PL153202B1 - Human immune interferon. - Google Patents
Human immune interferon.Info
- Publication number
- PL153202B1 PL153202B1 PL1982238671A PL23867182A PL153202B1 PL 153202 B1 PL153202 B1 PL 153202B1 PL 1982238671 A PL1982238671 A PL 1982238671A PL 23867182 A PL23867182 A PL 23867182A PL 153202 B1 PL153202 B1 PL 153202B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- ecori
- dna
- fragment
- ifn
- gene
- Prior art date
Links
- 101000599940 Homo sapiens Interferon gamma Proteins 0.000 title claims description 42
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 70
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 42
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 91
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 68
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 46
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 42
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 24
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 10
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 10
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims description 9
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 claims description 4
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 claims description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 claims description 2
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 claims 2
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 claims 1
- AIRZWUMAHCDDHR-KKUMJFAQSA-N Lys-Leu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O AIRZWUMAHCDDHR-KKUMJFAQSA-N 0.000 claims 1
- MDSUKZSLOATHMH-UHFFFAOYSA-N N-L-leucyl-L-valine Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(C)C)C(O)=O MDSUKZSLOATHMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 241001479493 Sousa Species 0.000 claims 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 claims 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 abstract description 37
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 abstract description 37
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 abstract description 23
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 abstract description 19
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 abstract description 18
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 abstract description 16
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 10
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 abstract description 6
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 abstract 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 57
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 49
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 49
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 44
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 44
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 44
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 43
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 40
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 38
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 33
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 30
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 30
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 24
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 22
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 19
- 239000000047 product Substances 0.000 description 19
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 18
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 17
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 16
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 15
- 108020005029 5' Flanking Region Proteins 0.000 description 15
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 14
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 14
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 13
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 13
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 13
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 11
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 11
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 10
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 10
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 10
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 10
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 9
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 9
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 8
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 8
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 8
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 8
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 8
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 8
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 8
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 7
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 7
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 7
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 7
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 6
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 6
- -1 host culture systems Substances 0.000 description 6
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N n-methyl-1-(2-naphthalen-1-ylsulfanylphenyl)methanamine Chemical compound CNCC1=CC=CC=C1SC1=CC=CC2=CC=CC=C12 OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 6
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 6
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 6
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 6
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 5
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 5
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 5
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 5
- YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N chloroform;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 5
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 5
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 5
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 5
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 3-phospho-D-glyceric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)COP(O)(O)=O OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 4
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 4
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 4
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 4
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 4
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 4
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 101150047627 pgk gene Proteins 0.000 description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001302584 Escherichia coli str. K-12 substr. W3110 Species 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 3
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 3
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 3
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 3
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 230000004957 immunoregulator effect Effects 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 3
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 3
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 3
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 3
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 3
- 108020004463 18S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 2
- 108020005065 3' Flanking Region Proteins 0.000 description 2
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 2
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101000959820 Homo sapiens Interferon alpha-1/13 Proteins 0.000 description 2
- 102100040019 Interferon alpha-1/13 Human genes 0.000 description 2
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 description 2
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 2
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 description 2
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 241000269368 Xenopus laevis Species 0.000 description 2
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 2
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 2
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 2
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 2
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 230000002414 glycolytic effect Effects 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 2
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000000856 sucrose gradient centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CWGBFIRHYJNILV-UHFFFAOYSA-N (1,4-diphenyl-1,2,4-triazol-4-ium-3-yl)-phenylazanide Chemical compound C=1C=CC=CC=1[N-]C1=NN(C=2C=CC=CC=2)C=[N+]1C1=CC=CC=C1 CWGBFIRHYJNILV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SXOUIMVOMIGLHO-AATRIKPKSA-N (E)-3-(indol-2-yl)acrylic acid Chemical compound C1=CC=C2NC(/C=C/C(=O)O)=CC2=C1 SXOUIMVOMIGLHO-AATRIKPKSA-N 0.000 description 1
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GHKCSRZBNZQHKW-UHFFFAOYSA-N 1-sulfanylethanol Chemical compound CC(O)S GHKCSRZBNZQHKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150090724 3 gene Proteins 0.000 description 1
- GVUOPSNMFBICMM-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-6-morpholin-4-yl-1h-pyrimidine-2,4-dione Chemical compound OC1=NC(O)=C(Br)C(N2CCOCC2)=N1 GVUOPSNMFBICMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FEHUHAVQGZZDMW-UHFFFAOYSA-N 5-methyl-4-piperidin-1-yl-2-propan-2-ylphenol Chemical compound C1=C(O)C(C(C)C)=CC(N2CCCCC2)=C1C FEHUHAVQGZZDMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710187578 Alcohol dehydrogenase 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100034035 Alcohol dehydrogenase 1A Human genes 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DPWDPEVGACCWTC-SRVKXCTJSA-N Asn-Tyr-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O DPWDPEVGACCWTC-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 241000304886 Bacilli Species 0.000 description 1
- 101100427060 Bacillus spizizenii (strain ATCC 23059 / NRRL B-14472 / W23) thyA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 1
- YHDXIZKDOIWPBW-WHFBIAKZSA-N Cys-Gln Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O YHDXIZKDOIWPBW-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- JIZRUFJGHPIYPS-SRVKXCTJSA-N Cys-Tyr-Cys Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N)O JIZRUFJGHPIYPS-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 108010008286 DNA nucleotidylexotransferase Proteins 0.000 description 1
- 102100033215 DNA nucleotidylexotransferase Human genes 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 241000710188 Encephalomyocarditis virus Species 0.000 description 1
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 description 1
- 101000867232 Escherichia coli Heat-stable enterotoxin II Proteins 0.000 description 1
- 101100153154 Escherichia phage T5 thy gene Proteins 0.000 description 1
- 208000034454 F12-related hereditary angioedema with normal C1Inh Diseases 0.000 description 1
- 108010001496 Galectin 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100021735 Galectin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 102100031132 Glucose-6-phosphate isomerase Human genes 0.000 description 1
- 108010070600 Glucose-6-phosphate isomerase Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 102000005548 Hexokinase Human genes 0.000 description 1
- 108700040460 Hexokinases Proteins 0.000 description 1
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000004195 Isomerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000769 Isomerases Proteins 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 241001625930 Luria Species 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- HLZORBMOISUNIV-DCAQKATOSA-N Met-Ser-Leu Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C HLZORBMOISUNIV-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- 241001460678 Napo <wasp> Species 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 102000012288 Phosphopyruvate Hydratase Human genes 0.000 description 1
- 108010022181 Phosphopyruvate Hydratase Proteins 0.000 description 1
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 1
- WDVSHHCDHLJJJR-UHFFFAOYSA-N Proflavine Chemical compound C1=CC(N)=CC2=NC3=CC(N)=CC=C3C=C21 WDVSHHCDHLJJJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010011939 Pyruvate Decarboxylase Proteins 0.000 description 1
- 102000013009 Pyruvate Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020005115 Pyruvate Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000009572 RNA Polymerase II Human genes 0.000 description 1
- 108010009460 RNA Polymerase II Proteins 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 101710141795 Ribonuclease inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 229940122208 Ribonuclease inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102100037968 Ribonuclease inhibitor Human genes 0.000 description 1
- 101100313751 Rickettsia conorii (strain ATCC VR-613 / Malish 7) thyX gene Proteins 0.000 description 1
- 101150014136 SUC2 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 101150073130 ampR gene Proteins 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000002022 anti-cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000001028 anti-proliverative effect Effects 0.000 description 1
- 238000002832 anti-viral assay Methods 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- QXJJQWWVWRCVQT-UHFFFAOYSA-K calcium;sodium;phosphate Chemical compound [Na+].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O QXJJQWWVWRCVQT-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 1
- 230000036978 cell physiology Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000002144 chemical decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000005289 controlled pore glass Substances 0.000 description 1
- 108091092330 cytoplasmic RNA Proteins 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003147 glycosyl group Chemical group 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 208000016861 hereditary angioedema type 3 Diseases 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 101150085823 hsdR gene Proteins 0.000 description 1
- 210000005104 human peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- PLVPPLCLBIEYEA-UHFFFAOYSA-N indoleacrylic acid Natural products C1=CC=C2C(C=CC(=O)O)=CNC2=C1 PLVPPLCLBIEYEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 229960001388 interferon-beta Drugs 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 1
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 239000005445 natural material Substances 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 229940056360 penicillin g Drugs 0.000 description 1
- 230000007030 peptide scission Effects 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N phorbol 13-acetate 12-myristate Chemical compound C([C@]1(O)C(=O)C(C)=C[C@H]1[C@@]1(O)[C@H](C)[C@H]2OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)C(CO)=C[C@H]1[C@H]1[C@]2(OC(C)=O)C1(C)C PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N 0.000 description 1
- 239000002644 phorbol ester Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- LFGREXWGYUGZLY-UHFFFAOYSA-N phosphoryl Chemical group [P]=O LFGREXWGYUGZLY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000007320 rich medium Substances 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 229940040944 tetracyclines Drugs 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000010490 three component reaction Methods 0.000 description 1
- 101150072314 thyA gene Proteins 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- A61K38/21—Interferons [IFN]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/57—IFN-gamma
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
- C12N15/71—Expression systems using regulatory sequences derived from the trp-operon
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/811—Interferon
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S930/00—Peptide or protein sequence
- Y10S930/01—Peptide or protein sequence
- Y10S930/14—Lymphokine; related peptides
- Y10S930/142—Interferon
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S930/00—Peptide or protein sequence
- Y10S930/01—Peptide or protein sequence
- Y10S930/30—Signal or leader sequence
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Mycology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Virology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
RZECZPOSPOLITA OPIS PATENTOWY 153 202 POLSKA
Patent dodatkowy do patentu nr--Zgłoszono: 82 10 19 (P. 238671)
Int. Cl.5 C12N 15/10 C12N 15/23
Pierwszeństwo: 81 10 19 Stany Zjednoczone Ameryki
URZĄD
PATENTOWY
RP
CZYTELNIA
OGCLfU
Zgłoszenie ogłoszono: 83 07 18
Opis patentowy opublikowano: 1991 11 29
Twórcy wynalazku: David V. Goeddel, Patrick W. Gray
Uprawniony z patentu: Genentech Inc., South
San Francisco (Stany Zjednoczone Ameryki)
Sposób wytwarzania ludzkiego interferonu odpornościowego
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania ludzkiego interferonu odpornościowego (gamma) zawierającego co najmniej aminokwasy 4-146 sekwencji przedstawionej na rysunku fig. 5 jego wariantów allelicznych uzupełnionych uszczuplonych (delecje) lub podstawionych o właściwościach ludzkiego interferonu na drodze technologii rekombinowanego DNA.
Wynalazek obejmuje w szczególności izolację i identyfikację sekwencji DNA kodujących ludzki interferon odpornościowy i konstrukcję nośników ekspresji rekombinowanego DNA, zawierających takie sekwencje DNA operacyjnie przyłączone do sekwencji promotora wywołującego ekspresję jak również tak skonstruowane nośniki ekspresji. Wynalazek wykorzystuje układy hodowli gospodarza, takie jak różne mikroorganizmy i hodowle komórek kręgowców transformowanych takimi nośnikami ekspresji, a więc nakierowane na ekspresję powyższych sekwencji DNA. Produkty końcowe takiej ekspresji stosuje się jako środki farmaceutyczne użyteczne w profilaktyce lub leczeniu ludzi. W korzystnych wykonaniach, wynalazek daje specyficznie nośniki ekspresji o właściwej sekwencji tak że wytwarza się ludzkie interferony odpornościowy i wydziela się z komórki żywiciela w postaci dojrzałej. Ponadto, wynalazek dotyczy różnych procesów użytecznych w wytwarzaniu powyższych sekwencji DNA, nośników ekspresji, układów hodowli gospodarza oraz produktów końcowych i ich postaci.
Wynalazek wywodzi się częściowo z odkrycia sekwencji DNA kodującej ludzki interferon odpornościowy i wydedukowanej sekwencji aminokwasowej tego interferonu. Ponadto, wynlazek daje informację o sekwencjach 3' i 5' - flankujących genu ludzkiego interferonu odpornościowego, ułatwiającą wprowadzenie ich in vitro do nośników ekspresji. W szczególności dany jest segment 5' - DNA kodujący przypuszczalny endogenny polipeptyd sygnałowy, który bezpośrednio poprzedza sekwencję aminokwasową przypuszczalnego dojrzałego ludzkiego interferonu odpornościowego. Odkrycia te z kolei umożliwiły opracowanie środków i metod wytwarzania, ludzkiego interferonu odpornościowego, technologią rekombinowanego DNA w ilościach umożliwiających oznaczenie jego właściwości biochemicznych i czynności biologicznej.
153 202
Publikacje i inne materiały wyjśniające tło wynalazku, a w szczególności przypadkach dające dalsze szczegóły dotyczące jego stosowania, są włączone do niniejszego opisu na zasadzie odnośnika. W tekście są one oznaczone numerami i odpowiedno zgrupowane w załączonej bibliografii.
A. Ludzk i intefferon odponoościowy . nntefeerony ludzkie można sklasyfikować w trzchh grupach, na podstawie różnej antygenowości i właściwości biologicznych i biochemicznych.
Grupa pierwsza obejmuje rodzinę interferonów leukocytowych (interferon a, LelF lub IFNa), które normalnie są produkowane głównie przez komórki krwi ludzkiej po indukcji wirusowej. Zostały one wyprodukowane mikrobiologicznie i stwierdzono, że są one biologicznie czynne (1,2, 3). Z uwagi na właściwości biologiczne, znalazły one zastosowanie kliniczne jako czynniki terapeutyczne w leczeniu zakażeń wirusowych i nowotworów złośliwych (4).
W grupie drugiej znajduje się ludzki interferon fibroblastowy (interferon β, FIF lub INF-/J), normalnie produkowany przez fibroblasty po indukcji wirusowej. Również one zostały wyprodukowane mikrobiologicznie. Wykazują szeroki zakres czynności biologicznej (5). Badania kliniczne wykazały ich potencjalną wartość terapeutyczną. Iterferony leukocytowe i fibroblastowe wykazują bardzo wyraźne podobieństwa biologicznych, pomimo homologii na poziomie aminokwasowym. Interferony obu grup mają po 165 do 166 aminokwasów i są białkami odpornymi na kwas.
Ludzki interferon odpornościowy (interferon y, IIF lub IFN-y) określany, którego dotyczy wynalazek, jest w przeciwieństwie do interferonów a i a, labilny przy pH 2. Jest on produkowany głównie po mitogenicznej indukcji limfocytów i również jest wyraźnie antygenowo specyficzny. Do niedawna ludzki interferon odpornościowy był wykrywany jedynie w bardzo małych ilościach, co ewidentnie utrudniało jego charakteryzację. Ostatnio doniesiono o znacznym, jednak nadal jedynie częściowym oczyszczeniu ludzkiego interferonu odpornościowego (6). Związek został wyprodukowany z hodowli limfocytów stymulowanych kombinacją fitohemaglutyny i estru forbolu i oczyszczony sekwencyjnym rozdziałem chromatograficznym. Procedura ta dała produkt o ciężarze cząsteczkowym 58 000.
Ludzki interferon odpornościowy został wyprodukowany w bardzo małych ilościach przez translację mRNA w oocytach. Wykazywał on aktywność interferonową charakterystyczną dla ludzkiego interferonu odpornościowego, stwarzając nadzieję, że CDNA iterferonu odpornościowego będzie mógł być syntetyzowany i klonowany (7).
Ilość otrzymywanego dotychczas interferonu odpornościowego była oczywiście niewystarczająca do jednoznacznego scharakteryzowania właściwości biologicznych oczyszczonego składnika. Jednakże badania in vitro przeprowadzone z surowymi preparatami, jak również badania in vivo z preparatami interferonu γ rozkoba sugerują, że zasadniczą czynnością interferonu odpornościowego może być czynność immunoregulacyjna (8, 9). Interferon odpornościowy ma nie tylko czynność przeciwwirusową i peześiwkomótkową, wspólną dla wszystkich ludzkich interferonów, lecz również wykazują efekt wzmacniania tych czynności interferonu a i β (10). Efekt antyproliferacyjny in vitro intereferonu γ wobec komórek nowotworowych jest około 10 do 100 razy większy niż interferonów innych klas (8,11,12). Te właściwości, łącznie z wyraźną rolą immunoregulacyjną (8, 9) sugerują aktywność przeciwnowotwotową IFN-y znacznie wyższą niż aktywność przeciwnowotworową IFN-y znacznie wyższą niż IFN-y i IFN-/J Badania in vivo przeprowadzone z preparatami IFN-y myszy i rozkolca wykazały wyraźną ich wyższość nad pezeciwwirusowo indukowanymi interferonami w ich przeciwnowotworowym działanu wobec osteogenicznego mięsaka (13).
Wszystkie dotychczasowe badania przeprowadzono z preparatami mało oczyszczonymi ze względu na ich niedostępność. Jednakże badania te sugerują bardzo ważne funkcje biologiczne interferonu odpornościowego. Interferon odpornościowy wykazuje nie tylko silnie związaną czynność ptześiooitusową, lecz prawdopodobnie również silną czynność immunoregulacyjną i przecionowotwotooą, co czyni go potencjalnie bardzo obiecującym kandydatem klinicznym.
Przewidywano, że zastosowanie technologii teZombinooanego DNA będzie najefektywniejszym sposobem uzyskania większych ilości ludzkiego interferonu odpornościowego. Niezależnie od tego, czy tak wyprodukowany materiał będzie obejmował glikozylację, która jest uważana za chataZtftystsśrną dla naturalnego materiału pochodzącego od człowieka, będzie on prawdopodobnie wykazywał czynność biologiczną dopuszczającą kliniczne jego stosowanie w leczeniu szerokiego zakresu stanów lub chorób wirusowych, nowotworowych i immunosupresyjnych.
153 202
B. Technologia rekombinowanego DNA. Technologia rekombinowanego DNA osiągnęła stan pewnego wyrafinowania. Biologowie molekularni z łatwością mogą rekombinować różne sekwencje DNA, stwarzając nowe jednostki DNA zdolne do produkcji znacznych ilości egzogennego produktu białkowego u transformowanych mikrobów. Dostępne są ogólne środki i metody ligacji różnych „tępo lub „lepko zakończonych fragmentów DNA produkujących nośniki ekspresji użyteczne w transformacji poszczególnych organizmów i kierujących ich wydajną syntezą żądanych produktów egzogennych. Jednakże w odniesieniu do indywidualnego produktu schemat nie zawsze jest przejrzysty i wiedza nie osiągnęła jeszcze etapu, na którym możliwe by było regularne przewidywanie powodzenia. Oczekujący pomyślnych wyników bez bazy doświadczalnej narażają się na znaczne ryzyko niepowodzenia.
