CZ282154B6 - Lidský imunitní interferon a jeho derivát, isolát DNA se sekvencí kodující lidský imunitní interferon, rekombinantní klonovací vektor, replikovatelný expresní vektor, rekombinantní mikroorganismus nebo buněčná kultura, farmaceutický přípravek, způsob výroby lidského imunitního interferonu a jeho použití - Google Patents

Abstract

Lidský imunitní interferon a jeho derivát mají aminokyselinovou sekvenci podle obr. 5 a jsou bez jiného proteinu. Isolát obsahuje DNA sekvenci kodující lidský imunitní interferon, s aminokyselinovou sekvencí podle obr. 5. Rekombinantní klonovací vektor obsahuje DNA sekvenci podle obr. 5. Replikovatelný expresní vektor je schopný exprimovat v transformantním mikroorganismu nebo buněčné kultuře DNA sekvenci podle obr. 5. Rekombinantní mikroorganismus nebo buněčná kultura jsou schopné exprimovat imunitní interferon s aminokyselinovou sekvencí podle obr. 5. Farmaceutický přípravek je určen k léčení tumorových nebo virových onemocnění nebo imunosupresivních stavů. Při způsobu výroby lidského imunitního interferonu se rekombinantní hostitelské buňky přeměněné expresním vektorem, obsahujícím DNA kodující lidský imunitní interferon s aminokyselinovou sekvencí podle obr. 5 nebo jeho alelu nebo derivát, kultivují za podmínek umožňujících expresi uvedené DNA sekvence za vzniku lidského imunitníhoŕ

Description

Vynález se týká lidského imunitního interferonu a jeho derivátu, isolátu DNA obsahující DNA sekvenci kódující lidský imunitní interferon, rekombinantního klonovacího vektoru obsahujícího DNA sekvenci kódující lidský imunitní interferon, replikovatelného expresního vektoru schopného exprimovat v transformantním mikroorganismu nebo buněčné kultuře DNA sekvenci kódující lidský imunitní interferon, rekombinantního mikroorganismu nebo buněčné kultury schopné exprimovat imunitní interferon, farmaceutického přípravku pro léčení tumorových nebo virových onemocnění nebo imunosupresivních stavů, způsobu výroby lidského imunitního interferonu a jeho použití pro přípravu shora uvedených farmaceutických přípravků;

Vynález se týká oblasti technologie rekombinace kyseliny desoxyribonukleové (DNA), prostředků a metod využívajících uvedenou technologii ke stanovení DNA sekvence a zní odvozené aminokyselinové sekvence lidského imunitního interferonu, výroby uvedeného interferonu a různých produktů této výroby a jejich použití.

Vynález se zvláště týká způsobu isolace a identifikace DNA sekvencí kódujících lidský imunitní interferon, sestrojování nosičů schopných exprimovat rekombinované DNA, které obsahují uvedené DNA sekvence operačně vázané na expresi vyvolávající promotorové sekvence, a samotných takto sestrojených exprese schopných prostředků. Vynález se dále týká, z jiného hlediska, systémů hostitelských kultur, jako kultur různých mikroorganismů a buněčných kultur obratlovců, transformovaných takovými exprese schopnými nosiči a tak usměrněných na expresi shora uvedených DNA sekvencí. Ještě z jiného hlediska se vynález týká prostředků a způsobů na přeměňování · konečných produktů uvedené exprese na nové výrobky, jako na farmaceutické prostředky, kterých se dá používat k profylaktickému nebo terapeutickému léčení lidí. Ve svém výhodném provedení se vynález obzvláště týká exprese schopných nosičů, které jsou vhodně sekvencovány tak, aby z hostitelské buňky byl produkován a vylučován lidský imunitní interferon v maturované formě. Vynález se dále týká různých postupů použitelných pro přípravu uvedených DNA sekvencí, exprese schopných nosičů, systémů hostitelských kultur, konečných produktů a výrobků z nich, včetně příslušných specifických a přidružených provedení.

Předložený vynález vzniknul částečně na základě stanovení DNA sekvence a z ní odvozené aminokyselinové sekvence lidského imunitního interferonu. Vynález dále poskytuje sekvenční informace o 3'- a 5'-přilehlých sekvencích lidského imunitního interferonového genu, což ulehčuje jeho in vitro navázání do exprese schopných nosičů. Vynález obzvláště poskytuje informaci o 5-DNA úseku kódujícím předpokládaný endogenní signální polypeptid, který' bezprostředně předchází aminokyselinové sekvenci předpokládaného maturovaného imunitního interferonu. Tyto objevy umožnily vzápětí vývoj prostředků a způsobů pro výrobu dostatečných množství lidského imunitního interferonu cestou technologie rekombinace DNA, což opět dovolilo stanovení jeho biochemických vlastností a bioaktivity.

Dosavadní stav techniky

Publikace a další materiály použité v následujícím popisu k osvětlení podstaty vynálezu, ave zvláštních případech k poskytnutí dalších podrobností týkajících se jeho praktického provádění, jsou v textu uváděny formou odkazů, které jsou pro přehlednost číselně označeny a seřazeny v připojeném seznamu literatury na konci popisné části vynálezu.

- 1 CZ 282154 B6

A. Lidský imunitní interferon

Lidské interferony lze na základě různé antigenicity a různých biologických a biochemických vlastností roztřídit do tří skupin.

První skupina zahrnuje druh leukocytárních interferonů (α-interferon, LelF nebo IFN-a), které ' jsou normálně produkovány hlavně základními buňkami lidské krve po virové indukci. Tyto interferony lze vyrábět mikrobiálně a bylo nalezeno, že i takto vyrobené interferony jsou biologicky aktivní (viz 1, 2, 3). Jejich biologické vlastnosti podnítily jejich použití v klinice jako ío terapeutických prostředků pro léčení virových infekcí a maligních stavů (viz 4).

Ve druhé skupině je zařazen lidský fíbroblastový interferon (β-interferon, FIF nebo IFN-β), normálně produkovaný fibroblasty po virové indukci, který lze podobně jako výše uvedený interferon vyrábět mikrobiálně a který vykazuje rovněž rozsáhlou řadu biologických aktivit 15 (viz 5). Klinické pokusy rovněž ukázaly jeho potenciální terapeutickou hodnotu. Leukocytámí a fibroblastové interferony vykazují velmi jasné podobnosti ve svých biologických vlastnostech navzdory skutečnosti, že stupeň homologity na aminokyselinové úrovni je relativně nízký. Po chemické stránce obsahují obě skupiny interferonů od 165 do 166 aminokyselin ajsou to bílkoviny stálé vůči kyselinám.

Třetí skupina zahrnuje lidský imunitní interferon (γ-interferon, IIF nebo IFN-γ), jinak označovaný též jako lidský gama interferon. Lidský imunitní interferon, ke kterému se vztahuje předložený vynález, je na rozdíl od a- a β-interferonů labilní při pH 2; je produkován hlavně po mitogenetické indukci lymfocytů ajest rovněž zřetelně antigenově odlišný. Až do nedávná se 25 lidský imunitní interferon dal pouze sledovat ve velmi nízkých hladinách, což bylo evidentně na překážku jeho charakterizaci. Nedávno byly publikovány značně rozsáhlé, ale ještě jen částečné způsoby čištění lidského imunitního interferonů (viz 6). Bylo uvedeno, že výchozí sloučenina byla vyprodukována z lymfocytámích kultur stimulovaných kombinací fytohemagglutinu s forbolesterem, a že byla čištěna řadou chromatografických dělení. Tímto postupem byl získán 30 produkt mající molekulární hmotnost 58 000.

Lidský imunitní interferon byl vyprodukován ve velmi malých množstvích translací mRNA (informační ribonukleové kyseliny) v oocytech; produkt vykazoval rysy interferonové aktivity lidského imunitního interferonů a postup dával naději, že lze synthetizovat a klonovat imunitní 35 interfeonovou cDNA (komplementární kyselinu desoxyribonukleovou) (viz 7).

Množství imunitního interferonů, které bylo až dosud získáno, zajisté nedostačovalo k provedení jednoznačných pokusů o charakterizaci přečištěné sloučeniny a o stanovení jejích biologických vlastností. Přesto však studie in vitro provedené se surovými preparáty, a rovněž pokusy in vivo 40 s přečištěnými preparáty γ-interferonu naznačily, že primární význam imunitního interferonů může spočívat v jeho použití jako imunoregulačního činidla (viz 8, 9). Imunitní interferon má nejenom antivirovou a protibuněčnou účinnost, společnou všem lidským interferonům, ale vykazuje též potenciační účinnost těchto aktivit u a- a β-interferonu (viz 10). Bylo rovněž publikováno, že in vitro antiproliferační účinnost γ-interferonu na nádorové buňky jest přibližně 45 lOx až lOOx vyšší než obdobná účinnost interferonů jiných skupin (viz 8, 11, 12). Tento výsledek, spolu s vyslovenou imunoregulační úlohou (viz 8, 9), naznačuje mnohem vyšší protinádorovou účinnost zmíněného IFN-γ oproti IFN-α a IFN-β. Pokusy in vivo s myšími a murinovými IFN-γ preparáty prokázaly jejich zřetelnou nadřazenost nad antivirově indukovanými interferony v jejich protinádorovém účinku vůči osteogennímu sarkomu (viz 13).

Všechny uvedené studie provedené před tímto vynálezem byly vzhledem k velmi nízké dostupnosti imunitního interferonů prováděny s dosti surovými preparáty. Nicméně však nesporně naznačily velmi důležité biologické vlastnosti imunitního interferonů. Imunitní

-2CZ 282154 B6 interferon má nejen mocnou antivirovou účinnost, ale pravděpodobně i silnou imunoregulační a protinádorovou účinnost, které ho zřetelně určují jako potenciálně velmi nadějného kandidáta pro klinické zkoušení.

Autoři vynálezu předpokládali, že aplikace technologie rekombinace DNA by byla nejefektivnější cestou k zajištění potřebných velkých množství lidského imunitního interferonu. Ať již bude či nebude takto vyprodukovaný materiál glykosylovaný, ·což se pokládá za charakteristické pro nativní, z lidských zdrojů získanou surovinu, bude pravděpodobně vykazovat bioaktivitu umožňující jeho klinické použití při léčení širokého okruhu virových, neoplastických a imunosuprimovaných stavů nebo onemocnění.

B. Technologie rekombinace DNA

Technologie rekombinace DNA dosáhla stadia, ve kterém se snadno dochází k některým klamným závěrům. Molekulární biologové jsou schopni rekombinovat různé DNA sekvence s určitou snadností, a vytvářejí nové DNA jednotky-schopné produkovat rozsáhlá množství exogenních bílkovinových produktů v transformovaných mikrobech. K disposici jsou obecné prostředky a metody pro in vitro ligaci různých fragmentů DNA s tupým nebo lepivým (kohesním) koncem, produkující potenciální exprese schopné nosiče, kterých lze používat ktransformování specifických organismů atak zaměřit jejich účinnou synthesu na žádaný exogenní produkt. Nicméně však, vztaženo na individuální produkt, zůstává uvedená cesta poněkud složitější a věda dosud nepokročila do stadia, kdy by bylo možné činit správné předpovědi úspěchu. A vskutku ti, kteří předvídají úspěšné výsledky bez podložení experimentálními daty, činí tak se značným rizikem neúčinnosti.

Plasmid, chromosomů prostá smyčka dvouvláknové DNA nalezená v bakteriích a v jiných mikrobech, často v mnohonásobných kopiích v jedné buňce, zůstává základním prvkem technologie rekombinace DNA. V informaci zakódované v plasmidické DNA jest včleněna informace potřebná k reprodukci plasmidu do dceřinných buněk (tj. počátek replikace) a obvykle jedna nebo více fenotypových selekčních charakteristik, jako je v případě bakterií resistence vůči antibiotikům; tyto selekční charakteristiky umožňují, že klony hostitelské buňky obsahující plasmid, který je předmětem našeho zájmu, moho.u být rozpoznány, vybrány a přednostně pěstovány v selektivním růstovém prostředí. Užitečnost plasmidů spočívá ve skutečnosti, že je lze specificky štěpit jednou nebo druhou restrikční endonukleasou neboli restrikčním enzymem, přičemž každá z těchto endonukleas rozpoznává na plasmidické DNA odlišné, specifické místo štěpení. Po rozštěpení lze do plasmidu vpravit heterologické geny nebo fragmenty genů buď přímým připojením v místě rozštěpení, nebo připojením na rekonstruovaných koncích sousedících s místem rozštěpení. Takto se vytvoří tak zvaný replikovatelný nosič schopný exprese. Rekombinace DNA se provádí vně buňky, ale vzniklý rekombinovaný replikovatelný, exprese schopný nosič, nebo plasmid, lze zavádět do buněk postupem známým jako transformace, a kultivací získaného transformantu lze připravovat velká množství rekombinovaného nosiče. Kromě toho, podle toho kam se gen vhodně zavede vzhledem k částem plasmidu, které řídí transkripci (přepis) a translaci (překlad) zakódovaných DNA informací, lze získaný exprese schopný nosič použít k aktuální produkci polypeptidické sekvence, pro kterou je vestavěný gen kodován; tento postup se v popisu vynálezu označuje jako exprese.

Exprese je iniciována v oblasti známé jako promotor, která je rozpoznávána a na kterou se váže RNA polymerasa. V transkripční fázi exprese se DNA odvinuje a vystavuje jako templát pro zahájení synthesy informační RNA z DNA sekvence. Informační RNA se vzápětí překládá do formy polypeptidu, který má takovou aminokyselinovou sekvenci, jaká je zakódovaná v mRNA. Každá aminokyselina je zakódovaná jediným nukleotidickým tripletem neboli kodonem, jejichž určitý soubor tvoří strukturální gen, tj. tu část, která kóduje sekvenci aminokyselin exprimovaného polypeptidického produktu. Translace je iniciována startovacím signálem (což je

-3CZ 282154 B6 obvykle kodon ATG, který se ve vzniklé informační RNA stane AUG). Konec translace a tím i konec produkování dalších aminokyselinových jednotek, určují tak zvané stop-kodony. Vzniklý produkt lze získat lysou hostitelské buňky, jeho oddělením od ostatních bílkovin a čištěním za použití vhodných metod.

