そして恒温で貯蔵した。

挿入物ＤＮＡｒｕの断片（下ｉＣ）に特異的なりｄｅｌ
制限断片を呆洛ヒフリド化用の試料として役立てた。こ
の動片（〜６．２Ｑ個の塩基対）ｉｊ、　ｐ　ＨＩ　Ｉ
　Ｆ　−ＳＶ　−Ｔｏ　ノｐｄｅ−ｉ　消化生ＪＲ’Ｆ
ｋｚ　’ｌｔ：ｐ％ホリアクリポリミドゲル中で電気泳
動することにより梢表した。美化エチジウムによシＬ）
ＮＡバンドｒ条色させた後、籍定断片ｒ添出させ、残角
する全ての美化エチジウム忙インアミルアルコール抽出
によって除法し１′？：、ｏ仄いで。

時短〜［片をエタノールでの沈澱によシ奴紬し、そし゛
Ｃ１ニック香ｊ１訳」によって５２ｐ−也ｌ振ｒイ丁な
ったしビー争タンリュ・ジエー・リクヒイ萌、「ｆ）Ｎ
Ａホポリラーセでのニックｆｉｉ＋ｔ＆による試験骨子
での簡的兵１占性に対するテオキ７リボ核酸の椋識」、
Ｊ、ＩＶｉｏｌ、　Ｂｉｏｌ　、　第／／３　ｐ、弗ノ
３７〜．２！／負（／Ｙ７７）　〕。この場合、それぞ
れ認、ｊμｌのｄＣＴＰ％ｄ　’１”Ｉ’　１）および
ｄＧＴＰ？ｆ：ｐｏｏμＭにて言上し、ｉ　Ｌ：）（／
（Ｚ　／　００　ｐｍｏ　ｌのα−ＡＴＰ　（γメルシ
ャム社、−０００Ｃｉ　／　ｍ　Ｍ　）と２゜ｊ単位の
Ｄ　Ｎ　Ａ−ポリメラーセエ（ベーリンガ〜社）と紮含
有する３０μｌのｊ　Ｏｍｔｖｌ　）リス−ＨＣｌ　（
ｐ）１７．１１ｔ）と７０ｍＭのｉＡ　ｇ　Ｃｌ　２と
コＯｍＭのβ−メルカントエタノール中において７３℃
にで４！−１分間培養し７℃。禾反比、のデオキシヌク
レオシド三燐葭は、１゛Ｅ九゛２価イ仮におけるセファ
ナツクスａ−７ｓでのゲル１過によって除去した。四匣
に５２ｐ−佇戯された１）ＮＡを０．／容量の一２Ｍ＃
酸ナトリウム（ｐＨｔ、／）とコ、ｊ容にのエタノール
とで２０℃にて沈澱させた。

フィルタ含浸させたＤ　Ｎ　Ａ　Ｖｃ附する上記試料の
ヒプリド化は、ティー拳ハナハンおよび二ム・メセルソ
ンにより夾買的に記載ちれたように行なった〔［−集落
密度におけるズラスミドホ別Ｊ、ジイーン誌、第１Ｏ巻
、第６３〜６７頁（／りざの〕２上記のように居候した
フィルタを０，１％フィコールと０．／　％ポリビニル
ビドリドンとｏ、ｉ％牛血清アルブミンと０．／　ｊ　
Ｍ　ＮｈＣｌとθ、０ＪＩＶＩトリｙ、　−）ｉＣｌ　
（ｐＨＩ　）と／ｍｂ／ＩのＥＤ’ｌ’Ａとにおいてｔ
ｊ℃にてコ時間予備培養し、そしてＯｏＯ，２％フィコ
ールと０．０２％ポリビニルビドリドンと０．０２％牛
血渭アルブミンと。、７ＪｒＭＮａＣ１！と０．／　ｊ
　Ｍ　）リス−ＨＣｚ　（ｐＨ，ｒ　）とｊｍＭＥ　Ｄ
　’Ｉ’　Ａと０．１％ＳＯ８とによって洗浄した。

上記の洗砂浴液と同一の溶液中においてぶ♂℃にてヒブ
リド化をｌ晩行なったが、この場合使用前に予め／　０
０　”Ｑにて３分間変性させた％２Ｐ−標識葛れた試料
ｒ用いた。ヒブリド化したフィルタｆ　Ｏ０３ｆＶＩ　
　ＮａＣｌ！とｖ、０ＡｉＶｉ）リス−ＨＣｌ（ＰＨＩ
）と−２ｍＭのＥＬＩＴＡとにより６ｇ℃にて、２時間
洗浄した俊、風乾しかつオートラジオグラフィにかけた
。

ｃ　ｉ）　Ｎ　Ａフラクションｇ３から侍られた矛ノ；
２３００個のクローンと、ｃｌ）ＮＡフラクションｇ２
がら生じたｇざ０１固のクローンとを選別した。この集
落ヒブリド化選別の結末、フラクションｇ３のａ　Ｄ　
Ｎ　Ａから生ずる１個の呆落とフラクションｇ２のｃ　
Ｉ）　Ｎ　Ａがら侍られる／１１＾１の染浴とが同定さ
れ、これらはγ０試料に強力にヒブリド化した。フラク
ションｇｅ１からの♂イ回の強力にヒブリド化する譲洛
をｒｌ、γ２．γ５　＋　ｒ５＋γ６゜γＢ、γ９およ
びγ１１と命名した。さらに、この７ラクシヨンからの
ヒプリド化の弱いλつの集落を同定した。これらをγ４
およびγノと命名した。７ラクシヨンｇ２からの年−の
強カヒブリド化集落をγ１ｏと命名した。その後の１ｌ
ｉｌＪ限およびヒブリド化分析は、集落γ４およびγ７
がＩＦＮ−１（ｇ、囲体のないことを示した。）２クシ
ョンｇ３からのｌ餉の強力にヒブリド化する集落のうち
ｓ’ｍは初ルｊのグループ／かり得られ、そして７個は
初期ＲＮＡヒブリド化分セ「において陽性？！−ボした
クルーズ／よからのものである。

勿論、上記のように％１４　ｕ　Ｉ　Ｆ　Ｎ−γ仲人物
ＤＮＡＴｏまたはこの仲人物を用いて同定されたりｏ−
ｙｏ他のＤＮＡ挿入物會用いるこのクローン選別方法は
１組換ＤＮＡ技術％会欣、天然源またはその組合せから
生ずるＤＮＡ配列を含有する他のクローン、或いは単一
もしくは多重の塩基置換、挿入、逆転、もしくは削除を
含む突然変異による上記Ｌ）ＮＡ配列に関連したＤＮＡ
配列を含有するクローンについても岡等に使用しうろこ
とが明らかである。したがって、この種の１）ＮＡ配列
およびその同定も本発明の範囲内である。さらに、上Ｂ
ピＤＮＡ配列によシ選別されないがヌクレオチドの配列
の結果、上配置）ＮＡ配列Ｖこよシ陥ち化されるポリベ
プチドを暗号化するよりな１）ＨＡ配列も本発明の範囲
内でめることｔ７解すべさでめる。

さらに、ヒト免疫インタンエロンを８１ち化するＤＮＡ
配列と、非ヒト供給源（たとえは、ねず与、豚、賜、牛
またｅよ犬）ηλらの免役インタ７エロンを亀号化する
１）ＮＡ配列との間には知似性が予調り８れるので１本
発明のＬ）ＮＡ配タリはコレラ件ヒト免役インタフエロ
ンケ暗号化するＤＮＡの選択に除し、ならひにツ１−ヒ
ト抗ウィルス剤および方法に使用する非ヒトインタフエ
ロンのクローン化および表現にふ・いても有用でｂる。

ガｕｌＦＮ−ｒ活性金坐フ！製ププチドの表現ＩＦＮ−
ｒ−関連の押入物−ＤＮＡ七含七するグラスミドでトラ
ンスフェクションもせるべくアフリカ産緑猿（ＡＰ、Ｓ
’　）の￥を緘細胞を９４裟するため、これら細胞ｔテ
ユベンコの改変イークル最小培地（「ＤＭｋＪ　）（（
、＋ＩＢＣＯ）に保持した。

この培地は１０％の納生児の子午面＠（ＧＩＢＣＯ）と
／ｒｎｔ尚シｉｏｏ年位のペニシリンとｌ縮機り１００
１１１１のストレフトマイシンとを含南した。

これら細胞培襲物ｐ（ＤＥＡＥ−テキストラン法の変法
を用いてプラスミド１）ＮＡによって形負転換させた。

次のより２をヤテなった：融合した細胞単一層をトリプ
クンーＥＤＴＡＶｃよｐ約１時間徹底的に処理し、次い
でこれら’ｆ　／　７　ｗＩｖ大（１つのプレート幽＃
）、２参個の穴倉；ｉ！する；コスタ−社）において１
０％の絹生先子牛血渭を含令するＤ　ＭＥ中に分散させ
た。−≠時間後。

細胞をＨＥＰＥＳ緩衝化された最少の必須培地で４回洗
浄し、そしてグラスミドＤＮＡ　（／　、２μｌのＦＩ
Ｚ−ＨＥＰＥＳ緩衝液における約ｌ〜／　Ｏｔ＃／ｌｉ
ｔ　（Ｄ＠度テ溶解）を３００ａｐ／ｍｌのｐｇＡｇ−
テキスト２ン（ファルマシア社）を含有するｌコＯμｌ
のＤＭＥへ加えた。次いで、この混合物を約ｊＯ−、４
０分間＃ｌＩＩ胞単一層へ施した〔ジエーーエツチ・マ
ツフカチャンおよびジエー争エスーパガノ、［ジエチル
アミノエチルテキストランによる猿ウィルス４！−ｏ７
−オキジリホ核敵の感染性の促進Ｊ　、　Ｊ、Ｎａｔｌ
、Ｃａｎｃｅｒ。

１ｎｓｔｉｔｕｔａ　、第ｕ　／　＠、　第Ｊ　ｊ　／
　〜ｊ　７　Ｊ４（ｌり７Ｊ’）ｉジー・チューおよび
ピー・エイ・シャープ「釉濁物におけるん胞の５Ｖｌｌ
ｔｏＪ）ＮＡトランス７エクシヨン：′Ｌ゛−抗ノ駅の
転写および翻訳の効率の分析」、ジイーン誌、第１３巻
、第１２７〜．２Ｑコ負＜１ｙｔｉノ　〕。　４１１胞
をＤΔ１Ｅで３回洗浄した後、新鮮な堵地（ＤＭＥ→／
Ｑ饅子牛血清＋ｉ　ｏ　ｏ　ｌｌｐ／ｍｌＶペニシリン
およびＩＯθμ７７／ｌｎｌストレントマイシン）を加
え、そして縮胞培養物をＣ０２培誓器において３７℃に
て７−２時間培養した。

トランスフェクションのために使片」したグラスミドＤ
ＮＡはりゾチウムーａ剤での溶菌にょクイー拳コリＤＨ
Ｉ　（λ）年落から１装し、セしてエム・カー７等によ
って実質的に記載されたように臭化エチジウムの存在下
でＣａＣ／勾配における等鴨・度遠心分離によって軸装
した〔［プラスミドＣｏ１Ｅｌから得られるンラスミド
クローン化ヘヒクル」、メソッド・イン・エンテモロジ
ー、第６ｒ巷１組挨ＤΔＡ（アール・ウーｂ）、第２６
ｔ〜２♂Ｑ負（／り７り）〕。

７２時間培髪した後、上澄液（〜／２威）？！−形負転
換された細胞〃）ら除去し、そして慣用のインタ７工ロ
ン分伯に使用して、生ｑす挙上活性なＩＦＮ−γ−ＩＪ
Ａ連ホリベグポリの上澄液中における存在を次足した。

