FI86559B - Foerfarande foer framstaellning av humant immuninterferon, daervid anvaendbara medel och dessas framstaellning. - Google Patents

Foerfarande foer framstaellning av humant immuninterferon, daervid anvaendbara medel och dessas framstaellning. Download PDF

Info

Publication number
FI86559B
FI86559B FI823528A FI823528A FI86559B FI 86559 B FI86559 B FI 86559B FI 823528 A FI823528 A FI 823528A FI 823528 A FI823528 A FI 823528A FI 86559 B FI86559 B FI 86559B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
lys
ser
asn
asp
phe
Prior art date
Application number
FI823528A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI823528L (fi
FI823528A0 (fi
FI86559C (fi
Inventor
David V Goeddel
Patrick W Gray
Original Assignee
Genentech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=23211703&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=FI86559(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Genentech Inc filed Critical Genentech Inc
Publication of FI823528A0 publication Critical patent/FI823528A0/fi
Publication of FI823528L publication Critical patent/FI823528L/fi
Publication of FI86559B publication Critical patent/FI86559B/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI86559C publication Critical patent/FI86559C/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/57—IFN-gamma
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C12N15/71—Expression systems using regulatory sequences derived from the trp-operon
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/811—Interferon
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S930/00—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/01—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/14—Lymphokine; related peptides
    • Y10S930/142—Interferon
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S930/00—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/01—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/30—Signal or leader sequence

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

1 86559
Menetelmä ihmisen immuuni-interferonin valmistamiseksi ja siihen liittyviä välineitä ja niiden valmistus
Kyseessä oleva keksintö koskee yhdistelmä-DNA-tek-5 niikkaa, tekniikan keinoja ja menetelmiä ihmisen immuuni-interferonin DNA-sekvenssin ja päätellyn aminohapposekvenssin selville saamisessa sekä immuuni-interferonin valmistusta ja tällaisia valmisteita ja niiden käyttöä.
Keksintö koskee lähemmin ihmisen immuuni-interfe-10 ronia koodaavien DNA-sekvenssien eristämistä ja identifiointia sekä yhdistelmä-DNA-ekspressiovektoreiden, jotka sisältävät sellaisia DNA-sekvenssejä ekspression aikaansaaviin promoottorisekvensseihin toiminnallisesti liittyneinä, konstruointia sekä näin konstruoituja ekspressio-15 vektoreita. Toisaalta kyseessä oleva keksintö koskee isän-täviljelyjärjestelmiä, kuten esim. erilaisia mikro-organismi- ja nisäkässoluviljelmiä, jotka on transformoitu sellaisilla ekspressiovektoreilla ja täten ohjattu yllä mainittujen DNA-sekvenssien ekspressioon. Muissa suhteissa 20 keksintö liittyy keinoihin ja menetelmiin sellaisen ekspression lopputuotteiden muuttamiseksi uusiksi kokonaisuuksiksi, kuten esim. farmaseuttisiksi koostumuksiksi, jotka ihmisellä ovat käyttökelpoisia ehkäisevässä hoidossa sekä terapiassa. Edullisissa suoritusmuodoissa keksintö koskee 25 erityisiä ekspressiovektoreita, joiden sekvenssit ovat sopivia, niin että tuotetaan ihmisen interferonia ja eristetään se solusta kypsässä muodossa. Lisäksi menetelmä koskee erilaisia menetelmiä, jotka ovat käyttökelpoisia mainittujen DNA-sekvenssien tuottamisessa, ekspressiovek-- 30 toreita, isäntäviljelmäjärjestelmiä sekä lopputuotteita ja näiden kokonaisuuksia sekä näiden spesifisiä ja niihin liittyviä keksinnön suoritusmuotoja.
Kyseessä oleva keksintö saa osittain alkunsa ihmisen immuuniinterferonia koodaavasta DNA-sekvenssistä sekä ' 35 päätellystä aminohapposekvenssistä. Lisäksi kyseessä oleva 2 86559 keksintö tarjoaa sekvenssejä koskevaa tietoa ihmisen in-terferonigeenin 3'- ja 5'-sivuavista sekvensseistä helpottaen täten in vitro niiden liittämistä ekspressioapuainei-siin. Erityisesti tarjotaan 5'-DNA-segmentti, joka koodaa 5 oletettua, endogeenista signaalipolypeptidiä, joka välittömästi edeltää oletetun, kypsän, ihmisen immuuni-interferonin aminohapposekvenssiä. Nämä keksinnöt vuorostaan ovat tehneet mahdolliseksi keinojen ja menetelmien kehittämisen ihmisen immuuni-interferonin riittävien määrien 10 tuottamiseksi yhdistelmä-DNA-tekniikan avulla, niin että on vuorostaan mahdollista määrittää sen biokemialliset ominaisuudet ja bioaktiivisuus.
Tässä yhteydessä käytetyt julkaisut ja muut aineistot valaisevat keksinnön taustaa ja tietyissä tapauksissa 15 tarjoavat lisää yksityiskohtia käytännön suoritusten suhteen ja sisältyvät tähän viitteinä ja mukavuussyistä viitteet on merkitty numeroin seuraavaan tekstiin sekä vastaavasti ryhmitelty liitteenä olevaan kirjallisuusluetteloon.
A. Ihmisen immuuni-interferoni 20 Ihmisen interferonit voidaan luokitella kolmeen ryhmään erilaisten antigeenisten, biologisten ja biokemiallisten ominaisuuksien perusteella.
Ensimmäinen ryhmä käsittää leukosyytti-interferonien luokan (α-interferoni, LelF tai IFN-α, joita normaa-j 25 listi tuottavat pääasiassa ihmisveren solut virusinduktion johdosta. Niitä on tuotettu mikrobien avulla ja niiden on havaittu olevan aktiivisia (1, 2, 3). Niiden biologiset ominaisuudet ovat saaneet aikaan niiden kliinisen käytön terapeuttisina aineina virusinfektioiden ja syöpätapausten - 30 hoidossa (4).
Seuraavaan ryhmään kuuluu ihmisen fibroblasti-in-terferoni (β-interferoni, FIF eli IFN-β), jota fibroblas-tit normaalisti tuottavat virusinduktion johdosta, jota on todennäköisesti tuotettu mikrobiologisesti ja jolla on to-- 35 dettu olevan laajaa biologista aktiivisuutta (5). Kliini- 3 86559 set kokeet osoittavat myös sen potentiaalisen terapeuttisen arvon. Leukosyytti- ja fibroblasti-interferoneilla on biologisten omineisuuksiensa suhteen hyvin selviä yhtäläisyyksiä siitä huolimatta, että homologian aste aminohappo-5 tasolla on suhteellisen alhainen. Lisäksi molemmat interferonin ryhmät sisältävät 165 - 166 aminohappoa ja ovat haponkestäviä proteiineja.
Ihmisen immuuni-interferonia Ύ-interferoni, 11F tai (IFN-Y), jota kyseessä oleva keksintö koskee, on vasta-10 kohtana a-ja β-interferoneille pH 2:ssa labiili, sitä tuotetaan pääasiallisesti lymfosyyttien mitogeenisen induktion avulla ja se eroaa myös selvästi antigeenisesti. Tähän mennessä ihmisen immuuni-interferonia voitiin löytää vain erittäin vähäisiä määriä, mikä selvästi vaikeutti sen 15 karakterisointia. Äskettäin on tiedotettu (6) jokseenkin laajaperäisestä, mutta vielä osittaisesta ihmisen immuuni-interferonin puhdistuksesta. Yhdisteen mainittiin tuotetun lymfosyyttiviljelmistä, joita stimuloitiin fytohemagglu-tiniinin ja forboliesterin yhdistelmällä ja sitä puhdis-20 tettiin peräkkäisillä kromatografisilla erotuksilla. Tämä menetelmä antoi tuotteen, jonka molekyylipaino oli 58 000.
Ihmisen immuuni-interferonia on tuotettu erittäin pieniä määriä oosyyteissä mRNA:n translaation avulla, mikä ilmaisee ihmisen immuuni-interferonin interferoniaktiivi-;; 25 suuden ominaisuuden sekä mahdollisuuden sen suhteen, että immuuni-interferoni-cDNA voitaisiin syntetisoida ja kloonata (7).