Plazmid, niechromosomalna pętla dwuniciowego DNA znajdowana u bakterii i innych mikrobów, często w licznych kopiach w jednej komórce, pozostaje podstawowym elementem technologii rekombinowanego DNA. W plazmidowym DNA zakodowana jest między innymi informacja wymagana dla reprodukcji i plazmidu w komórkach pochodnych (tj. źródło replikacji) i zwykle jedna lub więcej charakterystyka selekcji fenotypowej, jak, w przypadku bakterii, oporność na antybiotyki, umożliwiająca interesujący plazmid i preferencyjne hodowanie go w selektywnych pożywkach. Użyteczność plazmidów związana jest z faktem, że mogą być one specyficznie rozcinane różnymi endonukleazami restrykcyjnymi lub „enzymami restrykcyjnymi z których każdy rozpoznaje inny punkt w plazmidzie DNA. Następnie do plazmidu można wprowadzić heterologiczne geny lub fragmenty genów, w punkcie rozcięcia lub na zrekonstruowanych końcach przyległych do punktu rozcięcia. W ten sposób otrzymuje się tzw. replikowalne nośniki ekspresji. Rekombinacji DNA dokonuje się poza komórką, lecz powstały „rekombinowany replikowalny nośnik ekspresji lub plazmid można wprowadzać do komórek w procesie znanym jako transformacja, a duże ilości rekombinowanego nośnika można otrzymać przez hodowanie transformantu. Ponadto, gdy gen jest odpowiednio wprowadzony, w odniesieniu do części plazmidu rządzących transkrypcją i translacją zakodowanej informacji DNA, to powstały nośnik ekspresji można stosować do rzeczywistej produkcji sekwencji polipeptydu którą koduje wprowadzony gen, który to proces określa się jako ekspresja.
Ekspresja jest inicjowana w obszarze znanym jako promotor, który jest rozpoznawany i wiązany przez polimerazę RNA. W fazie transkrypcji ekspresji, DNA rozwija się, eksponując się jako wzorzec dla zainicjowanej syntezy informacyjnego RNA (mRNA) z sekwencji DNA. Informacyjny RNA z kolei podlega translacji w polipeptyd mający sekwencję aminokwasową zakodowaną przez mRNA. Każdy aminokwas jest kodowany tripletem nukleotydowym lub „kodonem, które kolektywnie stanowią „gen strukturalny, tj. tę część która koduje sekwencję aminokwasową polipeptydowego produktu ekspresji. Translacja jest inicjowana sygnałem „start (zwykle ATG, który w powstałym mRNA staje się AUG). Tzw, kodony stop określają zakończenie translacji i w ten sposób produkcję dalszych jednostek aminokwasowych. Powstały produkt może być uzyskany przez lizę, jeżeli to konieczne, komórki gospodarza w układach mikrobiologicznych i odzyskanie produktu przez odpowiednie oczyszczenie od innych białek.
W praktyce, przy użyciu technologii rekombinowanego DNA można dokonywać ekspresji całkowicie heterologicznych polipeptydów - tzw. ekspresji bezpośredniej - lub, alternatywnie, ekspresji polipeptydu złączonego z częścią sekwencji aminokwasowej, polipeptydu homologicznego. W tym ostatnim przypadku produkt który ma być biologicznie czynny jest czasami pozbawiony czynności w łączonym polipeptydzie homologiczno/heterologicznym, dopóki nie zostaje rozcięty w środowisku pozakomórkowym. Patrz brytyjski opis patentowy nr 2 007 676A i Wetzel, American Scientist 68, 664 (1980).
C. Technologia hodowli komórkowej. Hodowla komórkowa lub hodowla tkankowa znalazły utrwalone zastosowanie do badania genetyki i fizjologii komórkowej. Dostępne są środki i metody utrzymywania stałych linii komórkowych, preparowanych przez kolejne seryjne przenoszenia z izolatowanych normalnych komórek. Do użytkowania w badaniach takie linie komórkowe utrzymuje się na stałym nośniku w ciekłej pożywce lub hoduje w zawiesinie zawierającej substancje odżywcze. Zwiększenie skali w celu uzyskiwania większych ilości preparatów stwarza jedynie mechaniczne problemy. Szersze informacje zawarte są w Microbiology, wydanie drugie, Harper and Row, Publishers, Inc., Hagerstown, Maryland (1973), zwłaszcza na stronie 1122 i dalszych oraz
153 202 w Scientific American 245,66 i dalsze (1981), które to pozycje załącza się do niniejszego na zasadzie odnośnika.
Wynalazek bazuje na odkryciu, że technologię rekombinowanego DNA można z powodzeniem zastosować do wytwarzania ludzkiego interferonu odpornościowego, korzystnie w postaci bezpośredniej, w ilościach wystarczających do zapoczątkowania i prowadzenia badań na zwierzętach i badań klinicznych, stanowiących warunek konieczny dla wprowadzenia produktu na rynek. Produkt nadaje się do użycia, we wszystkich swych postaciach, w profilaktyce lub leczeniu ludzi w przypadkach zakażeń wirusowych i stanach złośliwych i immunosupresyjnych lub immunodeficytowych. Jego postaciami są różne możliwe formy oligomeryczne, które mogą obejmować związaną glikozylację. Produkt jest wytwarzany przez hodowlę transformowanych mikroorganizmów lub transformowanych komórek poddanych operacjom inżynierii genetycznej.
Użyty termin „transformowana komórka odnosi się do komórki do której wprowadzono DNA, pozyskany z egzogennej rekombinacji DNA, i do progeny każdej takiej komórki, która zatrzymuje tak wprowadzony DNA. Tak więc obecnie istnieje potencjalna możliwość wytwarzania i wyodrębniania ludzkiego interferonu odpornościowego w sposób bardziej wydajny niż to było możliwe dotychczas. Istotnym elementem wynalazku, w jego najkorzystniejszych wykonaniach, jest uzyskanie genetycznego ukierunkowania mikroorganizmu lub hodowli komórkowej na wytwarzanie ludzkiego interferonu odpornościowego w ilościach umożliwiających izolację i wydzielanego z komórki gospodarza w postaci dojrzałej.
Sposobem według wynalazku wytwarza się ludzki interferon odpornościowy. Wynalazek ukierunkowany jest na replikowalne nośniki ekspresji DNA niosące sekwencję genu kodujące ludzki interferon odpornościowy w postaci umożliwiającej ekspresję. Wynalazek wykorzystuje szczepy mikroorganizmów lub hodowle komórkowe tarnsformowane wyżej opisanymi nośnikami ekspresji oraz hodowle takich transformowanych szczepów zdolne do wytwarzania ludzkiego interfeonu odpornościowego. Wynalazek ponadto umożliwia prowadzenie różnych procesów użytecznych w wytwarzaniu sekwencji genu interferonu odpornościowego, nośników ekspresji DNA, szczepów mikroorganizmów i hodowli komórkowych i ich specyficznych postaci. W realizacji wynalazku wytwarza się hodowle fermentacyjne powyższych mikroorganizmów i komórek, ale przede wszystkim wynalazek jest nakierowany na wytwarzanie ludzkiego interferonu odpornościowego, jako bezpośredniego produktu ekspresji wydzielanego z komórki żywiciela w dojrzałej postaci. W tym celu można stosować gen kodujący sekwencję dojrzałego ludzkiego interferonu odpornościowego i DNA flankujący w punkcie 5' kodujący polipeptyd sygnałowy. Przyjmuje się, że polipeptyd sygnałowy ułatwia transport cząsteczki do ściany komórkowej organizmu gospodarza, gdzie jest ona rozszczepiona w procesie wydzielania produktu - dojrzałego ludzkiego interferonu. To wykonanie umożliwia izolację i oczyszczanie żądanego dojrzałego interferonu ludzkiego z pominięciem procedur eliminujących zanieczyszczenia wewnątrzkomórkowym białkiem gospodarza lub szczątkami komórki.
Ekspresja „dojrzałego ludzkiego interferonu odpornościowego oznacza produkcję w hodowli mikrobiologicznej lub komórkowej ludzkiego interferonu odpornościowego, której nie towarzyszy peptyd sygnałowy lub wstępna sekwencja peptydowa bezpośrednio poprzedzająca translację mRNA ludzkiego interferonu odpornościowego. Sposobem według wynalazku otrzymuje się pierwszy rekombinowany ludzki interferon odpornościowy mający jako pierwszy aminokwas metioninę (której obecność jest spowodowana wprowadzeniem kodonu ATG sygnału startowego przed genem strukturalnym lub, w przypadku wewnątrz - lub pozakomórkowego odcięcia metioniny posiadający jako pierwszy aminokwas - cysteinę. Dojrzały interferon ludzki może być również wytworzony łącznie ze sprzężonym białkiem innym niż konwencjonalny polipeptyd sygnałowy, ulegającym specyficznemu odcięciu w środowisku wewnątrz - lub pozakomórkowym. Patrz brytyjski opis patentowy nr 2007 676A. Dojrzały ludzki interferon odpornościowy może być wreszcie wytworzony przez bezpośrednią ekspresję, bez odcinania zewnętrznego, zbytecznego polipeptydu. Jest to szczególnie ważne wówczas, gdy dany gospodarz nieodszczepia lub odszczepia nieefektywnie peptyd sygnałowy, a nośnik ekspresji dokonuje ekspresji dojrzałego interferonu ludzkiego łącznie z jego peptydem sygnałowym. Tak wyprodukowany dojrzały ludzki interferon odpornościowy odzyskuje się i oczyszcza do poziomu umożliwiającego stosowanie w leczeniu zakażeń
153 202 5 wirusowych, nowotworów złośliwych oraz stanów immunosupresyjnych lub immunodeficytowych.
Ludzki interferon odpornościowy wytwarza się sposobem według wynalazku następująco:
1. Tkankę ludzką, przykładowo tkankę śledziony ludzkiej lub limfocyty obwodowej krwi hoduje się z mitogenami, w celu stymulowania produkcji interferonu odpornościowego.
2. Agregaty komórek z takich hodowli komórkowych ekstrahuje się w obecności inhibitora rybonukleazy, dla wyizolowania całości cytoplazmowego RNA.
3. Na kolumnie oligo-dT izoluje się całość mRNA w postaci poliadenylowanej. Uzyskany mRNA frakcjonuje się według wielkości, stosując gradient gęstości sacharozy i eletroforezę żelową z kwasem - mocznikiem.
4. Opowiedni mRNA (12 do 18 s) konwertuje się w jednoniciowy komplementarny DNA (cDNA), z którego wytwarza się dwuniciowy cDNA. Po doczepieniu poli-dC wprowadza się go do wektora, takiego jak plazmid niosący jeden lub kilka markerów fenotypowych.
5. Tak spreparowane wektory stosuje się do transformowania komórek bakteryjnych, otrzymując zbiór kolonii. Do oddzielnego oznakowania duplikatu zbioru kolonii stosuje się radioznakowanego cDNA sporządzonego z indukowanego i nie indukowanego mRNA, otrzymanego jak wyżej opisano. Następnie usuwa się nadmiar cDNA i eksponuje się kolonie na błonie czułej na promieniowanie rentgenowskie, w celu identyfikacji indukowanych klonów cDNA.
6. Z indukowanych klonów cDNA izoluje się i sekwencjonuje się odpowiedni plazmidowy DNA.
7. W pierwszym wykonaniu sekwencjonowane DNA poddaje się in vitro obróbce umożliwiającej ich wprowadzenie do odpowiedniego nośnika ekspresji, który stosuje się do transformowania komórki E. coli jako gospodarza, a komórkę hoduje się dla ekspresji żądanego ludzkiego interferonu odpornościowego.
8. Wyprodukowany w drodze ekspresji ludzki interferon odpornościowy ma w postaci dojrzałej niewątpliwie 146 aminokwasów, z których pierwszym jest cysteina i ma bardzo zasadowy charakter. Ciężar cząsteczkowy monomeru obliczono na 17140. Przypuszczalnie z powodu obecności licznych grup zasadowych, hydrofobowości, formowania mostków solnych itp., cząsteczka może ulegać asocjacji w postacie oligomeryczne, np. w dimery, trimery lub tetramery. Uprzednio obserwowany wysoki ciężar cząsteczkowy materiału naturalnego (6), którego nie tłumaczy sama sekwencja aminokwasowa, może być spowodowany takimi postaciami oligomerycznymi oraz udziałem węglowodanów z glikozylacji post - translacyjnej.
9. W pewnych układach komórek gospodarza, zwłaszcza w przypadku ligacji do nośnika ekspresji, powodującej ekspresję łącznie z peptydem sygnałowym, dojrzała postać ludzkiego interferonu odpornościowego jest przenoszona do środowiska hodowli komórkowej, co niezmiernie ułatwia odzysk i oczyszczanie.
A. Hodowle mikroorganizmów/komórek.
1. Szczepy bakteryjne/promotory. Opisaną w niniejszym pracę przeprowadzono stosując, między innymi, mikroorganizm E. coli K-12 szczep 294 (koniec A. thi~, har', khsm+), jak opisany w brytyjskim opisie patentowym nr 2055 382A. Szczep ten został zdeponowany w American Type Culture Collection pod numerem ATCC 31446. Użyteczne są również inne szczepy bakteryjne, w tym znane szczepy E. coli, takie jak E. coliB, E. coli X 1776 (ATCC 31537) i E. coli W 3110(F, χ', protoficzny) (ATCC 27325) lub inne szczepy bakteryjne, z których wiele zostało zdeponowanych i jest (potencjalnie) dostępnych z uznanych instytucji deponującej mikroorganizmy, takich jak American Type Culture Collection - patrz katalog ATCC. Patrz również wylożeniowy opis patentowy RGN nr 2644432. Tymi innymi mikroorganizmami są np. Bacilli, takie jak Bacillus subtilis i inne enterobacteriaceae, spośród których można wymienić przykładowo Salomonella tryphimurium i Setarratia maracesans, wykorzystując plazmidy zdolne do replikacji i ekspresji sekwencji heterologicznych genów.
Do inicjowania i podtrzymywania mikrobiologicznej produkcji heterologicznych peptydów stosuje się z powodzeniem, przykładowo, układy promotorów /J-laktamazy i laktozy. Szczegóły dotyczące sporządzania i konstrukcji tych układów promotora opublikowali Chang i inni, Naturę 275, 617 (1978) oraz Itakura i inni, Scuence 198, 1056 (1977), które to publikacje załącza się do niniejszego na zasadzie odnośnika. Ostatnio opracowano układ bazujący na tryptofanie, układ tzw. promotora trp. Szczegóły dotyczące sporządzania i konstrukcji tego układu opublikowali
153 202
Coeddel i inni, Nucleic Acids Research 8,4057 (1980) oraz Kleid i inni, opis zgłoszenia patentowego St. Zjedn. Ameryki nr seryjny 133 296, złożonego 24 marca 1980, które to publikacje załącza się do niniejszego na zasadzie odnośnika. Odkryto i stosuje się liczne inne promotory bakteryjne. Szczegóły dotyczące ich sekwencji nukleotydowych, umożliwiające fachowcom funkcyjne ich ligowanie w wektorach plazmidowych zostały opublikowane, patrz np. Siebenlist . i inni, Celi 20,269 (1980). Również ta publikacja jest załączona do nieniejszego na zasadzie odnośnika.
2. Szczepy drożdży (promotory c^r^c^^d^y). Układ ekspresji może opierać się również na plazmidzie YRp7 (14, 15, 16), który jest zdolny. do selekcji i replikacji zarówno u E. coli, jak i drożdży, Saccharomyces cerevisiae. Do selekcji u drożdży plazmid zawiera gen TRPI (14,15,16), który komplementuje (umożliwia wzrost w nieobecności tryptofanu) drożdży zawierających mutacje w tym genie, znajdującym się w chromosomie IV drożdży (17). Użyto szczepu RH218 (18) zdeponowanego w American Type Culture Collection bez ograniczeń (ATCC 44076). Oczywiście każdy szczep Saccharomyces cervisiae, zawierający mutację czyniącą komórkę trpl winien być efektywnym środowiskiem dla ekspresji plazmidu zawierającego ten układ ekspresji. Przykładem innego nadającego się do użycia szczepu jest pep-4-1 (19). Ten tryptofanosuksotropowy szczep również ma punkt mutacji w genie TRPI.
Umiejscowiony w punkcie 5' niedrożdżowego genu, 5'-flankująca sekwencja DNA (promotor) z genu drożdży (dehydrogenazy alkoholowej 1) może promotować ekspresję obcego genu w drożdżach, gdy zostanie umiejscowiona w plazmidzie użytym do transformacji drożdży. Oprócz promotora, właściwa ekspresja niedrożdżowego genu u drożdży wymaga drugiej sekwencji drożdżowej umiejscowionej w końcu 3'-niedrożdżowego genu na plazmidzie, umożliwiającej odpowiednie zakończenie transkrypcji i poliadenylizację u drodżdży. Promotor ten znajduje zastosowanie w wynalzku, jak również inne, patrz poniżej. W korzystnych wykonaniach, 5'-flankująca sekwencja genu kinazy 3-fosfoglicerynianowej drożdży (20) jest umiejscowiona powyżej genu strukturalnego, a po niej następuje DNA zawierający sygnały zakończenia - poliadenylacji, przykładowo gen TRPI (14,15, 16) lub gen PGK (20).
Ponieważ 5'- flankująca sekwencja (łącznie z 3'-kończącym DNA drożdży (poniżej) może promotować ekspresję obcych genów u drożdży, wydaje się prawdopodobne, że 5'-flankujące -sekwencje wysoce ekspresowanego genu drożdży mogą być zastosowane do ekspresji ważnych produktów genowych. Ponieważ w pewnych okolicznościach drożdże ekspresują do 65% rozpuszczalnego białka jako enzymy glikolityczne (21) i ponieważ ten wysoki poziom okazuje się wynikać z wysokiego poziomu produkcji indywidualnych mRNA, winno być możliwe do użycia do takiej ekspersji 5'-flankujących sekwencji jakichkolwiek innych genów glikolitycznych, np. enolazy, dehydrogenazy 3-fosforanu gliceraldehydu, heksokinazy, dekarboksylazy pirogronianowej, fosfofruktokunazy, izomerazy 6-fosforanu glikozy, mutazy 3-fosfoglicerynianu, kinazy pirogronianowej, izomerazy triozofosforanowej, izomerazy fosfoglikozowej i glikokinazy. Każda z 3'flankujących sekwencji tych genów winna również być odpowiednia do właściwego kończenia i poliadenylacji mRNA w takim układzie ekspresji. Innymi wysoce ekspresowanymi genami są geny kwaśnych fosfataz (23) i geny dokonujące ekspresji z wysokim poziomem produkcji, dzięki mutacjom w obszarze 5'-flankującym (mutanty zwiększające ekspresję), zwykle w związku z obecnością TY1 transportowanego elementu (24).
Przyjmuje się, że wszystkie wyżej wspomnianego geny podlegają transkrypcji przez drożdżową polimerazę RNAII (24). Możliwe jest, że promotory polimerazy I i III, które dokonują transkrypcji genu rybosomalnego RNA, 5S RNA i tRNA (24, 25) również mogą być użyteczne w takich konstrukcjach ekspresji.