V praxi se může při použití technologie rekombinace DNA exprimovat buď jenom heterologní polypeptid - tak zvaná‘přímá exprese, nebo se alternativně může exprimovat heterologní polypeptid vázaný na část aminokyselinové sekvence homologního polypeptidu. V posléze uvedeném případě se žádaný bioaktivní produkt někdy stane uvnitř fušovaného homologněheterologního polypeptidu bioinaktivním až do té doby, dokud není zmíněný fušovaný produkt rozštěpen v extracelulámím prostředí; viz britský patent číslo 2 007 676 A a publikaci Wetzela v časopisu Američan Scientist 68, 664 (1980).

C. Technologie kultivace buněk.

Způsob přípravy buněčných nebo tkáňových kultur pro studium genetiky a buněčné fysiologie jest dobře propracovaný. K disposici jsou prostředky a metody pro udržování permanentních buněčných linií, připravených postupnými sériovými přenosy z isolátu normálních buněk. Pro výzkumné použití se takové buněčné linie udržují buď na pevném nosiči v kapalném prostředí, nebo kultivací v suspensi obsahující podpůrné živné látky. Zvětšování laboratorních kultivací do velkých výrobních násad je podle všeho spojeno pouze s mechanickými problémy. Pokud se týká dalších základních údajů, odkazujeme na monografii Microbiology, 2. vydání, Harper a Row lne., Hagerstown, Maryland (1973), zvláště na str. 1122 a další, a na časopis Scietific Američan 245, str. 66 a další (1981).

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je lidský imunitní interferon a jeho derivát, oba s aminokyselinovou sekvencí, znázorněnou na připojeném obr. 5, bez jiného proteinu, s nímž je obvykle sražený, jakož i jeho alely.

Derivát lidského imunitního interferonu s aminokyselinovou sekvencí podle obr. 5 a jeho alela mají ve formě kyselinového derivátu funkci lidského imunitního interferonu.

Výhodný derivát lidského imunitního interferonu obsahuje aminokyselinový methionin na Nkonci, zejména zralé sekvence.

Lidský imunitní interferon s aminokyselinovou sekvencí, znázorněnou na obr. 5, nebo jeho alela nebo derivát s funkcí lidského imunitního interferonu mohou být bez přidružené přirozené glykosylace.

Lidský imunitní interferon s aminokyselinovou sekvencí podle obr. 5 nebo jeho alela nebo derivát s funkcí lidského imunitního interferonu jsou vytvářené expresí DNA, kódující aminokyselinovou sekvenci interferonu, v rekombinantní hostitelské buňce.

Lidský imunitní interferon může být vytvářený expresí kódující rekombinantní DNA sekvence v buněčné linii savců, přičemž buněčnou linií savců je zejména buněčná linie COS-7 opic.

Předmětem tohoto vynálezu je také isolát.DNA obsahující DNA sekvenci, kódující lidský interferon, s aminokyselinovou sekvencí, znázorněnou na obr. 5, nebo jeho alela nebo derivát s funkcí lidského imunitního interferonu.

-4CZ 282154 B6

Dalším předmětem vynálezu je rekombinantní klonovací vektor obsahující DNA sekvenci, kódující lidský imunitní interferon, s aminokyselinovou sekvencí podle obr. 2, nebo jeho alela nebo derivát s funkcí lidského imunitního interferonu.

Předmětem tohoto vynálezu je rovněž replikovatelný expresní vektor schopný exprimovat v transformantním mikroorganismu nebo buněčné kultuře DNA sekvenci, kódující lidský imunitní interferon, s aminokyselinovou sekvencí znázorněnou na obr. 5, nebo jeho alela nebo derivát s funkcí lidského imunitního interferonu.

io Jiným předmětem vynálezu je rekombinantní mikroorganismus nebo buněčná kultura schopné exprimovat imunitní interferon s aminokyselinovou sekvencí podle obr. 5 nebo jeho alelu nebo derivát s funkcí lidského imunitního interferonu.

Výhodným rekombinantním mikroorganismem je kmen E. coli nebo kvasinkový kmen.

Buněčnou kulturou je buněčná linie savců, zejména buněčná linie opic.

Dalším předmětem tohoto vynálezu je farmaceutický přípravek pro léčení tumorových nebo virových onemocnění nebo imunosupresivních stavů, který jako účinnou látku obsahuje 20 terapeuticky účinné množství lidského imunitního interferonu podle vynálezu ve spojení s farmaceuticky přijatelným nosičem, zejména určený pro parenterální podávání.

Předmětem tohoto vynálezu je dále způsob výroby lidského imunitního interferonu. Přitom se rekombinantní hostitelské buňky přeměněné expresním vektorem, obsahujícím DNA kódující 25 lidský imunitní interferon s aminokyselinovou sekvencí, znázorněnou na obr. 5, nebo jeho alelu nebo derivát s funkcí lidského imunitního interferonu, kultivují za podmínek umožňujících expresi uvedené DNA sekvence za vzniku lidského imunitního interferonu, který se potom izoluje.

Posledním předmětem tohoto vynálezu je použití lidského imunitního interferonu podle vynálezu pro přípravu farmaceutických přípravků k léčení tumorových nebo virových onemocnění nebo imunosupresivních stavů.

Vynález je založen na objevu autorů, že se technologie rekombinace DNA dá úspěšně používat 35 k výrobě lidského imunitního interferonu, s výhodou v jeho přímo použitelné formě, a to v množstvích dostatečných k zahájení a provádění testů na zvířatech a klinických zkoušek jakožto nezbytného předpokladu pro schválení komerčních záměrů. Uvedenou technologií získaný produkt je vhodný, ve všech svých formách, k použití pro profýlaktické nebo terapeutické ošetřování pacientů s virovými infekcemi nebo s maligními, imunosuprimovanými 40 nebo imunodeficitními stavy. Pod pojmem různé formy imunitního interferonu jsou zahrnuty různé možné oligomemí formy, které mohou zahrnovat i glykosylované formy. Produkt lze vyrábět geneticky zkonstruovanými transformovanými mikroorganismy nebo systémy transformovaných buněčných kultur. Termín transformovaná buňka, jak je zde používán, se týká buněk, do nichž byla vložena DNA. Tato DNA vznikla rekombinací exogenní DNA. Termín 45 transformovaná buňka, jak je zde používán, se týká také potomstva jakékoliv takové buňky, která obsahuje takto zavedenou DNA.

Existuje tak nyní potenciál, jak připravit a isolovat lidský imunitní interferon účinnějším způsobem než to bylo možné až dosud. Významným rysem předloženého vynálezu, v jeho 50 nej výhodnějším provedení je uskutečnění genetického řízení mikroorganismu nebo buněčné kultury tak, aby produkovaly lidský imunitní interferon v isolovatelných množstvích, vylučovaných z hostitelské buňky v maturované formě.

Vynález se týká lidského imunitního interferonu produkovaného shora uvedeným postupem a prostředků a způsobů kjeho výrobě. Vynález se dále týká replikace schopných DNA nosičů schopných exprese, obsahujících zakotvené genové sekvence kódující lidský imunitní interferon v exprimovatelné formě. Vynález je dále zaměřen na kmeny mikroorganismů nebo na buněčné kultury transformované shora popsanými nosiči schopnými exprese a na mikrobiální nebo buněčné kultury takto transformovaných kmenů nebo kultur, schopné produkovat lidský imunitní interferon. Z jiného aspektu se vynález týká různých postupů použitelných pro přípravu sekvencí genu pro uvedený imunitní interferon, DNA nosičů schopných exprese, potřebných kmenů mikroorganismů a buněčných kultur, a dalších specifických prostředků. Vynález je dále zaměřen na přípravu fermentačních kultur zmíněných mikroorganismů a buněčných kultur. Vynález se posléze týká přípravy lidského imunitního interferonu jako produktu přímé exprese, vylučovaného z hostitelské buňky v maturované formě. Tímto postupem se může využít gen kódující sekvenci maturovaného lidského imunitního interferonu plus 5’ sousedící DNA kódující signální polypeptid. Předpokládá se, že signální polypeptid podporuje transport molekuly k buněčné stěně hostitelského organismu, kde je štěpena během procesu vylučování maturovaného lidského interferonu. Tenta způsob dovoluje, že se žádaný maturovaný imunitní interferon může isolovat a čistit bez použití postupů určených k eliminaci nečistot povahy buněčných zbytků nebo intracelulárních bílkovin hostitele.

Výraz maturovaný lidský imunitní interferon značí mikrobiální nebo buněčnou kultivační produkci lidského imunitního interferonu nedoprovázeného signálním peptidem nebo presekvenčním peptidem. který bezprostředně doprovází translaci lidské imunitní interferonové mRNA. Podle vy nálezu jest tak zajištěno, že první rekombinantní lidský imunitní interferon má ve své sekvenci jako první aminokyselinu methionin (přítomný prostřednictvím ATG startovacího signálního kodonu, vloženého na počátek strukturálního genu) nebo, v případě, že methionin jest intra- nebo extracelulámě odštěpen, svoji normálně první aminokyselinu cystein. Maturovaný lidský imunitní interferon může být v souhlase s vynálezem rovněž produkován spolu s konjugovanou bílkovinou jiného druhu než je obvyklý signální polypeptid, přičemž zmíněný konjugát se dá specificky štěpit v intra- nebo extracelulámím prostředí; viz též britský patent číslo 2 007 676 A. Posléze může být maturovaný lidský imunitní interferon produkován přímou expresí, bez nutnosti odštěpování jakéhokoliv cizího, nadbytečného polypeptidu. Tento způsob jest zvláště významný tehdy, když použitý hostitel nemůže, nebo nemůže dostatečně účinně, odstranit signální peptid v případě, že exprese schopný nosič je určen k expresi maturovaného lidského interferonu spolu s navázaným signálním peptidem. Vyprodukovaný maturovaný lidský imunitní interferon se isoluje a čistí až do úrovně vhodné pro použití k ošetřování virových, maligních, imunosuprimovaných nebo imunodeficitních stavů.

Podle vynálezu se lidský imunitní interferon získává následujícím postupem:

1. Lidské tkáně, na příklad tkáň lidské sleziny nebo periferní krevní lymfocyty, se kultivují v přítomnosti mitogenů, které stimulují produkci imunitního interferonu.

2. Buněčné pelety z uvedených buněčných kultur se extrahují v přítomnosti inhibitoru ribonukleasy a isolují se všechny cytoplasmické RNA.

3. Na sloupci oligo-deoxythyminribosidu (oligo-dT) se isoluje celková mRNA v polyadenylátové formě. Tato mRNA se frakcionuje podle velikosti molekuly za použití sacharosového hustotního gradientu a elektroforesy na kyselino-močovinovém gelu.

4. Vhodná mRNA (o molekulové hmotnosti odpovídající sedimentační konstantě 12 až 18S) se převede na odpovídající jednovláknovou komplementární DNA (cDNA), ze které se vyrobí dvouvláknová cDNA. Po jejím zakončení polydeoxycytidinem (poly-dC) se provede inserce této cDNA do vhodného vektoru, na příklad do plasmidu nesoucího jeden nebo více fenotypových markérů.

-6CZ 282154 B6

5. Takto připravené vektory se použijí k transformování bakteriálních buněk ze kterých se sestaví banka kolonií. Radioaktivně značená cDNA připravená jednak z indukované a jednak z neindukované mRNA, odvozené shora uvedeným způsobem, se použije k separátnímu prozkoumání duplikátu banky kolonií. Přebytečná cDNA se pak odstraní a kolonie se exponují na film citlivý na X-paprsky a tak se identifikují klony s indukovanou cDNA.

6. Z klonů obsahujících indukovanou cDNA se isoluje odpovídající plasmidická DNA a provede se stanovení sekvence bází nukleových kyselin.

7. V prvním uspořádání se pak DNA se stanovenou sekvencí uzpůsobí in vitro k inserci do vhodného exprese schopného nosiče, který se pak použije k transformování hostitelské buňky E. coli, která se vzápětí podrobí kultivaci v živném prostředí, při které dochází k expresi žádaného lidského imunitního interferonu.

8. Takto exprimovaný lidský imunitní interferon má ve své maturované formě nepochybně 146 aminokyselin, začíná aminokyselinou cysteinem a má velmi bazický charakter. Jeho monomerická molekulární hmotnost byla vypočtena na 17 140. Pravděpodobně v důsledku přítomnosti četných bazických zbytků, hydrofobicity, tvorby solných můstků a podobných vlivů se jeho molekuly navzájem spojují do oligomemích forem, na příklad do formy dimeru, trimeru nebo tetrameru. Vysoké molekulární hmotnosti pozorované u přirozeného materiálu (viz 6), které nemohou být vysvětleny na základě samotné aminokyselinové sekvence, mohou být připočteny na vrub uvedeným oligomerním formám a rovněž příspěvku sacharidů z glykosylace, ke které dochází po translaci.

9. Maturovaná forma lidského imunitního interferonu je v některých hostitelských buněčných systémech, zvláště když je vázaná na exprese schopný nosič tak, aby byla exprimována společně sjeho signálním peptidem vylučována do živného prostředí buněčné kultury, což významně napomáhá při isolaci produktu a při čisticích postupech.

Výhodné provádění způsobu podle vynálezu je podrobně popsáno níže.

Příklady provedení vynálezu

A. Mikroorganismy a buněčné kultury

1. Bakteriální kmeny a promotory

Práce uvedené v popisu vynálezu byly prováděny za použití, kromě jiných, mikroorganismu Escherichia coli K-12, kmene 294 (zakončení A, thi', hsr’, _khsm⁺), který je popsán v britské patentové publikaci číslo 2 055 382 A. Tento kmen je uložen v Americké sbírce typových kultur (ATCC) pod ATCC příjmovým číslem 31 446. Použitelné jsou však i četné jiné mikrobiální kmeny, včetně známých kmenů E. coli, jako E. coli B, E. coli x 1776 (ATCC číslo 31 537) a E. coli W 3110 F, λ', protrofický) (ATCC číslo 27 325), nebo další mikrobiální kmeny, z nichž četné jsou uloženy a potencionálně dostupné v uznávaných ústavech pro ukládání mikroorganismů, jako ve shora zmíněné Americké sbírce typových kultur (ATCC); viz ATCC katalogový seznam. Viz též NSR patentový zveřejňovací spis 2 644 432. Jako příklad těchto dalších mikroorganismů lze uvést různé druhy Bacilli, jako Bacillus subtilis ajiné enterobakteriální mikroorganismy, ze kterých lze zmínit na příklad mikroorganismy Salmonella typhimurium a Serratia marcesans, využívající plasmidy, které mohou replikovat a exprimovat heterologické genové sekvence v nich obsažené.