Tähän mennessä saadun immuuni-interferonin määrä on varmasti riittämätön puhdistetun komponentin karakteri-30 sointia ja biologisia ominaisuuksia koskevien selvien kokeiden suorittamiseksi. Kuitenkin raaoilla valmisteilla suoritetut tutkimukset in vitro samoin kuin in vivo -kokeet hiiren γ -interferoni-valmisteilla antavat aiheen olettaa, että immuuni-interferonin ensisijainen tehtävä . 35 saattaa olla toimia immuunoregulatiivisena aineena (8, 9).
4 86559
Inunuuni-interferonilla ei ole ainoastaan virusten ja solujen vastaista aktiivisuutta, joka on yhteistä kaikille ihmisen interferoneille, vaan se osoittaa voimistavaa vaikutusta näitä aktiivisuuksia kohtaan a- ja β-interferonin 5 kanssa (10). Myös in vitro γ-interferonin antiprolifera-tiivisen vaikutuksen tuumorisoluja kohtaan on ilmoitettu olevan 10 - 100-kertainen muiden interferoniluokkien vaikutukseen nähden (8, 11, 12). Tämä tulos, yhdessä sen ilmeisen immunoregulatiivisen roolin kanssa (8, 9), tuntuu 10 osoittavan, että IFN-Ύ:11a on paljon selvempää tuumorin vastaista vaikutusta kuin IFN-a:lla ja IFN-Ö:lla. Tosiasiassa in vivo -kokeet, jotka on suoritettu hiirien avulla ja hiiren IFN-Y-valmisteilla, osoittavat selvää ylivoimaisuutta osteogeenistä tukikudossyöpää kohtaan omaa-15 vassa tuumorin vastaisessa vaikutuksessaan interferonien indusoiman virustenvastaisen aktiivisuuden suhteen (13).
Nämä kaikki tutkimukset kyseessä olevaan keksintöön saakka on suoritettu jokseenkin epäpuhtain valmistein, josta johtuu erittäin alhainen käyttökelpoisuus. Kuitenkin 20 ne viittaavat varmasti immuuni-interferonin hyvin tärkeisiin biologisiin toimintoihin. Inunuuni-interferonilla ei ole ainoastaan voimakasta viruksenvastaista aktiivisuutta, mutta sillä on luultavasti myös voimakasta immuunoregula tiivistä ja tuumorinvastaista aktiivisuutta, mikä viittaa | 25 sen olevan lupaava, kliiniseen käyttöön soveltuva ehdokas.
Havaittiin, että yhdistelmä-DNA-tekniikan käyttö olisi tehokkain tapa hankkia tarvittavia, suurempia määriä ihmisen immuuni-interferonia. Liittyipä tai ei näin tuotettuihin materiaaleihin glykosylointi, jota pidetään na-30 tiiville, ihmisestä peräisin olevalle aineelle ominaisena, niillä olisi luultavasti bioaktiivisuutta, joka tekee mahdolliseksi niiden kliinisen käytön virusperäisten, neo-plastisten sekä immunosuppressiolla käsiteltyjen tilojen tai sairauksien hoitoon laajalla alueella.
5 86559 B. Yhdistelmä-DNA-tekniikka
Yhdistelmä-DNA-tekniikka on saavuttanut jonkin verran kokemusta. Molekyylibiologit pystyvät yhdistämään erilaisia DNA-sekvenssejä kutakuinkin helposti luoden uusia 5 DNA-kokonaisuuksia, jotka pystyvät tuottamaan runsaita määriä eksogeenista proteiinituotetta transformoiduissa mikrobeissa. In vitro ovat käytettävissä yleiset keinot ja menetelmät erilaisten tylppä- tai "tahmea"-päisten DNA-fragmenttien liittämiseksi, tuottaen tiettyjen organis-10 mien transformoinnissa käyttökelpoisia, tehokkaita apuaineita, ohjaten täten eksogeenisen tuotteen tehokasta synteesiä. Kuitenkin yksittäisen tuotteen perusteella tie jää jokseenkin hankalaksi eikä tiede ole edistynyt vaiheeseen, jossa onnistumisesta voidaan tehdä säännöllisiä ennustei-15 ta. Tosiasiassa niillä, jotka lupaavat onnistuneita tuloksia ilman kokeellista perustaa, on huomattava vaara saada toimintakyvyttömiä tuotteita.
Plasmidi, ei-kromosomaalinen, kaksisäikeinen DNA-rengas, joka esiintyy bakteereissa ja muissa mikrobeissa 20 usein solua kohti moninkertaisina kopioina, jää yhdistelmä DNA-tekniikan peruselementiksi. Plasmidi-DNA:hän koodattuun informaatioon sisältyy se, että plasmidi tuotetaan uudelleen tytärsoluissa (ts. replikaation alkukohta) sekä yleensä yksi tai useampia valintaominaisuuksia, kuten 25 esim. bakteereiden tapauksessa, resistenssi antibiootteja kohtaan, mikä tekee mahdolliseksi tunnistaa kiinnostavan plasmidin sisältävän isäntäsolun kloonit sekä ensisijaisesti kasvattaa niitä valikoivassa elatusaineessa. Plas-midien hyväksi käyttö perustuu siihen seikkaan, että niitä 30 voidaan spesifisesti pilkkoa yhdellä tai toisella restrik-tioendonukleaasilla eli "restriktioentsyymillä", joista kukin tunnistaa plasmidi-DNA:lla eri kohdan. Tämän jälkeen heterologiset geenit tai geenifragmentit saatetaan liittää plasmidiin yhdistämällä päät pilkkomiskohdassa tai uu-' 35 delleen muodostetuissa päissä, pilkkomiskohdan vieressä.
6 86559 Täten muodostetut rakenteet ovat niin sanottuja replikoi-tuvia ekspressio vektoreita. DNA:n rekombinaatio suoritetaan solun ulkopuolella, mutta syntyvä "rekombinantti" replikoituva ekspressiovektori eli plasmidi voidaan viedä 5 soluihin menetelmän avulla, joka tunnetaan transformaationa ja suuria määriä rekombinanttivektoria voidaan saada transformanttia kasvattamalla. Lisäksi silloin, kun geeni on sopivasti sisällytetty plasmidin osien suhteen, jotka määräävät koodatun DNA-viestin transkriptiota ja transit) laatiota, syntyvää ekspression apuainetta voidaan käyttää suorastaan tuottamaan polypeptidisekvenssiä, jota inser-toitu geeni koodaa, tapahtumaa sanotaan ekspressioksi.
Ekspressio alkaa promoottorina tunnetulla alueella, jonka RNA-polymeraasi tunnistaa ja johon se sitoutuu. Eks-15 pression transkriptiovaiheessa DNA kiertyy auki, jolloin se on DNA-sekvenssistä alkavan lähetti-RNA:n synteesin muottina. Lähetti-RNA vuorostaan luetaan polypeptidiksi, jolla on mRNA:n koodaama aminohapposekvenssi. Kutakin aminohappoa koodaa nukleotiditripletti eli "kodoni", joka 20 kollektiivisesti muiden "kodonien" kanssa muodostaa "ra-kennegeenin", ts. osan, joka koodaa ekspressoidun polypep-tidituotteen aminohapposekvenssin. Translaatio alkaa "lähtö" -signaalista (tavallisesti ATG:stä, josta syntyvässä lähetti-RNA:ssa tulee AUG). Niin sanotut pysähdyskodonit 25 määräävät translaation päättymisen ja siitä syystä enem-pien aminohappoyksiköiden valmistuksen. Syntyvä tuote saatetaan saada hajottamalla, jos tarpeellista, isäntäsolu mikrobiperäisessä järjestelmässä ja erottamalla tuote muista proteiineista sopivan puhdistusmenetelmän avulla.
30 Käytännössä yhdistelmä-DNA-tekniikan käytöllä voi daan ekspressoida yksinomaan heterologisia polypeptidejä -niin sanottu suora ekspressio - tai vaihtoehtoisesti saatetaan ekspressoida heterologinen polypeptidi, joka on liitetty homologisen polypeptidin aminohapposekvenssi-35 osaan. Viimeksi mainitussa tapauksessa aiottu bioaktiivinen tuote on joskus tehty bioinaktiiviseksi yhdistetys- 7 86559 sä, homologisessa/heterologisessa polypeptidissä siihen saakka, kunnes se pilkotaan solunulkoisessa ympäristössä. Ks. GB-patenttijulkaisu 2 007 676A sekä Wetzel, American Scientist 68, 664 (1980).