Wreszcie, wiele promotorów drożdży zawiera również kontrolę transkrypcji, tak że mogą być wyłączane lub włączane, w zależności od zmian w warunkach wzrostu. Niektórymi przykładami takich promotorów drożdży są geny produkujące następujące białka: dehydroganezę alkoholową II, izocytochrom-c, kwaśną fosfatazę, enzymy degradacyjne związane z metabolizmem azotu, dehydrogenazę 3-fosforanu gliceraldehydu i enzymy odpowiedzialne za utylizację maltozy i galaktozy (22). Taki obszar kontrolny byłby bardzo użyteczny w kontrolowaniu ekspresji produktu białkowego - zwłaszcza gdy ich produkcja jest toksyczna dla drożdży. Winno być również możliwe wprowadzenie obszaru kontrolnego 5'-flankującej sekwencji z 5'-flankującą sekwencją zawierającą
153 202 Ί promotor z wysoce ekspresowego genu. Dałoby to promotor hybrydowy, a winno być możliwe, ponieważ obszar kontrolny i promotor są fizycznie odrębnymi sekwencjami DNA.
3. Układy hodowli komórkowej/wektory hodowli komórkowej. Rozmnażanie komórek kręgowców w hodowli (hodowla tkankowa) stało się w ostatnich latach procedurą rutynową (Patrz Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Patterson Kruse and Patterson eds. 1973). Jako gospodarza do produkcji interferonu oporności zastosowano tutaj linię COS-7 fibroblastów nerki małpy (25a). Jednakże omówione tu doświadczenia można było przeprowadzić na jakiejkolwiek linii komórkowej zdolnej do replikacji i ekspresji odpowiedniego wektora, np. linii komórkowej WI38, ΒΗΚ, 3T3, CHO, VERO i Hela. Ponadto, wymagane jest umiejscowienie w wektorze ekspresji początku replikacji i promotora naprzeciw genu poddawanego ekspresji, łącznie z koniecznymi punktami wiązania rybosomu, punktami łączenia RNA, punktami poliadenylacji i sekwencjami terminatora transkrypcji. Wprawdzie dotychczas eksploatowano te istotne elementy SV40, to oczywiście jest, że wynalazek, choć opisany na przykładzie korzystnego wykonania, nie ogranicza się do tych sekwencji. Przykładowo, można stosować początek replikacji innymi wirusowych ( np. Polyoma, Adeno, VSV, BPV itd.) wektorów, jak również komórkowe początki replikacji DNA, które mogą działać w stanie niezintegrowanym.
B. Układy wektora.
1. Bezpośrednia ekspresja dojrzałego interferonu odpornościowego u E. coli. Procedurą zastosowaną dla uzyskania bezpośredniej ekspresji IFN-y u E. coli jako polipeptydu dojrzałego interferonu (minus sekwencja sygnałowa) był wariant stosowanej uprzednio dla ludzkiego hormonu wzrostu (26) i ludzkiego interferonu leukocytowego (1), tak dalece, jak dotyczyła ona kombinacji syntetycznego (N-terminalnego) i cDNA.
Jak wydedukowano z sekwencji nukleotydowej p69, opisanej poniżej i przez porównanie ze znanym punktem rozcięcia między peptydem sygnałowym i dojrzałym polipeptydem kilku IFN-cr (2), IFN-y ma hydrofobowy peptyd sygnałowy składający się z 20 aminokwasów, po którym następuje 146 aminokwasów dojrzałego IFN-y (fig. 5). Jak przedstawiono na fig. 7, punkt endonukleazy restrykcyjnej BstNI jest dogodnie umiejscowiony na aminokwasie 4 dojrzałego IFN-y. Skonstruowano dwa syntetyczne oligodeoksynukleotydy deoksy, które obejmują kodon ATG startu translatacji, kodony aminokwasów 1, 2 i 3 (cysteina - tyrozyna - cysteina) i tworzą lepki koniec EcoRI. Powyższe oligodeoksynukleotydy ligowano do skłdającego się ze 100 par zasad fragmentu BstNI-Pstl p-69, konstruując składający się z 1115 par zasad syntetyczno-naturalnych gen hybrydowy, który koduje IFN-y i który jest związany punktami restrykcyjnymi EcoRI i Pstl. Ten gen wprowadzono do plazmidu pLelF A trp 103 pomiędzy punktami EcoRI i Pstl, otrzymując plazmid ekspresji pIFN-y trp 48. W tym plazmidzie gen IFN-y jest ekspresowany pod kontrolą promotora E. coli trp (pLelP A trp 103 jest pochodną pLelF A 25, w której punkt EcoRI oddalony od genu LelF A został usunięty. Procedurę zastosowaną do usunięcia tego punktu EcoRI opisano uprzednio (27)).
2. Ekspresja u drożdży. Dla ekspresji heterologicznego genu, takiego jak cDNA interferonu odpornościowego u drożdży konieczne było skonstruowanie plazmidowego wektora zawierającego cztery komponenty. Pierwszy komponent jest częścią, która umożliwia transformację zarówno E. coli jak i drożdży, a więc musi zawierać dający się selekcjonować gen z każdego organizmu. (W tym przypadku jest to gen oporności na ampicylinę z E. coli i gen THPI z drożdży). Ten komponent wymaga również utrzymania początku replikacji z obu organizmów, jako palzmidowego DNA w obu organizmach. (W tym przypadku jest to początek E. coli z pBR322 i początek arsl z chromosomu III drożdży).
Drugim komponentem plazmidu jest 5'-flankująca sekwencja z wysoce ekspresowego genu drożdży, promotująca transkrypcję umiejscowionego poniżej genu strukturalnego. W tym przypadku użyto 5'-flankującej sekwencji z genu kinazy 3-fosfoglicerynianowej (PGK) drożdży. Fragment skonstruowano w taki sposób, że usunięto ATG z sekwencji i strukturalnej PGK oraz 8 par zasad powyżej tego ATG. Sekwencję tę zastąpiono sekwencją zawierającą punkty rekstrykcyjne Xbal i EcoRI, dla dogodnego przełączenia tej 5'-flankującej sekwencji do genu strukturalnego.
Trzecim komponentem układu jest gen strukturalny skonstruowany w taki sposób, że zawiera sygnał startu translacji ATG i sygnał stop translacji. Izolacja i konstrukcja takiego genu są opisane poniżej.
153 202
Czwartym komponentem jest sekwencja DNA drożdży zawierająca 3'-flankującą sekwencję genu drożdży, która zawiera odpowiednie sygnały zakończenia transkrypcji i poliadenylacji.
Przy obecności wszystkich tych składników, wyprodukowano interferon odpornościowy u drożdży.
3. Ekspresja w hodowli komórek ssaków. Strategia syntezy interferonu odpornościowego w hodowli komórek ssaka polegała na opracowaniu wektora zdolnego zarówno do automatycznej replikacji, jak i ekspresji obcego genu, pod kontrolą heterologicznej jednostki transkrypcyjnej. Replikacji tego wektora w hodowli tkankowej dokonano przez dostarczenie początku replikacji DNA (pochodzącego od wirusa SV40) i funkcji pomocnika (antygen T), przez wprowadzenie wektora do linii komórkowej dokonującej endogennej ekspresji tego antygenu (28, 29). Powyższy promotor wirusa SV40 poprzedza gen strukturalny interferonu i zapewnia transkrypcję genu.
Wektor użyty do uzyskania ekspresji IFN-y składał się z sekwencji pBR322, stanowiących dający się selekcjonować makrker do selekcji u E. coli (oporność na ampicylinę), jak również początek replikacji DNA u E. coli. Sekwencje te, uzyskane z plazmidu pML-1 (28) obejmowały region łączący punkty restrykcyjne EcoRI i BamHI. Początek SV40 pochodzi z mającego 342 pary zasad fragmentu PvuII-HindIII obejmującego ten obszar (30, 31) (oba końce przeprowadzone w końce EcoRI). Sekwencje te nie tylko zawierają wirusowy początek replikacji DNA, lecz również kodują promotor wczesnej i późniejszej jednostki transkrypcyjnej. Orientacja obszaru początku SN40 była taka, że promotor późniejszej jednostki transkrypcyjnej był umiejscowiony proksymalnie w stosunku do genu kodującego interferon.
Na załączonych rysunkach fig. 1 przedstawia wirowanie w grandiencie sacharozy indukowanego poli(A)+ RNA limfocytów obwodowej krwi (PBL). Obserwowano dwa maksima aktywności interferowanej (zakreskowane prostokąty) wielkości 12S i 16S. Położenia markerów - rybosomalnego RNA (wirowanego niezależna) są przedstawione powyżej profilu absorbancji.
Figura 2 przedstawia elektroforezę indukowanego poli- (A)+ RNA PBL na agarze w zakwaszonym roztworze mocznika. Obserwowano tylko jedno maksimum aktywności, wędrujące łącznie z 18S RNA. Położenia markerów - rybosomalnego RNA, które poddano elektroforezie na przyległej ścieżce i wywołano bromkiem etidiowym są oznaczone powyżej profilu aktywności.
Figura 3 przedstawia hybrydyzację 96 kolonii indukowanymi i nie ondukowanymi próbnikami cDNA znakowanego 32P. 96 indywidualnych transformantów hodowano na płytce do mikromiareczkowania. Repliki przeniesiono na membrany nitrocelulozowe, a następnie filtry hybrydyzowano z próbnikami 32P-CDNA, sporządzonymi bądź z indukowanego mRNA (powyżej) lub mRNA izolowanego z nieundukowanych hodowli PBL (nieindukowane poniżej). Filtry przemyto w celu usunięcia niehybrydyzowanego RNA i eksponowano na błonie czułej na promieniowanie rentgenowskie. Zestaw filtrów jest reprezentatywny dla 86 zestawów (8300 niezależnych kolonii). Przykład klonu „indukowanego jest oznaczony symbolem H12.
Figura 4 jest mapą endonukleazy restrykcyjnej insertu cDNA klonu 69. Insert cDNA jest ograniczony punktami Pstl (kropki na obu końcach) i ogonami oligo dG-dG (pojedyńcze linie). Liczbę i wielkość fragmentów uzyskanych po rozcięciu nukleazą rekstrykcyjną oznaczono w drodze elektroforezy na 6% żelu akrylamidowym. Położenie potwierdzono analizą sekwencyjną kwasów nukleinowych (przedstawiona na rysunku fig. 5). Obszar kodujący największej otwartej konstrukcji kodującej jest objęty prostokątem. Obszar zakreskowany reprezentuje przypuszczalną sekwencję peptydu sygnałowego o 20 jednostkach, a obszar zakropkowany reprezentuje sekwencję dojrzałego IIF (146 aminokwasów). Koniec 5'-mRNA znajduje się po lewej stronie, a koniec 3' po stronie prawej.
Figura 5 przedstawia sekwencję nukleotydową insertu cDNA plazmidu p69, ilustrującą najbardziej powszechną postać allelową IFN-y. Przedstawiono również najdłuższą otwartą konstrukcję kodującą. Przypuszczalna sekwencja sygnałowa obejmuje kodony SI do S20.
Figura 6 przedstawia porównanie struktury mRNA IFN-y ze strukturą interferonów leukocytowego (IFN-α) i fobroblastowego (IFN-/I) mRNA klonu 69 (odpornościowy) zawiera znacznie dłuższe sekwencje nie podlegające translacji.
Figura 7 przedstawia schematyczny diagram konstrukcji plazmidu ekspresji IFN-y pIFN-y trp 48. Materiał wyjściowy stanowi mający 1250 par zasad insert cDNA Pstl z plazmidu p69.
153 202 9
Figura 8 przedstawia diagram plazmidu stosowanego do ekspresji IFN-y w komórkach małpy.
Figura 9 przedstawia hybrydyzację Southern ośmiu różnych DNA genomu ludzkiego trawionych EcoRI, hybrydyzowanych z fragmentem Ddel oznakowanym 32P o 600 parach zasad z insertu cDNA z p69. W każdej próbce DNA dwa fragmenty EcoRI wyraźnie hybrydyzują z próbnikiem.
Figura 10 przedstawia hybrydyzację Southern DNA genonu ludzkiego trawionego sześcioma różnymi endonukleazami restrykcyjnymi z oznakowanymi 32P próbnikami z p69.
Figura 11 przedstawia schematycznie mapę restrykcyjnej insertu Hindlll o 3100 parach zasad wektora pBl, z którego izolowano promotor PGK. Wskazane jest wprowadzenie punktu EcoRI i punktu Xbal do 5'-flankującego DNA genu PGK.
Figura 12 przedstawia 5'-flankującą sekwencję i wstępną sekwencję kodującą genu PGK przed wprowadzeniem punktów Xbal i EcoRI.
Figura 13 ilustruje schematycznie technikę zastosowaną do wprowadzania punktu Xbal w pozycję 8 promotora PGK i izolacji fragmentu wielkości 39 par zasad 5'-flankującej sekwencji i PGK zawierającej ten koniec Xbal oraz koniec Sau3A.
Figura 14 ilustruje schematycznie konstrukcję fragmentu wielkości 300 par zasad, zawierającą powyższy fragment wielkości 39 par zasad, dodatkową sekwencję 5'-flankującą PGK (265 par zasad) z Pvul do SaU3A (patrz fig. 11) i punkt EcoRI przylegający do Xbal.
Figura 15 ilustruje schematycznie konstrukcję fragmentu promotora PGK wielkości 1500 par zasad (Hindlll) EcoRI), który zawiera, oprócz fragmentu skonstruowanego jak na fig. 14, fragment do Pvul wielkości 1300 par zasad z sekwencji 5'-flankującej PGK (patrz fig. 11).
Figura 16 ilustruje skład wektora ekspresji ludzkiego unterferonu odpornościowego u drożdży, zawierającego zmodyfikowany promotor PGK, cDNA IFN-y i obszar terminatora genu PGK drożdży, jak opisano niżej.
Dane biologiczne.
A. Charakteryzacja czynności przewciwirusowej. W celu zneutralizowania przeciwciał, próbki rozcieńczano, jeżeli to było konieczne, do stężenia 500-1000 jednostek/ml, za pomocą PBS-BSA. Jednakowe objętości próbek indukowano w ciągu 2-12 godzin w 4°C z seryjnymi rozcieńczeniami przeciwludzkiego leukocytu królika, leukocytu fibroblastu lub β - otrzymano z National Institute of Alergy and Infectious Diseases. Anty-IFN-y sporządzano stosując autentyczny IFN-y (5-20% czystości), oczyszczony z stymulowanych limfocytów obwodowej krwi ludzkiej. Próbki wirowano w ciągu 3 minut przy 12 000 X g, na 3 minuty przed próbą. W celu zbadania stabilności przy pH 2, próbki doprowadzono do pH = 2 przez dodanie 1 N HC1, inkubowano w ciągu 2-12 godzin w 5°C i zobojętniano przez dodanie, przed próbą, 1 N NaOH. W celu zbadania wrażliwości na dodecylosiarczan sodu (SDS), próbki inkubowano przed próbą z jednostkową objętością 0,2% SDS, w ciągu 2-12 godzin w 4°C.
B. Charakteryzacja IFN-y produkowanego przez E. coli i komórki COS-7.
Czynność przeciwwirusowa (jednostek/ml)
Obróbka E. coli W3110/ komórki COS-7/
IFN-tr | IFN-/3 | IFN-y | pIFN-y trp48 ekstrakt | pSV y 69 supernatant | |
bez | 375 | 125 | 250 | 250 | 62,5 |
pH 2 | 375 | 125 | <6 | <12 | <4 |
0,1% SDS | 375 | — | <4 | <8 | — |
anty-IFN-α królika | <8 | 125 | 250 | 250 | 187 |
anty-IFN-β królika | 375 | <8 | 187 | 250 | 125 |
anty-IFN-y królika | 375 | 125 | <4 | <8 | <4 |
W powyższej tabeli przedstawiono charakterystyczne właściwości standardów IFN-α, β i γ po różnorakiej obróbce. Aktywność interferonu produkowanego przez E. coli W3110/pIFN-y trp48 i przez COS-7/pSV γ 69 jest wrażliwa na kwas, wrażliwa na SDS i neutralizowana antyserum
153 202 interferonu odpornościowego. Nie jest neutralizowana przeciwcialmi IFN-α i β. Powyższe dane potwierdzają, że interferon produkowany w tych systemach jest interferonem IFN-y i że insert cDNA plazmidu p69 koduje IFN-y.
Oczyszczanie. Jedna z metod za pomocą której IFN-y można oczyszczać, przykładowo z bakterii opisana jest następującym schemacie ogólnym.
1. Ekstrakcja komórek w buforze lizującym o wysokiej przewodności (pH około 8) na drodze przepuszczania przez homogenizator pod wysokim ciśnieniem i oziębianie odcieku w kąpieli lodowej.
2. Wytrącenie DNA na drodze wprowadzenia dodatku polietyleno-iminy przy jednoczesnym mieszaniu, przykładowo w temperaturze 4°C.
3. Wytrącenie białek bakteryjnych na drodze zmiany pH z pozostawieniem IFN-y w roztworze.
4. Oddzielenie części stałych przez odwirowanie w temperaturze 4°C.
5. Zatężenie cieczy znad osadu (po ponownym doprowadzeniu pH do właściwej wartości) na drodze ultrafiltracji.
6. Dializa zatężonego koncentratu wobec buforu o niskiej przewodności.
7. Usuwanie części stałych przez odwirowanie z pozostawieniem w roztworze IFN-y.
8. Jonowymienna chromatografia na karboksymetylocelulozie z elucją o gradiencie wzrastającej sile jonowej.
9. Chromatografia na żelu fosforanowo-wapniowym z elucją o gradientowo wzrastającej sile jonowej.
10. Jonowymienna chromatografia na karboksymetylocelulozie w łagodnie denaturujących warunkach z elucją o gradientowo wzrastającej sile jonowej.
11. Rozdział na drodze żelowej filtracji chromatograficznej.
W powyższym sposobie otrzymuje się produkty o czystości wyższej niż 95%.
Białko interferonu odpornościowego wytworzonego według wynalazku określono za pomocą zanalizowanego DNA genu i wydedukowanej sekwencji aminokwasowej - patrz fig. 5. Oczywiście istnieją dla omawianego interferonu i występują u indywidualnych osobników naturalne odmiany alleliczne. Różnice te można wykazać różnicami w składzie aminokwasowym ogólnej sekwencji lub delecjami, substytucjami, insercjami, inwersjami lub addycjami aminokwasów w sekwencji. Wszystkie takie odmiany alleliczne objęte są zakresem wynalazku.
Mając dostęp do DNA i sekwencji aminokwasowej IFN-y (patrz rys. fig. 5) najdogodniejszy sposób stosowania wielokrotnego wynalazku, bez wątpienia obejmować będzie wytwarzanie kompletnego genu na drodze syntezy (patrz 26 przykładowo) lub też syntetycznych oligodezoksynukleotydów przy pomocy których źródło cDNA można spróbnikować w celu wyodrębnienia genu standardową techniką hybrydyzacji. Otrzymawszy sekwencję nukleotydową z zakodowaną wymaganą strukturą białka IFN-y, środki osiągania ekspresji, izolacja, i oczyszczanie mające na celu otrzymanie preparatów wysokiej czystości IFN-y prowadzić można zgodnie z powyższym opisem.
