JPS5951792A - Dna配列、組換dna分子およびヒト免疫インタフエロン様ポリペプチドの製造方法 - Google Patents
Dna配列、組換dna分子およびヒト免疫インタフエロン様ポリペプチドの製造方法Info
- Publication number
- JPS5951792A JPS5951792A JP58026411A JP2641183A JPS5951792A JP S5951792 A JPS5951792 A JP S5951792A JP 58026411 A JP58026411 A JP 58026411A JP 2641183 A JP2641183 A JP 2641183A JP S5951792 A JPS5951792 A JP S5951792A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- ifn
- sequence
- polypeptide
- human
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/57—IFN-gamma
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔発明の属する技術分野〕
本@明は1)NA配列、組換DNA分子およびヒト免疫
インタフエロン様ポリペプチドの製造方法に関するもの
である。さらに詳細には1本発明は適当な宿主生物にお
いて表現される1)NA配列に関するものである。ここ
に開示する組換1)NA分子は、ヒト免疫インタフエロ
ンの免疫学的または生物学的活性を有するポリペプチド
t−暗号化するDNA配列を特徴とする。以1の記載か
ら判るように1本発明のDNA配タリりリ換L)NA分
子および方法は、抗ウィルスおよび抗腫瘍もしくは制癌
剤或いは免疫変鯛剤および方法に2いて肩出なポリペプ
チドの製造に使用することができる。
インタフエロン様ポリペプチドの製造方法に関するもの
である。さらに詳細には1本発明は適当な宿主生物にお
いて表現される1)NA配列に関するものである。ここ
に開示する組換1)NA分子は、ヒト免疫インタフエロ
ンの免疫学的または生物学的活性を有するポリペプチド
t−暗号化するDNA配列を特徴とする。以1の記載か
ら判るように1本発明のDNA配タリりリ換L)NA分
子および方法は、抗ウィルスおよび抗腫瘍もしくは制癌
剤或いは免疫変鯛剤および方法に2いて肩出なポリペプ
チドの製造に使用することができる。
本出願の明卸1曹においては、ネイチャー飴−第−g6
巻%第2弘λ/頁(/り♂Q年7月10日)に発表さn
7cインタフエロンの酪名法を使用する。「lk″N
J qまイ/タフエロン忙i51..(’IFN−γ」
は免疫インタフエロンを意味する。
巻%第2弘λ/頁(/り♂Q年7月10日)に発表さn
7cインタフエロンの酪名法を使用する。「lk″N
J qまイ/タフエロン忙i51..(’IFN−γ」
は免疫インタフエロンを意味する。
、28類のインタフエロン([IFNJ )がを在する
と知られている。mlのインタフエロンは小型かつ酸安
定性の蛋白質であって、細胞をウィルス感染に対し、耐
性にするものである〔ニー・アイザツクスおよびジエー
・リンデンマン。
と知られている。mlのインタフエロンは小型かつ酸安
定性の蛋白質であって、細胞をウィルス感染に対し、耐
性にするものである〔ニー・アイザツクスおよびジエー
・リンデンマン。
[ウィルス阻11.ザ・インタフエロン]。
Proc 、 Royal、 Sot+、Ser+B
J 1417巻、第23g〜67頁(/りj7);
タブリュ・イー・スチュワートn、rザ・インタフエロ
ンーシステム」、スプリンガーー出版(第2版) (/
りJ/)(以下、rザ・インタフエロン・システム」ト
1う)〕。型Jのインタフエロンは酸不安矩性である。
J 1417巻、第23g〜67頁(/りj7);
タブリュ・イー・スチュワートn、rザ・インタフエロ
ンーシステム」、スプリンガーー出版(第2版) (/
りJ/)(以下、rザ・インタフエロン・システム」ト
1う)〕。型Jのインタフエロンは酸不安矩性である。
机在、これらは良効に特性化ちれていない。IFNは菫
ろ細胞荷異性でるるか〔ザ・インタンエロンΦシステム
、7M/J!〜4tjj(J、ウィルス脣異性でない。
ろ細胞荷異性でるるか〔ザ・インタンエロンΦシステム
、7M/J!〜4tjj(J、ウィルス脣異性でない。
IFNは、広範囲のウィルスに対し細胞ケ保護する。
型Bのインタフエロンは、自然に或いはたとえはウィル
ス、微生物、マイトジェン、ウィルスもしくは細菌性抗
原のような各種の誘発剤に呼応して、或いは抗生物質、
内複累またはその他の微生物生成物に呼応して生産され
うる〔ザ・インタフエロンφシステムs7A”ざ〜弘り
貞〕。
ス、微生物、マイトジェン、ウィルスもしくは細菌性抗
原のような各種の誘発剤に呼応して、或いは抗生物質、
内複累またはその他の微生物生成物に呼応して生産され
うる〔ザ・インタフエロンφシステムs7A”ざ〜弘り
貞〕。
極く普通には、たとえばスタフィロコッカス・エンテロ
トキシン、ガラクトースオキシダーゼ、フイトヘムアグ
ルチニン、コンカナバリン、コリネバクテリウム・バル
ブムおよび混合リンパ球培寮物のようなマイトジェンが
使用される。
トキシン、ガラクトースオキシダーゼ、フイトヘムアグ
ルチニン、コンカナバリン、コリネバクテリウム・バル
ブムおよび混合リンパ球培寮物のようなマイトジェンが
使用される。
さらに、型■のインタフエロンは種々の源泉において生
産されると報告ちれている。たとえば。
産されると報告ちれている。たとえば。
CNS病における脳背髄液、フイトヘムアグルチニンに
より誘発される白血球、抗すンハ詠血清によy+h発δ
れるリンパ球、マクロファージおよびマイトジェンによ
り篩光込才しるリンパ球。
より誘発される白血球、抗すンハ詠血清によy+h発δ
れるリンパ球、マクロファージおよびマイトジェンによ
り篩光込才しるリンパ球。
マイトジェンによシル!;発される扁桃リンパ球、マク
ロファージおよびヘルペスウィルスわL涼により誘発さ
れるヘルペス感作リンパh、 I曳疹ウィルスにより誘
発される風疹ウィルス感作リンパ球、リンバタ細)It
il、多発a慣耐肺思名の骨髄。
ロファージおよびヘルペスウィルスわL涼により誘発さ
れるヘルペス感作リンパh、 I曳疹ウィルスにより誘
発される風疹ウィルス感作リンパ球、リンバタ細)It
il、多発a慣耐肺思名の骨髄。
白血病T細胞糸からのリンパ球およびバフィーコート、
人乳からまたはプラズマ7オレシスによυ短離されたリ
ンパ球などが芋げら才りる〔ザφインタフエロン・シス
テム、i4/i〜l/17頁;アイ・ナタン等、「ヒト
1゛−リンパ31−鮒廁糸によシ生産される免疫(γ)
インク7エロン」、ネイチャー誌、第222巻、第どグ
λ〜≠3頁(/りざ/);エム・ニー・ヘラ−等、「人
乳リンパ球によるリンフ才力インの生産」、インフェク
ション・アンド・インミュニティ* M’−3,2巻、
第632〜36負(/り1rl)’、ジーΦアール・ク
リンベル等、[ヒト扁桃リンパMによるインタフエロン
およびリンクオドキシンの分離生産」、セルラ轡◆イン
ミュニテイ、第20巻、第117〜り6負(/り7j)
; エム轡プレイ等、「マイトジェンによりヒト白皿球
中VC誘発されるインク7エロン:生産、部分オN製お
よび%性化」、ヨーロピアン・ジャーナルーインミュノ
ロジー、ai。
人乳からまたはプラズマ7オレシスによυ短離されたリ
ンパ球などが芋げら才りる〔ザφインタフエロン・シス
テム、i4/i〜l/17頁;アイ・ナタン等、「ヒト
1゛−リンパ31−鮒廁糸によシ生産される免疫(γ)
インク7エロン」、ネイチャー誌、第222巻、第どグ
λ〜≠3頁(/りざ/);エム・ニー・ヘラ−等、「人
乳リンパ球によるリンフ才力インの生産」、インフェク
ション・アンド・インミュニティ* M’−3,2巻、
第632〜36負(/り1rl)’、ジーΦアール・ク
リンベル等、[ヒト扁桃リンパMによるインタフエロン
およびリンクオドキシンの分離生産」、セルラ轡◆イン
ミュニテイ、第20巻、第117〜り6負(/り7j)
; エム轡プレイ等、「マイトジェンによりヒト白皿球
中VC誘発されるインク7エロン:生産、部分オN製お
よび%性化」、ヨーロピアン・ジャーナルーインミュノ
ロジー、ai。
巻、第1177〜♂3頁(15’rO)iエム・ウィラ
ノウスカースチュワートおよびダブリュ・イー・スチュ
ワートI1.rインタフエロンαおよびγの生産に開力
するヒト白血球数の演り定」、ジャーナル・インタ7エ
ロンーリサーチ、第1巻、第23.9〜ケ≠負(/P♂
/))。この異質性金考謔し、マイトジェン刺戟の際の
型1のIFN生産は、リンパ球の供給源および使用する
単離法に依存すると思われる。
ノウスカースチュワートおよびダブリュ・イー・スチュ
ワートI1.rインタフエロンαおよびγの生産に開力
するヒト白血球数の演り定」、ジャーナル・インタ7エ
ロンーリサーチ、第1巻、第23.9〜ケ≠負(/P♂
/))。この異質性金考謔し、マイトジェン刺戟の際の
型1のIFN生産は、リンパ球の供給源および使用する
単離法に依存すると思われる。
ウィルスおよび腫瘍もしくは癌に対するインタ7エロン
治療が、樵々の投与量および幾つかの投与方式で行なわ
れている〔ザ・インタ7エロン・システム% m3og
〜3λλ頁〕。たとえば。
治療が、樵々の投与量および幾つかの投与方式で行なわ
れている〔ザ・インタ7エロン・システム% m3og
〜3λλ頁〕。たとえば。
インタフエロンは経口的に、接種により(静脈内、筋肉
内、鼻孔内、皮内νよび皮下経路)、ならびに1桑、軟
骨およびスプレーの形態で刹効に投与されている。進′
畠、10〜10 単位の投与ISにで毎日7〜3回投与
される。治掠佇度は、処置さfL心、勧名2よひその状
態Vこ依存する。
内、鼻孔内、皮内νよび皮下経路)、ならびに1桑、軟
骨およびスプレーの形態で刹効に投与されている。進′
畠、10〜10 単位の投与ISにで毎日7〜3回投与
される。治掠佇度は、処置さfL心、勧名2よひその状
態Vこ依存する。
たとえば、ウィルス感染(儂一般に数日1111乃至−
逸聞にわたり毎H′またはmF−1,2回の投与で処置
され、まfcB!a瘍およびブ所は一般に数カ月11こ
け数年にわた#)40日または毎日多数回の投与で処置
される。勿論、成る患者に対して最も〃ノ朱的な加法は
担当医によシ決定延れねばなしツー、たとえば病気経過
、従前の加法およびインク7エロンに対する。信者の反
応なと周知の因子を考慮して投与方式および投与量を選
択せねはならない。
逸聞にわたり毎H′またはmF−1,2回の投与で処置
され、まfcB!a瘍およびブ所は一般に数カ月11こ
け数年にわた#)40日または毎日多数回の投与で処置
される。勿論、成る患者に対して最も〃ノ朱的な加法は
担当医によシ決定延れねばなしツー、たとえば病気経過
、従前の加法およびインク7エロンに対する。信者の反
応なと周知の因子を考慮して投与方式および投与量を選
択せねはならない。
抗ウィルス剤として、fiuIFNは次のものケ装置す
るために使用されている:呼吸器感染〔テキサス・レポ
ート、第弘ざ6〜り6負〕;単純庖珍角膜炎〔テキサス
・レポート、第V77〜!oOQ; アール・サンド
マツハ−、rkliにおける外因インタフェロ/」、イ
ンターナシヨナル・バイOロシ−’fi1ザ番ハーグ、
7ブストラクト/%W、2/// 、iタタ負(/97
1)J i急性粘膜出血しテキサス・レボ−)kf44
J’o/〜/Q負〕;アデノウィルス角結膜炎(ニー・
ロマノ等、ISMメモI−A#/j(/P7P年i。
るために使用されている:呼吸器感染〔テキサス・レポ
ート、第弘ざ6〜り6負〕;単純庖珍角膜炎〔テキサス
・レポート、第V77〜!oOQ; アール・サンド
マツハ−、rkliにおける外因インタフェロ/」、イ
ンターナシヨナル・バイOロシ−’fi1ザ番ハーグ、
7ブストラクト/%W、2/// 、iタタ負(/97
1)J i急性粘膜出血しテキサス・レボ−)kf44
J’o/〜/Q負〕;アデノウィルス角結膜炎(ニー・
ロマノ等、ISMメモI−A#/j(/P7P年i。
力)」;水痘庖珍〔テキサス・レホート、第31/〜/
j負」;サイトメガロウィルス感染〔テキサス・レポー
ト、第!、23〜.27負);およびBfi肝炎〔テキ
サス拳レポート、第sit〜λ2負〕。さらに、ザ・イ
ンタフェロン・システム、第307〜21頁も参照する
ことができる。しかしながら、抗ウィルス剤としてのI
FNの大規模な使用は、従来入手し得たよシも多倉のI
FNを必要とする。
j負」;サイトメガロウィルス感染〔テキサス・レポー
ト、第!、23〜.27負);およびBfi肝炎〔テキ
サス拳レポート、第sit〜λ2負〕。さらに、ザ・イ
ンタフェロン・システム、第307〜21頁も参照する
ことができる。しかしながら、抗ウィルス剤としてのI
FNの大規模な使用は、従来入手し得たよシも多倉のI
FNを必要とする。
IFNは、抗ウィルス作用の他に他の作用tも有する。
たとえ#−j′、これはコロニー刺戟因子の作用に拮抗
し、造血性コoニー形成糺胞の成長を阻止しかつ顆粒球
およびマクロファージ先駆体の正′gな分化を阻害する
〔テキサス・レポート* 第74’ 3〜44 P 負
)。サラニ、DMSO処Q會阻止する〔テキサス・レポ
ート、第V20〜.2♂負〕。
し、造血性コoニー形成糺胞の成長を阻止しかつ顆粒球
およびマクロファージ先駆体の正′gな分化を阻害する
〔テキサス・レポート* 第74’ 3〜44 P 負
)。サラニ、DMSO処Q會阻止する〔テキサス・レポ
ート、第V20〜.2♂負〕。
δらに、IFNは九反反ルし、の可振においても役割を
演する。たとえは、抗原に関する便用の射および時期に
依存し又、IFNは生体に2いても試蛤宍管内において
も兄疫強化作用および免役抑制作用の両省を示し9る〔
テキサス・レポート、第357〜65?頁〕。葛らに、
9′雛異感作リンパ潔は、抗原との接触後にlFNを主
座することが観察されている。したがって、この棟の抗
原防発されたIFNvi兄疫反応のFA整剤となって、
循環抗原レベルと細胞免役の発現との両者に影/#を与
えることができる〔テキサス・レポート、第370〜7
≠負〕。さらに、IFNはキラーリンパ球の粘性および
aC体−依存性nJ胞−媒介された細胞毎性を高めるこ
とも知られていル〔アール−アール・パーベルマン等、
rヒトにおける天然のおよび抗体−依存性細胞−媒介ち
れた細胞毎性のインタフ二ロンによる増強」、ネイチャ
ー誌、#4JJ7を、第2.27〜.23負(/り7り
);ビーeビバリーおよヒティーーナイト、「死亡は自
然にやって来る」、ネイチャfJf、、第一71巻、第
l/り〜20頁(lり7P) iテキサス・レポート、
第373〜gθ頁;ジェーΦアール・バドルストーン等
、1−インタフェロン僚沃後のヒトにおける天然キラー
h胞の肪発および速度論」、ネイチャー誌、第、2L2
巻、第4117〜/り貞(lり7り);ニス番フィンホ
ルン等。
演する。たとえは、抗原に関する便用の射および時期に
依存し又、IFNは生体に2いても試蛤宍管内において
も兄疫強化作用および免役抑制作用の両省を示し9る〔
テキサス・レポート、第357〜65?頁〕。葛らに、
9′雛異感作リンパ潔は、抗原との接触後にlFNを主
座することが観察されている。したがって、この棟の抗
原防発されたIFNvi兄疫反応のFA整剤となって、
循環抗原レベルと細胞免役の発現との両者に影/#を与
えることができる〔テキサス・レポート、第370〜7
≠負〕。さらに、IFNはキラーリンパ球の粘性および
aC体−依存性nJ胞−媒介された細胞毎性を高めるこ
とも知られていル〔アール−アール・パーベルマン等、
rヒトにおける天然のおよび抗体−依存性細胞−媒介ち
れた細胞毎性のインタフ二ロンによる増強」、ネイチャ
ー誌、#4JJ7を、第2.27〜.23負(/り7り
);ビーeビバリーおよヒティーーナイト、「死亡は自
然にやって来る」、ネイチャfJf、、第一71巻、第
l/り〜20頁(lり7P) iテキサス・レポート、
第373〜gθ頁;ジェーΦアール・バドルストーン等
、1−インタフェロン僚沃後のヒトにおける天然キラー
h胞の肪発および速度論」、ネイチャー誌、第、2L2
巻、第4117〜/り貞(lり7り);ニス番フィンホ
ルン等。
[ヒトにおけるインタフェロンおよび自然細胞語注、1
1.外米白血球インタフェロンを受ケた患者の研究J
、 AataoMed、5aand、、y74.!o4
を巻、纂≠7l−ffJ頁(lり71)〕。キラーリン
パ球および抗体−依存性細胞一媒介逼れた細胞毒性は、
III! i lbJ胞に対する免疫学的攻撃に直接的
にまたは間接的匹胸与することができる。
1.外米白血球インタフェロンを受ケた患者の研究J
、 AataoMed、5aand、、y74.!o4
を巻、纂≠7l−ffJ頁(lり71)〕。キラーリン
パ球および抗体−依存性細胞一媒介逼れた細胞毒性は、
III! i lbJ胞に対する免疫学的攻撃に直接的
にまたは間接的匹胸与することができる。
したがって、抗ウィルス剤として使用する他、)iul
FNは抗腫瘍2よひ制癌僚法において、或いは兄疫if
!14剤およびその方法において有力な用途會廂するし
ザφインタフェ四ン・システム。
FNは抗腫瘍2よひ制癌僚法において、或いは兄疫if
!14剤およびその方法において有力な用途會廂するし
ザφインタフェ四ン・システム。
第JAY〜、2/負% 第3り弘〜タタ頁]。机仕、I
FNは、多くのM6IJ!/lにおいて多くのafAの
j庫揚の成長に影響を与えゐことが知られているL−v
′やインタフエロン嗜システム、4.2り2〜j 04
’ jJ 〕。
FNは、多くのM6IJ!/lにおいて多くのafAの
j庫揚の成長に影響を与えゐことが知られているL−v
′やインタフエロン嗜システム、4.2り2〜j 04
’ jJ 〕。
他の抗腫瘍剤と同様、インクフエロンは小捕場に対して
使用ずれは丑に市゛幼でめると思わ7’Lる。
使用ずれは丑に市゛幼でめると思わ7’Lる。
動物IFNのtyl、腫瘍幼果は投与鉦と時ルjとに依
存するが、動性レベルより低い碇度で示されている。し
たがって、多くの研究2よび臨床試鮫が、HulFNの
抗腫瘍および制m ’F子性につき行なわれ続Gプてい
る。これらは、たとえは骨肉腫。
存するが、動性レベルより低い碇度で示されている。し
たがって、多くの研究2よび臨床試鮫が、HulFNの
抗腫瘍および制m ’F子性につき行なわれ続Gプてい
る。これらは、たとえは骨肉腫。
急性骨髄性白血病、多発性慣髄腫およびホドキンス病の
ような幾つかの悪性病の処振を包含する〔テキサス拳レ
ボ−)、g44グー2〜3!負〕。
ような幾つかの悪性病の処振を包含する〔テキサス拳レ
ボ−)、g44グー2〜3!負〕。
これら臨床試験の結果は有望であるが、IFNの抗腫瘍
、制5市および免疫変調のための用途は精製IFNの光
分な供給源が欠如するため著しく 1till約されて
いる。
、制5市および免疫変調のための用途は精製IFNの光
分な供給源が欠如するため著しく 1till約されて
いる。
生化学レベルにおいてIFNは、少なくとも3極の蛋白
質、蛋白質キナーゼ〔ヒー・レフロ−%、 I−イン
タ7エロン、二g知DNA1−よび鍬白負ヅ鼾酸化J
、 )’roe、 Na11.Aaad、 Sai、U
SA。
質、蛋白質キナーゼ〔ヒー・レフロ−%、 I−イン
タ7エロン、二g知DNA1−よび鍬白負ヅ鼾酸化J
、 )’roe、 Na11.Aaad、 Sai、U
SA。
第73巻、第3707〜//負(/り76); ニー・
シー彎ホバネシアンおよびアイ・エム・ケール、]°イ
ンタフエロン処理細胞からの(−2/ S / )オ
リボアテニル(pppAコ’−jA、2’−j’A)合
成酵素および蛋臼買キナーセ」、ヨーロビ7y・ジャー
ナル・バイオケミストリー、第23巻、第!/j−26
負(lり7り)〕、(,2/ s / )オリゴ(A
)合成酵素〔工−−ジーーホバネシアン等、1インタフ
エロン処理細胞からの酵素による蛋白賀合成の低分子掻
抑制創の合成」、ネイチャー誌、第、26g巻、第53
7〜3り頁(lり77);ニー・ジー・ホバネシアンお
よびアイ・エム・ケール、ヨーロピアンやシャーナル−
ハ#’;rミスドリー、上fiαノおよびホスフォジェ
ステラーゼ〔ニー・シュミット等、[インタフエロン誘
発ホス7オジエステラーゼ分解(−4’−−1’) 、
d−リコイソアデニレートおよびtRNAのC−C−A
床端−1、Proc、Nak 1.Aaad、 Sci
、 USA、第76巻、第≠7gに〜9.2負(15?
7り)ノの形成r酷元する。
シー彎ホバネシアンおよびアイ・エム・ケール、]°イ
ンタフエロン処理細胞からの(−2/ S / )オ
リボアテニル(pppAコ’−jA、2’−j’A)合
成酵素および蛋臼買キナーセ」、ヨーロビ7y・ジャー
ナル・バイオケミストリー、第23巻、第!/j−26
負(lり7り)〕、(,2/ s / )オリゴ(A
)合成酵素〔工−−ジーーホバネシアン等、1インタフ
エロン処理細胞からの酵素による蛋白賀合成の低分子掻
抑制創の合成」、ネイチャー誌、第、26g巻、第53
7〜3り頁(lり77);ニー・ジー・ホバネシアンお
よびアイ・エム・ケール、ヨーロピアンやシャーナル−
ハ#’;rミスドリー、上fiαノおよびホスフォジェ
ステラーゼ〔ニー・シュミット等、[インタフエロン誘
発ホス7オジエステラーゼ分解(−4’−−1’) 、
d−リコイソアデニレートおよびtRNAのC−C−A
床端−1、Proc、Nak 1.Aaad、 Sci
、 USA、第76巻、第≠7gに〜9.2負(15?
7り)ノの形成r酷元する。
ヒトインタフx t:+ ン(1’ rlu IF’N
J ) (rユ3つのグループ、すなわちα、βおよ
びγしこ分類6れている。これらの9ち、αおよびβイ
ンタフエロンrL版安)ヱ1生の型1のインタ7エロン
でめル一方、γ−インクフエロンは敞不妥定憔の型11
のインタフエロンである。さらに、こ扛ら3拙のHul
P’Nはすし原性において互いに41]違している。
J ) (rユ3つのグループ、すなわちα、βおよ
びγしこ分類6れている。これらの9ち、αおよびβイ
ンタフエロンrL版安)ヱ1生の型1のインタ7エロン
でめル一方、γ−インクフエロンは敞不妥定憔の型11
のインタフエロンである。さらに、こ扛ら3拙のHul
P’Nはすし原性において互いに41]違している。
HuIFN−aおよびHu I F N−βば、14u
ll”N−γより良好に上注化されている。fiulF
”N−γはクリコ蛋白質であると報告されている〔ニー
・ミズラミ令、]−インタフ二ロンのクリコシル化」、
ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー。
ll”N−γより良好に上注化されている。fiulF
”N−γはクリコ蛋白質であると報告されている〔ニー
・ミズラミ令、]−インタフ二ロンのクリコシル化」、
ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー。
第、253巻、第7乙/、2−/Jj(/27g);ザ
・インタフエロン・シスナノ1.第107〜/θg頁〕
。
・インタフエロン・シスナノ1.第107〜/θg頁〕
。
芒らに、これは4LO9θQO〜41.乙、 o o’
oタルトンの分子量′f:有すると報告されており+(
”のクリコシル化型はi、s、ooo〜70.θθQダ
ルトンの分子量を有するEJ能性がんる。敵不安定性(
p14.2において)である他、IPN−rrisl、
CVC”C/Q1)Ji Hに欠隔すると稽古されてい
る。みらに、仄の文m1kk照することができる〔テレ
イーf、上6α;ワイ・クー・イツブ等、[ヒトγ(免
疫)インタフエロンの部分和装2よひ轡扛化」。
oタルトンの分子量′f:有すると報告されており+(
”のクリコシル化型はi、s、ooo〜70.θθQダ
ルトンの分子量を有するEJ能性がんる。敵不安定性(
p14.2において)である他、IPN−rrisl、
CVC”C/Q1)Ji Hに欠隔すると稽古されてい
る。みらに、仄の文m1kk照することができる〔テレ
イーf、上6α;ワイ・クー・イツブ等、[ヒトγ(免
疫)インタフエロンの部分和装2よひ轡扛化」。
Proc、 Na t l、 ノ:Lcad 、
Sa i、 USA 、 第 7 δl、!、i/
60/〜1,03頁(/yl/); エムφビー・ラ
ングフォード等、1−ヒト免疫インタ7エロンの大規模
生産および物理化学的時性化」、インフエクション・ア
ンド・インミュニデイ、j4J!:%、第3t−グ/貞
(/り79)〕。延らに、Ifi″N−γはIFN−α
筺たはIFN−βとは異なる前11月民レセプタを認識
するとも報告されている〔ニーーニーΦブランカおよび
シーーバグリオニ、[型1および■のインタフエロンが
異なるレセプタを鳴するという証明」、ネイチャー醍、
第コタV巻、第76g〜70頁(/り♂/)〕。
Sa i、 USA 、 第 7 δl、!、i/
60/〜1,03頁(/yl/); エムφビー・ラ
ングフォード等、1−ヒト免疫インタ7エロンの大規模
生産および物理化学的時性化」、インフエクション・ア
ンド・インミュニデイ、j4J!:%、第3t−グ/貞
(/り79)〕。延らに、Ifi″N−γはIFN−α
筺たはIFN−βとは異なる前11月民レセプタを認識
するとも報告されている〔ニーーニーΦブランカおよび
シーーバグリオニ、[型1および■のインタフエロンが
異なるレセプタを鳴するという証明」、ネイチャー醍、
第コタV巻、第76g〜70頁(/り♂/)〕。
抗ウつルス活性の他に、IFN−γは抗腫瘍活性を示す
ことも報告されている。さらに、l’N−αおよびIF
N−βと比較して、l’N−γのりL腫局泊性は少なく
ともねず与i/cお・いで11事瘍の佼退をも1こらず
と思わ7Lる。さらに、天然ヤラー細胞の7古性はl’
N−αおよび11・゛へ一βにつき観察ちれたと同様な
水準に逢ぜず、 Ifi’N−γはIF′1〜−αお
よびIFN−βよりもその子liJけjりがカンクリオ
シドの循環レベルにより低いものと思われる〔エッチ・
アンケル等、[ねずみの繊維芽卸1胞1(型I)および
免疫(型])インタフエロン:ガングリオシドに対する
観和件およびねず与の白肌v4L −/−2/ 0 、
R細側に対する抗ウィルスおよび抗成長効果における顕
著l相違」。
ことも報告されている。さらに、l’N−αおよびIF
N−βと比較して、l’N−γのりL腫局泊性は少なく
ともねず与i/cお・いで11事瘍の佼退をも1こらず
と思わ7Lる。さらに、天然ヤラー細胞の7古性はl’
N−αおよび11・゛へ一βにつき観察ちれたと同様な
水準に逢ぜず、 Ifi’N−γはIF′1〜−αお
よびIFN−βよりもその子liJけjりがカンクリオ
シドの循環レベルにより低いものと思われる〔エッチ・
アンケル等、[ねずみの繊維芽卸1胞1(型I)および
免疫(型])インタフエロン:ガングリオシドに対する
観和件およびねず与の白肌v4L −/−2/ 0 、
R細側に対する抗ウィルスおよび抗成長効果における顕
著l相違」。
Proc、Natl、 Acad、 Sci、 USA
、 第77@、 第J!、2g〜3.2頁(/り10)
〕、〕I、−1がって、IFN−αまたはIFN−βに
対し貧勃な反比・を示す〃(11胞および腫瘍は、IF
N−rによって幼果的に処置されうると思われる〔たと
えは、フレイン%、J、Natl、 Cancer、I
n5titute 、 第6 /巻、第gり1頁(/り
7g)逼 バルン等、アブストラクト拳エヌ9ワイ9ア
カデミ−・ザイエンス、第//M(/り7り年IQ月2
3〜26日);ブラロツク寺、セルラー・インミュノロ
ジー、第≠2巻、第JYO〜2≠負(/りIt)):ビ
ー・ワイ・ルピンおよびニス・エル番グプタ、「抗ウィ
ルスおよび抗繁殖剤としてのヒトの型IJ?よひ型lの
インタフエロンの幼果の札違J 、 Proa。
、 第77@、 第J!、2g〜3.2頁(/り10)
〕、〕I、−1がって、IFN−αまたはIFN−βに
対し貧勃な反比・を示す〃(11胞および腫瘍は、IF
N−rによって幼果的に処置されうると思われる〔たと
えは、フレイン%、J、Natl、 Cancer、I
n5titute 、 第6 /巻、第gり1頁(/り
7g)逼 バルン等、アブストラクト拳エヌ9ワイ9ア
カデミ−・ザイエンス、第//M(/り7り年IQ月2
3〜26日);ブラロツク寺、セルラー・インミュノロ
ジー、第≠2巻、第JYO〜2≠負(/りIt)):ビ
ー・ワイ・ルピンおよびニス・エル番グプタ、「抗ウィ
ルスおよび抗繁殖剤としてのヒトの型IJ?よひ型lの
インタフエロンの幼果の札違J 、 Proa。
Natl、Acad、Soi、 USA 、 第7
7 巻、 mj タλj〜3−員(lりto))。
7 巻、 mj タλj〜3−員(lりto))。
HulFN−7’は、多くのヒト蛋白質と同様に多形性
であってもよい。したがって、特定固体の細胞はよ多一
般的なIFN−rの種類におけるIFN−rの8i類を
生産することができ、これらイ玉類はその一部であるa
1類の原型と生理学的に類似しているが、構造上僅かに
異なっている。したがって、IFN−γの蛋白質構造は
一般に明確であるが、特定の1体はそれとは僅かに異な
るIFN−γを生産するであろう。
であってもよい。したがって、特定固体の細胞はよ多一
般的なIFN−rの種類におけるIFN−rの8i類を
生産することができ、これらイ玉類はその一部であるa
1類の原型と生理学的に類似しているが、構造上僅かに
異なっている。したがって、IFN−γの蛋白質構造は
一般に明確であるが、特定の1体はそれとは僅かに異な
るIFN−γを生産するであろう。
)1uIF’N−aおよび)lulFN−βの両極類は
1組換DN人技術を用いて適当な宿主において生産笛れ
ている〔たとえrよ、ニスφナガタ等、[イー・コリに
訃けるヒト目皿モ)、インタフエロンY占性をイアする
ポリペプチドの脅威」、イ・イチャー誌、第一ざグ巻、
第376〜コO負(lりgo)(IFN−α)およびア
ール・ナリンク等、1−人Ii3%菌におけるヒト繊組
1・K山ノj包インタフエロン遺伝子の六組」、ネイチ
ャー誌、第−r7巷、第一り3〜コ0コ角(/りLυ(
IFN−β)〕。この株の技術は、δらにHuIFN−
αおよびMuIl”N−βの的−性化および初ル」の臨
床臥験紮口」能にした。
1組換DN人技術を用いて適当な宿主において生産笛れ
ている〔たとえrよ、ニスφナガタ等、[イー・コリに
訃けるヒト目皿モ)、インタフエロンY占性をイアする
ポリペプチドの脅威」、イ・イチャー誌、第一ざグ巻、
第376〜コO負(lりgo)(IFN−α)およびア
ール・ナリンク等、1−人Ii3%菌におけるヒト繊組
1・K山ノj包インタフエロン遺伝子の六組」、ネイチ
ャー誌、第−r7巷、第一り3〜コ0コ角(/りLυ(
IFN−β)〕。この株の技術は、δらにHuIFN−
αおよびMuIl”N−βの的−性化および初ル」の臨
床臥験紮口」能にした。
現在、入手しうる極めて少ifEの1iulFN−γが
繊紙培養において増殖さitたヒト細胞糸により、或い
はより一蚊的には廂徹試料から集められた白血球から生
産されている。これらの方法は低収率であゃ、かつ高価
なものである。これらは、さらVこ特性化を行ない、或
いは臨床試験を行なって抗ウィルス活性、抗腫WI活性
ま/こは免疫変調活性のIFN−γを続開したり、或い
はこれらの活性をfiuIFN−αお↓ひMulk’N
−βの抗ウィルスh LL庖1kltふ・よび免疫変調
活性に対して比較するには充分なMuIFN−rf与え
ていない。
繊紙培養において増殖さitたヒト細胞糸により、或い
はより一蚊的には廂徹試料から集められた白血球から生
産されている。これらの方法は低収率であゃ、かつ高価
なものである。これらは、さらVこ特性化を行ない、或
いは臨床試験を行なって抗ウィルス活性、抗腫WI活性
ま/こは免疫変調活性のIFN−γを続開したり、或い
はこれらの活性をfiuIFN−αお↓ひMulk’N
−βの抗ウィルスh LL庖1kltふ・よび免疫変調
活性に対して比較するには充分なMuIFN−rf与え
ていない。
本発明は、kLulFN−rを暗号化するDNA配列を
位置決定しかつ分離し、これら配列により適当な宿主を
形負転挾させ、それによp 1)NA配配列2換換D8
分子ならびにヒト免疫インタフエロンの免疫学的もしく
tよ生物学的活性を示すポリペプチド、物にこれら活性
を示すグリコジル化ポリペプチドの生産におけるこれら
配夕1jおよび分子の使用方法全提供することにより上
記の間馳を解決する。
位置決定しかつ分離し、これら配列により適当な宿主を
形負転挾させ、それによp 1)NA配配列2換換D8
分子ならびにヒト免疫インタフエロンの免疫学的もしく
tよ生物学的活性を示すポリペプチド、物にこれら活性
を示すグリコジル化ポリペプチドの生産におけるこれら
配夕1jおよび分子の使用方法全提供することにより上
記の間馳を解決する。
本発明によれは、抗ウィルス、抗膓瘍、制癌または免疫
変調剤および方法に使用するための免疫学的もしくは生
物学的HulFN−γの活性を示すポリペプチドを得る
ことができる。本発明は、これらポリペプチドを従来得
られなかったような量ならひに方法で生産することを可
能にする。
変調剤および方法に使用するための免疫学的もしくは生
物学的HulFN−γの活性を示すポリペプチドを得る
ことができる。本発明は、これらポリペプチドを従来得
られなかったような量ならひに方法で生産することを可
能にする。
以下の記載から判るように、本発明の1)NA配列pよ
び組換DjQA分子は、過当なNN主におい・てHul