5 C. Soluviljelmätekniikka
Solu- ja kudosviljelmien käytöllä geneettisissä ja solufysiologiaa koskevissa tutkimuksissa on varma asema. Käytettävissä ovat menetelmät ja keinot pysyvien solulin-jojen ylläpitämiseksi, jotka on valmistettu eristetyistä 10 normaalisoluista peräkkäisillä sarjasiirroilla. Tutkimuk sissa suoritettavaa käyttöä varten sellaisia solulinjoja pidetään yllä kiinteällä alustalla nestemäisessä elatus-aineessa tai kasvattamalla suspensiossa, joka sisältää tukiravinteita. Mittakaavan suurentaminen suuria valmis-15 tuseriä varten asettaa ainoastaan mekaanisia ongelmia. Lisätaustatiedon saantia varten olisi huomioitava seuraa-vissa julkaisuissa esitetyt tiedot, Microbiology, toinen painos, Harpen ja Row, julkaisijat, osakeyhtiö Hagerstown, Maryland (1973) erityisesti sivut 1122 et seq. sekä 20 Scientific American 245, 66 et seq. (1981), joista julkaisuista kukin on sisällytetty kyseessä olevaan patenttihakemukseen viitteenä.
Kyseessä oleva keksintö pohjautuu havaintoon, että yhdistelmä-DNA-tekniikkaa voidaan käyttää tuottamaan me-25 nestyksellisesti ihmisen immuuni-interferonia, luultavasti välittömässä muodossa ja määrältään riittävästi eläin- ja kliinisten kokeiden aloittamiseksi ja suorittamiseksi, mikä on edellytyksenä valmisteeen hyväksymiselle markkinointiin. Tuote soveltuu käytettäväksi kaikissa muodois-30 saan ihmisten profylaktiseen tai terapeuttiseen käsittelyyn virusinfektioita vastaan sekä pahanlaatuisissa ja immunosuppressio-olosuhteissa tai immuniteetin puuttuessa. Sen muotoihin sisältyy erilaisia oligomeerisia muotoja, joihin saattaa sisältyä yhdistetty glykosylaatio. Tuote 35 valmistetaan geneettisesti aikaansaatujen transformantti- 8 86559 mikro-organismien tai transformanttisoluviljelmien avulla. Tässä käytettynä termi "transformanttisolu" tarkoittaa solua, johon on liitetty solun ulkopuolisesta DNA-rekombi-naatiosta peräisin olevaa DNA:ta, ja tällaisen solun jäl-5 keläistä, joka säilyttää näin liitetyn DNA:n solussaan. Täten on nyt kapasiteettia valmistaa ja eristää ihmisen immuuni-interferoni paljon tehokkaamalla tavalla kuin on ollut aiemmin mahdollista. Kyseessä olevan keksinnön edul-lisimmassa suoritusmuodossa eräs merkittävä tekijä on kyky 10 geneettisesti ohjata mikro-organismi tai soluviljelmä valmistamaan eristettäviä määriä ihmisen immuuni-interferonia, jota kypsä isäntäsolun muoto erittää.
Kyseessä oleva keksintö koskee täten valmistettua ihmisen immuuni-interferonia sekä sen valmistusmenetelmiä 15 ja keinoja. Keksintö kohdistuu edelleen replikoituviin DNA- eksperessiovektoreihin, joihin sisältyy geenisekvenssejä, jotka koodaavat ihmisen immuuni-interferonia eks-pressoituvassa muodossa. Edelleen keksintö kohdistuu mikro-organismien kantoihin ja soluviljelmiin, jotka on 20 transformoitu yllä kuvatuilla ekspressiovektoreilla sekä tällaisten transformoitujen kantojen tai viljelmien mikrobi- tai soluviljelmiin, jotka voivat valmistaa ihmisen immuuni-interferonia. Vielä edelleen muissa suhteissa kyseessä oleva keksintö suuntautuu erilaisiin menetelmiin, : 25 jotka ovat käyttökelpoisia valmistettaessa mainittuja immuuni-interferonin geenisekvenssejä, DNA-ekspressiovekto-reita, mikro-organismien kantoja sekä soluviljelmiä ja niiden spesifisiin keksinnön suoritusmuotoihin. Vielä edelleen keksintö suuntautuu mainittujen mikro-organismien 30 käymisviljelmien ja soluviljelmien valmistukseen. Lisäksi keksintö kohdistuu ihmisen immuuni-interferonin valmistukseen suorana ekspressiotuotteena, joka on eritetty kypsässä muodossa isäntäsolusta. Tämä aloittamistapa saattaa käyttää hyväksi geeniä, joka koodaa ihmisen kypsän immuu-35 ni-interferonin sekvenssiä sekä 5'-sivuavaa DNA:a, joka 9 86559 koodaa signaalipolypeptidiä. Signaalipolypeptidin uskotaan auttavan molekyylin kuljettamisessa isäntäorganismien so-lunseinämään, missä se pilkotaan ihmisen kypsän interfe-ronituotteen eritystapahtuman kuluessa. Tämä suoritusmuoto 5 tekee mahdolliseksi aiotun, kypsän immuuni-interferonin eristämisen ja puhdistamisen turvautumatta käytettyihin menetelmiin, joiden tarkoituksena on poistaa solunsisäi-sestä isäntäproteiinista ja solunpirstaleista peräisin olevat kontaminantit.
10 Tässä yhteydessä käytetty viittaus ilmaisuun "ihmi sen kypsä immuuni-interferoni" sisältää lisäksi ihmisen immuuni-interferonin valmistuksen mikrobi- tai solunvil-jelmän avulla siten, että mukana ei ole signaalipeptidi tai sekvenssiä edeltävä peptidi, joka ottaa osaa ihmisen 15 immuuni-interferoni-mRNA:n translaatioon. Täten keksinnön mukaan valmistetaan ihmisen ensimmäinen vhdistelmä-immuuni-interferoni, jossa metioniini on ensimmäisenä aminohappona (ATG-lähtögodonin rakennegeenin eteen liittämisen vuoksi) tai, kun metioniini on intra- tai ekstrasellulaa-20 risesti pilkottu, sen normaalisti ensimmäinen aminohappo on kysteiini. Tämän mukaisesti ihmisen kypsä immuuni-interferoni voidaan myös valmistaa yhdessä konjugoidun proteiinin, muun kuin tavanomaisen signaalipolypeptidin kanssa konjugaatin ollessa tällöin pilkottavissa solun sisällä 25 tai solun ulkopuolella. Ks. GB-patenttijulkaisu 2 007 676A. Lopuksi, ihmisen kypsä immuuni-interferoni voidaan valmistaa suoran ekspression avulla tarvitsematta pilkkomalla poistaa mitään asiaankuulumatonta, tarpeetonta poly-peptidiä. Tämä on erityisesti tärkeää, kun isäntä ei voi 30 tai ei voi tehokkaasti poistaa signaalipeptidiä, jolloin ekspressioapuaine on konstruoitu ekspressoimaan ihmisen kypsä interferoni sen signaalipeptidin kanssa. Täten tuotettu ihmisen kypsä immuuni-interferoni eristetään ja puhdistetaan sellaiseksi, että se soveltuu virusperäisten, 35 pahanlaatuisten sekä immunosuppressioja immunitetin puu-tosolosuhteiden hoitamiseen.
ίο 86 559
Ihmisen immuuni-interferoni saatiin seuraavasti: 1. Ihmiskudoksia, esim. ihmisen pernakudosta tai periferisiä veren lymfosyyttejä viljeltiin mitogeenien kanssa immuuni-interferonin valmistamisen stimuloimiseksi.
5 2. Tällaisten soluviljelmien solupalloja uutettiin ribonukleaasi-inhibiittorin läsnäollessa kaiken sytoplas-maperäisen RNA:n eristämiseksi.
3. Oligo-dT-pylvään avulla eristettiin kokonais-lähetti-RNA (mRNA) polyadenyloidussa muodossa. Tämä mRNA
10 fraktioitiin koon mukaan sakkaroositiheysgradienttia sekä happoureageelielektroforeesia käyttäen.