上記のように、形質転換細胞によρ生産されたインタフ
エロン活性はＥＭＣウィルスで攻撃されたヒト・トリソ
ミック（Ｔ、２／細胞）につき決定した。このＴ　、！
　／　ｈ＋胞は、使用前にファルコン社の２６大のミク
ロ副定板に７日間接種した。上澄液ｔｏμｌと培地／、
２０μｌとの浴１１ｉ、Ｉ００μＩ！を次いで第１の穴
へ入れ、この溶液の一連の希釈物ｉｏｏμｌ（ム０ｇ１
ｏ＝　０．３　）を順次の穴へ入れた。これらの大へ、
２Ｑ時間後にＥＭＣウィルスを加えた。光学顕微鏡の下
で或いはウィルス訪発性細胞祢性効果を抑制する結晶バ
イオレットで染色した後、これらの穴を評価した。

本発明により生産されたＩＦＮ−ｒ活性を−細胞からの
上庶赦６０μｌを７コ０μｌの培地およＰｉｏμｌのＩ
ＦＮ−γ抗血ｌｆｆ　（ね）・ヶ、匈希釈）と混合し、
３７℃にて一時ＩＭ＋培誉した。／、２００７７にて！
分間遠心分離した後、上澄液を上ｄＣのようにＴ、２／
帷施につぎ分析した。

！ｌＪｌ分限および寸法決定（Ｃよシ演ら足された挿入
物が最も長かったもの（ｒｌ、γ５およびγ１ｏ）のク
ローンに対するこれら分相の結果は下ＨＬ２の辿シであ
った： ｐＨＩＩＦ’−８Ｖ−１＋　　　　１００　　　　　　
　０ｐＨＩ　ＩＦ−８Ｖ−１５００ ｐＨＩ　ＩＦ−８Ｖ−ｒ　１（１００ 上配γ１の活性は、３．５個のへの抗ウィルス保脛に相
幽し、この保護はこれら試料ｒ先ず抗−ＩＦＮ−γで処
理すれば泊失した。；計す限分布■は％挿入’ｔｌ−Ｌ
ＩＮＡｒｒ＋およびγ１Ｑがｐ　Ｓ　Ｖ！２９における
挿入物−〇ＮＡγ１に対し反対の配向であることを示し
た。したがってに＆されたように、ｒ５およびｒｌＱで
形質転換細胞た宿主によっては、伸」らの活性も表現感
れなかった。勿１ｈ御入物１）ＮＡγ、およびｒｉｌ＋
が′帛法にょシ正確な配向に寂かれるなら虹、これら１
ｊＮＡ伸入物で形賀獣挨された宿主はｌ　ｌ、ｔ　Ｊ−
１−γ全表現することが了解されるべきである。’ｉ”
　笑ｂ　γ１ｏにおける配列は、正確な配向に↓・かれ
るとＩＦＮ−γ活性を表現した。

さらに、抗−ＩＦＮ−α（羊）、抗−ＩＦ”Ｎ−β（山
羊）、抗−１ＦＮ−γ（ねずみ）および抗−ＩＦＮ−γ
（兎）を用いて中和分析を行なった。

その結北４次の通りであった： ィンタフエロン　　　抗ＩＦＮでの　　　　ＩＦＮＹ占
性ＩＦＮ−α（標準）　　　　　　　　　　　　　　　
　３０１ＦＮ−α（標準）　　抗−ＩＦＮ−α（羊）＜
３ＩＦＮ−β（標準）　　　　　　　　　　　　　　３
００ＩＦＮ−β（標準）　　仇−ＩＦＮ−β（山羊）＜
３１ＦＮ−γ（標準）　　　　　−−ｉｏ。

ＩＦＮ−γ（標準）　　抗−ＩＪ”Ｎ−γ（ねずみ）＜
３ＩＦＮ−ｒ（標準）　　抗−Ｉ　ＦＮ−ｒ　（兎）＜
３ＦＮ−ｒ （ｐＨＩＩＦ−８Ｖ−γ、）　　　　−−１０゜ＩＦＮ
−γ （ｐＨＩＩＦ−８Ｖ−γ１）　抗−ＩＦ’Ｎ−γ（ねず
み）〈３Ｉ　ＦＮ−７ （ｐＨＩ　ＩＦ−８Ｖ−γ１）　　抗−ＩＦＮ−ｒ（３
Ｑ）　　　　　　＜ｊＩＦＮ−γ （ｐＨＩＩＦ−８Ｖ−γ＋）　　抗−ＩＦＮ−ａ（羊）
　　　　　１００ＩＦＮ−γ （ｐＨ４ＩＦ−８Ｖ−７’＋）　　抗　Ｉ’Ｎ−β（山
羊）／６０これらの中和分相は、ｐＨＬ　ＩＦ−８Ｖ　
−ｒｔによシ生産妊ｔＬるポリベプテドの生物学的粘性
が２槍の惧帽源（兎およびねすみ）からのわＬ−ＩＥ”
Ｎ−γにより中和されるが、その活性は抗−ＩＦＮ−α
または抗−ＩＦＮ−βによって中和ちれないことを示し
た。比軟分相および便米何なった分相（上記）は、抗原
活性におけるこの麦が標準０ＩＦＮ−ａ　、ＩＦＮ−β
およびＩＦＮ−ｒの挙動に平行することを示した。

ヌクレオチド配列（下ｄＣ）は、γ１のＩＦＮ−ｒ暗号
化領域もこのＩＦＮ−γの予想信号配列ｋｌＳ号化する
ヌクレオチドを含肩することを示したので、培地中への
成熟核細胞の分泌の際。

蛋白質の処理が行なわれるものと思われる。

次に第６図を鉦照すれば、挿入物ＤＮＡ　Ｔｏ。

γ１およびγ５の物理地図を、容積の制限酵素にューイ
ンクランド自ビオラブ社筐たはぺ一すン力−社）を用い
る消化により供給者の％足した条件下で作成した。消化
の生成物を、参〇１ｎＭ）リス−ＢＯＡ　ａ　（ｐｌ−
１７，１）と２０　ｍｊＶｌｏＥｌ）ＴＡとにおけるコ
１．２慢アカロース”よたりよ６襲ホリアクリルアミド
ゲル（Ｃおいて喝気泳鯛にかけた。こ（１らを臭化エチ
ジウムで染色し１内眠化した後に分布＋Ｌ、或いｒＬメ
＝トラジス°グラフィーにかけた俊に、側限θ［片釦Ｐ
　−燐酸塩（下記）で末端識椋し、そしてｐＢｔｔｊ、
２λり静細な物理地図と比軟した〔ジエー・ジー・サッ
トクリフ、「太Ｉ％菌フラスミドｐＢＲｊ、２．２の先
金ヌクレオチド配夕１」」、コールド・スズリンク・ハ
ーバ−魯シンポジウム、第グ３巻％第１号、第７７〜り
Ｏ負（／り７ｇ）〕。２つの挿入物の制限地図勿、これ
らの消化パターンに基づいて作成した。これらを、ニー
・エム・マキサムおよびダブリス・ギルバートの方法（
１”ＤＮＡの新規なｊ−序決定方法」、Ｐｒｏｃ、Ｎａ
Ｌｌ、Ａｕａｄ。

Ｓａｉ、ＵＳＡ、第７４を巻、７１ｆ、　！　ｔ　Ｏ〜
６≠負（ｌり７７）〕によってＤＮＡ押入物を順序入定
することにより修正した。

ン２スミド１）ＮＡｋ　ｂ　ｂ’ｌｊ’Ｊ用に一群のク
ローンからｆ）ＮＡを年１跳するため上ｄ己で１史川し
たカー７等の方法（上記）によシｐ）ｉＩＩＦ−８Ｖ−
ｒａ　、　ｐＨＩ　Ｉｆｉ”−８Ｖ−１１、ｐＨＩ　Ｉ
Ｆ−８Ｖ−ｒ５およびｐａＩＩＦ−８Ｖ−γ、０から鉤
裂した。単離さｎた型ＩのＤＮＡを前記と同和ζに中性
蔗糖−勾配遠心分離によｐｈ製し、供に業者にューイン
ク゛ランド・ビオラブ社）により主として推奨された稙
々の貼限＃素により制限した。

制限されたＤＮＡを、φ単位の細菌性アルカリホスファ
ターゼと０，１％のＳＤＳとの存在下で７３”Ｃにて３
０分間脱燐酸化した。２回フェノール抽出しかつエタノ
ール沈澱した後、このＬＪＮＡをｒ−Ｐ”−ＡＴＰ　（
〜Ｊ　０００Ｃ４／ｍｍｏｌ）およびポリヌクレオチド
キナーゼ（Ｐ−Ｌバイオケミカルス社）によ＃）ｓ′末
端標識した。或いは制限断片凱α−標識ｐ３２−ヌクレ
オシド三燐除（〜／　０ＯＯＣｉ／ｍｔｎｏｌ　）の存
在下に制限１）ＮＡ−ポリメラーゼ反応（クレノー断片
、ペーリンガー社）により３′−末端標識した。

１１ｉｂｔ序決定するため、標識されたシ「片を２つの
方法で処理した。成るものは、第コの利限酵系で１袈さ
せるｎｉ＋に、ポリアクリルアミドゲル上でａ製した。

個のものについては、第２の１ｉｌＪ限酵素によって＠
ちに曲数させた。第３の手順にお・い′Ｃは、’　４１
のストランドｔアルカリ袈性とナノ′しに続くポリアク
リルアミドケル電気ｖＫ励とによシ分離した。ｌＴｉ１
１名の賜金、９ｒ短のｌｌｒ片をトリス−４７ＮＩ　％
　−Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ緩衝７医にて７Ｉ；リアクリルアミ
ドゲル上で分離した。弗６Ｌ！！ｊは釉々の制限障１片
（円は椋１１にを示し、矢印は順ル決定力向をｉＩ）オ
ｊヒｐ）ｉＩ　ＩＦ−８Ｖ−γｏ　、　ｐｉ（Ｉ　Ｌｋ
’　−８Ｖ−ｒ＋　、ｐＨｌｌ１ｉ”−８Ｖ−ｒｓとｐ
Ｌ（ＩＩＦ−８Ｖ−γ１０　　とを用いて行なった７１
ｋ　）−）決建方法を示している。

これら断片に、ニー・エム・マキサムおよびダブリス・
キルバートの力伝（上１ｆｆ）に従って分解した。これ
ら生成物を１．ｔ　ＯｒｎＭ　）　＋）スー硼ｗｅ、と
７ｍＭのＥｌ）ＴＡ（ｐｌｌｇ、３）とにおいて種々の
幽此および長さのアクリルアミドグル上でり。。、−０
ｏｏｖにで分画した〇 ｃ［１ＮＡＨΦ入物の各長さを両ストランドからＪＩ８
火定し、標識木端として作用葛せた谷制限部位はこれを
陰間させる断片を用いてノー序決定した。本発明のＩＦ
Ｎ−γ　ＤＮＡ（ｉ、１暗号化ストランドにりき得られ
た複合ヌクレオチド献夕１」およびその対比、するアミ
ノ酸配列を第７図に下す。

次に第７〜ｇ図を番照して、挿入物のヘテロポリマ一部
分ｉＧυよびＡＫ茄む部分（恐らくｍ　ＲＮ　Ａのポリ
Ａ禾端を反映する）により１つの９１」にｍｋべる。診
瑚のため、（申入物には複合す申入物の第／ヌクレオチ
ドから、この複合仲人物の未翻訳部分に充分大ｐ込んだ
ヌクレオチドまで番号を付ける。位飯ざター７／におけ
るＡＴＧ開始トリプレットと、付随ｊざ７−３１２にお
けるＴＡＡ停止トリブレットとはナンセンスコドンによ
シ中断されない解胱枠を規矩する。し；」始伯号および
停止信号によりフランクしたその他任意の翻訳可能な配
列（すなわち、異なる′ｐＰ＋軌枠に存在する）は短か
逼き゛るためＩ　Ｆ　Ｎ−γの予想寸法のポリペプチド
を賠号化することができない。したがって、恐らく、ヌ
クレオチドにりとＡｕｇ乙との間の領域が、本発明によ
るＩＦＮ−γτ晴ラブ化するよりｌスフレメチド配列を
含むと予心さ才し心。