FN−1の免疫学的もしくは生物学的活性を下すポリペ
プチドの生Ili k Th令することができる。δら
に、過当なイM生におけるこれりDNA配列おまひ組換
DNA号子の快表は、これらポリペプチド’/r fk
k +:j化する多りの遺伝子の生mt−”J能にする
。これらポリペプチドおよび遺伝子の分子構造および性
質は、したがって容易に決定することができる。これら
ポリペプチドおよび遺伝子は、細土中で生産きれたまま
で或いは適当に訪尋体化もしくは改変した伎にこれら生
産物目釘の生産を検出しかつ向上させ。
び組換DjQA分子は、過当なNN主におい・てHul
FN−1の免疫学的もしくは生物学的活性を下すポリペ
プチドの生Ili k Th令することができる。δら
に、過当なイM生におけるこれりDNA配列おまひ組換
DNA号子の快表は、これらポリペプチド’/r fk
k +:j化する多りの遺伝子の生mt−”J能にする
。これらポリペプチドおよび遺伝子の分子構造および性
質は、したがって容易に決定することができる。これら
ポリペプチドおよび遺伝子は、細土中で生産きれたまま
で或いは適当に訪尋体化もしくは改変した伎にこれら生
産物目釘の生産を検出しかつ向上させ。
さらに抗ウィルス、抗腫瘍、制癌もしくtよ免疫変調剤
および方法に使用するための組成物および方法において
有用である。
および方法に使用するための組成物および方法において
有用である。
上記から明らかなように1本発明の基本的局面は、Hu
lFN−rの免疫学けりもしくは生物学的活性を示すポ
リペプチドellK号化し、或いは少なくともDNA配
列の収束物からこの柚のL) N A配夕1」の選択に
口J能VCする仁と會舟像とする1) N A配列を提
供することであり、この1)NA配列はDhN A神入
吻γ0.γ1.γ2 + 15 +γ4゜γ5.γ6+
r7+r8+7”P+rj[11γl++上記1)NA
挿入物のいずれにかヒブリド化するDNA配列。
lFN−rの免疫学けりもしくは生物学的活性を示すポ
リペプチドellK号化し、或いは少なくともDNA配
列の収束物からこの柚のL) N A配夕1」の選択に
口J能VCする仁と會舟像とする1) N A配列を提
供することであり、この1)NA配列はDhN A神入
吻γ0.γ1.γ2 + 15 +γ4゜γ5.γ6+
r7+r8+7”P+rj[11γl++上記1)NA
挿入物のいずれにかヒブリド化するDNA配列。
天β1合成もしくは牛舎hx、 DJ’−、突然変異、
年−もしくは多重の前tii D N A配列もしくは
仲人物のいずれかに対する塩基置侯、削除、押入および
逆転を宮め全ゆる供給踪から侍られるDNA配夕!I
h i’] =d 1)NA配列のいずれかのコドンの
表現の隙暗号化されるポリペプチドに対し先膜学的もし
くは生物学的同様な活性を示すポリペプチドを暗号化す
るコドンの配列からなる1)NA配列よシなる群から選
択逼れることを特似とする。本発明の配列は、さらに宿
主においてHu If+’N−f” AらひVCHu
I F N −1259ポリペプチドの生産金b」能に
することを待機とする。
年−もしくは多重の前tii D N A配列もしくは
仲人物のいずれかに対する塩基置侯、削除、押入および
逆転を宮め全ゆる供給踪から侍られるDNA配夕!I
h i’] =d 1)NA配列のいずれかのコドンの
表現の隙暗号化されるポリペプチドに対し先膜学的もし
くは生物学的同様な活性を示すポリペプチドを暗号化す
るコドンの配列からなる1)NA配列よシなる群から選
択逼れることを特似とする。本発明の配列は、さらに宿
主においてHu If+’N−f” AらひVCHu
I F N −1259ポリペプチドの生産金b」能に
することを待機とする。
実施例
以下、本発明tよりiI+軸に説明する。
本明細@において次の用飴を使用する:ヌクレオチド;
糖部分(ペントース)と9.l酸と言家系複弗項式塩基
とよりなるi) N AもしくはRN Aのモノマ一単
位。」虱元はクリコシド炭系(ペントースの7′炭;も
)を弁して糖部分にボd合きれており、塩丞と楯とのこ
の組付せrヌクレオチドと叶ぷ。この虹mlユヌクレオ
テドを特性化する。≠柚のD五りA塙基はアテニン(r
AJ )、グアニン(「ul )、シトシン(1−eJ
)およびチミン(rTJ )である。弘オ虫の1tN
A上五−基はA、 G、Cおよびウラシル(rUJ )
で6る。
糖部分(ペントース)と9.l酸と言家系複弗項式塩基
とよりなるi) N AもしくはRN Aのモノマ一単
位。」虱元はクリコシド炭系(ペントースの7′炭;も
)を弁して糖部分にボd合きれており、塩丞と楯とのこ
の組付せrヌクレオチドと叶ぷ。この虹mlユヌクレオ
テドを特性化する。≠柚のD五りA塙基はアテニン(r
AJ )、グアニン(「ul )、シトシン(1−eJ
)およびチミン(rTJ )である。弘オ虫の1tN
A上五−基はA、 G、Cおよびウラシル(rUJ )
で6る。
DNA配タリりリ接するペントースの3′あ・よひ!′
炭素の間のホスホジエステル1lil”ifにより互い
に接続されたヌクレオチドの枦状列。
炭素の間のホスホジエステル1lil”ifにより互い
に接続されたヌクレオチドの枦状列。
コドン: mRNA1介してアミノ酸、し択開始信号
または翻訳停止18号合暗号化する3個のヌクレオチド
(トリブレット)のDNA自己自己ウリとえば、ヌクレ
オテドトリブレントi”r A 。
または翻訳停止18号合暗号化する3個のヌクレオチド
(トリブレット)のDNA自己自己ウリとえば、ヌクレ
オテドトリブレントi”r A 。
TTG%CTT%CTC%CTAz−よひCTGI、i
7ミノ敵ロイシン([LeuJ )を陥号化し、TAG
、TAAおよびTGAは翻訳停止信号であり、かつAT
Gは翻訳開始信号でるる。
7ミノ敵ロイシン([LeuJ )を陥号化し、TAG
、TAAおよびTGAは翻訳停止信号であり、かつAT
Gは翻訳開始信号でるる。
′P!1絖伜: m1tNAをアミノば配夕IJ筐で
翻訳する際のコドンのクルーフ化。翻訳の際1堰止な加
胱忰を維持せねばならない。たとえば、1JNA6e+
1J(jcruGTTGTAAGはJ ッ(DjJlf
、 %r、枠、すなわち相として衣視する仁とができ、
そので〕しそれは異なるアミノ敵配列金与える: GCT GUT ’I’GT AAG −−Ala−G
ly−Cys−LysG C1’G GTT GTA
AG−Leu−Val−ValGC県警1−’pU $
−AA G−−Trp−Leu−(停止)ポリペ7°チ
ド: 餉接するアミノ酸のα−アミン基とカルボキシ基
との間のベフテド精合によシ互いに接続されたアミノ酸
の線状列。
翻訳する際のコドンのクルーフ化。翻訳の際1堰止な加
胱忰を維持せねばならない。たとえば、1JNA6e+
1J(jcruGTTGTAAGはJ ッ(DjJlf
、 %r、枠、すなわち相として衣視する仁とができ、
そので〕しそれは異なるアミノ敵配列金与える: GCT GUT ’I’GT AAG −−Ala−G
ly−Cys−LysG C1’G GTT GTA
AG−Leu−Val−ValGC県警1−’pU $
−AA G−−Trp−Leu−(停止)ポリペ7°チ
ド: 餉接するアミノ酸のα−アミン基とカルボキシ基
との間のベフテド精合によシ互いに接続されたアミノ酸
の線状列。
ゲノム: 細胞またはウィルスの完全DNA。
これは、特に物質のポリペプチドを暗号化する構造遺伝
子、ならびにたとえばシャインーダルガルノ配列のよう
な配列を含むオペレータ、プロモータならびにリボンー
ム結合性および反工L1性配列を仮言する。
子、ならびにたとえばシャインーダルガルノ配列のよう
な配列を含むオペレータ、プロモータならびにリボンー
ム結合性および反工L1性配列を仮言する。
構造遺伝子ニーf:の雛型もしくはメツセンジャRN
A ([mRNAj ) f介して!足ホリペプテドに
特徴的なアミノ酸のロe列ケ暗号化−する1JNA配夕
’J。
A ([mRNAj ) f介して!足ホリペプテドに
特徴的なアミノ酸のロe列ケ暗号化−する1JNA配夕
’J。
転 ′tii−: 栴:i1i遺伝子からm RN
A 5生丸する過程。
A 5生丸する過程。
翻 訳:mRNAからポリペグチトゲ生産する過程。
表 現: ポリペプチドを生殖するため構造遺伝子によ
シ行なわれる過程。これは転みと翻訳との組合せでるる
。
シ行なわれる過程。これは転みと翻訳との組合せでるる
。
プラスミド: 非染色体二i It D N A配列で
あって、プラスミドが宿王細廁において複製嘔れるよう
な完全「レプリコン」からなっている。
あって、プラスミドが宿王細廁において複製嘔れるよう
な完全「レプリコン」からなっている。
7ラスミドを単細胞生物中に入れると、この生物の特性
はプラスミドのDNAの結果として笈化しまたは形質転
装される。たとえば、テトラサイクリン耐性(’I’e
t’)に対する遺伝子を有するプラスミドは、従前にテ
トラサイクリンに対し7感受性であった細胞をこ7Lv
cIfl・(性である細胞へと形買転換δせる。プラス
ミドにより形買転換δれた細胞金「形翼転換体」と叶ふ
。
はプラスミドのDNAの結果として笈化しまたは形質転
装される。たとえば、テトラサイクリン耐性(’I’e
t’)に対する遺伝子を有するプラスミドは、従前にテ
トラサイクリンに対し7感受性であった細胞をこ7Lv
cIfl・(性である細胞へと形買転換δせる。プラス
ミドにより形買転換δれた細胞金「形翼転換体」と叶ふ
。
ファージもしくはバクテリオファージ:細菌性ウィルス
であって、その多くは蛋白質エンベログもしくはコート
に包封されたDNA配列よシなっている(1カプシド」
)。
であって、その多くは蛋白質エンベログもしくはコート
に包封されたDNA配列よシなっている(1カプシド」
)。
クローン化ベヒクル: 化1王細胞において被製しうる
グラスミド、ファージ1)NAもしくはその他のL)N
A配列であって、7個もしくは少数のエンドヌクレアー
ゼ認識部位を特徴とし、この部位においてIJNA配列
は決定b」能な方法で切断することができ、しかもDN
Aの必須の生物学的機能、たとえり;複製、コート蛋白
質の生産を喪失することがなく、またフロモータもしく
は結合部位の喪失を伴うことがなく、さらに形質転換細
胞の同定に使用するのに適した標識、たとえばラートラ
サイタリン的11生もしく illアンヒシリン劇性を
含む。クローン化ベヒクルはしばしばベクターと呼はれ
る。
グラスミド、ファージ1)NAもしくはその他のL)N
A配列であって、7個もしくは少数のエンドヌクレアー
ゼ認識部位を特徴とし、この部位においてIJNA配列
は決定b」能な方法で切断することができ、しかもDN
Aの必須の生物学的機能、たとえり;複製、コート蛋白
質の生産を喪失することがなく、またフロモータもしく
は結合部位の喪失を伴うことがなく、さらに形質転換細
胞の同定に使用するのに適した標識、たとえばラートラ
サイタリン的11生もしく illアンヒシリン劇性を
含む。クローン化ベヒクルはしばしばベクターと呼はれ
る。
クローン化: 剣性繁殖により生物またはこれら/lf
Mの生物から生ずるDNA配列の集洛を札侯1)NA分
子またぐよヒブリドo8”8 生体細胞の外部で南部ヌ
シ稍邸にて帖付さ扛、かつ生坏#胞中に維持しうる、セ
、(々異なるクノムからのDNAのトノF片よりなる分
子。
Mの生物から生ずるDNA配列の集洛を札侯1)NA分
子またぐよヒブリドo8”8 生体細胞の外部で南部ヌ
シ稍邸にて帖付さ扛、かつ生坏#胞中に維持しうる、セ
、(々異なるクノムからのDNAのトノF片よりなる分
子。
衣現制御配夕1」: これら遺伝子に作用粕会3れた
除、楢造遺伝子の訳机k IIIIJ飾2よひ調部する
ヌクレオチドの配タリ。これらは1−系、バージλの主
嶽オペレータおよびフロモータ官i域、fd被核蛋蛋白
のtBIJ飼Jvt城寂よひその他の原始核もしくは成
熟核卸11剋秒よひそのウィルスり遺伝子の表現を制卸
することが知らtした配夕1」またはそれらの組合せを
包もする。
除、楢造遺伝子の訳机k IIIIJ飾2よひ調部する
ヌクレオチドの配タリ。これらは1−系、バージλの主
嶽オペレータおよびフロモータ官i域、fd被核蛋蛋白
のtBIJ飼Jvt城寂よひその他の原始核もしくは成
熟核卸11剋秒よひそのウィルスり遺伝子の表現を制卸
することが知らtした配夕1」またはそれらの組合せを
包もする。
第1図を番照して、ここには組換D 1’J A分子の
混合物の製造方法に卜する一共体例か示ちれてお9%こ
れら組換1)NA分子の炊つかは本発明を特徴化する挿
入1JNA配列會乞んでいる。
混合物の製造方法に卜する一共体例か示ちれてお9%こ
れら組換1)NA分子の炊つかは本発明を特徴化する挿
入1JNA配列會乞んでいる。
本発明に使用したkLN入りよ、マイトジェン刺戟され
たヒト牌#IIIJ@から抽出した。このpI細廁は、
1人の提供者から多足の免役系細胞を与えかつ込らにイ
ンターロイキン1生殖細胞のM除により殆んど変動しな
い皿で免役インタフエロンを生産するというオリ点を与
える。例数なら、牌11i1!胞は主としてリンパ詠と
マクロファージとから傅成さlしるからでめる。
たヒト牌#IIIJ@から抽出した。このpI細廁は、
1人の提供者から多足の免役系細胞を与えかつ込らにイ
ンターロイキン1生殖細胞のM除により殆んど変動しな
い皿で免役インタフエロンを生産するというオリ点を与
える。例数なら、牌11i1!胞は主としてリンパ詠と
マクロファージとから傅成さlしるからでめる。
本発明″4#j=によシ、牌細胞の生存率およびインタ
フエロン測冗櫃は主として牌臓の除去と処理との間の時
間に依存することが見出された。
フエロン測冗櫃は主として牌臓の除去と処理との間の時
間に依存することが見出された。
(a) ヒト牌#tIi胞の単離
外科部門から竹られたヒトの牌臓r無菌ンシスチツク袋
に入れで央験室へ搬入し、央貌室中に持込まれた後、無
陶カラス皿VC移した。無菌解体鋏によって牌臓の外膜
を除去し、お−の牌臓組織を切除した。この71ili
織を72スチック製ヘトリ皿(直%/!am)に入れ、
ここでさらに−屑小ちい片1で切断した(〜0.j・♂
)。
に入れで央験室へ搬入し、央貌室中に持込まれた後、無
陶カラス皿VC移した。無菌解体鋏によって牌臓の外膜
を除去し、お−の牌臓組織を切除した。この71ili
織を72スチック製ヘトリ皿(直%/!am)に入れ、
ここでさらに−屑小ちい片1で切断した(〜0.j・♂
)。
約10m1ノktPMI /6440培地(ギフコ社
)(−2’/ / l cDJNl& kiC05と2
0 W )1i K P l& Sと全補充)を添加し
た佼、大部分の細胞か弛緩するまで2縮のプラスチック
表a豹器からのフランシャ端部により組社断片忙紋く漬
した。次いで、この愁濁物’、(i4−90m1t7)
RPMI /6410培地で布釈し、得られた懸濁物
を元金に混せした。
)(−2’/ / l cDJNl& kiC05と2
0 W )1i K P l& Sと全補充)を添加し
た佼、大部分の細胞か弛緩するまで2縮のプラスチック
表a豹器からのフランシャ端部により組社断片忙紋く漬
した。次いで、この愁濁物’、(i4−90m1t7)
RPMI /6410培地で布釈し、得られた懸濁物
を元金に混せした。
次いで、組織と軸側のliν、濁吻ケ無凶の金lAt1
中(I x O13umlotn )に移し、そして液
体を別のプラスチック装ベトリ皿に拮赦した。次いで。
中(I x O13umlotn )に移し、そして液
体を別のプラスチック装ベトリ皿に拮赦した。次いで。
篩上の組織を原プラスチック皿に戻し、そして熟砕し、
かつI′ii1記と同様に1過した。最後に。
かつI′ii1記と同様に1過した。最後に。
全糺胞懸濁物をo、z lのフ”ラスチック試験管に江
ぎ込んだ。この+j「L全j痺j滅力稲1司装されるま
で新たな片につき反彷した。
ぎ込んだ。この+j「L全j痺j滅力稲1司装されるま
で新たな片につき反彷した。
殆んどの夕り滅矛山川」(これらは凝集しかつグラスチ
ツク試験管の底部に厚い沈澱勿形成する)を金楓篩によ
り懸濁物全書ひ1過して除去した。
ツク試験管の底部に厚い沈澱勿形成する)を金楓篩によ
り懸濁物全書ひ1過して除去した。
次いで* +11++胞懸濁物f / 00 m、lの
無―円錐状のシリコン処理したガラス遠心分離管に移し
、試験官の底部に葦たは島ミ濁1勿の衣面に1だイJ在
する飯果物を全て除去した。
無―円錐状のシリコン処理したガラス遠心分離管に移し
、試験官の底部に葦たは島ミ濁1勿の衣面に1だイJ在
する飯果物を全て除去した。
次いで、”100x Iにて70分間室温にて遠心分離
することにより細胞を來め、これら細胞7z10倍谷i
の冷トリス−NH4Ct (り部のOJ j % N)
14CJ +/部ノ) 1,1 、x、 −klcl
(2o、A1i/ / l S PIi 7 、J )
)溶液中に軟和に懸濁させて亦白球を浴解させた。μ
℃にて70分間後、紙部に凝集した全ての死細胞を除去
し、白色細胞を集め、かつ少なくともktPMI /
A≠Q培地によってコ回洗浄した。次いで、これら細胞
を完全培地(0,03%のし一グルタミンと/ 00
U/aのペニシリンと100μI/mlのストレプトマ
イシンと25μg/IIL13のネオマイシンとj×1
o−5モルのβ−メルカプトエタノールとlOチの胎児
牛血清とを補充し九RPMI /6110)中へλ〜t
y−xio6個の細胞/〜の龜度まで懸濁させた。
することにより細胞を來め、これら細胞7z10倍谷i
の冷トリス−NH4Ct (り部のOJ j % N)
14CJ +/部ノ) 1,1 、x、 −klcl
(2o、A1i/ / l S PIi 7 、J )
)溶液中に軟和に懸濁させて亦白球を浴解させた。μ
℃にて70分間後、紙部に凝集した全ての死細胞を除去
し、白色細胞を集め、かつ少なくともktPMI /
A≠Q培地によってコ回洗浄した。次いで、これら細胞
を完全培地(0,03%のし一グルタミンと/ 00
U/aのペニシリンと100μI/mlのストレプトマ
イシンと25μg/IIL13のネオマイシンとj×1
o−5モルのβ−メルカプトエタノールとlOチの胎児
牛血清とを補充し九RPMI /6110)中へλ〜t
y−xio6個の細胞/〜の龜度まで懸濁させた。
(b) マイトジェンによるヒト牌細胞の刺戟上ロピ
細胞、懸濁物(〜31!、/ x / 010細胞)を
攪拌フラスコに移し、スタフィロコッカスφエンテロト
キシンA (rsNAJ ) (イー・ジエテロトキシ
ンAの精製ならひに幾つかの化与的および9勿理的性負
」、バイオケミストリー、第//@、g3AO〜G4A
(/り7.2)およびエル・スベロおよびジエー会エフ
聾メツガー、[スタフィロコッカス・エンテロトキシン
A(SEA)J、メソッド中イン嗜エンチモロジー、第
72巻(ベストカ、ニス細)(/りざ−2)(出版中)
に災質的に記載されたスタフィロコッカス・アウレウス
菌株/3N、2りOりからオb義〕をo、 s my/
mlの最Julになる壕で力11え、さらにフイトヘム
アクルチニン(rP)lAJ ) k / Om9/m
l (DSL筐で加えた。培養物の上方の雰四気をj%
C02ガス混合物で飽和した後、懸濁物を37℃にてコ
、j日間ゆつくシ撹拌した。コ、j日後、T−,2/細
胞に対する抗ウィルス分相を用いてIFHにつき分相し
た(染色体、2/に対しトリソミツク)〔ワイ・エッチ
・タン等、「ヒト采色体、2/投与;インタフエロン誘
発抗ウィルス状態の表現に対する作用」、プイエンス誌
、第l♂6巻。
細胞、懸濁物(〜31!、/ x / 010細胞)を
攪拌フラスコに移し、スタフィロコッカスφエンテロト
キシンA (rsNAJ ) (イー・ジエテロトキシ
ンAの精製ならひに幾つかの化与的および9勿理的性負
」、バイオケミストリー、第//@、g3AO〜G4A
(/り7.2)およびエル・スベロおよびジエー会エフ
聾メツガー、[スタフィロコッカス・エンテロトキシン
A(SEA)J、メソッド中イン嗜エンチモロジー、第
72巻(ベストカ、ニス細)(/りざ−2)(出版中)
に災質的に記載されたスタフィロコッカス・アウレウス
菌株/3N、2りOりからオb義〕をo、 s my/
mlの最Julになる壕で力11え、さらにフイトヘム
アクルチニン(rP)lAJ ) k / Om9/m
l (DSL筐で加えた。培養物の上方の雰四気をj%
C02ガス混合物で飽和した後、懸濁物を37℃にてコ
、j日間ゆつくシ撹拌した。コ、j日後、T−,2/細
胞に対する抗ウィルス分相を用いてIFHにつき分相し
た(染色体、2/に対しトリソミツク)〔ワイ・エッチ
・タン等、「ヒト采色体、2/投与;インタフエロン誘
発抗ウィルス状態の表現に対する作用」、プイエンス誌
、第l♂6巻。
第67〜t3負(/り740)。その際、攻撃ウィルス
としては脳心筋夫ウィルス(1−kMcJ )’e k
用L fc (ニス・エル会ヘルガー等、「ナマルバ細
胞で合成されたインタフエロン令メツセ1ンジャRNA
のha化」、ジャーナル・バイオロジーカル・ケミスト
リーh m ” ’ G h 第一タjj〜6/負(
/りto))。この分析において、J、J−−4’、
0のインタフエロン測定値を得た(”J。
としては脳心筋夫ウィルス(1−kMcJ )’e k
用L fc (ニス・エル会ヘルガー等、「ナマルバ細
胞で合成されたインタフエロン令メツセ1ンジャRNA
のha化」、ジャーナル・バイオロジーカル・ケミスト
リーh m ” ’ G h 第一タjj〜6/負(
/りto))。この分析において、J、J−−4’、
0のインタフエロン測定値を得た(”J。
・ Lab、単位/N)。
この分相は、FS≠卸1胞を使用するものよpも鋭敏で
ある。イーj故なら、NI)i白血球−IFN標準のl
単位はこの分析において約i、7 (log13Lab
単位/m)を与えるからである。したがって、l’−L
ab単位」として示したこれらの結果は、[国際(白血
球)単位」に変換するには約30の係数で割算せねばな
らない。
ある。イーj故なら、NI)i白血球−IFN標準のl
単位はこの分析において約i、7 (log13Lab
単位/m)を与えるからである。したがって、l’−L
ab単位」として示したこれらの結果は、[国際(白血
球)単位」に変換するには約30の係数で割算せねばな
らない。
勿論、他のマイトジェンを使用して、牌組廁においてI
FN−γ生産を誘発嘔せうることも了解すべきである。
FN−γ生産を誘発嘔せうることも了解すべきである。
たとえば、5EA(0,jμg/mt)のみおよびP
l(A (/ 0 μg/IILI )とi、2−o−
テトラテカノイルーホルボールー13−アセテ−ト(r
TPAJ )との混合物ヶも使用した。それらの結果は
、生産δjLるIl=’Nの皺が主として牌Nl11胞
の品質(すなわち細胞の外相除去と培養との間の時間)
K依存することを示唆している。
l(A (/ 0 μg/IILI )とi、2−o−
テトラテカノイルーホルボールー13−アセテ−ト(r
TPAJ )との混合物ヶも使用した。それらの結果は
、生産δjLるIl=’Nの皺が主として牌Nl11胞
の品質(すなわち細胞の外相除去と培養との間の時間)
K依存することを示唆している。
遠心分111[によ5SEA/P)lA訪発牌糺廁を集
め、これらを冷PBSで洗浄した。これら誘発牌雅胞か
ら全RNAf:単離するため、これらの細胞をクアニジ
ウムチオシアネートの溶液を直ちに浴解さぜた〔ジエー
・エム・チルブライン等、[リボヌクレアー化の豊掬°
な供給諒からの生物学的油性なリボ核酸の単離」、バイ
オケミストリー%第7g巻、第J−タグ〜タタ頁(/2
7り月。
め、これらを冷PBSで洗浄した。これら誘発牌雅胞か
ら全RNAf:単離するため、これらの細胞をクアニジ
ウムチオシアネートの溶液を直ちに浴解さぜた〔ジエー
・エム・チルブライン等、[リボヌクレアー化の豊掬°
な供給諒からの生物学的油性なリボ核酸の単離」、バイ
オケミストリー%第7g巻、第J−タグ〜タタ頁(/2
7り月。
牌臓/個当り斗均301n9の全RNAが侍られた。
次いで、クアニジニウム塩酸塩浴液から沈澱させ、かつ
万すゴ(d’i’)セルロース上でのクロマトグラフィ
によってRNAを私製した(ジエー・エム・チルブライ
/?f、上記〕。この段階において、豹/ m9 (そ
の内60%以上がr RNAである)のRNAが残存し
た。
万すゴ(d’i’)セルロース上でのクロマトグラフィ
によってRNAを私製した(ジエー・エム・チルブライ
/?f、上記〕。この段階において、豹/ m9 (そ
の内60%以上がr RNAである)のRNAが残存し
た。
得られたボIJA RNA2無菌水中に浴解し。
混合物を6に℃にて7分間加熱し、そしてこれを/ O
mM トリス−14C1(ph+ 7.j )と/ m
MのEl)TAとにおいで5〜コO%の蔗糖勾配にてl
l−−2IRのRN Aを/勾配につき使用し、かつペ
ックマン5W4t/W Tiロータにおいて、弘℃にて
76時間、 III、000 rp+nで遠心分離する
ことにより分画した。l5CO勾配分別器において23
個のフラクション(谷0.4t ml ) f集メる一
方、光学密度(λj4tnm)を連続的に辿j足した。
mM トリス−14C1(ph+ 7.j )と/ m
MのEl)TAとにおいで5〜コO%の蔗糖勾配にてl
l−−2IRのRN Aを/勾配につき使用し、かつペ
ックマン5W4t/W Tiロータにおいて、弘℃にて
76時間、 III、000 rp+nで遠心分離する
ことにより分画した。l5CO勾配分別器において23
個のフラクション(谷0.4t ml ) f集メる一
方、光学密度(λj4tnm)を連続的に辿j足した。
RNAN的中OOμgのオリゴ(dT)セルローズの平
行勾配にて遠心分離した後、よSおよび/l57RNA
ビーク(!JS rRNAは試験管の底部に存在した
)の高さを側足することによシ単離RNAの輩を分相し
た。
行勾配にて遠心分離した後、よSおよび/l57RNA
ビーク(!JS rRNAは試験管の底部に存在した
)の高さを側足することによシ単離RNAの輩を分相し
た。
4!r7ラクシヨンにおけるRNA′ft少なくともコ
時間−,217℃にて沈澱させ、これを遠心分離(10
,00Orpm、jOmin、−,20−C,HB4L
qツルバールロータ)によって集め、これを7Q%エタ
ノールで洗浄した。lcN A ’に乾課した後、これ
’i、2.t−jOμ/17)熱菌水申へ俗解させた。
時間−,217℃にて沈澱させ、これを遠心分離(10
,00Orpm、jOmin、−,20−C,HB4L
qツルバールロータ)によって集め、これを7Q%エタ
ノールで洗浄した。lcN A ’に乾課した後、これ
’i、2.t−jOμ/17)熱菌水申へ俗解させた。
ポリA″−ftNA蔗糖−勾ら己フラクションのそれぞ
れ全小′A、胚芽抽出物(全容に10μj)甲で855
−メチオニンの存仕下に翻訳し〔ヒー・ロバーツおよび
ビーφエム・パターンン、[市販小麦胚芽からの細胞を
含lない系におりるTMV RNA おJ=(j%i
o ビン18 RNA(D効果的翻訳J 、 Pro
p、 Nat 1.Acad、Sci、 USA。
れ全小′A、胚芽抽出物(全容に10μj)甲で855
−メチオニンの存仕下に翻訳し〔ヒー・ロバーツおよび
ビーφエム・パターンン、[市販小麦胚芽からの細胞を
含lない系におりるTMV RNA おJ=(j%i
o ビン18 RNA(D効果的翻訳J 、 Pro
p、 Nat 1.Acad、Sci、 USA。
第70巻、第、2330〜j4tA(/り73)’J、
そして合成蛋白質を72.5%の81)S−ポリ−アク
リルアミドゲル上で分析した〔ニー・ケー争うエムリ、
「バクテリオファージT4tのヘラトラ組立てる際の構
造蛋白質の囲装」、ネイチャー誌、第、227巻、比べ
♂O〜t!頁(/り70)〕。
そして合成蛋白質を72.5%の81)S−ポリ−アク
リルアミドゲル上で分析した〔ニー・ケー争うエムリ、
「バクテリオファージT4tのヘラトラ組立てる際の構
造蛋白質の囲装」、ネイチャー誌、第、227巻、比べ
♂O〜t!頁(/り70)〕。
この糸における大型ホリペグチドの合成は、ここでII
I製されたRNAフラクションがRN Aを含有し、こ
のRNAはに験管内の翻訳のいがなる抑制因子をも會壱
しないことを示した。
I製されたRNAフラクションがRN Aを含有し、こ
のRNAはに験管内の翻訳のいがなる抑制因子をも會壱
しないことを示した。
さらにポリA+RNAフラクションを分析して、mRN
Aによシ暗号化された抗ウィルス活性を決定した。この
分析につき、jOnlのホリA” RNA (/117
9/IIUI) f/6〜.20個cvv=y7リカ腫
蛙(Xenopus 1aavis )の卵母#ii
I廁のそれぞれに注入し、そしてこれら卵母細胞を、2
0℃にて3日間培養した。次いで、培地を取出し、卵母
細胞を牌細胞培地について前記したと同様に分析するま
で一70℃にて保存し1分泌された翻訳生成物をその抗
ウィルス活性につき分析した〔ニー・コールマンおよび
ジエー・そルサー、[Nアフリカ産蛙の卵母細胞からの
蛋白質の輸出」、セル誌、第17巻%第j/7〜26負
(lり7り)〕。この分析の結果をグラフとして第2図
に示す。一般に、これらの分析は牌細胞培地の抗ウィル
ス活性よりも30−100倍低いIFN活性を示した。
Aによシ暗号化された抗ウィルス活性を決定した。この
分析につき、jOnlのホリA” RNA (/117
9/IIUI) f/6〜.20個cvv=y7リカ腫
蛙(Xenopus 1aavis )の卵母#ii
I廁のそれぞれに注入し、そしてこれら卵母細胞を、2
0℃にて3日間培養した。次いで、培地を取出し、卵母
細胞を牌細胞培地について前記したと同様に分析するま
で一70℃にて保存し1分泌された翻訳生成物をその抗
ウィルス活性につき分析した〔ニー・コールマンおよび
ジエー・そルサー、[Nアフリカ産蛙の卵母細胞からの
蛋白質の輸出」、セル誌、第17巻%第j/7〜26負
(lり7り)〕。この分析の結果をグラフとして第2図
に示す。一般に、これらの分析は牌細胞培地の抗ウィル
ス活性よりも30−100倍低いIFN活性を示した。
しばしば、これらの分析はIFN−特異性RNAの異質
性の糺明を断水した。例数なら、しはしはショルダー、
すガわちずつと迅速に、移動する活81.棟が存在した
からである。
性の糺明を断水した。例数なら、しはしはショルダー、
すガわちずつと迅速に、移動する活81.棟が存在した
からである。
IFN活性7ラクシヨンにつ八、さらに卵母細胞により
分泌6れたIFNの抗yA特性についても検査し、その
LこQ l k’ Hの抗ウィルス活性金ヒトIFN−
βに対し調装された過刺U LJ)f)’(。
分泌6れたIFNの抗yA特性についても検査し、その
LこQ l k’ Hの抗ウィルス活性金ヒトIFN−
βに対し調装された過刺U LJ)f)’(。
血清(イー・デ・クラーク博士の奇賑による(抗−IF
N−β血清(山羊))で、或いはヒトI FN−αに刻
し調製された抗血清(クー・カンチル博士によシ脣脂(
抗−IFN−α(羊))およびジエ・ウィルセフ皓士に
よる狛舶(抗−IFN−α血清(兎))、或いはそれら
の混合物で中和することを試みた(37℃にで1時間)
。
N−β血清(山羊))で、或いはヒトI FN−αに刻
し調製された抗血清(クー・カンチル博士によシ脣脂(
抗−IFN−α(羊))およびジエ・ウィルセフ皓士に
よる狛舶(抗−IFN−α血清(兎))、或いはそれら
の混合物で中和することを試みた(37℃にで1時間)
。
卵母細胞IF’N試料はこれらの抗血清では中和されな
かったことが観察された。しかしながら、これら試料の
IFN活性は、IFN−、γに対し調JRsれた抗血清
(エムΦビ一番ラングフォード博士およびジー・ジエー
拳スタントン博士による寄贈(兎)または誘発牌細胞か
ら侍られた部分和製IFN−γによシねすみ(Balb
/c)を免疫化することによシ調製した抗血清によって
中和さnた。
かったことが観察された。しかしながら、これら試料の
IFN活性は、IFN−、γに対し調JRsれた抗血清
(エムΦビ一番ラングフォード博士およびジー・ジエー
拳スタントン博士による寄贈(兎)または誘発牌細胞か
ら侍られた部分和製IFN−γによシねすみ(Balb
/c)を免疫化することによシ調製した抗血清によって
中和さnた。
IFN−r特異性mRNA以外らに精製するため、活性
蔗糖勾配フラクションからのRN Aを集め、これをS
O%ホルムアミドと100mMLi C1とt+nMの
El)TAと0.シ% 5iJ8と10mMのトリy、
−HCI (Pi″17.41 )とを含有する緩衝
液中に俗解させ、そして60℃にて7分間加熱した。次
いで、これ2j−,2oチ蔗糖勾配(0,/ In9R
NA/勾配)(上記緩衝液を官有)にてペックマン5W
jt型Tiロータを用い66.00Orpmにてi 、
r c −c j 時間遠心分11 シた。0..2
mlずつの20個のフラクションを集め、各7ラクシヨ
ンからこれを一λO℃にてl挽回容量の/MNaCI!
およびλ、!容童のgTaHと共に静置することによ、
9RNAを沈澱させた。
蔗糖勾配フラクションからのRN Aを集め、これをS
O%ホルムアミドと100mMLi C1とt+nMの
El)TAと0.シ% 5iJ8と10mMのトリy、
−HCI (Pi″17.41 )とを含有する緩衝
液中に俗解させ、そして60℃にて7分間加熱した。次
いで、これ2j−,2oチ蔗糖勾配(0,/ In9R
NA/勾配)(上記緩衝液を官有)にてペックマン5W
jt型Tiロータを用い66.00Orpmにてi 、
r c −c j 時間遠心分11 シた。0..2
mlずつの20個のフラクションを集め、各7ラクシヨ
ンからこれを一λO℃にてl挽回容量の/MNaCI!