Związki wytwarzane sposobem według wynalazku można formułować znanymi sposobami z farmaceutycznie użyteczne kompozycje, mieszając ludzki interferon odpornościowy z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem. Odpowiednie nośniki i ich formułowanie są opisane w Remington^ Pharmaceutical Sciences, E. W. Martin, którą to pozycję załącza się do niniejszego na zasadzie odnośnika. Takie kompozycje będą zawierać efektywną ilość białka interferowanego łącznie z odpowiednią ilością nośnika, czyniąc je odpowiednimi do podawania pacjentowi.
Ludzki interferon odpornościowy wytworzony według wynalazku może być podawany pozajelitowo pacjentom wymagającym leczenia przeciwnowotworowego lub przeciwwirusowego i wykazującym stany immunosupresyjne. Wielkość dawki i częstotliwość dawkowania mogą być podobne jak w klinicznych badaniach innych ludzkich interferonów, np. około (1-10) X 10® jednostek dziennie, a w przypadku materiału o czystości powyżej 1% do np. 50 X 106 jednostek dziennie. Dawkowanie IFN-y może być znacznie zwiększone, w celu uzyskania większego efektu, dzięki zasadniczej nieobecności innych niż IFN-y białek ludzkich, które to białka w materiałach pochodzenia ludzkiego mogłoby powodować pewne niekorzystne efekty.
Jako jeden z przykładów odpowiedniej formy dawkowania zasadniczo homogenicznego IFN-y w postaci pozajelitowej, 3 mg IFN-y o aktywności właściwej około 2 X 108 jednostek/mg
153 202 można rozpuścić w 25 ml 5 N albuminy osocza (ludzkiego) - USP, roztwór przepuścić przez filtr bakteriologiczny, a przesączony roztwór rozlać do 100 ampułek zawierających po 6X10® jednostek interferonu nadającego się do stosowania pozajelitowego. Ampułki przed użyciem należy przechowywać w zimnie (-20°C).
Choć omówiono w opisie szczególnie korzystne wykonania, oczywiste jest, że wynalazek nie ogranicza się do tych wykonań, a jego zakres jest określony w zastrzeżeniach.
Przykład
A. Źródło mRNA IFN-y. Limfocyty krwi obwodowej (PBL) uzyskano od dawców ludzkich w drodze leukoferazy. Oczyszczono je dalej w drodze wirowania gradientowego Ficoll-Hypaque, a następnie hodowano, w stężeniu 5X110® komórek/ml, w roztworze RPMI1640 zawierającym 1% L-glutaminy, 25 mM HEPES i 1 % roztwór penicyliny - streptomycyny (Gibco, Grand Island, NY). Komórki indukowano do produkcji IFN-y za pomocą mitogenowej stąfilokokowej enterotoksyny B (1 //g/ml) i hodowano w ciągu 24 do 48 godzin w 37°C w 5% CO2. Do hodowli PBL dodawano deacetylotymozyny-ff-1 (0,1 //g/ml), w celu zwiększenia względnej wydajności aktywności IFN-y.
B. Izolacja informacyjnego RNA. Całość RNA z hodowli PBL ekstrahowano zasadniczo tak jak podaje S. L. Berger i inni (33). Komórki oddzielano przez wirowanie, a następnie ponownie zawieszano w roztworze zawierającym 10 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1,5 mM MgCh i 10 mM kompleksu rybonukleozydo-wanadylowego. Komórki poddawano lizie przez dodanie NP-40 (stężenie końcowe 1%), a jądra oddzielono przez wirowanie. Supernatant zawierał całość RNA, który dalej oczyszczono przez wielokrotną ekstrakcję fenolem i chloroformem. Do fazy wodnej dodawano NaCl do stężenia 0,2 M, po czym sumaryczny RNA wytrącano przez dodanie dwóch objętości etanolu. RNA z hodowli nie indukowanych (nie stymulowanych) izolowano tymi samymi metodami. Oczyszczanie mRNA z preparatów sumarycznego RNA przeprowadzano drogą chromatografii na oligo-dT celulozie (34). Typowa wydajność z 1-2 litrów hodowli PBL wynosiła 5-10 mg sumarycznego RNA i 50-200 ug poli(A)+ RNA.
C. Frakcjonowanie mRNA według wielkości. Frakcjonowanie mRNA przeprowadzano dwiema metodami. Metody te stosowano niezależnie, a każda z nich dawała znaczne wzbogacenie w mRNA IFN-.
Do frakcjonowania mRNA zastosowano wirowanie w gradiencie sacharozy w obecności denaturującego formamidu. Gradienty 5 do 25% sacharozy w 70% formamidzie (32) wirowano przy 154 000 X g, w ciągu 19 godzin w 20°C. Następnie od góry gradientu pobierano kolejne frakcje (0,5 ml), wytrącano etanolem, a próbki materiału wystrzykiwano do oocytów Xenopus Laevis, w celu translacji mRNA (35). Po upływie 24 godzin w temperaturze pokojowej badano środowisko inkubacyjne na czynność przeciwwirusową, w stanadardowej próbie inhibitowania efektu cytopatycznego, z użyciem wirusa Vesicular Stomatitis (szczep Indiana) lub wirusa encephalomyocarditis na komórkach WISH (owodnia ludzka), jak opisuje Stewart (36), z tą różnicą, że próbki inkubowano z komórkami w ciągu 24 godzin (a nie 4), przed zakażeniem wirusem. Obserwowano dwa maksima aktywności RNA frakcjonowanego w gradiencie sacharozy (fig. 1). Jedno maksimum sedymentowało z obliczoną wielkością 12S i zawierało aktywność przeciwwirusową wielkości 100-400 jednostek/ml w porównaniu ze standardem IFN-y (na mikrogram wstrzyknięto RNA. Drugie maksimum aktywności sedymentowało jako wielkość 16S i zawierało około połowę aktywności maksimum wolniej sedymentującego. Każde z tych maksimów aktywności było powodowane obecnością IFN-y, gdyż nie obserwowano aktywności gdy te same frakcje były badane na bydlęcej linii komórkowej (MDBK), która nie jest chroniona ludzkim IFN-y. Aktywności IFN-α i IFN-J są łatwe do wykrycia w próbie MDBK (5).
Frakcjonowanie mRNA (200//g) przeprowadzano również elektroforetycznie na żelu agarowym, w zakwaszonym roztworze mocznika. Stosowano żel sporządzony z 1,75% agaru, 0,025 M cytrynianu sodu, pH 3,8 i 6M mocznika (37,38). Elektroforezę prowadzono w ciągu 7 godzin przy 25 mA i 4°C. Następnie żel frakcjonowano za pomocą żyletki. Indywidualne wycinki stapiano w 70°C i ekstrahowano dwukrotnie fenolem i jednokrotnie chloroformem. Frakcje wytrącano etanolem i badano na mRNA IFN-y przez wstrzyknięcie do oocytów Xenopus laevis i w próbie przeciw wirusowej. W próbkach frakcjonowanych na żelu obserwowano tylko jedno maksimum aktywności (fig. 2). Maksimum to wędrowało razem z 18S RNA i miało aktywność 600 jednostek/ml na mikrogram wstrzykniętego RNA. Również ta aktywność okazała się IFN-y specyficzna, ponieważ nie ochraniała komórek MDBK.
153 202
Rozbieżność między maksimami aktywności obserwowaną na gradientach sacharozy (12S i 16S) i żelach z kwaśnym mocznikiem (18S) można tłumaczyć tym, że te niezależne frakcjonowania nie są prowadzone w warunkach pełnej denaturacji.
D. Sporządzanie zbioru kolonii zawierających sekwencje IFN-y. Dwuniciowy cDNA preparowano standardowymi procedurami (26, 39), stosując 3pg frakcjonowanego na żelu mRNA. Frakcjonowanie cDNA według wielkości przeprowadzano na 6% żelu poliakryloamidowym. Eluowano dwie frakcje, 800-1500 par zasad (130 ng) i > 1500 par zasad (204 ng). 35 ng porcje cDNA każdej wielkości przedłużano rodnikami doksyC. za pomocą terminalnej transferazy deoksynukleotydylowej (40) i traktowano 300 ng plazmidu pBR322 (41), który podobnie ogonowano rodnikami deoksyG w punkcie Pstl (40). Mieszaninę transformowano do E. coli K12 szczep 294. Otrzymano około 8000 transformantów z cDNA wielkości 800-1500 par zasad i 400 transformantów z cDNA wielkości >1500 par zasad.
E. Skrining zestawu kolonii na indukowane cDNA. Kolonie indywidualne inkulowano do zagłębień na płytkach do mikromiareczkowania, zawierających LB (58) i 5 ug/ml tetracykliny i utrzymywano w -20°C, po dodaniu DMSO do 7%. Hodowano dwie kopie zestawu kolonii na filtrach nitrocelulozowych i utrwalano na filtrze DNA z każdej kolonii, stosując procedurę Grunstein-Hogness (42).
Sporządzono próbnik cDNA znakowanego 32P, stosując mRNA wielkości 18S, frakcjonowany na żelu, z indukowanych i nie indukowanych hodowli PBL. Jako primer stosowano Oligo dTi2-ia, a warunki reakcji były jak uprzednio opisano (1). Filtry zawierające 8000 transformantów z odcinka cDNA wielkości 600-1500 par zasad i 400 transformantów z odcinka cDNA wielkości 1500 par zasad hybrydyzowano z 20 X 106 cpm indukowanego 32P-GDNA. Duplikat zestawu filtrów hybrydyzowano z 20 X 106 cpm nie indukowanego 32P-GDNA. Hybrydyzację prowadzono w ciągu 16 godzin, w warunkach jak podają Fritsch i inni (43). Filtry ekstensywne przemyto, a następnie eskponowano na czułej na promieniowanie rentgenowskie błonie Kodak XR-5 z ekranami wzmacniającymi DuPont Lighning-Plus. Ekspozycja trwała 16-48 godzin. Obraz hybrydyzacji kolonii porównywano z oboma próbnikami. Około 40% kolonii wyraźnie hybrydyzowało z oboma róbnikami, natomiast około 50% kolonii nie hybrydyzowało z żadnym (przedstawiono na fig. 5). 124 kolonie hybrydyzowały znacznie z próbnikiem indukowanym, lecz nie wykrywalnie lub słabiej z próbnikiem nie indukowanym. Kolonie te indywidualnie inkulowano do zagłębień płytki do mikromiareczkowania, hodowano i przenoszono na filtry nitrocelulozowe i hybrydyzowano z tymi samymi dwoma próbnikami, jak wyżej opisano. Plazmidowy DNA izolowany z każdej z tych kolonii metodą szybką (44) również wiązano na filtrach nitrocelulozowych i hybrydyzowano (45) z indukowanymi i nie indukowanymi próbnikami. DNA z 22 kolonii hybrydyzował tylko z próbnikiem indukowanym. Kolonie te nazwano „indukowanymi11.
F. Charakteryzacja kolonii indukowanych. Z 5 indukowanych kolonii spreparowano plazmidowy DNA (46) i użyto go do scharakteryzowania insertów cDNA. Mapa restrykcji endokukleazami pięciu indukowanych plazmidów (p67, p68, p69, p71 i p72) wykazuje podobieństwo dla czterech z nich (p67, p69, p71 i p72). Te cztery plazmidy miały po 4 punkty Ddel, 2 Hinfl i jeden Rsal w insercie cDNA. Piąty plazmid (p68) zawierał wspólny fragment Ddel i okazał się być krótkim klonem cDNA w stosunku do pozostałych czterech. Homologia sugerowana mapą restrykcji nukleazami została potwierdzona przez hybrydyzację. Spreparowano 32P-znakowany DNA (47) z fragmentu Ddel wielkości 600 par zasad z plazmidu p67 i użyto go do hybrydyzacji (42) do innych indukowanych kolonii. Wszystkie pięć kolonii poddanych restrykcji nukleazami hybrydyzowano z tym próbnikiem, podobnie jak 17 innych kolonii spośród 124 wybranych w skriningu indukowana/nie indukowana. Długość insertu cDNA w każdym z hybrydyzowanych plazmidów oznaczono przez trawienie Pstl i elektroforezę żelową. Klon o najdłuższym insercie cDNA okazał się klonem 69 o długości insertu 1200-1400 par zasad. Tego DNA użyto we wszystkich dalszych doświadczeniach, a jego mapę restrykcji endonukleazami przedstawiono na fig. 4.
Wykazano, że insert cDNA w p69 był cDNA IFN-y, poprzez jego produkty ekspresji wytworzone w trzech niezależnych układach ekspresji, wykazujących czynność przeciwwirusową, jak opisano bardziej szczegółowo poniżej.
G. Analiza sekwencyjna insertu cDNA p69. Pełną sekwencję nukleotydową insertu cDNA plazmamidu p69 oznaczono metodą zakończenia łańcuchem dwudeoksynukleotydowym (48), po subklonowaniu fragmentów do wektora mp7 Μ13 (49) i chemiczną procedurą Maam-Gilbert (52).
153 202
Najdłuższy otwarty układ odczytu koduje białko o 166 aminokwasach, przedstawione na fig. 5. Pierwszą zakodowaną resztą jest pierwszy kodon met napotkany w końcu 5' cDNA. Pierwszych 20 aminokwasów aminoterminalnych prawodpodobnie stanowi sekwencję sygnałową wydzielania pozostałych 146 aminokwasów. Ta przypuszczalna sekwencja sygnałowa na wspólne z innymi scharakteryzowanymi sekwencjami sygnałowymi takie cechy jak wielkość i hydrofobowość. Ponadto, cztery aminokwasy znalezione w przypuszczalnej sekwencji rozciąga (ser-leu-gly-cys) są identyczne z czterema aminokwasami znalezionymi w punkcie rozcięcia kilku interferonów leukocytowych (LelF B, C, D, F i H (2)). Zakodowana dojrzała sekwencja 146 aminokwasów (dalej określana jest rekombinowany ludzki interferon odpornościowy) ma ciężar cząsteczkowy 17 140.
W zakodowanej sekwencji białkowej występują dwie pozycje potencjalnej glikolizacji (50), przy aminokwasach 28 do 30 (asn-gly-thy) i aminokwasach 100 lub 102 (asn-tyr-ser). Istnienie tych pozycji pokrywa się z obserwowaną glikolizacją ludzkiego IFN-y (6,51). Dwa jedyne rodniki cysteiny (pozycje 1 i 3) są zbyt bliskie dla wytworzenia mostku dwusiarczkowego, co jest zgodne z obserwowaną stabilnością IFN-y w obecności czynników redukujących, takich jak j3-merkaptoetanol (51). Wydedukowana dojrzała sekwencja aminokwasowa jest ogólnie dość zasadowa, mając sumarycznie 30 rodników lizyny, argininy i histydyny, a tylko sumarcznie 19 rodników kwasu asparaginowego i kwasu glutaminowego.
Struktura mRNA IFN-y wydedukowana z sekwencji DNA plazmidu p69 wyraźnie różni się od struktury mRNA IFN-ar (1,2) i mRNA IFN-/6 (5). Jak przedstawiono na fig. 6 obszar kodujący IFN-y jest krótszy, a nie podlegające translacji obszary 5' i 3' znacznie dłuższe niż u IFN-cr lub IFN-J.
H. Ekspresja rekombinowanego ludzkiego interferonu odpornościowego u E. coli. W odniesieniu do fig. 7 50pg plazmidu p69 trawiono Pstl, izolując elektroforezę na 6% żelu poliakrylamidowym insert wielkości 1250 par zasad. Elektroeluowano z żelu około 10 ug tego insertu. 5 pg tego fragmentu Pstl częściowo trawiono 3 jednostkami BstNI (Bethesda Research Labs, w ciągu 15 minut w 37°C, a mieszaninę reakcyjną oczyszczono na 6% żelu poliakrylamidowym. Odzyskano około 0,5 pg żądanego fragmentu BstNI - Pstl wielkości 1100 par zasad. Dwa wskazane oligodeoksynukleotydy, 5'-dAATICATGTGTTATTGTC i 5'-dTGACAATAACACATG (fig. 7) zsyntetyzowano metodą fosfotrójestrową (53) i fosforylowano jak następuje. Po 100 pmoli każdego oligodeoksynukleotydu zmieszano w 30pg 60 mM Tris-HCl (pH 8), 10 mM MgCk, 15 mM J-merkaptoetanolu i 240pGi (y-32P)ATP (Amersham, 5000 Ci/mmol). Dodano 12 jednostek kinazy polinukleotydowej T4 i prowadzono reakcję w ciągu 30 minut q 37°C. Dodano 1 pl lOmM ATP i kontynuowano reakcję w ciągu dalszych 20 minut. Po ekstrakcji C6H5OH/CHCI3 oligomery zmieszano z 0,25 pg fragmentu BstNI-Pstl wielkości 1100 par zasad i wytrącono etanolem. Fragmenty te ligowano w 20°C w ciągu 2 godzin w 30 pl 20 mM Tris-HCl (pH 7,5). 10 mM MgCh, 10 mM ditiotreitolu. 0,5 mM ATP i 10 jednostkami ligazy DNA T4. Mieszaninę trawiono w ciągu godziny 30 jednostkami Pstl i 30 jednostkami EcoRI (dla wyeliminowania polimeryzacji przez ligację lepkich końców) i poddano elektroforezie na 6% żelu poliakrylamidowym. Produkt wielkości 1115 par zasad (110 000 cpm) odzyskano w drodze elektroelucji.
Plazmid pLelF A trp 103 (fig. 7) jest pochodną plazmidu pLelF A 25 (1), w którym usunięto punkt EcoRI odleglejszy od genu LelF A (27). 3 pg PlelF A trp 103 trawiono 20 jednostkami EcoRI i 20 jednostkami Pstl w ciągu 90 minut w 37°C i poddano elektroforezie na 6% żelu poliakryloamidowym. Elktroelucją uzyskano duży ( 3900 par zasad) fragment wektora. Do 0,15 ug powyższego spreparowanego wektora ligowano fragment EcoRI-Pstl IFN-y wielkości 1115 par zasad. Transformacja szczepu E. coli K-12 294 (ATCC 31446) dała 120 kolonii opornych na tetracyklinę. Z 60 tych transformantów spreparaowano plazmidowe DNA i poddano trawieniu za pomocą EcoRI i Pstl. Trzy z tych plazmidów zawierały żądany fragment EcoRI-Pstl wielkości 1115 par zasad. Analiza sekwencji DNA potwierdziła, że plazmidy miały żądaną sekwencję nukleotydową na załączeniach między promotorem trp, syntetycznym DNA i cDNA. Do badań dodatkowych wybrano jeden z tych plazmidów, pIFN-y trp 48. Plazmidu tego użyto do transformacji i E. coli K-12 szczep W3110 (ATCC 27325).