この配列は、１ことえＱよ単−丑７“こは多Ｒ（の編基
匝換ｓ　ＩｋｌＪ除＋　３１ｊ’人もしくは逆転ケ含め
央舊（武具のような遺伝子に対する変化がまだが仏子に
おいて生じていなかつプこり、或いは後（ζこれを使用
してそれにより表現さｔ’Ｌ　／）；Ｊ＝　’）ペプチ
ドの性質ｆｆ、変化させ伯なかった９丁か’Ｊｒ４出イ
９Ｆ除するものでない。首／ヒ、第７〜ｇ図に示したも
の〔上記〕と生理宇土類似しているが樗造上僅かに異な
る遺伝子もしくはポリペプチドｔもたらし得るような任
意の多りレ性を′排除するものでもない。

勿ｋｒ、ｌ’Ａ法（上Ｂじ〕によシポリＡ土ｔＮＡから
得られるクローン化ｅ　Ｄ　Ｎ　ＡはＪ′−木端ヌクレ
オチドを欠如したり、或いは人為的配夕１ｊでさえ含イ
ｊしうることをアカ゛ｔすべさでめる〔アール・、アイ
・リチャード等、「成長心のβ−クロビンａ　Ｄ　Ｎ　
Ａの分子クローン化および配列分相」。

ヌクレイツーク・アシッド・リサーチ、第７巷、第１１
３７〜ｌ／Ｌ／；頁（／り７り）」。しｆこかつで。

ヌクレオチ）Ｊタータフに位置するＡ’ｌ’Ｇが実際に
標準ＩＦＮ−γ晰号化配夕１］の九初のＡＴＧであると
は眠らない。しかしながら、以下の脱明の目的には、ヌ
クレオチドｇ９−タｌにおりるＡＴＧが標準ＩＦＮ−γ
暗号化配夕１」の最初のＡＴＧであると仮定する。

ざらに、成熟核＋ｎＲＮＡにおいてｊ゛′′禾端の最初
のＡＵＧ）リフレットは一般に蛋白質合成のだめの開始
部位である〔エム・コザツク。

「成熟核リポソームはｍ　ＲＮ　Ａにおける開に＝領域
をどのように選択するか」、セル誌、第１ｉｔ巻、第１
１０り〜、２ｊ負（／り７ｇ）〕。ここで、父、疫イン
タ７エロンの第／アミノ緻に対応する複合断片中のコド
ンｉ、ｔ　最初のＡＴＧから、２０のコドンである。こ
のことは、免疫インタフエロンを唱号化するＩＪＮＡ配
夕１ノに先行して、コク１向のアミノ酸よりなる信号ポ
リペプチドを決定する配タリが存在し９ることを７］＜
股している。この批定の信号配列は、一連のＪ庚；水仙
アミノ敵を會南スる。勿馳、疎水牡残曇のこのよりな蓄
積ｒよ、イ呂号白己夕１」に年も俵Ｈ゛ジでめる（ヒー
・ディ一番タヒッドおよびヒーーシー・タイ、１（摸か
らの蛋白質分泌のメカニズム」、イ・イチャー酩、弗−
２ト３巻、第弘３３〜３ｇ員（ツタざ０）ｊｏ「取免Ｉ
ＪＨｕｌｌｉ’へ−γに１珂らかに刈応丁ゐヌクレオチ
ド配夕１」６′よ、ｌ弘Ａ　１１Ｑ＋の１ミノ服を隋ち
一化するヌクレオチドからなっている。インタフエロン
唱号化配夕１ｊ内のコドン用途は、−敷Ｋ　ＩＱＵ乳知
ｍＲＮＡにつき編集されたものＬアール・グランタム等
、「暗号化カタロクハ」途およびゲノム仮説」、ヌクレ
イツク会アシッド・リサーチ、第を巻、第Ｖり〜６．２
負（／りｇｏ））に良く一致する。

勿論、第７図に示したポリペプチドの構造は、生体内酵
素との反応によシ惹起されるポリペプチドに対するイ０
ｊらの変化、たとえばグリコジル化’ｆ”１１ｋ、に入
れていない。したがって、第７凶に示したアミノ敵配列
は生体内で生産されるＨｕＩｋ’Ｎ−ｒと同一でないこ
とｔ７解せねはならない。

の同定 井ｙ…および＾−１’ｕ　ｌでの部分開表によシ予め発
生もれかつＥｃ４ｐＲＩ　リンカ−によるλシャロン弘
Ａアームに対して結合されている胎児ヒト染色体Ｌ）Ｎ
Ａの断片から生じたヒブリドファージの収集物は、アー
ル・エム・ローン等ニよシｌ／ｌ１ＩＲちれている〔セ
ル誌、第７！巻、比ｉｉｓ’ｙ〜７４’ｊｉｌ（／り７
♂）〕。この遺伝子収集物ｔ、前記したようなＰ　−標
識Ｄ　Ｎ　Ａ　ｆ４＋入物全試料として使用することに
よシ、その楊での手ｊｌにより選別した〔ダブリス・デ
ィー・ベントｙおよびアール・ダプリス・テビス、サイ
エンス誌、１４７２６％、第／ｌｒＯ〜Ｊ’−負（／Ｆ
７７）＋ティー・マニアチス％、セル誌、第１ｊｔ巻、
　第Ａｔｒｙ〜７０／負（ｌり７１）〕。コ樵のヒブリ
ド化−陽性ファージクローンを、反後ブラックｈ製によ
シマニアチス等、上記〕。これらグラツク會λＣＭ弘Ａ
−ｇＨＩＩＦ−／およびλＣＭ≠八−ｇへＩＩＦ−λと
命名した。

λＣ）ｉ４ｔＡ−ｇ）ｉｌＩＦ−／およびλｃＨａｈ−
ｇｄｌｌＦ−一の両省は、卵母糺ノ厄甲に注入もれると
ｉ’Ｎ−γγ占性會庄じた。！ｌＪｌ分限が示したとこ
ろでは、一つの１ラツクはλＣＨ＋Ａ−ｇ）ｉｌｌＦ−
／がλＣ上１４（Ａ−ｇＨＩＩＦ−λよシもその３′末
端において短かい点で異なつでいる。しかしながら、両
ブラックは生物学的に活性であるため、λＣＨ弘Ａ−４
ｆ（ＩＩＦ−／に２ける喪失配列はＩＦＮ−γ暗号化配
列の／部ｌたは少なくとも生物学的活性を暗号化する部
分でないと思われる。

さらに、λＣＭ弘Ａ−ｇＨＩＩＦ−／およびλＣＨ４′
Ａ−ｇハＩＩＦ’−コの制限分相は、それらがＩＦＮＩ
に対する暗号化配列内にイントロン金含癩することを示
した。しかしながら、ブラックの陽性生物学的活性は、
走伝子が南アフリカ汲蛙（Ｘ５ｎｏｐｔｓ＋ｓ　　Ｉａ
ｅｖｉｓ　）中で正確に処理されることｔ示している。

１１ｉ’ｊ″Ｊ−ｒ活性全暗号化する朱色体逼伝子は細
ｍ宿主中では衆玩しえないが（イρ」故なら、その介在
する配列がこの極の宿主によｐ正確に処理されえないか
らでるる）、呆色体造伝子はヒト非暗号化領域、イント
ロンおよび暗号化領域が高レベルの表現および生物学的
活性ＩＦＮ−ｒへの生箆物の正確な処理に対しＮ、賛と
なるような成熟核宿主においてＩＦＮ−７の主層に対し
極めて有用であることを了解すべきである。

活性の向上 蛋白質の生産レベルは３つの主長な因子によシ支配され
る：すなわち、細胞内におけるその遺伝子のコピー数と
、これら遺伝子コピーが転写される効率と、これらが１
訳ちれる効率とである。転写および翻訳（これらが−緒
になって表現ｔｌ−栴取する）の５ｃ／Ｊ率は、次いで
、カ「望の暗号化配列の前方に通′品位にするヌクレオ
チド配列に依存する。これらのヌクレオチド配タリまた
は赤現制碑配夕（ｊｌ、藷に、ＲＮＡホリポリーセが反
応して転写ｒ開始δゼゐ位置（ノロモータ配タリ）と、
リホソームがｍ　ＲＮ　Ａ　（％ｘ写の生地物）と和合
しかつ反応して翻訳ケレｊμｄδせゐＬ亀とｔ規定する
。必らずしも全てのこのよ’）Ａ表現制御配列が同等な
効率をもって伽舵すると龜眠らない。したかつて、抽望
蛋白賀のためのｌ付異的暗号化配列をその誇接ヌクレメ
チド配列から分離し、これらｔ他の公知の六税制御配夕
１」に融合姑せて一層制レベルの表現ｒ倚るよりに°ｒ
るのが有利である。これは達成されており、ν「たに処
理されたＬＪＮＡ断片紫より多いコピー数のプラスミド
もしくはバクテリオファージｖ５等体中に挿入して、　
Ｍｌｌ円内迫伝子コピー数′ｆｔ増加させ、それにより
嵌玩蛋白負の収率を向上させることができる。

幾つかの表視制御配列ヶ上記のように使用することかで
きる。これら線、メペレータ、ツロ七−タ、イー・コリ
の乳糖オペロン（＋−ｌａａ　糸Ｊ　）のリポソーム結
合および反応配列（たとえばシャインーダルガルノ配列
などの配夕ＩＪｋ包含するン、イー・コリのトリブトフ
ァン合戟酵累糸（ｒｔｒｐ糸」）の対比・する配列、フ
ァージλの主要なオペレータおよびプロモータ（上部と
＋＝様に０ＬＰＬおよびＯにＰル）、繊維状単−鎮Ｌ）
ＮＡファージの吊り御領域、または原始根もしくは成熟
核細胞およびそのウィルスの遺伝子の表現を１ｌｉ１４
　御するその他の配列、またはその組合せを包含する。

したがって、適当な福主における特定ポリペプチドの生
産を向上させるには、そのポリペプチドを暗号化する遺
伝子を前記と同様にｄＡ製し、これを組換ＤＮＡ分子中
へその従前の表現制御配列に近接して或いは上目ピで改
善された表現ｇ＋ｌＪ御配列の１つの１ｌＪＩＪ御１で
挿入することができる。

この種の方法は当業界で公知である。

翻訳の効率を向上させる他の方法は、化学的または酵素
的にし１１製された。Ｊ−リボヌクレオチドを開始コド
ンの前に挿入することである。このび第、２構造か倚ら
れる１３　よジ１）・細には、−始ＡＵＧコドンが各局
に接近しりる位ｉｔ（すなわち、第、２＠造により地閉
δイしていない）においてヘヤビ／の頂部にまたは仙の
年−知領域に生ずるよう配りリヲ設８１することができ
る。妊らに、上記シャインータ゛ルカルノ断片の位ｆＭ
ｋよひ配列も同様に最適化させることができる。ｍ　Ｒ
Ｎ　Ａの一般構造（折曲け）の１仮性が轍告芒ｇている
しティー・イセレンタントおよびタブリス・ファイエ＃
＊　　「ｒｎＲＮＡ　Ｃ７）１４．２ｍｍ’Ｊｉ”よび
翻訳囲貼の効率−１、ジーン関、第り巻、第／〜／−負
（／りｇｏ））。

さらに、所望生成物の細胞収率にお・りる増加は、細胞
中に利用しうる迫伝子数の増加に依存する。これは、Ｈ
ｕＪＦＮ−γ逼仏イ（その転写および翻訳制御巣子を伴
いまたは伴わす゛に）をよシ多いコピー数の７″ラスミ
ド中へｉ　７ｃは温度制御きれたコピー数のプラスミド
（すなわち。

プラスミドのコヒー数が温度上昇後に増力Ｕするような
突然ｆ異を竹なうプラスミド）中へ挿入して達成するこ
とができるしとｍ一つ−リン寺、［クローン化逼伝子お
よびその主産物の増殖に対する温展仏存性コヒー数を有
するグラスミド」。