K. iniciaci a k udržování mikrobiální produkce heterologních polypeptidů lze na příklad s výhodou používat beta-laktamasových a laktosových promotorových systémů. Podrobnosti tykající se uspořádání a konstruování těchto promotorových systémů byly publikovány Changem a spolupracovníky v časopisu Nátuře 275, 617 (1978) a Itakurou se spolupracovníky v časopisu Science 198, 1056 (1977), na které zde odkazujeme. Nedávno byl vyvinut systém založený na tryptofanu (trp), tak zvaný trp-promotorový systém. Podrobnosti týkající se uspořádání a konstruování tohoto systému · byly publikovány Goeddelem a spolupracovníky wčasopisu Nucleic Acids Research 8, 4057 (1980) a Kleidem a spolupracovníky v SSSR patentu číslo 133 296, registrovaném 24. dubna 1980, na které zde odkazujeme. Byly objeveny a použity četné další mikrobiální promotory, a byly publikovány podrobnosti týkající se jejich nukleotidických sekvencí, dovolující odborníkům funkčně je navázat do plasmidických vektorů; viz na příklad Siebenlist se spolupracovníky, časopis Cell 20, 269 (1980), na které zde odkazujeme.

2. Kvasničné kmeny a kvasničné promotory

Exprese schopný systém těchto mikroorganismů může být rovněž využíván plasmidem YRp7 (viz 14, 15, 16), který je schopný selekce a replikace jak v mikroorganismu E. coli, tak v kvasinkách Sacharomyces cerevisiae. Pro selekci v kvasinkách obsahuje tento plasmid gen TRPÍ (viz 14, 15, 16), který doplňuje (tj. připouští růst v nepřítomnosti tryptofanu) kvasinky, mající mutace na tomto genu (nalezené na chromosomu IV kvasinek, viz 17). Při způsobu podle vynálezu je používán kvasinkový kmen RH 218 (viz 18), který je uložený v Americké sbírce typových kultur pod ATCC číslem 44 076. Je však zřejmé, že jakýkoliv kmen Sacharomyces cerevisiae, obsahující mutaci, která vytváří buněčný trp 1, může být účinným prostředím pro expresi plasmidu obsahujícího exprese schopný systém. Příkladem dalšího kmenu, který může být k těmto účelům používán, je pep4-l (viz 19). Tento tryptofanový auxotrofní kmen má rovněž bodovou mutaci v TRPÍ genu.

Umístí-li se na 5'-stranu nekvasinkového genu 5’-přilehlá DNA sekvence (promotor) z kvasinkového genu (pro alkoholdehydrogenasu 1), může tento gen podporovat expresi cizího gen-u v kvasinkách, umístí-li se do plasmidu použitého k transformování kvasinky. Správná exprese nekvasinkového genu v kvasinkách vyžaduje vedle promotoru ještě druhou kvasinkovou sekvenci umístěnou na 3'-konci nekvasinkového genu v plasmidu, která umožňuje vhodnou terminaci transkripce a polyadenylace v kvasinkách. Tohoto promotoru se dá vhodně používat při způsobu podle předloženého vynálezu, a rovněž dalších podobných, viz níže. Ve výhodném provedení se 5'-přilehlá sekvence kvasinkového 3-fosfoglycerátkinasového genu (viz 20) umístí proti proudu od strukturálního genu a pak následuje opět DNA obsahující signály pro terminaci - polyadenylaci, na příklad TRPÍ gen (viz 14, 15, 16) nebo fosfoglycerátkinasový gen (PGK) (viz 20).

Poněvadž kvasinková 5'-přilehlá sekvence (ve spojení s 3' kvasinkovou terminační DNA) (viz níže) může fungovat jako promotor exprese cizorodých genů v kvasinkách, lze analogicky předpokládat, že se pro expresi důležitých genových produktů dá používat 5-přilehlých sekvencí jakéhokoliv vysoce exprimovaného kvasinkového genu. Jelikož za některých okolností exprimují kvasinky až 65 % jejich rozpustné bílkoviny ve formě glykolytických enzymů (viz 21) a protože se ukazuje, že toto vysoké množství vyplývá z produkce vysokých hladin individuálních mRNA (viz 22), bylo by možné používat 5’-přilehlých sekvencí jakéhokoliv jiného glykolytického genu pro uvedené exprimační účely, na příklad enolasy, glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenasy. hexokinasy, pyruvátdekarboxylasy, fosfofruktokinasy, glukoso-6-fosfátisomerasy, 3fosfoglycerátmutasy, pyruvátkinasy, triosofosfátisomerasy, fosfoglukosoisomerasy a glukokinasy. Jakýchkoliv 3’-přilehlých sekvencí těchto genů by bylo rovněž možné používat pro vhodnou terminaci a mRNA polyadenylaci v takovém exprese schopném systému - viz výše. Některé jiné vysoce exprimované geny jsou na příklad geny pro kyselé fosfatasy (viz 23) a geny, které exprimují vysoké hladiny produktů v důsledku mutací v 5'-přilehlých oblastech (mutanty, které zvyšují expresi), obvykle v důsledku přítomnosti TY1 převoditelného prvku (viz 24).

-8CZ 282154 B6

Předpokládá se, že všechny shora uvedené geny jsou transkribovány kvasinkovou RNA polymerasou II (viz 24). Je možné, že by. v podobných konstrukcích schopných exprese byly rovněž použitelné RNA polymerasy I a III, které transkribují geny pro ribosomální RNA, 5S RNA a tRNA (viz 24, 25).

Posléze, četné kvasinkové promotory obsahují rovněž transkripční kontroly, takže je lze vypojit nebo zapojit změnou růstových podmínek. Jako příklady takových kvasinkových promotorů lze uvést geny, které produkují následující bílkoviny: alkoholdehydrogenasa II, isocytochrom-c, kyselá fosfatasa, degradační enzymy spojené s metabolismem dusíku, glyceraldehyd-3ío fosfátdehydrogenasa a enzymy zodpovědné za využívání maltosy a galaktosy (viz 22). Uvedená kontrolní oblast by mohla být velmi užitečná při kontrole exprese bílkovinového produktu zvláště když tyto produkty jsou toxické vůči kvasince. Bylo by rovněž možné připojit kontrolní oblast jedné 5'-přilehlé sekvence na 5'-přilehlou sekvenci obsahující promotor z vysoce exprimovaného genu. To by vedlo k hybridnímu promotoru a bylo by to proveditelné, neboť se 15 zdá, že kontrolní oblast a promotor mají fyzikálně odlišné DNA sekvence.

3. Systémy buněčných kultur a vektory buněčných kultur

Propagace buněk obratlovců v kultuře (tkáňová kultura) se v posledních letech stala rutinní 20 záležitostí (viz monografie Tissue Culture”, Academie Press, vyd. Kruše a Patterson, 1973). Při způsobu podle vynálezu bylo používáno fibroblastů z opičích ledvin linie COS-7 jakožto hostitele pro produkci imunitního interferonu (viz 25a). Avšak pokusy, které jsou zde detailně popsány, lze provádět s jakoukoliv buněčnou linií, která je schopná replikace a exprese kompatibilního vektoru, na příklad s buněčnými liniemi WI 38, ΒΗΚ, 3T3, CHO, VĚRO a HeLa 25 buněk. Pokud se týká požadavků na exprese schopný vektor, vyžaduje se dále přítomnost zdroje replikace a promotoru umístěného v čele exprimovaného genu, spolu s nutností přítomnosti ribosomových vazebných míst, míst pro spojování RNA, míst pro polyadenylaci a sekvencí pro transkripční terminátory. I když tyto základní prvky obsažené ve viru SV 40 jsou využívány při způsobu podle tohoto vynálezu, je třeba zdůraznit, že vynález, i když je popsán na příkladech 30 výhodného provedení, není omezen jen na tyto sekvence. Tak na příklad lze používat jako zdroje replikace jiných virových vektorů (na příklad polyoma, adeno, VSV, BPV atak dále), a rovněž buněčných zdrojů DNA replikace, které mohou plnit svou funkci v neintegrovaném stavu.

B. Vektorové systémy

1. Přímá exprese maturovaného imunitního interferonu v E. coli.

Postup použitý k dosazení přímé exprese imunitního IFN-γ v mikroorganismu E. coli ve formě maturovaného interferonového polypeptidu (minus signální sekvence) jest variantou postupu 40 použitého dříve pro expresi lidského růstového hormonu (viz 26) a lidského leukocytámího interferonu (viz 1), pokud se týká kombinace synthetických (N-terminálních) a cDNA kyselin.

Jak bylo dedukováno z nukleotidové sekvence plasmidu p69, popsané níže, a ze srovnání se známým místem štěpení mezi signálním peptidem a maturovaným polypeptidem v případě 45 několika interferonů IFN-α (viz 2), má interferon IFN-γ hydrofobní signální peptid o 20 aminokyselinách následovaný 146 aminokyselinami maturovaného IFN-γ (viz obr. 5). Jak je znázorněno na obr. 7, místo štěpení restrikční endoňukleasou BstNI jest výhodně umístěno u aminokyseliny 4 maturovaného IFN-γ. Byly sestaveny dva synthetické oligodeoxynukleotidy, které zahrnují ATG kodon pro iniciaci translace, kodony pro aminokyseliny 1, 2 a 3 (cystein 50 tyrosin - cystein) a vytváří EcoRI kohesní konec. Tyto deoxyoligonukleotidy byly navázány na BstNI až Pstl fragment plasmidu p69 o 100 párech bází a zkonstruován syntheticko-přirozený hybridní gen o 1115 párech bází, který kóduje interferon IFN-γ a který je vázán EcoRI a Pstí restrikčními místy. Tento gen byl vložen do plasmidu pLelF A trp 103 mezi jeho EcoRI a Pstl

-9CZ 282154 B6 restrikční místa a byl získán exprese schopný plasmid pIFN-γ trp 48. V tomto plasmidu jest exprimován IFN-γ gen pod kontrolou trp promotoru E. coli. Plasmid pLelF A trp 103 jest derivátem plasmidu pLelF A 25, ve kterém EcoRI restrikční místo umístěné vně LelF A genu bylo odstraněno; postup používaný k odstranění tohoto EcoRI místa byl popsán dříve (viz 27).

2. Exprese v kvasinkách

Za účelem exprese heterologního genu, jako cDNA pro imunitní interferon, v kvasince je nutné zkonstruovat plasmidový vektor obsahující čtyři komponenty. První komponenta je část, která bere v úvahu transformaci obou mikroorganismů, jak E. coli tak kvasinky, a proto musí obsahovat výběru schopný gen z každého tohoto organismu; v případě způsobu podle vynálezu je to gen pro ampicilinovou resistenci z E. coli a gen TRPÍ z kvasinek. Tato komponenta vyžaduje rovněž zdroj replikace z obou organismů, aby mohla být udržována jako plasmidická DNA v obou organismech; ve zde uvedeném případě je to E. coli zdroj z plasmidu pBR 322 a ars 1 zdroj z chromosomu III kvasinky.

Druhou komponentou plasmidu je 5'-přilehlá sekvence z vysoce exprimovaného kvasinkového genu, která podporuje transkripci po proudu umístěného strukturálního genu. Ve zde uvedeném případu se jako 5'-přilehlé sekvence používá sekvence z kvasinkového genu pro 3fosfoglycerátkinasu (PGK). Tento fragment byl zkonstruován tím způsobem, že byl odstraněn ATG kodon z PGK strukturální sekvence a dále ještě 8 párů bází (bp) proti proudu od tohoto ATG. Uvedená sekvence byla nahrazena sekvencí obsahující jak Xbal tak EcoRI restrikční místa, za účelem vhodného navázání této 5'-přilehlé sekvence na strukturální gen.

Třetí komponentou systému je strukturální gen zkonstruovaný tím způsobem, aby obsahoval jak ATG startovací signál pro translaci, tak ATG stop signál pro translaci. Isolace a zkonstruování takového genu je popsána níže.

Čtvrtou komponentou jest kvasinková DNA sekvence obsahující 3'-přilehlou sekvenci kvasinkového genu, která obsahuje vhodné signály pro zakončení transkripce a pro polyadenylaci.

Jsou-li všechny výše uvedené komponenty přítomny, může být v kvasinkách produkován imunitní interferon.

3. Exprese v savčí buněčné kultuře

Strategie synthesy imunitního interferonu v savčí buněčné kultuře spočívá na vyvinutí vektoru schopného jak autonomní replikace, tak exprese cizorodého genu za kontroly heterologní transkripční jednotky. Replikace tohoto vektoru ve tkáňové kultuře bylo dosaženo tím, že se opatřil zdroj DNA replikace (odvozený od viru SV 40) a ze se umožnila pomocná funkce (T antigen) zavedením vektoru do buněčné linie endogenně exprimující tento antigen (viz 28, 29). Bývalý promotor viru SV 40 předchází strukturální gen interferonu a zajišťuje transkripci genu.

Vektor používaný k dosažení exprese interferonu IFN-γ se skládá ze sekvencí plasmidu pBR 322, které obstarávají jak volitelný markér pro selekci v E. coli (ampicilinovou resistenci), tak E. coli zdroj pro DNA replikaci. Tyto sekvence jsou odvozeny z plasmidu pML-1 (viz 28) a obsahují oblast zahrnující EcoRI a BamHI restrikční místa. Zdroj SV 40 jest odvozen z PvuII až HindlII fragmentu o 342 párech bází zahrnující tuto oblast (viz 30, 31); oba konce jsou při tom převedeny na EcoRI zakončení. Tyto sekvence, kromě toho, že obsahují virový zdroj DNA replikace, kódují promotor jak pro prvotní, tak pro pozdější transkripční jednotku. Orientace oblasti zdroje SV 40 je taková, že promotor pro pozdější transkripční jednotku je umístěn blíže

- 10CZ 282154 B6 ke genu kódujícímu interferon.