I. Struktura genu sekwencji kodującej IFN-y. Strukturę genu kodującego IFN-y analizowano metodą hybrydyzacji Southern. W procedurze tej (54) 5 mikrogramów DNA ludzkiego limfocytu o wysokim ciężarze cząsteczkowym (otrzymanego według 55) wyczerpująco trawi się różnymi endo14
153 202 nukleazami restrykcyjnymi, poddaje się elektroforezie na 1,0% żelu agarowym (56) i przenosi na filtr nitrocelulozowy (54). Z fragmentu Ddel insertu cDNA p69 wielkości 600 par zasad sporządzono P-znakowany próbnik DNA i hybrydyzowano go (43) z odbiciem DNA na nitrocelulozie. Próbnik w ilości 107 impulsów na minutę hybrydyzowano w ciągu 16 godzin, a następnie przemyto jak opisano (43). Osiem próbek genomowego DNA od różnych donorów ludzkich trawiono endonukleazą restrykcyjną EcoRI i hybrydyzowano z 32P-znakowanym próbnikiem. Jak przedstawiono na fig. 9, obserwuje się dwa wyraźne sygnały hybrydyzacji wielkości 8,8 tys par zasad i 2,0 tys par zasad, jak obliczono przez porównanie ruchliwości λ DNA trawionego Hindlll. Mogą być one wynikiem dwóch genów IFN-y lub jednego genu rozszczepionego w punkcie EcoRI. Ponieważ cDNA p68 nie zawiera punktu EcoRI, dla wyjaśnienia pojedyńczego genu byłaby potrzebna interweniująca sekwencja (intron) z wewnętrznym punktem EcoRI.
W celu rozróżnienia między tymi dwoma możliwościami, przeprowadzono drugą hybrydyzację Southern z tym samym próbnikiem wobec pięciu innych trawień endonukleazą jednego DNA ludzkiego (fig. 10). Zaobserwowano po dwa hybrydyzujące fragmenty DNA w przypadku trawienia PvuII (6,7 tys. par zasad i 4,0 tys. par zasad) i HincII (2,5 tys. par zasad i 2,2 tys. par zasad) o po jednym dla Hindlll (9,0 tys. par zasad), BgllI (11,5 tys. par zasad) i BamHI (9,5 tys. par zasad). Dwa geny IFN-y musiałyby być złączone na niezwykle bliskiej odległości (poniżej 9,0 tys par zasad), aby znajdować w tym samym hybrydyzującym fragmencie Hindlll. Wynik ten sugeruje, że w DNA genomu ludzkiego obecny jest tylko jeden homologiczny gen IFN-y (inaczej niż w przypadku wielu pokrewnych genów IFN-y) i że gen ten jest rozcinany jednym lub kilkoma intronami zawierającymi punkty EcoRI, PvuII i HoncII. To przewidywanie znalazło potwierdzenie w hybrydyzacji 32P-znakowanego (47) fragmentu otrzymanego tylko z 3'-nietranslatowanego obszaru cDNA z p69 (fragment Ddel wiekości 130 par zasad z insertu cDNA przedstawionego na fig. 5, wielkości 860 do 990 par zasad wobec DNA genomu ludzkiego trawionego EcoRI. Do tego próbnika hybrydyzował jedynie fragment EcoRI wielkość 2,0 tys par zasad, co sugeruje, że zawiera on sekwencje 3'-nietranslantowe, podczas gdy fragment EcoRI wielkości 8,8 tys. par zasad zawiera sekwencje 5'. Struktura genu IFN-y (jeden gen z co najmniej jednym nitronem) wyraźnie różni się od struktury genu IFN-α (więcej niż jeden gen (2) bez intronów (56)) i struktury genu IFN-/3 (jeden gen bez intronów (57)).
J. Sporządzanie ekstraktów bakteryjnych. 24-godzinną hodowlę E. coli W31 lO/pIFN-y trp 48 w pożywce Luria zawierającej tetracyklinę w ilości 5 mikrogramów w ml inkulowano pożywkę M9 (58) zaiwerającą 0,2% glikozy, 0,5% aminokwasów kazeiny i 5 jfg/ml tetracykliny, w rozcieńczeniu 1:100. Gdy A550 wyniosło 0,1 do 0,2 dodano kwasu indoloakrylowego do końcowego stężenia 20pg/ml. Przy Asso= 1,0 poddano wirowaniu 10 ml próbki, a uzyskany materiał natychmiast ponownie zawieszono w 1 ml solanki buforowej fosforanem, zawierającej albuminę bydlęcego osocza (PBS-BSA) w ilości 1 /zg/ml. Otwarto komórki przez sonikację i odwirowano od zanieczyszczeń. Supernatanty do oznaczeń przechowywano w 4°C. Aktywność interferonową supernatantów oznaczono na 250 jednostek/ml, przez porównanie ze standardami IFN-y w próbie inhibitowania efektu cytopatycznego (CPE).
K. Transformacja drożdży/szczepów i pożywki. Szczepy drożdży transformowano jak uprzednio opisano (59). Do selekcji plazmidów zawierających fmkcjonalny gen TRPI użyto szczepu E. coli JA300 (thr leuB6 thi thyA trpC1117 hsdm” hsdR” str*) (20). Jako gospodarza transformacji drożdży użyto szczep drożdży RH218 mającego ten genotyp (trpl gal2 SUC2 mai CUPL) (18). RH218 zdeponowano bez ograniczeń w American Type Culture Collection, ATCC 44076. M9 (pożywka minimalna) z 0,25% aminokwasów kazeiny (CAA) i LB (pożywka bogata) były jak opisuje je Miller (58), z dodatkiem 20/zg/ml ampicyliny (Sigma), po autoklawowaniu i oziębieniu. Drożdże hodowano na następujących pożywkach: YEPD z zawartością 1% ekstraktu z drożdży, 2% peptonu i 2% glikozy ±3% argonu Difco. YNB + CAA zawierała 6,7 z zasady azotowej drożdży (YNB) (bez aminokwasów (Difco)), 10 mg adeniny, 10 mg uracylu, 5 g CAA, 20 g glikozy i ±30 g agaru w litrze.
L. Konstrukcja wektora ekspresji drożdży. 1. 10/zg YRp7 (14, 15, 16) trwaiono EcoRI. „Lepkie końce DNA „tępiono za pomocą polimerazy DNA I (fragment Klenowa). Wektor i insert rozwijano na 1% żelu agarowym (SeaKem), wycinano z żelu, elektroeluowano i ekstrahowano dwukrotnie jednakowymi objętościami chloroformu i fenolu, po czym wytrącano etanolem.
153 202
Otrzymane cząsteczki DNA z „tępym“ końcem ligowano ze sobą w końcowej objętości 50pi (w ciągu 12 godzin w 12°C. Mieszaniny ligacyjnej użyto do transformacji E. coli szczep JA300 na oporność na ampicylinę i protoforię tryptofanową. Izolowano plazmidy zawierające gen TRPI w obu orientacjach pFRWl miał gen TRPI w tej samej orientacji co YRp7, natomiast pFRW2 miał gen TRPI w orientacji przeciwnej.
20pg pFRW2 linearyzowano za pomocą Hindlll i poddano elektroforezie na 1% żelu agarowym.. Linearne cząsteczki eluowano z żelu i w ilości 200 ng ligowano z insertem Hindlll wielkości 3,1 tys . par zasad plazmidu pBI (131), który jest fragmentem restrykcyjnym zawierającym gen kinazy 3-fosfoglicerynianowej drożdży. Mieszaniny ligacyjnej użyto do transformacji E. coli szczep 294 na oporność na ampicylinę i wrażliwość na tetracyklinę. Plazmid spreparowany z jednego takiego rekombinantu miał nienaruszony gen TRPI z fragmentem Hindlll wielkości 3,1 tys. par zasad z insertu DNA pBI w punkcie Hindlll genu oporności na tetracyklinę. Jest to plazmid pFRM31. 5pg pFRM31 wyczerpująco trawiono EcoRI, ekstrahowano dwukrotnie fenolem i chloroformem i wytrącono etanolem. Lepkie końce cząsteczki wypełniono za pomocą polimerazy DNA I (fragment Klenowa), w reakcji z udziałem po 250pM każdego z trójfosforanów deoksynukleozydu. Reakcję prowadzono w ciągu 20 minut w 14°C, po czym ekstrahowano DNA dwukrotnie fenolem-chloroformem wytrącano etanolem. Ponownie zawieszony DNA wyczerpująco trawiono Ciał i poddawano elektroforezie na 6% żelu akrylamidowym. Fragment wektora eluowano z żelu, ekstrahowano fenolem-chloroformem i wytrącano etanolem.
Sześcioma N-termInalnymi aminokwasami oczyszczonego, ludzkiego enzymu 3-fosfoglIcerynianowego są następujące:
2 3 4 5 6
SER — LEU — SER — HSM — LYS — LEU
Jedna ze struktur odczytu translacji generowana z sekwencji DNA fragmentu restrykcyjnego Sau3A - do - Sau3A wielkości 141 par zasad (zawierającego wewnętrzny punkt HincII; patrz mapa restrykcji PGK, fig. 11) produkuje następującą sekwencję aminokwasową:
2 3 4 5 6
MET-SER —LEU —SER —SER —LYS —LEU
Po usunięciu początkowej metioniny widać, że N-terminalna sekwencja aminokwasowa PGK na homologię 5 spośród 6 aminokwasów z N-terminalną sekwencją aminokwasową ludzkiego PGK. Ten wynik sekwencjonowania sugeruje, że start genu strukturalnego PGK dorżdży jest kodowany przez DNA we fragmencie restrykcyjnym Sau3 A plazmidu pBI wielkości 141 par zasad. We wcześniejszej pracy (20) sugerowano, że sekwencja DNA specyfikująca mRNA PGK może znajdować się w tym obszarze fragementu Hindlll. Dalsze sekwencjonowanie fragmentu Sau3A wielkość 141 par zasad daje więcej sekwencji DNA promotora PGK (fig. 12).
Standardowymi metodami (Crea i inni, Nucleic Acid, Res. S, 2331 (1980)) zsyntetyzowano syntetyczny oligonukleotyd o sekwencji 5'ATTTGTTCTAAA3'. 100 ng tego primera oznakowano na końcu 5' za pomocą 10 jednostek kinazy polinukleotydowej T4 w 20 μθ (χ32Ρ)ΑΤΡ. Roztworu znakowanego primera użyto w reakcji mającej być pierwszym etapem w wieloetapowym procesie wprowadzenia punktu restrykcji RcoRI do 5' flankującego DNA PGK bezpośrednio poprzedzającego sekwencję genu strukturalnego PGK.
100μg pBI (20) wyczerpująco trawiono Haelll, a następnie rozwinięto na 6% żelu poliakrylamidowym. Pasmo najwyższe na żelu wywołanym bromkiem etidiowym (zawierające obszar promotora PGK) izolowano przez elektroelucję, jak wyżej opisano. Ten odcinek Haelll DNA wielkości 1200 par zasad poddano restrykcji HincII i rozwinięto na 6% żelu poliakrylamidowym. Elektroelucją izolowano pasmo 650 par zasad. Izolowano 5μg DNA. Ten odcinek HaeIII-doHincII, wielkości 650 par zasad, ponownie zawieszono w 20μ1 H2O i zmieszano z 20 ul roztworu fosforylowego primerem, wyżej opisanego. Mieszaninę ekstrahowano jednokrotnie fenolem chloroformem i wytrącono etanolem. Wysuszony DNA ponownie zawieszono w 50μ1 H2O i w ciągu 7 minut ogrzewano we wrzącej łaźni wodnej. Roztwór szybko oziębiono w łaźni suchy lód 16
153 202 etanol (10-20 sekund) i przeniesiono do łaźni woda - lód. Dodano 50μΐ roztworu zawierającego 10μ1 buforu 10Χ polimeraza DNA I (Boehringer Mannheim), 10//1 uprzednio sporządzonego roztworu zawierającego po 2,5 mM trójfosforanów deoksynukleozydów (dATP, dTTP, dGTP i dCTP), 25μ1 H2O i 5 jednostek polimerazy DNA I, fragment Klenowa. Mieszaninę reakcyjną objętości 100pl inkubowano w 37°C w ciągu 4 godzin. Roztwór ekstrahowano jednokrotnie fenolem-chloroformem, wytrącono etanolem, wysuszono przez liofilizację i poddano wyczerpującej restrykcji 10 jednostkami Sau3A.
Następnie roztwór rozwinięto na 6% żelu poliakrylamidowym. Pasmo odpowiadające 39 parom zasad wycięto z żelu i izolowano opisaną elektroelucją. Pasmo 39 par ma jeden koniec tępy i jeden koniec kleisty SaU3A. Powyższy fragment klonowano do zmodyfikowanego wektora pFIF trp 69 (5), 10 //g pFIF trp 69 linearyzowano za pomocą Xbal, po czym jednokrotnie ekstrahowano fenolem - chloroformem za pomocą polimerazy DNA I, fragmentem Klenowa w 50pg mieszaniny reakcyjnej zawierającej po 250μΜ trójfosforanów nuklezydów. Ten DNA rozcięto za pomocą BamHI i rozwinięto na 6% żelu poliakryloamidowym. Fragment wektora izolowano z żelu elektroelucją i ponownie zawieszono w 20 pg H2O. 20 ng tego wektora ligowano z 20 ng wyżej otrzymanego fragmentu wielkości 39 par zasad, w ciągu 4 godzin w temperaturze pokojowej. 1/5 mieszaniny ligacyjnej użyto do transformacji E. coli szczep 294 na oporność na ampicylinę (na płytkach LB + 20pg/ml ampicyliny). Plazmidy z transformantów badano procedurą szybkiego skriningu (44). Jeden plazmid, pPGK-39, wybrano do analizy sekwencyjnej. 20pg tego plazmidu trawiono Xlal, wytrącono etanolem, a następnie potraktowano 1000 jednostek alkalicznej fosfatazy bakteryjnej, w 68°C, w ciągu 45 minut. DNA ekstrahowania 3X fenolem - chloroformem i wytrącono etanolem. Defosforylowane końce oznakowano w 20pg mieszaniny reakcyjnej zawierającej 200//Ci (y P)ATP i 10 jednostek kinazy polinukleotydowej T4. Plazmid rozcięto za pomocą Sali i rozwinięto na 6% żelu poliakrylamidowym.
Pasmo znakowanego insertu izolowano z żelu i sekwencjonowano metodą degradacji chemicznej (52). Sekwencja DNA na końcu 3' tego fragmentu promotora odpowiadała oczekiwanej.
2. Konstrukcja fragmentu Pvul - do - EcoRI promotora PGK, wielkości 312 par zasad. 25pg pPGK-39 (fig. 13) trawiono równocześnie Sali i Xbal (po 5 jednostek) i poddano elektroforezie na 6% żelu. Drogą elektroelucji izolowano pasmo 390 par zasad zawierające fragment promotora wielkości 39 par zasad. Ponownie zawieszony DNA poddano restrykcji Sau3A i elektroforezie na 8% żelu akrylamidowym. Pasmo 39 para zasad promotora PGK izolowano elektroelucją. Ren DNA zawierał 39 par zasad końca 5'-promotora PGK na fragmencie Sau - do - Xbal.
25/rg pBl poddano restrykcji Pvul i KpnI, a następnie elektroforezie na 6% żelu akrylamidowym. Elektroelucją izolowano pasmo DNA wielkości 800 par zasad, które poddano restrykcji za pomocą Sau3A i elektroforezie na 6% żelu akrylamidowym. Elektroelucją izolowano pasmo 265 par zasad z promotora PGK (fig. 11).
Uzyskany DNA ligowano z fragmentem promotora wielkości 39 par zasad, w ciągu dwóch godzin w temperaturze pokojowej. Mieszaninę ligacyjną poddano restrykcji za pomocą Xbal i Pvul i elektroforezie na 6% żelu akrylamidowym. Drogą elektroelucji izolowano fragment restrykcyjny Xba - do -Pvul i dodano go do mieszaniny ligacyjnej zawierającej 200 ng pBR322 (41) (uprzednio izolowany pomniejszony o fragment restrykcyjny Pvul - do Pstl wielkości 162 par zasad) i 200 ng cDNA Xbal - do Pstl genu LeiF A, uprzednio izolowanego z 20 ug pLeiF trp A 25. Tej trójskładnikowej mieszaniny ligacyjnej użyto do transformowania E. coli szczep 294 na oporność na tetracyklinę. Kolonie transformantów poddano miniskriningowi (44), izolując jedną z kolonii, pPGK300, mającą 304 razy zasad 5'-flankującego DNA PGK przyłączonego do genu LeiF A w wektorze na bazie pBR322. Koniec 5'-genu LeiF ma następującą sekwencję: 5'-CTAGAATTC-3'. Tak więc wprowadzenie punktu Xbal z fragmentu promotora PGK do tej sekwencji umożliwia addycję do punktu EcoRI punktu Xbal, pPGK-300 zawiera część promotora PGK izolowaną we fragmencie Pvul - do - EcoRI.
3. Konstrukcja fragmentu EcoRI - do - EcoRI promotora PGK wielkości 1500 par zasad. 10μg pBl trawiono Pvul i EcoRI i rozwinięto na 6% żelu akrylamidowym. Elektroelucją izolowano pasmo Pvul - do - EcoRI z 5'-flankującego DNA PGK wielkości 1,3 tys. par zasad. 10 pg pPGK-300 trawiono EcoRI i Pvul i drogą elektroelucji izolowano fragment promotora wielkości 312 par zasad, po elektroforezie mieszaniny reakcyjnej na 6% żelu akrylamidowym. 5 ug pFRL4 rozcięto
153 202
EcoRI, wytrącono etanolem i w ciągu 45 minut, w 68°C, traktowano bakteryjną fosfatazą alkaliczną. Po trzech ekstrakcjach DNA fenolem/chloroformem, wytrąceniu etanolem i ponownym zawieszeniu, 200 ng wektora ligowano 100 ng DNA EcoRI - do - Pvul z pPGK-300 wielkości 312 par zasad i 100 ng DNA EcoRI - do - Pvul z pBl. Mieszaniny ligacyjnej użyto do transformacji E. coli szczep 294 na oporność na ampicylinę. Jednym z uzyskanych transformantów byłpPGK-1500. Plazmid ten zawiera fragment promotora PGK jako fragment DNA EcoRI - do - EcoRI lub Hindlll - do - EcoRI. .
10/rg pPGK-1500 wyczerpująco trawiono za pomocą Ciał i EcoRI, a następnie mieszaninę reakcyjną poddano elektroforezie na 6% żelu akrylamidowym. Elektroelucją izolowano fragment wielkości 900 par zasad zawierający promotor PGK. 10/rg pIFN-g tro 48 wyczerpująco trwaiono za pomocą EcoRI i HincII i poddano elektroforezie na 6% żelu akrylamidowym. Pasmo 938 par zasad zawierające podlegający bezpośredniej ekspresji cDNA IFN-y izolowano z żelu drogą elektroelucji.