ジーン恥、Ｒ４６巻、第り／〜１０１．負（／り７タリ
〕。

代案として、逼伝子短の堀カロは、たとえば。

前Ｂじの方法で処理された組換Ｌ）ＮＡ分子を雛型バク
テリオファージλ中に挿入することにより。

最も簡単にはプラスミドを制限酵素で消化して線状分子
【得、これを次いでル１」限ファージλクローン化ベヒ
クル〔たトエば、エヌ・イー・ムレ−等、［試験管内組
裸体の回収を簡単化さぜるλファージＪ　、　ＪＶｉｏ
　１．Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ　、、　ｆ、　／　５０巻
、第３３〜６７負（／り７７）およびエヌ・イー・ムレ
−等、［バクテリオファージＴμからのＤＮＡ　リカー
ゼ遺伝子の分子クローン化］、Ｊ。

Ｍｏ１．Ｂｉｏｌｏ、第／３λ巻、あ弘り３〜Ｊ−０３
頁（／り７り）に＝ｅ載された型のもの」　およびＤＮ
Ａリガーゼと共に培養して生成された組換Ｌ）ＮＡ分子
と混合することによシ達成できる。次いで、１カ望の組
換ンアージを前記と同様に選択し、これを使用してイー
働コリの′４ｃｊ主侑８１、ｒ浴原化さ一部る。

したがって、本発明の（甲人物Ｌ）ＮＡｉＳｖ、ｔコタ
フラスミドから取シ用して、これをＭｉＪ乙じと１ｊす
（ｋに他の表現ベクター申へ仲人し、そしてこれらベク
ターを前ｈＣと同様に独々のイｔ１王で使用して１に’
Ｎ−γを貼り化する遺伝子のり玩を改善しうることを了
解ずべきである。

また、ＩＦＮ−ｒ活性を示すポリペプチド（本発明によ
ｐ調製）は、融合蛋白質（たとえは分泌を指弔する原始
根もしくは成ンＶ１核Ｎ−木端セグメントに結合）とし
て、グロインタフェロン（たとえば、分泌の隙間ｈ−ａ
れうるインタフエロン信号配列の全部筐たは一部から出
発する）として、或いは成熟インタフェロン（表現およ
び分泌の際の初ル１メチオニンを含む任刈、の異質アミ
ノ酸の開裂による）として、或いはｆ−ｍａｔ・−イン
タフェロンとしても１候しうること全了解すべきである
。本発明において一つの’ｆ−ｔに上用なポリペプチド
は、容易に一散惑れるアミノ酸またはアミン末端に結合
された一連のアミノ酸金有する成熟免疫インタフエロン
であろう。この構造は適当な宿主における蛋白質の合成
を可能にし、ここで＆熟免疫インタフエロン中に存在し
ない動始１ム号が心安と熟れ１次いで余分のアミノ酸が
開裂して成熟免疫インタフエロンを生成する。

ポリペプチドのこれら異なる形態の収率は。

上内ピ手顔０いずれかまたけその組合せによシｎ」上さ
せることができる。さらに１本１）ＮＡ配りりに使用さ
れるコドンの幾つかまたは全部の代りに、他のコドンを
使用することもできる。これらの置換コドンは、代替さ
れたコドンにより暗号化されるものと同じアミノ酸を暗
号化するが。

よシ高い収率でポリペプチドを生産することができる。

或いは、アミノ酸を換またはよｐ長い％Ｌ＜はより短い
１４　ｕ　Ｉ　Ｆ　Ｎ　−ｒ関連ポリペプチドｔもたら
すコドンの７個もしくは組合せを変えると、その性質を
有益に俊化させることができる（たとえは、安に性？垢
太ちせ、浴解鼓勿ル太塾せ、抗ウィルス油性金１％大さ
せ、−９ｊ−Ａ廿成酵累枯性を小太させ寸たは伯主竹異
性範囲を拡大６せる〕。

板抜に、本発明Ｑ組候ＤＮ人分子により生糺δれるポリ
ペプチドの油性は、本発明の種間を逸脱することなく周
知手段により、不発明の１３ＮＡ配夕１ｊもしくはポリ
ペプチドを断片化、改変または誘導体化して向上させる
ことができる。

たとえは、他のインタフエロンを有するヒブリドを、適
当な宿主にてゑ伝子レベルで調製しかつ永埃さぜること
ができ、或いは化学合成法によシ蛋白質レベルで行なう
こともできる。

本発明のポリペプチドの収率を向上させる方法の一例を
第り図に示す。これはｐＬ温度訪発性の総状糸を使用す
ることを含む〔イーーレマウト勢、ジーン誌、第／よ巻
、第８／〜り３頁（／りｇ／）〕。この栴造は、成熟γ
インタフエロンの第１アミノ酸を暗号化するヌクレオチ
ドトリクレノ）（ＴＧＴ）に直接融合ちれたＡＴＧ出発
コドンを喘・似とし１こ。この構成はｆ’　−Ｍｅｌ　
−１’Ｎ−γ全生産する。しかしながら、初期メチオニ
ンはイー・コリ自身によジ表杉りの際に関裂されまたは
後に除去されて成熟１１”Ｎ−γを生成する。

この構造は、プレーγインタフエロンを略号化するＤＮ
Ａ配列を治するグラスミド（ＭＰＩａ）（どのヌクレオ
チドもメチル化されず、したがってその配列におけるＮ
墾鶴部位を餉鎖しないようイー・コリの９ｍｌ園株から
侍たもの）をΔひｌによシ制限してｉａされた。成熟ｒ
−ＩＦ’Ｎの最初の弘つのコドンを喪失している得られ
た断片を、次の順序 ＡＧＣＴＴＧ’ｌ’ＴＡＣＴＧＣＣＡｔ；ＡＣＡＡＴＧ
ＡＣＧＧ’ｌ”ＣＣＴＧ を鳴する合成リンカ−へ結合させた。このリンカ−は／
端部に坦ｎｄｌｌ残部を肩しかつ他端部に入り」残部を
弔すると共に、成熟γインタフェロンの最初の弘個のア
ミノ酸に対する暗号化配タリ（Ｔｕ’ｒＴＡＣＴＧＣＣ
ＡＧ　）を弔する。次いで。

倚ら１１．ｆｃ、　１１片盆シ竺Ｈ１で開表６−１（こ
の部位はＩＦＮ−γｌｌｋ’ｉ号化配列の昇化配列在す
る）、仄いでｔｒｐンロモータヲ４′Ｊするグラスミド
の世す１１１部位とＲａｍ）ｉＩ部位との間に挿入する
（第２１８！！、ｌ）。

次いで、侍しれたフラスミド忙易ｊす１ｕおよび４復Ｒ
１によりυ６絞８ゼ、垂１する木端會Ｓ／によシ除去し
た。こ！しらの保作は、些＞ｏＲＩ−坦すｌロノ丁片と
１．）≧：ｅｌ≧、　Ｒｌ市り１混およびＳ　／　ＩＮ
ｊ化によジ生じたＡＴＧ開始コドンの直後に融合されて
いるＩＦＮ−γの最初のアミノ酸を暗号化するトリフレ
ット（ＴＧ’ｌ’）との８り除勿もたらした。

この表挽ベクターからｔｒｐフロモータ（Ｉｌ″餘去し
かつこれｆＰＬ７’ｏモータで文俟するため、　ｐＰｉ
、ａコ３６（ヨーロッパを針山に第４’／７Ａ７号に記
載）を拍ヱＲ１で制限し、これを残部（クレノー）に充
填した。次いで、ＤＮＡ配列ｆ：、Ｂ鼾すｉＩで制限し
、この配列を上記グラスミドからのＩｈ”Ｎ−ｒｔＪｋ
号化配列ｔ−ｉするＨｐａ　ｌ　−Ｂａｍｌ−１ｆ〜ｒ
片と組合せた（第り図）。

次いで、イー・コリ５ＧＩＩ０４Ｌ４Ｌ（ｐｃ／Ｉｒｊ
７）を形質転換させ、このンロテアーゼマイナス菌株は
本発明のＩＦＮ−１’宮イイＰ１．表現ベクターと共に
感温性レプレッサを弔する。この形質転換ちれた菌株ｅ
よ、ＩＦＮ−γの活性を示すホリベグチドを全細力民蛋
白貝の約／Ｊ％のレベルで生産した。

さらに、１０」じｊＪＮＡ配列と嚢状ベクターｐＰ１．
ｃλざ（レマウト等、上記）とを１史用して同様な構造
を作成した。この構造は、ＩＦＮ−γ収率が若干低いた
め、従前のｍ造より好ましくない。

しかしながら、これはよｐ良好な長ルｊ安定性を有する
。その安定性のため、この培養物（イー・コリに／コム
１１１△ｔｒｐ（ｐＰＬｃ、２ｇ−ＨＩＩＩ；’６．２
））全アメリカン会タイプ・カルチャー・コレクション
（下記）に物、ｈ七した。

動９勿細ｊ厄におけるＩＦＮ−γの表現泪１１菌生圧さ
！Ｌ１シたがってクリコシル化されていないＩＦＮ−γ
は缶物学的に活性であるが。

が示δれているしフィ・り−・イラン％、ＰｒｏＣ。

Ｎａｔ　ｌ、　Ａｅａｄ、　Ｓａｉ、　Ｕ　Ｓ　Ａ　、
　躬７ｇも、第／ｌＯ／〜ｏｓ）＜＜ｉｙざ／）〕。し
かしなから、グリコジル化蛋白負は１だ光分に有性化３
れていない。

したがって１本発明りＬＪ　Ｎ　Ａ　６１；タリを使用
してクリコシル化ＩＦＮ−γを動物紅胞甲に生産も→す
て、これをｎ１Ｊｔｉｅ　ｔ、たイ４１々の治む（およ
び臨床方法ふ゛よひ組成物に使用するのか４１福であろ
う。

異賀咄乳知現ち。に赴いてクローン化遺伝子を表現さぜ
うる幾ねかのクローン化ベクターが現存する（たとえは
、ビー１ジエー慢ザウザンおよびビー・ベルブ、Ｊ、　
Ｍｏ１．Ａｐｐｌ、Ｇｏｎｅｔ、、第１巻、第３２７〜
グ／負（７か−）；ニス・スブラ−ｒ　＝％、　Ｍｏ　
１．Ｃｅ目　Ｂｉｏｌ、、　Ｍ４／　％、ｊ３Ｆ！ｉｌ
ｌ〜２弘負（／りｇｉ）；アール・ジエーーカウフマン
およびビー・ニー囃シャーン、　Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ。

Ｂｉｏｌ、（出版中）〕。本出願人は、ジヒドロホレー
トレタクターゼ（ＤＨＦ’Ｒ−）に不足している支那ハ
ムスター卯画胞（Ｃｉ−１ｏ）の同１１モ形賀転換を宮
む糸（ジー会つルラウブおよびエル・ニー・ケイシフ　
、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　ｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓａｉ、Ｕ
　Ｓ　Ａ。

第７７巻、　第１７２／ｌ　〜ＪＯＱ　（／り（ｆＯ）
）ｋ、２種の７ラスミドすなわちｐＡｄＤＳＶ（Ａ）−
３〔アール拳ジエーΦカウフマンおよびビー・ニー・シ
ャープ、Ｍｏ　１．Ｃｅ　ｌ　１．Ｂｉｏ　ｌ、　（出
版中）Ｊおよびヒト１に″Ｎ−γ全暗号化するｐｓＶ、
２−ＩＦＮ−γと共に使用するよう選択した（第７０図
）。

ＣＨＯ，ＤＩＩＦＲ−細胞（ビー・ニー・シャープの４
ｆ賜、この同時形質転換に使用）を、／Ｑチ胎児生血ｆ
＊（Ｆｅ２）およびケンタマイシン（ｊθμ５１／ｌ１
ｌ）を細光したα最少必須培ｊｌｐ。

（ＭＥ〜ｌ）（ギブコ社、カタログ腐０７．２−／りｏ
ｏ）を含廟する組絨培養フラスコ（ギブコ社）中で３７
℃に維持した。形寅私換体を上記のようにかつαＭＥＭ
（リボヌクレオシドとテオキシリボヌクレメシドとを欠
如する（キブコ社、カタログＡ６０７コー２ｏｏｏ））
および１０％透析ＦＣ８において培養した。後者の培地
金１選択培地」とｈう。