Stručný popis připojených obrázků:

Na obrázku 1 je znázorněna sacharosová gradientová centrifugace indukované periferní krevní lymfocytámí (PBL) poly(A) + RNA. Byla pozorována dvě maxima interferonové aktivity (jak je znázorněno šrafovanými sloupci) o velikosti odpovídající sedimentační konstantě 12S a 16S. Umístění ribosomálních RNA markérů (které byly odstřeďovány nezávisle) je označeno nad křivkou absorbance.

Na obrázku 2 je znázorněn průběh elektroforesy indukované PBL poly(A) + RNA na kyselinomočovinové agarose. Byl pozorován pouze jeden vrchol aktivity, který se pohybuje společně se standardem RNA o velikosti 18S. Polohy ribosomálních RNA markérů, které byly podrobeny současně elektroforese na sousední dráze a které byly detegovány vybarvením ethidiumbromidem. jsou označený nad profilem aktivity.

Obrázek 3 znázorňuje hybridizační vzorky 96 kolonií s indukovanými a neindukovanými sondami cDNA, značenými radioaktivním ^j2P. Na mikrotitrační desce bylo vypěstováno 96 individuálních transformantů, zhotovena jejich kopie na dvou nitrocelulosových membránách a pak byly filtry hvbridizovány se zkušebními vzorky ³²P-cDNA, připravenými buď z indukované mRNA (horní obrázek), nebo z mRNA isolované z neindukovaných PBL kultur (neindukované sondy, dolní obrázek). Filtry byly promyty, aby se odstranila nehybridizovaná RNA a pak byly exponovány na film citlivý na X-paprsky. Uvedený soubor filtrů je reprezentativním typem 86 takových souborů (8300 nezávislých kolonií). Příklad indukovaného klonu je označen jako H 12.

Na obrázku 4 je znázorněna mapa restrikčních endonukleásových míst klonu 69 s cDNA insercí. cDNA inserce je navázána Pstl restrikčními místy (na obrázku znázorněno malými kroužky na obou koncích) a oligo dC-dG úseky (znázorněno jednoduchou čarou na obou koncích). Počet a velikost fragmentů vzniklých štěpením restrikčními nukleasami byl stanoven elektroforesou na 6% akrylamidovém gelu. Umístění restrikčních míst bylo potvrzeno stanovením sekvence nukleotidů (uvedeno na obrázku 5). Kódovací oblast největší otevřené čtecí jednotky je označena prázdným rámečkem, vyšrafovaná oblast označuje předpokládanou sekvenci signálního peptidu s 20 zbytky a vytečkovaná oblast značí sekvenci maturovaného IIF o 146 aminokyselinách. 5’konec mRNA je na levé straně obrázku, zatímco 3'-konec je napravo.

Na obrázku 5 je znázorněna nukleotidická sekvence cDNA inserce plasmidu p69, která ilustruje nejběžnější allelickou formu IFN-γ. Je rovněž uvedena dedukovaná aminokyselinová sekvence nejdelší otevřené čtecí jednotky. Domnělá signální sekvence je representována zbytky označenými SI až S20.

Na obrázku 6 je znázorněno srovnání struktury imunitní IFN-γ mRNA s analogickou strukturou leukocytámího (IFN-α) a fibroblastového (IFN-β) interferonu. mRNA z klonu 69 (označená jako imunní) obsahuje signifikantně větší množství nepřekládaných sekvencí.

Na obrázku 7 je uveden schematický diagram zkonstruování plasmidu pIFN-γ trp 48 exprimujícího interferon IFN-γ. Výchozím materiálem pro uvedenou konstrukci je Pstl cDNA inserce plasmidu p69 o 1250 párech bází.

Na obrázku 8 je znázorněn diagťam plasmidu používaného k expresi IFN-γ v opičích buňkách.

Na obrázku 9 je znázorněna Southemova hybridizace osmi různých lidských genomických DNA digerovaných restrikčním enzymem EcoRI a hybridizovaných s ³²P značeným Ddel fragmentem

- 11 CZ 282154 B6 cDNA inserce plasmidu p69 o 600 párech bází. Dva shora uvedené EcoRI fragmenty zřetelně hybridizují se zkušebním vzorkem v každém DNA vzorku.

Na obrázku 10 je znázorněna Southernova hybridizace fragmentů získaných digescí lidské genomické DNA šesti různými restrikčními endonukleasami a hybridizovaných s ³²P-značeným zkušebním vzorkem z plasmidu p69.

Na obrázku 11 je schematicky znázorněna restrikční endonukleasová mapa inserce HindlII vektoru pBl o 3100 párech bází, ze které byl isolován PGK promotor. Je uvedena inserce EcoRI a Xbal restrikčního místa v 5'-přilehlé DNA PGK genu.

Na obrázku 12 je uvedena 5’-přilehlá sekvence plus iniciační kódovací sekvence pro PGK gen před insercí Xbal a EcoRI restrikčních míst.

Na obrázku 13 je schematicky znázorněna pracovní technika použitá k insercí Xbal místa do polohy 8 v PGK promotoru a k isolaci fragmentu o 39 párech bází z 5'-přilehlé sekvence PGK obsahující toto Xbal zakončení a Sau3A zakončení.

Na obrázku 14 je schematicky znázorněno zkonstruování fragmentu o 300 párech bází, obsahující shora uvedený fragment o 39 párech bází, další PGK 5'-přilehlou sekvenci (o 265 párech bází) od Pvul až po Sau3A restrikční místo (viz obrázek 11), a EcoRI restrikční místo sousedící s Xbal místem.

Na obrázku 15 je schematicky znázorněno zkonstruování fragmentu PGK promotoru o 1500 párech bází (HindlII až EcoRI) který obsahuje, kromě fragmentu zkonstruovaného podle obrázku 14, fragment HindlII až Pvul o 1300 párech bází z PGK 5'-přilehlé sekvence (viz obrázek 11).

Na obrázku 16 je znázorněno složení exprese schopného vektoru pro lidský imunitní interferon v kvasince, obsahující modifikovaný PGK promotor, interferonovou IFN-γ cDNA aterminační oblast kvasinkového PGK genu, jak je podrobněji popsáno v následujícím popisu.

A. Zdroj, interferonové IFN-γ mRNA

Periferní krevní lymfocyty (PBL) byly získány od lidských dárců leukoforesou. Získané PBL byly dále čištěny Ficollovou-Hypaqueovou gradientovou centrifugací a pak kultivovány při koncentraci 5 x 10⁶ buněk/ml na živné půdě RPM I 1640 obsahující 1 % L-glutaminu, 25 mM HEPES a 1 % roztoku penicilinu se streptomycinem (Gibco, Grand Island, NY). Buňky byly indukovány k produkci interferonu IFN-γ mitogenním stafylokokovým enterotoxinem B (v koncentraci 1 pg/ml) a kultivovány 24 až 48 h při 37 °C v prostředí s 5 % kysličníku uhličitého. Za účelem zvýšení relativního výtěžku IFN-γ aktivity byl k PBL kulturám přidáván desacetylthymosin-a-1 (v koncentraci 0,1 pg/ml).

B. Isolace informační RNA

Celková RNA byla z PBL kultur extrahována v podstatě způsobem, který popsal Berger S. L. se spolupracovníky (viz 33). Buňky byly odstředěním peletovány a znovu suspendovány v roztoku 10 mM chloridu sodného, 10 mM hydrochloridu tris-hydroxymethylaminomethanu (Tris-HCl) (pH 7,5), 1,5 mM bezvodého chloridu hořečnatého a 10 mM ribonukleosid-vanadylového komplexu. Buňky byly lysovány přidáním NP-40 (tak, aby jeho konečná koncentrace byla 1%) a buněčná jádra byla peletována odstředěním. Supematant, který obsahoval celkovou RNA, byl několikanásobně extrahován fenolem a chloroformem. Vodná fáze byla upravena chloridem sodným na koncentraci 0,2 M NaCl a pak byla celková RNA vysrážena přidáním dvou objemů ethanolu. RNA z neindukovaných (nestimulovaných) kultur byla isolována stejnými metodami.

- 12CZ 282154 B6

K isolaci mRNA z vysrážené celkové RNA bylo použito chromatografie na oligo-dT celulose (viz 34). Typické výtěžky z 1 až 2 litrů kultivovaných PBL lymfocytů byly 5 až 10 mg celkové RNA a 50 až 200 pg poly(A) + RNA.

C. Frakcionace mRNA podle velikosti molekuly

K frakcionaci mRNA preparátů bylo poůžívário dvou metod. Tyto metody byly aplikovány nezávisle na sobě (spíše než současně) a každá vedla k signifikantnímu obohacení IFN-γ mRNA.

K frakcionaci mRNA byla použita centrifugace se sacharosovým gradientem v přítomnosti formamidu jako denaturačního činidla. Odstřeďování bylo prováděno v 70% formamidu s gradientem sacharosy od 5 do 25 % při 154 000 násobku zemského gravitačního zrychlení (g) po dobu 19 h při 20 °C (viz 32). Z vrchní části gradientu byly postupně odebírány frakce po 0,5 ml, vysráženy ethanolem a alikvotní podíl byl injikován do oocytů žáby Xenopus laevis za účelem translace mRNA (viz 35). Po inkubaci po dobu 24 h při teplotě místnosti bylo kultivační prostředí testováno na antivirovou účinnost pomocí standardního testu inhibice cytopathického účinku, za použití viru vasikulosní stomatitidy (kmen Indiana) nebo viru encefalomyokarditidy na WISH buňkách (lidské amnionové), způsobem popsaným Stewart m (viz 36), s tím rozdílem, že vzorky byly inkubovány s buňkami po dobu 24 h (místo 4 h) před tím než byly vystaveny působení viru. U RNA získané frakcionaci za užití sacharosového gradientu byly shodně pozorovány dva vrcholy aktivity (viz obr. 1). Jeden vrchol odpovídal kalkulované velikosti molekuly o sedimentační konstantě 12S (svedbergů) a obsahoval 100 až 400 jednotek antivirové účinnosti v 1 ml (ve srovnání se standardem IFN-α) na mikrogram injikované RNA. Druhý vrchol aktivity odpovídal velikosti molekuly o sedimentační konstantě 16S a vykazoval asi poloviční aktivitu pomaleji sedimentující molekuly. Je zřejmé, že každý z těchto vrcholů aktivity je nutno přičíst interferonu IFN-γ, neboť nebyla pozorována žádná aktivita, když byly tytéž frakce testovány na linii hovězích buněk (MDBK), která není chráněna lidským IFN-γ. Aktivita IFN-α a IFN-β se dá snadno zmíněným MDBK testem detegovat (viz 5).

Frakcionace mRNA (200 pg) byla podle druhé metody prováděna elektroforesou na kyselinomočovinových agarosových gelech. Deska s uvedeným agarosovým gelem (viz 37, 38) se skládá z 1,75 % agarosy. 0,025 'M citrátu sodného o pH 3,8 a 6M močoviny. Elektroforesa byla prováděna po dobu 7 h při 25 mA a při 4 °C. Pak byl gel rozřezán podle frakcí žiletkou. Jednotlivé plátky byly roztaveny při 70 °C a extrahovány dvakrát fenolem a jednou chloroformem. Získané frakce pak byly vysráženy ethanolem a· poté stanovována přítomnost interferonové IFN-γ mRNA antivirovým testem po injikování do oocytů Xenopus laevis. Pouze jeden vrchol aktivity byl pozorován ve vzorcích rozfrakcionovaného gelu (viz obr. 2). Tento vrchol aktivity se pohybuje společně s RNA o sedimentační konstantě 18S a vykázal aktivitu 600 jednotek/ml na mikrogram injikované RNA. Tato aktivita byla rovněž specifická pro interferon IFN-γ, neboť nechránila MDBK buňky.

Rozdíly pozorované mezi velikostí molekuly odpovídající vrcholům aktivity při frakcionaci pomocí sacharosového gradientu (sedimentační konstanty 12S a 16S) a pomocí kyselinomočovinového gelu (18S) mohou byt vysvětleny pozorováním, že tyto nezávislé frakcionační metody nebyly provedeny za zcela denaturujících podmínek.

D. Příprava banky kolonií obsahujících IFN-γ sekvence

Gelovou frakcionaci připravená mRNA (3 pg) byla použita k přípravě dvouvláknové cDNA standardními postupy (viz 36, 39). Získaná cDNA byla frakcionována podle velikosti molekuly na 6% polyakrylamidovém gelu. Elektroelucí byly získány frakce o dvou velikostech molekuly, jedna o 800 až 1500 párech bází (138 ng) a druhá o více než 1500 párech bází (204 ng). Podíly po 35 ng každé shora uvedené velikosti cDNA byly prodlouženy deoxycytidinovými (deoxy-C)

- 13 CZ 282154 B6 zbytky za použití terminální deoxynukleotidyltransferasy (viz 40) a anelovány s 300 ng plasmidu pBR 322 (viz 41), který byl podobně zakončen deoxyguanosinovými (deoxy-G) zbytky v místě Pstl štěpení (viz 40). Každá takto získaná anelovaná směs pak byla transformována do mikroorganismu E. coli K 12 kmene 294. Bylo získáno přibližně 8000 transformantů scDNA o 800 až 1500 párech bází a 400 transformantů s cDNA o více než 1500 párech bází.

E. Třídění banky kolonií na kolonie s indukovanou cDNA

Kolonie byly individuálně inokulovány do prohlubní mikrotitračních desek obsahujících živnou půdu LB (viz 58) plus 5 pg/ml tetracyklinu, a desky byly po přidání dimethylsulfoxidu (DMSO) na koncentraci 7 % uloženy při - 20 °C. Byly vypěstovány dvě kopie banky kolonií na nitrocelulosových filtrech a DNA z každé kolonie byly fixovány na filtru GrunsteinovýmHognessovým postupem (viz 42).