Wektor ekspresji drożdży skonstruowano w reakcji trzech składników, przez ligację fragmentu promotora PGK (na odcinku Cla - do - EcoRI), poddanego delecji pFRM-31 i wyżej izolowanego cDNA IFN-y. Mieszaninę ligacyjną inkubowano w 14°C w ciągu 12 godzin. Mieszaniny ligacyjnej użyto do transformacji E. coli szczep 294 na oporność na ampiicylinę. Transformanty analizowano na obecność odpowiednio skonstruowanego plazmidu ekspresji, pPGK-IFNγ (fig. 16). Plazmidów zawierających układ ekspresji użyto do transformowania sferoplastów drożdży szczepu RH218 na prototropię tryptofanową w agarze nie zawierającym tryptofanu. Rekombinowane drożdże badano następnie na obecność rekombinowanego ludzkiego interferonu.
Ekstrakty z drożdży sporządzono jak następuje: 10 mililitrowe kolonie hodowano w YNB +1 CAA do osiągnięcia Α66ο~1-2, wirowano i ponownie zawieszano w 500//1 buforu PBS (20 mM NaOH2PO4, pH = 7,4, 150 mM NaCl). Dodawano takiej samej objętości kulek szklanych (0,450,5 mm) i rozcierano mieszaninę w ciągu 2 minut. Ekstrakty wirowano w ciągu 30 sekund z szybkością 14 tys. obrotów na minutę i zbierano supernatant. Aktywność interferowaną w supernatancie oznaczono na 16 000 jednostek/ml, przez porównanie ze standardem IFN-cr w próbie inhinitowania CPE.
M. Konstrukcja wektora pSV γ 69 hodowli komórkowej. Fragment JindIII-PvuII wielkości 342 par zasad, obejmujący początek SV40, konwertowano we fragment ze związanym punktem restrykcji EcoRI. Punkt Hindlll konwertowano przez dodanie syntetycznego oligomeru (5'dAGCTGAATTC) a punkt PvuII konwertowano przez ligację tępego końca w wypełniony punkt EcoRI, przy użyciu plimerazy I (fragment Klenowa). Otrzymany fragment EcoRI insertowano do punktu EcoRI pMl-1 (28). Plazmid z promotorem SV40 zorientowanym od genu ampR dalej modyfikowano przez usunięcie punktu EcoRI najbliższego genu ampR pMl-1 (27).
Wyizolowano fragment Hpa-BgIII DNA klomowanego HBV wielkości 1023 par zasad (60) i punkt Hpal wirusa hepatitis (HBV) konwertowano w punkt EcoRI, za pomocą syntetycznego oligomeru (5'dGCGAATTCGC). Ten EcoRI-BglU związany fragment bezpośrednio klonowano do punktów EcoRI-BamHI wyżej opisanego plazmidu niosącego początek SV40.
Do pozostałego punktu EcoRI insertowano gen IFN-y na wielkości 1250 par zasad fragmencie Pst I p69, po konwersji końców Pstl w końce EcoRI. Izolowano klony w których promotor SV40 poprzedzał gen strukturalny IFN-y. Otrzymane plazmidy wprowadzano do komórek hodowli tkankowej (29), stosując technikę dekstranu DEAE (61) zmodyfikowaną w taki sposób, że transfekcję w obecności dekstranu DEAE prowadzono w ciągu 8 godzin. Pożywki komórkowe zmieniano co 2-3 dni. Codziennie pobierano po 200 ul do oznaczeń biologicznych interferonu. Typową wydajnością było 50-100 jednostek/m na próbkach badanych w 3 lub 4 dni po transfekcji.
Analiza wykazała, że produkt ekspresji nie zawiera N-końcowej części CYS-TYR-CYSrekombinowanego ludzkiego interferonu odpornościowego (por. fig. 5) potwierdzając obecność cięcia peptydu sygnałowego przy połączeniu CYS-GLN (aminokwasy 3 i 4 na fig. 5), tak jakby dojrzały polipetyd faktycznie składał się z 153 aminokwasów.
N. Częściowe oczyszczenie rekombinowanego des-CYS-TYR-CYS-ludzkiego interferonu odpornościowego. W celu wyprodukowania większych ilości ludzkiego IFN-y pochodzącego z
153 202 komórek małpy, świeże hodowle jednowarstwowe komórek COS-7 na dziesięciu 10 cm płytkach transfekowano sumarycznie 30//g pDLIF3 w 110 ml dekstranu DEAE (200p/ml desktarnu DEAE, ciężar cząsteczkowy 500 000,0,5 M Tris pH 7,5,2 DMEM). Po 16 godzinach w 37°C płytki dwukrotnie przemyto DMEM. Do każdej płytki dodano po 15 ml świeżego DMEM uzupełnionego 10% f. b. s., 2 mM glutaminy, 50^/ml penicyliny G i 50mg/ml streptomycyny. Pożywki następnego dnia zastępowano DMEM bez osocza. Następnie każdego dnia dodowano pożywkę nie zawierającą osocza. Zebrane pożywki utrzymywano w 4°C, do analizy lub związania z CPG. Połączone frakcje z próbek pobranych w 3 i 4 dniu po transfekcji zawierały zasadniczo całą aktywność.
0,5 g GPG (szkło o kontrolowanej porowatości, Electronucleonics, CPG 325,120/200 mesh) dodano do 100 ml supernantantu komórkowego i całość mieszano w ciągu 3 godzin w 4°C. Po krótkim wirowaniu osadzone kulki upakowano w kolumnie i starannie przemyto 20 mM NaPO41 M NaCl 0,1% /ł-merkaptoetanolem pH 7,2. Aktywność eluowano tym samym buforem zawierającym 30% glikolu etylenowego, a następnie tym samym buforem zawierającym 50% glikolu etylenowego. Zasadniczo aktywność związała się z CPG. 75% eluowanej aktywności znaleziono we frakcjach eluowanych 30% glikolem etylenowym. Frakcje te połączono i rozcieńczono 20 mM NaPOh IM NaCl pH 7,2 do końcowego stężenia 10% glikolu etylenowego i bezpośrednio naniesiono na kolumnę z 10 ml Sepharose Con A (Pharmacia). Po starannym przemyciu 20 ml NaPO< 1 M NaCl pH 7,2 eluowano aktywność -20 mM NaPO4 1 M NaCl 0,2 M σ-metylo-D-mannozydu. Znaczna ilość aktywności (55%) nie wiązała się z tą lektyną. 45% aktywności eluowano a-metyloD- mannozydem.
Bibliografia
1. Goedel i inni, Naturę 287,411 (1980)
2. Goedel i inni, Naturę 290,20 (1981)
3. Yelveton i inni, Nucleic Acids Research 9, 731 (1981)
4. Gutterman i inni, Annals of int. Med. 93, 399 (1980)
5. Goedel i inni, Nucleic Acids Research 8, 4057 (1980)
6. Yip i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 78, 1601 (1981)
7. Taniguchi i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 78, 3469 (1981)
8. Bloom, Naturę 289, 593 (1980)
9. Sonnenfeld i inni, Cellular Immunol. 40. 285 (1978)
10. Fleishmann i inni, Infection and Immunity 26, 248 (1979)
11. B^l^^^ck i inni, Cellular Immunology 49. 390 (1980)
12. Rudin i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77, 5928 (1980)
13. Crane i inni, J. Natl. Cancer Inst. 61, (1978)
14. Stinchcomb i inni, Naturę 282, 39 (1979)
15. Kingsman i inni Gene 7, 141 (1979)
16. Tschumper i inni, Gene 10, 157 (1980)
17. Mortimer i inni, Microbiological Reviews 44, 519 (198 )
18. Miozzari i inni, Journal of Bacteriology 134, 48 (1978)
19. Jones, Genetics 85, 23 (1977)
20. Hitzeman i inni, J. Biol. Chem. 255, 12073 (1980)
21. Hess i inni, J. Adv. Enzyme Pegul. 7, 149 (1968)
22. Holland i in. Biochemistry 17. 4900 (1978)
23. Bostian i inni. Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 77, 4504
24. The Molecular Biology of Yest (Aug 11-18, 1981), Cold Spring -Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York
25. Chambon, Ann. Rev.Biochemistry, 44, 613 (1975)
25a. Gluzman, Celi. 23, 175 (1981)
26. Goedel i inni, Naturę 281, 544 (1979)
27. Itakura i inni, Science 198, 1056 (1977)
28. Lusky i inni, Naturę 293, 79 (1981)
29. Gluzman i inni, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 44, 293 (1980)
30. Fiers i inni, Naturę 273, 113 (1978)
31. Reddy i inni, Sicenoe 200, 494 (1978)
153 202
32. Boedtker i inni, Próg, in Nucleic Acids Res. Mol. Biol. 19, 253 (1976)
33. Berger i inni, Biochemistry 18, 5143 (1979)
34. Aviv i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 1408 (1972)
35. Gurodn i inni, J. Molec. Biol. 80, 539 (1975)
36. Stewart, The Interferon System. Springer, New York, strony 13-26 (1979)
37. Lehrach i inni, Biochemistry 16, 4743 (1977)
38. Lynch i inni, Virology 98, 251 (1979)
39. Wickens i inni, J. Biol. Chem. 253, 2483 (1978)
40. Chang i inni, Naturę 275, 617 (1978)
41. Bolivar i inni, Gene 2, 95 (1977)
42. Grunstein i inni, Proc. Natl. Acad. Sci USA 72, 3961 (1975)
43. Fritsch i inni, Celi 19, 959 (1980)
44. Birnboim i inni, Nucleic Adids Res. 7, 1513 (1979)
45. Kafatos i inni, Nucleic Acids Res. 7, 1541 (1979)
46. Glewell i inni, Biochemistry 9, 4428 (1970)
47. Taylor i inni, Biochim. Biophys. Acta 442, 324 (1976)
48. Smith, Methods Enzymol. 65, 560 (1980)
49. Messing i inni, Nucleic Acids Res. 9, 309 (1981)
50. Winzler, Hormonal Proteins and Peptides (ed. Li) Academix Press, Nwe York, strona 1 (1973)
51. Nathan i inni, Naturę 292, 842 (1981)
52. Maxam i inni, Methods in Enzymol. 65, 490 (1980)
53. Gran i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 75, 5765 (1978)
54. Southern, J. Molec. Biol. 98, 503 (1975)
55. Blin i inni, Nucleic Acids Res. 3, 2303 (1976)
56. Lawn i inni, Science 212, 1169 (1981)
57. Lawn i inni, Nucleic Acids Res. 9, 1045 (1981)
58. Miller, Experiments in Molecular Genetics, strona 431-3, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York (1972)
59. Beggs, Naturę 275, 104 (1978)
60. Valenzuela i inni, Animal Virus Genetics (ed. Fields, Jaenish and Fox), strona 57, Academic Press, New York (1980)
61. McCuthan i inni, J. Natl. Gancer Inst. 41, 351 (1968)
Claims (5)
- Zastrzeżenia patentowe1. Sposób wytwarzania ludzkiego interferonu odpornościowego (gamma) zawierającego co najmniej aminokwasy 4 do 146 sekwencji przedstawionej na rysunku fig. 5, jego wariantów allelicznych, uzupełnionych, uszczuplonych lub podstawionych o właściwościach ludzkiego interferonu odpornościowego, na drodze technologii rekombinacji DNA, znamienny tym, że pozyskany z naturalnego źródła lub ewentualnie co najmniej w części zsyntezyzowany kodujący interferon odpornościowy DNA operatywnie umieszcza się w obrębie wektora ekspresji w elementach, w których będzie odbywać się ekspresja DNA, obejmująca promotor, którym to wektorem ekspresji transformuje się odpowiednie komórki gospodarza, które hoduje się następnie w warunkach takich, w których wektor ekspresji wytwarza DNA kodujący ludzki interferon odpornościowy, który z kolei wyodrębnia się z komórek gospodarza.
- 2. Sposób według zastrz. 1. znamienny tym, że wytwarza się rekombinowany ludzki interferon odpornościowy o 146 aminokwasach oznaczonych na rysunku fig. 5 numerami 1 do 146, lub jego warianty alleliczne, uzupełnione, uszczuplone lub podstawione.
- 3. Sposób według zastrz. 1 znamienny tym, że wytwarza się des-CYS-TYR-CYS rekombinowany ludzki interferon odpornościowy o 143 aminokwasach oznaczonych na rysunku fig. 5 numerami 4 do 146, lub jego warianty alleliczne, uzupełnione, uszczuplone lub podstawione.153 2025-25% 70%1.75% 6ΜSG-. 2.153 202 “P-cONAP-cDNA2*·. .* ·.·· ·>·M· ·’ · w • ··# <-HI23.Ss/NIΗ^«Η δ<δΐ£3urLHI I I I IO 200 400I I I I600 600I I I I11000 1200 ^y^.4.153 202 _j * o<.X I— U CD to o 3 > CD3§iWZ o 3 uj CD st5t5 od CD UJ CD to l·—Od h> <CO ZH2 33a. I— ea3£ J cd o >*S co kJC -« o ιPd <Pi-J « otC|»2 o*x odCD Pu O Pu CD <3CO CDSi—Hien I— >CD cd»— => tnSt sE ag =5 <XSt uj CD £tStJ cj o X I—PU CD <3J *£ o <3 UJ CD £tEl° st — CJ u l·u CJ to < o3^SS3 CD uj I— JCD E3 o33SO HCD s atJCD □ C-D ^t «t > CDOJM ^D|m?.« u H□ S->
- 4) I— — CDΜη < to3«-1
- 5&X h33S?53 >* »— dS
!b> ; t X u to z to . 1— < 1 h~ UJ X , Ł— Pu ; cd UJ i S-> X 1Ι- Pu Ο to 1— H CD t -4 < c > J <Ł o O UJ CD syJ CD- część IWJ .S3 l-H <£ j Q < c52 st co 04— efl I—-a □ LD it <u O u I— >><:*E > <cΗ H-1 « O<£12 s«tUJ stStJ CD sg3^'O H CD 00 ,g£ pu cd < 3 w cd >-l C Pd CJElo z 3 o3D CDZ H33 =>CDSt153 202 częsc153 2025' 3' ι-.......' :.............. . .... . .... . . : . 1 ..........::ί -1 odpornościowy leukocytowy sa fibroblostowy200400 _J_I_L_600 600 _J_I1000SG- . 6.'/G-. 7 część II2.0 kbpEcoRI Hind Π9.0 kbp4.0 kbp2.0 kbpI— 1-41 b p —IPyu I Sou 3A Hinc UATG I Sou3A1300bp | 265bp]46bp|_τ I_Hoe ΠΙI I ATGI1 265bp |46bpT- T insertĘęoRI-Xbą I punktyHinc IEcoRI Bgl UPGK genHind HI-40 -30 -20 -10 -15'----------GATCATAAGGAAGTAATTATCTACTTTTTACAAiCAAATTATAAAACA część IMET SER LEU SER SER LYS LEU LEU VAL ATG TCT TTA TCT TCA AAG TTG CTC GTC22. część IIEcoRIGen strukturalny PGK i flankujqcyONAXbolKlenow Pol. I ♦ ,, 4 dNTP kołat z żelu wektoru Bom HIIHoelB. HincI izolat, fragment wielkości 650 bpHq> U Pvu I Sou 3A HincH tr-anstoypcja PCK atg5-ATTTGTTGTAAA i'1 Klenow Pol. I ♦4 dNTPAAATGTTGTTTA 5' AAATCATCAAAA-3' a— 5-5' Sąu 3A egzonukleaza , , izolat, fragment ’ wielkości mtp aaatwttgtotaAAAACAACAAAA część I aa. część II «W·» pPGK-39Xbo I, Sou 3A izo lat, fragment υ wielkości 39 bpSouSA Xbo I pBlP*u iΡνυ I, Sou 3A iaolat, fragment υ wielkości 265bpSou 3A1 1 ligaza DNA i T4 Eco RIP»t ΑΡ” (EcoRI) θΦ1 HindBIEcoRI Hind HIBom HI pBI pPGK-300EcoRI, Pvul izolat, fragment wielkości 13 kbPvul, EcoRI izolat, fragment ' promotorEcoRIJBAP EcoRI 1_ Pvul _) Pvul L EcoRI 1 transkrypcja PGK _1 1 ligazaDNA T4 fS, częsc I HindSL Psft· (FcoRD (fcoRI) AP transkrypcjaPGKFcoRIIFN-r '{Eco RI) Hind H terminatorPGK ~S&.S6.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US31248981A | 1981-10-19 | 1981-10-19 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
PL238671A1 PL238671A1 (en) | 1983-07-18 |
PL153202B1 true PL153202B1 (en) | 1991-03-29 |
Family
ID=23211703
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PL1982238671A PL153202B1 (en) | 1981-10-19 | 1982-10-19 | Human immune interferon. |
Country Status (43)
Country | Link |
---|---|
US (4) | US4762791A (pl) |
EP (1) | EP0077670B1 (pl) |
JP (3) | JPS5890514A (pl) |
KR (1) | KR840001837A (pl) |
AT (1) | ATE44289T1 (pl) |
AU (1) | AU561343B2 (pl) |
BG (2) | BG42527A3 (pl) |
BR (1) | BR8206068A (pl) |
CA (1) | CA1341590C (pl) |
CH (1) | CH663619A5 (pl) |
CZ (1) | CZ282154B6 (pl) |
DD (1) | DD208822A5 (pl) |
DE (4) | DE77670T1 (pl) |
DK (1) | DK163187C (pl) |
DZ (1) | DZ467A1 (pl) |
ES (1) | ES8402351A1 (pl) |
FI (1) | FI86559C (pl) |
FR (1) | FR2514783B1 (pl) |
GB (1) | GB2107718B (pl) |
GR (1) | GR78391B (pl) |
GT (1) | GT198277746A (pl) |
HK (1) | HK66289A (pl) |
HU (1) | HU202287B (pl) |
IE (1) | IE54371B1 (pl) |
IL (1) | IL66992A (pl) |
IT (1) | IT1153265B (pl) |
LU (1) | LU88327I2 (pl) |
MX (2) | MX166499B (pl) |
MY (1) | MY102546A (pl) |
NL (1) | NL930040I2 (pl) |
NO (2) | NO164177C (pl) |
NZ (1) | NZ202190A (pl) |
OA (1) | OA07233A (pl) |
PH (1) | PH26963A (pl) |
PL (1) | PL153202B1 (pl) |
PT (1) | PT75696B (pl) |
RO (1) | RO89534A (pl) |
RU (3) | RU2056460C1 (pl) |
SG (1) | SG76988G (pl) |
SK (1) | SK279535B6 (pl) |
YU (1) | YU45871B (pl) |
ZA (1) | ZA827569B (pl) |
ZW (1) | ZW22282A1 (pl) |
Families Citing this family (188)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
NZ199722A (en) | 1981-02-25 | 1985-12-13 | Genentech Inc | Dna transfer vector for expression of exogenous polypeptide in yeast;transformed yeast strain |
ZW18282A1 (en) * | 1981-08-31 | 1983-03-23 | Genentech Inc | Preparation of polypeptides in vertebrate cell culture |
JPS58146281A (ja) * | 1981-10-19 | 1983-08-31 | Suntory Ltd | 酵母細胞の形質転換法 |
AU561343B2 (en) * | 1981-10-19 | 1987-05-07 | Genentech Inc. | Human immune interferon by recombinant dna |
JPS62223191A (ja) * | 1981-12-24 | 1987-10-01 | Asahi Chem Ind Co Ltd | 新規な生理活性ペプチドの製法 |
JPS58110548A (ja) * | 1981-12-24 | 1983-07-01 | Asahi Chem Ind Co Ltd | 新規な生理活性ペプチド |
GB8406910D0 (en) * | 1984-03-16 | 1984-04-18 | Biogen Nv | Gamma interferon |
EP0088540A3 (en) * | 1982-02-22 | 1984-10-17 | Biogen, Inc. | Dna sequences, recombinant dna molecules and processes for producing human immune interferon-like polypeptides |
US5004689A (en) * | 1982-02-22 | 1991-04-02 | Biogen, Massachusetts | DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing human gamma interferon-like polypeptides in high yields |
US6432677B1 (en) | 1982-03-08 | 2002-08-13 | Genentech, Inc. | Non-human animal interferons |