クリコシル化ＩＦＮ−γの衣睨１（１更川した”　Ｎ’
　も”ｔｌ　シフ７　スミＦ’　（１）　Ｓ　Ｖ　、！
−１ｋ’　Ｎ−γ）　ｆ、　ｐ１４１１Ｆ−８Ｖ−γ＋
ｏ　（アール嗜テホス等、ヌクレイツク・アシッド・リ
ザーチ、第７０巻、第一４ｔざ７〜．ｆＯ１貝（／２ざ
−ＶＪ？ｃ９ａｕ　ＪＡ　［１ＦＮ−１の３′非暗号化
饋城に位置する識別部位］により制限して〜＝１！した
し第６図Ｊ０　Ｉ　ＦＮ−ｒを含廟するイくＩられた約
ｒｓ。

塩基対の断片を蔗糖勾配上で鞘製し、次いでこれを部分
Ｂａｍ　Ｉｆ　ｌ　Ｉｇ化ｐＰＬｃ、２ざ３３衣机ベク
ター中に結合６せた。表現ベクターｐ　Ｐ　Ｌ　ｃ、２
♂３３はＩ）　Ｐ　Ｌ　ａλｇ〔ヨーロッパ９子許出願
第≠１７６７号〕　と同一であるが、ただし合成リンカ
−（陽）ＩＩ−プ鰺ニ一旦ａｌｌ−秒■−襲」Ｉ　−Ｘ
ｂａ　Ｉ　−Ｐｓｔ　Ｉ　−ＢａｍＨＩ　）　７ｉ　ｐ
ＰＬｏ、２Ｊ’の独特の旦馳）１１部位〔レマウト等、
ジーン誌、（出版中）〕中へ仲人した。イ１られたＩＦ
Ｉ″Ｊ−γ金山の組換ＤＮＡ分子ｆ　ｐ　Ｐ　Ｌ　＊　
Ｓ　Ａ　−Ｉ　Ｆ　Ｎ−γと命名した。

次いで、この分子（！−Ｈ１ｎｄｌｌｌおよびＢａｍＨ
Ｉで制限してそのＩＦＮ−ｒ宮令の断片奮阜離した。こ
の断片をｐ８Ｖコーｄｂｆｒの世ｎｄ出／Ｂｇｌ　ｌ　
１６１１１８４体中へ結合して、この）２スミド中のＨ
ｉ−ｎ　ｄ　ｉｌｌ　／　Ｂｇ　ｌ　Ｑねす与ｄｂｆｒ
　ｃ　ＤＮＡ担持断片をＩＦＮ−ｒ担狩〜ｒ片で飯挾し
た。この結合に使用し７ヒ改震ＰＳＶλ−ｄｂｆｒ（ベ
ルブおよびカナｍ＝の寄贈）はｐｓＶ−，２ｄｂｆｒと
同一であるが〔ニス自すプラマニ等、　’Ｍｏ１．Ｃｅ
１ｌ。

Ｂｉｏｌ、、　　第１巻、第Ｉｊ参〜６≠負（ｉｙｒｉ
）　　〕、ただしｐ８Ｖ、２−ｄｈｆｒ　０ｊ（９９Ｒ
Ｉ−、Ｐｖｕｉｌ　ｉＱｉ片を有する原始根配列はｐＭ
Ｌの彫碧Ｒ１−ｐ見ｌ■断片、すなわち哺乳類細胞にお
ける複・製に対し阻止的な配列を含七しないｐＢＲＪ、
２．２の１１」除突然変異株〔エム・ラスキーおよびエ
ム・ボッチャン、ネイチャー誌、第２９３巻、第７２〜
１／ｊｔＣ／り１／）〕で置換した。したがって。

得られたグラスミドｐＳＶ−ＩＦＮ−γは、８Ｖ４ＬＯ
早期フロモータの直下流かつＳＶ弘θ切断部位およびホ
リアデニル化イざ号の上ηＬのＩＦＮ−ｒ暗号化配列を
室上する（第／θ凶）。

同時形質転換に使用した他の７ジスミトは、ｐＡｄｉ）
Ｊ４ＳＶ（Ａ、）−Ｊ　（ヒー・シャープのを贈）とし
た。これはねすみＤ　１ｉ　Ｆ　Ｒ暗号化配列をせ刹す
る（第ｉｏ図）。こｇは細胞全１７１−ＩＦＲ”六机型
に形負転侠し、このことは培択培地（すなわち、リボヌ
クレオシド２よひテオキシリホヌクレオシドを久μ口す
る培地）ＶＣおいてＲ’４　Ｋｎする形翼転換体の能力
により示３れる。

グラハムおよびパンデルニブによｐ記載されたと同＠な
方法金使用して、ｃｉｉｏ細胞ｅｌＱＪ時形質転換させ
た〔エフ・エル・グラハムおよびニー・ジエー・パンデ
ルニブ、パイロロジー。

第ｊμ巻、第ｊ″３６〜Ｊ５’ｊ＊（／Ｐ　Ｊ））。　
先ず２組織培養フラスコ（／、２！継）へｊｘ１０５個
の細胞／フラスコを２ｊ時間接権した後、これら細胞へ
ＤＮＡｔカロえた。−釉のグラスミド（上記ンを４嘔Ｈ
１またはシュＫｌに↓シ開腋させ、１裂１）ＮＡの適当
値（辿？６、金部で豹１０μｇ）ｔ−柚々の相対比で混
合しくｐＳＶ−ＩＦＮ−ｒ：　ｐＡｄＤＪ４８Ｖ（Ａ）
−Ｊ　ｉ　　／　：　／　。

１０：ｌおよびλｚｔｉ）、このＤＮＡ’ｉｉエタノー
ルで沈澱させ、これを−００μｌの１ｍＭ）リス−）ｉ
ｃ／　（ｐ）１７．コ）と０．１ｍＭのＨＥ　Ｐ　Ｅ　
Ｂ（−７，２）とに再懸濁させ、そして得られた浴液に
一２ｊＯｊ’ｌ　（λｘ　ＨＢＢ　：　２１０ｍＭ　Ｎ
ｖｒＣｅ　＋Ｊ　、（７ｍ　Ｍ　Ｎａ　２　Ｍ　Ｐ　０
４　ｉ〕００ｍｈｌ　ＨＷＰｈ；８（ｐＨ７，−２））
へゆつく夛ピペットで加えながら。

ＨＢＳ俗液を連続的に通気することによシ、細胞へ加え
るＤＮＡをル〜製した。

燐酸カルシウム−ＤＮＡ沈澱を室温にて３０分間生成さ
せた後、！００μＥ懸濁物を予め増−殖培地を除去した
単一層へ加えた。フラスコを傾斜嘔せて、全単一層上へ
の沈澱物の消散を確保した。

フラスコを室温で３０分間放臘した後、５ｍ６の培地を
加えそしてこのフラスコｔｌ−３７℃にて弘時間培養し
た。次いで、ｉｏ％グリセリンを言肩する培地で帥１胞
を処理し、そしてこれらを培地で２回洗浄した。約２日
間後、細胞は融合に達した。次いでこれらを送択培地中
へ柩継きしく１＝ｉ０）ｈ　この迫択培ＪＩ！Ｉを５日
り隔で補充し、Ｉｌｌ？、Ｉ−２過間後に年−の未洛盆
鉄察することができた。これら推定の形賀転俟体倉りロ
ーン化シリンタ中でトリプシン処理し、そしてこれらｔ
小型フラスコ（、ｌｔ７Ｍ）へ杉し／ζ。

先ず最初に、６柚の同時展り転換（４偲Ｒ１／沖１（１
：それぞれＤＮＡ比／：／、／θ：／および−２，ｔ：
／）から／３！稙の形賀転換体を１４！−離した。これ
ら形賀転倶体の年一層から培地の試料を選別して、イン
タ７エロンをｍ＆的に分泌する形ＪＸ転俟体を検出した
。

これらの分析は、脳心１／Ｉ氷ウィルス（ＮＭＣ）のヒ
）ＦＳ−グ繊り芽細胞に対するａｉ胞蕎性効果を抑制す
るｒインタ７エロンの能力に基づいた。この仕上〔のた
め、増焔培地における試料の一連の布釈物（／　：Ｊ）
を調製し、これらをＦＳ−≠細胞のサブ融合単一層を含
むざ×ｌ−２穴のミクロ測定板に移した。３７゛Ｃにて
２μ時１Ｌ４ｊの培養後、壇殖培地を父倶しそしてＥ　
ｋｌ　Ｃの／Ｓを各穴へ加えた。さらに２≠時間培簀し
た後、プレートを観察し、細胞に関するウィルスの細胞
＃ｉ性幼来に約する保護極度に従って個々の穴を評価し
た。さらに、ＩＩｉ’Ｎ−γの保存浴液を各穴につぎ内
部標準として使用した。この分町結来金１−夾験至単位
」すなわち細胞動性効果の１０％抑！ｌＪをもたらす希
釈の逆数として表わす。この「実験室単位」をナショナ
ル・インステチュート・オプ・ヘルスのヒト白血球比較
インタ７エｏン（Ｇ−０，２３−タｏｉ−ｚｓ７）と比
較した。Ｉ　ｌｉ’　Ｎ−αの７国島単位は、この分析
方式におけるＩＦＮ−γのｌＱ「夾数室年位」に＃１は
等しい。

さらに、この分析には’ＩＮの比較形質転換体（それぞ
れプラスミドｐｓＶ２−ＩＰＮ−γおよヒｐＡｄＬ）Ｊ
７ＳＶ（Ａ）−ｊ　（７）Ｅ（ＩＯＲＩ　オＪ：ひ坂＞
ｍＨＩ消化物）を使用した。これら比較のいずれを使用
しても’１）ＨＦｕ＋形賀転換体ｒ！、得らレナカツｆ
Ｃ０ｇらに、？Ａ化ｒｌＡｄｌ）、ｚ４ＳＶ（Ａ）−Ｊ
　　１）ＮＡのみを使用した形５！Ｌ転換体は一例らの
検出しうるインタフェロンｒ占注τ庄じながった。

これら分析のね果を第１衣にがり−。

、２ｊ：／　　　　　ＥａｏＲＩ　　　　　　　４１　
　　　　２　　　　　　ｊＢａｍＨＩ　　　　　／　　
　　ｊ　　　　／１０：／　　　　Ｅｃｏｋｔエフ、２
　　　　／□Ｂａｍ）１１　　　　／ｌ　　　　／４’
　　　　ｊ／：／　　　　ＥａｏＲｌ　　　　／２　　
　　／ｊ　　　　／ｊＢａｍＨＩ　　　　ｌｔ　　　　
６　　　１３（ｉｌ　　ｐｓＶ、２−ＩＦＮ−７”／ｐ
ＡｄＤ、２４ｓＶ（Ａ）−３（２）　　これは、所定レ
ベルのＩ　ＦＮ−ｒを生産する形質転換体の数を示す。

給米Ｑよ夾験呈牟位／祷として穴わず。

最高の生産性形質転換体の２批τ泗択し、こ扛らをＥ−
１０ＢおよびＥ−ｉｏｃと翻名した。イロ」故なら、仁
れらは両省とも旦叩Ｒ１およびＩＯ：／のＤＮＡ比を用
いて！１４＃！シたからである。しかしながら、形質転
換体ｔＳ択する紬の非選択培地におけるλ日間の細胞培
養は、単離形翼転換体を少数の形貴転換Ｍ胞から生ぜし
めたでめろう。したがって、を定ＤＮＡ比の意義は確か
でない。

これらのＩＩ＋ｉｉｉ胞糸は、約ｊＯ，０００ｊａｂ単
位／Ｉ　ＦＮ−１ｍｔを与えた。これは、リンパ球を刺
戟する古典的方法によるＨｕｌＦＮ−γ生産に匹敵する
が、さらにこれは構成的であって鶴発ｆ！：例ら必嶽と
しないという利点を有する。本発明の方法によるＩＦＮ
−γの生産は、さらに、ＩＦＮ−ｒが細胞培養の誘発に
よる従来のＩＦＮ−γ生産の場合と異なシ他のリンフ才
力インによｐ汚染されないというオｔｌＡをも壱する。