およびλ、!容童のgTaHと共に静置することによ、
9RNAを沈澱させた。
卵母細胞におけると同様に、各フラクションにつきRN
Aを分析した。これらの分析において、IFN活性はλ
つのピークに分割ちれると思われた(ll−13Sおよ
び/j−/48)。
Aを分析した。これらの分析において、IFN活性はλ
つのピークに分割ちれると思われた(ll−13Sおよ
び/j−/48)。
観察されたこの沈師異負性が変性における異なる工程に
よるものかど9〃≧、或いrよポリA−木端の異なる投
込によるものかどうか、或いはその異負性が、2種の異
なるIF″N −+n RN A柚類を示ずかどうか次
足することができなかった。
よるものかど9〃≧、或いrよポリA−木端の異なる投
込によるものかどうか、或いはその異負性が、2種の異
なるIF″N −+n RN A柚類を示ずかどうか次
足することができなかった。
この点において、蔗糖勾自己から侍ら1しるポリ(A)
RNA生取物でさえ極めて多数の異なるm RN Aを
金山することを認識ずべきで必る。
RNA生取物でさえ極めて多数の異なるm RN Aを
金山することを認識ずべきで必る。
IFN−γに対し軸!j(的なmRNA以外は、他のm
RNAは望1しくない汚染物である(第7図)。
RNAは望1しくない汚染物である(第7図)。
残念ながら、これらの汚染RN Aは、不発1力のクロ
ーン化工柱の残余の部分においてHuIFN−γm R
N Aと同様に4動する。したがって。
ーン化工柱の残余の部分においてHuIFN−γm R
N Aと同様に4動する。したがって。
ボ!/ (A)RNAにおけるそれらの存在は、IFN
−r以外のポリペプチドを暗号化するような遺伝子を含
む望ましくない#I菌ツクローン多数を最終的にもたら
すであろう。この汚染は、H「望のIFN−γヒプリド
クローンの単離において複雑な選別問題全提起する。I
FN−γの場合、悠別間勉は、P)T望のクローンを同
定するだめの選別試料として作用するHulFN−r
mRNAもしく r:L LI N Aまたはその部分
の充分子*h葛れた試料が欠如するため、ちらに重大と
なる。したがって、IFN−γクローンに対する選別過
相は極りて時間のかかる1離のものとなる。さらに、&
めて少割合のIFN−rクローンのみが生物学的もしく
は免疫学的に宿性な形態でIFN−γ金我現すると予想
されるので、活性クローンの単離は「藁の中から釦を見
つける」ような選別過程となる。
−r以外のポリペプチドを暗号化するような遺伝子を含
む望ましくない#I菌ツクローン多数を最終的にもたら
すであろう。この汚染は、H「望のIFN−γヒプリド
クローンの単離において複雑な選別問題全提起する。I
FN−γの場合、悠別間勉は、P)T望のクローンを同
定するだめの選別試料として作用するHulFN−r
mRNAもしく r:L LI N Aまたはその部分
の充分子*h葛れた試料が欠如するため、ちらに重大と
なる。したがって、IFN−γクローンに対する選別過
相は極りて時間のかかる1離のものとなる。さらに、&
めて少割合のIFN−rクローンのみが生物学的もしく
は免疫学的に宿性な形態でIFN−γ金我現すると予想
されるので、活性クローンの単離は「藁の中から釦を見
つける」ような選別過程となる。
南オリなことに、本出願人は組換DNA技術を使用して
HulFN−r mRNAもしくはa D N Aま
たはその部分の梢製試料を提供することができる。次い
で、この和製されたmRNAもしくはo D N Aを
使用して極めて多数の細閑クローンを連速に選別するこ
とができ、それにょシIFN−γをi古性型で入坑する
クローンを年しする可能性が著しく重大する。
HulFN−r mRNAもしくはa D N Aま
たはその部分の梢製試料を提供することができる。次い
で、この和製されたmRNAもしくはo D N Aを
使用して極めて多数の細閑クローンを連速に選別するこ
とができ、それにょシIFN−γをi古性型で入坑する
クローンを年しする可能性が著しく重大する。
I F N −7” a L) N A f含廟する
二處g a D N A□今一1−−1−ト員−1−□
噌−1−1−1−ψ−軸1.1、―114.ol、、1
1ユ、い、、7.1□1゜の合成 IFN−r mRNA(04菖なポリ(A)RNAk
hr、mとして使用し、釉光市DN A (l c
L)NA J )tc vt!l製した〔主としてアー
ルーテボス等にょシ、[バクテリオファージMSλ r
t N Aのほぼ元金寸法のDNAコヒーを宅するンラ
スミドの作成および特性化J 、 J、biol、
Biol 、第/−28’ %、第!り!〜6/り負(
/り7り)、バクテリオファージMS2 RNA (D
DNAコピーを廟するンラスミドの作成〕。
二處g a D N A□今一1−−1−ト員−1−□
噌−1−1−1−ψ−軸1.1、―114.ol、、1
1ユ、い、、7.1□1゜の合成 IFN−r mRNA(04菖なポリ(A)RNAk
hr、mとして使用し、釉光市DN A (l c
L)NA J )tc vt!l製した〔主としてアー
ルーテボス等にょシ、[バクテリオファージMSλ r
t N Aのほぼ元金寸法のDNAコヒーを宅するンラ
スミドの作成および特性化J 、 J、biol、
Biol 、第/−28’ %、第!り!〜6/り負(
/り7り)、バクテリオファージMS2 RNA (D
DNAコピーを廟するンラスミドの作成〕。
Vθμgのボ!7A”RNA(第2図、保存勾配フラク
ション//、/、2./3)をiooμlの60mMト
リ、(−MCI!(pli &’、J )とJ OmM
のβ−メルカプトエタノールとjOmlvlのHCIと
10mMのMgCl2とそれぞfL O1J’ m M
c7) II 棟のdNTPと/ 01tEl (D
PT+2−+aと100μCiのα−P”dATPと
10011Ciのa −P32dCTP(それぞれ2!
00 Ci/mol )と44+nMのN a 4 P
2 ()7と/ 00 j$、位のAMV逆転与酵素
との混合物中において≠3℃で30分間培太した。
ション//、/、2./3)をiooμlの60mMト
リ、(−MCI!(pli &’、J )とJ OmM
のβ−メルカプトエタノールとjOmlvlのHCIと
10mMのMgCl2とそれぞfL O1J’ m M
c7) II 棟のdNTPと/ 01tEl (D
PT+2−+aと100μCiのα−P”dATPと
10011Ciのa −P32dCTP(それぞれ2!
00 Ci/mol )と44+nMのN a 4 P
2 ()7と/ 00 j$、位のAMV逆転与酵素
との混合物中において≠3℃で30分間培太した。
EDTAによ逆反応を停止させ、フェノールで抽出した
後、この混合物tセファデックスー075カラムに九項
した。−一θ℃にて/晩エタノールによ#)空隙フラク
ション中に核酸を沈澱込せ、そしてこ扛らを遠心分離に
ょシ除去した。ベレットを70%エタノールで抗がし、
乾採し、そして≠〇μlの1(20申に入れた。
後、この混合物tセファデックスー075カラムに九項
した。−一θ℃にて/晩エタノールによ#)空隙フラク
ション中に核酸を沈澱込せ、そしてこ扛らを遠心分離に
ょシ除去した。ベレットを70%エタノールで抗がし、
乾採し、そして≠〇μlの1(20申に入れた。
上記で脅威されたc i) N A果洛Qよ夾隙上、殴
厚なポリAmRNA中に存在した異なるm RN Aか
ら生じた複雑なa D N Aの混合物である(第7図
)。さらに、A+JV逆転写酵凧による早期の停止のた
め、cDNAの多くがポリARNAにおける各徨のmR
NAの不完全なコピーである(第1図に示さず)。
厚なポリAmRNA中に存在した異なるm RN Aか
ら生じた複雑なa D N Aの混合物である(第7図
)。さらに、A+JV逆転写酵凧による早期の停止のた
め、cDNAの多くがポリARNAにおける各徨のmR
NAの不完全なコピーである(第1図に示さず)。
aDNA’j−二m鋲にする前に、これを補完的m型m
RNAに対する結合から除去し、その際上H己の水性混
合物を700℃にて3Q抄tlj加熱し1次いで直ちに
0℃にて冷却した。3μgの膵HRNアーゼと3単位の
T、−KNアーゼとを加え、そしてこの混合物を37℃
にて30分間培養した。
RNAに対する結合から除去し、その際上H己の水性混
合物を700℃にて3Q抄tlj加熱し1次いで直ちに
0℃にて冷却した。3μgの膵HRNアーゼと3単位の
T、−KNアーゼとを加え、そしてこの混合物を37℃
にて30分間培養した。
この温合物【K−ホスフェ−)(pHA、り)(最P礫
# / 00 m M )とジチオスレイトール(44
mM)と”gc12 (/ Orr+fVi)とμ値の
dNTP (それぞ71.2 j O# M )とs
o μciのα−P dA’l’Pと!Qμl、”i
V)P32dCTP(七nそれ−600Ci/mol
)とのk ’ct?Aのijj加によpiooμlに
rA%し、1−・コリoNhポリメラーゼl(ビオラブ
社、ioo年位)を加え、そして得られた混合物’7/
j℃にて3時間項%することによシ、 * 1JN
A 朗に二重鎖にした。反応をk i) T A i/
cより1・?止させ、混合物をフェノール処理し、セン
アテックスーG7jカラムに通し、そして上記と同様に
空隙フラクション倉エタノールによ?)−2o゛cにて
l晩沈澱させた。
# / 00 m M )とジチオスレイトール(44
mM)と”gc12 (/ Orr+fVi)とμ値の
dNTP (それぞ71.2 j O# M )とs
o μciのα−P dA’l’Pと!Qμl、”i
V)P32dCTP(七nそれ−600Ci/mol
)とのk ’ct?Aのijj加によpiooμlに
rA%し、1−・コリoNhポリメラーゼl(ビオラブ
社、ioo年位)を加え、そして得られた混合物’7/
j℃にて3時間項%することによシ、 * 1JN
A 朗に二重鎖にした。反応をk i) T A i/
cより1・?止させ、混合物をフェノール処理し、セン
アテックスーG7jカラムに通し、そして上記と同様に
空隙フラクション倉エタノールによ?)−2o゛cにて
l晩沈澱させた。
二重鎖c D N A榴造に’A存する単−類ヘアピン
ルーズを開くため、遠心分離によりD N A (I:
取出し、ペレットを丸味し、これ盆再びH2O甲に入f
t、そして温合物を0.コMのNaCJとs。
ルーズを開くため、遠心分離によりD N A (I:
取出し、ペレットを丸味し、これ盆再びH2O甲に入f
t、そして温合物を0.コMのNaCJとs。
mMのNa0Ac (pi’弘、j )と1mNiのZ
n C12と10率位の81ヌクレアーセ(シグマ社)
トのiooμl中において37℃で30分間培養した。
n C12と10率位の81ヌクレアーセ(シグマ社)
トのiooμl中において37℃で30分間培養した。
この混合vlJj&ニア j−/ k / CHCI
s / イソアミルアルコールで抽出し、かつI)N
Alz;100μlの2MのN kl 4U Acと1
ottyのイー・コリtRNAと//X6のエタノール
とのmk 〃JによシーコO℃にて、2時間および一7
0℃にて70分間沈澱させることにより反応を停止させ
た。遠心分離によシベレットを取出し、そしてこれを乾
蝶した。二重鎖c l) N Aのこの混合物はポリA
RNA(第1図)全調製するため雛型として使用した前
記ポ17 A RN A (D共買注の結末ならびに
AMV転与酵糸によるa D N A転写の恐らく早期
の停止のため(第7図に示さず)異質性となる。
s / イソアミルアルコールで抽出し、かつI)N
Alz;100μlの2MのN kl 4U Acと1
ottyのイー・コリtRNAと//X6のエタノール
とのmk 〃JによシーコO℃にて、2時間および一7
0℃にて70分間沈澱させることにより反応を停止させ
た。遠心分離によシベレットを取出し、そしてこれを乾
蝶した。二重鎖c l) N Aのこの混合物はポリA
RNA(第1図)全調製するため雛型として使用した前
記ポ17 A RN A (D共買注の結末ならびに
AMV転与酵糸によるa D N A転写の恐らく早期
の停止のため(第7図に示さず)異質性となる。
この異質性の幼果を狗めるため、ペレットをJ o t
ttの10mMのトリス−flcl (p)17.6
)と/mMのEDTAとの中に浴解し、これ會sr“C
にてj分間培養し、プロそフェノールブルー−キシレン
シアノールFFと蔗糖とt刀11え。
ttの10mMのトリス−flcl (p)17.6
)と/mMのEDTAとの中に浴解し、これ會sr“C
にてj分間培養し、プロそフェノールブルー−キシレン
シアノールFFと蔗糖とt刀11え。
13NAI4t%ホリアクリルアミドゲル(トリス−ホ
レート%、20偏×参〇〇μ×0.3鴎、λ0OV−,
20+nA)において/晩屯気泳動にがr)ることによ
シ、二重鎖c L) N A孔付物で寸法決定した。こ
の場合、ファージφ×/7≠LINAのz t−p 2
p−標識ちれたfiaelll消化物tも標識として
平行的に電気泳動δせた。このゲルおオートラジオグラ
フィーにかけた後、I)NAをゲル上の位置に応じて各
フラクション、すなわちg4 (100〜/ 00
0 bp )、 g5 (1000〜ン、26
0bp)およびgz (/−2よθ〜/弘oo bp
)に分際した。各フラクションに対応するクルのスライ
スを切除し、これらを、2IILeの0.3 MのNf
(40A cと10mMのMgC/2とo、i%の5i
)Sとにょシ浴出させ、そしてIJ N ’A ′?f
:λ倍谷量のエタノールにて沈殿もせた(−−2o℃>
。遠心分離の後、各ベレットを10Oμtの)i2(J
中に入れ。
レート%、20偏×参〇〇μ×0.3鴎、λ0OV−,
20+nA)において/晩屯気泳動にがr)ることによ
シ、二重鎖c L) N A孔付物で寸法決定した。こ
の場合、ファージφ×/7≠LINAのz t−p 2
p−標識ちれたfiaelll消化物tも標識として
平行的に電気泳動δせた。このゲルおオートラジオグラ
フィーにかけた後、I)NAをゲル上の位置に応じて各
フラクション、すなわちg4 (100〜/ 00
0 bp )、 g5 (1000〜ン、26
0bp)およびgz (/−2よθ〜/弘oo bp
)に分際した。各フラクションに対応するクルのスライ
スを切除し、これらを、2IILeの0.3 MのNf
(40A cと10mMのMgC/2とo、i%の5i
)Sとにょシ浴出させ、そしてIJ N ’A ′?f
:λ倍谷量のエタノールにて沈殿もせた(−−2o℃>
。遠心分離の後、各ベレットを10Oμtの)i2(J
中に入れ。
これ2りQθμlの10mMのNa−ホスフェート(p
)+7,4L) (!:/ 001’l (9e’14
′6k)(7) kニー トロキシルアパタイト、(ビ
オラブ社)との存狂下に37℃にて10分間培養した。
)+7,4L) (!:/ 001’l (9e’14
′6k)(7) kニー トロキシルアパタイト、(ビ
オラブ社)との存狂下に37℃にて10分間培養した。
次いで、ヒドロキシルアバタイトヲセファテックスーG
7!カラムに光填し、カラムf 2 m MのNa−ホ
スフェ−)(pi−17,グ〕で激しく洗伊した後、D
NA會θ、t/LjMのNa−ホスフェート(pi−1
7,弘)にょジ浴出させ、でしてこれ?/>θ谷−一の
2MのNaQAa (PIij)とλ容★のエタノール
とで沈澱δせた。
7!カラムに光填し、カラムf 2 m MのNa−ホ
スフェ−)(pi−17,グ〕で激しく洗伊した後、D
NA會θ、t/LjMのNa−ホスフェート(pi−1
7,弘)にょジ浴出させ、でしてこれ?/>θ谷−一の
2MのNaQAa (PIij)とλ容★のエタノール
とで沈澱δせた。
ここでも、谷c D N Aフラクション内に多数のL
)NAが在任し、その内の極めて少数がIfi’N−γ
−関連c D N Aである(第1図)ことを認めねば
ならない。
)NAが在任し、その内の極めて少数がIfi’N−γ
−関連c D N Aである(第1図)ことを認めねば
ならない。
二爪鎮aDNAのクローン化
本発明により調製された二単鎖cDNA奮クローン化さ
せ、或いは表現する際に、多種類の宿主/クローン化ベ
ヒクル組合せ物を使用することができる。たとえば、市
川なりローン化もしくは表現ベヒクルは染色体、非染色
体および合成のり、NA配タリのセクメントよυなるこ
とかで@、たとえば5v4toの各抛の公知訴4捧およ
び公知の卸」菌性ンラスミト、/ことえは colEl
、pCRI 、pBRJ2J、pMB?およびその誘導
体を含むイー・コリからのプラスミド、巾広い宿王軛囲
のプラスミド、たとえばRP4L、ファージDNA、た
とえはンアーシλの多数の誘導体、たとえはNM″/ざ
り2よひその他の1)NAファージ、たとえばM/3お
よび繊維状単−頼1) N Aファージおよびプラスミ
ドとファージDNAとの組合せから得られるベクター、
たとえばファージDNAもしくはその他の衣現制御卸配
列を使用丁べく改変させたプラスミドまたは酵母プラス
ミドたとえばλμの7ラスミトもしくはその誘導体が挙
げられる。有用なりローン化もしくは表現宿主は細囚性
宿主、たとえばイー・コリHB10/、イー・コリX/
771.% イーΦコリX、2.2g2%イー・コリM
RCiおよびシュードモナス、枯草菌、藺熱細菌および
その他の細菌類、#母およびその他の真菌類の菌株。
せ、或いは表現する際に、多種類の宿主/クローン化ベ
ヒクル組合せ物を使用することができる。たとえば、市
川なりローン化もしくは表現ベヒクルは染色体、非染色
体および合成のり、NA配タリのセクメントよυなるこ
とかで@、たとえば5v4toの各抛の公知訴4捧およ
び公知の卸」菌性ンラスミト、/ことえは colEl
、pCRI 、pBRJ2J、pMB?およびその誘導
体を含むイー・コリからのプラスミド、巾広い宿王軛囲
のプラスミド、たとえばRP4L、ファージDNA、た
とえはンアーシλの多数の誘導体、たとえはNM″/ざ
り2よひその他の1)NAファージ、たとえばM/3お
よび繊維状単−頼1) N Aファージおよびプラスミ
ドとファージDNAとの組合せから得られるベクター、
たとえばファージDNAもしくはその他の衣現制御卸配
列を使用丁べく改変させたプラスミドまたは酵母プラス
ミドたとえばλμの7ラスミトもしくはその誘導体が挙
げられる。有用なりローン化もしくは表現宿主は細囚性
宿主、たとえばイー・コリHB10/、イー・コリX/
771.% イーΦコリX、2.2g2%イー・コリM
RCiおよびシュードモナス、枯草菌、藺熱細菌および
その他の細菌類、#母およびその他の真菌類の菌株。
動物性もしくは植物性宿主、たとえは動物(ヒトを含む
)もしくは殖物細側の培養物またはその他の宿主を包含
することができる。勿論、全ての91主/ベクター組合
せ物が同等に上動であるとは限らない。特定の宿生/ク
ローン化ベヒクル組合せ物の選択は、本発明の乾曲から
逸脱することなく、示された原理を考慮して当業者によ
シ行なうことができる。
)もしくは殖物細側の培養物またはその他の宿主を包含
することができる。勿論、全ての91主/ベクター組合
せ物が同等に上動であるとは限らない。特定の宿生/ク
ローン化ベヒクル組合せ物の選択は、本発明の乾曲から
逸脱することなく、示された原理を考慮して当業者によ
シ行なうことができる。
δらに、それぞれ付足のクローン化もしくは表現ベヒク
ル内において、二に鎖1)N’Aの挿入のため棟々の部
位を選択することができる。これらの部位は、一般にそ
れらケ切断する制限エンドヌクレアーセによって命名さ
れる。これらの部位は当業者によって充分に認にちれて
いる。
ル内において、二に鎖1)N’Aの挿入のため棟々の部
位を選択することができる。これらの部位は、一般にそ
れらケ切断する制限エンドヌクレアーセによって命名さ
れる。これらの部位は当業者によって充分に認にちれて
いる。
勿論1本発明において有用なりローン化もしくは表現ベ
ヒクルは1選択されたDNA断片の挿入を行なうための
制限エンドヌクレアーゼ部位を有する必敦がないことを
了解すべきである。
ヒクルは1選択されたDNA断片の挿入を行なうための
制限エンドヌクレアーゼ部位を有する必敦がないことを
了解すべきである。
むしろ、ベヒクルは他の手段によって断片に結合させる
ことができる。
ことができる。
ベクター、すなわちクローン化もしくは表現ベヒクル、
竹に選択ちれたDNA断片を句層δせて組換L)NA分
子を生成させるよう選択した部位は、種々の因子たとえ
?′f、府定の制限酵素にかける部位の数、表現ずべ@
蛋白質の寸法、 VH王細ノ抱r欅素による蛋白質分館
に約する庚望蛋白黄の感受性、梢袈の際除去するのが困
鎚な?d主#I胞蛋蛋白による衣机すべき蛋H負の汚染
もしくは結合1次現前性、たとえばベクター配列に対す
る開始コドンおよび停止コド/の位餉、ならびに当業者
により認隊されたその他の因子によって決定される。特
定の遺伝子に対するベクターおよび押入部位の選択はこ
れら因子のバランスによシ決定され、必らずしも全ての
選択がP9[定の場合に同等に不動であるとは限らない
。
竹に選択ちれたDNA断片を句層δせて組換L)NA分
子を生成させるよう選択した部位は、種々の因子たとえ
?′f、府定の制限酵素にかける部位の数、表現ずべ@
蛋白質の寸法、 VH王細ノ抱r欅素による蛋白質分館
に約する庚望蛋白黄の感受性、梢袈の際除去するのが困
鎚な?d主#I胞蛋蛋白による衣机すべき蛋H負の汚染
もしくは結合1次現前性、たとえばベクター配列に対す
る開始コドンおよび停止コド/の位餉、ならびに当業者
により認隊されたその他の因子によって決定される。特
定の遺伝子に対するベクターおよび押入部位の選択はこ
れら因子のバランスによシ決定され、必らずしも全ての
選択がP9[定の場合に同等に不動であるとは限らない
。
異種D N Aをクローン化ベヒクルもしくは表現ベク
ター中へ挿入して組換DNA分子を生成させるには幾つ
かの方法が当渠芥で知られているが、本発明による初M
のクローン化に好適な方法はpsVj、2り1)NA(
下=e)をBamHIによシ消化し、μ囲141部位に
充填し、そして末端転位酵素によりdC末端を3′木端
へ加えることからなっている。次いで、二i1 鎚a
D N Aを、先ずこれをdG末編で処理した後p8V
j、2り1)NAへ粕合さぜる。末端処理1)NAおj
O木端処理aL)NAy久いで融合させてDNhを7ラ
スミドの選択部位へ押入し、かつヒプリド1)NA2栴
壌化δせることかでき、aG−ae末端の補光的性質は
七の融合と動−千141部位の再−成と1i−加能にす
る(第7図)。ここで得られた組換DNA分子は、クロ
ーン化ベクター中の選択位置に挿入遺伝子を杢する(第
7区1)。
ター中へ挿入して組換DNA分子を生成させるには幾つ
かの方法が当渠芥で知られているが、本発明による初M
のクローン化に好適な方法はpsVj、2り1)NA(
下=e)をBamHIによシ消化し、μ囲141部位に
充填し、そして末端転位酵素によりdC末端を3′木端
へ加えることからなっている。次いで、二i1 鎚a
D N Aを、先ずこれをdG末編で処理した後p8V
j、2り1)NAへ粕合さぜる。末端処理1)NAおj
O木端処理aL)NAy久いで融合させてDNhを7ラ
スミドの選択部位へ押入し、かつヒプリド1)NA2栴
壌化δせることかでき、aG−ae末端の補光的性質は
七の融合と動−千141部位の再−成と1i−加能にす
る(第7図)。ここで得られた組換DNA分子は、クロ
ーン化ベクター中の選択位置に挿入遺伝子を杢する(第
7区1)。
勿論、DNA配クリをクローン化もしくは戎机ベヒクル
中へ挿入して組換DNA分子を生成させるための、他の
公知の方法も本発明においてN%に有用である。これら
には、たとえばdA−dT、末端処理、偵接的結合、合
成リンカ、エキソヌクレアーゼおよびホリメラーゼー栢
合修復反応にわヒく結合、また4−11) NAポリメ
ラーゼおよび適当な単−馳雛脆によるDNA@の処理に
続く結合などが包含される。
中へ挿入して組換DNA分子を生成させるための、他の
公知の方法も本発明においてN%に有用である。これら
には、たとえばdA−dT、末端処理、偵接的結合、合
成リンカ、エキソヌクレアーゼおよびホリメラーゼー栢
合修復反応にわヒく結合、また4−11) NAポリメ
ラーゼおよび適当な単−馳雛脆によるDNA@の処理に
続く結合などが包含される。
勿論、クローン化ベヒクルの選択部位に挿入沁れるヌク
レオチド自じ夕1」址7ヒはcL)NA〜1片は、f9
T望のポリペプチドに刈する′;A際の粥造遺伝子の部
分でないヌクレオチドを色名することもでき、或いは/
31r望蛋白寅に刈する元金44造遺伝子の〜1片のみ
を包含することもできる。と了′r?1すべきである。
レオチド自じ夕1」址7ヒはcL)NA〜1片は、f9
T望のポリペプチドに刈する′;A際の粥造遺伝子の部
分でないヌクレオチドを色名することもでき、或いは/
31r望蛋白寅に刈する元金44造遺伝子の〜1片のみ
を包含することもできる。と了′r?1すべきである。
例しかのL)NA配タリが最終的に仰入され、形質転換
された宿主がjlulFN−γの生物学的もしくは免疫
手的活性勿肩するホリベプヶドを生産し、或いは11
N A配列そのものをkL u I F N−γの免疫
学的もしくは生物学的粘性を有するポリペプチドの生産
に4用なりNA配列金含有するクローンヲ選択するため
のヒプリド化試料として使用しうろことのみが必要とさ
れる。
された宿主がjlulFN−γの生物学的もしくは免疫
手的活性勿肩するホリベプヶドを生産し、或いは11
N A配列そのものをkL u I F N−γの免疫
学的もしくは生物学的粘性を有するポリペプチドの生産
に4用なりNA配列金含有するクローンヲ選択するため
のヒプリド化試料として使用しうろことのみが必要とさ
れる。
異質遺伝子を含鳴するクローン化ベヒクルもさせ、それ
によりこのに’7主がヒブリド遺伝子の暗号化するHu
lFN−rの免疫学的もしくは生り学的活性を示すポリ
ペプチドを?mしうるようにする。適当な宿主のふ択も
、当莱昇で認識された多くの因子によって4′に理チ扛
る。こ往らには、たとえは選択ベクターに対する適合性
、ヒブリドプラスミドによって暗号化される蛋白質の物
性、B1望蛋白負の回収の谷易さ、表現特性、生物安全
性およびコスト等が包含される。
によりこのに’7主がヒブリド遺伝子の暗号化するHu
lFN−rの免疫学的もしくは生り学的活性を示すポリ
ペプチドを?mしうるようにする。適当な宿主のふ択も
、当莱昇で認識された多くの因子によって4′に理チ扛
る。こ往らには、たとえは選択ベクターに対する適合性
、ヒブリドプラスミドによって暗号化される蛋白質の物
性、B1望蛋白負の回収の谷易さ、表現特性、生物安全
性およびコスト等が包含される。
これら因子のバランスを行なわねばならないが、必らず
しも全ての宿主が付定組換1)NA分子のり四−ン化も
り、<は表現のいずれかに対しIm”] eに有効であ
るとは限らないことを了解すべきである。
しも全ての宿主が付定組換1)NA分子のり四−ン化も
り、<は表現のいずれかに対しIm”] eに有効であ
るとは限らないことを了解すべきである。
本発明の合成において、好適な初期クローン化ベヒクル
はpsVj、2りであり、かつ好適な初期制限エンドヌ
クレアーセ部位はBamHIである。好適な初期宿主は
イー・コリDl(I(、りである。
はpsVj、2りであり、かつ好適な初期制限エンドヌ
クレアーセ部位はBamHIである。好適な初期宿主は
イー・コリDl(I(、りである。
psv、tλりはキメラ5vt−oプラスミド表現ベク
ターであって、これからは多くのシーH&域が除去され
ている。構造はんんどのVPI遺伝子(O,ハリ〜0.
/グjmap卑位)忙欠如しているが、複製、転写の開
始および終了、ならびに/48およびlり8 mRNA
の切lI/IBよひホリアデニル化に関与する全ての領
域忙保持する。
ターであって、これからは多くのシーH&域が除去され
ている。構造はんんどのVPI遺伝子(O,ハリ〜0.