IE54592B1 (en) * | 1982-03-08 | 1989-12-06 | Genentech Inc | Anumal interferons, processes involved in their production, compositions containing them, dna sequences coding therefor and espression vehicles containing such sequences and cells transformed thereby |
US5827694A (en) * | 1982-03-08 | 1998-10-27 | Genentech, Inc. | DNA encoding non-human animal interferons, vectors and hosts therefor, and recombinant production of IFN polypeptides |
IL68100A0 (en) * | 1982-03-24 | 1983-06-15 | Takeda Chemical Industries Ltd | Novel dna and use thereof |
US6936694B1 (en) | 1982-05-06 | 2005-08-30 | Intermune, Inc. | Manufacture and expression of large structural genes |
JPH0787797B2 (ja) * | 1982-05-20 | 1995-09-27 | サントリー株式会社 | ヒト・ガンマ・インタ−フエロン様ポリペプチドの製造法 |
AU577259B2 (en) * | 1982-08-13 | 1988-09-22 | Zymogenetics Inc. | Glycolytic promters for regulated protein expression protease inhibitor |
AU571460B2 (en) * | 1982-09-27 | 1988-04-21 | Cancer Institute Of Japanese Foundation For Cancer Research | Alpha interferon dna, recombinant plasmid, engineered organism and alpha interferon polypeptide |
AU575301B2 (en) * | 1982-10-08 | 1988-07-28 | Juridical Foundation, Japanese Foundation For Cancer Research | Novel vector |
US4966843A (en) * | 1982-11-01 | 1990-10-30 | Cetus Corporation | Expression of interferon genes in Chinese hamster ovary cells |
US5831023A (en) * | 1982-11-01 | 1998-11-03 | Genentech, Inc. | Recombinant animal interferon polypeptides |
WO1984002129A1 (en) * | 1982-11-22 | 1984-06-07 | Takeda Chemical Industries Ltd | Human immune interferon protein and process for its preparation |
US4511503A (en) * | 1982-12-22 | 1985-04-16 | Genentech, Inc. | Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins |
GR79124B (pl) * | 1982-12-22 | 1984-10-02 | Genentech Inc | |
US4599197A (en) * | 1982-12-22 | 1986-07-08 | Genentech, Inc. | Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins |
US4511502A (en) * | 1982-12-22 | 1985-04-16 | Genentech, Inc. | Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins |
US4512922A (en) * | 1982-12-22 | 1985-04-23 | Genentech, Inc. | Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins |
US4620948A (en) * | 1982-12-22 | 1986-11-04 | Genentech, Inc. | Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins |
US4518526A (en) * | 1982-12-22 | 1985-05-21 | Genentech, Inc. | Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins |
JPH0740925B2 (ja) * | 1983-03-14 | 1995-05-10 | 協和醗酵工業株式会社 | 新規ヒトインタ−フエロン−γポリペプチド |
US7198919B1 (en) * | 1983-04-25 | 2007-04-03 | Genentech, Inc. | Use of alpha factor sequences in yeast expression systems |
ZA843275B (en) * | 1983-05-05 | 1984-12-24 | Hoffmann La Roche | Novel vectors for interferon expression |
DK265384A (da) * | 1983-06-01 | 1984-12-02 | Hoffmann La Roche | Polypeptider med interferonaktivitet |
JP2551746B2 (ja) * | 1983-07-19 | 1996-11-06 | サントリー株式会社 | 改良プラスミドベクタ−およびその利用 |
JPS6034919A (ja) * | 1983-08-04 | 1985-02-22 | Green Cross Corp:The | ガンマ・インタ−フェロン組成物 |
EP0133767B1 (en) * | 1983-08-04 | 1991-04-03 | The Green Cross Corporation | Gamma interferon composition |
IL72773A0 (en) * | 1983-08-29 | 1984-11-30 | Meloy Lab | Production of immune interferon and its mrna |
US4476049A (en) * | 1983-09-20 | 1984-10-09 | Hoffmann-La Roche Inc. | Method for the extraction of immune interferon |
US4681930A (en) * | 1983-09-20 | 1987-07-21 | Hoffmann-La Roche Inc. | Immune interferon and a method for its extraction and purification |
US4604284A (en) * | 1983-09-20 | 1986-08-05 | Hoffmann-La Roche Inc. | Homogeneous immune interferon fragment |
ZA846554B (en) * | 1983-09-20 | 1985-04-24 | Hoffmann La Roche | Immune interferon and method for its purification |
JPS6079000A (ja) * | 1983-10-04 | 1985-05-04 | Takeda Chem Ind Ltd | ヒトγ型インタ−フエロン単量体の製造法 |
JPH0788398B2 (ja) * | 1983-10-17 | 1995-09-27 | サントリー株式会社 | 新規生理活性ポリペプチドおよびその製造法 |
GB8328820D0 (en) * | 1983-10-28 | 1983-11-30 | Searle & Co | Synthetic human gamma interferon gene |
FR2556365B1 (fr) * | 1983-12-09 | 1987-07-31 | Transgene Sa | Vecteurs de clonage et d'expression de l'interferon-g, bacteries transformees et procede de preparation de l'interferon-g |
KR850004274A (ko) * | 1983-12-13 | 1985-07-11 | 원본미기재 | 에리트로포이에틴의 제조방법 |
NZ210501A (en) * | 1983-12-13 | 1991-08-27 | Kirin Amgen Inc | Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence |
US4703008A (en) * | 1983-12-13 | 1987-10-27 | Kiren-Amgen, Inc. | DNA sequences encoding erythropoietin |
US4855238A (en) * | 1983-12-16 | 1989-08-08 | Genentech, Inc. | Recombinant gamma interferons having enhanced stability and methods therefor |
MX9203641A (es) * | 1983-12-16 | 1992-07-01 | Genentech Inc | Interferones gamma recombinantes que poseen estabilidad mejorada y metodos biotecnologicos para su obtencion. |
JPS60145098A (ja) * | 1984-01-09 | 1985-07-31 | Suntory Ltd | 糖付加ポリペプチドの製造法 |
WO1985004420A1 (en) * | 1984-03-29 | 1985-10-10 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Novel dna and its use |
DE3414831A1 (de) * | 1984-04-19 | 1985-10-31 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Herstellung von polypeptiden mit human-gammainterferon-aktivitaet |
GB8414354D0 (en) * | 1984-06-05 | 1984-07-11 | Biogen Nv | Purifying protein |
WO1985005618A1 (en) * | 1984-06-06 | 1985-12-19 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Process for preparing interferon derivative |
IL75302A0 (en) * | 1984-06-06 | 1985-09-29 | Takeda Chemical Industries Ltd | Novel polypeptide and production thereof |
CA1302320C (en) * | 1984-06-11 | 1992-06-02 | Hideo Niwa | Expression of human cromosomal interferon-_ in animal cells |
JPS60262594A (ja) * | 1984-06-11 | 1985-12-25 | Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd | ヒトインタ−フエロン−γ |
GB8414911D0 (en) * | 1984-06-12 | 1984-07-18 | Searle & Co | Producing human gamma interferon |
JPS6124599A (ja) * | 1984-07-11 | 1986-02-03 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | 新規ヒトインタ−フエロン−rポリペプチド誘導体 |
GB2164650A (en) * | 1984-09-25 | 1986-03-26 | Fujisawa Pharmaceutical Co | Process for production of y-interferon |
US4946674A (en) * | 1984-10-05 | 1990-08-07 | Bioferon Biochemische Substanzen Gmbh & Co. | Process for treatment of rheumatic diseases |
JPS6188875A (ja) * | 1984-10-05 | 1986-05-07 | Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd | ヒトインタ−フエロン−γ |
DE3436638C2 (de) * | 1984-10-05 | 1992-10-08 | Bioferon biochemische Substanzen GmbH & Co, 7958 Laupheim | Verwendung von Interferon-gamma (IFN-gamma) enthaltenden Präparationen zur Behandlung rheumatischer Erkrankungen |
ATE66375T1 (de) * | 1984-10-05 | 1991-09-15 | Bioferon Biochem Substanz | Verwendung von interferon-gamma (ifn-gamma) enthaltenden praeparationen zur systemischen behandlung von verschiedenen erkrankungen des menschen in niedriger dosierung. |
IL76591A0 (en) * | 1984-10-05 | 1986-02-28 | Bioferon Biochem Substanz | Pharmaceutical compositions containing ifn-ypsilon and processes for the preparation thereof |
JPS61108397A (ja) * | 1984-10-31 | 1986-05-27 | Green Cross Corp:The | インタ−フエロン−γ蛋白質の製造法 |
AU598455B2 (en) * | 1984-12-27 | 1990-06-28 | Suntory Limited | Method for purifying an interferon |
JPS6156195A (ja) * | 1985-03-01 | 1986-03-20 | Asahi Chem Ind Co Ltd | 新規生理活性ペプチド |
GB8508340D0 (en) * | 1985-03-29 | 1985-05-09 | Creighton T E | Production of protein |
EP0225887B1 (en) * | 1985-04-08 | 1994-06-08 | Amgen Inc. | A method and a hybrid promoter for controlling exogenous gene transcription |
US4873312A (en) * | 1985-04-25 | 1989-10-10 | Amgen | Method for purifying interferon and composition of matter produced thereby |
FR2583429B1 (fr) * | 1985-06-18 | 1989-11-03 | Transgene Sa | Vecteur d'expression de l'interferon u dans les cellules de mammifere, procede pour sa mise en oeuvre et produit obtenu et composition pharmaceutique contenant l'interferon u |
US4845196A (en) * | 1985-06-24 | 1989-07-04 | G. D. Searle & Co. | Modified interferon gammas |
US5104795A (en) * | 1985-11-13 | 1992-04-14 | Zoma Corporation | Shortened phosphoglycerate kinase promoter |
JPS63501767A (ja) * | 1985-11-13 | 1988-07-21 | ゾマ、コーポレーション | 短縮化されたホスホグリセリン酸キナ−ゼプロモ−タ− |
EP0237019A3 (en) * | 1986-03-14 | 1988-03-09 | Toray Industries, Inc. | Interferon conjugate and production thereof using recombinant gene |
US5198343A (en) * | 1986-08-05 | 1993-03-30 | Transgene, S.A. | Method for expressing a heterologous protein in a dapD- mutant of E. coli and the strain obtained |
US6238889B1 (en) * | 1986-12-16 | 2001-05-29 | Dsm N.V. | Molecular cloning and expression of the Pro8 isoform of human IL-3 |
US4939088A (en) * | 1987-02-18 | 1990-07-03 | Meloy Laboratories Inc. | Sustained production of recombinant gamma interferon using an Epstein-Barr virus replicon |
US4944941A (en) * | 1987-08-07 | 1990-07-31 | Genentech, Inc. | Methods and compositions for the treatment of lung conditions |
US6384194B1 (en) * | 1987-12-16 | 2002-05-07 | Dsm N.V. | Expression and purification of human interleukin-3 and muteins thereof |
US5258287A (en) * | 1988-03-22 | 1993-11-02 | Genentech, Inc. | DNA encoding and methods of production of insulin-like growth factor binding protein BP53 |
IL90021A0 (en) * | 1988-04-25 | 1989-12-15 | Phillips Petroleum Co | Process for the production of interferon |
US5198212A (en) * | 1988-10-31 | 1993-03-30 | University Of Lousville Research Foundation Incorporated | Method and compositions for treatment of trauma-associated sepsis with gamma interferon |
US20020168750A1 (en) * | 1988-12-23 | 2002-11-14 | James Rasmussen | Enzymatically active recombinant glucocerebrosidase |
US5236838A (en) * | 1988-12-23 | 1993-08-17 | Genzyme Corporation | Enzymatically active recombinant glucocerebrosidase |
US6451600B1 (en) * | 1989-12-22 | 2002-09-17 | Genzyme Corporation | Enzymatically active recombinant glucocerebrosidase |
US5196191A (en) * | 1989-03-17 | 1993-03-23 | Genentech, Inc. | Temporal gamma-interferon administration for allergies |
US5112605A (en) * | 1989-03-17 | 1992-05-12 | Genentech, Inc. | Temporal gamma-interferon administration for allergies |
AU5355790A (en) * | 1989-04-19 | 1990-11-16 | Cetus Corporation | Multifunctional m-csf proteins and genes encoding therefor |
DE4009268A1 (de) * | 1990-03-22 | 1991-09-26 | Consortium Elektrochem Ind | Sekretion von hirudinderivaten |
US5281520A (en) * | 1990-09-12 | 1994-01-25 | Zymogenetics, Inc. | Method for producing acyloxyacyl hydrolase |
JPH05506247A (ja) * | 1990-09-27 | 1993-09-16 | シェリング・コーポレーション | ヒトγインターフェロンのアンタゴニスト |
EP0487298A3 (en) * | 1990-11-21 | 1992-12-16 | Schering Corporation | Human gamma interferon antagonist/agonist screen |
AU1268192A (en) * | 1991-01-04 | 1992-08-17 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Cloning and expression of tissue transglutaminases |
AU1337092A (en) * | 1991-01-29 | 1992-08-27 | Brigham And Women's Hospital | A cdna encoding the type i iodothyronine 5' deiodinase |
US5272078A (en) * | 1991-01-29 | 1993-12-21 | Brigham And Women's Hospital | CDNA encoding the type I iodothyronine 5'deiodinase |
US6180602B1 (en) | 1992-08-04 | 2001-01-30 | Sagami Chemical Research Center | Human novel cDNA, TGF-beta superfamily protein encoded thereby and the use of immunosuppressive agent |
WO1994003599A1 (en) * | 1992-08-04 | 1994-02-17 | Sagami Chemical Research Center | HUMAN cDNA AND PROTEIN WHICH SAID cDNA CODES FOR |
WO1994010296A1 (en) * | 1992-11-03 | 1994-05-11 | Oklahoma Medical Research Foundation | Transglutaminase gene |
US6558661B1 (en) * | 1992-12-29 | 2003-05-06 | Genentech, Inc. | Treatment of inflammatory bowel disease with IFN-γ inhibitors |
AU690583B2 (en) | 1993-09-15 | 1998-04-30 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Recombinant alphavirus vectors |
JP4383530B2 (ja) | 1996-04-05 | 2009-12-16 | ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス, インコーポレーテッド | 細胞巨大分子合成の阻害が減少したアルファウイルスベクター |
WO1998012332A1 (en) | 1996-09-17 | 1998-03-26 | Chiron Corporation | Compositions and methods for treating intracellular diseases |
US20020168634A1 (en) * | 1999-05-05 | 2002-11-14 | Christine Marie Debouck | Methods for identifiying genes essential to the growth of an organism |
US6753165B1 (en) * | 1999-01-14 | 2004-06-22 | Bolder Biotechnology, Inc. | Methods for making proteins containing free cysteine residues |
DE69838552T2 (de) | 1997-07-14 | 2008-05-21 | Bolder Biotechnology, Inc., Louisville | Derivate des wachstumshormons und verwandte proteine |
US20080076706A1 (en) | 1997-07-14 | 2008-03-27 | Bolder Biotechnology, Inc. | Derivatives of Growth Hormone and Related Proteins, and Methods of Use Thereof |
US7153943B2 (en) * | 1997-07-14 | 2006-12-26 | Bolder Biotechnology, Inc. | Derivatives of growth hormone and related proteins, and methods of use thereof |
ATE410181T1 (de) | 1998-04-02 | 2008-10-15 | Genentech Inc | Verwendung von intereferon gamma zur behandlung von herzhypertrophie |
US6602705B1 (en) | 1998-12-31 | 2003-08-05 | Chiron Corporation | Expression of HIV polypeptides and production of virus-like particles |
US7935805B1 (en) | 1998-12-31 | 2011-05-03 | Novartis Vaccines & Diagnostics, Inc | Polynucleotides encoding antigenic HIV Type C polypeptides, polypeptides and uses thereof |
US8288126B2 (en) | 1999-01-14 | 2012-10-16 | Bolder Biotechnology, Inc. | Methods for making proteins containing free cysteine residues |
CN1309423C (zh) | 1999-11-12 | 2007-04-11 | 马克西根控股公司 | 干扰素γ偶联物 |
HUP0203409A3 (en) | 1999-11-12 | 2005-06-28 | Maxygen Holdings Ltd Redwood C | Interferon gamma conjugates |
EP2213743A1 (en) | 2000-04-12 | 2010-08-04 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
IL152804A0 (en) * | 2000-05-16 | 2003-06-24 | Bolder Biotechnology Inc | Methods for refolding proteins containing free cysteine residues |
KR20040007413A (ko) * | 2000-11-03 | 2004-01-24 | 바이오메디신즈 인코포레이티드 | 단기 및 장기 약물 약량측정 방법 |
EP1351707B9 (en) * | 2001-01-09 | 2012-01-25 | Baylor Research Institute | Methods for treating autoimmune diseases in a subject and in vitro diagnostic assays |
US6958388B2 (en) | 2001-04-06 | 2005-10-25 | Maxygen, Aps | Interferon gamma polypeptide variants |
US7038015B2 (en) | 2001-04-06 | 2006-05-02 | Maxygen Holdings, Ltd. | Interferon gamma polypeptide variants |
EP2292772A1 (en) | 2001-07-05 | 2011-03-09 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | HIV vaccination with a DNA encoding a HIV polypeptide and a HIV polypeptide |
CA2634992C (en) | 2001-07-05 | 2012-10-16 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Polynucleotides encoding antigenic hiv type c polypeptides, polypeptides and uses thereof |
KR100991644B1 (ko) * | 2001-08-17 | 2010-11-02 | 콜리 파마슈티칼 게엠베하 | 활성이 개량된 조합 모티프 면역자극성 올리고뉴클레오티드 |
US20050002900A1 (en) * | 2001-11-06 | 2005-01-06 | Grace Wong | Method of treating estrogen responsive breast cancer |
WO2003039455A2 (en) * | 2001-11-06 | 2003-05-15 | Applied Research Systems Ars Holding N.V. | Methods of treating endometreosis |
CN100438870C (zh) * | 2001-11-09 | 2008-12-03 | 精达制药公司 | ω干扰素在制备治疗温血动物对象中病毒性疾病的药物中的用途 |
JP2005517648A (ja) * | 2001-12-07 | 2005-06-16 | インターミューン インコーポレイテッド | 肝炎ウイルス感染症を治療するための組成物および方法 |
EP2261250B1 (en) | 2001-12-21 | 2015-07-01 | Human Genome Sciences, Inc. | GCSF-Albumin fusion proteins |
US6790641B2 (en) | 2002-05-01 | 2004-09-14 | Cell Genesys, Inc. | Lentiviral vector particles resistant to complement inactivation |