Za použití mRNÁ o velikosti odpovídající 18S, získané gelovou frakcionací jednak z indukovaných a jednak z neindukovaných PBL kultur byly připraveny zkušební vzorky cDNA značené radioaktivním ^j2P. Jako příměru bylo použito oligo-dT₁₂.i₈ (oligo-deoxythyminribosidu), za dříve popsaných reakčních podmínek (viz 1). Filtry obsahující 8000 transformantů z fragmentu cDNA o velikosti 600 až 1500 párů bází a 400 transformantů z fragmentu cDNA o velikosti vyšší než 1500 párů bází byly hybridizovány s 20 x 10⁶ cpm indukovaných ^J'P-cDNA. Duplikát banky kolonií na filtrech byl hybridizován s 20 x 10⁶ cpm neindukovaných ''P-cDNA. Hybridizace byla prováděna po dobu 16 h za použití podmínek popsaných Fritschem a spolupracovníky (viz 43). Filtry byly důkladně promyty (viz 43) a pak exponovány na film Kodak XR-5 citlivý na X-paprsky, za použití DuPont Lightning-Plus zesilovací fólie po dobu 16 až 48 h. Hybridisační vzorek z každé kolonie byl srovnán s uvedenými dvěma zkušebními vzorky. Přibližně 40 % kolonií zřetelně hybridizovalo s oběma zkušebními vzorky, a přibližně 50 % kolonií nehybridizovalo ani s jedním vzorkem (srovnej s obr. 3). 124 kolonií hybridizovalo signifikantně s indukovaným zkušebním vzorkem, ale nedetegovatelně nebo mnohem slaběji hybridizovalo s neindukovaným zkušebním vzorkem. Uvedené kolonie byly indiduálně inokulovány do prohlubní mikrotitračních desek, kultivovány, přeneseny na nitrocelulosové filtry a hybridizovány se stejným dvěma zkušebními vzorky shora popsaným způsobem. Plasmidová DNA isolovaná z každé z těchto kolonií ziychlenou metodou (viz 44) byla rovněž fixována na nitrocelulosových filtrech a hybridizována (viz 45) s indukovanými a neindukovanými zkušebními vzorky. DNA z 22 kolonií hybridizovaly pouze s indukovaným zkušebním vzorkem a byly označeny jako indukované kolonie.

F. Charakterizace indukovaných kolonií

Z 5 indukovaných kolonií byly připraveny plasmidové DNA (viz 46) a použity k charakterizaci cDNA insercí. Mapování pěti indukovaných plasmidů (p67, p68, p69, p71 a p72) pomocí restrikčních endonukleas naznačilo, že čtyři z nich mají podobné restrikční nukleasové mapy. Každý z těchto čtyř plasmidů (p67, p69, p71 a p72) má čtyři Ddel místa štěpení, dvě Hinfl místa a jedno Rsal místo v cDNA inserci. Pátý plasmid (p68) obsahuje společný Ddel fragment a zdá se, že je to krátký cDNA klon, příbuzný s ostatními čtyřmi. Homologie naznačená restrikčním endonukleasovým mapováním byla potvrzena hybridizací. Z Ddel fragmentu plasmidu p67 o 600 párech bází byl připraven ³²P značený DNA zkušební vzorek (viz 47) a použit k hybridizací (viz 42) s ostatními indukovanými koloniemi. Všech pět pomocí· restrikčních nukleas zmapovaných kolonií zkříženě hybridizovalo s tímto zkušebním vzorkem, stejně tak jako 17 ostatních indukovaných kolonií vybraných ze 124 kolonií při třídění na indukované a neindukované. Pstl digescí a gelovou elektroforesou byla stanovena délka uvedených cDNA insercí v každém z těchto zkříženě hybridizujících plasmidů. Klonem s nejdelší cDNA insercí je klon 69 s délkou inserce 1200 až 1400 párů bází. Tato DNA byla používána při všech dalších pokusech, a její restrikční endonukleasová mapa je znázorněna na obr. 4.

- 14CZ 282154 B6

Pomocí produktů exprese, produkovaných ve třech nezávislých exprese schopných systémech a vykazujícího antivirovou aktivitu, jak je podrobněji popsáno níže, bylo prokázáno, že cDNA inserce v plasmidu p69 je interferonová IFN-γ cDNA.

G. Sekvenční analýza cDNA inserce plasmidu p69

Úplná nukleotiďová sekvence cDNA inserce plasmidu p69 byla stanovená jednak terminační metodou dideoxynukleotidového řetězce (viz 48) po subklonování fragmentů do M13 vektoru mp7 (viz 49) a jednak chemickým postupem podle Maxama a Gilberta (viz 52). Nejdelší ío otevřená čtecí jednotka kóduje bílkovinu o 166 aminokyselinách, znázorněnou na obr. 5. Prvním zakódovaným aminokyselinovým zbytkem je první met kodon umístěný na 5’ konci cDNA. Prvních 20 aminokyselinových zbytků na aminokonci slouží pravděpodobně jako signální sekvence pro sekreci zbývajících 146 aminokyselin. Tato domnělá signální sekvence má vlastnosti společné s ostatními charakteristickými signálními sekvencemi, jako velikost 15 a hydrofobicitu. Kromě toho čtyři aminokyseliny nalezené u domnělé štěpné sekvence (ser-leugly-cys) jsou identické se čtyřmi aminokyselinovými zbytky nalezenými v místě štěpení řady leukocytámích interferonů (LelF B, C, D, F, a H, viz 2). Zakódovaná maturovaná aminokyselinová sekvence 146 aminokyselin (zde dále označená jako rekombinantní lidský imunitní interferon) má molekulovou hmotnost 17 140.

V zakódované bílkovinné sekvenci jsou dvě potenciální místa glykosylace (viz 50), u aminokyselin na posicích 28 až 30 (asn-gly-thr) a u aminokyselin na posicích 100 až 102 (asntyr-ser). Existence těchto míst je v souhlase s pozorovanou glykosylací lidského interferonů IFN-γ (viz 6, 51). Kromě toho jsou pouze dva přítomné cysteinové zbytky (v polohách 1 a 3) 25 stericky příliš stěsnané, takže nemohou tvořit disulfidický můstek, což je v souhlase s pozorovanou stabilitou interferonů IFN-γ v přítomnosti redukčních činidel, jako βmerkaptoethanolu (viz 51). Odvozená maturovaná aminokyselinová sekvence jest obecně značně bazická, s celkem 30 zbytky lysinu, argininu a histidinu, a pouze s celkem 19 zbytky kyseliny asparagové a kyseliny glutamové.

’ 30 mRNA struktura interferonů IFN-γ, jak byla odvozena z DNA sekvence plasmidu p69, jest zcela odlišná od struktury interferonové IFN-α (viz 1, 2) nebo IFN-β (viz 5) mRNA. Jak je znázorněno na obr. 6, je kódovací oblast interferonů IFN-γ kratší, poněvadž 5'-nepřekládané a 3'nepřekládané oblasti jsou mnohem delší než analogické oblasti jak v interferonů IFN-α, tak 35 IFN-β.

H. Exprese rekombinantního lidského imunitního interferonů v mikroorganismu E. coli

Jak je znázorněno na obr. 7, bylo 50 pg plasmidu p69 digerováno restrikční endonukleasou Pstl 40 a elektroforesou na 6% polyakrylamidovém gelu byla isolována inserce o 1250 párech bází.

Elektroelucí bylo z gelu získáno přibližně 10 pg uvedené inserce. 5 pg tohoto Pstl fragmentu bylo parciálně digerováno 3 jednotkami endonukleasy BstNI (dodavatel Bethesda Research Labs.) po dobu 15 min při 37 °C a reakční směs čištěna na 6% polyakrylamidovém gelu. Bylo isolováno přibližně 0,5 pg žádaného BstNI - Pstl fragmentu o 1100 párech bází. 45 Fosfotriesterovou metodou (viz 53) byly synthetizovány dva na obr. 7 uvedené deoxyoligonukleotidy, 5'-dAATTCATGTGTTATTGTC a 5'-dTGACAATAACACATG,· které byly fosforylovány následujícím způsobem. Do roztoku 100 pmol každého z uvedených deoxyoligonukleotidů ve 30 plitrech obsahujících 60 mM Tris-HCl (pH 8), lOmM chloridu hořečnatého, 15 mM β-merkaptoethanolu a 240 pCi (γ-³²Ρ)ΑΤΡ (dodavatel Amersham, aktivita. 50 5 0 00 Ci/mmol) bylo přidáno 12 jednotek T4 polynukleotidkinasy a reakční směs byla ponechána reagovat 30 min při 37 °C. K reakční směsi byl přidán 1 plitr 10 mM ATP a reakce nechána probíhat dalších 20 min. Po fenolchloroformové extrakci reakční směsi byly získané oligomery

- 15 CZ 282154 B6 zkombinovány s BstNI-Pstl fragmentem o 1100 párech bází a produkty vysráženy ethanolem. Ligace fragmentů byla prováděna při 20 °C po dobu 2 h ve 30 mikrolitrech obsahujících 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM chloridu hořečnatého bezvodého, 10 mM dithiothreitolu, 0,5 mM ATP a 10 jednotek T4 DNA-ligasy. Směs byla po skončení reakce digerována 1 h 30 jednotkami 5 endonukleasy Pstl a 30 jednotkami EcoRJ (za účelem odstranění polymerisačních produktů vzniklých během ligace na kohesivních koncích) a podrobena elektroforese na 6% polyakrylamidovém gelu. Elektroelucí byl získán produkt o 1115 párech bází (110 000 cpm). ·

Plasmid pLelF A trp 103 (viz obr. 7) jest derivátem plasmidu pLelF A 25 (viz 1), ve kterém bylo io odstraněno EcoRJ místo štěpení distální k LelF A genu (viz 27). 3 μg plasmidu pLelF A trp 103 byly digerovány 20 jednotkami endonukleasy EcoRJ a 20 jednotkami Pstl po dobu 90 min při 37 °C a směs podrobena elektroforese na 6% polyakrylamidovém gelu. Elektroelucí byl isolován velký vektorový fragment asi o 3900 párech bází. Shora uvedený EcoRI-Pstl IFN-γ DNA fragment o 1115 párech bází byl navázán do 0,15 pg takto připraveného vektoru. Transformací 15 do E. coli K-12 kmene 294 (ATCC číslo 31 446) bylo získáno 120 kolonií resistentních vůči tetracyklinu. Z 60' těchto transformantů byla připravena plasmidová DNA a digerována endonukleasami EcoRI a Pstl. Tři z uvedených plasmidů obsahovaly žádaný EcoRI-Pstl fragment s 1115 páry bází. DNA sekvenční analýzou bylo ověřeno, že tyto plasmidy mají žádanou nukleotidovou sekvenci při spojení mezi trp promotorem, synthetickou DNA a cDNA. Jeden 20 z těchto plasmidů, označený pIFN-γ trp 48, byl vybrán pro další studium. Tento plasmid byl použit k transformování E. coli K-12 kmene W3110 (uložený pod ATCC číslem 27 325).

I. Genová struktura sekvence kódující interferon IFN-γ

Struktura genu kódujícího interferon IFN-γ byla analyzována pomocí Southemovy hybridizace. Při tomto postupu (viz 54) bylo 5 pg lidské lymfocytámí DNA o vysoké molekulární hmotnosti (připravené způsobem popsaným v publikaci 55) digerováno až do dokončení různými restrikčními endonukleasami, směs podrobena elektroforese na 1,0% agarosových gelech (viz 56) a skvrny fragmentů nasáty na nitrocelulosový filtr (viz 54). Z Ddel fragmentu o 600 párech bází z cDNA inserce plasmidu p69 byl připraven ³²P-značený DNA zkušební vzorek (viz 47) a hybridizován (viz 43) se skvrnou DNA na nitrocelulosovém filtru. Zkušební vzorek o 10 impulsech za minutu byl hybridizován po dobu 16 h a pak byl filtr vymyt popsaným způsobem (viz 43). Osm genomických DNA vzorků od různých lidských dárců bylo digerováno restrikční endonukleasou EcoRJ a fragmenty hybridizovány s ³²P-značeným zkušebním vzorkem 35 z plasmidu p69. Jak je znázorněno na obr. 9, byly pozorovány dva zřetelné hybridizační signály odpovídající velikostí 8,8 tisícům párů bází (kbp) a 2,0 kbp, jak bylo odhadnuto srovnáním jejich pohyblivostí s pohyblivostí fragmentu získaného digescí λ DNA endonukleasou Hind lil. Tento výsledek by odpovídal buď dvěma IFN-γ genům, nebo jedinému genu rozštěpenému v Ecol místě štěpení. Jelikož plasmidická p69 cDNA neobsahuje EcoRI místo štěpení, bylo by k vysvětlení možnosti jediného genu třeba intervenující sekvence (intronu) s interním EcoRI místem štěpení. Za účelem rozlišení těchto možností byla provedena další Southemova hybridizace stejného zkušebního vzorku spětí jinými fragmenty endonukleasových digescí jediné lidské DNA (viz obr. 10). Byly pozorovány dva hybridizující DNA fragmenty se dvěma jinými fragmenty' endonukleasového štěpení, PvuII (6,7 kbp a 4,0 kbp) a HincII (2,5 kbp a 2,2 kbp). Tři vzorky 45 z endonukleasové digesce však poskytnuly pouze jeden hybridizující DNA fragment: HindlII (9,0 kbp), BglII (11.5 kbp) a BamHI (9,5 kbp). Dva IFN-γ geny by musely být vázány v neobvykle blízké vzdálenosti (méně než 9,0 kbp), aby byly obsaženy ve stejném HindlII hybridizujícím fragmentu. Tento výsledek naznačuje, že v lidské genomické DNA je přítomen pouze jediný homologní interferonový IFN-γ gen (na rozdíl od četných příbuzných IFN-α genů) a že tento gen je štěpen v oblasti jednoho nebo více intronů obsahujících EcoRI, PvuII a HincII místa štěpení. Tato předpověď byla podpořena hybridizací ³²P-značeného fragmentu (viz 47) připraveného z právě 3'-nepřekládané oblasti cDNA z plasmidu p69 (Ddel fragment o 130 párech bází od 860tého páru bází k 990tému páru bází, viz obr. 5) s EcoRI fragmenty získanými digescí

- 16CZ 282154 B6 lidské genomické DNA. S uvedeným zkušebním vzorkem hybridizoval pouze EcoRI fragment o 2,0 kbp, z čehož lze soudit, že tento fragment obsahuje 3’-nepřekládané sekvence, zatímco EcoRI fragment o 8.8 kbp obsahuje 5' sekvence. Struktura genu IFN-γ (genu obsahujícího alespoň jeden intron) jest zřetelně odlišná od interferonového genu IFN-α /několikanásobný gen (viz 2) bez intronů (viz 56)/ nebo IFN-β /jediný gen bez intronů (viz 57)/.