4. Sopiva mRNA (12 - 18 S) muutettiin vastaavaksi, yksisäikeiseksi, komplementaariseksi DNA:ksi (cDNA), josta valmistettiin kaksisäikeinen cDNA. Poly-cC-päätteen sito- 15 misen jälkeen se liitettiin vektoriin, kuten esim. plasmi-diin, jossa oli yksi tai useampia fenotyyppisiä markkerei-ta.
5. Täten valmistettuja vektoreita käytettiin transformoimaan bakteerisoluja, jolloin saadaan pesäkekirjas- 20 ton. Radiomerkattua cDNA:a, joka oli valmistettu sekä indusoidusta että indusoimattomasta mRNA:sta, joka oli saatu edellä kuvatulla tavalla, käytettiin kaksoispesäkekirjas-tojen tutkimiseksi erillään. Ylimääräinen cDNA poistettiin ja pesäkkeet valotettiin röntgensädefilmille indusoitujen 25 cDNA-pesäkkeiden identifioimiseksi.
6. Indusoiduista cDNA-klooneista eristettiin vas taava plasmidi-DNA ja selvitettiin sen sekvenssi.
7. Ensimmäisen suoritusmuodon mukaan sekventoitu DNA liitettiin sitten in vitro insertiota varten sopivaan 30 ekspressiovektoriin, jota käytettiin E. coli-isäntäsolun transformointiin, jota vuorostaan kasvatettiin viljelmässä ja jonka annettiin ekspressoida haluttu ihmisen immuuni-interferoni-tuote.
8. Täten ekspressoitu ihmisen immuuni-interferoni 35 kypsässä muodossaan sisältää epäilemättä 146 aminohappoa.
11 86559 alkaen kysteiinillä ja se on luonteeltaan hyvin emäksinen. Sen monomeerin molekyylipainoksi on laskettu 17 140. Mahdollisesti useiden emäksisten tähteiden, hydrofobisuuden, suolasillan muodostumisen jne. vuoksi molekyyli voi liit-5 tyä itsensä kanssa oligomeerimuodoiksi, esim. dimeeri-, trimeeri- tai tetrameeri-muodoksi. Aiemmin luonnonmateriaaleilla (6) havaitut suuret molekyylipainot, joita ei voida selittää yksinomaan aminohapposekvenssin perusteella, saattavat johtua sellaisista oligomeerimuodoista sekä 10 translaation jälkeisestä glykosylaatiosta peräisin olevan hi i1ihydraatin myötävaikutuksesta.
9. Tietyissä isäntäsolujärjestelmissä, erityisesti, kun on liitettynä ekspressioapuaineeseen, niin että eks-pressoidaan yhdessä signaalipeptidinsä kanssa, ihmisen im-15 muuni-interferoni kuljetetaan pois, mikä edistää huomat tavasti eristämistä ja auttaa puhdistusmenetelmissä.
A. Mikro-organismit/soluviljelmät 1. Bakteerikannat/promoottorit
Kyseessä olevassa hakemuksessa kuvattu työ suori-20 tettiin käyttämällä mm. mikro-organismi E. coli K12:a kantaa 294 (pää A, thi*, hsr", khsm*), kuten kuvataan GB patenttijulkaisussa 2 055 382A. Tämä kanta on talletettu kokoelmaan American Type Culture Collection ATCC numerolla 31446. Kuitenkin monet muut mikrobikannat ovat käyttökel-25 poisia mm. tunnetut E. coli -kannat, kuten esim. E. coli B, E. coli X 1776 (ATCC nro 31537) ja E. coli W 3110 (F', \ ,ριτοΐΓΌίΙηβη) (ATCC 27325) tai muut mikrobikannat, joista monia on talletettu tunnistettuihin mikro-organismien talletuslaitoksiin, kuten esim. American Type Culture Collec-30 tion (ATCC) - vertaa ATCC-luetteloa,ja jotka ovat (mahdollisesti) niistä saatavissa. Katso myös saksalaista patenttijulkaisua 2 644 432. Näihin muihin mikro-organis-meihin kuuluu esim. Bacilli, kuten esim. Bacillus subtilis ja muita enterobacteriaceae, joista voidaan mainita esi-35 merkkeinä Salmonella typhlmurlum ja Serratia marcesans.
i2 8 6 559 jotka käyttävät hyväkseen plasmideja, jotka voivat replikoitua ja ekspressoida niissä olevia geenisekvenssejä.
Esimerkiksi beeta-laktamaasi ja laktoosipromoot-torijärjestelmiä on edullisesti käytetty hyväksi aloitet-5 taessa ja pidettäessä yllä heterologisten polypeptidien mikrobiperäistä valmistusta. Nämä promoottori-järjestelmien kokoonpanon ja rakenteen yksityiskohdat on esitetty julkaisuissa Chang et ai., Nature 275, 617 (1978) sekä
Itakura et ai., Science 198, 1956 (1977), jotka tässä yh-10 teydessä on esitetty viitteinä. Aivan äskettäin on kehitetty tryptofaaniin perustuva järjestelmä, ns. trp-promoo-ttori-järjestelmä. Tämän järjestelmän kokoonpanoa ja rakennetta koskevat yksityiskohdat ovat julkaisseet Goeddel et ai., Nucleic Acids Research 8, 4057 (1980) sekä Kleid 15 et ai., U.S.S.N. 133, 296, jätetty maaliskuun 24 päivänä 1980, jotka sisältyvät tähän hakemukseen viitteinä. On löydetty ja käytetty hyväksi monia muita mikrobipromoot-toreita ja niiden nukleotidisekvenssejä koskevia yksityiskohtia, joiden perusteella taitava tutkija liittää ne toi-20 minnallisesti plasmidivektoreihin, on julkaistu - ks. esim. Siebenlist et ai., Cell 20, 269 (1980), joka sisältyy tähän hakemukseen viitteenä.
2. Hiivakannat/hiivapromoottorit
Kyseessä oleva ekspressio-järjestelmä saattaa käyt-25 tää myös plasmidia YRp7 (14, 15, 16), joka kykenee selektioon ja replikatioon sekä E. colissa että hiivassa, Sac-charomyces cerevisiae. Hiivassa tapahtuvaa selektiota varten plasmidi sisältää TRPl-geenin (14, 15, 16), joka täydentää (sallii kasvun tryptofäänin poissaollessa) hiivaa, 30 joka sisältää mutaatioita tässä geenissä, joka löytyy hiivan kromosomi IV:stä (17). Tässä yhteydessä käytetty kanta oli kanta RH218 (18), joka on talletettu kokoelmaan
American Type Culture Collection ilman rajoitusta (ATCC nro 44076). Kuitenkin on selvää, että mikä tahansa 35 Saccharomyces cerevisiae -kanta, joka sisältää mutaation.
i3 86559 joka tekee solun trpl:ksi, olisi tehokas ympäristö eks-pressio-järjestelmän sisältävän plasmidin ekspressiolle. Eräs esimerkki toisesta kannasta, jota voitaisiin käyttää, on pep4-l (19). Tällä tryptofaani-auksotrofi-kannalla on 5 myös pistemutaatio TRP1-geenissä.
Kun hiivageenistä (alkoholidehydrogenaasi 1) saatu 5'-sivuava DNA-sekvenssi (promoottori) asetetaan ei-hiiva-geenin 5'-puolelle, voidaan edistää vieraan geenin ekspressiota hiivassa, kun se sijoitetaan plasmidiin, jota 10 käytetään hiivan transformointiin. Promoottorin lisäksi ei-hiivageenin sopiva ekspressio hiivassa edellyttää, että toinen hiivasekvenssi sijoitetaan plasmidilla ei-hiivageenin 3'-päähän, niin että sopiva transkription päättyminen ja polyadenylaatio on hiivassa mahdollinen. Tätä promoot-15 toria voidaan sopivasti käyttää kyseessä olevassa keksinnössä samoin kuin muissa - ks. jäljempänä. Edullisissa keksinnön suoritusmuodoissa hiivan 3-fosfoglyseraattiki-naasigeenin (20) 5'-sivuava sekvenssi asetetaan rakenne-geenistä ylöspäin, jota seuraa jälleen DNA, joka sisältää 20 päättymisen polyadenylaation signaalit, esim. TRP1 (14, 15, 16)-geeni tai PGK (20)-geeni.