Ｅ−ｉｏＢ３およびＥ−ＩＯＣＩ、（Ｅ−１０Ｂおよび
ｍ−ｔｏｃの再りローン化単−果落からｎＩ製されたサ
ブ系統）は、長期増殖の際、その皐励が相違した。Ｅ−
ｉｏＢ３は、ｉｓ同目と２Ｑ回目との間にＩＦＮ−ｒの
著しい生産低下を示し／こ。しかしながら、Ｅ−１０Ｃ
Ａを使用した場合は、ＩＦＮ−γ化層にイ０」らの低１
も観察されなかった。さらに単−集落としてｍ−１ｔ）
Ｃから生じた他の細用糸？ｒ９ＬＶＪ、、　／θｌ目Ｖ
ｌメソトレキセイト（ＭＴＸ）　　中で増殖させると、
Ｅ−ｔｏｃより約６倍高いレベルにて■ｉｌＩ′Ｎ−γ
ｒ生座した。

さらに生産０ｎＭメソトレキセイト（Ｅ−７ｏｃｉｏｉ
）にで増庖きせた俊に選択した集洛を、２６０ｎＭ　Ｍ
ＴＸ（Ｅ−ＩＱＣ１０／−，２ｊＯｎＭ）にて増殖式せ
た。ｊＯｍｉの培」也中で増殖させたこれら細胞の／７
０Ｃｍ２の融合単一層は３×１０５の実験室単位のＩＦ
Ｎ−ｒ／成の培養物を生成した（比活性：　２−！ｘ／
　０’　（ｊａｂ単位／９））。

この細胞培養物〔支部ハムスター卵＃Ｉ胞（ＤＨＦｆσ
）（Ｒ／ＱＣ１０／　　、２．ｔＯｎＭ）をアメリカン
・タイプｅカルチャー・コレクションに寄託した。

（「Ｒ」はｒＣＪの代りに上部ＲＩ消化′（ｆ−指示す
るものである）。メソトレキセイトおよび他の増殖方法
を使用して、さらに増動および生産の増大が司龍となる
。ざらに、市レベルの１に１す−γにて１ｖＩ殖させて
多蓋生並性菌株についての起りうる壽性問題を避けると
共に、培養コストを減少させるため、よシ少ない割合の
血清（たとえば、０．ｊ％対ｊチ）　ｖｃて増殖させる
細胞を選択することができる。

天然ＩＦＮ−１の分子量の初勘推足１ｌＩＬ＜ゲルｆ１
過技釣ニよタテ６１１１足）はｐｏ、ｏｏｏ　〜ｔｏ、
ｏｏ。

の範囲で変化した〔たとえば、ワイ・ケイ・イック、Ｐ
ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　
第７１巻、第７６０／〜０！貞（／りｇ／）；エム・ビ
−ラングフォード等、　　Ｉｎｆｅｃｔ　Ｉｍｍｕｎ　
、第２６巻。

第３６〜ｔ／頁（／り７り）〕。さらに最近、２３．０
００〜．２ｏ、ｏｏｏの分子量推定がなされた〔クイ０
ケー・イツプ灼・、Ｐｒｏｏ、Ｎａ１．Ａａａｄ。

Ｓａｉ、ＵＳＡ％第７２巻、第１１２０〜２１７頁（／
り♂２）〕。

これらの最近の推冗値は、ＩＦＮ−ｒが同一もしくは同
一でないコ０，０００．．２ｊ、０００サブ単位からな
る凝集物、恐らく夕゛イマーであることを示唆している
。本発明のＣＨＯ生産Ｉ　ＦＮ−ｒ〔細胞系統Ｅ−ｉｏ
ｃｉｏｉ）はそれぞれ分子量めった。これらの槓ｇＡｒ
ｉｌｌＳＶλ−Ｉｋ゛Ｎ−γの単一クローン化遺伝子か
ら生するはずでりる・軸重学的（シト−グリコジル化）
ＩＦＮ−ｒの分子蓋は約／７，０００であり、かつ示す
ベフチドにあ・けるグリコジル化に対し一つのム」能な
部位が存在するので、ＩＦＮ−ｒの３棟の形態ｃよ非−
グリコジル化（ｉ　７．ｏｏｏ　）の棟団と、２極のそ
れぞれ異１つでクリコシル化葛れた（コ／、０００およ
び、ｚｓ、ｏｏｏ　）の独類であると思われる。

本発明のＣＨＯ細胞中で生産６オ′シたＩＦＮ−γ紫ね
ずみ抗−Ｈｕ−ＩＦ’Ｎ−γ血清によって免疫沈澱させ
たが、ここでハ」いた血清はヒト牌細胞をスタフィロコ
ッカス・エンテロトキシンＡで誘発させた後にｈｃｈｚ
≠ゲル濾過カラムからの４ｔｊ　Ｋ　Ｈｕ−ＩＦＮ−ｒ
　ヒータによｐＢａｌｂ／Ｃねすみ全免疫化することに
よｐ生欣賂せたものである（アール・テボス等、ジャー
ナル・インタ７エロン・リサーチ、第２巻、第ｖＯり〜
４ｔ−２ＱＪｋ（／りざ−）〕。さらに、抗−Ｍ　ｕ　
−Ｉ　Ｆ　Ｎ−ｒによシ免疫沈澱させた試料中に２棟の
分子量のバンド紫観祭し、それにょシ憾らにそれらの性
寅を確認した。

橡々の生膜により細胞培養物から精製を何なった後１本
発明で生産されたグリコモル化ＩＦＮ−ｒ’ｃ％＋Ｊ配
したＩ　Ｆ　Ｎ　−ｒの柚々の臨床θソおよび治療的用
途に使用することができる。さらに。

上記のグリコジル化ＩＦＮ−ｒおよび前記の非グリコジ
ル化ＩＦＮ−ｒの両者を使用して、たとえは異種拒絶反
応における免疫連続反応ｔ−阻止することかでき、或い
は持続性細菌または寄生性感染の処置においてマクロフ
ァージ活性化因子（ＭＡＦ）の代）にまたはそれと同等
に使用することができる。

免疫連続反応の阻止剤としてＩ　ＦＮ−７”は異種拒絶
反応を防止するのに有用である。たとえば異極細胞（た
とえば移植組織）およびその抗原は宿主のＴ細胞を刺戟
してリンフ才力インを生成することが知られている。し
たかって。

ＩＦＮ−ｒを含め異極組織に反応して異裡移柚片の囲Ｖ
に局部的にリン７オカインが生成８れるであろう。この
場合、ＩＦＮ−ｒは異楯細廁に作用してこ２しら細胞を
刺戟し、Ｉａ決履子を生成ぢせることかできる。次いで
、具独犬足子および異極りＬ原は伯主に対し堰止な慧泳
で提供され′″Ｌ激しい４ｉｒ！、役反Ｉ乙−をもＩＣ
らし、典佃りＬ原に対し個主中に抗体のｌ：Ｅ底をもた
らし、さらに簾賛なことには移植片を排尿する細胞毒性
′ｒ−細胞の生成をもたらす。本発明の一局面は、＊発
明のＩＦＮ−γに対する抗体を使用してこＶ柚の拒絶反
応１を防止、することでめる。何故なら、この釉のわし
体は具ａ！細胞および抗原による刺戟の隙、宿主Ｔ−細
胞によシ作られたＩＦＮ−１’と結合するからである。

次いで、この結合されたｉｐ’Ｎ−γはもはや異種細胞
を刺戟してｌａ医定子を生成することができず、したが
って適正な怠味で抗原および次定子を循主に提供して細
胞毒性Ｔ−細胞を住成葛せかつ異極組織の個主による拒
絶反応をもたらすのを防止できない。

ＭＡＦの代シとして％またはそれと１０ｊ等に本発明の
Ｉｆ’″Ｎ−γは細胞、たとえはＢル１υＬ滅させるマ
クロファージを活性化させ、１菌性ウィルスおよび小型
靭状物負、／ヒとえは奇生物置を取ｐ込む。このＡＪ途
において、ＩＦＮ−γｔユ吋に抗生物質に耐性でめる軸
＠感染を処置するのに有用であろう。

本明細誉申に配飄し１ζ力法で調装された似生物および
組換１ＪＮＡ分子は、７９ざ一年一万／２日付でメリー
ラント州ロックビル在のアメリカン・タイプ・カルチャ
ー・コレクションに寄託した培養物で例示される。これ
ら培繁物は次のように同定されている； ＨＩ　ＩＦ−Ａ　：　、ｈ；、　ａｏｌｉ　１）Ｍ／　
（λバｐｆｉｌＩＦ−８Ｖ−γ、）ＨＩＩＦ’−Ｂ　：
　　Ｅ　ｃｏｌｊ　Ｄ）ｉ／（λ）（ｐｉ−ＬＩＩＦ’
−８Ｖ−γ、）ＨＩＩＦ−Ｃ：　　λｃＨ≠Ａ−ｇＨＩ
Ｉｌｉ’−２これら培養物はそれぞれＡＴＣＣ−３？ｏ
４ｔＡ　。

３りＯ弘７およびグＯＯ弘≠の受託番号ｔ″受けている
。

さらに１本発明の方法で調製ちれた２独の他の形質転換
さ扛た組換ＤＮＡ分子は／りざ３年／月２７日伺゛でメ
リーラ／ドカ１、ロックヒル在のアメリカン・タイプ・
カルチャーφコレク７ヨンに寄１ｉ−１ｌ：された培養
物で例示きれる。これら培養物は仄のように同ボされて
い／）： ＨＩＩＦ−Ｄ：　　支那ハムスター卵軸月包（ｉ＞＊ｉ
ｙ上１−）（Ｒ／　ＱＣ／　０／　−，２ｊ　ＯｎｈＡ
）ＨＩＩＦ−Ｅ　：　　ｉ、ｃｏｌｉ　Ｋ／、２△ｒＬ
Ｉ△ｔｒｐ（ｐＰＬｃ、２ざ−ｆｉｌｉＦ　　夕２） これら培養物は、それぞｌＬＡ　’ｉ″ＣＣ（１４１，
、どコ００および３’？２７どの受此企号を受けている
。

以上、多くの実廁例につき本発明を説明したが、本発明
の方法および組成物ｔ第１」ハｊする他の実施態様全提
供すべく不発ツ」の基本的構成を変化させうろことは明
らかでわる。したかつで、本発明の範囲は上記実軸５す
の４に眠厘δれないことは明らかであろう。

〔発明の効果〕

本発明によれは、ヒト免投インタフエロンの生物学的も
しくは免疫学的活性全示すポリペプチドを生産するυＮ
Ａｆｉ己列１組換１）ＮＡ分子およびそれらによｐ形質
転換された宿主ならひにこれらポリペプチドを暗号化す
る遺伝子が提供され、さらにこれらＤＮＡ配列、分子、
宿生。

遺伝子およびポリペプチドの製造および使用方法が提供
される。これらＬ）ＮＡ配＋１１はヒト免疫インタ７エ
ロンの％　Ｑｕ学的もしくは免疫学的粘性ケ示すポリペ
プチドを札号化することを特徴とする。さらに、これら
Ｌ）ＮＡ配列は適当なグリコジル化を有するポリペプチ
ドをも生産する。