J. Příprava bakteriálních extraktů

Kultura E. coli W 3110/pIFN-y trp 48, kultivovaná přes noc na živné půdě Luria obsahující 5 μg/ml tetracyklinu byla použita k inokulaci živné půdy M9 (viz 58) obsahující 0,2 hmotnostních % glukosy, 0,5 hmotn. % kasamino-kyselin (CAA; směs aminokyselin získaná hydrolysou kaseinu) a 5 pg/ml tetracyklinu, zředěné 1 : 100. Když absorpce při 550 nm (A550) dosáhla hodnoty 0,1 až 0,2, byla do média přidána kyselina indolylakrylová tak, aby konečná koncentrace byla 20 pg/ml. Po dosažení A_55O = 1,0 byly 10 ml vzorky kultury centrifugovány a získaná biomasa ihned znovu suspendována vl ml roztoku fosfátového pufru v roztoku, chloridu sodného, obsahujícího 1 mg/ml hovězího serumalbuminu (PBS-BSA). Buňky byly rozrušeny ultrazvukem a buněčné zbytky odstraněny odstředěním. Supematanty byly uloženy při 4 °C až do otestování aktivity. Srovnáním s IFN-α standardy bylo pomocí testu inhibice cytopathického účinku (CPE) stanoveno, že interferonová aktivita supernatantů je 250 jednotek/ml.

K. Transformace kvasinkových kmenů a živná prostředí

Kvasinkové kmeny byly transformovány dříve popsaným způsobem (viz 59). Pro výběr plasmidů obsahujících funkční TRP I gen bylo použito mikroorganismu E. coli kmene JA300 (thr leuB6 thi thyA trpCl 117 hsdnť hsdR' str^R) (viz 20). Jako kvasinkového transformačního hostitele bylo používáno kvasinkového kmene RH 218 majícího genotyp (trpí gal2 SUC2 mal CUPI) (viz 18). Kmen RH 218 jest uložen, bez jakéhokoliv omezování, v Americké sbírce typových kultur pod ATCC číslem 44 076. K minimálnímu živnému prostředí M9 s 0,25 hmot. % CAA a k bohatému médiu LB, která popsal Miller (viz 58), bylo přidáno 20 pg/ml ampicillinu (firmy Sigma) po autoklávování a ochlazení. Kvasinky byly kultivovány na následujících živných půdách: YEPD, obsahující 1 hmotn. % kvasničného extraktu, 2 hmotn. % peptonu, 2 hmotn. % glukosy a 3 hmotn. % agaru Difco; YNB + CAA, obsahující 6,7 g kvasničných dusíkatých látek (bez aminokyselin) (YNB) Difco, 10 mg adeninu, 10 mg uracilu, 5 g CAA, 20 g glukosy a 30 g agaru v jednom litru.

L. Zkonstruování kvasinkového vektoru schopného exprese

1. 10 pg plasmidů YRp7 (viz 14, 15, 16) bylo digerováno restrikční endonukleasou EcoRI. Kohesní (lepivé) konce získané DNA byly převedeny pomocí DNA polymerasy I (Klenowův fragment) na tupé. Vektor a inserce byly naneseny na 1% agarosový gel (SeaKem), po rozdělení byly frakce vyříznuty, elektroeluovány, vyextrahovány 2x stejnými objemy chloroformu a fenolu a produkt vysrážen ethanolem. Získané DNA molekuly s tupými konci byly podrobeny vzájemné ligaci po dobu 12 h při 12 °C v konečném objemu 50 plitrů. Získaná ligační směs byla použita k transformování E. coli kmene JA 300 na ampicilinovou resistenci a tryptofanovou prototrofú. Byly isolovány plasmidy obsahující TRPÍ gen v obou orientacích: plasmid pFRWl měl TRPÍ gen ve stejné orientaci jako plasmid YRp7, zatímco plasmid pFRW2 měl TRPÍ gen v opačné orientaci.

pg plasmidů pFRW2 bylo linearisováno restrikčním enzymem HindlII a získaná směs dělena elektroforesou na 1% agarosovém gelu. Lineární molekuly byly z gelu eluovány a 200 ng produktu pak bylo podrobeno ligaci s 500 ng HindlII inserce plasmidů pBl o 3,1 kbp (viz 13), která je restrikčním fragmentem obsahujícím kvasinkový 3-fosfoglycerátkinasový gen. Ligační

- 17CZ 282154 B6 směs byla použita k transformování E. coli kmene 294 na resistenci vůči ampicilinu a citlivost vůči tetracyklinu. Plasmid připravený z jednoho takového rekombinantu měl neporušený TRPÍ gen s HindlII fragmentem o 3,1 kbp z DNA inserce plasmidu pBl v HindlII místě štěpení tetracyklinové resistence genu. Tento plasmid byl označen jako pFRM31. 5 gg posléze uvedeného plasmidu pFRM31 bylo úplně digerováno endonukleasou EcoRI, směs extrahována dvakrát fenolem a chloroformem a produkt vysrážen ethanolem. Kohesní konce molekuly byly vyplněriy za použití DNA polymerasy I (Klenowův fragment); k reakci bylo použito po 250 μΜ každého deoxynukleosidtrifosfátu. Reakce byla prováděna po dobu 20 min při 14 °C, pak byla DNA extrahována dvakrát fenolem a chloroformem a produkt vysrážen ethanolem. DNA byla znovu suspendována, kompletně digerována restrikčním enzymem Clal a směs dělena elektroforesou na 6% akry lamidovém gelu. Vektorový fragment byl z gelu eluován, extrahován fenolem a chloroformem a vysrážen ethanolem.

Šest N-terminálních aminokyselin 3-fosfoglacerátového enzymu přečištěného po isolaci z lidských zdrojů má následující složení:

1-2-3-4-5-6 SER - LEU - SER - HSM - LYS - LEU Jedna z translačních čtecích jednotek, generovaná z DNA sekvence Sau3A až Sau3A restrikčního fragmentu o 141 párech bází (obsahující vnitřní HincII místo štěpení; viz PGK restrikční mapu na obr. 11) produkuje následující aminokyselinovou sekvenci:

- 2 - 3 - 4-5-6

MET - SER - LEU - SER - SER - LYS - LEU Je zřejmé, že po odstranění iniciační aminokyseliny methioninu má N-terminální aminokyselinová sekvence PGK 5 ze 6 aminokyselin homologních s N-terminální aminokyselinovou sekvencí lidského PGK.

Výsledek tohoto určení sekvence naznačuje, že start kvasinkového PGK strukturálního genu je kodován pomocí DNA obsažené v Sau3A restrikčním fragmentu plasmidu pBl o 141 párech bází. Předchozí práce (viz 20) naznačily, že DNA sekvence specifikující PGK mRNA by mohly být obsaženy v oblasti HindlII fragmentu. Další sekvenování Sau3A fragmentu o 141 párech bází poskytlo podrobnější údaje o DNA sekvenci PGK promotoru (viz obr. 12).

Standardními metodami byl synthetizován synthetický oligonukleotid o sekvenci 5'ATTTGTTGTAAA3' /viz Crea a spolupracovníci, Nucleic Acids Res. 8, 2331 (1980)/. 100 ng tohoto primeru bylo označeno na 5'-konci za použití 10 jednotek T4 polynukleotidkinasy v objemu 20 mikrolitrů reakční směsi obsahující rovněž 200 gCi (γ-³²Ρ)-ΑΤΡ. Roztok získaného značeného primeru byl použit k reakci obnovení párů bází, plánované jako první stupeň v mnohastupňovém postupu zaměřeném na zavedení EcoRI restrikčního místa do PGK 5’koncové DNA, právě předcházející sekvenci PGK strukturálního genu.

100 gg plasmidu pBl (viz 20) bylo úplně digerováno restrikčním enzymem HaelII a směs rozdělena na 6% polyakrylamidovém gelu. Nejhořejší pás fragmentu na gelu po ethidiumbromidové detekci (obsahující oblast PGK promotoru) byl isolován elektroelucí shora popsaným způsobem. Získaný HaelII fragment DNA o 1200 párech bází byl rozštěpen nukleasou HincII a směs rozdělena na 6% akrylamidovém gelu. Elektroelucí byl isolován pás obsahující fragment o 650 párech bází; bylo získáno 5 gg DNA. Tato HaelII až HincII část DNA o 650 párech bází byla znovu suspendována ve 20 mikrolitrech vody a roztok smíchán s 20 glitry roztoku fosforylovaného primeru připraveného shora popsaným způsobem. Směs byla extrahována lx fenolem a chloroformem a produkt vysrážen ethanolem. Vysušená DNA byla

- 18CZ 282154 B6 resuspendována v 50 plitrech vody a směs zahřívána 7 min na vroucí vodní lázni. Roztok byl ry chle ochlazen v lázni suchý led - ethanol (10 až 20 s) a pak přenesen do lázně -led-voda. K roztoku bylo přidáno 50 plitrů roztoku složeného z 10 plitrů roztoku lOx DNA polymerasy I v pufru (Boehringer Mannheim), 10 plitrů roztoku upraveného předem na 2,5 mM každého 5 z použitých deoxynukleotidtrifosfátů (dATP, dTTP, dGTP a dCTP), 25 plitrů vody a z 5 jednotek DNA polymerasy I (Klenowův fragment). Tato reakční směs o objemu 100 pl byla inkubována 4 h při 37 °C. Pak byl roztok extrahován jednou fenolem a chloroformem, produkt vysrážen ethanolem, vysušen lyofilisací a pak vyčerpávajícím způsobem štěpen 10 jednotkami restrikční endonukleasy Sau3A. Získaná směs byla nanesena na 6% polyakrylamidový gel ío a dělena elektroforesou. Pás obsahující fragment odpovídající velikostí 39 párům bází byl z gelu vyříznut a produkt isolován elektroelucí shora popsaným způsobem. Získaný fragment o 39 párech bází má jeden tupý konec a jeden Sau3A kohesní konec. Tento fragment byl zaklonován do modifikovaného vektoru pFIF trp 69 (viz 5) následujícím způsobem: 10 pg plasmidu pFIF trp 69 bylo linearisováno působením enzymu Xbal, směs extrahována jednou fenolem 15 a chloroformem a produkt vysrážen ethanolem. Xbal kohesní konec byl vyplněn za použití DNA polymerasy I (Klenowův fragment) v 50 pl reakční směsi obsahující po 250 pM každého použitého nukleosidtrifosfátu. Získaná DNA byla rozštěpena enzymem BamHI a směs dělena elektroforesou na 6% polyakrylamidovém gelu. Vektorový fragment byl z gelu isolován elektroelucí a znovu suspendován ve 20 pl vody. 20 ng tohoto vektoru bylo podrobeno ligaci 20 s 20 ng fragmentu o 39 párech bází připraveného shora uvedeným způsobem, po dobu 4 h při teplotě místnosti. Jedna pětina ligační směsi byla použita k transformování mikroorganismu E. coli kmene 294 na resistenci vůči ampicilinu (desky s LB živnou půdou + 20 pg/ml ampicilinu). Plasmidy z transformantů byly hodnoceny rychlou vyhledávací metodou (viz 44). Jeden z těchto plasmidů, pPGK-39, byl vybrán pro sekvenční analýzu. 20 pg tohoto plasmidu bylo digerováno 25 endonukleasou Xbal, produkt vysrážen ethanolem a pak na něj bylo působeno 1000 jednotkami bakteriální alkalické fosfatasy 45 min při 68 °C. DNA byla extrahována 3x fenolem a chloroformem a pak vysrážena ethanolem. Defosforylované konce byly poté radioaktivně označeny ve 20 pl reakčního roztoku obsahujícího 200 pCi (γ-³²Ρ) ATP a 10 jednotek T4 polynukleotidkinasy. Plasmid byl rozštěpen endonukleasou Sáli a směs dělena elektroforesou na 30 6% polyakrylamidovém gelu. Pás obsahující značenou inserci byl z gelu vyisolován a podroben sekvenční analýze chemickou degradační metodou (viz 52). DNA sekvence na 3'-konci této promotorové části měla očekávané pořadí.

2. Zkonstruování Pvul až EcoRI PGK promotorového fragmentu o 312 párech bází pg plasmidu pPGK-39 (viz obr. 13) bylo současně digerováno restrikčními endonukleasami Sáli a Xbal (po 5 jednotkách každé) a získaná směs byla podrobena elektroforese na 6% gelu. Elektroelucí byl isolován fragment o 390 párech bází obsahující promotorovou část o 39 párech bází. Získaná DNA byla resuspendována ve vodě, štěpena endonukleasou Sau3A a směs dělena 40 elektroforesou na 8% polyakrylamidovém gelu. Elektroelucí byl isolován pás obsahující PGK promotorovou část o 39 párech bází. Tato DNA obsahovala 39 párů bází z 5'-konce PGK promotoru na Sau3A až Xbal fragmentu.

pg plasmidu pBl bylo rozštěpeno restrikčními enzymy Pvul aKpnl a směs dělena 45 elektroforesou na 6% arylamidovém gelu. Elektroelucí byl isolován pás obsahující DNA o 800 párech bází; uvedená DNA byla rozštěpena restrikční endonukleasou Sau3A a směs dělena elektroforesou na 6% polyakrylamidovém gelu. Elektroelucí byl isolován pás obsahující fragment z PGK promotoru o 265 párech bází (viz obr. 11).