Koska hiivan 5'-sivuava sekvenssi (yhdistettynä hiivan 31-terminaatio-DNA:han) (ks. jäljempänä) voi toimia hiivassa vieraiden geenien ekspression edistämiseksi, 25 näyttää todennäköiseltä, että minkä tahansa voimakkaasti ekspressoidun hiivageenin 5'-sivuavia sekvenssejä voitaisiin käyttää tärkeiden geenituotteiden ekspressioon. Koska joissakin olosuhteissa hiiva ekspressoi liukoisen proteiininsa 65 %:iin saakka glykolyyttisinä entsyymeinä (21) ja 30 koska tämä korkea taso näyttää olevan tulos yksityisten mRNAriden korkeasta tasosta (22), olisi sellaisiin eks-pressio-tarkoituksiin mahdollista käyttää mitä tahansa muita glykolyyttisiä geenejä - esim. enolaasia, glyseral-dehydi-3-fosfaattidehydrogenaasia, heksokinaasia, pyruvaa-35 ttidekarboksylaasia, fosfofruktokinaasia, glukoosi-6-fos- i4 86 559 faatti-isomeraasia, 3-fosfoglyseraattimutaasia, pyruvaat-tikinaasia, triosifosfaatti-lsomeraasia, fosfoglukoosi-isomeraasla ja glukokinaasia. Mitä tahansa näiden geenien 3’-sivuavia sekvenssejä voitaisiin myös sellaisessa eks-5 pressio-järjestelmässä käyttää sopivaan terminaatioon sekä mRNA-polyadenylaatioon - vrt. yllä. Jotkut muut voimakkaasti ekspressoidut geenit ovat happamien fosfataasien geenejä (23) sekä geenejä, jotka ekspressoivat voimakkaasti 5' -sivuavissa alueissa esiintyvien mutaatioiden (mutantit, 10 jotka lisäävät ekspressiota) johdosta syntyviä tuotteita -johtuvat tavallisesti muutettavissa olevan TY1-elementin (24) läsnäolosta.
Hiivan RNA polymeraasi II:n (24) ajatellaan suorittavan kaikkien edellä mainittujen geenien transkriptio. 15 Mahdollisesti ribosomaalista RNA:a, 5S RNA:a ja tRNA:ita vastaavia geenien transkriptiota suorittavien RNA-polyme-raasi I:n ja III:n promoottorit (24, 25) saattavat myös olla käyttökelpoisia sellaisissa ekspressiorakenteissa.
Lopuksi, monet hiivapromoottorit sisältävät myös 20 transkription kontrollin, niin että niiden toiminta voidaan keskeyttää tai kytkeä muuttamalla kasvuolosuhteita. Esimerkkejä sellaisista hiivapromoottoreista ovat geenit, jotka tuottavat seuraavia proteiineja: alkoholidehydroge-naasi II:a, isosytokromi-c:tä, hapanta fosfataasia, typen 25 metaboliaan liittyviä pilkkovia entsyymejä, glyseralde-hydi-3-fosfaattidehydrogenaasia sekä entsyymejä, jotka vastaavat maltoosin ja galaktoosin hyväksikäytöstä (22). Tällainen kontrollialue olisi erittäin käyttökelpoinen säädettäessä proteiinituotteen ekspressiota - erityisesti 30 kun tuote on hiivalle toksinen. Olisi myös mahdollista sijoittaa 5'sivuavan sekvenssin kontrollialue 5'-sivuavan sekvenssin kanssa, joka sisältää voimakkaasti ekspressoi-dusta geenistä peräisin olevan promoottorin. Tästä olisi tuloksena hybridipromoottori ja se olisi mahdollista, kos-35 ka kontrollialue ja promoottori näyttävät olevan rakenteellisesti erillisiä sekvenssejä.
is 86S59 3. Soluviljelraäjärjestelmät/soluviljelmävektorit Vertebraattlsolujen tuottamisesta viljelmässä (kudosvil-jelmä) on viime vuosina tullut rutiini menetelmä (ks. Tissue Culture, Academic Press, Kruse ja Patterson kustan-5 tajät, 1973). Tässä yhteydessä käytettiin isäntänä apinan munuaisen fibrablastien COS-7-linjaa immuuni-interferonin tuottamiseksi (25a). Kuitenkin tässä yksityiskohtaisesti esitetyt kokeet voitaisiin suorittaa missä tahansa solu-linjassa, joka pystyy sopivan vektorin replikaatioon ja 10 ekspressioon, esim. WI38:ssa, BHK:ssa, 3T3:ssa, CH0:ssa, VEROrssa sekä HeLa-solulinjoissa. Edelleen ekspressiolta edellytetään, että vektori on replikaation lähtökohta ja promoottori sijaitsee ekspressoitavan geenin edessä sekä kunkin tarvittavan ribosomin sitoutumiskohtia, joissa int-15 ronit irrotetaan mRNA-prekursoreista, polyadenylaatiokoh-tia sekä transkriptionaalisia terminaattorisekvenssejä. Samalla kun SV40:n oleellisia elementtejä on tässä yhteydessä käytetty hyväksi, on selvää, ettei keksintöä, vaikka sitä kuvataan tässä edullisemman keksinnön suoritusmuodon 20 termein, tulisi konstruoida näihin sekvensseihin rajoittuen. Esim. voitaisiin käyttää muiden virusperäisten (esim. polyoma, adeno, VSV, BVP jne.) vektoreiden replikaation alkukohtaa sekä DNA:n replikaation soluperäisiä alkukohtia, jotka voisivat toimia epätäydellisessä muodos-25 sa.
B. Vektorijärjestelmät 1. Kypsän immuuni-interferonin suora ekspressio E.
colissa
Menetelmä, jota käytettiin saamaan E. colissa IFNrY: 30 n suora ekspressio kypsänä interferonipolypeptidinä (miinus signaalisekvenssi), oli muunnos menetelmästä, jota aiemmin käytettiin ihmisen kasvuhormonille (26) sekä ihmisen leukosyytti-interferonille (1), sikäli että siihen kytkeytyi synteettisen (N-terminaalisen) ja cDNA:iden yh-35 distelmä.
i6 8 6 5 59
Myöhemmin kuvatun p69:n nukleotidisekvenssin perusteella sekä vertaamalla tunnettuun pilkkoutumiskohtaan, joka sijaitsee signaalipeptidin ja useita IFN-a:a (2) vastaavan kypsän polypeptidin välillä, IFN-Ύ :11a on hydro-5 fobinen 20 aminohapon muodostama signaalipeptidi, jota seuraa kypsän IFN-Y:n 146 aminohappoa (kuvio 5). Kuten on esitetty kuviossa 7, BstNI-restriktioendonukleaasin toi-mintakohta sijaitsee sopivasti kypsän IFN-Y:n aminohapossa 4. Konstruoitiin kaksi synteettistä oligodeoksinukleoti-10 diä, jotka sisältävät ATG-translationaalisen alkukodonin, kodonit aminohappoja 1, 2 ja 3 (kysteiini-tyrosiini-kys-teiini) varten ja saatiin aikaan EcoRI koossapysyvä pää. Nämä desoksioligonukleotidit sidottiin p69:n 100 emäsparia sisältävään BstNI-Pstl-fragmenttiin, jotta konstruoitiin 15 1115 emäsparia käsittävä synteettis-luonnonmukainen hybri- digeeni, joka koodaa IFN-Ύ:a ja jonka rajoittavat EcoRl-ja Pstl-restriktiokohdat. Tämä geeni liitettiin pLelF A trp 103 plasmidiin EcoRI- ja Pstl-kohtien väliin, jotta saatiin ekspressioplasmidi pIFN-Y trp 48. Tässä plasmidis-20 sa IFN-Y -geeni ekspressoidaan E. coll trp promoottorin kontrollin alaisena. [pLelF A trp 103 on peräisin pLelF A 25:stä, jossa LelF A -geeniin nähden distaalisesti sijaitseva EcoRI-kohta poistettiin. Menetelmää, jota käytettiin tämän EcoRI-kohdan poistamiseksi, on kuvattu aiemmin 25 (27).] 2. Ekspressio hiivassa
Immuuni-interferonin tuottamiseksi tarvittavan he-terologisen geenin, kuten esim. cDNArn, ekspressiota varten hiivassa, oli tarpeellista konstruoida plasmidivekto-30 ri, joka sisälsi neljä komponenttia. Ensimmäinen komponentti on osa, joka sallii sekä E. colin että hiivan transformaation ja sen täytyy täten sisältää kustakin organismista valikoitavissa oleva geeni. (Tässä tapauksessa se on E. colista peräisin oleva ampisilliiniresistenssin geeni 35 ja hiivan TRP1-geeni.) Tämä komponentti edellyttää myös, i7 8 6 559 että molemmista organismeista peräisin oleva replikaation alkukohta on molemmissa organismeissa säilytettävä plas-midi-DNA:na. (Tässä tapauksessa se on pBR322:sta peräisin oleva E. coll -alkukohta sekä arsl-alkukohta hiivan kromo-5 somi III:sta.)