/グjmap卑位)忙欠如しているが、複製、転写の開
始および終了、ならびに/48およびlり8 mRNA
の切lI/IBよひホリアデニル化に関与する全ての領
域忙保持する。
p8Vよλ2はシー)SV4LO仏写電1」御の下で遺
伝子?i−表机するよ′)tc、設訂されている。
伝子?i−表机するよ′)tc、設訂されている。
pSVj2りの楢成f:第3凶に示す。キメラグラスミ
ドpsVj(シー・ジエー・ライ博士の寄贈による)は
Batnii1部位VC押人されたSV4/LODNA
悄@+ & 肩するpBRj、2.2 よcZっている
。psVjにおけるSV 1)NAは位置0.2≠!(
今回BamMI部位に亥換させた!!jすm部位)から
反時酊方向へ独特の5VIIOBa四HI部位(位置o
、1yz)まで処理する。
ドpsVj(シー・ジエー・ライ博士の寄贈による)は
Batnii1部位VC押人されたSV4/LODNA
悄@+ & 肩するpBRj、2.2 よcZっている
。psVjにおけるSV 1)NAは位置0.2≠!(
今回BamMI部位に亥換させた!!jすm部位)から
反時酊方向へ独特の5VIIOBa四HI部位(位置o
、1yz)まで処理する。
スーパーコイルのプラスミドpsvt DNAを臭化エ
チジウムの存在下に尺す、Uによって部分消化し、そし
て・フェノール化および沈鹸の後、δらにこれ全1片り
−1によって消化妊せ、次いでゲル上でpsVjの弘J
JObPj3にさのドナーDNAIr片を和装した。次
いで、jμyのpBRjコ、2 L)NAf真1田およ
びどs−4lによって先金に消化ざぜ、グル上で/j4
L2bp長さのp BRJ 2.2− Pst l −
Pvu l アクセフ“l断片を和装した(第3凶)
。これらλつの鞘製断片(ドナーおよびアクセプタ)を
等モル比にて混会し、これらをT弘すカーゼによって7
4℃で結合さ一+!:/ζ。この結合混合物の//jt
使用してイー・コリに/2菌体HB10/’<形質転換
させ、それにより推足100個以上のpBR3λλ−S
V+θ組換体を得た。これらクローンの1棟、すなわち
psV、t、2は制限分析の際、予想の&すIl断片を
もたらした。さらに、これをHindlおよび傷−1川
での消化により特性化を行ない、これは独特の旦さm
H1部位を鳴した(第3図)。
チジウムの存在下に尺す、Uによって部分消化し、そし
て・フェノール化および沈鹸の後、δらにこれ全1片り
−1によって消化妊せ、次いでゲル上でpsVjの弘J
JObPj3にさのドナーDNAIr片を和装した。次
いで、jμyのpBRjコ、2 L)NAf真1田およ
びどs−4lによって先金に消化ざぜ、グル上で/j4
L2bp長さのp BRJ 2.2− Pst l −
Pvu l アクセフ“l断片を和装した(第3凶)
。これらλつの鞘製断片(ドナーおよびアクセプタ)を
等モル比にて混会し、これらをT弘すカーゼによって7
4℃で結合さ一+!:/ζ。この結合混合物の//jt
使用してイー・コリに/2菌体HB10/’<形質転換
させ、それにより推足100個以上のpBR3λλ−S
V+θ組換体を得た。これらクローンの1棟、すなわち
psV、t、2は制限分析の際、予想の&すIl断片を
もたらした。さらに、これをHindlおよび傷−1川
での消化により特性化を行ない、これは独特の旦さm
H1部位を鳴した(第3図)。
次いで、psV7.2をC1m lおよヒバ竺HIによ
って消化し、そして生じたjj20bp長さの断片を低
融点の7ガロースから回収した。さらに、8V4401
)NA f Bamkll オヨびHapQによって消
化し、そして3026個の塩基対を宅スルBatn H
1−キソ■防片倉回収し、この切片は5vaoケノムの
初ルJWt域を分船する(マツプ年iiO,/ II
j 〜0.726 )。 C,ia、 l (Ai
”CGA’f’ )および)iap 11 (CCGG
)のエンドヌクレアーセ識別部位は相違している′X)
へ これらエンドヌクレアーゼによシ生する融合木M(
CG)tよ1TiJ −である。したがって、jj20
bP*GのC,1−a l一部、!l!!HIは、グル
和装された30り4bp長さの小PU−μY障1片に結
合することができた(第3図)。
って消化し、そして生じたjj20bp長さの断片を低
融点の7ガロースから回収した。さらに、8V4401
)NA f Bamkll オヨびHapQによって消
化し、そして3026個の塩基対を宅スルBatn H
1−キソ■防片倉回収し、この切片は5vaoケノムの
初ルJWt域を分船する(マツプ年iiO,/ II
j 〜0.726 )。 C,ia、 l (Ai
”CGA’f’ )および)iap 11 (CCGG
)のエンドヌクレアーセ識別部位は相違している′X)
へ これらエンドヌクレアーゼによシ生する融合木M(
CG)tよ1TiJ −である。したがって、jj20
bP*GのC,1−a l一部、!l!!HIは、グル
和装された30り4bp長さの小PU−μY障1片に結
合することができた(第3図)。
イー中コリに/λ(菌株HB10/)をJし質転換させ
た後、!θ0 (1!+以上のカルベニシリン耐性クロ
ーンを得た。アガロースゲル上で分析したざ柚の組換ク
ローンの内6aIはP、v−u lで消化した際、P9
r望の〜す片ずなわち、234L/ bp、221s3
bpおよび、20OAbp陣r片のλモル等量を生成す
ることが判明した。これは、大型′r−抗原遺伝子およ
び初期のSV≠00配列のj′−近位の手分**、間す
る20IObpの5Va01U+片(PvuQ (0,
33) 〜、1Q−p l (0,7,Zj )まで)
の予想の反復と一致する。
た後、!θ0 (1!+以上のカルベニシリン耐性クロ
ーンを得た。アガロースゲル上で分析したざ柚の組換ク
ローンの内6aIはP、v−u lで消化した際、P9
r望の〜す片ずなわち、234L/ bp、221s3
bpおよび、20OAbp陣r片のλモル等量を生成す
ることが判明した。これは、大型′r−抗原遺伝子およ
び初期のSV≠00配列のj′−近位の手分**、間す
る20IObpの5Va01U+片(PvuQ (0,
33) 〜、1Q−p l (0,7,Zj )まで)
の予想の反復と一致する。
これら組換ン゛ラスミドの/柚會辿択し、これをpsV
J−22と部名した(第3凶および第弘凶)。
J−22と部名した(第3凶および第弘凶)。
PSvハdの主たる時機は次の通りである:(a) S
VりOゲノムの児全な初期領域が存在し、これはスモ
ール−屯仇原と2−ジーT抗原とを亀号化し、さらに猿
の細胞における複製に必教な領域か存在し、また項のレ
ート領域に位置する「エンハンサ」配列も存在し;(b
)主たる構造蛋白質VPIに対する遺伝子が削除葛れて
お夛(0,り4’j〜0.7≠!マツプ単位のHind
tll−4狸111〜[片;(C)独特の部用H1部位
がキメラプラスミド上に存在して、ここに異種配列を挿
入してSv≠Oレートシーモータの制御下に表視を行な
うことができ、このBamHI部位はVPI遺伝子の翻
始コドン(これは境在除去されている)の前に72個の
ヌクレオチドと748m RN人アクセプタ切除部位の
後の32個のヌクレオチドとが存在し;(d)主たる/
zSレートメツセージに対するドナーおよびアクセクタ
切除部位が存在し; 16) S V≠Qレーシー域か
らのホリアデニル化郡位が存在しくSv≠Oマツプ単位
0017);かつ1f)SV4tQi)NAのコQざO
bp期片(マツ7位m、 0.3 j〜0.723)の
複埃rt猿の細胞における同質組供ki’J龍にすると
共(c、SV弘Qレフリコンを祐生させ、このレフリコ
ンからはプラスミド1じ列か除去き7しているがウィル
ス構造這伝子vPlの代ジに伸入屯伝子金含有している
。
VりOゲノムの児全な初期領域が存在し、これはスモ
ール−屯仇原と2−ジーT抗原とを亀号化し、さらに猿
の細胞における複製に必教な領域か存在し、また項のレ
ート領域に位置する「エンハンサ」配列も存在し;(b
)主たる構造蛋白質VPIに対する遺伝子が削除葛れて
お夛(0,り4’j〜0.7≠!マツプ単位のHind
tll−4狸111〜[片;(C)独特の部用H1部位
がキメラプラスミド上に存在して、ここに異種配列を挿
入してSv≠Oレートシーモータの制御下に表視を行な
うことができ、このBamHI部位はVPI遺伝子の翻
始コドン(これは境在除去されている)の前に72個の
ヌクレオチドと748m RN人アクセプタ切除部位の
後の32個のヌクレオチドとが存在し;(d)主たる/
zSレートメツセージに対するドナーおよびアクセクタ
切除部位が存在し; 16) S V≠Qレーシー域か
らのホリアデニル化郡位が存在しくSv≠Oマツプ単位
0017);かつ1f)SV4tQi)NAのコQざO
bp期片(マツ7位m、 0.3 j〜0.723)の
複埃rt猿の細胞における同質組供ki’J龍にすると
共(c、SV弘Qレフリコンを祐生させ、このレフリコ
ンからはプラスミド1じ列か除去き7しているがウィル
ス構造這伝子vPlの代ジに伸入屯伝子金含有している
。
j (7B 11 (lJ p SV j −25’
D 1’J A f 4’ O本位]辞、、!旦H1制
限酵素により、6oμEの♂rniViのMgC72と
弘Om &i (1) Na Clと100mMのトリ
ス−11c/ (Pti 7.弘)とにおいて37℃で
2時間消化した。EDTAによシ反応を竹・止葛せ、そ
して混合物をフェノール処理しく3回)、エーテル抽出
しく、2回)、そして、//10 ’!4kc/)、2
ytのKOA a (P143 )と、2谷址のエタ
ノールとで沈澱させた。
D 1’J A f 4’ O本位]辞、、!旦H1制
限酵素により、6oμEの♂rniViのMgC72と
弘Om &i (1) Na Clと100mMのトリ
ス−11c/ (Pti 7.弘)とにおいて37℃で
2時間消化した。EDTAによシ反応を竹・止葛せ、そ
して混合物をフェノール処理しく3回)、エーテル抽出
しく、2回)、そして、//10 ’!4kc/)、2
ytのKOA a (P143 )と、2谷址のエタ
ノールとで沈澱させた。
次いで、沈澱されかつ腺秋化した(すaml(1)ps
VjJタ υNA全分除し、これを7θ装エクノールで
コ回fk、即し、礼法し、h20中に入れ。
VjJタ υNA全分除し、これを7θ装エクノールで
コ回fk、即し、礼法し、h20中に入れ。
そしてjOmMのトリス−)1UI!(p)iff、j
)とjOmklのKczと10mMのMgCJ2と3
0mMのβ−メルカプトエタノールとそれぞれ、2 j
O/JM (D 4’ 個(D d N T P ト
j OJ$位(jり AhlV逆転与酵系との混合物5
0μlにおいてJ7’Cにて30分間培養した。反応を
EDTAによシ停止させ、混合物をフェノール/CHC
j、/イソアミルアルコールで抽出した。iTh液と混
合物とをセファテックス−G7!カラム(jQ礪xO6
j Oa ) ヘ/ Omhlのトリス−MCI (p
)i ’/、j )と1mMの1!;l) TAとにお
いて充填し、そして、2MのKOA a (pHt )
とエタノールとにょシを1!J7ラクシヨンf−,20
’Cにて7時間沈澱させた。
)とjOmklのKczと10mMのMgCJ2と3
0mMのβ−メルカプトエタノールとそれぞれ、2 j
O/JM (D 4’ 個(D d N T P ト
j OJ$位(jり AhlV逆転与酵系との混合物5
0μlにおいてJ7’Cにて30分間培養した。反応を
EDTAによシ停止させ、混合物をフェノール/CHC
j、/イソアミルアルコールで抽出した。iTh液と混
合物とをセファテックス−G7!カラム(jQ礪xO6
j Oa ) ヘ/ Omhlのトリス−MCI (p
)i ’/、j )と1mMの1!;l) TAとにお
いて充填し、そして、2MのKOA a (pHt )
とエタノールとにょシを1!J7ラクシヨンf−,20
’Cにて7時間沈澱させた。
1)NAを遠心分゛離により分離し、乾燥し、30at
の10mMのトリス−)iCl (p)17.3 )と
1mMのEl)TAとの中に入れ、これをi”cにて3
0秒間カロ熱し、次いで氷上で急冷した。次いで、DN
Aを0./ l/−Mのに一カコジル敵と30mMのト
リスMf# * (pl−16,I )と7mMのC0
8U4と/ II亀Mのジチオスレイトールと0.1m
MのdcTPと/ 00 pciのa −P”d CT
P(2j00 Ci /mol )と/ 00 *位’
D 木WWaデオキシヌクレオチジル転位酵′、A(P
−1,ビオケミカルス社)との混合物、200μtに
おいて37℃で培養した。5分間および70分間の後、
100μlずりを抜取り、 )yLsし・をE 111
” A /こよシ停止させた。
の10mMのトリス−)iCl (p)17.3 )と
1mMのEl)TAとの中に入れ、これをi”cにて3
0秒間カロ熱し、次いで氷上で急冷した。次いで、DN
Aを0./ l/−Mのに一カコジル敵と30mMのト
リスMf# * (pl−16,I )と7mMのC0
8U4と/ II亀Mのジチオスレイトールと0.1m
MのdcTPと/ 00 pciのa −P”d CT
P(2j00 Ci /mol )と/ 00 *位’
D 木WWaデオキシヌクレオチジル転位酵′、A(P
−1,ビオケミカルス社)との混合物、200μtに
おいて37℃で培養した。5分間および70分間の後、
100μlずりを抜取り、 )yLsし・をE 111
” A /こよシ停止させた。
これら部位をフェノール/CHCl、/イソアミルアル
コールで抽出し、DNA1上記と11j」様にセファデ
ックス−G7!カラムによるクロマトクラフイによって
和製した。空隙フラクションにおけるD NA7!i−
エタノールにより沈澱させ、違心分離し、乾燥させ、そ
して3Qμlのi。
コールで抽出し、DNA1上記と11j」様にセファデ
ックス−G7!カラムによるクロマトクラフイによって
和製した。空隙フラクションにおけるD NA7!i−
エタノールにより沈澱させ、違心分離し、乾燥させ、そ
して3Qμlのi。
mMのトリス−HCl: (pl−17,j )と7m
MのEDTAとに入れた。平均−!コおよび3z個のd
cMP残渣が5分間およびio分間の培簀の後それぞれ
線状化されたpsVj、2りL)NAの3′末端に句加
された。さらに、尤す〕消化されかつdc−末端処理さ
nfcpsV−t−2りIJNAの7カロースゲル電気
vK勘によって示、されるように、殆んど内部切面は生
じなかった。
MのEDTAとに入れた。平均−!コおよび3z個のd
cMP残渣が5分間およびio分間の培簀の後それぞれ
線状化されたpsVj、2りL)NAの3′末端に句加
された。さらに、尤す〕消化されかつdc−末端処理さ
nfcpsV−t−2りIJNAの7カロースゲル電気
vK勘によって示、されるように、殆んど内部切面は生
じなかった。
上記の二に勉cl)NA(フラクションg2* gbお
よびg<)fr遠心分離し、乾VζさせコQμlのIO
+n1Wiトリス−MCI (P)17.6 )と/m
h/10El)TAとに入れ、そしでO0/弘MのI(
−力コジル酸とJOmMのトリス綾衝故(pH4,ざ)
と1mMのCo3O4と/+nMのジチオスレイトール
と0.2mMの11’ −dcTP (j、7 Ci
1mM。
よびg<)fr遠心分離し、乾VζさせコQμlのIO
+n1Wiトリス−MCI (P)17.6 )と/m
h/10El)TAとに入れ、そしでO0/弘MのI(
−力コジル酸とJOmMのトリス綾衝故(pH4,ざ)
と1mMのCo3O4と/+nMのジチオスレイトール
と0.2mMの11’ −dcTP (j、7 Ci
1mM。
/、t 弘II/mCi )と、204位の末端テスオ
キシヌクレオチジル転位酵素とをも有する混合物30r
ILt中において37℃で10分間培養した。
キシヌクレオチジル転位酵素とをも有する混合物30r
ILt中において37℃で10分間培養した。
反応をEDTAにより停止場せた。
次いで1反応混合物をフェノール7cHcz。
/イソアミルアルコールで抽出し、これをセファテック
ス−a7sカラムに通した。空謙フラクションにおける
D N A f KOA cおよびエタノールによシ/
晩沈厳させ、そしてJINA’#北心分11fmllこ
より除去した。目」収もtしたDNA紮早・4燥し、こ
れflomMのトリス−HCJ (pi17.j)と/
mMのEDTAとθ、/MのhaCtとの混合物30
μtに入れた。平JtOJj Od GAiPの残漬が
d s L)NA (各フラクションg2、g、お↓ひ
g4)の3′末9R+fに付加ち扛た( 6o ng、
−ttLぞれ約0.i p+nol )。
ス−a7sカラムに通した。空謙フラクションにおける
D N A f KOA cおよびエタノールによシ/
晩沈厳させ、そしてJINA’#北心分11fmllこ
より除去した。目」収もtしたDNA紮早・4燥し、こ
れflomMのトリス−HCJ (pi17.j)と/
mMのEDTAとθ、/MのhaCtとの混合物30
μtに入れた。平JtOJj Od GAiPの残漬が
d s L)NA (各フラクションg2、g、お↓ひ
g4)の3′末9R+fに付加ち扛た( 6o ng、
−ttLぞれ約0.i p+nol )。
各フラクションgzh gsおよびg4からのdG−末
端処理されたd s J)NA / 、tμl(0,
03pmol ) t−BamHIによりbi状化され
かツdC−末端処理されたλμl (0,/ j pm
oL )のpsVj、25’と混合した。70分後、/
rjttlの10mMのトリス−1−1c/ (pli
7.j )と1mMのEl)TAと0./ MのNn
C1とを加え、この混合物を6♂”Cにて5分1h1、
弘3℃にて2時間それ(J牡培養し、そしてこれを徐々
に呈温(−25搬まで参時間かけて冷却した。
端処理されたd s J)NA / 、tμl(0,
03pmol ) t−BamHIによりbi状化され
かツdC−末端処理されたλμl (0,/ j pm
oL )のpsVj、25’と混合した。70分後、/
rjttlの10mMのトリス−1−1c/ (pli
7.j )と1mMのEl)TAと0./ MのNn
C1とを加え、この混合物を6♂”Cにて5分1h1、
弘3℃にて2時間それ(J牡培養し、そしてこれを徐々
に呈温(−25搬まで参時間かけて冷却した。
勿論、アニーリングの後に得られるヒブリドDNAは、
挿入LINA配列金伴わない兵なる組換1) N A分
子と焼柚かのクローン化ベヒクルとの大混合物で必る。
挿入LINA配列金伴わない兵なる組換1) N A分
子と焼柚かのクローン化ベヒクルとの大混合物で必る。
しかしながら、谷AM1挨1)NA分子は艷思)11部
位にc L) N A断片r金山する。
位にc L) N A断片r金山する。
この槓の各c D RA IPlr片は、遺伝子または
そり断片からなることもできる。悦めて少数のc D
N A ldi片のみが、 I(u IFi(−γ%し
くしよその一部を暗号化する(第7図)。大多数のもの
は、本発明の方法で使用さgたホ17 (A) RNA
の一部であるm )! N A 7L有する他の蛋白質
もしくはその部分の1つに貼号化する(第1図ジ。べら
に、上dCで調製さnた保存クローンのいずれもIFN
−γの免疫学的もしくは生物学的活性を示すポリペプチ
ドの表現を行ないえないことを理解すべきでめる。むし
ろ、これらはこの極のクローン′f:迫別する際に刹用
な7ピけてるる。
そり断片からなることもできる。悦めて少数のc D
N A ldi片のみが、 I(u IFi(−γ%し
くしよその一部を暗号化する(第7図)。大多数のもの
は、本発明の方法で使用さgたホ17 (A) RNA
の一部であるm )! N A 7L有する他の蛋白質
もしくはその部分の1つに貼号化する(第1図ジ。べら
に、上dCで調製さnた保存クローンのいずれもIFN
−γの免疫学的もしくは生物学的活性を示すポリペプチ
ドの表現を行ないえないことを理解すべきでめる。むし
ろ、これらはこの極のクローン′f:迫別する際に刹用
な7ピけてるる。
必要に応じ遇尚l閉じ込め施設を用いてトラ/スフエク
ションエ札および全ての七の仮の工程全竹ない、生じ7
ヒ形%L Q’i:俣俸電ここで処理し1こ。
ションエ札および全ての七の仮の工程全竹ない、生じ7
ヒ形%L Q’i:俣俸電ここで処理し1こ。
アニールさイシ1ζL) N A (そ2Lぞれンフク
7ヨンg2ig6およびga)のu付物33μl電それ
ぞれ10ottlの競合イー・コリυf11(λ)KI
Il胞へ刀日えた。OCで3Q分1ti」if匝した埃
、泊月JIB t ≠/−Cにてj分nJ xi 簑し
、/ Jn&のLB−培地全冷力1jシ、そし′て6L
合′i勿乞−さらに37℃にて弘!分間培児した。次い
で、廿混合物の乙(〜3!Oμり7<100μSI/μ
lのカルベニシリンを含有する寒天板上に接柱し、でし
でこれら板体を3’7’Cにて/晩培養した。
7ヨンg2ig6およびga)のu付物33μl電それ
ぞれ10ottlの競合イー・コリυf11(λ)KI
Il胞へ刀日えた。OCで3Q分1ti」if匝した埃
、泊月JIB t ≠/−Cにてj分nJ xi 簑し
、/ Jn&のLB−培地全冷力1jシ、そし′て6L
合′i勿乞−さらに37℃にて弘!分間培児した。次い
で、廿混合物の乙(〜3!Oμり7<100μSI/μ
lのカルベニシリンを含有する寒天板上に接柱し、でし
でこれら板体を3’7’Cにて/晩培養した。
プラスミドp S V j−タはペニシリン釦付用の遺
伝子をもむので、この迫伝子金元芋な状悪で弔するプラ
スミドにより形り4転換されたイー・コリ栢主は、形質
転換さ扛でいないような細菌を除いてすし生vIJ個ケ
葛む培養物においてj1’4殖するであろう。し1こか
つて、カルベニンリン包′−h培寮物における謂殖rJ
、b fl且侯1) N A分子または揚壌化ベクター
でJし質私換さnた宿主のあ択忙町龍にする。
伝子をもむので、この迫伝子金元芋な状悪で弔するプラ
スミドにより形り4転換されたイー・コリ栢主は、形質
転換さ扛でいないような細菌を除いてすし生vIJ個ケ
葛む培養物においてj1’4殖するであろう。し1こか
つて、カルベニンリン包′−h培寮物における謂殖rJ
、b fl且侯1) N A分子または揚壌化ベクター
でJし質私換さnた宿主のあ択忙町龍にする。
1−々の果落を釣上け、そしてこれらtミクロ測定板に
おける200μf (1) L B−培地(カルベニシ
リンを含胸する)にて/晩増殖させた。ジメチルスルホ
キシド?!−70%の最I(コ碌度マで刃口えた後、プ
レートt−λO℃で貯蔵し1ヒ。
おける200μf (1) L B−培地(カルベニシ
リンを含胸する)にて/晩増殖させた。ジメチルスルホ
キシド?!−70%の最I(コ碌度マで刃口えた後、プ
レートt−λO℃で貯蔵し1ヒ。
谷フラクション(g41. g’およびg2)のカルベ
ニシリン4性のクローンは各種の組換1)NA分子を含
有し、鹸発牌細胞から得られたポリARNAにおけるm
RN Aの混合物の寸法次定された完全もしくは部分
コピーを示す(第71)。
ニシリン4性のクローンは各種の組換1)NA分子を含
有し、鹸発牌細胞から得られたポリARNAにおけるm
RN Aの混合物の寸法次定された完全もしくは部分
コピーを示す(第71)。
これらクローンの大多数は単一の組換DNA分子を含有
する。しかしながら、これら組換1)NA分子の極く少
数のみがHuIFN−γに関係する。したがって、クロ
ーンはHuIFN−r完全クローンを他のものから辿択
するように選別せねはならない。
する。しかしながら、これら組換1)NA分子の極く少
数のみがHuIFN−γに関係する。したがって、クロ
ーンはHuIFN−r完全クローンを他のものから辿択
するように選別せねはならない。
の選別
HulFN−T alJNA 7.(君、ilする
Aa mクローンを選別するには幾つかの方法がある。
Aa mクローンを選別するには幾つかの方法がある。
これらには、たとえばRNA、4択ヒブリド化(アルウ
ィン寺、下ML ) *分画ヒプリド化(ティー・ヒー
拳セント・ジョンおよび)′−ル・タプリュ・テビス、
「分画ンランクフィルタヒンリド化によるザツカロミセ
スセレヒシイからのカシクトースb発性L)NA配列の
単離」、セル藺、第76巻、第ダ弘3〜弘よλ負(lり
7り))1台底試料によるヒプリド化(ビー・ノイエス
等、[オリゴデオキシヌクレオチド試料を用いることに
よるガストリンmRNAの検出および部分1番(部分k
J bProc、Natl、Acad、Sci、USA
、 第76巻、第7770〜7ダ頁(lり7り))、ま
たは免疫学的分析(エル−ヴイラーカマロ7等、「プロ
インシュリンを合成する細菌クローンJ 、 Pro
o、NatlAaad、So i、U S A 、 第
7 、を巻、第37.27〜3/負(lり7g)入また
は生物学重分ルf(ニー0シー・ワイ・チャンク等、[
ねずみのジヒドロホレイトレダクターゼを暗号化するD
NA配タリのイーもコリにおける表視」、ネイチャー誌
、第273%、第6/7〜2’iL負(/yyr))
によるD1望蛋白質を生皮するクローンの送別が包色
°ちれる。不発明石等は、Mも便利かつ有望な王女クロ
ーンの泗別方法としてRNA選択ヒブリド化を迭択した
。
ィン寺、下ML ) *分画ヒプリド化(ティー・ヒー
拳セント・ジョンおよび)′−ル・タプリュ・テビス、
「分画ンランクフィルタヒンリド化によるザツカロミセ
スセレヒシイからのカシクトースb発性L)NA配列の
単離」、セル藺、第76巻、第ダ弘3〜弘よλ負(lり
7り))1台底試料によるヒプリド化(ビー・ノイエス
等、[オリゴデオキシヌクレオチド試料を用いることに
よるガストリンmRNAの検出および部分1番(部分k
J bProc、Natl、Acad、Sci、USA
、 第76巻、第7770〜7ダ頁(lり7り))、ま
たは免疫学的分析(エル−ヴイラーカマロ7等、「プロ
インシュリンを合成する細菌クローンJ 、 Pro
o、NatlAaad、So i、U S A 、 第
7 、を巻、第37.27〜3/負(lり7g)入また
は生物学重分ルf(ニー0シー・ワイ・チャンク等、[
ねずみのジヒドロホレイトレダクターゼを暗号化するD
NA配タリのイーもコリにおける表視」、ネイチャー誌
、第273%、第6/7〜2’iL負(/yyr))
によるD1望蛋白質を生皮するクローンの送別が包色
°ちれる。不発明石等は、Mも便利かつ有望な王女クロ
ーンの泗別方法としてRNA選択ヒブリド化を迭択した
。
第3図を参照して、組換DNA分子を、クローンの上記
貯蔵物のうちカルベニシリンに感受性の約zoa!のり
p−ンの貯瓶培髪物から単離した(−2つのクローンの
、2棟混合物を紀よ因に示す)(工程A)。組換DNA
分子を開裂させ(ル、mHI)、それらの挿入物を稍裟
し、そして前記と同様に調製したIlu I FN −
r mRNAを雷鳴する全1tNAヘヒブリド化した(
工程B)。
貯蔵物のうちカルベニシリンに感受性の約zoa!のり
p−ンの貯瓶培髪物から単離した(−2つのクローンの
、2棟混合物を紀よ因に示す)(工程A)。組換DNA
分子を開裂させ(ル、mHI)、それらの挿入物を稍裟
し、そして前記と同様に調製したIlu I FN −
r mRNAを雷鳴する全1tNAヘヒブリド化した(
工程B)。
全1)NA−挿入物一全RNA−ヒプリドをヒプリド化
ちれていない全RNAから分kL、そしてヒプリド化さ
れたQ RN A 金ヒプリドから回収した(工程C)
。回収さ371CRN Aを上記としfc(工&D)。
ちれていない全RNAから分kL、そしてヒプリド化さ
れたQ RN A 金ヒプリドから回収した(工程C)
。回収さ371CRN Aを上記としfc(工&D)。
もし、組換DNA分子の組付’taが全RNA中K>−
ける1iu I k’N −r mRNAに対し厳格な
ヒプリド化条件下でヒブリド化しうるBatnHI仲人
ヌクレメテド配タリを南する組換L)NA分子を3南す
ILば、このヒプリドから遊離された+n RN Aは
卯母ん」胞において)1ulFN−rの生成忙もたらす
でめろ9゜イLIj故なら、他の組換DNA分子−全R
N Aヒブリドから遊離されるm RN AはIFN−
r−関連性でないからである。
ける1iu I k’N −r mRNAに対し厳格な
ヒプリド化条件下でヒブリド化しうるBatnHI仲人
ヌクレメテド配タリを南する組換L)NA分子を3南す
ILば、このヒプリドから遊離された+n RN Aは
卯母ん」胞において)1ulFN−rの生成忙もたらす
でめろ9゜イLIj故なら、他の組換DNA分子−全R
N Aヒブリドから遊離されるm RN AはIFN−
r−関連性でないからである。
jTO極のクローンからなるグループは陽性反応を与え
九ので、これらクローンを6袖のツブグルー7に再分類
しく♂クローンの参つのサブグループおよびタフローン
の一つのサブグループ)、そして各サブグループを前記
と同様に分析した。この過&l この分析に対応する年
−のクローンが同定されるまで続けた。
九ので、これらクローンを6袖のツブグルー7に再分類
しく♂クローンの参つのサブグループおよびタフローン
の一つのサブグループ)、そして各サブグループを前記
と同様に分析した。この過&l この分析に対応する年
−のクローンが同定されるまで続けた。
このように1i5」足された組換DN人分子およびそれ
によシ形負転俟されfc軸菌培誉物が完全なIFN−γ
cl)NA配列を市するという保証はなく、1だ実際
に1)NA配タリがIFN−γを暗号化し、またはIF
N−γの免疫学的もしくは生物学的油性を示すポリペプ
チドをこのクローンに表視させうるとは保証されない。
によシ形負転俟されfc軸菌培誉物が完全なIFN−γ
cl)NA配列を市するという保証はなく、1だ実際
に1)NA配タリがIFN−γを暗号化し、またはIF
N−γの免疫学的もしくは生物学的油性を示すポリペプ
チドをこのクローンに表視させうるとは保証されない。
しかしながら、組換1)NA分子は、!!かに11i’
N −r n5RNAlIIt号化配列に補完的な広範
なヌクレオチド配列を含有する。したがって、仁の組換
1)NA分子鉱少なくとも他の組換DNA分子およびそ
れにより形質転換されたクローンを迅速に選別して標準
もしくは完全なIFN−iヌクレオチド輻号化配列を有
するような他・のクローンを同定する試料の供給源とし
て使用することができる。
N −r n5RNAlIIt号化配列に補完的な広範
なヌクレオチド配列を含有する。したがって、仁の組換
1)NA分子鉱少なくとも他の組換DNA分子およびそ
れにより形質転換されたクローンを迅速に選別して標準
もしくは完全なIFN−iヌクレオチド輻号化配列を有
するような他・のクローンを同定する試料の供給源とし
て使用することができる。
次いで、これらクローンをIFN−1の生物学的もしく
は免疫学的活性を示すポリペ1チドの可能な総状につき
分析することができる。さらに、これらヒプリドプラス
ミドの挿入13NA19r片およびそのアミノ酸翻訳生
成物のヌクレオチド配列を決定しかつ使用して、IFN
−7の収率および活性を向上させることができる。
は免疫学的活性を示すポリペ1チドの可能な総状につき
分析することができる。さらに、これらヒプリドプラス
ミドの挿入13NA19r片およびそのアミノ酸翻訳生
成物のヌクレオチド配列を決定しかつ使用して、IFN
−7の収率および活性を向上させることができる。
2、初期分析の夾施
工程A:「押入物−DNAJの軸装および乙の「伸入物
−DNAJ勿名治するニ トロセルロースフィルタの〜4製 上dピで88mした株存W (g2. g!r>ヨヒg
4 )のそれぞれ′t−よQ柚のクローンよりなるクル
ーズに分割し、jP−の緑大赦上に2いて谷組を/晩増
殖させた。次いで、これらクローンから得られたバクテ
リヤf j ttr、lのLll−培地へ懸濁させ、こ
の懸濁’@)t−0,61のLB−培地に接種し、細菌
懸濁物を/晩増ルさせた(ンラスミドの59殖を伴わな
い)。リノチウムートリトンX100の溶菌、透E!A
な溶菌物のポリエチレングリコール沈澱、および具化エ
チジウムの存在下fCおりるCsC1の勾配遠心分離に
よって、これら培養物からDNAt−単離した。次いで
*somのクローンの各混合物のスーパーコイル1)N
A (〜、2toall)4eaooalの10mMト
リス−上fC/CpH7,3)と/mMのEl)TAと
にと夕、そしてこの浴液/jOA!fμツHjで消化し
て「L)NA−挿入物」を切断した。L)NAの開裂が
完結した後(l/L%ホリアポリノヒアミドゲルにおけ
るzttiの電気泳動によって横置する)−このLIN
AyI5合v/J’f:、7−L/ −ル処J’A シ
H”−−チルで抽出し、そしてiiJ口Cと同様にDN
A’iエタノールによって沈澱させた。
−DNAJ勿名治するニ トロセルロースフィルタの〜4製 上dピで88mした株存W (g2. g!r>ヨヒg
4 )のそれぞれ′t−よQ柚のクローンよりなるクル
ーズに分割し、jP−の緑大赦上に2いて谷組を/晩増
殖させた。次いで、これらクローンから得られたバクテ
リヤf j ttr、lのLll−培地へ懸濁させ、こ
の懸濁’@)t−0,61のLB−培地に接種し、細菌
懸濁物を/晩増ルさせた(ンラスミドの59殖を伴わな
い)。リノチウムートリトンX100の溶菌、透E!A
な溶菌物のポリエチレングリコール沈澱、および具化エ
チジウムの存在下fCおりるCsC1の勾配遠心分離に
よって、これら培養物からDNAt−単離した。次いで
*somのクローンの各混合物のスーパーコイル1)N
A (〜、2toall)4eaooalの10mMト
リス−上fC/CpH7,3)と/mMのEl)TAと
にと夕、そしてこの浴液/jOA!fμツHjで消化し
て「L)NA−挿入物」を切断した。L)NAの開裂が
完結した後(l/L%ホリアポリノヒアミドゲルにおけ
るzttiの電気泳動によって横置する)−このLIN
AyI5合v/J’f:、7−L/ −ル処J’A シ
H”−−チルで抽出し、そしてiiJ口Cと同様にDN
A’iエタノールによって沈澱させた。
込心分離しかつ旅しく乾燥し7c後、j)NAベレット
を200μlの/ OrllM トリス−)1cz(p
)(7,5)と1m1VIのEDTAにトシ、x、r’
cにて5分間加熱し、冷却し、そして10mMのトリス
−MCI!(−17,j)と/mMの、t!;DTAと
におけるj−20%蔗抛勾配置1rr3e上に光填した
。
を200μlの/ OrllM トリス−)1cz(p
)(7,5)と1m1VIのEDTAにトシ、x、r’
cにて5分間加熱し、冷却し、そして10mMのトリス
−MCI!(−17,j)と/mMの、t!;DTAと
におけるj−20%蔗抛勾配置1rr3e上に光填した
。
これをペックマンSW≠lロータにおいて≠OK。
μ℃にて76時間遠心分離した。
次いで、これら政友勾配を分別し、そして切断された[
挿入物−DNAJの混合物(〜λQμg)を含櫓する7
ラクシヨンを2□答量の2MのKOA o (pi(j
)と、2谷祖のエタノールとにより一部O℃にて少な
くとも3時間沈fIi妊せた。
挿入物−DNAJの混合物(〜λQμg)を含櫓する7
ラクシヨンを2□答量の2MのKOA o (pi(j
)と、2谷祖のエタノールとにより一部O℃にて少な
くとも3時間沈fIi妊せた。
沈澱した混合物?r:急心分離して[挿入物−L)NA
J勿分陥分離仄いてこのベレットを全部でi6oμノの
10ouνlトリス−1ie z (pti 7.s
)と/ mM El)1”Aとにと9(10μJk1史
月」して弘羨ポリアクリルアミドクール上で電気泳動δ
せた)、この混合’mt10ocにて5分111」刀1
4左〜し、そして1sottzの/ IVi Na0
fi ’1))lIχた。
J勿分陥分離仄いてこのベレットを全部でi6oμノの
10ouνlトリス−1ie z (pti 7.s
)と/ mM El)1”Aとにと9(10μJk1史
月」して弘羨ポリアクリルアミドクール上で電気泳動δ
せた)、この混合’mt10ocにて5分111」刀1
4左〜し、そして1sottzの/ IVi Na0
fi ’1))lIχた。
次いで、/、J−MのNaC1と0./ j ivl
cp Na−クエン酸塩と0..2! IVIのトリス
−fief (pHLO)と0.1 j M(Dlic
kとt ’6 廟−fる混合−IVりo。
cp Na−クエン酸塩と0..2! IVIのトリス
−fief (pHLO)と0.1 j M(Dlic
kとt ’6 廟−fる混合−IVりo。
μjを姫加することによシ混合?k ’I」イ1し、そ
してこれ金ニトロセルロースフィルタ(内径7闘、ミリ
ホ7HAWP 01tls tt ) にゆッ< t)
、i+lしてIP逃し、四Φ入物−DNAJiフィル
タへ吸着させた。これらフィルタ11乾し、012Mの
NaCJとo、oりML </) Ha−クエン酸塩と
で抗浄した後、礼法しかつ秋圧下でzo′Cにて1時間
焼成した。
してこれ金ニトロセルロースフィルタ(内径7闘、ミリ
ホ7HAWP 01tls tt ) にゆッ< t)
、i+lしてIP逃し、四Φ入物−DNAJiフィル
タへ吸着させた。これらフィルタ11乾し、012Mの
NaCJとo、oりML </) Ha−クエン酸塩と
で抗浄した後、礼法しかつ秋圧下でzo′Cにて1時間
焼成した。
工程B:伸大人物LJNAと芋RN Aとのヒブリド化
Aj%ホルムアミド(アンバーライトMHIによシ脱イ
オン化、セルバ社)とOo、2%の8118と20mM
のHEPgS(ptlA、4t)とOJMのNaCJと
ポリA RNA (jO〜100pH,5EA−b発牌
細胞かL:)得られ、かつg’1Jiic:と同様にj
〜20%蔗勧勾配にて1ト)表したもの)との温合物2
00μlを17.l製した。この混合物を、シリコン処
理されたエツベンドルフ試鹸1において41℃にて1分
間加熱した。仄いで、この混合物ヲニトロセルロースフ
ィルタ(鉛組で11tL、かつOoりMのNaCJと0
.OP MのNa−クエン酸塩とで截らしたもの)の半
裁物20枚をち゛む/!〃uの試験管に加えた。これら
20枚のニトロセルロースフィルタは、それぞれg5の
クローン保存物の一部から調製されたjO禎のクローン
よりなる。20グループを示した。この温合物において
、これらフィルタを10℃で、2局・間培養した。
オン化、セルバ社)とOo、2%の8118と20mM
のHEPgS(ptlA、4t)とOJMのNaCJと
ポリA RNA (jO〜100pH,5EA−b発牌
細胞かL:)得られ、かつg’1Jiic:と同様にj
〜20%蔗勧勾配にて1ト)表したもの)との温合物2
00μlを17.l製した。この混合物を、シリコン処
理されたエツベンドルフ試鹸1において41℃にて1分
間加熱した。仄いで、この混合物ヲニトロセルロースフ
ィルタ(鉛組で11tL、かつOoりMのNaCJと0
.OP MのNa−クエン酸塩とで截らしたもの)の半
裁物20枚をち゛む/!〃uの試験管に加えた。これら
20枚のニトロセルロースフィルタは、それぞれg5の
クローン保存物の一部から調製されたjO禎のクローン
よりなる。20グループを示した。この温合物において
、これらフィルタを10℃で、2局・間培養した。
工程C:ヒブリド化さ扛た全RNA−挿入物−L)NA
の非ヒプリド化全RNAか らの分離 ヒブリド化された全RN A −(41人5B −1J
N Aを9櫓する20枚のフィルタ2soαのプラス
チックチューブへ移し、これらflomMのトリス−)
1cJ (p)17j )と0./ j IVIのNa
CJと7mMのEl)TAと0.5チの5LISとの浴
7i!Oaでり回ならびに5L)8 t−ち址ない上=
eの級餉液で2回それぞれi、scにて仇浄した。仄い
で。
の非ヒプリド化全RNAか らの分離 ヒブリド化された全RN A −(41人5B −1J
N Aを9櫓する20枚のフィルタ2soαのプラス
チックチューブへ移し、これらflomMのトリス−)
1cJ (p)17j )と0./ j IVIのNa
CJと7mMのEl)TAと0.5チの5LISとの浴
7i!Oaでり回ならびに5L)8 t−ち址ない上=
eの級餉液で2回それぞれi、scにて仇浄した。仄い
で。
各フィルタを/30μlの1120とdμ、g(4μy
)のポリA=RNA(オリゴ(dT)セルロースを通過
した牌細胞のRNA)を官有するシリコン処理されたエ
ツベンドルフチューブへ移した。これらチューブをio
o”cにて7分間加熱し、そして直ちにCO2/エタノ
ール浴甲で凍結させた。
)のポリA=RNA(オリゴ(dT)セルロースを通過
した牌細胞のRNA)を官有するシリコン処理されたエ
ツベンドルフチューブへ移した。これらチューブをio
o”cにて7分間加熱し、そして直ちにCO2/エタノ
ール浴甲で凍結させた。
これらチューブを室温1で解凍させた稜、チューブから
フィルタを取出し、そして浴出ちれたRNA7.20μ
/の、2MのNa OAa (p)I j )とグOO
μEのエタノールとで一20℃にて7晩沈澱させた。遠
心分離によ!JRNAを集め、ペレットf70%エタノ
ールで2回洗沖し、そしてこれt乾脈した。
フィルタを取出し、そして浴出ちれたRNA7.20μ
/の、2MのNa OAa (p)I j )とグOO
μEのエタノールとで一20℃にて7晩沈澱させた。遠
心分離によ!JRNAを集め、ペレットf70%エタノ
ールで2回洗沖し、そしてこれt乾脈した。
工程D:1に111−r mRNJ$性の測定、20枚
のフィルタに対応し、したがってフジクションg3から
のjO独のクローンの初メツ、20グループに相当する
。20t1i!のRNAペレットのそれぞれ全一μl
(DH20中にとり、そしてRNAを前記と1IIIJ
様に75〜20個の闇ア7す力産蛙の卵母細胞のそれぞ
れに注入した。、23℃にて3日間の仮、卵母細胞の培
地′(il−取出し、そしてiHピと同様にIFN抗ウ
ィルス活性につき分析した。
のフィルタに対応し、したがってフジクションg3から
のjO独のクローンの初メツ、20グループに相当する
。20t1i!のRNAペレットのそれぞれ全一μl
(DH20中にとり、そしてRNAを前記と1IIIJ
様に75〜20個の闇ア7す力産蛙の卵母細胞のそれぞ
れに注入した。、23℃にて3日間の仮、卵母細胞の培
地′(il−取出し、そしてiHピと同様にIFN抗ウ
ィルス活性につき分析した。
3、 RNA選択選択リブリド化分析呆oDNAフラク
ションg、3(iooθ〜/コJ′Obp )からの1
0種のクローンからなる。2(7グループの内、グルー
プ/、l、、3,10./!およびitは、初期分析に
おいて卵母細胞中で測定されたIFN活性f、1fEt
号化するmRNA (訪発牌細胞のポリA RNAか
ら)へヒブリド化する「押入物−DNAJを含有した。
ションg、3(iooθ〜/コJ′Obp )からの1
0種のクローンからなる。2(7グループの内、グルー
プ/、l、、3,10./!およびitは、初期分析に
おいて卵母細胞中で測定されたIFN活性f、1fEt
号化するmRNA (訪発牌細胞のポリA RNAか
ら)へヒブリド化する「押入物−DNAJを含有した。
上記のように第一のヒブリド化および分相の後、クルー
ズ/。
ズ/。
グループλの50種のクローンを6種のツブグループ、
すなわちそれぞ7’Lサブグループコーl〜2−A(、
r4Mtのクローンからなる弘グループおよびP侃のク
ローンかりなる2クルーズノに分割し、そして上記のヒ
プリド化と分相+胴とをこれら6檎のサングループから
の4車入物−1)NA’i含有するニトロセルロースフ
ィルタにつき反復した。このヒブリド化の後、サブグル
ーフノーコおよびλ−6は初期外信においてインタフエ
ロン活性を示した。サブグループ2−7〜J−Jの第一
の送別において、サブグループ2−Jは強力なIFN抗
ウィルス活性をポし続けた。
すなわちそれぞ7’Lサブグループコーl〜2−A(、
r4Mtのクローンからなる弘グループおよびP侃のク
ローンかりなる2クルーズノに分割し、そして上記のヒ
プリド化と分相+胴とをこれら6檎のサングループから
の4車入物−1)NA’i含有するニトロセルロースフ
ィルタにつき反復した。このヒブリド化の後、サブグル
ーフノーコおよびλ−6は初期外信においてインタフエ
ロン活性を示した。サブグループ2−7〜J−Jの第一
の送別において、サブグループ2−Jは強力なIFN抗
ウィルス活性をポし続けた。
したがって、サブグループ、2−6をその個々のt種の
クローン(J −、g、、/〜ココ−,1rと命名)に
分割し、そして上すじのようにして、b旦H1によシ切
助しうる押入物−DNA2有するこれらlr柚のクロー
ンの内5種につき上Bピのようにニトロセルロースフィ
ルタに対する3申入物/DNAの結合、RNAヒブリド
化および分析を反復した。これら手順の後、クローンコ
ー60.2、−一6.3および、2−6.7はインクフ
エロン分釘において陽性でめった。ここでも、第一のヒ
プリド化は、これらクローンがIk″N油性を暗号化す
るm RN A葡結合しうる挿入物DNAτ含街したこ
とを示している。
クローン(J −、g、、/〜ココ−,1rと命名)に
分割し、そして上すじのようにして、b旦H1によシ切
助しうる押入物−DNA2有するこれらlr柚のクロー
ンの内5種につき上Bピのようにニトロセルロースフィ
ルタに対する3申入物/DNAの結合、RNAヒブリド
化および分析を反復した。これら手順の後、クローンコ
ー60.2、−一6.3および、2−6.7はインクフ
エロン分釘において陽性でめった。ここでも、第一のヒ
プリド化は、これらクローンがIk″N油性を暗号化す
るm RN A葡結合しうる挿入物DNAτ含街したこ
とを示している。
制限分析はクローン、! −6,λ、−一6.3および
−−A、7から切晧された挿入物DNAが同一であるこ
とを示したので、これら3mのクローンを7つとして処
理し、これをイー−コリDk11(λ)(psVj2り
(シ悪Ml )/)II IF−0、その組挨DNA分
子psVjコタ(桓H1)/)IIIF−0,「p)I
IIF−8V−roJおよびその挿入物DNAro)と
合名した。この命名は、このクローンおよび組換DNA
分子が垣H1部位にlLu1FN−r−関連aDNA(
「f(IIF’Jもしくは「r」)を含有するフラスミ
ドpsV7.2りかうなることを示し、この臀定分子は
同定さ1L7IC最初のものでるる(「0」、[roJ
)。
−−A、7から切晧された挿入物DNAが同一であるこ
とを示したので、これら3mのクローンを7つとして処
理し、これをイー−コリDk11(λ)(psVj2り
(シ悪Ml )/)II IF−0、その組挨DNA分
子psVjコタ(桓H1)/)IIIF−0,「p)I
IIF−8V−roJおよびその挿入物DNAro)と
合名した。この命名は、このクローンおよび組換DNA
分子が垣H1部位にlLu1FN−r−関連aDNA(
「f(IIF’Jもしくは「r」)を含有するフラスミ
ドpsV7.2りかうなることを示し、この臀定分子は
同定さ1L7IC最初のものでるる(「0」、[roJ
)。
γ0に対し父差ヒプリド化する組侠DN人分上記のよう
に単離したp)111F−8V−rD金使用して集落ヒ
プリド化によジクルーフ−g5(1000−%−1is
obp)b−よひg2(/+2jO〜/4’00bp)
のcDNAから上icのよりにvanしたクローンの休
符9勿を送別した〔エム・グルシンスタインおよびブイ
−・ニスーホグネス、[q+定遺伝子を含1′jするク
ローン化IJNA(D単離方法J 、ProCoNat
l、 Acad、 Sci、USA 。
に単離したp)111F−8V−rD金使用して集落ヒ
プリド化によジクルーフ−g5(1000−%−1is
obp)b−よひg2(/+2jO〜/4’00bp)
のcDNAから上icのよりにvanしたクローンの休
符9勿を送別した〔エム・グルシンスタインおよびブイ
−・ニスーホグネス、[q+定遺伝子を含1′jするク
ローン化IJNA(D単離方法J 、ProCoNat
l、 Acad、 Sci、USA 。
第7コ巻、第3り6/〜6よ負(/り7j)〕。この方
法は、p)IIIF−8V−γOから作成した放射&!