Získaná DNA byla podrobena ligaci se shora uvedeným promotorovým fragmentem o 39 párech bází po dobu dvou hodin při teplotě místnosti. Směs po ligaci byla rozštěpena endonukleasami Xbal a Pvul a rozdělena elektroforesou na 6% polyakrylamidovém gelu. Elektroelucí byl

- 19CZ 282154 B6 isolován Xbal až Pvul restrikční fragment o 304 párech bází. Tento fragment byl vnesen do ligační směsi obsahující 200 ng fragmentu plasmidu pBR322 (viz 41) získaného předem po odstranění Pvul až Pstl restrikčního fragmentu o 162 párech bází, a 200 ng Xbal až Pstl fragmentu LelF A cDNA genu isolovaného předem z 20 pg plasmidu pLelF trp A 25. Této třísložkové ligační směsi bylo použito k transformování E. coli kmene 294 na resistenci vůči tetracyklinu. Kolonie transformantů byly podrobeny zkrácenému třídění (viz 44) a byla isolována jedna z kolonií, pPGK-300, mající fragmeht PGK 5'-přilehlé DNA o 304 párech bází fušovaný na LelF A gen ve vektoru založeném na plasmidu pBR 322. 5'-konec LelF A genu má následující nukleotiďickou sekvenci: 5'-CTAGAATTC-3'. Fuse Xbal restrikčního místa z PGK promotorového fragmentu do této sekvence dovoluje adici EcoRI restrikčního místa na uvedené Xbal místo. Plasmid pPGK-300 tak obsahuje část PGK promotoru isolovaného v Pvul až EcoRI fragmentu.

3. Zkonstruování EcoRI až EcoRI PGK promotorového fragmentu o 1500 párech bází pg plasmidu pBl bylo digerováno restrikčními endonukleasami Pvul a EcoRI a směs dělena elektroforesou na 6% polyakrylamidovém gelu. Elektroelucí byl isolován pás obsahující Pvul až EcoRI část DNA o 1,3 kbp z PGK 5-přilehlé DNA. 10 pg plasmidu pPGK-300 bylo digerováno endonukleasami EcoRI a Pvul a po rozdělení směsi elektroforesou na 6% polyakrylamidovém gelu byl elektroelucí isolován promotorový fragment o 312 párech bází. 5 pg plasmidu pFRL4 bylo rozříznuto endonukleasou EcoRI, produkt vysrážen ethanolem a pak na něj bylo působeno 45 min při 68 °C bakteriální alkalickou fosfatasou. DNA byla třikrát extrahována fenolem a chloroformem, vysrážena ethanolem a resuspendována ve 20 ml vody; 200 ng tohoto vektoru bylo podrobeno ligaci se 100 ng EcoRI až Pvul fragmentu DNA z pPGK-300 o 312 párech bází a se 100 ng EcoRI až Pvul fragmentu DNA z plasmidu pBl. Této trojsložkové ligační směsi bylo použito k transformaci E. coli kmene 294 na resistenci vůči ampicilinu. Jeden ze získaných transformantů byl označen pPGK-1500. Tento plasmid obsahuje PGK promotorový fragment o 1500 párech bází jako EcoRI až EcoRI nebo HindlII až EcoRI část DNA.

pg získaného plasmidu pPGK-1500 bylo kompletně digerováno enzymy Clal a EcoRI a získaná směs rozdělena elektroforesou na 6% polyakryamidovém gelu. Elektroelucí byl isolován fragment o 900 párech bází obsahující PGK promotor. 10 pg plasmidu pIFN-γ trp 48 bylo kompletně digerováno enzymy EcoRI a HincII a směs dělena elektroforesou na 6% polyakryamidovém gelu. Elektroelucí byl z gelu isolován pás obsahující přímo exprimovatelnou IFN-y cDNA o 938 párech bází.

Kvasinkový exprese schopný vektor byl zkonstruován ve třísložkové reakci vzájemnou ligaci PGK promotorového fragmentu (na Clal až EcoRI části), deletovaného plasmidu pFRM-31 a shora isolované IFN-γ cDNA. Ligační směs byla inkubována 12 h při 14 °C. Poté bylo získané ligační směsi použito k transformování mikroorganismu E. coli kmene 294 na ampicilinovou resistenci. Získaní transformanti byli analyzováni na přítomnost správně zkonstruovaného exprese schopného plasmidu pPGK-IFN-γ (viz obr. 16). Plasmidů obsahujících exprese schopný systém bylo použito k transformování sferoplastů kvasinkového kmene RH 218 na tryptofánovou prototrofii v agarové půdě postrádající tryptofan. Tyto rekombinované kvasinky pak byly analyzovány na přítomnost rekombinantního lidského imunitního interferonu.

Kvasničné extrakty byly připraveny následujícím způsobem: Kultury o objemu 10 ml byly kultivovány na YNB + CAA živné půdě až do dosažení Α₆₆₀ asi 1 až 2, pak byly buňky odstředěny a znovu suspendovány v 500 pl PBS pufru (20 mM dihydrogenfosforečnanu sodného o pH 7.4 a 150 mM chlorid sodný). Po přidání stejného objemu skleněných perel (o průměru 0,45 až 0,5 mm) byla směs prudce míchána po dobu 2 min. Extrakty byly odstřeďovány 30 s při 14 000 otáčkách za minutu a v supematantu byla stanovena interferonová aktivita; ve srovnání s IFN-γ standardem a za užití testu inhibice CPE byla nalezena aktivita 16000 jednotek/ml.

-20CZ 282154 B6

M. Zkonstruování buněčné kultury s vektorem pSVy69

HindlII až PvuII fragment o 342 párech bází obsahující SV 40 zdroj byl přeměněn na fragment s navázaným EcoRl restrikčním místem. HindlII restrikční místo bylo konvertováno adicí synthetického oligomeru (5'-dAGCTGAATTC) a PvuII restrikční místo bylo konvertováno tupou ligací na vyplněné EcoRl místo za použití polymerasy I (Klenowův fragment). Získaný EcoRl fragment byl vložen do EcoRl restrikčního místa plasmidu pML-1 (viz 28). Plasmid s SV40 bývalým promotorem orientovaným daleko od genu pro ampicilinovou resistenci (amp^R) byl dále modifikován odstraněním EcoRl restrikčního místa nejbližšího k amp^R genu plasmidu pML-1 (viz 27).

Byl isolován Hpal až BglII fragment o 1023 párech bází klonované HBV DNA (viz 60) aHpal restrikční místo viru hepatitidy B (HBV) bylo konvertováno na EcoRl restrikční místo synthetickým oligomerem (5’-dGCGAATTCGC). Tento EcoRl až BglII navázaný fragment byl přímo zaklonován do EcoRl až BamHI restrikčních míst shora uvedeného plasmidu nesoucího zdroj SV 40.

Do zbývajícího EcoRl restrikčního místa byl vložen interferonový IFN-γ gen na Pstl fragmentu plasmidu p69 o 1250 párech bází, po konversi jeho Pstl konců na EcoRl konce. Byly isolovány klony, ve kterých bývalý promotor SV 40 předcházel strukturálnímu genu interferonu IFN-γ. Získané plasmidy pak byly zavedeny do buněk tkáňové kultury (viz 29) za použití diethylaminoethyldextranové (DEAE-dextranové) pracovní techniky (viz 61), modifikované tím způsobem, že transformace v přítomnosti DEAE-dextranu byla prováděna po dobu 8 h. Buněčné médium bylo vyměňováno každé 2 až 3 dny. Denně bylo odebíráno 200 μΐ kapaliny pro biologické hodnocení interferonové aktivity. Typické výtěžky činily 50 až 100 jednotek/ml ve vzorcích testovaných za tři až čtyři dny po transfekci.

Podle analýzy chybí v produktu exprese část CYS-TYR-CYS na N-konci lidského imunitního interferonu [srovnej obrázek 5]. Z toho plyne, že na spojení CYS-GLN [aminokyseliny 3 a 4 na obrázku 5] dochází ke štěpení signálního peptidu, takže maturovaný polypeptid by ve skutečnosti sestával ze 143 aminokyselin.

N. Částečné čištění des-CYS-TYR-CYS rekombinantního lidského imunitního interferonu

Za účelem produkce většího množství lidského interferonu IFN-γ pocházejícího z opičích buněk, byly čerstvé monomolekulámí vrstvy buněk COS-7 na deseti lOcm deskách transfektovány celkem s 30 pg pDLIF 3 ve 110 ml DEAE-dextranu [obsahujících 200 μg/ml DEAE-dextranu o molekulové hmotnosti 500 000, 0,05 M Tris o pH 7,5 v DMEM]. Po 16 hodinách inkubace při 37 °C byly desky promyty dvakrát DMEM. Na každou desku bylo pak přidáno 15 ml čerstvého DMEM doplněného 10 hm. % f.b.s. sera, 2 mM glutaminu, 50 μ/ml penicilinu G, 50 mg/ml streptomycinu. Následující den pak bylo médium nahrazeno DMEM prostým sera. Čerstvé médium prosté sera bylo přidáváno každý den. Média byla sbírána a přechovávána při 4 °C dokud nebyla otestována; podíly vykazující aktivitu byly zpracovány za použití CPG k vázání aktivních složek (viz níže). Testováním bylo zjištěno, že média odebraná za 3 a za 4 dny po transfekci vzorků obsahovala v podstatě veškerou aktivitu.

Ke 100 ml buněčného supematantu bylo přidáno 0,5 g CPG (porésní sklo o kontrolované velikosti pórů, CPG 350 firmy Electronucleonics, velikost otvorů 120/200) a směs byla míchána 3 h při 4 °C. V podstatě veškerá aktivita se při tom navázala na CPG. Po krátkém odstředění směsi na stolní odstředivce byly usazené kuličky přeneseny do trubice a sloupec důkladně promyt roztokem pufru obsahujícím 20 mM metafosforečnanu sodného, 1M chloridu sodného a 0,1 hm. % β-merkaptoethanolu, pH 7,2. Poté byla aktivita eluována stejným pufrem obsahujícím 30 hm. % ethylenglykolu a dále eluována uvedeným pufrem obsahujícím 50 hm. %

-21 CZ 282154 B6 ethylenglykolu. 75 hm. % veškeré aktivity bylo nalezeno ve frakcích eluovaných pufrem s 30 hm. % ethylenglykolu. Tyto frakce byly spojeny a roztok byl zředěn pufrem obsahujícím 20 mM metafosforečnanu sodného a 1 M chloridu sodného o pH 7,2 tak, aby konečná koncentrace ethylenglykolu byla 10 hm. %, a směs nanesena přímo na sloupec připravený 5 z 10 ml Con A Sepharosy (firmy Pharmacia). Po důkladném promytí sloupce pufrem obsahujícím 20 mM metafosforečnan sodný a 1 M chlorid sodný o pH 7,2 byla aktivita eluována roztokem obsahujícím 20 mM metafosforečnan sodný, 1 M chlorid sodný a 0,2 M a-methyl-Dmannosid. Podstatné množství aktivity (55 hm. %) se na uvedený lektin nevázalo; 45 hm. % aktivity se eluovalo cc-methyl-D-mannosidem.

O. Farmaceutické přípravky

Sloučeniny podle vynálezu lze za účelem farmaceuticky použitelných přípravků formulovat známými metodami, při kterých se lidský imunitní interferon mísí s farmaceuticky vhodným 15 nosným vehikulem. Vhodná vehikula a vhodné způsoby formulování do formy farmaceutických aplikačních forem jsou popsány Έ. W. Martinem v monografii Remingtonů Pharmaceuticál Sciences, na kterou zde odkazujeme. Vhodné farmaceutické komposice obsahují účinné množství interferonové bílkoviny podle vynálezu spolu s vhodným množstvím vehikula, čímž se získají farmaceuticky přijatelné přípravky vhodné pro účinné podávání nemocným.

Lidský imunitní interferon podle vynálezu lze parenterálně podávat jedincům, kteří potřebují antitumorální nebo antivirovou léčbu, nebo kteří vykazují imunosupresivní stavy. Dávkování a počet dávek jsou analogické těm, které se běžně používají při klinickém zkoušení jiných lidských interferonů, na příklad přibližně (1 až 10) x 10⁶ jednotek denně a v případě materiálu 25 o čistotě vyšší než 1 hm. %, účelně rovněž až do této čistoty, na příklad 50 x 10⁶ jednotek denně.

Dávkování interferonu IFN-γ lze za účelem zvětšení účinku podstatně zvýšit vzhledem k tomu, že v něm v podstatě nejsou přítomny kromě IFN-γ jiné lidské bílkoviny, které u materiálů získaných z lidských zdrojů mohou indukovat některé nežádoucí účinky.

Vhodná dávkovači forma pro v podstatě homogenní IFN-γ pro parenterální aplikaci se připraví na příklad následujícím způsobem: 3 mg interferonu IFN-γ o specifické aktivitě na příklad 2 x 10⁸ U/mg se rozpustí ve 25 ml’5 N lidského serumalbuminu (o čistotě podle USP), roztok se zfiltruje přes bakteriologický filtr a filtrát se rozdělí do 100 ks injekčních ampulek, z nichž pak každá obsahuje 6 x 10⁶ jednotek čistého interferonu vhodného pro parenterální podávání.

Injekční ampulky se před použitím skladují účelně v lednici při teplotě - 20 °C.

P. Biologická účinnost

a) Charakterizace antivirové účinnosti

Pro stanovení neutralizace antivirové účinnosti protilátkami různého původu byly vzorky podle potřeby zředěny pufrem PBS-BSA (viz výše) na koncentraci 500 až 1000 jednotek/ml. Stejné objemy vzorku byly inkubovány 2 až 12 h při 4 °C se sériově ředěnými vzorky králičího protihumánního leukocytámího, fibroblastového nebo imunitního interferonového antisera. Anti45 IFN-α a anti-IFN-β byly získány z ústavu National Institute of Allergy and Infectious Diseases.

Anti-IFN-γ bylo připraveno za použití autentického interferonu IFN-γ (o čistotě 5 až 20 hm. %), získaného čištěním stimulovaných periferních krevních lymfocytů. Tři min před testováním byly vzorky odstřeďovány po dobu 3 min při přetížení 12 000 x g. Pro testování stability při pH 2 byly vzorky upraveny na pH 2 přidáním 1 M kyseliny chlorovodíkové, inkubovány 2 až 12 h při 4 °C 50 a před hodnocením zneutralizovány přidáním 1 M hydroxidu sodného. Pro testování citlivosti vůči dodecylsulfátu sodnému (SDS) byly vzorky před hodnocením inkubovány se stejným objemem 0,2 hm. % SDS po dobu 2 až 12 h při 4 °C.