Toinen plasmidin komponentti on voimakkaasti eks-pressoidusta hiivageenistä peräisin oleva 5'-sivuava sekvenssi, joka edistää alavirtaan asettuneen rakennegeenin transkriptiota. Tässä tapauksessa käytetty 5'-sivuava sek-10 venssi on hiivan 3-fosfoglyseraattikinaasi (PGK)-geenistä peräisin oleva sekvenssi. Fragmentti oli konstruoitu siten, että poistettiin PGK-rakennegeenin ATG sekä 8 bp ylävirtaan tästä ATG:stä. Tämä sekvenssi korvattiin sekvenssillä, joka sisälsi Xbal- sekä EcoRI-restriktiokohdan tä-15 män 5'-sivuavan sekvenssin sopivaksi liittämiseksi raken- negeeniin.
Systeemin kolmas komponentti on rakennegeeni, joka on konstruoitu sillä tavalla, että se sisältää sekä translaation ATG-alku- että loppusignaalit. Sellaisen geenin 20 eristäminen ja konstruointi kuvataan myöhemmin.
Neljäs komponentti on hiivan DNA-sekvenssi, joka sisältää hiivageenin 3'-sivuavan sekvenssin, joka sisältää sopivat signaalit sekä transkription päättymistä että po-lyadenylaatiota varten.
25 Immuuni-interferoni on tuotettu hiivassa, jolloin kaikki nämä komponentit ovat läsnä.
3. Ekspressio nisäkässoluviljelmässä
Immuuni-interferonin synteesin strategia nisäkäs-soluviljelmässä on riippuvainen vektorin kehittymisestä, 30 joka kykenee vieraan geenin autonomiseen replikaatioon sekä ekspressioon heterologisen transkriptionasiisen yksikön kontrollin alaisena. Tämän vektorin replikaatio soluviljelmässä toteutettiin antamalla käyttöön DNA-replikaa-tion alkukohta (peräisin SV40-viruksesta) sekä antamalla 35 käyttöön auttajafunktio (T-antigeeni) liittämällä solusar- ie 8 6 559 jaan vektori, joka endogeenisesti ekspressoi tätä antigeeniä (28, 29). SV40-viruksen entinen promoottori edelsi interferonin rakennegeeniä ja varmisti geenin transkription.
5 Vektori, jota käytettiin IFN-Ύ :n ekspressioon, si sälsi pBR322-sekvenssejä, jotka antavat käytettäväksi valittavissa olevan markkerin E. colissa tapahtuvaa selektiota varten (ampisilliiniresistenssi) sekä DNA-replikaa-tion E. coli -alkukohdan. Nämä sekvenssit olivat peräisin 10 plasmidi-pML-l:stä (28) ja ne sulkivat sisäänsä alueen, joka käsittää EcoRI- sekä BamHI-restriktiokohdat. SV40-alkukohta on peräisin 342 emäsparin PvuII-Hindlll-fragmen-tista, joka sulkee sisäänsä tämän alueen (30, 31) (molempien päiden ollessa muunnettavissa EcoRI-päiksi). Nämä 15 sekvenssit, sen lisäksi, että ne käsittävät DNA-replikaa-tion virusperäisen alkukohdan, koodaavat sekä ensimmäistä että viimeistä translaatioyksikköä vastaavan promoottorin. SV40-alkukohta-alueen sijainti oli sellainen, että viimeistä transkriptioyksikköä vastaava promoottori sijoitet-20 tiin proksimaalisesti interferonia koodaavan geenin suhteen.
Kuvio 1 esittää perifeerisen veren lymfosyytti (PBL) polyA+RNA:n sakkaroositiheysgradienttisentrifugoin-tia. Interferoniaktiivisuuden kaksi huippua havaittiin : 25 (kuten on esitetty varjostetuin pylväin) 12S:n ja 16S:n kohdalla. Ribosomaalisten RNA-markkereiden (sentrifugoitu erikseen) asemat on merkitty absorbanssikäyrän yläpuolelle.
Kuvio 2 esittää indusoidun PBL poly(A)+ RNA:n elek-30 troforeesia happo-urea-agaroosilla. Havaittiin vain yksi aktiivisuushuippu, joka yhtyi 18S RNA:n kanssa. Ribosomaalisten RNA-markkereiden, joiden elektroforeesi on ajettu viereisellä kaistalla ja jotka on visualisoitu etidiumbro-midi-värjäyksen avulla, asemat on merkitty aktiivisuuspro-- 35 fiilin yläpuolelle.
ΐ9 8 6 559
Kuvio 3 esittää 96 pesäkkeen hybridisaatiota indusoitujen ja indusoimattomien 32P-merkattujen cDNA-näyttei-den kanssa. 96 yksittäistä transformanttia kasvatettiin mikrotiitterilevyllä, kopioitiin (replica plated) kahdelle 5 nitroselluloosamembraanille ja sitten suotimet hybridisoi-tiin 32P-cDNA-koettimien kanssa, jotka oli valmistettu joko indusoidusta mRNA:sta (yllä) tai mRNA:sta, joka oli eristetty indusoimattomista PBL-viljelmistä (indusoimaton, alla). Suotimet pestiin ei-hybridisoidun RNA:n poistami-10 seksi ja sitten ne valotettiin röntgensädefilmille. Tämä suotimien sarja edustaa 86 tällaista sarjaa (8 300 erillistä pesäkettä). "Indusoidun" kloonin esimerkki on merkitty H12:na.
Kuvio 4 on klooni 69 cDNA insertin restriktioendo-15 nukleaasikartta. cDNA-inserttiä sitovat Pstl-kohdat (pisteet molemmissa päissä) sekä oligo dC-dG-päät (yksittäiset viivat). Restriktionukleaasilla suoritetulla pilkkomisella aikaansaatujen fragmenttien lukumäärä ja koko määritettiin elektroforeesilla, joka ajettiin 6-%:isillä akryyliamidi-20 geeleillä. Kohtien asemat varmistettiin nukleiinihapposek-ventoinnllla (esitetty kuviossa 5). Suurimman avoimen lukukehyksen koodausalue on kehystetty ja viivoitettu alue esittää oletettua 20 signaalipeptidisekvenssitähdettä, kun taas täplitetty alue edustaa kypsää IIF-sekvenssiä (146 .25 aminohappoa). mRNA:n 5'-pää on vasemmalla, kun taas 3'-pää on oikealla.
Kuvio 5 esittää plasmidl p69 cDNA insertin nukleo-tidisekvenssiä, se kuvaa kuitenkin yleisintä alleelista IFN-Ύ :n muotoa. Pisimmän, avoimen lukukehyksen päätelty ... 30 aminohapposekvenssi on myös esitetty. Oletettua signaali-sekvenssiä esittävät tähteet, joita merkitään S1-S20.
Kuvio 6 esittää IFN-Y mRNA-rakenteen vertailua leukosyytti (IFN-a)- ja fibroblast! (IFN-β)-interferonien rakenteen kanssa. Klooni 69 mRNA (merkattu immuuni) sisältää 35 merkittävästi suurempia määriä sekvenssejä, joille ei translaatiota ole suoritettu.