CA2491178A1 (en) | 2002-07-03 | 2004-01-15 | Maxygen Holdings Ltd. | Full-length interferon gamma polypeptide variants |
US7229614B2 (en) * | 2002-07-03 | 2007-06-12 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Interferon gamma in the detection and treatment of angiomyolipomas |
US7335743B2 (en) * | 2002-10-16 | 2008-02-26 | Amgen Inc. | Human anti-IFN-γ neutralizing antibodies as selective IFN-γ pathway inhibitors |
US7731947B2 (en) | 2003-11-17 | 2010-06-08 | Intarcia Therapeutics, Inc. | Composition and dosage form comprising an interferon particle formulation and suspending vehicle |
TWI353991B (en) | 2003-05-06 | 2011-12-11 | Syntonix Pharmaceuticals Inc | Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids |
CA2545603A1 (en) | 2003-11-12 | 2005-05-26 | Biogen Idec Ma Inc. | Neonatal fc receptor (fcrn)-binding polypeptide variants, dimeric fc binding proteins and methods related thereto |
BRPI0507159A (pt) | 2004-02-02 | 2007-06-26 | Ambrx Inc | polipeptìdeos em feixe de quatro hélices humanos modificados e seus usos |
EP1814583A2 (en) | 2004-11-01 | 2007-08-08 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Combination approaches for generating immune responses |
EP2364995A1 (en) | 2004-12-23 | 2011-09-14 | Molmed SpA | Conjugation product |
KR20070100346A (ko) | 2005-01-05 | 2007-10-10 | 바이오겐 아이덱 엠에이 인코포레이티드 | 크립토 결합 분자 |
KR101380570B1 (ko) * | 2005-01-27 | 2014-04-01 | 노비뮨 에스 에이 | 인간 항-인터페론 감마 항체 및 이것의 사용 방법 |
US11246913B2 (en) | 2005-02-03 | 2022-02-15 | Intarcia Therapeutics, Inc. | Suspension formulation comprising an insulinotropic peptide |
WO2006083761A2 (en) | 2005-02-03 | 2006-08-10 | Alza Corporation | Solvent/polymer solutions as suspension vehicles |
US20100196336A1 (en) | 2006-05-23 | 2010-08-05 | Dongsu Park | Modified dendritic cells having enhanced survival and immunogenicity and related compositions and methods |
CA2651855C (en) | 2006-05-30 | 2011-08-02 | Intarcia Therapeutics, Inc. | Two-piece, internal-channel osmotic delivery system flow modulator |
US7682356B2 (en) | 2006-08-09 | 2010-03-23 | Intarcia Therapeutics, Inc. | Osmotic delivery systems and piston assemblies for use therein |
EP2102355B1 (en) | 2006-12-14 | 2016-03-02 | Bolder Biotechnology, Inc. | Long acting proteins and peptides and methods of making and using the same |
CN105688191A (zh) | 2007-04-23 | 2016-06-22 | 精达制药公司 | 促胰岛素释放肽的混悬制剂及其应用 |
CN101675071B (zh) * | 2007-05-02 | 2014-06-18 | Ambrx公司 | 经修饰干扰素β多肽和其用途 |
AU2008331866A1 (en) * | 2007-11-28 | 2009-06-11 | Smart Tube, Inc. | Devices, systems and methods for the collection, stimulation, stabilization, and analysis of a biological sample |
NZ602170A (en) | 2008-02-08 | 2014-03-28 | Ambrx Inc | Modified leptin polypeptides and their uses |
EP2240155B1 (en) | 2008-02-13 | 2012-06-06 | Intarcia Therapeutics, Inc | Devices, formulations, and methods for delivery of multiple beneficial agents |
EP2248903A1 (en) | 2009-04-29 | 2010-11-10 | Universitat Autònoma De Barcelona | Methods and reagents for efficient and targeted gene transfer to monocytes and macrophages |
US8298561B2 (en) | 2009-09-28 | 2012-10-30 | Intarcia Therapeutics, Inc. | Rapid establishment and/or termination of substantial steady-state drug delivery |
MX2013000301A (es) | 2010-07-09 | 2013-05-09 | Biogen Idec Hemophilia Inc | Factores quimericos de coagulacion. |
US20120208755A1 (en) | 2011-02-16 | 2012-08-16 | Intarcia Therapeutics, Inc. | Compositions, Devices and Methods of Use Thereof for the Treatment of Cancers |
RU2446172C1 (ru) * | 2011-03-24 | 2012-03-27 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Фармапарк" | Способ получения зрелого интерферона альфа-2 человека с использованием дрожжей saccharomyces cerevisiae и штамм-продуцент интерферона альфа-2 человека (варианты) |
EA023379B1 (ru) * | 2011-06-21 | 2016-05-31 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Фарма Ген" | ШТАММ ESCHERICHIA COLI BL21(DE3)-pIE-GAMMA И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА НАТИВНОГО РЕКОМБИНАНТНОГО ИНТЕРФЕРОНА ГАММА ЧЕЛОВЕКА |
US9738707B2 (en) | 2011-07-15 | 2017-08-22 | Biogen Ma Inc. | Heterodimeric Fc regions, binding molecules comprising same, and methods relating thereto |
WO2013024156A2 (en) | 2011-08-17 | 2013-02-21 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Combinations of anti-hcv-entry factor antibodies and interferons for the treatment and the prevention of hcv infection |
WO2013024158A1 (en) | 2011-08-17 | 2013-02-21 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Combinations of protein kinase inhibitors and interferons or of protein kinase inhibitors and direct acting antivirals for the treatment and the prevention of hcv infection |
WO2013106577A2 (en) | 2012-01-10 | 2013-07-18 | Biogen Idec Ma Inc. | Enhancement of transport of therapeutic molecules across the blood brain barrier |
US20140350087A9 (en) | 2012-03-22 | 2014-11-27 | Halozyme, Inc. | Oncovector Nucleic Acid Molecules and Methods of Use |
US9732144B2 (en) | 2012-07-05 | 2017-08-15 | Ohio State Innovation Foundation | Infectious bursal disease (IBDV) vaccine compositions |
WO2014033266A1 (en) | 2012-08-31 | 2014-03-06 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Anti-sr-bi antibodies for the inhibition of hepatitis c virus infection |
AU2014228938B2 (en) | 2013-03-15 | 2019-05-02 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Factor IX polypeptide formulations |
EP2940128A1 (en) | 2014-04-30 | 2015-11-04 | Institut d'Investigació Biomèdica de Bellvitge (IDIBELL) | Adenovirus comprising an albumin-binding moiety |
US9889085B1 (en) | 2014-09-30 | 2018-02-13 | Intarcia Therapeutics, Inc. | Therapeutic methods for the treatment of diabetes and related conditions for patients with high baseline HbA1c |
DK3253875T3 (da) | 2015-02-04 | 2020-04-14 | H Hoffmann La Roche Ag | Tau-antisense-oligomerer og anvendelser deraf |
EP3954993A1 (en) | 2015-02-04 | 2022-02-16 | Bristol-Myers Squibb Company | Methods of selecting therapeutic molecules |
US11091543B2 (en) | 2015-05-07 | 2021-08-17 | Swedish Orphan Biovitrum Ag | Methods, compositions and dosing regimens for treating or preventing interferon-gamma related indications |
IL302519A (en) | 2015-05-07 | 2023-07-01 | Novimmune Sa | Methods and preparations for diagnosis and treatment of disorders in patients with high levels of chemokine C.-X.-C. Ligand 9 and other biomarkers |
CA2987766A1 (en) | 2015-06-03 | 2016-12-08 | Intarcia Therapeutics, Inc. | Implant placement and removal systems |
CN108348593B (zh) | 2015-08-31 | 2022-08-16 | 泰克诺瓦克斯股份有限公司 | 基于人呼吸道合胞病毒(hrsv)病毒样颗粒(vlps)的疫苗 |
JP7250520B2 (ja) | 2016-04-13 | 2023-04-03 | ヤンセン ファーマシューティカルズ,インコーポレーテッド | 組換えアルテリウイルスレプリコン系およびその使用 |
MX2018014016A (es) | 2016-05-16 | 2019-08-01 | Intarcia Therapeutics Inc | Polipéptidos selectivos del receptor de glucagón y métodos para utilizarlos. |
USD860451S1 (en) | 2016-06-02 | 2019-09-17 | Intarcia Therapeutics, Inc. | Implant removal tool |
USD840030S1 (en) | 2016-06-02 | 2019-02-05 | Intarcia Therapeutics, Inc. | Implant placement guide |
CA3040264A1 (en) | 2016-10-17 | 2018-04-26 | Synthetic Genomics, Inc. | Recombinant virus replicon systems and uses thereof |
WO2018106615A2 (en) | 2016-12-05 | 2018-06-14 | Synthetic Genomics, Inc. | Compositions and methods for enhancing gene expression |
WO2018129058A1 (en) | 2017-01-03 | 2018-07-12 | Intarcia Therapeutics, Inc. | Methods comprising continuous administration of a glp-1 receptor agonist and co-adminstration of a drug |
US11672877B2 (en) | 2017-08-23 | 2023-06-13 | Wayne State University | In vivo immunoimaging of interferon-gamma |
EA202091516A1 (ru) | 2017-12-19 | 2020-11-03 | Янссен Сайенсиз Айрлэнд Анлимитед Компани | Способы и композиции для индукции иммунного ответа против вируса гепатита b (hbv) |
US11389531B2 (en) | 2017-12-19 | 2022-07-19 | Janssen Sciences Ireland Unlimited Company | Methods and apparatus for the delivery of hepatitis B virus (HBV) vaccines |
EA202091513A1 (ru) | 2017-12-19 | 2020-09-09 | Янссен Сайенсиз Айрлэнд Анлимитед Компани | Вакцины против вируса гепатита b (hbv) и их применение |
AU2019210189A1 (en) | 2018-01-19 | 2020-08-06 | Janssen Pharmaceuticals, Inc. | Induce and enhance immune responses using recombinant replicon systems |
AU2021237818A1 (en) | 2020-03-19 | 2022-09-29 | Trizell Ltd. | Temperature-responsive virus storage system |
JP2023519709A (ja) | 2020-03-30 | 2023-05-12 | トライゼル リミテッド | がんを治療するための組成物及び方法 |
Family Cites Families (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4332892A (en) * | 1979-01-15 | 1982-06-01 | President And Fellows Of Harvard College | Protein synthesis |
JPS5598118A (en) * | 1979-01-18 | 1980-07-25 | Hayashibara Takeshi | Preparation of type-2 interferon and drug containing the same |
AU538665B2 (en) * | 1979-10-30 | 1984-08-23 | Juridical Foundation, Japanese Foundation For Cancer Research | Human interferon dna |
IL58765A (en) * | 1979-11-21 | 1986-09-30 | Yeda Res & Dev | Process for the production of essentially pure messenger rna of human fibroblast interferon and process for the production of interferon beta |
GB2068970B (en) * | 1980-02-06 | 1983-06-22 | Searle & Co | Recombinant dna technique for the preparation of a protein resembling human interferon |
DE3005897A1 (de) * | 1980-02-16 | 1981-09-03 | Hoechst Ag, 6000 Frankfurt | Genprodukt eines hoeheren organismus aus einem dieses gen enhtaltenden mikroorganismus |
US4338397A (en) * | 1980-04-11 | 1982-07-06 | President And Fellows Of Harvard College | Mature protein synthesis |
US4460685A (en) * | 1980-05-29 | 1984-07-17 | New York University | Method of enhancing the production of human γ Interferon |
FI64813C (fi) * | 1980-12-31 | 1984-01-10 | Ilkka Antero Palva | Foerfarande foer producering av ett utvalt aeggviteaemne och vid foerfarandet anvaenda rekombinantplasmidvektorer |
IL65475A0 (en) * | 1981-04-17 | 1982-07-30 | Meloy Lab | Production of immune interferon and its mrna |
US4376821A (en) * | 1981-04-17 | 1983-03-15 | Meloy Laboratories, Inc. | Production of human IFN-gamma (immune) interferon |
AU561343B2 (en) * | 1981-10-19 | 1987-05-07 | Genentech Inc. | Human immune interferon by recombinant dna |
-
1982
- 1982-10-14 AU AU89352/82A patent/AU561343B2/en not_active Expired
- 1982-10-15 ZA ZA827569A patent/ZA827569B/xx unknown
- 1982-10-15 IL IL66992A patent/IL66992A/xx not_active IP Right Cessation
- 1982-10-15 FI FI823528A patent/FI86559C/fi not_active IP Right Cessation
- 1982-10-15 ZW ZW222/82A patent/ZW22282A1/xx unknown
- 1982-10-15 NZ NZ202190A patent/NZ202190A/en unknown
- 1982-10-15 PH PH27993A patent/PH26963A/en unknown
- 1982-10-16 KR KR1019820004666A patent/KR840001837A/ko unknown
- 1982-10-17 DZ DZ826687A patent/DZ467A1/fr active
- 1982-10-18 DE DE198282305521T patent/DE77670T1/de active Pending
- 1982-10-18 GB GB08229661A patent/GB2107718B/en not_active Expired
- 1982-10-18 RO RO82108819A patent/RO89534A/ro unknown
- 1982-10-18 BG BG058326A patent/BG42527A3/xx unknown
- 1982-10-18 MX MX194810A patent/MX166499B/es unknown
- 1982-10-18 DD DD82244081A patent/DD208822A5/de unknown
- 1982-10-18 AT AT82305521T patent/ATE44289T1/de active
- 1982-10-18 YU YU233582A patent/YU45871B/sh unknown
- 1982-10-18 BR BR8206068A patent/BR8206068A/pt unknown
- 1982-10-18 ES ES516620A patent/ES8402351A1/es not_active Expired
- 1982-10-18 GR GR69556A patent/GR78391B/el unknown
- 1982-10-18 IT IT23795/82A patent/IT1153265B/it active
- 1982-10-18 DK DK460882A patent/DK163187C/da active
- 1982-10-18 CA CA004136713A patent/CA1341590C/en not_active Expired - Fee Related
- 1982-10-18 IE IE2517/82A patent/IE54371B1/en not_active IP Right Cessation
- 1982-10-18 JP JP57182681A patent/JPS5890514A/ja active Granted
- 1982-10-18 NO NO823467A patent/NO164177C/no not_active IP Right Cessation
- 1982-10-18 SK SK7389-82A patent/SK279535B6/sk unknown
- 1982-10-18 DE DE8282305521T patent/DE3279788D1/de not_active Expired
- 1982-10-18 CZ CS827389A patent/CZ282154B6/cs unknown
- 1982-10-18 DE DE1993175065 patent/DE19375065I2/de active Active
- 1982-10-18 CH CH6057/82A patent/CH663619A5/de not_active IP Right Cessation
- 1982-10-18 FR FR8217405A patent/FR2514783B1/fr not_active Expired
- 1982-10-18 DE DE19823238554 patent/DE3238554A1/de active Granted
- 1982-10-18 BG BG076612A patent/BG44877A3/xx unknown
- 1982-10-18 PT PT75696A patent/PT75696B/pt unknown
- 1982-10-18 EP EP82305521A patent/EP0077670B1/en not_active Expired
- 1982-10-19 HU HU823305A patent/HU202287B/hu unknown
- 1982-10-19 GT GT198277746A patent/GT198277746A/es unknown
- 1982-10-19 PL PL1982238671A patent/PL153202B1/pl unknown
- 1982-10-19 RU SU823507549A patent/RU2056460C1/ru active
- 1982-10-19 OA OA57825A patent/OA07233A/xx unknown
-
1985
- 1985-06-20 US US06/746,813 patent/US4762791A/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-09-11 US US06/774,838 patent/US4727138A/en not_active Expired - Lifetime
-
1986
- 1986-11-11 JP JP61268482A patent/JP2515308B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1987
- 1987-08-04 US US07/081,420 patent/US4925793A/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-09-04 US US07/094,477 patent/US4929554A/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-09-19 MY MYPI87001768A patent/MY102546A/en unknown
-
1988
- 1988-04-08 RU SU884355518A patent/RU2092561C1/ru active
- 1988-04-28 RU SU4355606A patent/RU2107728C1/ru active
- 1988-11-17 SG SG769/88A patent/SG76988G/en unknown
-
1989
- 1989-08-17 HK HK662/89A patent/HK66289A/xx not_active IP Right Cessation
-
1990
- 1990-10-17 JP JP2278835A patent/JPH07106144B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1992
- 1992-10-21 MX MX9206041A patent/MX9206041A/es not_active Application Discontinuation
-
1993
- 1993-05-27 NL NL930040C patent/NL930040I2/nl unknown
- 1993-06-24 LU LU88327C patent/LU88327I2/fr unknown
-
1994
- 1994-12-20 NO NO1994025C patent/NO1994025I1/no unknown
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
PL153202B1 (en) | Human immune interferon. | |
US5096705A (en) | Human immune interferon | |
EP0043980B1 (en) | Mature human leukocyte interferon a, process for its microbial preparation, intermediates therefor and compositions containing it. | |
CA1341583C (en) | Interferons and process for their preparation | |
US5582824A (en) | Recombinant DES-CYS-TYR-CYS human immune interferon | |
CA1339936C (en) | Animal interferons | |
US4801685A (en) | Microbial production of mature human leukocyte interferon K and L | |
US4810645A (en) | Microbial production of mature human leukocyte interferon K and L | |
BG61060B2 (bg) | Човешки имунен интерферон | |
Goeddel | Microbial production of mature human leukocyte interferons | |
BG60890B2 (bg) | Човешки имунен интерферон | |
BG60888B2 (bg) | Човешки имунен интерферон | |
BG60889B2 (bg) | Човешки имунен интерферон | |
PH26492A (en) | Recombinant human immune interferon | |
NZ214261A (en) | Human immune interferon: production by recombinant dna technology | |
HRP950157A2 (en) | Polypeptide with human interferon (ifn-gamma) characteristics | |
IL63197A (en) | Intraferons for mature human oocytes, their preparation and preparations containing them | |
BG60939B2 (bg) | Човешки имунен интерферон |