活活性試料ユニトロセルロースフィルタ1履さ・れた浴
菌細菌呆洛のjJNAヘヒブリド化させて、1連クロー
ンの迅速な同定を1」能にする。
法は、p)IIIF−8V−γOから作成した放射&!
活活性試料ユニトロセルロースフィルタ1履さ・れた浴
菌細菌呆洛のjJNAヘヒブリド化させて、1連クロー
ンの迅速な同定を1」能にする。
上記のようにミクロ測矩仮に貯蔵し、たクローンの保存
物を、予め洲ムさせて洗剤を除去した同様な寸法のニト
ロセルロースシート(孔径08aSμm%シュライシャ
およびシュウエルまたはミリボア)上で複表し、そして
これらシートヲカルペニシリン(10Qμg/μl)k
も有するLB−寒天板上に振袖した。細藺集落全37′
Gにて7晩増殖6せた。電画およびニトロセルロースシ
ートに対テる細菌の固定ケ行ない、この場合11仄に0
1.t NのNa(J4i(約7分間λ回)、7Mのト
リスーハCJ (pH7、t ) (ボリア分間)。
物を、予め洲ムさせて洗剤を除去した同様な寸法のニト
ロセルロースシート(孔径08aSμm%シュライシャ
およびシュウエルまたはミリボア)上で複表し、そして
これらシートヲカルペニシリン(10Qμg/μl)k
も有するLB−寒天板上に振袖した。細藺集落全37′
Gにて7晩増殖6せた。電画およびニトロセルロースシ
ートに対テる細菌の固定ケ行ない、この場合11仄に0
1.t NのNa(J4i(約7分間λ回)、7Mのト
リスーハCJ (pH7、t ) (ボリア分間)。
0.3 Mのトリス−HCJ (pH7,!; )およ
び/、tMのNaC1(約7分間)、、2x 88C(
0,/′MのNaC1、0,0/ j Mツク−”−7
kt ト1,1 ウA(pl(7,−2)) (約7分
間)で洗浄した。エタノールで充分にゆすぎ、かつ風乾
した後、こ扛らシートを減圧1にgOCで、2時間短、
成し、そして恒温で貯蔵した。
び/、tMのNaC1(約7分間)、、2x 88C(
0,/′MのNaC1、0,0/ j Mツク−”−7
kt ト1,1 ウA(pl(7,−2)) (約7分
間)で洗浄した。エタノールで充分にゆすぎ、かつ風乾
した後、こ扛らシートを減圧1にgOCで、2時間短、
成し、そして恒温で貯蔵した。
挿入物DNAruの断片(下iC)に特異的なりdel
制限断片を呆洛ヒフリド化用の試料として役立てた。こ
の動片(〜6.2Q個の塩基対)ij、 p HI I
F −SV −To ノpde−i 消化生JR’F
kz ’lt:p%ホリアクリポリミドゲル中で電気泳
動することにより梢表した。美化エチジウムによシL)
NAバンドr条色させた後、籍定断片r添出させ、残角
する全ての美化エチジウム忙インアミルアルコール抽出
によって除法し1′?:、o仄いで。
制限断片を呆洛ヒフリド化用の試料として役立てた。こ
の動片(〜6.2Q個の塩基対)ij、 p HI I
F −SV −To ノpde−i 消化生JR’F
kz ’lt:p%ホリアクリポリミドゲル中で電気泳
動することにより梢表した。美化エチジウムによシL)
NAバンドr条色させた後、籍定断片r添出させ、残角
する全ての美化エチジウム忙インアミルアルコール抽出
によって除法し1′?:、o仄いで。
時短〜[片をエタノールでの沈澱によシ奴紬し、そし゛
C1ニック香j1訳」によって52p−也l振rイ丁な
ったしビー争タンリュ・ジエー・リクヒイ萌、「f)N
Aホポリラーセでのニックfii+t&による試験骨子
での簡的兵1占性に対するテオキ7リボ核酸の椋識」、
J、IViol、 Biol 、 第//3 p、弗ノ
37〜.2!/負(/Y77) 〕。この場合、それぞ
れ認、jμlのdCTP%d ’1”I’ 1)および
dGTP?f:pooμMにて言上し、i L:)(/
(Z / 00 pmo lのα−ATP (γメルシ
ャム社、−000Ci / m M )と2゜j単位の
D N A−ポリメラーセエ(ベーリンガ〜社)と紮含
有する30μlのj Omtvl )リス−HCl (
p)17.11t)と70mMのiA g Cl 2と
コOmMのβ−メルカントエタノール中において73℃
にで4!−1分間培養し7℃。禾反比、のデオキシヌク
レオシド三燐葭は、1゛E九゛2価イ仮におけるセファ
ナツクスa−7sでのゲル1過によって除去した。四匣
に52p−佇戯された1)NAを0./容量の一2M#
酸ナトリウム(pHt、/)とコ、j容にのエタノール
とで20℃にて沈澱させた。
C1ニック香j1訳」によって52p−也l振rイ丁な
ったしビー争タンリュ・ジエー・リクヒイ萌、「f)N
Aホポリラーセでのニックfii+t&による試験骨子
での簡的兵1占性に対するテオキ7リボ核酸の椋識」、
J、IViol、 Biol 、 第//3 p、弗ノ
37〜.2!/負(/Y77) 〕。この場合、それぞ
れ認、jμlのdCTP%d ’1”I’ 1)および
dGTP?f:pooμMにて言上し、i L:)(/
(Z / 00 pmo lのα−ATP (γメルシ
ャム社、−000Ci / m M )と2゜j単位の
D N A−ポリメラーセエ(ベーリンガ〜社)と紮含
有する30μlのj Omtvl )リス−HCl (
p)17.11t)と70mMのiA g Cl 2と
コOmMのβ−メルカントエタノール中において73℃
にで4!−1分間培養し7℃。禾反比、のデオキシヌク
レオシド三燐葭は、1゛E九゛2価イ仮におけるセファ
ナツクスa−7sでのゲル1過によって除去した。四匣
に52p−佇戯された1)NAを0./容量の一2M#
酸ナトリウム(pHt、/)とコ、j容にのエタノール
とで20℃にて沈澱させた。
フィルタ含浸させたD N A Vc附する上記試料の
ヒプリド化は、ティー拳ハナハンおよび二ム・メセルソ
ンにより夾買的に記載ちれたように行なった〔[−集落
密度におけるズラスミドホ別J、ジイーン誌、第1O巻
、第63〜67頁(/りざの〕2上記のように居候した
フィルタを0,1%フィコールと0./ %ポリビニル
ビドリドンとo、i%牛血清アルブミンと0./ j
M NhClとθ、0JIVIトリy、 −)iCl
(pHI )と/mb/IのED’l’Aとにおいてt
j℃にてコ時間予備培養し、そしてOoO,2%フィコ
ールと0.02%ポリビニルビドリドンと0.02%牛
血渭アルブミンと。、7JrMNaC1!と0./ j
M )リス−HCz (pH,r )とjmME D
’I’ Aと0.1%SO8とによって洗浄した。
ヒプリド化は、ティー拳ハナハンおよび二ム・メセルソ
ンにより夾買的に記載ちれたように行なった〔[−集落
密度におけるズラスミドホ別J、ジイーン誌、第1O巻
、第63〜67頁(/りざの〕2上記のように居候した
フィルタを0,1%フィコールと0./ %ポリビニル
ビドリドンとo、i%牛血清アルブミンと0./ j
M NhClとθ、0JIVIトリy、 −)iCl
(pHI )と/mb/IのED’l’Aとにおいてt
j℃にてコ時間予備培養し、そしてOoO,2%フィコ
ールと0.02%ポリビニルビドリドンと0.02%牛
血渭アルブミンと。、7JrMNaC1!と0./ j
M )リス−HCz (pH,r )とjmME D
’I’ Aと0.1%SO8とによって洗浄した。
上記の洗砂浴液と同一の溶液中においてぶ♂℃にてヒブ
リド化をl晩行なったが、この場合使用前に予め/ 0
0 ”Qにて3分間変性させた%2P−標識葛れた試料
r用いた。ヒブリド化したフィルタf O03fVI
NaCl!とv、0AiVi)リス−HCl(PHI
)と−2mMのELITAとにより6g℃にて、2時間
洗浄した俊、風乾しかつオートラジオグラフィにかけた
。
リド化をl晩行なったが、この場合使用前に予め/ 0
0 ”Qにて3分間変性させた%2P−標識葛れた試料
r用いた。ヒブリド化したフィルタf O03fVI
NaCl!とv、0AiVi)リス−HCl(PHI
)と−2mMのELITAとにより6g℃にて、2時間
洗浄した俊、風乾しかつオートラジオグラフィにかけた
。
c i) N Aフラクションg3から侍られた矛ノ;
2300個のクローンと、cl)NAフラクションg2
がら生じたgざ01固のクローンとを選別した。この集
落ヒブリド化選別の結末、フラクションg3のa D
N Aから生ずる1個の呆落とフラクションg2のc
I) N Aがら侍られる/11^1の染浴とが同定さ
れ、これらはγ0試料に強力にヒブリド化した。フラク
ションge1からの♂イ回の強力にヒブリド化する譲洛
をrl、γ2.γ5 + r5+γ6゜γB、γ9およ
びγ11と命名した。さらに、この7ラクシヨンからの
ヒプリド化の弱いλつの集落を同定した。これらをγ4
およびγノと命名した。7ラクシヨンg2からの年−の
強カヒブリド化集落をγ1oと命名した。その後の1l
ilJ限およびヒブリド化分析は、集落γ4およびγ7
がIFN−1(g、囲体のないことを示した。)2クシ
ョンg3からのl餉の強力にヒブリド化する集落のうち
s’mは初ルjのグループ/かり得られ、そして7個は
初期RNAヒブリド化分セ「において陽性?!−ボした
クルーズ/よからのものである。
2300個のクローンと、cl)NAフラクションg2
がら生じたgざ01固のクローンとを選別した。この集
落ヒブリド化選別の結末、フラクションg3のa D
N Aから生ずる1個の呆落とフラクションg2のc
I) N Aがら侍られる/11^1の染浴とが同定さ
れ、これらはγ0試料に強力にヒブリド化した。フラク
ションge1からの♂イ回の強力にヒブリド化する譲洛
をrl、γ2.γ5 + r5+γ6゜γB、γ9およ
びγ11と命名した。さらに、この7ラクシヨンからの
ヒプリド化の弱いλつの集落を同定した。これらをγ4
およびγノと命名した。7ラクシヨンg2からの年−の
強カヒブリド化集落をγ1oと命名した。その後の1l
ilJ限およびヒブリド化分析は、集落γ4およびγ7
がIFN−1(g、囲体のないことを示した。)2クシ
ョンg3からのl餉の強力にヒブリド化する集落のうち
s’mは初ルjのグループ/かり得られ、そして7個は
初期RNAヒブリド化分セ「において陽性?!−ボした
クルーズ/よからのものである。
勿論、上記のように%14 u I F N−γ仲人物
DNAToまたはこの仲人物を用いて同定されたりo−
yo他のDNA挿入物會用いるこのクローン選別方法は
1組換DNA技術%会欣、天然源またはその組合せから
生ずるDNA配列を含有する他のクローン、或いは単一
もしくは多重の塩基置換、挿入、逆転、もしくは削除を
含む突然変異による上記L)NA配列に関連したDNA
配列を含有するクローンについても岡等に使用しうろこ
とが明らかである。したがって、この種の1)NA配列
およびその同定も本発明の範囲内である。さらに、上B
ピDNA配列によシ選別されないがヌクレオチドの配列
の結果、上配置)NA配列Vこよシ陥ち化されるポリベ
プチドを暗号化するよりな1)HA配列も本発明の範囲
内でめることt7解すべさでめる。
DNAToまたはこの仲人物を用いて同定されたりo−
yo他のDNA挿入物會用いるこのクローン選別方法は
1組換DNA技術%会欣、天然源またはその組合せから
生ずるDNA配列を含有する他のクローン、或いは単一
もしくは多重の塩基置換、挿入、逆転、もしくは削除を
含む突然変異による上記L)NA配列に関連したDNA
配列を含有するクローンについても岡等に使用しうろこ
とが明らかである。したがって、この種の1)NA配列
およびその同定も本発明の範囲内である。さらに、上B
ピDNA配列によシ選別されないがヌクレオチドの配列
の結果、上配置)NA配列Vこよシ陥ち化されるポリベ
プチドを暗号化するよりな1)HA配列も本発明の範囲
内でめることt7解すべさでめる。
さらに、ヒト免疫インタンエロンを81ち化するDNA
配列と、非ヒト供給源(たとえは、ねず与、豚、賜、牛
またeよ犬)ηλらの免役インタ7エロンを亀号化する
1)NA配列との間には知似性が予調り8れるので1本
発明のL)NA配タリはコレラ件ヒト免役インタフエロ
ンケ暗号化するDNAの選択に除し、ならひにツ1−ヒ
ト抗ウィルス剤および方法に使用する非ヒトインタフエ
ロンのクローン化および表現にふ・いても有用でbる。
配列と、非ヒト供給源(たとえは、ねず与、豚、賜、牛
またeよ犬)ηλらの免役インタ7エロンを亀号化する
1)NA配列との間には知似性が予調り8れるので1本
発明のL)NA配タリはコレラ件ヒト免役インタフエロ
ンケ暗号化するDNAの選択に除し、ならひにツ1−ヒ
ト抗ウィルス剤および方法に使用する非ヒトインタフエ
ロンのクローン化および表現にふ・いても有用でbる。
ガulFN−r活性金坐フ!製ププチドの表現IFN−
r−関連の押入物−DNA七含七するグラスミドでトラ
ンスフェクションもせるべくアフリカ産緑猿(AP、S
’ )の¥を緘細胞を94裟するため、これら細胞tテ
ユベンコの改変イークル最小培地(「DMkJ )((
、+IBCO)に保持した。
r−関連の押入物−DNA七含七するグラスミドでトラ
ンスフェクションもせるべくアフリカ産緑猿(AP、S
’ )の¥を緘細胞を94裟するため、これら細胞tテ
ユベンコの改変イークル最小培地(「DMkJ )((
、+IBCO)に保持した。
この培地は10%の納生児の子午面@(GIBCO)と
/rnt尚シioo年位のペニシリンとl縮機り100
1111のストレフトマイシンとを含南した。
/rnt尚シioo年位のペニシリンとl縮機り100
1111のストレフトマイシンとを含南した。
これら細胞培襲物p(DEAE−テキストラン法の変法
を用いてプラスミド1)NAによって形負転換させた。
を用いてプラスミド1)NAによって形負転換させた。
次のより2をヤテなった:融合した細胞単一層をトリプ
クンーEDTAVcよp約1時間徹底的に処理し、次い
でこれら’f / 7 wIv大(1つのプレート幽#
)、2参個の穴倉;i!する;コスタ−社)において1
0%の絹生先子牛血渭を含令するD ME中に分散させ
た。−≠時間後。
クンーEDTAVcよp約1時間徹底的に処理し、次い
でこれら’f / 7 wIv大(1つのプレート幽#
)、2参個の穴倉;i!する;コスタ−社)において1
0%の絹生先子牛血渭を含令するD ME中に分散させ
た。−≠時間後。
細胞をHEPES緩衝化された最少の必須培地で4回洗
浄し、そしてグラスミドDNA (/ 、2μlのFI
Z−HEPES緩衝液における約l〜/ Ot#/li
t (D@度テ溶解)を300ap/mlのpgAg−
テキスト2ン(ファルマシア社)を含有するlコOμl
のDMEへ加えた。次いで、この混合物を約jO−、4
0分間#lII胞単一層へ施した〔ジエーーエツチ・マ
ツフカチャンおよびジエー争エスーパガノ、[ジエチル
アミノエチルテキストランによる猿ウィルス4!−o7
−オキジリホ核敵の感染性の促進J 、 J、Natl
、Cancer。
浄し、そしてグラスミドDNA (/ 、2μlのFI
Z−HEPES緩衝液における約l〜/ Ot#/li
t (D@度テ溶解)を300ap/mlのpgAg−
テキスト2ン(ファルマシア社)を含有するlコOμl
のDMEへ加えた。次いで、この混合物を約jO−、4
0分間#lII胞単一層へ施した〔ジエーーエツチ・マ
ツフカチャンおよびジエー争エスーパガノ、[ジエチル
アミノエチルテキストランによる猿ウィルス4!−o7
−オキジリホ核敵の感染性の促進J 、 J、Natl
、Cancer。
1nstituta 、第u / @、 第J j /
〜j 7 J4(lり7J’)iジー・チューおよび
ピー・エイ・シャープ「釉濁物におけるん胞の5Vll
toJ)NAトランス7エクシヨン:′L゛−抗ノ駅の
転写および翻訳の効率の分析」、ジイーン誌、第13巻
、第127〜.2Qコ負<1ytiノ 〕。 411胞
をDΔ1Eで3回洗浄した後、新鮮な堵地(DME→/
Q饅子牛血清+i o o llp/mlVペニシリン
およびIOθμ77/lnlストレントマイシン)を加
え、そして縮胞培養物をC02培誓器において37℃に
て7−2時間培養した。
〜j 7 J4(lり7J’)iジー・チューおよび
ピー・エイ・シャープ「釉濁物におけるん胞の5Vll
toJ)NAトランス7エクシヨン:′L゛−抗ノ駅の
転写および翻訳の効率の分析」、ジイーン誌、第13巻
、第127〜.2Qコ負<1ytiノ 〕。 411胞
をDΔ1Eで3回洗浄した後、新鮮な堵地(DME→/
Q饅子牛血清+i o o llp/mlVペニシリン
およびIOθμ77/lnlストレントマイシン)を加
え、そして縮胞培養物をC02培誓器において37℃に
て7−2時間培養した。
トランスフェクションのために使片」したグラスミドD
NAはりゾチウムーa剤での溶菌にょクイー拳コリDH
I (λ)年落から1装し、セしてエム・カー7等によ
って実質的に記載されたように臭化エチジウムの存在下
でCaC/勾配における等鴨・度遠心分離によって軸装
した〔[プラスミドCo1Elから得られるンラスミド
クローン化ヘヒクル」、メソッド・イン・エンテモロジ
ー、第6r巷1組挨DΔA(アール・ウーb)、第26
t〜2♂Q負(/り7り)〕。
NAはりゾチウムーa剤での溶菌にょクイー拳コリDH
I (λ)年落から1装し、セしてエム・カー7等によ
って実質的に記載されたように臭化エチジウムの存在下
でCaC/勾配における等鴨・度遠心分離によって軸装
した〔[プラスミドCo1Elから得られるンラスミド
クローン化ヘヒクル」、メソッド・イン・エンテモロジ
ー、第6r巷1組挨DΔA(アール・ウーb)、第26
t〜2♂Q負(/り7り)〕。
72時間培髪した後、上澄液(〜/2威)?!−形負転
換された細胞〃)ら除去し、そして慣用のインタ7工ロ
ン分伯に使用して、生qす挙上活性なIFN−γ−IJ
A連ホリベグポリの上澄液中における存在を次足した。
換された細胞〃)ら除去し、そして慣用のインタ7工ロ
ン分伯に使用して、生qす挙上活性なIFN−γ−IJ
A連ホリベグポリの上澄液中における存在を次足した。
上記のように、形質転換細胞によρ生産されたインタフ
エロン活性はEMCウィルスで攻撃されたヒト・トリソ
ミック(T、2/細胞)につき決定した。このT 、!
/ h+胞は、使用前にファルコン社の26大のミク
ロ副定板に7日間接種した。上澄液toμlと培地/、
20μlとの浴11i、I00μI!を次いで第1の穴
へ入れ、この溶液の一連の希釈物iooμl(ム0g1
o= 0.3 )を順次の穴へ入れた。これらの大へ、
2Q時間後にEMCウィルスを加えた。光学顕微鏡の下
で或いはウィルス訪発性細胞祢性効果を抑制する結晶バ
イオレットで染色した後、これらの穴を評価した。
エロン活性はEMCウィルスで攻撃されたヒト・トリソ
ミック(T、2/細胞)につき決定した。このT 、!
/ h+胞は、使用前にファルコン社の26大のミク
ロ副定板に7日間接種した。上澄液toμlと培地/、
20μlとの浴11i、I00μI!を次いで第1の穴
へ入れ、この溶液の一連の希釈物iooμl(ム0g1
o= 0.3 )を順次の穴へ入れた。これらの大へ、
2Q時間後にEMCウィルスを加えた。光学顕微鏡の下
で或いはウィルス訪発性細胞祢性効果を抑制する結晶バ
イオレットで染色した後、これらの穴を評価した。
本発明により生産されたIFN−r活性を−細胞からの
上庶赦60μlを7コ0μlの培地およPioμlのI
FN−γ抗血lff (ね)・ヶ、匈希釈)と混合し、
37℃にて一時IM+培誉した。/、20077にて!
分間遠心分離した後、上澄液を上dCのようにT、2/
帷施につぎ分析した。
上庶赦60μlを7コ0μlの培地およPioμlのI
FN−γ抗血lff (ね)・ヶ、匈希釈)と混合し、
37℃にて一時IM+培誉した。/、20077にて!