20 86 559
Kuvio 7 esittää kaaviomaisesti IFN-γ ekspressio-plasmidi pIFN-Ύ trp 48:n rakenteen. Lähtöaineena on 1 250 emäsparin PstI cDNA insertti plasmidi p69:stä.
Kuvio 8 esittää diagrammin plasmidista, jota on 5 käytetty IFN-Y:n ekspressioon apinan soluissa.
Kuvio 9 esittää kahdeksan erilaisen EcoRl:n pilkkomaa ihmisen genomin DNA:n "Southern" hybridisaatiota, jotka on hybridisoitu 32P-leimatun 600 emäsparin Ddel-frag-mentin kanssa, jotka ovat peräisin p69:n cDNA-insertistä. 10 EcoRI-fragmentit hybridisoituvat kussakin DNA-näytteessä olevan koettimen kanssa.
Kuvio 10 esittää kuudella eri restriktioendonuk-leaasilla pilkotun, ihmisen genomi-DNA:n, joka on hybridi-soitu p69:stä peräisin olevan 32P:llä leimatun koettimen 15 kanssa, "Southern"-hybridisaation.
Kuvio 11 esittää kaaviomaisesti vektorin pBl, josta PGK-promoottori eristettiin, 3,1 kbp Hindlll-insertin res-triktiokarttaa. Osoitetaan EcoRI- ja Xbal-kohdan insertio PGK-geenin 5'-sivuavassa DNA:ssa.
20 Kuvio 12 kuvaa 5'-sivuavaa sekvenssiä plus alku- koodaussekvenssiä PGK-geenille ennen Xbal- ja EcoRl-koh-tien insertiota.
Kuvio 13 valaisee kaaviomaisesti menettelytapoja, joita käytetään Xbal-kohdan insertioon kohdassa 8 PGK-pro-: 25 moottorissa ja eristämään PGK:n 5'-sivuavan sekvenssin 39bp-fragmentti, joka sisältää tämän Xbal-pään sekä Sau3A-pään.
Kuvio 14 valaisee kaaviomaisesti 300bp-fragmentin konstruktiota, joka sisältää yllä esitetyn 39bp-fragmen-30 tin, ja lisäksi PGK 5'-sivuavan sekvenssin (265 bp) PvuI:-stä Sau3A:han (ks. kuvio 11) sekä EcoRI-kohdan Xbal:n vieressä.
Kuvio 15 valaisee kaaviomaisesti 1500 bp-PGK promoottori-fragmentin (HindiII/EcoRI) konstruktiota, johon 35 sisältyy kuviossa 14 konstruoidun fragmentin lisäksi 1300 2i 86559 bp-Hindlll-PvuI-fragmentti PGK 5'-sivuavasta sekvenssistä (ks. kuvio 11).
Kuvio 16 valaisee ekspressiovektorin koostumusta ihmisen interferonia varten hiivassa ja se sisältää modi-5 fioidun PGK-promoottorin, hiivan PGK-geenin IFN-Y cDNA ja terminaattorialueen, kuten tässä yhteydessä kuvataan yksityiskohtaisemmin .
A. IFN-Y mRNA:n lähde
Perifeerisen veren lymfosyytit (PBLs) olivat peräi-10 sin ihmisluovuttajista, joista ne saatiin leukoforeesin avulla. PBL:t puhdistettiin edelleen Ficoll-Hypaque-gra-dienttisentrifugoinnin avulla ja sitten niitä viljeltiin konsentraationa 5 x 106 solua/ml RPMI 1640:a, 1 % L-glu-tamiinia, 25 mM HEPES:iä sekä 1 % penisilliini-streotomy-15 siiniä sisältävässä liuoksessa (Gibco, Grand Island, NY). Nämä solut indusoitiin IFN-Y:n tuottamiseksi mitogeenisel-la stafylokokkienterotoksiini B:llä (1, pg/ml) ja niitä viljeltiin 24 - 48 tunnin ajan 37 °C:ssa 5-%:isessa C02:-ssa. PBL-viljelmiin lisättiin desasetyylitymosiini-a-1:a 20 (0,1 pg/ml) IFN-Y-aktiivisuuden suhteellisen saannon li säämiseksi .
B. Lähetti-RNA:n eristäminen PBL-viljelmistä uutettiin kokonais-RNA oleellisesti, kuten Berger, S.L. et ai. (33) ovat kuvanneet. Solut 25 koottiin sentrifugoimalla ja liettämällä ne sitten uudelleen 10 mM NaCl:iin, 10 mM Tris-HCl:iin (pH 7,5), 1,5 mM MgCl2:iin sekä 10 mM ribonukleosidivanadyylikompleksiin. Solut hajotettiin lisäämällä NP-40:a (1 % lopullisesta konsentraatiosta), nukleukset koottiin sentrifugoimalla. 30 Supernatantti sisälsi kokonais-RNA:n, jota puhdistettiin edelleen moninkertaisilla fenoli- ja kloroformiuuttamisil-la. Vesijae tehtiin 0,2 M:ksi NaCl:n suhteen ja sitten kokonais-RNA seostettiin lisäämällä kaksi tilavuutta etanolia. Indusoimattomista (ei-stimuloiduista) viljelmistä RNA 35 eristettiin samoin menetelmin. Käytettiin oligo-dT-sellu- 22 86 559 loosakromatografiaa mRNA:n puhdistamiseksi kokonais-RNA-valmisteista (34). Tyypilliset saannot 1-2 litrasta viljeltyjä PBL:iä olivat 5 - 10 mg kokonais-RNA:a ja 50 - 200 mg poly(A)+RNA:a.
5 C. mRNA:n koon mukainen fraktiointi mRNA-valmisteiden fraktiointiin käytettiin kahta menetelmää. Näitä menetelmiä käytettiin itsenäisesti (pikemmin kuin yhdistettyinä) ja kumpikin menetelmä kartutti merkittävästi IFN-Ύ mRNA:a.
10 mRNA:n fraktiointiin käytettiin sakkaroosigradient- tisentrifugointia formamididenaturoimisaineen läsnäollessa. Gradientit, joissa oli 5 - 25 % sakkaroosia 70-%:ises-sa formamidissa (32), sentrifugoitiin 154 000 x g:llä 19 tunnin ajan 20 °C:ssa. Peräkkäiset jakeet (0,5 ml) pois-15 tettiin sitten gradientin yläosasta, saostettiin etanolilla ja alikvootti ruiskutettiin Xenopus laevis oosyytteihin mRNArn translaatiota varten (35). Huoneen lämpötilassa suoritetun 24 tunnin pituisen inkubaation jälkeen virusten vastainen aktiivisuus määritettiin elatusaineesta sytopaa-20 ttisen vaikutuksen standardiestomäärityksen avulla käyttämällä (Vesicular Stomatitis) rakkulasuutulehdusvirusta (Indianakanta) tai Encephalomyocarditis-virusta, WISH (ihmisen amnion) soluilla Stewartin kuvaamalla tavalla (36), paitsi että näytteitä inkuboitiin solujen kanssa 24 tunnin . 25 ajan (neljän tunnin sijaan) ennen kuin niitä käsiteltiin viruksella. Sakkaroosigradientissa fraktioidussa RNA:ssa havaittiin sitten kaksi aktiivisuushuippua (kuvio 1). Yksi piikki sedimentoitui 12S:n lasketun koon mukana ja se sisälsi 100 - 400 yksikköä/ml viruksenvastaista aktiivisuut-30 ta (IFN-a-standardiin) verrattuna mikrogrammaa kohti ruiskutettua RNA:a. Toinen aktiivisuuspiikki sedimentoitui 16S ja se sisälsi noin puolet hitaammin sedimentoituvan piikin aktiivisuudesta. Kukin näistä aktiivisuuspiikeistä näyttää johtuvan IFN-Y:sta, koska yhtään aktiivisuutta ei havait-35 tu, kun samat jakeet määritettiin härän solulinjalla 23 86 559 (MDBK), jota ei suojattu ihmisen IFN-Y:lla. Sekä IFN-a-aktiivisuus että IFN-B-aktiivisuus olisi helposti havaittu MDBK-määrityksen avulla (5).
mRNA:n (200 /pg) fraktiointi suoritettiin elektro-5 foreesin avulla happamilla urea-agaroosigeeleillä. Agaroo-sigeelilevy (37, 38) koostui 1,75 %:sta agaroosia, 0,025 M natriumsitraattia, pH 3,8 ja 6 M ureaa. Elektroforeesia ajettiin seitsemän tunnin ajan 25 milliampeerin virralla 4 eC:ssa. Sitten geeli fraktioitiin partaveitsen terällä. 10 Yksityiset viipaleet sulatettiin 70 eC:ssa ja uutettiin kaksi kertaa fenolilla ja kerran kloroformilla. Jakeet saostettiin sitten etanolilla ja sen jälkeen niistä määritettiin IFN-Y mRNA ruiskuttamalla niitä Xenopus laevis oosyytteihin sekä suorittamalla viruksenvastaisen aktiivi-15 suuden määritys. Geelin fraktioiduissa näytteissä havaittiin vain yksi aktiivisuushuippu (kuvio 2). Tämä huippu yhtyi 18S RNA:n kanssa ja sen aktiivisuus oli 600 yksik-köä/ml mikrogrammaa kohti ruiskutettua RNA:a. Tämä aktiivisuus näytti olevan myös IFN-Y-spesifinen, koska se ei 20 suojannut MDBK-soluja.