適当な宿主において、これら１）ＮＡ配列および組換１
）ＮＡ分子は、ヒト免疫インタフエロンの生物学的もし
くは免疫学的活性を示す遺伝子およびポリペプチドの生
産および同定をＯＪ能にすると共に抗ウィルス、抗腫瘍
もしくはＩＩＩ癌剤および免疫変調剤および方法にそれ
らを使用することを可能にする。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のポリペプチドを暗号化する押入ＤＮＡ
配列を特徴とする幾つかの組換ＤＮＡ分子の混合物ン製
造するための本発明の方法の−具体例を示す略図であシ
； 第２図は本発明によシ製造された２遅の蔗糖−勾１ｐＲ
ＮＡフラクションのｌＦＮ暗号暗号化活水すグラフでｔ
Ｄジ； 第３凶はｐｓＶＪλりの（Ｎ造の略図であジ；第グ図ｉ
ｊ　ｐ　Ｓ　Ｖｊ　２夕の略図であシ；第ｊ図は本発明
に使用するＲＮＡ違択ヒブリド化分析の略図であシ； 第を図は本発明のＨｕＩＦＮ−γ遺伝子の制限地図およ
び挿入物１）ＮＡγ。（の、γ＋（１）＋γ５（３）お
よびγ１ｏ（／のの順序決定に使用する順序決定方法の
略図であり、星印（☆）は笑験的１ｃ決定された制限部
位を示し、残余の部位はヌクレオチド配列に基づいて予
沖ｊすることができ；第７〜ｒ図はＨｕｌＦＮ−γ勿暗
号化する複合ＤＮＡの暗号化ストランドのヌクレオチド
配列を示し、この配列は複合Ｄ　Ｎ　Ａの胸始部から複
合ＤＮＡの未ＩｉＳ訳領域まで光分に番号利けされてお
シ、ヌクレオチドざり〜ｉＩ／Ｉ−ｇは信号配列を示し
、ヌクレオチド／弘り〜ｚｌｌ、は明らかに［成熟ＪＩ
ＦＮ−γを示し、毎号ホリベツチドおよび成熟ｆＦＮ−
７のアミノ酸配列は−（−Ｉシそれのヌクレオチド配列
の上方に示され、　ｆｓ号ポリペプチドのアミノ酸は一
２θ〜−／′！！で番号付けちれ、かつ明白な成熟ＩＦ
Ｎ−ｒのアミノ酸は／〜ｌ■１で番号付けされておシ；
第り図は細菌＃Ｉ胞において＾レベルでＩＦＮ−ｒを生
座しうる吹埃ベクターの構造を示す略図であシ； 第ｉｏｇはンラスミドｐＡｄＤＪｊｓＶ（Ａ）−３およ
びｐＳＶノーＩＦＮ−γの略図である。 特許出願人　　バイオジエン　ナームローズ図面の浄書
（内容に変更なし） 争　２冑 ｐ５Ｖ５２＃ｈρ＃Ｊｌ　　　　ｐｓｙｓｙ、ｚｔｔｍ
　　　戸５ｐｓｚｐ、ｘｔｔｗａ　　　　戸ｃｑｒｓ＃
ＱｒＦ／θ、２ フラタショ：／Ｎ。 Ｆ／６．３ Ｆ／６．４ Ｆ／Ｇ、５　　　　　　　０　　イー、］＋）：　　ｏ
ｙｔｒλ）ＬｃｔＷ４　　−（π＝　　　４二　不芳シ
ー罵（ｍＡ’Ｎｉ　　　−’）’１ｙｙＱＩ　　　　　
了−”　　ｒｌｍＰＮＪ　　　ＩＩＦｓｎＡ’ＮＡ ４８ ＦＩＧ、　　８ ：ＧＡ　　ＡＡＡ　　ＡＧＧ　　ＡＧＴ　　ＣＡＧ　　
ＡＴＧ　　ＣＴＧ　　ＴＴＴ　　ＣＧＡ　　ＧＧＴ　　
ＣＧＡ　　ＡＧＡ　　ＧＣＡ　　ＴＣＣＣＡＧ　　ＴＡ
Ａ　　ＴＧＧ　　ＴＴＧ　　ＴＣＣ＞ｎ　　ＴＡＴ　　
ＴＡＡ　　ＴＡＴ　　ＴＴＡ　　ＡＣＡ　　ＴＴＡ　　
ＴＴＴ　　ＡＴＡ　　ＴＧＧ　　ＧＧＡ　　ＡＴＡ　　
ＴＡＴ　　ＴＴＴ　　ＴＡＧ　　ＡＣＴ　　ＣＡＴ　　
ＣＡＡ　　丁ＣＡ；ＡＡ　ＡＡＴ　ＧＡＡ　ＴＡＴ　Ｃ
ＴＡ　ＴＴＡ　ＡＴＡ　ＴＡＴ　ＧＴＡ　ＴＴＡ　ＴＴ
Ｔ　ＡＴＡ　ＡＴＴ　ＣＣＴ　ＡＴＡ　ＴＣＣＴＧＴ　
ＧＡＣＴＧＴ：ＡＡ　ＧＧＣＴＡＴ　ＧＴＧ　ＡＴＴ　
ＡＣＡ　ＡＧＧ　ＣＴＴ　ＴＡＴ　ＣＴＣＡＧＧ　ＧＧ
ＣＣＡＡ　ＣＴＡ　ＧＧＣＡＧＣＣＡＡ　ＣＣＴ　ＡＡ
Ｇ；八Ｔ　　ＧＡＴ　　ＡＣＡ　　ＡＴＧ　　ＡＡＣＡ
ＣＴ　　ＴＡＴ　　ＡＡＧ　　ＴＧＡ　　ＡＧＴ　　Ｇ
ＡＴ　　ＡＣＴ　　ＡＴＣＣＡＧ　　ＴＴＡ　　ＣＴＧ
　　ＣＣＧ　　ＧＴＴ　　ＴＧＡｉＧｃ　ＡＴＧ　ＴＣ
Ａ　ＧＡＣＡＧＡ　ＡＣＴ　ＴＧＡ　ＡＴＧ　ＴＧＴ　
ＣＡＧ　ＧＴＧ　ＡＣＣＣＴＧ　ＡＴＧ　ＡＡＡ　ＡＣ
Ａ、　ＴＡＧ　ＣＡＴ　ＣＴＣｒＴＧ　ＡＣＡ　ＡＣＴ
　ＧＴＧ　ＡＣＴ　ＧＴＡ　ＣＣＣＡＡＡ　ＴＧＧ　Ａ
ＡＡ　ＧＴＡ　ＡＣＴ　ＣＡＴ　ＴＴＧ　ＴＴＡ　ＡＡ
Ａ　ＴＴＧ　ＧＧＧ　ＧＧＧ４８２− ＴＧＣＣＴＧ　ＣＡＡ　ＴＡＴ　ＴＴＧ　ＡＡＴ　ＴＴ
Ｔ　ＡＡＡ　ＴＣＴ　ＡＡＡ　ＴＣＴ　　　　６３１Ａ
ＡＴ　ＡＡＧ　ＴＡＴ　ＴＴＡ　ＴＡＡ　ＴＡＧ　ＣＡ
Ａ　ＣＴＴ　ＴＴＧ　ＴＧＴ　ＡＡＴ　　　　７２１Ｃ
ＴＣＡＣＴ　ＴＡＡ　ＴＣＣＴＴＴ　ＧＴＴ　ＴＴＣＴ
ＧＡ　ＣＴＡ　ＡＴＴ　ＡＧＧ　　　　８１１ＣＡＡ　
ＧＡＴ　ＣＣＣＡＴＧ　ＧＧＴ　ＴＧＴ　ＧＴＧ　ＴＴ
Ｔ　ＡＴＴ　ＴＣＡ　ＣＴＴ　　　　９０１ＡＡＡ　Ｔ
ＡＴ　ＧＣＣＴＧＣＡＡＴ　ＣＴＧ　ＡＧＣＣＡＧ　Ｔ
ＧＣＴＴＴ　ＡＡＴ　　　　９９１ＡＧＧ　ＡＧＡ　Ｔ
ＴＴ　ＣＡＴ　ＧＣＣＴＧＧ　ＴＧＣＴＴＣＣＡＡ　Ａ
ＴＡ　ＴＴＧ　　　１０８１６ＧＧ　ＧＧＧ　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１１
４４Ｆ／θ、１０ 手　糸売　ネ市　ｊＥ　書（方式） Ｉ沼川５８年　４月あ日 特許庁長官　　若杉　和　夫　殿 １、事件の表示 昭和５８年　特許願　第　２６４１１　　号２、発明の
名称 ３、補正をする昔 事件との関係　　　特許出願人 名称　　　バイオジエン　ナームロース　ヘンノソトノ
ヤノプ（国籍）（オランダ領アンチル　） ４、代　理　人 （１）　　明細書 ″　□°／ Ｊ［！「許Ｙ １、事件の表示　　１１ｍ口５８年　特許願　第　２６
４１１　　号２、発明の名称 ３、？重重をする膚 事件との関係　　　　特許用）９状 名称　　バイオジエン　ナームローズ　ヘンツノトン中
ノブ代表考　　　エフ。ブイ、フィア゛ス （国籍）（オランダ領アンデル） ４、代　理　人 ６、補正の対象