分間遠心分離した後、上澄液を上dCのようにT、2/
帷施につぎ分析した。
!lJl分限および寸法決定(Cよシ演ら足された挿入
物が最も長かったもの(rl、γ5およびγ1o)のク
ローンに対するこれら分相の結果は下HL2の辿シであ
った: pHIIF’−8V−1+ 100
0pHI IF−8V−1500 pHI IF−8V−r 1(100 上配γ1の活性は、3.5個のへの抗ウィルス保脛に相
幽し、この保護はこれら試料r先ず抗−IFN−γで処
理すれば泊失した。;計す限分布■は%挿入’tl−L
INArr+およびγ1Qがp S V!29における
挿入物−〇NAγ1に対し反対の配向であることを示し
た。したがってに&されたように、r5およびrlQで
形質転換細胞た宿主によっては、伸」らの活性も表現感
れなかった。勿1h御入物1)NAγ、およびril+
が′帛法にょシ正確な配向に寂かれるなら虹、これら1
jNA伸入物で形賀獣挨された宿主はl l、t J−
1−γ全表現することが了解されるべきである。’i”
笑b γ1oにおける配列は、正確な配向に↓・かれ
るとIFN−γ活性を表現した。
物が最も長かったもの(rl、γ5およびγ1o)のク
ローンに対するこれら分相の結果は下HL2の辿シであ
った: pHIIF’−8V−1+ 100
0pHI IF−8V−1500 pHI IF−8V−r 1(100 上配γ1の活性は、3.5個のへの抗ウィルス保脛に相
幽し、この保護はこれら試料r先ず抗−IFN−γで処
理すれば泊失した。;計す限分布■は%挿入’tl−L
INArr+およびγ1Qがp S V!29における
挿入物−〇NAγ1に対し反対の配向であることを示し
た。したがってに&されたように、r5およびrlQで
形質転換細胞た宿主によっては、伸」らの活性も表現感
れなかった。勿1h御入物1)NAγ、およびril+
が′帛法にょシ正確な配向に寂かれるなら虹、これら1
jNA伸入物で形賀獣挨された宿主はl l、t J−
1−γ全表現することが了解されるべきである。’i”
笑b γ1oにおける配列は、正確な配向に↓・かれ
るとIFN−γ活性を表現した。
さらに、抗−IFN−α(羊)、抗−IF”N−β(山
羊)、抗−1FN−γ(ねずみ)および抗−IFN−γ
(兎)を用いて中和分析を行なった。
羊)、抗−1FN−γ(ねずみ)および抗−IFN−γ
(兎)を用いて中和分析を行なった。
その結北4次の通りであった:
ィンタフエロン 抗IFNでの IFNY占
性IFN−α(標準)
301FN−α(標準) 抗−IFN−α(羊)<
3IFN−β(標準) 3
00IFN−β(標準) 仇−IFN−β(山羊)<
31FN−γ(標準) −−io。
性IFN−α(標準)
301FN−α(標準) 抗−IFN−α(羊)<
3IFN−β(標準) 3
00IFN−β(標準) 仇−IFN−β(山羊)<
31FN−γ(標準) −−io。
IFN−γ(標準) 抗−IJ”N−γ(ねずみ)<
3IFN−r(標準) 抗−I FN−r (兎)<
3FN−r (pHIIF−8V−γ、) −−10゜IFN
−γ (pHIIF−8V−γ1) 抗−IF’N−γ(ねず
み)〈3I FN−7 (pHI IF−8V−γ1) 抗−IFN−r(3
Q) <jIFN−γ (pHIIF−8V−γ+) 抗−IFN−a(羊)
100IFN−γ (pH4IF−8V−7’+) 抗 I’N−β(山
羊)/60これらの中和分相は、pHL IF−8V
−rtによシ生産妊tLるポリベプテドの生物学的粘性
が2槍の惧帽源(兎およびねすみ)からのわL−IE”
N−γにより中和されるが、その活性は抗−IFN−α
または抗−IFN−βによって中和ちれないことを示し
た。比軟分相および便米何なった分相(上記)は、抗原
活性におけるこの麦が標準0IFN−a 、IFN−β
およびIFN−rの挙動に平行することを示した。
3IFN−r(標準) 抗−I FN−r (兎)<
3FN−r (pHIIF−8V−γ、) −−10゜IFN
−γ (pHIIF−8V−γ1) 抗−IF’N−γ(ねず
み)〈3I FN−7 (pHI IF−8V−γ1) 抗−IFN−r(3
Q) <jIFN−γ (pHIIF−8V−γ+) 抗−IFN−a(羊)
100IFN−γ (pH4IF−8V−7’+) 抗 I’N−β(山
羊)/60これらの中和分相は、pHL IF−8V
−rtによシ生産妊tLるポリベプテドの生物学的粘性
が2槍の惧帽源(兎およびねすみ)からのわL−IE”
N−γにより中和されるが、その活性は抗−IFN−α
または抗−IFN−βによって中和ちれないことを示し
た。比軟分相および便米何なった分相(上記)は、抗原
活性におけるこの麦が標準0IFN−a 、IFN−β
およびIFN−rの挙動に平行することを示した。
ヌクレオチド配列(下dC)は、γ1のIFN−r暗号
化領域もこのIFN−γの予想信号配列klS号化する
ヌクレオチドを含肩することを示したので、培地中への
成熟核細胞の分泌の際。
化領域もこのIFN−γの予想信号配列klS号化する
ヌクレオチドを含肩することを示したので、培地中への
成熟核細胞の分泌の際。
蛋白質の処理が行なわれるものと思われる。
次に第6図を鉦照すれば、挿入物DNA To。
γ1およびγ5の物理地図を、容積の制限酵素にューイ
ンクランド自ビオラブ社筐たはぺ一すン力−社)を用い
る消化により供給者の%足した条件下で作成した。消化
の生成物を、参〇1nM)リス−BOA a (pl−
17,1)と20 mjVloEl)TAとにおけるコ
1.2慢アカロース”よたりよ6襲ホリアクリルアミド
ゲル(Cおいて喝気泳鯛にかけた。こ(1らを臭化エチ
ジウムで染色し1内眠化した後に分布+L、或いrLメ
=トラジス°グラフィーにかけた俊に、側限θ[片釦P
−燐酸塩(下記)で末端識椋し、そしてpBttj、
2λり静細な物理地図と比軟した〔ジエー・ジー・サッ
トクリフ、「太I%菌フラスミドpBRj、2.2の先
金ヌクレオチド配夕1」」、コールド・スズリンク・ハ
ーバ−魯シンポジウム、第グ3巻%第1号、第77〜り
O負(/り7g)〕。2つの挿入物の制限地図勿、これ
らの消化パターンに基づいて作成した。これらを、ニー
・エム・マキサムおよびダブリス・ギルバートの方法(
1”DNAの新規なj−序決定方法」、Proc、Na
Ll、Auad。
ンクランド自ビオラブ社筐たはぺ一すン力−社)を用い
る消化により供給者の%足した条件下で作成した。消化
の生成物を、参〇1nM)リス−BOA a (pl−
17,1)と20 mjVloEl)TAとにおけるコ
1.2慢アカロース”よたりよ6襲ホリアクリルアミド
ゲル(Cおいて喝気泳鯛にかけた。こ(1らを臭化エチ
ジウムで染色し1内眠化した後に分布+L、或いrLメ
=トラジス°グラフィーにかけた俊に、側限θ[片釦P
−燐酸塩(下記)で末端識椋し、そしてpBttj、
2λり静細な物理地図と比軟した〔ジエー・ジー・サッ
トクリフ、「太I%菌フラスミドpBRj、2.2の先
金ヌクレオチド配夕1」」、コールド・スズリンク・ハ
ーバ−魯シンポジウム、第グ3巻%第1号、第77〜り
O負(/り7g)〕。2つの挿入物の制限地図勿、これ
らの消化パターンに基づいて作成した。これらを、ニー
・エム・マキサムおよびダブリス・ギルバートの方法(
1”DNAの新規なj−序決定方法」、Proc、Na
Ll、Auad。
Sai、USA、第74を巻、71f、 ! t O〜
6≠負(lり77)〕によってDNA押入物を順序入定
することにより修正した。
6≠負(lり77)〕によってDNA押入物を順序入定
することにより修正した。
ン2スミド1)NAk b b’lj’J用に一群のク
ローンからf)NAを年1跳するため上d己で1史川し
たカー7等の方法(上記)によシp)iIIF−8V−
ra 、 pHI Ifi”−8V−11、pHI I
F−8V−r5およびpaIIF−8V−γ、0から鉤
裂した。単離さnた型IのDNAを前記と同和ζに中性
蔗糖−勾配遠心分離によph製し、供に業者にューイン
ク゛ランド・ビオラブ社)により主として推奨された稙
々の貼限#素により制限した。
ローンからf)NAを年1跳するため上d己で1史川し
たカー7等の方法(上記)によシp)iIIF−8V−
ra 、 pHI Ifi”−8V−11、pHI I
F−8V−r5およびpaIIF−8V−γ、0から鉤
裂した。単離さnた型IのDNAを前記と同和ζに中性
蔗糖−勾配遠心分離によph製し、供に業者にューイン
ク゛ランド・ビオラブ社)により主として推奨された稙
々の貼限#素により制限した。
制限されたDNAを、φ単位の細菌性アルカリホスファ
ターゼと0,1%のSDSとの存在下で73”Cにて3
0分間脱燐酸化した。2回フェノール抽出しかつエタノ
ール沈澱した後、このLJNAをr−P”−ATP (
〜J 000C4/mmol)およびポリヌクレオチド
キナーゼ(P−Lバイオケミカルス社)によ#)s′末
端標識した。或いは制限断片凱α−標識p32−ヌクレ
オシド三燐除(〜/ 0OOCi/mtnol )の存
在下に制限1)NA−ポリメラーゼ反応(クレノー断片
、ペーリンガー社)により3′−末端標識した。
ターゼと0,1%のSDSとの存在下で73”Cにて3
0分間脱燐酸化した。2回フェノール抽出しかつエタノ
ール沈澱した後、このLJNAをr−P”−ATP (
〜J 000C4/mmol)およびポリヌクレオチド
キナーゼ(P−Lバイオケミカルス社)によ#)s′末
端標識した。或いは制限断片凱α−標識p32−ヌクレ
オシド三燐除(〜/ 0OOCi/mtnol )の存
在下に制限1)NA−ポリメラーゼ反応(クレノー断片
、ペーリンガー社)により3′−末端標識した。
11ibt序決定するため、標識されたシ「片を2つの
方法で処理した。成るものは、第コの利限酵系で1袈さ
せるni+に、ポリアクリルアミドゲル上でa製した。
方法で処理した。成るものは、第コの利限酵系で1袈さ
せるni+に、ポリアクリルアミドゲル上でa製した。
個のものについては、第2の1ilJ限酵素によって@
ちに曲数させた。第3の手順にお・い′Cは、’ 41
のストランドtアルカリ袈性とナノ′しに続くポリアク
リルアミドケル電気vK励とによシ分離した。lTi1
1名の賜金、9r短のllr片をトリス−47NI %
−E D T A緩衝7医にて7I;リアクリルアミ
ドゲル上で分離した。弗6L!!jは釉々の制限障1片
(円は椋11にを示し、矢印は順ル決定力向をiI)オ
jヒp)iI IF−8V−γo 、 pi(I Lk
’ −8V−r+ 、pHll1i”−8V−rsとp
L(IIF−8V−γ10 とを用いて行なった71
k )−)決建方法を示している。
ちに曲数させた。第3の手順にお・い′Cは、’ 41
のストランドtアルカリ袈性とナノ′しに続くポリアク
リルアミドケル電気vK励とによシ分離した。lTi1
1名の賜金、9r短のllr片をトリス−47NI %
−E D T A緩衝7医にて7I;リアクリルアミ
ドゲル上で分離した。弗6L!!jは釉々の制限障1片
(円は椋11にを示し、矢印は順ル決定力向をiI)オ
jヒp)iI IF−8V−γo 、 pi(I Lk
’ −8V−r+ 、pHll1i”−8V−rsとp
L(IIF−8V−γ10 とを用いて行なった71
k )−)決建方法を示している。
これら断片に、ニー・エム・マキサムおよびダブリス・
キルバートの力伝(上1ff)に従って分解した。これ
ら生成物を1.t OrnM ) +)スー硼we、と
7mMのEl)TA(pllg、3)とにおいて種々の
幽此および長さのアクリルアミドグル上でり。。、−0
oovにで分画した〇 c[1NAHΦ入物の各長さを両ストランドからJI8
火定し、標識木端として作用葛せた谷制限部位はこれを
陰間させる断片を用いてノー序決定した。本発明のIF
N−γ DNA(i、1暗号化ストランドにりき得られ
た複合ヌクレオチド献夕1」およびその対比、するアミ
ノ酸配列を第7図に下す。
キルバートの力伝(上1ff)に従って分解した。これ
ら生成物を1.t OrnM ) +)スー硼we、と
7mMのEl)TA(pllg、3)とにおいて種々の
幽此および長さのアクリルアミドグル上でり。。、−0
oovにで分画した〇 c[1NAHΦ入物の各長さを両ストランドからJI8
火定し、標識木端として作用葛せた谷制限部位はこれを
陰間させる断片を用いてノー序決定した。本発明のIF
N−γ DNA(i、1暗号化ストランドにりき得られ
た複合ヌクレオチド献夕1」およびその対比、するアミ
ノ酸配列を第7図に下す。
次に第7〜g図を番照して、挿入物のヘテロポリマ一部
分iGυよびAK茄む部分(恐らくm RN Aのポリ
A禾端を反映する)により1つの91」にmkべる。診
瑚のため、(申入物には複合す申入物の第/ヌクレオチ
ドから、この複合仲人物の未翻訳部分に充分大p込んだ
ヌクレオチドまで番号を付ける。位飯ざター7/におけ
るATG開始トリプレットと、付随jざ7−312にお
けるTAA停止トリブレットとはナンセンスコドンによ
シ中断されない解胱枠を規矩する。し;」始伯号および
停止信号によりフランクしたその他任意の翻訳可能な配
列(すなわち、異なる′pP+軌枠に存在する)は短か
逼き゛るためI F N−γの予想寸法のポリペプチド
を賠号化することができない。したがって、恐らく、ヌ
クレオチドにりとAug乙との間の領域が、本発明によ
るIFN−γτ晴ラブ化するよりlスフレメチド配列を
含むと予心さ才し心。
分iGυよびAK茄む部分(恐らくm RN Aのポリ
A禾端を反映する)により1つの91」にmkべる。診
瑚のため、(申入物には複合す申入物の第/ヌクレオチ
ドから、この複合仲人物の未翻訳部分に充分大p込んだ
ヌクレオチドまで番号を付ける。位飯ざター7/におけ
るATG開始トリプレットと、付随jざ7−312にお
けるTAA停止トリブレットとはナンセンスコドンによ
シ中断されない解胱枠を規矩する。し;」始伯号および
停止信号によりフランクしたその他任意の翻訳可能な配
列(すなわち、異なる′pP+軌枠に存在する)は短か
逼き゛るためI F N−γの予想寸法のポリペプチド
を賠号化することができない。したがって、恐らく、ヌ
クレオチドにりとAug乙との間の領域が、本発明によ
るIFN−γτ晴ラブ化するよりlスフレメチド配列を
含むと予心さ才し心。
この配列は、1ことえQよ単−丑7“こは多R(の編基
匝換s IklJ除+ 31j’人もしくは逆転ケ含め
央舊(武具のような遺伝子に対する変化がまだが仏子に
おいて生じていなかつプこり、或いは後(ζこれを使用
してそれにより表現さt’L /);J= ’)ペプチ
ドの性質ff、変化させ伯なかった9丁か’Jr4出イ
9F除するものでない。首/ヒ、第7〜g図に示したも
の〔上記〕と生理宇土類似しているが樗造上僅かに異な
る遺伝子もしくはポリペプチドtもたらし得るような任
意の多りレ性を′排除するものでもない。
匝換s IklJ除+ 31j’人もしくは逆転ケ含め
央舊(武具のような遺伝子に対する変化がまだが仏子に
おいて生じていなかつプこり、或いは後(ζこれを使用
してそれにより表現さt’L /);J= ’)ペプチ
ドの性質ff、変化させ伯なかった9丁か’Jr4出イ
9F除するものでない。首/ヒ、第7〜g図に示したも
の〔上記〕と生理宇土類似しているが樗造上僅かに異な
る遺伝子もしくはポリペプチドtもたらし得るような任
意の多りレ性を′排除するものでもない。
勿kr、l’A法(上Bじ〕によシポリA土tNAから
得られるクローン化e D N AはJ′−木端ヌクレ
オチドを欠如したり、或いは人為的配夕1jでさえ含イ
jしうることをアカ゛tすべさでめる〔アール・、アイ
・リチャード等、「成長心のβ−クロビンa D N
Aの分子クローン化および配列分相」。
得られるクローン化e D N AはJ′−木端ヌクレ
オチドを欠如したり、或いは人為的配夕1jでさえ含イ
jしうることをアカ゛tすべさでめる〔アール・、アイ
・リチャード等、「成長心のβ−クロビンa D N
Aの分子クローン化および配列分相」。
ヌクレイツーク・アシッド・リサーチ、第7巷、第11
37〜l/L/;頁(/り7り)」。しfこかつで。
37〜l/L/;頁(/り7り)」。しfこかつで。
ヌクレオチ)Jタータフに位置するA’l’Gが実際に
標準IFN−γ晰号化配夕1]の九初のATGであると
は眠らない。しかしながら、以下の脱明の目的には、ヌ
クレオチドg9−タlにおりるATGが標準IFN−γ
暗号化配夕1」の最初のATGであると仮定する。
標準IFN−γ晰号化配夕1]の九初のATGであると
は眠らない。しかしながら、以下の脱明の目的には、ヌ
クレオチドg9−タlにおりるATGが標準IFN−γ
暗号化配夕1」の最初のATGであると仮定する。
ざらに、成熟核+nRNAにおいてj゛′′禾端の最初
のAUG)リフレットは一般に蛋白質合成のだめの開始
部位である〔エム・コザツク。
のAUG)リフレットは一般に蛋白質合成のだめの開始
部位である〔エム・コザツク。
「成熟核リポソームはm RN Aにおける開に=領域
をどのように選択するか」、セル誌、第1it巻、第1
10り〜、2j負(/り7g)〕。ここで、父、疫イン
タ7エロンの第/アミノ緻に対応する複合断片中のコド
ンi、t 最初のATGから、20のコドンである。こ
のことは、免疫インタフエロンを唱号化するIJNA配
夕1ノに先行して、コク1向のアミノ酸よりなる信号ポ
リペプチドを決定する配タリが存在し9ることを7]<
股している。この批定の信号配列は、一連のJ庚;水仙
アミノ敵を會南スる。勿馳、疎水牡残曇のこのよりな蓄
積rよ、イ呂号白己夕1」に年も俵H゛ジでめる(ヒー
・ディ一番タヒッドおよびヒーーシー・タイ、1(摸か
らの蛋白質分泌のメカニズム」、イ・イチャー酩、弗−
2ト3巻、第弘33〜3g員(ツタざ0)jo「取免I
JHulli’へ−γに1珂らかに刈応丁ゐヌクレオチ
ド配夕1」6′よ、l弘A 11Q+の1ミノ服を隋ち
一化するヌクレオチドからなっている。インタフエロン
唱号化配夕1j内のコドン用途は、−敷K IQU乳知
mRNAにつき編集されたものLアール・グランタム等
、「暗号化カタロクハ」途およびゲノム仮説」、ヌクレ
イツク会アシッド・リサーチ、第を巻、第Vり〜6.2
負(/りgo))に良く一致する。
をどのように選択するか」、セル誌、第1it巻、第1
10り〜、2j負(/り7g)〕。ここで、父、疫イン
タ7エロンの第/アミノ緻に対応する複合断片中のコド
ンi、t 最初のATGから、20のコドンである。こ
のことは、免疫インタフエロンを唱号化するIJNA配
夕1ノに先行して、コク1向のアミノ酸よりなる信号ポ
リペプチドを決定する配タリが存在し9ることを7]<
股している。この批定の信号配列は、一連のJ庚;水仙
アミノ敵を會南スる。勿馳、疎水牡残曇のこのよりな蓄
積rよ、イ呂号白己夕1」に年も俵H゛ジでめる(ヒー
・ディ一番タヒッドおよびヒーーシー・タイ、1(摸か
らの蛋白質分泌のメカニズム」、イ・イチャー酩、弗−
2ト3巻、第弘33〜3g員(ツタざ0)jo「取免I
JHulli’へ−γに1珂らかに刈応丁ゐヌクレオチ
ド配夕1」6′よ、l弘A 11Q+の1ミノ服を隋ち
一化するヌクレオチドからなっている。インタフエロン
唱号化配夕1j内のコドン用途は、−敷K IQU乳知
mRNAにつき編集されたものLアール・グランタム等
、「暗号化カタロクハ」途およびゲノム仮説」、ヌクレ
イツク会アシッド・リサーチ、第を巻、第Vり〜6.2
負(/りgo))に良く一致する。
勿論、第7図に示したポリペプチドの構造は、生体内酵
素との反応によシ惹起されるポリペプチドに対するイ0
jらの変化、たとえばグリコジル化’f”11k、に入
れていない。したがって、第7凶に示したアミノ敵配列
は生体内で生産されるHuIk’N−rと同一でないこ
とt7解せねはならない。
素との反応によシ惹起されるポリペプチドに対するイ0
jらの変化、たとえばグリコジル化’f”11k、に入
れていない。したがって、第7凶に示したアミノ敵配列
は生体内で生産されるHuIk’N−rと同一でないこ
とt7解せねはならない。
の同定
井y…および^−1’u lでの部分開表によシ予め発
生もれかつEc4pRI リンカ−によるλシャロン弘
Aアームに対して結合されている胎児ヒト染色体L)N
Aの断片から生じたヒブリドファージの収集物は、アー
ル・エム・ローン等ニよシl/l1IRちれている〔セ
ル誌、第7!巻、比iis’y〜74’jil(/り7
♂)〕。この遺伝子収集物t、前記したようなP −標
識D N A f4+入物全試料として使用することに
よシ、その楊での手jlにより選別した〔ダブリス・デ
ィー・ベントyおよびアール・ダプリス・テビス、サイ
エンス誌、14726%、第/lrO〜J’−負(/F
77)+ティー・マニアチス%、セル誌、第1jt巻、
第Atry〜70/負(lり71)〕。コ樵のヒブリ
ド化−陽性ファージクローンを、反後ブラックh製によ
シマニアチス等、上記〕。これらグラツク會λCM弘A
−gHIIF−/およびλCM≠八−gへIIF−λと
命名した。
生もれかつEc4pRI リンカ−によるλシャロン弘
Aアームに対して結合されている胎児ヒト染色体L)N
Aの断片から生じたヒブリドファージの収集物は、アー
ル・エム・ローン等ニよシl/l1IRちれている〔セ
ル誌、第7!巻、比iis’y〜74’jil(/り7
♂)〕。この遺伝子収集物t、前記したようなP −標
識D N A f4+入物全試料として使用することに
よシ、その楊での手jlにより選別した〔ダブリス・デ
ィー・ベントyおよびアール・ダプリス・テビス、サイ
エンス誌、14726%、第/lrO〜J’−負(/F
77)+ティー・マニアチス%、セル誌、第1jt巻、
第Atry〜70/負(lり71)〕。コ樵のヒブリ
ド化−陽性ファージクローンを、反後ブラックh製によ
シマニアチス等、上記〕。これらグラツク會λCM弘A
−gHIIF−/およびλCM≠八−gへIIF−λと
命名した。
λC)i4tA−g)ilIF−/およびλcHah−
gdllF−一の両省は、卵母糺ノ厄甲に注入もれると
i’N−γγ占性會庄じた。!lJl分限が示したとこ
ろでは、一つの1ラツクはλCH+A−g)illF−
/がλC上14(A−gHIIF−λよシもその3′末
端において短かい点で異なつでいる。しかしながら、両
ブラックは生物学的に活性であるため、λCH弘A−4
f(IIF−/に2ける喪失配列はIFN−γ暗号化配
列の/部lたは少なくとも生物学的活性を暗号化する部
分でないと思われる。
gdllF−一の両省は、卵母糺ノ厄甲に注入もれると
i’N−γγ占性會庄じた。!lJl分限が示したとこ
ろでは、一つの1ラツクはλCH+A−g)illF−
/がλC上14(A−gHIIF−λよシもその3′末
端において短かい点で異なつでいる。しかしながら、両
ブラックは生物学的に活性であるため、λCH弘A−4
f(IIF−/に2ける喪失配列はIFN−γ暗号化配
列の/部lたは少なくとも生物学的活性を暗号化する部
分でないと思われる。
さらに、λCM弘A−gHIIF−/およびλCH4′
A−gハIIF’−コの制限分相は、それらがIFNI
に対する暗号化配列内にイントロン金含癩することを示
した。しかしながら、ブラックの陽性生物学的活性は、
走伝子が南アフリカ汲蛙(X5nopts+s Ia
evis )中で正確に処理されることt示している。
A−gハIIF’−コの制限分相は、それらがIFNI
に対する暗号化配列内にイントロン金含癩することを示
した。しかしながら、ブラックの陽性生物学的活性は、
走伝子が南アフリカ汲蛙(X5nopts+s Ia
evis )中で正確に処理されることt示している。
11i’j″J−r活性全暗号化する朱色体逼伝子は細
m宿主中では衆玩しえないが(イρ」故なら、その介在
する配列がこの極の宿主によp正確に処理されえないか
らでるる)、呆色体造伝子はヒト非暗号化領域、イント
ロンおよび暗号化領域が高レベルの表現および生物学的
活性IFN−rへの生箆物の正確な処理に対しN、賛と
なるような成熟核宿主においてIFN−7の主層に対し
極めて有用であることを了解すべきである。
m宿主中では衆玩しえないが(イρ」故なら、その介在
する配列がこの極の宿主によp正確に処理されえないか
らでるる)、呆色体造伝子はヒト非暗号化領域、イント
ロンおよび暗号化領域が高レベルの表現および生物学的
活性IFN−rへの生箆物の正確な処理に対しN、賛と
なるような成熟核宿主においてIFN−7の主層に対し
極めて有用であることを了解すべきである。
活性の向上
蛋白質の生産レベルは3つの主長な因子によシ支配され
る:すなわち、細胞内におけるその遺伝子のコピー数と
、これら遺伝子コピーが転写される効率と、これらが1
訳ちれる効率とである。転写および翻訳(これらが−緒
になって表現tl−栴取する)の5c/J率は、次いで
、カ「望の暗号化配列の前方に通′品位にするヌクレオ
チド配列に依存する。これらのヌクレオチド配タリまた
は赤現制碑配夕(jl、藷に、RNAホリポリーセが反
応して転写r開始δゼゐ位置(ノロモータ配タリ)と、
リホソームがm RN A (%x写の生地物)と和合
しかつ反応して翻訳ケレjμdδせゐL亀とt規定する
。必らずしも全てのこのよ’)A表現制御配列が同等な
効率をもって伽舵すると龜眠らない。したかつて、抽望
蛋白賀のためのl付異的暗号化配列をその誇接ヌクレメ
チド配列から分離し、これらt他の公知の六税制御配夕
1」に融合姑せて一層制レベルの表現r倚るよりに°r
るのが有利である。これは達成されており、ν「たに処
理されたLJNA断片紫より多いコピー数のプラスミド
もしくはバクテリオファージv5等体中に挿入して、
Mll円内迫伝子コピー数′ft増加させ、それにより
嵌玩蛋白負の収率を向上させることができる。
る:すなわち、細胞内におけるその遺伝子のコピー数と
、これら遺伝子コピーが転写される効率と、これらが1
訳ちれる効率とである。転写および翻訳(これらが−緒
になって表現tl−栴取する)の5c/J率は、次いで
、カ「望の暗号化配列の前方に通′品位にするヌクレオ
チド配列に依存する。これらのヌクレオチド配タリまた
は赤現制碑配夕(jl、藷に、RNAホリポリーセが反
応して転写r開始δゼゐ位置(ノロモータ配タリ)と、
リホソームがm RN A (%x写の生地物)と和合
しかつ反応して翻訳ケレjμdδせゐL亀とt規定する
。必らずしも全てのこのよ’)A表現制御配列が同等な
効率をもって伽舵すると龜眠らない。したかつて、抽望
蛋白賀のためのl付異的暗号化配列をその誇接ヌクレメ
チド配列から分離し、これらt他の公知の六税制御配夕
1」に融合姑せて一層制レベルの表現r倚るよりに°r
るのが有利である。これは達成されており、ν「たに処
理されたLJNA断片紫より多いコピー数のプラスミド
もしくはバクテリオファージv5等体中に挿入して、
Mll円内迫伝子コピー数′ft増加させ、それにより
嵌玩蛋白負の収率を向上させることができる。
幾つかの表視制御配列ヶ上記のように使用することかで
きる。これら線、メペレータ、ツロ七−タ、イー・コリ
の乳糖オペロン(+−laa 糸J )のリポソーム結
合および反応配列(たとえばシャインーダルガルノ配列
などの配夕IJk包含するン、イー・コリのトリブトフ
ァン合戟酵累糸(rtrp糸」)の対比・する配列、フ
ァージλの主要なオペレータおよびプロモータ(上部と
+=様に0LPLおよびOにPル)、繊維状単−鎮L)
NAファージの吊り御領域、または原始根もしくは成熟
核細胞およびそのウィルスの遺伝子の表現を1li14
御するその他の配列、またはその組合せを包含する。
きる。これら線、メペレータ、ツロ七−タ、イー・コリ
の乳糖オペロン(+−laa 糸J )のリポソーム結
合および反応配列(たとえばシャインーダルガルノ配列
などの配夕IJk包含するン、イー・コリのトリブトフ
ァン合戟酵累糸(rtrp糸」)の対比・する配列、フ
ァージλの主要なオペレータおよびプロモータ(上部と
+=様に0LPLおよびOにPル)、繊維状単−鎮L)
NAファージの吊り御領域、または原始根もしくは成熟
核細胞およびそのウィルスの遺伝子の表現を1li14
御するその他の配列、またはその組合せを包含する。
したがって、適当な福主における特定ポリペプチドの生
産を向上させるには、そのポリペプチドを暗号化する遺
伝子を前記と同様にdA製し、これを組換DNA分子中
へその従前の表現制御配列に近接して或いは上目ピで改
善された表現g+lJ御配列の1つの1lJIJ御1で
挿入することができる。
産を向上させるには、そのポリペプチドを暗号化する遺
伝子を前記と同様にdA製し、これを組換DNA分子中
へその従前の表現制御配列に近接して或いは上目ピで改
善された表現g+lJ御配列の1つの1lJIJ御1で
挿入することができる。
この種の方法は当業界で公知である。
翻訳の効率を向上させる他の方法は、化学的または酵素
的にし11製された。J−リボヌクレオチドを開始コド
ンの前に挿入することである。このび第、2構造か倚ら
れる13 よジ1)・細には、−始AUGコドンが各局
に接近しりる位it(すなわち、第、2@造により地閉
δイしていない)においてヘヤビ/の頂部にまたは仙の
年−知領域に生ずるよう配りリヲ設81することができ
る。妊らに、上記シャインータ゛ルカルノ断片の位fM
kよひ配列も同様に最適化させることができる。m R
N Aの一般構造(折曲け)の1仮性が轍告芒gている
しティー・イセレンタントおよびタブリス・ファイエ#
* 「rnRNA C7)14.2mm’Ji”よび
翻訳囲貼の効率−1、ジーン関、第り巻、第/〜/−負
(/りgo))。
的にし11製された。J−リボヌクレオチドを開始コド
ンの前に挿入することである。このび第、2構造か倚ら
れる13 よジ1)・細には、−始AUGコドンが各局
に接近しりる位it(すなわち、第、2@造により地閉
δイしていない)においてヘヤビ/の頂部にまたは仙の
年−知領域に生ずるよう配りリヲ設81することができ
る。妊らに、上記シャインータ゛ルカルノ断片の位fM
kよひ配列も同様に最適化させることができる。m R
N Aの一般構造(折曲け)の1仮性が轍告芒gている
しティー・イセレンタントおよびタブリス・ファイエ#
* 「rnRNA C7)14.2mm’Ji”よび
翻訳囲貼の効率−1、ジーン関、第り巻、第/〜/−負
(/りgo))。
さらに、所望生成物の細胞収率にお・りる増加は、細胞
中に利用しうる迫伝子数の増加に依存する。これは、H
uJFN−γ逼仏イ(その転写および翻訳制御巣子を伴
いまたは伴わす゛に)をよシ多いコピー数の7″ラスミ
ド中へi 7cは温度制御きれたコピー数のプラスミド
(すなわち。
中に利用しうる迫伝子数の増加に依存する。これは、H
uJFN−γ逼仏イ(その転写および翻訳制御巣子を伴
いまたは伴わす゛に)をよシ多いコピー数の7″ラスミ
ド中へi 7cは温度制御きれたコピー数のプラスミド
(すなわち。
プラスミドのコヒー数が温度上昇後に増力Uするような
突然f異を竹なうプラスミド)中へ挿入して達成するこ
とができるしとm一つ−リン寺、[クローン化逼伝子お
よびその主産物の増殖に対する温展仏存性コヒー数を有
するグラスミド」。
突然f異を竹なうプラスミド)中へ挿入して達成するこ
とができるしとm一つ−リン寺、[クローン化逼伝子お
よびその主産物の増殖に対する温展仏存性コヒー数を有
するグラスミド」。
ジーン恥、R46巻、第り/〜101.負(/り7タリ
〕。
〕。
代案として、逼伝子短の堀カロは、たとえば。
前Bじの方法で処理された組換L)NA分子を雛型バク
テリオファージλ中に挿入することにより。
テリオファージλ中に挿入することにより。
最も簡単にはプラスミドを制限酵素で消化して線状分子
【得、これを次いでル1」限ファージλクローン化ベヒ
クル〔たトエば、エヌ・イー・ムレ−等、[試験管内組
裸体の回収を簡単化さぜるλファージJ 、 JVio
1.Gen、 Genet 、、 f、 / 50巻
、第33〜67負(/り77)およびエヌ・イー・ムレ
−等、[バクテリオファージTμからのDNA リカー
ゼ遺伝子の分子クローン化]、J。
【得、これを次いでル1」限ファージλクローン化ベヒ
クル〔たトエば、エヌ・イー・ムレ−等、[試験管内組
裸体の回収を簡単化さぜるλファージJ 、 JVio
1.Gen、 Genet 、、 f、 / 50巻
、第33〜67負(/り77)およびエヌ・イー・ムレ
−等、[バクテリオファージTμからのDNA リカー
ゼ遺伝子の分子クローン化]、J。
Mo1.Biolo、第/3λ巻、あ弘り3〜J−03
頁(/り7り)に=e載された型のもの」 およびDN
Aリガーゼと共に培養して生成された組換L)NA分子
と混合することによシ達成できる。次いで、1カ望の組
換ンアージを前記と同様に選択し、これを使用してイー
働コリの′4cj主侑81、r浴原化さ一部る。
頁(/り7り)に=e載された型のもの」 およびDN
Aリガーゼと共に培養して生成された組換L)NA分子
と混合することによシ達成できる。次いで、1カ望の組
換ンアージを前記と同様に選択し、これを使用してイー
働コリの′4cj主侑81、r浴原化さ一部る。
したがって、本発明の(甲人物L)NAiSv、tコタ
フラスミドから取シ用して、これをMiJ乙じと1jす
(kに他の表現ベクター申へ仲人し、そしてこれらベク
ターを前hCと同様に独々のイt1王で使用して1に’
N−γを貼り化する遺伝子のり玩を改善しうることを了
解ずべきである。
フラスミドから取シ用して、これをMiJ乙じと1jす
(kに他の表現ベクター申へ仲人し、そしてこれらベク
ターを前hCと同様に独々のイt1王で使用して1に’
N−γを貼り化する遺伝子のり玩を改善しうることを了
解ずべきである。
また、IFN−r活性を示すポリペプチド(本発明によ
p調製)は、融合蛋白質(たとえは分泌を指弔する原始
根もしくは成ンV1核N−木端セグメントに結合)とし
て、グロインタフェロン(たとえば、分泌の隙間h−a
れうるインタフエロン信号配列の全部筐たは一部から出
発する)として、或いは成熟インタフェロン(表現およ
び分泌の際の初ル1メチオニンを含む任刈、の異質アミ
ノ酸の開裂による)として、或いはf−mat・−イン
タフェロンとしても1候しうること全了解すべきである
。本発明において一つの’f−tに上用なポリペプチド
は、容易に一散惑れるアミノ酸またはアミン末端に結合
された一連のアミノ酸金有する成熟免疫インタフエロン
であろう。この構造は適当な宿主における蛋白質の合成
を可能にし、ここで&熟免疫インタフエロン中に存在し
ない動始1ム号が心安と熟れ1次いで余分のアミノ酸が
開裂して成熟免疫インタフエロンを生成する。
p調製)は、融合蛋白質(たとえは分泌を指弔する原始
根もしくは成ンV1核N−木端セグメントに結合)とし
て、グロインタフェロン(たとえば、分泌の隙間h−a
れうるインタフエロン信号配列の全部筐たは一部から出
発する)として、或いは成熟インタフェロン(表現およ
び分泌の際の初ル1メチオニンを含む任刈、の異質アミ
ノ酸の開裂による)として、或いはf−mat・−イン
タフェロンとしても1候しうること全了解すべきである
。本発明において一つの’f−tに上用なポリペプチド
は、容易に一散惑れるアミノ酸またはアミン末端に結合
された一連のアミノ酸金有する成熟免疫インタフエロン
であろう。この構造は適当な宿主における蛋白質の合成
を可能にし、ここで&熟免疫インタフエロン中に存在し
ない動始1ム号が心安と熟れ1次いで余分のアミノ酸が
開裂して成熟免疫インタフエロンを生成する。
ポリペプチドのこれら異なる形態の収率は。
上内ピ手顔0いずれかまたけその組合せによシn」上さ
せることができる。さらに1本1)NA配りりに使用さ
れるコドンの幾つかまたは全部の代りに、他のコドンを
使用することもできる。これらの置換コドンは、代替さ
れたコドンにより暗号化されるものと同じアミノ酸を暗
号化するが。
せることができる。さらに1本1)NA配りりに使用さ
れるコドンの幾つかまたは全部の代りに、他のコドンを
使用することもできる。これらの置換コドンは、代替さ
れたコドンにより暗号化されるものと同じアミノ酸を暗
号化するが。
よシ高い収率でポリペプチドを生産することができる。
或いは、アミノ酸を換またはよp長い%L<はより短い
14 u I F N −r関連ポリペプチドtもたら
すコドンの7個もしくは組合せを変えると、その性質を
有益に俊化させることができる(たとえは、安に性?垢
太ちせ、浴解鼓勿ル太塾せ、抗ウィルス油性金1%大さ
せ、−9j−A廿成酵累枯性を小太させ寸たは伯主竹異
性範囲を拡大6せる〕。
14 u I F N −r関連ポリペプチドtもたら
すコドンの7個もしくは組合せを変えると、その性質を
有益に俊化させることができる(たとえは、安に性?垢
太ちせ、浴解鼓勿ル太塾せ、抗ウィルス油性金1%大さ
せ、−9j−A廿成酵累枯性を小太させ寸たは伯主竹異
性範囲を拡大6せる〕。
板抜に、本発明Q組候DN人分子により生糺δれるポリ
ペプチドの油性は、本発明の種間を逸脱することなく周
知手段により、不発明の13NA配夕1jもしくはポリ
ペプチドを断片化、改変または誘導体化して向上させる
ことができる。
ペプチドの油性は、本発明の種間を逸脱することなく周
知手段により、不発明の13NA配夕1jもしくはポリ
ペプチドを断片化、改変または誘導体化して向上させる
ことができる。
たとえは、他のインタフエロンを有するヒブリドを、適
当な宿主にてゑ伝子レベルで調製しかつ永埃さぜること
ができ、或いは化学合成法によシ蛋白質レベルで行なう
こともできる。
当な宿主にてゑ伝子レベルで調製しかつ永埃さぜること
ができ、或いは化学合成法によシ蛋白質レベルで行なう
こともできる。
本発明のポリペプチドの収率を向上させる方法の一例を
第り図に示す。これはpL温度訪発性の総状糸を使用す
ることを含む〔イーーレマウト勢、ジーン誌、第/よ巻
、第8/〜り3頁(/りg/)〕。この栴造は、成熟γ
インタフエロンの第1アミノ酸を暗号化するヌクレオチ
ドトリクレノ)(TGT)に直接融合ちれたATG出発
コドンを喘・似とし1こ。この構成はf’ −Mel
−1’N−γ全生産する。しかしながら、初期メチオニ
ンはイー・コリ自身によジ表杉りの際に関裂されまたは
後に除去されて成熟11”N−γを生成する。
第り図に示す。これはpL温度訪発性の総状糸を使用す
ることを含む〔イーーレマウト勢、ジーン誌、第/よ巻
、第8/〜り3頁(/りg/)〕。この栴造は、成熟γ
インタフエロンの第1アミノ酸を暗号化するヌクレオチ
ドトリクレノ)(TGT)に直接融合ちれたATG出発
コドンを喘・似とし1こ。この構成はf’ −Mel
−1’N−γ全生産する。しかしながら、初期メチオニ
ンはイー・コリ自身によジ表杉りの際に関裂されまたは
後に除去されて成熟11”N−γを生成する。
この構造は、プレーγインタフエロンを略号化するDN
A配列を治するグラスミド(MPIa)(どのヌクレオ
チドもメチル化されず、したがってその配列におけるN
墾鶴部位を餉鎖しないようイー・コリの9ml園株から
侍たもの)をΔひlによシ制限してiaされた。成熟r
−IF’Nの最初の弘つのコドンを喪失している得られ
た断片を、次の順序 AGCTTG’l’TACTGCCAt;ACAATG
ACGG’l”CCTG を鳴する合成リンカ−へ結合させた。このリンカ−は/
端部に坦ndll残部を肩しかつ他端部に入り」残部を
弔すると共に、成熟γインタフェロンの最初の弘個のア
ミノ酸に対する暗号化配タリ(Tu’rTACTGCC
AG )を弔する。次いで。
A配列を治するグラスミド(MPIa)(どのヌクレオ
チドもメチル化されず、したがってその配列におけるN
墾鶴部位を餉鎖しないようイー・コリの9ml園株から
侍たもの)をΔひlによシ制限してiaされた。成熟r
−IF’Nの最初の弘つのコドンを喪失している得られ
た断片を、次の順序 AGCTTG’l’TACTGCCAt;ACAATG
ACGG’l”CCTG を鳴する合成リンカ−へ結合させた。このリンカ−は/
端部に坦ndll残部を肩しかつ他端部に入り」残部を
弔すると共に、成熟γインタフェロンの最初の弘個のア
ミノ酸に対する暗号化配タリ(Tu’rTACTGCC
AG )を弔する。次いで。
倚ら11.fc、 11片盆シ竺H1で開表6−1(こ
の部位はIFN−γllk’i号化配列の昇化配列在す
る)、仄いでtrpンロモータヲ4′Jするグラスミド
の世す111部位とRam)iI部位との間に挿入する
(第218!!、l)。
の部位はIFN−γllk’i号化配列の昇化配列在す
る)、仄いでtrpンロモータヲ4′Jするグラスミド
の世す111部位とRam)iI部位との間に挿入する
(第218!!、l)。
次いで、侍しれたフラスミド忙易jす1uおよび4復R
1によりυ6絞8ゼ、垂1する木端會S/によシ除去し
た。こ!しらの保作は、些>oRI−坦すlロノ丁片と
1.)≧:el≧、 Rl市り1混およびS / IN
j化によジ生じたATG開始コドンの直後に融合されて
いるIFN−γの最初のアミノ酸を暗号化するトリフレ
ット(TG’l’)との8り除勿もたらした。
1によりυ6絞8ゼ、垂1する木端會S/によシ除去し
た。こ!しらの保作は、些>oRI−坦すlロノ丁片と
1.)≧:el≧、 Rl市り1混およびS / IN
j化によジ生じたATG開始コドンの直後に融合されて
いるIFN−γの最初のアミノ酸を暗号化するトリフレ
ット(TG’l’)との8り除勿もたらした。
この表挽ベクターからtrpフロモータ(Il″餘去し
かつこれfPL7’oモータで文俟するため、 pPi
、aコ36(ヨーロッパを針山に第4’/7A7号に記
載)を拍ヱR1で制限し、これを残部(クレノー)に充
填した。次いで、DNA配列f:、B鼾すiIで制限し
、この配列を上記グラスミドからのIh”N−rtJk
号化配列t−iするHpa l −Baml−1f〜r
片と組合せた(第り図)。
かつこれfPL7’oモータで文俟するため、 pPi
、aコ36(ヨーロッパを針山に第4’/7A7号に記
載)を拍ヱR1で制限し、これを残部(クレノー)に充
填した。次いで、DNA配列f:、B鼾すiIで制限し
、この配列を上記グラスミドからのIh”N−rtJk
号化配列t−iするHpa l −Baml−1f〜r
片と組合せた(第り図)。
次いで、イー・コリ5GII04L4L(pc/Irj
7)を形質転換させ、このンロテアーゼマイナス菌株は
本発明のIFN−1’宮イイP1.表現ベクターと共に
感温性レプレッサを弔する。この形質転換ちれた菌株e
よ、IFN−γの活性を示すホリベグチドを全細力民蛋
白貝の約/J%のレベルで生産した。
7)を形質転換させ、このンロテアーゼマイナス菌株は
本発明のIFN−1’宮イイP1.表現ベクターと共に
感温性レプレッサを弔する。この形質転換ちれた菌株e
よ、IFN−γの活性を示すホリベグチドを全細力民蛋
白貝の約/J%のレベルで生産した。
さらに、10」じjJNA配列と嚢状ベクターpP1.
cλざ(レマウト等、上記)とを1史用して同様な構造
を作成した。この構造は、IFN−γ収率が若干低いた
め、従前のm造より好ましくない。
cλざ(レマウト等、上記)とを1史用して同様な構造
を作成した。この構造は、IFN−γ収率が若干低いた
め、従前のm造より好ましくない。
しかしながら、これはよp良好な長ルj安定性を有する
。その安定性のため、この培養物(イー・コリに/コム
111△trp(pPLc、2g−HIII;’6.2
))全アメリカン会タイプ・カルチャー・コレクション
(下記)に物、h七した。
。その安定性のため、この培養物(イー・コリに/コム
111△trp(pPLc、2g−HIII;’6.2
))全アメリカン会タイプ・カルチャー・コレクション
(下記)に物、h七した。
動9勿細j厄におけるIFN−γの表現泪11菌生圧さ
!L1シたがってクリコシル化されていないIFN−γ
は缶物学的に活性であるが。
!L1シたがってクリコシル化されていないIFN−γ
は缶物学的に活性であるが。
が示δれているしフィ・り−・イラン%、ProC。
Nat l、 Aead、 Sai、 U S A 、
躬7gも、第/lO/〜os)<<iyざ/)〕。し
かしなから、グリコジル化蛋白負は1だ光分に有性化3
れていない。
躬7gも、第/lO/〜os)<<iyざ/)〕。し
かしなから、グリコジル化蛋白負は1だ光分に有性化3
れていない。
したがって1本発明りLJ N A 61;タリを使用
してクリコシル化IFN−γを動物紅胞甲に生産も→す
て、これをn1Jtie t、たイ41々の治む(およ
び臨床方法ふ゛よひ組成物に使用するのか41福であろ
う。
してクリコシル化IFN−γを動物紅胞甲に生産も→す
て、これをn1Jtie t、たイ41々の治む(およ
び臨床方法ふ゛よひ組成物に使用するのか41福であろ
う。
異賀咄乳知現ち。に赴いてクローン化遺伝子を表現さぜ
うる幾ねかのクローン化ベクターが現存する(たとえは
、ビー1ジエー慢ザウザンおよびビー・ベルブ、J、
Mo1.Appl、Gonet、、第1巻、第327〜
グ/負(7か−);ニス・スブラ−r =%、 Mo
1.Ce目 Biol、、 M4/ %、j3F!il
l〜2弘負(/りgi);アール・ジエーーカウフマン
およびビー・ニー囃シャーン、 Mo1.Ce1l。
うる幾ねかのクローン化ベクターが現存する(たとえは
、ビー1ジエー慢ザウザンおよびビー・ベルブ、J、
Mo1.Appl、Gonet、、第1巻、第327〜
グ/負(7か−);ニス・スブラ−r =%、 Mo
1.Ce目 Biol、、 M4/ %、j3F!il
l〜2弘負(/りgi);アール・ジエーーカウフマン
およびビー・ニー囃シャーン、 Mo1.Ce1l。
Biol、(出版中)〕。本出願人は、ジヒドロホレー
トレタクターゼ(DHF’R−)に不足している支那ハ
ムスター卯画胞(Ci−1o)の同11モ形賀転換を宮
む糸(ジー会つルラウブおよびエル・ニー・ケイシフ
、 Proc、Nat l、 Acad、 Sai、U
S A。
トレタクターゼ(DHF’R−)に不足している支那ハ
ムスター卯画胞(Ci−1o)の同11モ形賀転換を宮
む糸(ジー会つルラウブおよびエル・ニー・ケイシフ
、 Proc、Nat l、 Acad、 Sai、U
S A。
第77巻、 第172/l 〜JOQ (/り(fO)
)k、2種の7ラスミドすなわちpAdDSV(A)−
3〔アール拳ジエーΦカウフマンおよびビー・ニー・シ
ャープ、Mo 1.Ce l 1.Bio l、 (出
版中)Jおよびヒト1に″N−γ全暗号化するpsV、
2−IFN−γと共に使用するよう選択した(第70図
)。
)k、2種の7ラスミドすなわちpAdDSV(A)−
3〔アール拳ジエーΦカウフマンおよびビー・ニー・シ
ャープ、Mo 1.Ce l 1.Bio l、 (出
版中)Jおよびヒト1に″N−γ全暗号化するpsV、
2−IFN−γと共に使用するよう選択した(第70図
)。
CHO,DIIFR−細胞(ビー・ニー・シャープの4
f賜、この同時形質転換に使用)を、/Qチ胎児生血f
*(Fe2)およびケンタマイシン(jθμ51/l1
l)を細光したα最少必須培jlp。
f賜、この同時形質転換に使用)を、/Qチ胎児生血f
*(Fe2)およびケンタマイシン(jθμ51/l1
l)を細光したα最少必須培jlp。
(ME〜l)(ギブコ社、カタログ腐07.2−/りo
o)を含廟する組絨培養フラスコ(ギブコ社)中で37
℃に維持した。形寅私換体を上記のようにかつαMEM
(リボヌクレオシドとテオキシリボヌクレメシドとを欠
如する(キブコ社、カタログA607コー2ooo))
および10%透析FC8において培養した。後者の培地
金1選択培地」とhう。
o)を含廟する組絨培養フラスコ(ギブコ社)中で37
℃に維持した。形寅私換体を上記のようにかつαMEM
(リボヌクレオシドとテオキシリボヌクレメシドとを欠
如する(キブコ社、カタログA607コー2ooo))
および10%透析FC8において培養した。後者の培地
金1選択培地」とhう。
クリコシル化IFN−γの衣睨1(1更川した” N’
も”tl シフ7 スミF’ (1) S V 、!