-22CZ 282154 B6

b) Charakterizace interferonu IFN-γ produkovaného E. coli a buňkami COS-7

Působení činidel	Antivirová účinnost (jednotky/ml)
IFN-a	IFN-β	IFN-γ	Extrakt E. coli W 3110/pIFN-y-trp48	Supematant buňky COS-7/pSV-y-69
bez úpravy vzorku	375	125	250	250	62,5
pH 2	375	'125	<6	<12	<4
0,1 hm. % SDS	375	—	<4	<8	—
králičí anti-IFN-a	<8	125	250	250	187
králičí anti-IFN-β	375	<8	187	250	125
králičí anti-IFN-γ	375	125	<4	<8	<4

V tabulce jest uvedeno charakteristické chování standardů interferonů IFN-a, IFN-β a IFN-γ při působení různých činidel. Interferonová aktivita produkovaná mikroorganismem E. coli W3110/pIFN-y trp 48 a buňkami COS-7/pSVy 69 vykazuje citlivost vůči kyselinám, citlivost vůči SDS aje neutralizována antiserem imunitního interferonu; není neutralizována protilátkami vůči IFN-α nebo IFN-β. Tyto výsledky potvrzují, že produkty produkované v vedených systémech jsou imunitní interferony, a že cDNA inserce plasmidu p69 kóduje interferon IFN-γ.

R. Čištění interferonu IFN-γ

Jedna z metod, kterou lze čistit interferon IFN-γ pocházející na příklad z bakterií, jest popsána v následujícím obecném schématu:

1. Buňky se extrahují vlysujícím pufru o vysoké vodivosti (asi při pH 8) pasáží homogenisátorem za vysokého tlaku a efluent se chladí v ledové lázni.

2. DNA se vysráží přidáním polyethyleniminu za míchání při teplotě na příklad 4 °C.

3. Bakteriální bílkoviny se vysráží při vhodném pH, přičemž IFN-γ zůstane v roztoku.

4. Pevné podíly se oddělí odstředěním při 4 °C.

5. Supematant se zkoncentruje (po úpravě pH) na příklad ultrafiltrací.

6. Koncentrát se dialysuje proti pufru o nízké vodivosti.

7. Pevné podíly se odstraní odstředěním a získá se roztok interferonu IFN-γ.

8. Provede se ionexová chromatografie na karboxymethylcelulose, za použití gradientově eluce vzrůstající iontovou silou.

9. Produkt se čistí chromatografií na kalciumfoafátovém gelu za použití gradientově eluce vzrůstající iontovou silou.

10. Provede se ionexová chromatografie ná karboxymethylcelulose za mírných denaturujících podmínek, za použití gradientově eluce vzrůstající iontovou silou.

11. Produkt se separuje gelovou filtrační chromatografií.

Uvedeným postupem se získá materiál o čistotě vyšší než 95 hm. %.

-23CZ 282154 B6

Imunitní interferonová bílkovina podle vynálezu je definována pomocí stanoveného DNA genu a zněj odvozené aminokyselinové sekvence - viz. obr. 5. Je zřejmé, že k tomuto speciálnímu interferonů, uváděnému na tomto místě, existují a individuálně se od případu k případu vyskytují různé alelické variace. Tyto variace lze demonstrovat jako rozdíl(y) v druhu jednotlivých aminokyselin v celkové aminokyselinové sekvenci interferonů nebo jako delece, substituce, inserce, inverse nebo adice jedné nebo více aminokyselin v uvedené sekvenci. Všechny takové alelické variace spadají do rozsahu tohoto vynálezu. ·

Vskutku existuje nyní možnost použít technologie rekombinace DNA k přípravě různých derivátů lidského interferonů IFN-γ různě modifikovaných výslednou jednotlivou nebo několikanásobnou substitucí, delecí, adicí nebo náhradou aminokyseliny. Všechny takové modifikace vedoucí k příslušným derivátům lidského interferonů IFN-γ jsou včleněny do rozsahu tohoto vynálezu, pokud zůstává nezměněn druh základní charakteristické aktivity lidského IFN-γ.

Když je nyní k disposici znalost DNA a aminokyselinové sekvence IFN-γ (viz obr. 5), bude mít nejvýhodnější způsob reprodukce předloženého vynálezu bezpochyby za následek přípravu biiď kompletního genu synthetickými prostředky (viz na příklad odkaz 26), nebo přípravu synthetických deoxyoligonukleotidů, se kterými bude možné vyšetřovat cDNA zdroje za účelem isolace genu standardními hybridizačními pracovními technikami. Jakmile byla jednou stanovena nukleotidická sekvence kódující požadovanou IFN-γ bílkovinu, mohly by být podle shora uvedeného popisu sledovány různé prostředky k dosažení exprese, isolace a čištění poskytující IFN-γ preparáty o vysoké čistotě.

Ačkoliv byla výše popsána specifická výhodná podstata vynálezu, je zřejmé, že předložený vynález není limitován uvedeným popisem a že jeho právoplatný rozsah vyplývá z následujícího předmětu vynálezu.

Literatura

1. Goeddel et al.. Nátuře 287. 411 (1980).

2. Goeddel et al.. Nátuře 290, 20 (1981).

3. Yelverton et aL, Nucleic Acids Research 9, 731 (1981).

4. Gutterman et al., Annals of Int. Med. 93, 399 (1980).

5. Goeddel et al., Nucleic Acids Reseach 8, 4057 (1980).

6. Yip et al., Proč. Nati. Acad. Sci. (USA) 78, 1601 (1981)

7. Taniguchi et al., Proč. Nati. Acad. Sci. (USA) 78, 3469 (1981).

8. Bloom. Nátuře 289. 593 (1980).

9. Sonnenfeld et aL, Cellular Immunol. 40, 285 (1978).

10. Fleishmann et al., Infection and Immunity 26, 248 (1979)

11. Blalock et aL, Cellular Immunology 49, 390 (1980).

1-2. Rudin et al., Proč. Nati. Acad. Sci. (USA) 77. 5928 (1980).

13. Crane et al., J. Nati. Cancer Inst. 61, 871 (1978).

14. Stinchcomb et al., Nátuře 282, 39 (1979).

15. Kingsman et al.. Gene 7, 141 (1979).

16. Tschumper et al.. Gene 10, 157 (1980).

-24CZ 282154 B6

17. Mortimer et al·, Microbiological Reviews 44, 519 (198).

18. Miozzari et al·, Joumal of Bacteriology 134, 48 (1978).

19. Jones. Genetics 85, 23 (1977).

20. Hitzeman, et al., J. Biol. Chem. 255, 12073 (1980).

Hesset al.. J. Adv. Enzyme Regul. 7, 149 (1968).

22. Holland et al., Biochemistry 17, 4900 (1978).

23. Bostian et al., Proč. Nati. Acad, Sci. (USA) 77, 4504 (1980).

24. The Molecular Biology of Yeast (Aug 11-18, 1981), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.

25. Chám bon. Ann. Rev. Biochemistry, 44, 613 (1975).

25a. Gluzman. Cell 23. 175 (1981).

26. Goeddel et al.. Nátuře 281, 544 (1979).

27. Itakura et al., Science 198, 1056 (1977).

28. Lusky et al.. Nátuře 293, 79 (1981).

29. Gluzman et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 44, 293 (1980).

30. Fiers et al.. Nátuře 273. 113 (1978).

31. Reddy et al.. Science 200, 494 (1978).

32. Boedtker et al., Prog. in Nucleic Acids Res. Mol. Biol. 19, 253 (1976).

33. Berger etal.. Biochemistry 18, 5143 (1979).

34. Aviv et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 69, 1408 (1972).

35. Gurdon et al., J. Molec. Biol. 80, 539 (1975).

36. Stewart, The Interferon Systém. Springer, New York, p. 13-26 (1979).

37. Lehrach et al·, Biochemistry 16, 4743 (1977).

38. Lvnch et al.. Virology 98, 251 (1979).

39. Wickens et al., J. Biol. Chem. 253,2483 (1978).

40. Chang et al.. Nátuře 275, 617 (1978).

41. Bolivar et al.. Gene 2, 95 (1977).

42. Grunstein et al., Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A, 72, 3961 (1975).

43. Fritsch et al.. Cell 19, 959 (1980).

44. Rimhoim et al., Nucleic Acids Res. 7, 1513 (1979).

45. Kafatos et al·, Nucleic Acids Res. 7, 1541 (1979).

46. Clewell et al·., Biochemistry 9, 4428 (1970).

47. Taylor et al., Biochim. Biophys. Acta 442, 324 (1976).

48. Smith, Methods Enzymol. 65, 560 (1980).

49. Messing et al., Nucleic Acids Res. 9, 309 (1981).

50. Winzler, Hormonal Proteins and Peptides (ed. Li) Academie Press, New York, p. 1 (1973).

-25 CZ 282154 B6

51. Nathan et al., Nátuře 292, 842 (1981).

52. Maxam et al., Methods in Enzymol. 65, 490 (1980).

53. Crea et aL, Proč. Nati. Acad. Sci. (USA) 75, 5765 (1978).

54. Southem, J. Molec. Biol. 98, 503 (1975).

55. Blin et al.. Nucleic Acids Res. 3. 2303 (1976).

56. Lawn et al.. Science 212, 1159 (1981).

57. Lawn et a|., Nucleic Acids Res. 9, 1045 (1981).

58. Miller, Experiments in Molecular Genetics, p. 431-3, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York (1972).

59. Beggs, Nátuře 275, 104 (1978).

60. Valenzuela et al., Animal Virus Genetics (ed. Fields, Jaenisch and Fox) p. 57, Academie Press, New York (1980).

61. McCuthan et al., J. Nati. Cancer Inst. 41.351 (1968).

Claims (20)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Lidský imunitní interferon a jeho derivát, oba s aminokyselinovou sekvencí, znázorněnou na obr. 5, bez jiného proteinu, s nimž je obvykle sdružený, jakož i jeho alely.
2. 2. Derivát lidského imunitního interferonu podle nároku 1, s aminokyselinovou sekvencí, znázorněnou na obr. 5, a jeho alela, přičemž kyselinový derivát má funkci lidského imunitního interferonu.
3. 3. Derivát lidského imunitního interferonu podle nároku 2, s aminokyselinovým methioninem na N-konci.
4. 4. Lidský imunitní interferon podle nároku 1, s aminokyselinovým methioninem na N-konci zralé sekvence.
5. 5. Lidský imunitní interferon podle nároku 1, s aminokyselinovou sekvencí, znázorněnou na obr. 5, nebo jeho alela nebo derivát s funkcí lidského imunitního interferonu bez přidružené přirozené glykosylace.
6. 6. Lidský imunitní interferon podle nároku 1, s aminokyselinovou sekvencí, znázorněnou na obr. 5, nebo jeho alela nebo derivát s funkcí lidského imunitního interferonu, vytvářené expresí DNA, kódující aminokyselinovou sekvenci interferonu, v rekombinantní hostitelské buňce.
7. 7. Lidský imunitní interferon podle nároku 6, vytvářený expresí kódující rekombinantní DNA sekvence v buněčné linii savců.
8. 8. Lidský imunitní interferon podle nároku 7, v němž buněčnou linií je buněčná linie COS-7 opic.

   -26CZ 282154 B6
9. 9. Isolát DNA obsahující DNA sekvenci, kódující lidský imunitní interferon, s aminokyselinovou sekvencí, znázorněnou na obr. 5, nebo jeho alela nebo derivát s funkcí lidského imunitního interferonu.
10. 10. Rekombinantní klonovací vektor obsahující DNA sekvenci, kódující lidský imunitní interferon, s aminokyselinovou sekvencí znázorněnou na obr. 5, nebo jeho alela nebo derivát s funkcí lidského imunitního interferonu.
11. 11. Replikovatelný expresní vektor schopný exprimovat v transformantním mikroorganismu nebo buněčné kultuře DNA sekvenci, kódující lidský imunitní interferon, s aminokyselinovou sekvenci znázorněnou na obr. 5, nebo jeho alela nebo derivát s funkcí lidského imunitního interferonu.
12. 12. Rekombinantní mikroorganismus nebo buněčná kultura schopné exprimovat imunitní interferon s aminokyselinovou sekvencí, znázorněnou na obr. 5, nebo jeho alelu nebo derivát s funkcí lidského imunitního interferonu.
13. 13. Rekombinantní mikroorganismus podle nároku 12, jímž je kmen E. coli.
14. 14. Rekombinantní mikroorganismus podle nároku 12, jímž je kvasinkový kmen.
15. 15. Buněčná kultura podle nároku 12, kterou je buněčná linie savců.
16. 16. Buněčná kultura podle nároku 15, v níž buněčnou linií je buněčná linie opic.
17. 17. Farmaceutický přípravek pro léčení tumorových nebo virových onemocnění nebo imunosupresivních stavů, vyznačující se tím, že jako účinnou látku obsahuje terapeuticky účinné množství lidského imunitního interferonu podle některého z nároků 1 až 8 ve spojení s farmaceuticky přijatelným nosičem.
18. 18. Farmaceutický přípravek podle nároku 17, vyznačující se t í m , že je upraven do formy pro parenterální podávání.
19. 19. Způsob výroby lidského imunitního interferonu, vyznačující se tím, že se rekombinantní hostitelské buňky přeměněné expresním vektorem, obsahujícím DNA kódující lidský imunitní interferon s aminokyselinovou sekvencí, znázorněnou na obr. 5, nebo jeho alelu nebo derivát s funkcí lidského imunitního interferonu, kultivují za podmínek umožňujících expresi uvedené DNA sekvence za vzniku lidského imunitního interferonu, který se pak izoluje.
20. 20. Použití lidského imunitního interferonu podle některého z nároků 1 až 8 nebo připraveného způsobem podle nároku 19, pro přípravu farmaceutických přípravků k léčení tumorových nebo virových onemocnění nebo imunosupresivních stavů.