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　　ｐ旧ＩＦ−８Ｖ−ｒｏのＤ　Ｎ　Ａ　（’４
   ＋入物、ｘｉＪＪ　Ｎ　Ａ　挿入物にヒフリド化しかつ
   ＩＦＮ−γ城のポリペプチドを暗号化するＬ）ＮＡ配夕
   １バならびに異種１）ＮＡ配列および挿入物のいずれか
   によ！０１ｉｆ号化込れたポリペプチドｋｌ−号化する
   １）ＮＡ配タりリりなる群から選択δれるＤＮＡ配列。 悶　ＤＮＡ挿入物にヒフリド化するＬ）ＮＡ配クりｆ　
   ｐ　ＨＩ　Ｉ　Ｆ−ｂ　Ｖ　　ｒ　Ｉ　Ｔ　Ｐ　Ｈ１１
   ｋ’−８Ｖ−ｒ２　＋ｐ　Ｊ（工１　ｋ　−ｂ　Ｖ　　
   ｉ’３　、ｐ　ｆ（Ｉ　Ｉ　Ｆ−８Ｖ　ｒ　５＋　ｐ　
   ”工ＩＦ−８Ｖ−１６，ｐＨＩ　ＩＦ−８Ｖ−ｒＢ　、
   　ｐｌＨＩＦ−８Ｖ　−ｒｑ　、　ｐＨＩ　Ｌｂ’−８
   Ｖ−γ１ｇ　、　ｐ）ｉｆ　ＩＦ’−８Ｖ−ｒｌｌすｉ
   Ｊ　Ｎ　Ａ　４ｔＨ＋入物、これら異種ＤＮＡ仲人物の
   いずれかにヒフリド化しかつＩＦＮ−γ型のボリベフ゛
   チドケＩＩ旨号化するＤ１喝Ａ白己夕１，７ｊらひにケ
   （棟ＤＮＡ配列お↓ひ挿入物のいずＩＬ４ｈ　＆’Ｃよ
   り暗号化塾れ／ζホリベフテドｒ階〜化するＤ　Ｎ　Ａ
   配りリよりなる群刀・Ｌ：）迅択する！愕ｉｔ’ｌ’　
   ｉｉ＋ｉ水の鰺巳曲褐／力阪ｄじ戟の、ＤＮＡ　　自己
   クリ。 （：ｉ）Ｄ　Ｎ　Ａ　（Φ人物にヒブリド化−ｆｌ、Ｄ
   ＮＡ部夕ｊ」ｔ、λＣ１−１弘Ａ−ｇＨ１１に’−／お
   よびλＣ１ｉＣ１１ｌｌＡ−１上゛−２のＩＦ’Ｎ（関
   連配列、こ才りら叡柚Ｌ）ＮＡ配列のい丁２ｔかにヒフ
   リド化しかつＩＦＮ−γ型のポリペプチドｋ　ｌｌｉ’
   ｆ号化する１）ＮＡ配タりリならひに異種ＤＮＡ配クリ
   のいずれかにより暗号化さＩしたポリペプチドを暗号化
   するＤ　Ｎ　Ａ　ｆＡＬ列よυなる群から選択する特許
   請求の範囲第７項または第２狽記載の１）ＮＡ配列。 ＡＧＡＣＡＴＧＡＡＴＧＴＣＡＡ石汀ＴＴＣＡ／い釦品
   αＡＡＡＡ弘ＭＣ晶弘ＷＣＴＣＧＡＡＡＡＧσｒＧＡＣ
   ｒＡＡＴＴＡＴＴＣＧＧＴＭＣｒＧＡＣｎＧＡＡＴＧＴ
   ＣＣＡＡＣＧＣＡＡＡＡＡＡＧＧＡＧＴＣＡＧＡＴＧＣ
   Ｉ’ＧｍＣＧＡＧＧＴＣＧＡＡＧＡＧＣＡＴＣＣＣＡＧ
   ｒＡＡ、およびＡＴＧｒＧＴＴＡＣｒＧＣＣＡＧＧＡＣ
   ＣＣＡＴＡＴＧＴＡＡＩＷＩ；ＡＡＧ（ＴＡＧＡＡＡＡ
   ＣＣ，ＴｒＡＡＧＡＡのＬ）ＮＡ配夕１」よりなる訃か
   ら選択される将計珀求の範囲第１項乃至第３項のいずれ
   かＶＣ記載のＤＮＡ配ｔｕ。 ｔ５）ＤＮＡ配列からなシ、このＤＪ″ＪＡ配タｌＪｔ
   府計計ツ求の範囲第１項乃至第弘項のいずれかにｍｌ載
   の１）ＮＡ配夕１］よりな／）群から選択する組挨ＤＮ
   Ａ分子。 （６）　　ＤＮＡ配列が表現ｆｔ１ｌＪ　Ｓ中口Ｌクリ
   に作用結付されている特許［！６求の範囲第！項記載の
   組換ＩＪＮＡ分子。 （７１表＃ｌ’ＮＩＪｉｌＩｇ己りリル：す（呆、　　
   β−１−ｇ＝ｃ　　糸、　　ｔ−ｒ−ｐ糸、ファージλ
   の生９ｇベレータおよびンロモータ領域、ｆｄ被嶺蛋白
   寅の１ｌｉｌｌ岬領域、原始核もしくは成熟核軸側２よ
   ひそｉＬらのウィルスの遺伝子の衣机を１ｉｌＪ飾する
   他の’ＱＣ列、ならひにそれらの組合せから選択する％
   ｔｉ・珀求の範囲第６狽ｂＣ軟の組換ＩＪＮＡ分子。 Ｌ８）　　ｐｌｉｌ　１ｋ”−８Ｖ−７ｎ　、　７ｋ　
   ’Ｊ）ＩＣｐＨＩ　ＩＦ−８Ｖ−γ５およＯｐＨＩ　Ｉ
   Ｆ’−８ｖ−ｒｈａ　ニＩＮ４するが１に’１ＳＪ−γ
   ｌ！’、１連ＤＮＡ伸人物を反対ねじ向にてイｆする組
   俣ｊＪＮＡ分子よりなる群から選択されるｌ付許紬求の
   範囲第６狽゛または第７項すじ載のｌ１ｉｌ、ｌ換ＤＮ
   Ａ分子。 ｔ９）　　ｐｓＶ、２−ＩＦＮ−ｒ　ｋよびｐ　Ｐ　Ｌ
   　ｃ　Ｓ　Ａ　−Ｉ　Ｆ　Ｎ−ｒよりなる群から選択さ
   れる％ｄ′ト稍求の範囲第６項または第７項記載の組換
   １）ＮＡ分子。 （１１符許梢求の範囲第５項乃至第２狽のいずれかに記
   載の少なくともｌ裡の組挨ＤＮＡ分子により形質転換さ
   れた細土。 Ｕυ　イー・コ１ハシュードモナス、枯草菌、市熱紬蘭
   、他の細菌、酵母、他の真菌類の菌株、ねずみもしくは
   その他の制御または極ｗｊＪ仙主およびヒト組餓＃ＩＩ
   Ｉ胞よシなる椙、から泗択芒れる特ｆｆ’ｌｉｉ’ｊ氷
   の馳囲第ｌθｉ↓ｉ１賊の１ｄ王。 ｕ４　　イー・コ１ハ　シュードモナス、枯阜凶、面熱
   細菌、他の細菌、酵匂、他の共ｌ！ｌｆガムの菌株、オ
   λす牟もしくはその他の動物−よたは４ｔ【−宿王訳た
   はヒトＢｉ繊癲ｊ胞よシなるイ；トから選択されてｒｌ
   、γ５およびｒｌｏ　よりなる群から恵沢されたづ手入
   ＪＪＮＡ、によりｊし負転掠さ）した仔Ｉ午請求の範囲
   第１０項または第７７項記載の形寅転換宿王。 （１：３１　　　　λＣＭ４ｔＡ　−ｇＨＩ　Ｉ　ｋ’
   　−／　　ＥＥ　７ｈＵ　　λＣｆｉ　Ｉｔ　Ａ　−ｇ
   ＨＩＩＦ−一の工薯゛Ｎ−γ曲迩仲入物によジ形負転換
   姑れた成熟核宿主よりなる訃から選択される特許１ｌｉ
   ｉＸの範囲第１０項または第１／項記載の形貝転換宿主
   。 （１４１イー・コリに／−ΔＨＩ△ｔ　ｒ　ｐ　（ＭＩ
   　Ｉ　Ｆ−！、２）、イー会コリＳＧ≠０４Ｌ弘（ｐ　
   ｃ　ｌざｊ７）、（ｐＰＬｃｓＡ−ＩＦＮ−１）、ＣＭ
   Ｏ（１））ＩＦＲ）（１２−１０Ｂ）。 Ｃ１−１０（ＤＨＦＲ−）　（Ｅ−／θＣ）、Ｃ１１０
   （υ４４　Ｆｌも−）（Ｅ−１０ｋＳ３）、　　ＣＭＯ
   （ＤｌｉＦＲ）（ｋ：、−１０ＣＡ）、ＣＨＯ（１）Ｈ
   ＦＩｔ　）（Ｋ−ＩＱＣ１０／）　オＬびＣＭＯ（ＤＨ
   ＦＲ）（Ｒ−ＩＱＣ１０／　　、２ｊＯｎＭ）よυなる
   群から選択されるｑ′ｆ肝珀求の範囲第１０３Ａまたは
   謁／／項能軌の形負私換イ６生。 四　％＃ｆｉｉｖ求の軛ｖｊ３第ＩＯ項乃主第７３項の
   いずれかに記載の形寅転挨偏王にょ仄生産さ２Ｌるヒト
   免投インタフエロンの免疫学的もしくは生物学市活性ケ
   示すポリペプチド。 ＯＱ　　％許肋求の範囲第／弘項ｍｌ載の形質転換宿主
   により生産されるＩＦＮ−γの免＆字的もしくは生物学
   的活性紫示すポリペプチド。 （１７）　　ＣＨＯ（ＤＭＦＲ−）（Ｅ−１０Ｂ）、Ｃ
   ）１０（Ｄ五ｌ電・１ζ−）（Ｅ−ＩＤＣ）、Ｃ）１０
   （Ｌ）ＨＦＲ）（Ｅ−＃）Ｂｊ）、ＣＨＯ（ＤＨＦＷ−
   ）（ｊ；−１０ｃ６）、Ｃ）１０（ＤＨＦＲ−）（Ｅ−
   ＩＱＣ１０／　）、およびＣ）１０（ｉ））ＩＦＲ）（
   Ｒ−ＩＱＣ１０／　　、２ｊＯｎＭ）よシなる群から選
   択式れる形質転換宿主により生産されるクリコシル化Ｉ
   ＦＮ−γ。 Ｕ〜　物１Ｆ’７・趙求の範囲第／、ＩＪｊ乃至第弘狽
   のいずれかに記載のＬ）　ＮＡ配列によｐａ＆号化さｎ
   るポリペプチドもしくＱユそのＶ「片丘たはそのｖ！Ｔ
   導体。 贈式 ％式％ ］ のポリペプチドよシなる群から選択される特ｉ１−晶求
   の範囲第１３項乃至第７７項のいずれかに記載のポリペ
   プチドもしくはその部［片またはその島尋体。 ＋２１　　特ｇ１−Ｍ求の馳囲第／項乃至第μ項のいず
   れかに目上載のＬＩＮＡ配列をクローン化ベヒクル中へ
   尋人゛３−ること金付徴とする組換ＬＩＮＡ分子の製造
   方伝。 （２１）％ＦＴｆＭＶ求の陶（巳囲第７項１．１載のン
   〈すλ市１」仰巾自己夕（」奮クローン化ベヒクル中へ
   尋人しｈ　ｉｒｊ糺衣机ｆｉｊｉ制御配列ケ削口しクロ
   ーン化ベヒクル中へＳｖ、　大してＤ１″ＪＡ配夕ＩＪ
   （１）表現【仙坤かつｕ・′４發する工程を憾らに宮む
   豹ｉｆＦＭ米の耽囲第−〇項目じ眠の方法。 （２２）　１階Ｒ１・賄求の範囲第６坂乃至第２項のい
   ずれかに１ｃ載の組侠Ｄ　ｆｉ　Ａ分子により過当な？
   ｉ主金形賀転快させ、前ｉ己イ百王を培養し、かつｎｌ
   」ｂピホリベフテドを回収すること・と特徴とする、ヒ
   ト免疫インクフエロンの矢投学的または生物学的ＮＪ性
   を示すポリペプチドの製造方法。 （２３）　ＴＳ主をイー・コ１ハシュードモナス、枯草
   菌、高熱翁す藺、１田のｉｍｌ貞、自を母、カビの菌株
   、動９勿もしくはイ直物イｄ主およびヒト糸＋１ｈ改ル
   １＋ｌＪｉ己よりなる４１１″から選択する符＃ｉ’　
   Ｂ＋’ｉ氷の範囲第２λ狽６Ｃ載の方法。 （２４）特詮’１−ｉｔＧｆ求の範囲第６項乃至第り項
   のいずれかに記載の組換ＬＩＮＡ分子によシ形質転侠さ
   れた宿主を培誓し、かつボリベフ゛チドｋＬ＋収するこ
   とｔＩＦｆ＊とする、ヒト免疫インタフェロンの免疫字
   曲ばたは生物学的ｌ占性を示すポリペプチドの製造方法
   。 （２５）どのＤＮＡ配列が特許請求の範囲第１項乃全第
   Ｖ項のいずれかにｄ上載のＪＪＮＡ自己夕ＩＪにヒプリ
   ド化するかｔ法定することを％′似とする、ＤＮＡ配列
   の群からのＨｕｌＦＮ−γの免疫学的または生物学的活
   性奢ボずポリペプチド會暗号化するＬ）ＮＡ配列の選択
   方法。 （２６）どのＤＮＡ配列がｌ特許Ｈｈ求の範囲第１項乃
   至第参項のいずれかに記載のＤＮＡ配列にヒプリド化す
   るかを決定するととを％似とツーる。 非ヒト免疫インタ７エロンの免疫４的または生物学的活
   性を示すポリペプチドを暗号化するＤＮＡ配列の選択方
   法９ （２７）選別ＤＮＡ配列を、大然豚からの１）ＮＡ配列
   、合成りＮＡ！！ＩＬ列５組換ＤＮＡ分子からのＤＮＡ
   ｆｉｃ列および異種ＤＮＡ配列のいずれかの組合ぜでり
   るＤＮＡ配列よシなる抑から選択する待針１求の範囲第
   コｓｙｌたは第コロ項ｄ上載の方法。 （２Ｂ）神ｇ７１・請求の範曲第ｉｓ狽乃至第ｌり項の
   いずれかＶＣ記載のポリペプチド↓りする群から選択ち
   れる少なくとも／拙のポリペプチドからなることを特徴
   とするヒトウィルス感染の処飯用またはヒト癌もしくは
   腫瘍の処置用組成物。 （２、特許請求の範囲比、２ｇ項ＨＣ載の組成物の有効
   量を医薬上Ｗ＋容しうる方法でヒトに投与することを％
   徴とするヒトウィルス感染の処置またはヒト癌もしくは
   Ｊ匣瘍の処置方法。 （６０）％許ｎＩ？求の範囲第／よ項乃至第／り項のい
   ずれかに記載のポリペプチドよシなる群から選択される
   少なくとも７種のポリペプチドからなることを特徴とす
   る免疫没調剤として使用する組成物。 （６１）％針藺求の範囲第３０項ｍｌ域の組成物の有効
   ｉＬを医薬上許答しうる方法で投与することを特徴とす
   る免役ＫＪ４方法。 （６２）異１１移殖片拒絶に対処するための、ＩＦＮ−
   γに対する医業上ｖ＋ｈしうる抗体の使用。 ＜６５）　Ｉｔ！１瘍および癌に対するならひに細菌お
   よび寄生虫の感染に対するマクロファージｆ：活性化さ
   せるための、医薬上許容しうるＩＦＮ−ｒの使用。