−1k’ N−γ) f、 p1411F−8V−γ+
o (アール嗜テホス等、ヌクレイツク・アシッド・リ
ザーチ、第70巻、第一4tざ7〜.fO1貝(/2ざ
−VJ?c9au JA [1FN−1の3′非暗号化
饋城に位置する識別部位]により制限して〜=1!した
し第6図J0 I FN−rを含廟するイくIられた約
rs。
も”tl シフ7 スミF’ (1) S V 、!
−1k’ N−γ) f、 p1411F−8V−γ+
o (アール嗜テホス等、ヌクレイツク・アシッド・リ
ザーチ、第70巻、第一4tざ7〜.fO1貝(/2ざ
−VJ?c9au JA [1FN−1の3′非暗号化
饋城に位置する識別部位]により制限して〜=1!した
し第6図J0 I FN−rを含廟するイくIられた約
rs。
塩基対の断片を蔗糖勾配上で鞘製し、次いでこれを部分
Bam If l Ig化pPLc、2ざ33衣机ベク
ター中に結合6せた。表現ベクターp P L c、2
♂33はI) P L aλg〔ヨーロッパ9子許出願
第≠1767号〕 と同一であるが、ただし合成リンカ
−(陽)II−プ鰺ニ一旦all−秒■−襲」I −X
ba I −Pst I −BamHI ) 7i p
PLo、2J’の独特の旦馳)11部位〔レマウト等、
ジーン誌、(出版中)〕中へ仲人した。イ1られたIF
I″J−γ金山の組換DNA分子f p P L *
S A −I F N−γと命名した。
Bam If l Ig化pPLc、2ざ33衣机ベク
ター中に結合6せた。表現ベクターp P L c、2
♂33はI) P L aλg〔ヨーロッパ9子許出願
第≠1767号〕 と同一であるが、ただし合成リンカ
−(陽)II−プ鰺ニ一旦all−秒■−襲」I −X
ba I −Pst I −BamHI ) 7i p
PLo、2J’の独特の旦馳)11部位〔レマウト等、
ジーン誌、(出版中)〕中へ仲人した。イ1られたIF
I″J−γ金山の組換DNA分子f p P L *
S A −I F N−γと命名した。
次いで、この分子(!−H1ndlllおよびBamH
Iで制限してそのIFN−r宮令の断片奮阜離した。こ
の断片をp8Vコーdbfrの世nd出/Bgl l
1611184体中へ結合して、この)2スミド中のH
i−n d ill / Bg l Qねす与dbfr
c DNA担持断片をIFN−r担狩〜r片で飯挾し
た。この結合に使用し7ヒ改震PSVλ−dbfr(ベ
ルブおよびカナm=の寄贈)はpsV−,2dbfrと
同一であるが〔ニス自すプラマニ等、 ’Mo1.Ce
1l。
Iで制限してそのIFN−r宮令の断片奮阜離した。こ
の断片をp8Vコーdbfrの世nd出/Bgl l
1611184体中へ結合して、この)2スミド中のH
i−n d ill / Bg l Qねす与dbfr
c DNA担持断片をIFN−r担狩〜r片で飯挾し
た。この結合に使用し7ヒ改震PSVλ−dbfr(ベ
ルブおよびカナm=の寄贈)はpsV−,2dbfrと
同一であるが〔ニス自すプラマニ等、 ’Mo1.Ce
1l。
Biol、、 第1巻、第Ij参〜6≠負(iyri
) 〕、ただしp8V、2−dhfr 0j(99R
I−、Pvuil iQi片を有する原始根配列はpM
Lの彫碧R1−p見l■断片、すなわち哺乳類細胞にお
ける複・製に対し阻止的な配列を含七しないpBRJ、
2.2の11」除突然変異株〔エム・ラスキーおよびエ
ム・ボッチャン、ネイチャー誌、第293巻、第72〜
1/jtC/り1/)〕で置換した。したがって。
) 〕、ただしp8V、2−dhfr 0j(99R
I−、Pvuil iQi片を有する原始根配列はpM
Lの彫碧R1−p見l■断片、すなわち哺乳類細胞にお
ける複・製に対し阻止的な配列を含七しないpBRJ、
2.2の11」除突然変異株〔エム・ラスキーおよびエ
ム・ボッチャン、ネイチャー誌、第293巻、第72〜
1/jtC/り1/)〕で置換した。したがって。
得られたグラスミドpSV−IFN−γは、8V4LO
早期フロモータの直下流かつSV弘θ切断部位およびホ
リアデニル化イざ号の上ηLのIFN−r暗号化配列を
室上する(第/θ凶)。
早期フロモータの直下流かつSV弘θ切断部位およびホ
リアデニル化イざ号の上ηLのIFN−r暗号化配列を
室上する(第/θ凶)。
同時形質転換に使用した他の7ジスミトは、pAdi)
J4SV(A、)−J (ヒー・シャープのを贈)とし
た。これはねすみD 1i F R暗号化配列をせ刹す
る(第io図)。こgは細胞全171−IFR”六机型
に形負転侠し、このことは培択培地(すなわち、リボヌ
クレオシド2よひテオキシリホヌクレオシドを久μ口す
る培地)VCおいてR’4 Knする形翼転換体の能力
により示3れる。
J4SV(A、)−J (ヒー・シャープのを贈)とし
た。これはねすみD 1i F R暗号化配列をせ刹す
る(第io図)。こgは細胞全171−IFR”六机型
に形負転侠し、このことは培択培地(すなわち、リボヌ
クレオシド2よひテオキシリホヌクレオシドを久μ口す
る培地)VCおいてR’4 Knする形翼転換体の能力
により示3れる。
グラハムおよびパンデルニブによp記載されたと同@な
方法金使用して、ciio細胞elQJ時形質転換させ
た〔エフ・エル・グラハムおよびニー・ジエー・パンデ
ルニブ、パイロロジー。
方法金使用して、ciio細胞elQJ時形質転換させ
た〔エフ・エル・グラハムおよびニー・ジエー・パンデ
ルニブ、パイロロジー。
第jμ巻、第j″36〜J5’j*(/P J))。
先ず2組織培養フラスコ(/、2!継)へjx105個
の細胞/フラスコを2j時間接権した後、これら細胞へ
DNAtカロえた。−釉のグラスミド(上記ンを4嘔H
1またはシュKlに↓シ開腋させ、1裂1)NAの適当
値(辿?6、金部で豹10μg)t−柚々の相対比で混
合しくpSV−IFN−r: pAdDJ48V(A)
−J i / : / 。
先ず2組織培養フラスコ(/、2!継)へjx105個
の細胞/フラスコを2j時間接権した後、これら細胞へ
DNAtカロえた。−釉のグラスミド(上記ンを4嘔H
1またはシュKlに↓シ開腋させ、1裂1)NAの適当
値(辿?6、金部で豹10μg)t−柚々の相対比で混
合しくpSV−IFN−r: pAdDJ48V(A)
−J i / : / 。
10:lおよびλzti)、このDNA’iiエタノー
ルで沈澱させ、これを−00μlの1mM)リス−)i
c/ (p)17.コ)と0.1mMのHE P E
B(−7,2)とに再懸濁させ、そして得られた浴液に
一2jOj’l (λx HBB : 210mM N
vrCe +J 、(7m M Na 2 M P 0
4 i〕00mhl HWPh;8(pH7,−2))
へゆつく夛ピペットで加えながら。
ルで沈澱させ、これを−00μlの1mM)リス−)i
c/ (p)17.コ)と0.1mMのHE P E
B(−7,2)とに再懸濁させ、そして得られた浴液に
一2jOj’l (λx HBB : 210mM N
vrCe +J 、(7m M Na 2 M P 0
4 i〕00mhl HWPh;8(pH7,−2))
へゆつく夛ピペットで加えながら。
HBS俗液を連続的に通気することによシ、細胞へ加え
るDNAをル〜製した。
るDNAをル〜製した。
燐酸カルシウム−DNA沈澱を室温にて30分間生成さ
せた後、!00μE懸濁物を予め増−殖培地を除去した
単一層へ加えた。フラスコを傾斜嘔せて、全単一層上へ
の沈澱物の消散を確保した。
せた後、!00μE懸濁物を予め増−殖培地を除去した
単一層へ加えた。フラスコを傾斜嘔せて、全単一層上へ
の沈澱物の消散を確保した。
フラスコを室温で30分間放臘した後、5m6の培地を
加えそしてこのフラスコtl−37℃にて弘時間培養し
た。次いで、io%グリセリンを言肩する培地で帥1胞
を処理し、そしてこれらを培地で2回洗浄した。約2日
間後、細胞は融合に達した。次いでこれらを送択培地中
へ柩継きしく1=i0)h この迫択培JI!Iを5日
り隔で補充し、Ill?、I−2過間後に年−の未洛盆
鉄察することができた。これら推定の形賀転俟体倉りロ
ーン化シリンタ中でトリプシン処理し、そしてこれらt
小型フラスコ(、lt7M)へ杉し/ζ。
加えそしてこのフラスコtl−37℃にて弘時間培養し
た。次いで、io%グリセリンを言肩する培地で帥1胞
を処理し、そしてこれらを培地で2回洗浄した。約2日
間後、細胞は融合に達した。次いでこれらを送択培地中
へ柩継きしく1=i0)h この迫択培JI!Iを5日
り隔で補充し、Ill?、I−2過間後に年−の未洛盆
鉄察することができた。これら推定の形賀転俟体倉りロ
ーン化シリンタ中でトリプシン処理し、そしてこれらt
小型フラスコ(、lt7M)へ杉し/ζ。
先ず最初に、6柚の同時展り転換(4偲R1/沖1(1
:それぞれDNA比/:/、/θ:/および−2,t:
/)から/3!稙の形賀転換体を14!−離した。これ
ら形賀転倶体の年一層から培地の試料を選別して、イン
タ7エロンをm&的に分泌する形JX転俟体を検出した
。
:それぞれDNA比/:/、/θ:/および−2,t:
/)から/3!稙の形賀転換体を14!−離した。これ
ら形賀転倶体の年一層から培地の試料を選別して、イン
タ7エロンをm&的に分泌する形JX転俟体を検出した
。
これらの分析は、脳心1/I氷ウィルス(NMC)のヒ
)FS−グ繊り芽細胞に対するai胞蕎性効果を抑制す
るrインタ7エロンの能力に基づいた。この仕上〔のた
め、増焔培地における試料の一連の布釈物(/ :J)
を調製し、これらをFS−≠細胞のサブ融合単一層を含
むざ×l−2穴のミクロ測定板に移した。37゛Cにて
2μ時1L4jの培養後、壇殖培地を父倶しそしてE
kl Cの/Sを各穴へ加えた。さらに2≠時間培簀し
た後、プレートを観察し、細胞に関するウィルスの細胞
#i性幼来に約する保護極度に従って個々の穴を評価し
た。さらに、IIi’N−γの保存浴液を各穴につぎ内
部標準として使用した。この分町結来金1−夾験至単位
」すなわち細胞動性効果の10%抑!lJをもたらす希
釈の逆数として表わす。この「実験室単位」をナショナ
ル・インステチュート・オプ・ヘルスのヒト白血球比較
インタ7エoン(G−0,23−タoi−zs7)と比
較した。I li’ N−αの7国島単位は、この分析
方式におけるIFN−γのlQ「夾数室年位」に#1は
等しい。
)FS−グ繊り芽細胞に対するai胞蕎性効果を抑制す
るrインタ7エロンの能力に基づいた。この仕上〔のた
め、増焔培地における試料の一連の布釈物(/ :J)
を調製し、これらをFS−≠細胞のサブ融合単一層を含
むざ×l−2穴のミクロ測定板に移した。37゛Cにて
2μ時1L4jの培養後、壇殖培地を父倶しそしてE
kl Cの/Sを各穴へ加えた。さらに2≠時間培簀し
た後、プレートを観察し、細胞に関するウィルスの細胞
#i性幼来に約する保護極度に従って個々の穴を評価し
た。さらに、IIi’N−γの保存浴液を各穴につぎ内
部標準として使用した。この分町結来金1−夾験至単位
」すなわち細胞動性効果の10%抑!lJをもたらす希
釈の逆数として表わす。この「実験室単位」をナショナ
ル・インステチュート・オプ・ヘルスのヒト白血球比較
インタ7エoン(G−0,23−タoi−zs7)と比
較した。I li’ N−αの7国島単位は、この分析
方式におけるIFN−γのlQ「夾数室年位」に#1は
等しい。
さらに、この分析には’INの比較形質転換体(それぞ
れプラスミドpsV2−IPN−γおよヒpAdL)J
7SV(A)−j (7)E(IORI オJ:ひ坂>
mHI消化物)を使用した。これら比較のいずれを使用
しても’1)HFu+形賀転換体r!、得らレナカツf
C0gらに、?A化rlAdl)、z4SV(A)−J
1)NAのみを使用した形5!L転換体は一例らの
検出しうるインタフェロンr占注τ庄じながった。
れプラスミドpsV2−IPN−γおよヒpAdL)J
7SV(A)−j (7)E(IORI オJ:ひ坂>
mHI消化物)を使用した。これら比較のいずれを使用
しても’1)HFu+形賀転換体r!、得らレナカツf
C0gらに、?A化rlAdl)、z4SV(A)−J
1)NAのみを使用した形5!L転換体は一例らの
検出しうるインタフェロンr占注τ庄じながった。
これら分析のね果を第1衣にがり−。
、2j:/ EaoRI 41
2 jBamHI /
j /10:/ Ecoktエフ、2
/□Bam)11 /l /4’
j/:/ EaoRl /2
/j /jBamHI lt
6 13(il psV、2−IFN−7”/p
AdD、24sV(A)−3(2) これは、所定レ
ベルのI FN−rを生産する形質転換体の数を示す。
2 jBamHI /
j /10:/ Ecoktエフ、2
/□Bam)11 /l /4’
j/:/ EaoRl /2
/j /jBamHI lt
6 13(il psV、2−IFN−7”/p
AdD、24sV(A)−3(2) これは、所定レ
ベルのI FN−rを生産する形質転換体の数を示す。
給米Qよ夾験呈牟位/祷として穴わず。
最高の生産性形質転換体の2批τ泗択し、こ扛らをE−
10BおよびE−iocと翻名した。イロ」故なら、仁
れらは両省とも旦叩R1およびIO:/のDNA比を用
いて!14#!シたからである。しかしながら、形質転
換体tS択する紬の非選択培地におけるλ日間の細胞培
養は、単離形翼転換体を少数の形貴転換M胞から生ぜし
めたでめろう。したがって、を定DNA比の意義は確か
でない。
10BおよびE−iocと翻名した。イロ」故なら、仁
れらは両省とも旦叩R1およびIO:/のDNA比を用
いて!14#!シたからである。しかしながら、形質転
換体tS択する紬の非選択培地におけるλ日間の細胞培
養は、単離形翼転換体を少数の形貴転換M胞から生ぜし
めたでめろう。したがって、を定DNA比の意義は確か
でない。
これらのII+iii胞糸は、約jO,000jab単
位/I FN−1mtを与えた。これは、リンパ球を刺
戟する古典的方法によるHulFN−γ生産に匹敵する
が、さらにこれは構成的であって鶴発f!:例ら必嶽と
しないという利点を有する。本発明の方法によるIFN
−γの生産は、さらに、IFN−rが細胞培養の誘発に
よる従来のIFN−γ生産の場合と異なシ他のリンフ才
力インによp汚染されないというオtlAをも壱する。
位/I FN−1mtを与えた。これは、リンパ球を刺
戟する古典的方法によるHulFN−γ生産に匹敵する
が、さらにこれは構成的であって鶴発f!:例ら必嶽と
しないという利点を有する。本発明の方法によるIFN
−γの生産は、さらに、IFN−rが細胞培養の誘発に
よる従来のIFN−γ生産の場合と異なシ他のリンフ才
力インによp汚染されないというオtlAをも壱する。
E−ioB3およびE−IOCI、(E−10Bおよび
m−tocの再りローン化単−果落からnI製されたサ
ブ系統)は、長期増殖の際、その皐励が相違した。E−
ioB3は、is同目と2Q回目との間にIFN−rの
著しい生産低下を示し/こ。しかしながら、E−10C
Aを使用した場合は、IFN−γ化層にイ0」らの低1
も観察されなかった。さらに単−集落としてm−1t)
Cから生じた他の細用糸?r9LVJ、、 /θl目V
lメソトレキセイト(MTX) 中で増殖させると、
E−tocより約6倍高いレベルにて■ilI′N−γ
r生座した。
m−tocの再りローン化単−果落からnI製されたサ
ブ系統)は、長期増殖の際、その皐励が相違した。E−
ioB3は、is同目と2Q回目との間にIFN−rの
著しい生産低下を示し/こ。しかしながら、E−10C
Aを使用した場合は、IFN−γ化層にイ0」らの低1
も観察されなかった。さらに単−集落としてm−1t)
Cから生じた他の細用糸?r9LVJ、、 /θl目V
lメソトレキセイト(MTX) 中で増殖させると、
E−tocより約6倍高いレベルにて■ilI′N−γ
r生座した。
さらに生産0nMメソトレキセイト(E−7ocioi
)にで増庖きせた俊に選択した集洛を、260nM M
TX(E−IQC10/−,2jOnM)にて増殖式せ
た。jOmiの培」也中で増殖させたこれら細胞の/7
0Cm2の融合単一層は3×105の実験室単位のIF
N−r/成の培養物を生成した(比活性: 2−!x/
0’ (jab単位/9))。
)にで増庖きせた俊に選択した集洛を、260nM M
TX(E−IQC10/−,2jOnM)にて増殖式せ
た。jOmiの培」也中で増殖させたこれら細胞の/7
0Cm2の融合単一層は3×105の実験室単位のIF
N−r/成の培養物を生成した(比活性: 2−!x/
0’ (jab単位/9))。
この細胞培養物〔支部ハムスター卵#I胞(DHFfσ
)(R/QC10/ 、2.tOnM)をアメリカン
・タイプeカルチャー・コレクションに寄託した。
)(R/QC10/ 、2.tOnM)をアメリカン
・タイプeカルチャー・コレクションに寄託した。
(「R」はrCJの代りに上部RI消化′(f−指示す
るものである)。メソトレキセイトおよび他の増殖方法
を使用して、さらに増動および生産の増大が司龍となる
。ざらに、市レベルの1に1す−γにて1vI殖させて
多蓋生並性菌株についての起りうる壽性問題を避けると
共に、培養コストを減少させるため、よシ少ない割合の
血清(たとえば、0.j%対jチ) vcて増殖させる
細胞を選択することができる。
るものである)。メソトレキセイトおよび他の増殖方法
を使用して、さらに増動および生産の増大が司龍となる
。ざらに、市レベルの1に1す−γにて1vI殖させて
多蓋生並性菌株についての起りうる壽性問題を避けると
共に、培養コストを減少させるため、よシ少ない割合の
血清(たとえば、0.j%対jチ) vcて増殖させる
細胞を選択することができる。
天然IFN−1の分子量の初勘推足1lIL<ゲルf1
過技釣ニよタテ6111足)はpo、ooo 〜to、
oo。
過技釣ニよタテ6111足)はpo、ooo 〜to、
oo。
の範囲で変化した〔たとえば、ワイ・ケイ・イック、P
roc、 Natl、Acad、Sci、 USA、
第71巻、第760/〜0!貞(/りg/);エム・ビ
−ラングフォード等、 Infect Immun
、第26巻。
roc、 Natl、Acad、Sci、 USA、
第71巻、第760/〜0!貞(/りg/);エム・ビ
−ラングフォード等、 Infect Immun
、第26巻。
第36〜t/頁(/り7り)〕。さらに最近、23.0
00〜.2o、oooの分子量推定がなされた〔クイ0
ケー・イツプ灼・、Proo、Na1.Aaad。
00〜.2o、oooの分子量推定がなされた〔クイ0
ケー・イツプ灼・、Proo、Na1.Aaad。
Sai、USA%第72巻、第1120〜217頁(/
り♂2)〕。
り♂2)〕。
これらの最近の推冗値は、IFN−rが同一もしくは同
一でないコ0,000..2j、000サブ単位からな
る凝集物、恐らく夕゛イマーであることを示唆している
。本発明のCHO生産I FN−r〔細胞系統E−io
cioi)はそれぞれ分子量めった。これらの槓gAr
illSVλ−Ik゛N−γの単一クローン化遺伝子か
ら生するはずでりる・軸重学的(シト−グリコジル化)
IFN−rの分子蓋は約/7,000であり、かつ示す
ベフチドにあ・けるグリコジル化に対し一つのム」能な
部位が存在するので、IFN−rの3棟の形態cよ非−
グリコジル化(i 7.ooo )の棟団と、2極のそ
れぞれ異1つでクリコシル化葛れた(コ/、000およ
び、zs、ooo )の独類であると思われる。
一でないコ0,000..2j、000サブ単位からな
る凝集物、恐らく夕゛イマーであることを示唆している
。本発明のCHO生産I FN−r〔細胞系統E−io
cioi)はそれぞれ分子量めった。これらの槓gAr
illSVλ−Ik゛N−γの単一クローン化遺伝子か
ら生するはずでりる・軸重学的(シト−グリコジル化)
IFN−rの分子蓋は約/7,000であり、かつ示す
ベフチドにあ・けるグリコジル化に対し一つのム」能な
部位が存在するので、IFN−rの3棟の形態cよ非−
グリコジル化(i 7.ooo )の棟団と、2極のそ
れぞれ異1つでクリコシル化葛れた(コ/、000およ
び、zs、ooo )の独類であると思われる。
本発明のCHO細胞中で生産6オ′シたIFN−γ紫ね
ずみ抗−Hu−IF’N−γ血清によって免疫沈澱させ
たが、ここでハ」いた血清はヒト牌細胞をスタフィロコ
ッカス・エンテロトキシンAで誘発させた後にhchz
≠ゲル濾過カラムからの4tj K Hu−IFN−r
ヒータによpBalb/Cねすみ全免疫化することに
よp生欣賂せたものである(アール・テボス等、ジャー
ナル・インタ7エロン・リサーチ、第2巻、第vOり〜
4t−2QJk(/りざ−)〕。さらに、抗−M u
−I F N−rによシ免疫沈澱させた試料中に2棟の
分子量のバンド紫観祭し、それにょシ憾らにそれらの性
寅を確認した。
ずみ抗−Hu−IF’N−γ血清によって免疫沈澱させ
たが、ここでハ」いた血清はヒト牌細胞をスタフィロコ
ッカス・エンテロトキシンAで誘発させた後にhchz
≠ゲル濾過カラムからの4tj K Hu−IFN−r
ヒータによpBalb/Cねすみ全免疫化することに
よp生欣賂せたものである(アール・テボス等、ジャー
ナル・インタ7エロン・リサーチ、第2巻、第vOり〜
4t−2QJk(/りざ−)〕。さらに、抗−M u
−I F N−rによシ免疫沈澱させた試料中に2棟の
分子量のバンド紫観祭し、それにょシ憾らにそれらの性
寅を確認した。
橡々の生膜により細胞培養物から精製を何なった後1本
発明で生産されたグリコモル化IFN−r’c%+J配
したI F N −rの柚々の臨床θソおよび治療的用
途に使用することができる。さらに。
発明で生産されたグリコモル化IFN−r’c%+J配
したI F N −rの柚々の臨床θソおよび治療的用
途に使用することができる。さらに。
上記のグリコジル化IFN−rおよび前記の非グリコジ
ル化IFN−rの両者を使用して、たとえは異種拒絶反
応における免疫連続反応t−阻止することかでき、或い
は持続性細菌または寄生性感染の処置においてマクロフ
ァージ活性化因子(MAF)の代)にまたはそれと同等
に使用することができる。
ル化IFN−rの両者を使用して、たとえは異種拒絶反
応における免疫連続反応t−阻止することかでき、或い
は持続性細菌または寄生性感染の処置においてマクロフ
ァージ活性化因子(MAF)の代)にまたはそれと同等
に使用することができる。
免疫連続反応の阻止剤としてI FN−7”は異種拒絶
反応を防止するのに有用である。たとえば異極細胞(た
とえば移植組織)およびその抗原は宿主のT細胞を刺戟
してリンフ才力インを生成することが知られている。し
たかって。
反応を防止するのに有用である。たとえば異極細胞(た
とえば移植組織)およびその抗原は宿主のT細胞を刺戟
してリンフ才力インを生成することが知られている。し
たかって。
IFN−rを含め異極組織に反応して異裡移柚片の囲V
に局部的にリン7オカインが生成8れるであろう。この
場合、IFN−rは異楯細廁に作用してこ2しら細胞を
刺戟し、Ia決履子を生成ぢせることかできる。次いで
、具独犬足子および異極りL原は伯主に対し堰止な慧泳
で提供され′″L激しい4ir!、役反I乙−をもIC
らし、典佃りL原に対し個主中に抗体のl:E底をもた
らし、さらに簾賛なことには移植片を排尿する細胞毒性
′r−細胞の生成をもたらす。本発明の一局面は、*発
明のIFN−γに対する抗体を使用してこV柚の拒絶反
応1を防止、することでめる。何故なら、この釉のわし
体は具a!細胞および抗原による刺戟の隙、宿主T−細
胞によシ作られたIFN−1’と結合するからである。
に局部的にリン7オカインが生成8れるであろう。この
場合、IFN−rは異楯細廁に作用してこ2しら細胞を
刺戟し、Ia決履子を生成ぢせることかできる。次いで
、具独犬足子および異極りL原は伯主に対し堰止な慧泳
で提供され′″L激しい4ir!、役反I乙−をもIC
らし、典佃りL原に対し個主中に抗体のl:E底をもた
らし、さらに簾賛なことには移植片を排尿する細胞毒性
′r−細胞の生成をもたらす。本発明の一局面は、*発
明のIFN−γに対する抗体を使用してこV柚の拒絶反
応1を防止、することでめる。何故なら、この釉のわし
体は具a!細胞および抗原による刺戟の隙、宿主T−細
胞によシ作られたIFN−1’と結合するからである。
次いで、この結合されたip’N−γはもはや異種細胞
を刺戟してla医定子を生成することができず、したが
って適正な怠味で抗原および次定子を循主に提供して細
胞毒性T−細胞を住成葛せかつ異極組織の個主による拒
絶反応をもたらすのを防止できない。
を刺戟してla医定子を生成することができず、したが
って適正な怠味で抗原および次定子を循主に提供して細
胞毒性T−細胞を住成葛せかつ異極組織の個主による拒
絶反応をもたらすのを防止できない。
MAFの代シとして%またはそれと10j等に本発明の
If’″N−γは細胞、たとえはBル1υL滅させるマ
クロファージを活性化させ、1菌性ウィルスおよび小型
靭状物負、/ヒとえは奇生物置を取p込む。このAJ途
において、IFN−γtユ吋に抗生物質に耐性でめる軸
@感染を処置するのに有用であろう。
If’″N−γは細胞、たとえはBル1υL滅させるマ
クロファージを活性化させ、1菌性ウィルスおよび小型
靭状物負、/ヒとえは奇生物置を取p込む。このAJ途
において、IFN−γtユ吋に抗生物質に耐性でめる軸
@感染を処置するのに有用であろう。
本明細誉申に配飄し1ζ力法で調装された似生物および
組換1JNA分子は、79ざ一年一万/2日付でメリー
ラント州ロックビル在のアメリカン・タイプ・カルチャ
ー・コレクションに寄託した培養物で例示される。これ
ら培繁物は次のように同定されている; HI IF−A : 、h;、 aoli 1)M/
(λバpfilIF−8V−γ、)HIIF’−B :
E colj D)i/(λ)(pi−LIIF’
−8V−γ、)HIIF−C: λcH≠A−gHI
Ili’−2これら培養物はそれぞれATCC−3?o
4tA 。
組換1JNA分子は、79ざ一年一万/2日付でメリー
ラント州ロックビル在のアメリカン・タイプ・カルチャ
ー・コレクションに寄託した培養物で例示される。これ
ら培繁物は次のように同定されている; HI IF−A : 、h;、 aoli 1)M/
(λバpfilIF−8V−γ、)HIIF’−B :
E colj D)i/(λ)(pi−LIIF’
−8V−γ、)HIIF−C: λcH≠A−gHI
Ili’−2これら培養物はそれぞれATCC−3?o
4tA 。
3りO弘7およびグOO弘≠の受託番号t″受けている
。
。
さらに1本発明の方法で調製ちれた2独の他の形質転換
さ扛た組換DNA分子は/りざ3年/月27日伺゛でメ
リーラ/ドカ1、ロックヒル在のアメリカン・タイプ・
カルチャーφコレク7ヨンに寄1i−1l:された培養
物で例示きれる。これら培養物は仄のように同ボされて
い/): HIIF−D: 支那ハムスター卵軸月包(i>*i
y上1−)(R/ QC/ 0/ −,2j OnhA
)HIIF−E : i、coli K/、2△rL
I△trp(pPLc、2ざ−filiF 夕2) これら培養物は、それぞlLA ’i″CC(141,
、どコ00および3’?27どの受此企号を受けている
。
さ扛た組換DNA分子は/りざ3年/月27日伺゛でメ
リーラ/ドカ1、ロックヒル在のアメリカン・タイプ・
カルチャーφコレク7ヨンに寄1i−1l:された培養
物で例示きれる。これら培養物は仄のように同ボされて
い/): HIIF−D: 支那ハムスター卵軸月包(i>*i
y上1−)(R/ QC/ 0/ −,2j OnhA
)HIIF−E : i、coli K/、2△rL
I△trp(pPLc、2ざ−filiF 夕2) これら培養物は、それぞlLA ’i″CC(141,
、どコ00および3’?27どの受此企号を受けている
。
以上、多くの実廁例につき本発明を説明したが、本発明
の方法および組成物t第1」ハjする他の実施態様全提
供すべく不発ツ」の基本的構成を変化させうろことは明
らかでわる。したかつで、本発明の範囲は上記実軸5す
の4に眠厘δれないことは明らかであろう。
の方法および組成物t第1」ハjする他の実施態様全提
供すべく不発ツ」の基本的構成を変化させうろことは明
らかでわる。したかつで、本発明の範囲は上記実軸5す
の4に眠厘δれないことは明らかであろう。
本発明によれは、ヒト免投インタフエロンの生物学的も
しくは免疫学的活性全示すポリペプチドを生産するυN
Afi己列1組換1)NA分子およびそれらによp形質
転換された宿主ならひにこれらポリペプチドを暗号化す
る遺伝子が提供され、さらにこれらDNA配列、分子、
宿生。
しくは免疫学的活性全示すポリペプチドを生産するυN
Afi己列1組換1)NA分子およびそれらによp形質
転換された宿主ならひにこれらポリペプチドを暗号化す
る遺伝子が提供され、さらにこれらDNA配列、分子、
宿生。
遺伝子およびポリペプチドの製造および使用方法が提供
される。これらL)NA配+11はヒト免疫インタ7エ
ロンの% Qu学的もしくは免疫学的粘性ケ示すポリペ
プチドを札号化することを特徴とする。さらに、これら
L)NA配列は適当なグリコジル化を有するポリペプチ
ドをも生産する。
される。これらL)NA配+11はヒト免疫インタ7エ
ロンの% Qu学的もしくは免疫学的粘性ケ示すポリペ
プチドを札号化することを特徴とする。さらに、これら
L)NA配列は適当なグリコジル化を有するポリペプチ
ドをも生産する。
適当な宿主において、これら1)NA配列および組換1
)NA分子は、ヒト免疫インタフエロンの生物学的もし
くは免疫学的活性を示す遺伝子およびポリペプチドの生
産および同定をOJ能にすると共に抗ウィルス、抗腫瘍
もしくはIII癌剤および免疫変調剤および方法にそれ
らを使用することを可能にする。
)NA分子は、ヒト免疫インタフエロンの生物学的もし
くは免疫学的活性を示す遺伝子およびポリペプチドの生
産および同定をOJ能にすると共に抗ウィルス、抗腫瘍
もしくはIII癌剤および免疫変調剤および方法にそれ
らを使用することを可能にする。
第1図は本発明のポリペプチドを暗号化する押入DNA
配列を特徴とする幾つかの組換DNA分子の混合物ン製
造するための本発明の方法の−具体例を示す略図であシ
; 第2図は本発明によシ製造された2遅の蔗糖−勾1pR
NAフラクションのlFN暗号暗号化活水すグラフでt
Dジ; 第3凶はpsVJλりの(N造の略図であジ;第グ図i
j p S Vj 2夕の略図であシ;第j図は本発明
に使用するRNA違択ヒブリド化分析の略図であシ; 第を図は本発明のHuIFN−γ遺伝子の制限地図およ
び挿入物1)NAγ。(の、γ+(1)+γ5(3)お
よびγ1o(/のの順序決定に使用する順序決定方法の
略図であり、星印(☆)は笑験的1c決定された制限部
位を示し、残余の部位はヌクレオチド配列に基づいて予
沖jすることができ;第7〜r図はHulFN−γ勿暗
号化する複合DNAの暗号化ストランドのヌクレオチド
配列を示し、この配列は複合D N Aの胸始部から複
合DNAの未IiS訳領域まで光分に番号利けされてお
シ、ヌクレオチドざり〜iI/I−gは信号配列を示し
、ヌクレオチド/弘り〜zll、は明らかに[成熟JI
FN−γを示し、毎号ホリベツチドおよび成熟fFN−
7のアミノ酸配列は−(−Iシそれのヌクレオチド配列
の上方に示され、 fs号ポリペプチドのアミノ酸は一
2θ〜−/′!!で番号付けちれ、かつ明白な成熟IF
N−rのアミノ酸は/〜l■1で番号付けされておシ;
第り図は細菌#I胞において^レベルでIFN−rを生
座しうる吹埃ベクターの構造を示す略図であシ; 第iogはンラスミドpAdDJjsV(A)−3およ
びpSVノーIFN−γの略図である。 特許出願人 バイオジエン ナームローズ図面の浄書
(内容に変更なし) 争 2冑 p5V52#hρ#Jl psysy、zttm
戸5pszp、xttwa 戸cqrs#
QrF/θ、2 フラタショ:/N。 F/6.3 F/6.4 F/G、5 0 イー、]+): o
ytrλ)LctW4 −(π= 4二 不芳シ
ー罵(mA’Ni −’)’1yyQI
了−” rlmPNJ IIFsnA’NA 48 FIG、 8 :GA AAA AGG AGT CAG
ATG CTG TTT CGA GGT
CGA AGA GCA TCCCAG TA
A TGG TTG TCC>n TAT
TAA TAT TTA ACA TTA
TTT ATA TGG GGA ATA
TAT TTT TAG ACT CAT
CAA 丁CA;AA AAT GAA TAT C
TA TTA ATA TAT GTA TTA TT
T ATA ATT CCT ATA TCCTGT
GACTGT:AA GGCTAT GTG ATT
ACA AGG CTT TAT CTCAGG GG
CCAA CTA GGCAGCCAA CCT AA
G;八T GAT ACA ATG AACA
CT TAT AAG TGA AGT G
AT ACT ATCCAG TTA CTG
CCG GTT TGAiGc ATG TC
A GACAGA ACT TGA ATG TGT
CAG GTG ACCCTG ATG AAA AC
A、 TAG CAT CTCrTG ACA ACT
GTG ACT GTA CCCAAA TGG A
AA GTA ACT CAT TTG TTA AA
A TTG GGG GGG482− TGCCTG CAA TAT TTG AAT TT
T AAA TCT AAA TCT 631A
AT AAG TAT TTA TAA TAG CA
A CTT TTG TGT AAT 721C
TCACT TAA TCCTTT GTT TTCT
GA CTA ATT AGG 811CAA
GAT CCCATG GGT TGT GTG TT
T ATT TCA CTT 901AAA T
AT GCCTGCAAT CTG AGCCAG T
GCTTT AAT 991AGG AGA T
TT CAT GCCTGG TGCTTCCAA A
TA TTG 10816GG GGG
11
44F/θ、10 手 糸売 ネ市 jE 書(方式) I沼川58年 4月あ日 特許庁長官 若杉 和 夫 殿 1、事件の表示 昭和58年 特許願 第 26411 号2、発明の
名称 3、補正をする昔 事件との関係 特許出願人 名称 バイオジエン ナームロース ヘンノソトノ
ヤノプ(国籍)(オランダ領アンチル ) 4、代 理 人 (1) 明細書 ″ □°/ J[!「許Y 1、事件の表示 11m口58年 特許願 第 26
411 号2、発明の名称 3、?重重をする膚 事件との関係 特許用)9状 名称 バイオジエン ナームローズ ヘンツノトン中
ノブ代表考 エフ。ブイ、フィア゛ス (国籍)(オランダ領アンデル) 4、代 理 人 6、補正の対象
配列を特徴とする幾つかの組換DNA分子の混合物ン製
造するための本発明の方法の−具体例を示す略図であシ
; 第2図は本発明によシ製造された2遅の蔗糖−勾1pR
NAフラクションのlFN暗号暗号化活水すグラフでt
Dジ; 第3凶はpsVJλりの(N造の略図であジ;第グ図i
j p S Vj 2夕の略図であシ;第j図は本発明
に使用するRNA違択ヒブリド化分析の略図であシ; 第を図は本発明のHuIFN−γ遺伝子の制限地図およ
び挿入物1)NAγ。(の、γ+(1)+γ5(3)お
よびγ1o(/のの順序決定に使用する順序決定方法の
略図であり、星印(☆)は笑験的1c決定された制限部
位を示し、残余の部位はヌクレオチド配列に基づいて予
沖jすることができ;第7〜r図はHulFN−γ勿暗
号化する複合DNAの暗号化ストランドのヌクレオチド
配列を示し、この配列は複合D N Aの胸始部から複
合DNAの未IiS訳領域まで光分に番号利けされてお
シ、ヌクレオチドざり〜iI/I−gは信号配列を示し
、ヌクレオチド/弘り〜zll、は明らかに[成熟JI
FN−γを示し、毎号ホリベツチドおよび成熟fFN−
7のアミノ酸配列は−(−Iシそれのヌクレオチド配列
の上方に示され、 fs号ポリペプチドのアミノ酸は一
2θ〜−/′!!で番号付けちれ、かつ明白な成熟IF
N−rのアミノ酸は/〜l■1で番号付けされておシ;
第り図は細菌#I胞において^レベルでIFN−rを生
座しうる吹埃ベクターの構造を示す略図であシ; 第iogはンラスミドpAdDJjsV(A)−3およ
びpSVノーIFN−γの略図である。 特許出願人 バイオジエン ナームローズ図面の浄書
(内容に変更なし) 争 2冑 p5V52#hρ#Jl psysy、zttm
戸5pszp、xttwa 戸cqrs#
QrF/θ、2 フラタショ:/N。 F/6.3 F/6.4 F/G、5 0 イー、]+): o
ytrλ)LctW4 −(π= 4二 不芳シ
ー罵(mA’Ni −’)’1yyQI
了−” rlmPNJ IIFsnA’NA 48 FIG、 8 :GA AAA AGG AGT CAG
ATG CTG TTT CGA GGT
CGA AGA GCA TCCCAG TA
A TGG TTG TCC>n TAT
TAA TAT TTA ACA TTA
TTT ATA TGG GGA ATA
TAT TTT TAG ACT CAT
CAA 丁CA;AA AAT GAA TAT C
TA TTA ATA TAT GTA TTA TT
T ATA ATT CCT ATA TCCTGT
GACTGT:AA GGCTAT GTG ATT
ACA AGG CTT TAT CTCAGG GG
CCAA CTA GGCAGCCAA CCT AA
G;八T GAT ACA ATG AACA
CT TAT AAG TGA AGT G
AT ACT ATCCAG TTA CTG
CCG GTT TGAiGc ATG TC
A GACAGA ACT TGA ATG TGT
CAG GTG ACCCTG ATG AAA AC
A、 TAG CAT CTCrTG ACA ACT
GTG ACT GTA CCCAAA TGG A
AA GTA ACT CAT TTG TTA AA
A TTG GGG GGG482− TGCCTG CAA TAT TTG AAT TT
T AAA TCT AAA TCT 631A
AT AAG TAT TTA TAA TAG CA
A CTT TTG TGT AAT 721C
TCACT TAA TCCTTT GTT TTCT
GA CTA ATT AGG 811CAA
GAT CCCATG GGT TGT GTG TT
T ATT TCA CTT 901AAA T
AT GCCTGCAAT CTG AGCCAG T
GCTTT AAT 991AGG AGA T
TT CAT GCCTGG TGCTTCCAA A
TA TTG 10816GG GGG
11
44F/θ、10 手 糸売 ネ市 jE 書(方式) I沼川58年 4月あ日 特許庁長官 若杉 和 夫 殿 1、事件の表示 昭和58年 特許願 第 26411 号2、発明の
名称 3、補正をする昔 事件との関係 特許出願人 名称 バイオジエン ナームロース ヘンノソトノ
ヤノプ(国籍)(オランダ領アンチル ) 4、代 理 人 (1) 明細書 ″ □°/ J[!「許Y 1、事件の表示 11m口58年 特許願 第 26
411 号2、発明の名称 3、?重重をする膚 事件との関係 特許用)9状 名称 バイオジエン ナームローズ ヘンツノトン中
ノブ代表考 エフ。ブイ、フィア゛ス (国籍)(オランダ領アンデル) 4、代 理 人 6、補正の対象
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 (1) p旧IF−8V−roのD N A (’4
+入物、xiJJ N A 挿入物にヒフリド化しかつ
IFN−γ城のポリペプチドを暗号化するL)NA配夕
1バならびに異種1)NA配列および挿入物のいずれか
によ!01if号化込れたポリペプチドkl−号化する
1)NA配タりリりなる群から選択δれるDNA配列。 悶 DNA挿入物にヒフリド化するL)NA配クりf
p HI I F−b V r I T P H11
k’−8V−r2 +p J(工1 k −b V
i’3 、p f(I I F−8V r 5+ p
”工IF−8V−16,pHI IF−8V−rB 、
plHIF−8V −rq 、 pHI Lb’−8
V−γ1g 、 p)if IF’−8V−rllすi
J N A 4tH+入物、これら異種DNA仲人物の
いずれかにヒフリド化しかつIFN−γ型のボリベフ゛
チドケII旨号化するD1喝A白己夕1,7jらひにケ
(棟DNA配列お↓ひ挿入物のいずIL4h &’Cよ
り暗号化塾れ/ζホリベフテドr階〜化するD N A
配りリよりなる群刀・L:)迅択する!愕it’l’
ii+i水の鰺巳曲褐/力阪dじ戟の、DNA 自己
クリ。 (:i)D N A (Φ人物にヒブリド化−fl、D
NA部夕j」t、λC1−1弘A−gH11に’−/お
よびλC1iC11llA−1上゛−2のIF’N(関
連配列、こ才りら叡柚L)NA配列のい丁2tかにヒフ
リド化しかつIFN−γ型のポリペプチドk lli’
f号化する1)NA配タりリならひに異種DNA配クリ
のいずれかにより暗号化さIしたポリペプチドを暗号化
するD N A fAL列よυなる群から選択する特許
請求の範囲第7項または第2狽記載の1)NA配列。 AGACATGAATGTCAA石汀TTCA/い釦品
αAAAA弘MC晶弘WCTCGAAAAGσrGAC
rAATTATTCGGTMCrGACnGAATGT
CCAACGCAAAAAAGGAGTCAGATGC
I’GmCGAGGTCGAAGAGCATCCCAG
rAA、およびATGrGTTACrGCCAGGAC
CCATATGTAAIWI;AAG(TAGAAAA
CC,TrAAGAAのL)NA配夕1」よりなる訃か
ら選択される将計珀求の範囲第1項乃至第3項のいずれ
かVC記載のDNA配tu。 t5)DNA配列からなシ、このDJ″JA配タlJt
府計計ツ求の範囲第1項乃至第弘項のいずれかにml載
の1)NA配夕1]よりな/)群から選択する組挨DN
A分子。 (6) DNA配列が表現ft1lJ S中口Lクリ
に作用結付されている特許[!6求の範囲第!項記載の
組換IJNA分子。 (71表#l’NIJilIg己りリル:す(呆、
β−1−g=c 糸、 t−r−p糸、ファージλ
の生9gベレータおよびンロモータ領域、fd被嶺蛋白
寅の1lill岬領域、原始核もしくは成熟核軸側2よ
ひそiLらのウィルスの遺伝子の衣机を1ilJ飾する
他の’QC列、ならひにそれらの組合せから選択する%
ti・珀求の範囲第6狽bC軟の組換IJNA分子。 L8) plil 1k”−8V−7n 、 7k
’J)ICpHI IF−8V−γ5およOpHI I
F’−8v−rha ニIN4するが1に’1SJ−γ
l!’、1連DNA伸人物を反対ねじ向にてイfする組
俣jJNA分子よりなる群から選択されるl付許紬求の
範囲第6狽゛または第7項すじ載のl1il、l換DN
A分子。 t9) psV、2−IFN−r kよびp P L
c S A −I F N−rよりなる群から選択さ
れる%d′ト稍求の範囲第6項または第7項記載の組換
1)NA分子。 (11符許梢求の範囲第5項乃至第2狽のいずれかに記
載の少なくともl裡の組挨DNA分子により形質転換さ
れた細土。 Uυ イー・コ1ハシュードモナス、枯草菌、市熱紬蘭
、他の細菌、酵母、他の真菌類の菌株、ねずみもしくは
その他の制御または極wjJ仙主およびヒト組餓#II
I胞よシなる椙、から泗択芒れる特ff’lii’j氷
の馳囲第lθi↓i1賊の1d王。 u4 イー・コ1ハ シュードモナス、枯阜凶、面熱
細菌、他の細菌、酵匂、他の共l!lfガムの菌株、オ
λす牟もしくはその他の動物−よたは4t【−宿王訳た
はヒトBi繊癲j胞よシなるイ;トから選択されてrl
、γ5およびrlo よりなる群から恵沢されたづ手入
JJNA、によりjし負転掠さ)した仔I午請求の範囲
第10項または第77項記載の形寅転換宿王。 (1:31 λCM4tA −gHI I k’
−/ EE 7hU λCfi It A −g
HIIF−一の工薯゛N−γ曲迩仲入物によジ形負転換
姑れた成熟核宿主よりなる訃から選択される特許1li
iXの範囲第10項または第1/項記載の形貝転換宿主
。 (141イー・コリに/−ΔHI△t r p (MI
I F−!、2)、イー会コリSG≠04L弘(p
c lざj7)、(pPLcsA−IFN−1)、CM
O(1))IFR)(12−10B)。 C1−10(DHFR−) (E−/θC)、C110
(υ44 Flも−)(E−10kS3)、 CMO
(DliFR)(k:、−10CA)、CHO(1)H
FIt )(K−IQC10/) オLびCMO(DH
FR)(R−IQC10/ 、2jOnM)よυなる
群から選択されるq′f肝珀求の範囲第103Aまたは
謁//項能軌の形負私換イ6生。 四 %#fiiv求の軛vj3第IO項乃主第73項の
いずれかに記載の形寅転挨偏王にょ仄生産さ2Lるヒト
免投インタフエロンの免疫学的もしくは生物学市活性ケ
示すポリペプチド。 OQ %許肋求の範囲第/弘項ml載の形質転換宿主
により生産されるIFN−γの免&字的もしくは生物学
的活性紫示すポリペプチド。 (17) CHO(DMFR−)(E−10B)、C
)10(D五l電・1ζ−)(E−IDC)、C)10
(L)HFR)(E−#)Bj)、CHO(DHFW−
)(j;−10c6)、C)10(DHFR−)(E−
IQC10/ )、およびC)10(i))IFR)(
R−IQC10/ 、2jOnM)よシなる群から選
択式れる形質転換宿主により生産されるクリコシル化I
FN−γ。 U〜 物1F’7・趙求の範囲第/、IJj乃至第弘狽
のいずれかに記載のL) NA配列によpa&号化さn
るポリペプチドもしくQユそのV「片丘たはそのv!T
導体。 贈式 %式% ] のポリペプチドよシなる群から選択される特i1−晶求
の範囲第13項乃至第77項のいずれかに記載のポリペ
プチドもしくはその部[片またはその島尋体。 +21 特g1−M求の馳囲第/項乃至第μ項のいず
れかに目上載のLINA配列をクローン化ベヒクル中へ
尋人゛3−ること金付徴とする組換LINA分子の製造
方伝。 (21)%FTfMV求の陶(巳囲第7項1.1載のン
〈すλ市1」仰巾自己夕(」奮クローン化ベヒクル中へ
尋人しh irj糺衣机fiji制御配列ケ削口しクロ
ーン化ベヒクル中へSv、 大してD1″JA配夕IJ
(1)表現【仙坤かつu・′4發する工程を憾らに宮む
豹ifFM米の耽囲第−〇項目じ眠の方法。 (22) 1階R1・賄求の範囲第6坂乃至第2項のい
ずれかに1c載の組侠D fi A分子により過当な?
i主金形賀転快させ、前i己イ百王を培養し、かつnl
」bピホリベフテドを回収すること・と特徴とする、ヒ
ト免疫インクフエロンの矢投学的または生物学的NJ性
を示すポリペプチドの製造方法。 (23) TS主をイー・コ1ハシュードモナス、枯草
菌、高熱翁す藺、1田のiml貞、自を母、カビの菌株
、動9勿もしくはイ直物イd主およびヒト糸+1h改ル
1+lJi己よりなる411″から選択する符#i’
B+’i氷の範囲第2λ狽6C載の方法。 (24)特詮’1−itGf求の範囲第6項乃至第り項
のいずれかに記載の組換LINA分子によシ形質転侠さ
れた宿主を培誓し、かつボリベフ゛チドkL+収するこ
とtIFf*とする、ヒト免疫インタフェロンの免疫字
曲ばたは生物学的l占性を示すポリペプチドの製造方法
。 (25)どのDNA配列が特許請求の範囲第1項乃全第
V項のいずれかにd上載のJJNA自己夕IJにヒプリ
ド化するかt法定することを%′似とする、DNA配列
の群からのHulFN−γの免疫学的または生物学的活
性奢ボずポリペプチド會暗号化するL)NA配列の選択
方法。 (26)どのDNA配列がl特許Hh求の範囲第1項乃
至第参項のいずれかに記載のDNA配列にヒプリド化す
るかを決定するととを%似とツーる。 非ヒト免疫インタ7エロンの免疫4的または生物学的活
性を示すポリペプチドを暗号化するDNA配列の選択方
法9 (27)選別DNA配列を、大然豚からの1)NA配列
、合成りNA!!IL列5組換DNA分子からのDNA
fic列および異種DNA配列のいずれかの組合ぜでり
るDNA配列よシなる抑から選択する待針1求の範囲第
コsylたは第コロ項d上載の方法。 (2B)神g71・請求の範曲第is狽乃至第lり項の
いずれかVC記載のポリペプチド↓りする群から選択ち
れる少なくとも/拙のポリペプチドからなることを特徴
とするヒトウィルス感染の処飯用またはヒト癌もしくは
腫瘍の処置用組成物。 (2、特許請求の範囲比、2g項HC載の組成物の有効
量を医薬上W+容しうる方法でヒトに投与することを%
徴とするヒトウィルス感染の処置またはヒト癌もしくは
J匣瘍の処置方法。 (60)%許nI?求の範囲第/よ項乃至第/り項のい
ずれかに記載のポリペプチドよシなる群から選択される
少なくとも7種のポリペプチドからなることを特徴とす
る免疫没調剤として使用する組成物。 (61)%針藺求の範囲第30項ml域の組成物の有効
iLを医薬上許答しうる方法で投与することを特徴とす
る免役KJ4方法。 (62)異11移殖片拒絶に対処するための、IFN−
γに対する医業上v+hしうる抗体の使用。 <65) It!1瘍および癌に対するならひに細菌お
よび寄生虫の感染に対するマクロファージf:活性化さ
せるための、医薬上許容しうるIFN−rの使用。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB8205203 | 1982-02-22 | ||
GB8205203 | 1982-02-22 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS5951792A true JPS5951792A (ja) | 1984-03-26 |
Family
ID=10528520
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP58026411A Pending JPS5951792A (ja) | 1982-02-22 | 1983-02-21 | Dna配列、組換dna分子およびヒト免疫インタフエロン様ポリペプチドの製造方法 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0088540A3 (ja) |
JP (1) | JPS5951792A (ja) |
AU (2) | AU1167483A (ja) |
DK (1) | DK73483A (ja) |
ES (1) | ES8403969A1 (ja) |
IL (1) | IL67961A0 (ja) |
ZA (1) | ZA831094B (ja) |
Cited By (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS58201995A (ja) * | 1982-05-20 | 1983-11-25 | Suntory Ltd | ヒト・ガンマ・インタ−フエロン様ポリペプチドの製造法 |
WO1985003086A1 (en) * | 1984-01-09 | 1985-07-18 | Suntory Limited | Process for preparing sugar-added polypeptides |
WO1985004420A1 (en) * | 1984-03-29 | 1985-10-10 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Novel dna and its use |
JPS60202899A (ja) * | 1983-12-16 | 1985-10-14 | ジエネンテツク・インコ−ポレイテツド | 安定性の高い組換えガンマインタ−フエロン |
JPS60233100A (ja) * | 1984-04-19 | 1985-11-19 | ヘキスト・アクチエンゲゼルシヤフト | ヒトγ―インターフェロン活性を有するポリペプチドおよびその製造法 |
WO1985005619A1 (en) * | 1984-06-06 | 1985-12-19 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Novel polypeptide and process for its preparation |
JPS60262594A (ja) * | 1984-06-11 | 1985-12-25 | Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd | ヒトインタ−フエロン−γ |
JPS611395A (ja) * | 1984-06-12 | 1986-01-07 | ジ−・デイ・サ−ル アンド コンパニ− | ヒトr−インタ−フエロン |
JPS6143990A (ja) * | 1984-04-27 | 1986-03-03 | イエダ リサ−チ アンド デベロツプメント カンパニ− リミテツド | γ−インタ−フエロンの製造法 |
JPS6188875A (ja) * | 1984-10-05 | 1986-05-07 | Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd | ヒトインタ−フエロン−γ |
JPS61108397A (ja) * | 1984-10-31 | 1986-05-27 | Green Cross Corp:The | インタ−フエロン−γ蛋白質の製造法 |
JPS61501430A (ja) * | 1984-03-16 | 1986-07-17 | バイオジェン インコーポレイテッド | 修飾ガンマ・インタ−フェロン、そのifnをコ−ドするdna配列およびそのifnの生産方法 |
JPS63211240A (ja) * | 1982-11-22 | 1988-09-02 | Takeda Chem Ind Ltd | ヒト免疫インターフェロン蛋白質含有薬剤 |
JPH01501792A (ja) * | 1986-03-17 | 1989-06-22 | シェリング・コーポレーション | γ型インターフェロンによる癌の治療 |
Families Citing this family (31)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IL68100A0 (en) * | 1982-03-24 | 1983-06-15 | Takeda Chemical Industries Ltd | Novel dna and use thereof |
AU571460B2 (en) * | 1982-09-27 | 1988-04-21 | Cancer Institute Of Japanese Foundation For Cancer Research | Alpha interferon dna, recombinant plasmid, engineered organism and alpha interferon polypeptide |
US4966843A (en) * | 1982-11-01 | 1990-10-30 | Cetus Corporation | Expression of interferon genes in Chinese hamster ovary cells |
JPH0740925B2 (ja) * | 1983-03-14 | 1995-05-10 | 協和醗酵工業株式会社 | 新規ヒトインタ−フエロン−γポリペプチド |
ZA846554B (en) * | 1983-09-20 | 1985-04-24 | Hoffmann La Roche | Immune interferon and method for its purification |
US4476049A (en) * | 1983-09-20 | 1984-10-09 | Hoffmann-La Roche Inc. | Method for the extraction of immune interferon |
US4604284A (en) * | 1983-09-20 | 1986-08-05 | Hoffmann-La Roche Inc. | Homogeneous immune interferon fragment |
JPH0788398B2 (ja) * | 1983-10-17 | 1995-09-27 | サントリー株式会社 | 新規生理活性ポリペプチドおよびその製造法 |
MX9203641A (es) * | 1983-12-16 | 1992-07-01 | Genentech Inc | Interferones gamma recombinantes que poseen estabilidad mejorada y metodos biotecnologicos para su obtencion. |
US4758512A (en) * | 1984-03-06 | 1988-07-19 | President And Fellows Of Harvard College | Hosts and methods for producing recombinant products in high yields |
DE3409966A1 (de) * | 1984-03-19 | 1985-09-26 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Gentechnologisches verfahren zur herstellung von human-gammainterferon und mittel zur durchfuehrung dieses verfahrens |
EP0158198A1 (en) * | 1984-03-29 | 1985-10-16 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | DNA and use thereof |
CA1302320C (en) * | 1984-06-11 | 1992-06-02 | Hideo Niwa | Expression of human cromosomal interferon-_ in animal cells |
GB2164650A (en) * | 1984-09-25 | 1986-03-26 | Fujisawa Pharmaceutical Co | Process for production of y-interferon |
IL76591A0 (en) * | 1984-10-05 | 1986-02-28 | Bioferon Biochem Substanz | Pharmaceutical compositions containing ifn-ypsilon and processes for the preparation thereof |
DE3521733A1 (de) * | 1985-06-18 | 1986-12-18 | Bioferon biochemische Substanzen GmbH & Co, 7958 Laupheim | Verwendung von interferon-gamma (ifn-gamma) enthaltenden praeparationen zur systemischen behandlung von tumoren und viruserkrankungen in niedriger dosierung |
US4946674A (en) * | 1984-10-05 | 1990-08-07 | Bioferon Biochemische Substanzen Gmbh & Co. | Process for treatment of rheumatic diseases |
FR2583429B1 (fr) * | 1985-06-18 | 1989-11-03 | Transgene Sa | Vecteur d'expression de l'interferon u dans les cellules de mammifere, procede pour sa mise en oeuvre et produit obtenu et composition pharmaceutique contenant l'interferon u |
GB8522336D0 (en) * | 1985-09-09 | 1985-10-16 | Biogen Nv | Composition for treatment of allergies |
US4879111A (en) * | 1986-04-17 | 1989-11-07 | Cetus Corporation | Treatment of infections with lymphokines |
KR970008217B1 (ko) * | 1986-08-01 | 1997-05-22 | 알프레드 퍼넷트 | 재조합 백신 |
DE3642096A1 (de) * | 1986-12-10 | 1988-06-16 | Boehringer Ingelheim Int | Pferde-(gamma)-interferon |
US5190751A (en) * | 1987-01-20 | 1993-03-02 | Schering Corporation | Treatment of certain leukemias with a combination of gamma interferon and alpha interferon |
NL8700927A (nl) * | 1987-04-16 | 1988-11-16 | Stichting Rega V Z W | Anti-interferon-gamma-antilichamen; en hun therapeutische toepassing. |
AUPN154295A0 (en) * | 1995-03-06 | 1995-03-30 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Nucleic acid molecule encoding a protein with avian gamma-interferon activity |
US6642032B2 (en) | 1993-04-14 | 2003-11-04 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Uses of avian interferon gamma (IFN-γ) |
CN1309423C (zh) | 1999-11-12 | 2007-04-11 | 马克西根控股公司 | 干扰素γ偶联物 |
HUP0203409A3 (en) | 1999-11-12 | 2005-06-28 | Maxygen Holdings Ltd Redwood C | Interferon gamma conjugates |
US7038015B2 (en) | 2001-04-06 | 2006-05-02 | Maxygen Holdings, Ltd. | Interferon gamma polypeptide variants |
US6958388B2 (en) | 2001-04-06 | 2005-10-25 | Maxygen, Aps | Interferon gamma polypeptide variants |
CA2491178A1 (en) | 2002-07-03 | 2004-01-15 | Maxygen Holdings Ltd. | Full-length interferon gamma polypeptide variants |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5890514A (ja) * | 1981-10-19 | 1983-05-30 | ジエネンテツク・インコ−ポレイテツド | ヒト免疫インターフエロンをコートするdna配列 |
JPS58110548A (ja) * | 1981-12-24 | 1983-07-01 | Asahi Chem Ind Co Ltd | 新規な生理活性ペプチド |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IL65475A0 (en) * | 1981-04-17 | 1982-07-30 | Meloy Lab | Production of immune interferon and its mrna |
IL68100A0 (en) * | 1982-03-24 | 1983-06-15 | Takeda Chemical Industries Ltd | Novel dna and use thereof |
JPH0787797B2 (ja) * | 1982-05-20 | 1995-09-27 | サントリー株式会社 | ヒト・ガンマ・インタ−フエロン様ポリペプチドの製造法 |
US4582800A (en) * | 1982-07-12 | 1986-04-15 | Hoffmann-La Roche Inc. | Novel vectors and method for controlling interferon expression |
-
1983
- 1983-02-17 EP EP83300805A patent/EP0088540A3/en not_active Ceased
- 1983-02-17 ZA ZA831094A patent/ZA831094B/xx unknown
- 1983-02-18 AU AU11674/83A patent/AU1167483A/en not_active Abandoned
- 1983-02-21 IL IL67961A patent/IL67961A0/xx unknown
- 1983-02-21 ES ES519953A patent/ES8403969A1/es not_active Expired
- 1983-02-21 DK DK73483A patent/DK73483A/da not_active Application Discontinuation
- 1983-02-21 JP JP58026411A patent/JPS5951792A/ja active Pending
-
1989
- 1989-02-06 AU AU29644/89A patent/AU2964489A/en not_active Abandoned
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5890514A (ja) * | 1981-10-19 | 1983-05-30 | ジエネンテツク・インコ−ポレイテツド | ヒト免疫インターフエロンをコートするdna配列 |
JPS58110548A (ja) * | 1981-12-24 | 1983-07-01 | Asahi Chem Ind Co Ltd | 新規な生理活性ペプチド |
Cited By (18)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS58201995A (ja) * | 1982-05-20 | 1983-11-25 | Suntory Ltd | ヒト・ガンマ・インタ−フエロン様ポリペプチドの製造法 |
JPH0536414B2 (ja) * | 1982-11-22 | 1993-05-31 | Takeda Chemical Industries Ltd | |
JPS63211240A (ja) * | 1982-11-22 | 1988-09-02 | Takeda Chem Ind Ltd | ヒト免疫インターフェロン蛋白質含有薬剤 |
JPS60202899A (ja) * | 1983-12-16 | 1985-10-14 | ジエネンテツク・インコ−ポレイテツド | 安定性の高い組換えガンマインタ−フエロン |
JPH03201979A (ja) * | 1983-12-16 | 1991-09-03 | Genentech Inc | 安定性の高い組換えガンマインターフエロン |
WO1985003086A1 (en) * | 1984-01-09 | 1985-07-18 | Suntory Limited | Process for preparing sugar-added polypeptides |
JPS61501430A (ja) * | 1984-03-16 | 1986-07-17 | バイオジェン インコーポレイテッド | 修飾ガンマ・インタ−フェロン、そのifnをコ−ドするdna配列およびそのifnの生産方法 |
WO1985004420A1 (en) * | 1984-03-29 | 1985-10-10 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Novel dna and its use |
JPS60233100A (ja) * | 1984-04-19 | 1985-11-19 | ヘキスト・アクチエンゲゼルシヤフト | ヒトγ―インターフェロン活性を有するポリペプチドおよびその製造法 |
JPH06153957A (ja) * | 1984-04-19 | 1994-06-03 | Hoechst Ag | ヒトγ−インターフェロンの部分アミノ酸配列をコードするDNA配列 |
JPS6143990A (ja) * | 1984-04-27 | 1986-03-03 | イエダ リサ−チ アンド デベロツプメント カンパニ− リミテツド | γ−インタ−フエロンの製造法 |
WO1985005618A1 (en) * | 1984-06-06 | 1985-12-19 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Process for preparing interferon derivative |
WO1985005619A1 (en) * | 1984-06-06 | 1985-12-19 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Novel polypeptide and process for its preparation |
JPS60262594A (ja) * | 1984-06-11 | 1985-12-25 | Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd | ヒトインタ−フエロン−γ |
JPS611395A (ja) * | 1984-06-12 | 1986-01-07 | ジ−・デイ・サ−ル アンド コンパニ− | ヒトr−インタ−フエロン |
JPS6188875A (ja) * | 1984-10-05 | 1986-05-07 | Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd | ヒトインタ−フエロン−γ |
JPS61108397A (ja) * | 1984-10-31 | 1986-05-27 | Green Cross Corp:The | インタ−フエロン−γ蛋白質の製造法 |
JPH01501792A (ja) * | 1986-03-17 | 1989-06-22 | シェリング・コーポレーション | γ型インターフェロンによる癌の治療 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
IL67961A0 (en) | 1983-06-15 |
AU2964489A (en) | 1989-08-24 |
AU1167483A (en) | 1983-09-01 |
ZA831094B (en) | 1983-11-30 |
ES519953A0 (es) | 1984-04-01 |
DK73483D0 (da) | 1983-02-21 |
ES8403969A1 (es) | 1984-04-01 |
EP0088540A3 (en) | 1984-10-17 |
DK73483A (da) | 1983-08-23 |
EP0088540A2 (en) | 1983-09-14 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JPS5951792A (ja) | Dna配列、組換dna分子およびヒト免疫インタフエロン様ポリペプチドの製造方法 | |
JP2687995B2 (ja) | Dna配列、組替えdna分子およびヒト繊維芽細胞インターフェロン様ポリペプチドの製造方法 | |
US4853332A (en) | Structural genes, plasmids and transformed cells for producing cysteine depleted muteins of biologically active proteins | |
USRE33653E (en) | Human recombinant interleukin-2 muteins | |
JPS62501470A (ja) | 腫瘍壊死因子の精製、製造および使用法 | |
US5004689A (en) | DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing human gamma interferon-like polypeptides in high yields | |
EP0218825A1 (en) | Cysteine-depleted muteins of interferon-beta, their preparation, formulations containing them, and structural genes, vectors and organisms, and their production, suitable for use in the preparation of said muteins | |
JPS59501097A (ja) | 大きな構造遺伝子の製造および発現 | |
CZ282154B6 (cs) | Lidský imunitní interferon a jeho derivát, isolát DNA se sekvencí kodující lidský imunitní interferon, rekombinantní klonovací vektor, replikovatelný expresní vektor, rekombinantní mikroorganismus nebo buněčná kultura, farmaceutický přípravek, způsob výroby lidského imunitního interferonu a jeho použití | |
CN1045539C (zh) | 克隆编码具有人粒性巨噬细胞和嗜伊红细胞生长因子活性多肽的cDNA | |
CN107353347A (zh) | 一种由猪白蛋白、猪干扰素γ和猪干扰素α组成的融合蛋白及其制备方法 | |
WO2022057904A1 (zh) | 溶瘤病毒与经改造的免疫细胞联合治疗肿瘤 | |
CN108840952A (zh) | 一种由鸡白蛋白、鸡干扰素γ和鸡干扰素α组成的融合蛋白及其制备方法 | |
CN108840950A (zh) | 一种由猪白细胞介素2、猪干扰素γ和猪干扰素α组成的融合蛋白及其制备方法 | |
JP2003325188A (ja) | サイトカイン遺伝子組換えカイコおよびそのタンパク質の製造方法 | |
WO2002081519A9 (fr) | Nouvelle proteine hybride ifn-thy, preparation et utilisation | |
CN108864300A (zh) | 鸡白蛋白-干扰素α-白介素2融合蛋白、制备方法及其编码基因、一种鸡长效干扰素 | |
CN108794645A (zh) | 一种由牛白蛋白、牛干扰素γ和牛干扰素α组成的融合蛋白及其制备方法 | |
CN107383202A (zh) | 一种由鸡白蛋白、鸡干扰素γ和鸡白细胞介素2组成的融合蛋白及其制备方法 | |
CN108794644A (zh) | 一种由牛白细胞介素2、牛干扰素γ和牛干扰素α组成的融合蛋白及其制备方法 | |
CN107353348A (zh) | 一种重组羊长效干扰素τ及制备此长效干扰素的融合蛋白及其制备方法 | |
CN107383204A (zh) | 一种由羊白细胞介素2、羊干扰素γ和羊干扰素τ组成的融合蛋白及其制备方法 | |
CN107365390A (zh) | 一种由猪白蛋白、猪干扰素γ和猪白细胞介素2组成的融合蛋白及其制备方法 | |
CN107245110A (zh) | 一种由羊白蛋白、羊干扰素γ和羊干扰素τ组成的融合蛋白及其制备方法 | |
CN109053897A (zh) | 一种由鸡白细胞介素2、鸡干扰素γ和鸡干扰素α组成的融合蛋白及其制备方法 |