Tämä aktiivisuushuippujen välinen poikkeamus koon suhteen, joka havaittiin sakkaroosigradienteissa (12S ja 16S) sekä happamilla ureageeleillä (18S), voidaan selittää sen havainnon perusteella, että fraktiointimenetelmiä ei ·. 25 ole suoritettu täysin denaturoivissa olosuhteissa.
D. IFN-Y-sekvenssejä sisältävän pesäkekirjastonval- mistus 3 pg geelillä fraktioitua mRNA:a käytettiin kaksi säikeisen cDNA:n valmistukseen standardimenetelmin (26, 30 39). cDNA fraktioitiin koon mukaan 6-%:isella polyakryyli- amidi geelillä. Elektroeluoitiin kaksi koon mukaista jaet-ta, 800 - 1500 bp (138 ng) ja >1500 bp (204 ng). 35 ng:n eriä kunkin koon mukaista cDNA:a jatkettiin desoksiC-täh-teillä käyttämällä terminaalista desoksinukleotidyyli 35 transferaasia (40) ja jäähdytettiin hitaasti 300 ng:n ka- 24 86 559 kanssa plasmidi pBR322 (41), johon oli samalla tavalla liitetty desoksiG-tähteitä PstI kohdassa (40). Kukin jäähdytetty seos transformoitiin sitten E. coli K12 kantaan 294. Arviolta saatiin 8 000 transformanttia 800 - 1500 5 bpcDNArn ja 400 transformanttia saatiin >1500 bp-cDNA:n kanssa.
E. Pesäkekirjaston seulonta indusoitujen cDNA:iden suhteen
Pesäkkeet siirrostettiin yksitellen LB (58) + 5pg-10 /ml tetrasykliiniä sisältävien mikrotiitterilevyjen sy vennyksiin ja niitä säilytettiin -20 °C:ssa, sen jälkeen kun oli lisätty 7 % DMS0. Nitroselluloosasuotimilla viljeltiin pesäkekirjaston kahta kopiota ja kustakin pesäkkeestä pe räisin oleva DNA kiinnitettiin suodattimelle 15 Grunstein Hogness-menetelmän avulla (42).
32P:llä merkatut cDNA-koettimet valmistettiin käyttämällä mRNA:n 18S-geelijaetta, joka oli peräisin indusoiduista sekä indusoimattomista PBL-viljelmistä. Oligo dT12-1Θ oli käytetty aluke (primer) ja reaktio-olosuhteet on 20 kuvattu aiemmin (1). Suotimet, jotka sisälsivät 8 000 transformanttia, jotka olivat peräisin 600 - 1500 bp:n DNA-jakeesta sekä 400 transformanttia, jotka olivat peräisin >1500 bp:n emäsjakeesta, hybridisoitiin 20 x 106 cpm:n kanssa indusoitua 32P-cDNA:a. Suotimien kaksoissarja hyb-: : 25 ridisoitiin 20 x 106 cpm:n kanssa indusoimatonta 32P-cDNA:a.
Hybridisaatio oli 16 tunnin mittainen ja käytettiin Frit-sch et ai.:n (43) kuvaa mia olosuhteita. Suotimet pestiin perusteellisesti (43) ja valotettiin sitten Kodak XR-5 röntgensädefilmille tehostamalla filmejä Du Pont Light-. 30 ning-Plus:ssa 16 - 48 tunnin ajan. Verrattiin kunkin pe säkkeen hybridisaatiota kahden koettimen kanssa. Suunnilleen 40 % pesäkkeistä hybridisoitui selvästi molempien koettimien kanssa, kun taas lähes 50 % pesäkkeistä ei hybridisoitunut kummankaan koettimen kanssa (esitetty .35 kuviossa 3). 124 pesäkettä hybridisoitui merkitsevästi indusoidun koettimen kanssa, mutta huomaamattomasti tai hei- 25 86 559 kommin indusoimattoman koettimen kanssa. Nämä pesäkkeet siirrostettiin yksitellen mikrotiitterilevyjen syvennyksiin, kasvatettiin ja siirrettiin nitroselluloosasuodat-timille sekä hybridisoitiin kahden saman koettimen kanssa 5 kuten edellä on kuvattu. Nopealla menetelmällä (44) kustakin näistä pesäkkeistä eristetty plasmidi-DNA sidottiin myös nitroselluloosasuodattimiin ja hybridisoitiin indusoitujen ja indusoimattomien koettimien kanssa. 22 pesäkkeestä peräisin oleva DNA hybridisoitiin ainoastaan indu-10 soidun koettimen kanssa ja niitä nimitettiin "indusoiduiksi" pesäkkeiksi.
F. Indusoitujen pesäkkeiden karakterisointi Plasmidi-DNA valmistettiin 5 indusoidusta pesäkkeestä (46) ja käytettiin cDNA-inserttien karakterisointiin. 15 Viiden indusoidun plasmidin (p67, p68, p69, p71 sekä p72) restriktioendonukleaasi-kartoituksen perusteella neljällä oli samankaltaiset restriktionukleaasikartat. Näillä neljällä plasmidilla (p67, p69, p71 ja p72) oli kullakin neljä Ddel-kohtaa, kaksi Hinfl-kohtaa sekä yksi ainoa Rsal-20 kohta cDNA-insertissä. Viides plasmidi (p68) sisälsi yhteisen Ddel-fragmentin ja näytti olevan lyhyt cDNA-kloo-ni, joka oli sukua muille neljälle plasmidille. Restrik-tio nukleaasikartoituksen perusteella päätelty homologia varmistettiin hybridisaation avulla. p67-plasmidin 600 bp 25 Ddel-fragmentista valmistettiin (47) 32P:llä merkattu DNA- koetin ja sitä käytettiin hybridisaatioon (42), joka suoritettiin muihin indusoituihin pesäkkeisiin. Kaikki viisi restriktionukleaasilla kartoitetuista pesäkkeistä rlsti-hybridisoitiin tämän koettimen kanssa, kuten tapahtui 17 30 muulle pesäkkeelle 124 pesäkkeestä, jotka oli valittu indusoidun/ indusoimattoman seulonnan avulla. cDNA-insertion pituus kussakin näissä ristiin hybridisoituvissa plasmi-deissa määritettiin Pstl:llä suoritetun pilkkomisen ja geelielektroforeesin avulla. Klooni, jossa oli pisin cDNA-35 insertio, näytti olevan klooni 69, jossa insertion pituus 26 8 6 5 59 oli 1 200 - 1 400 bp. Tätä DNA käytettiin kaikkiin muihin kokeisiin, ja sen restriktioendonukleaasikartta esitetään kuviossa 4.
cDNA-insertion p69:ssä osoitettiin olevan IFN-γ 5 cDNA ekspressiotuotteidensa perusteella, joita oli valmistettu kolmessa itsenäisessä, viruksenvastaista aktiivisuutta tuottavassa ekspressiojärjestelmässä, kuten myöhemmin yksityiskohtaisemmin kuvataan.
G. p69:n cDNA-insertion sekvenssianalyysi 10 Plasmidi p69 cDNA-insertion täydellinen nukleoti- disekvenssi määritettiin didesoksinukleotidiketjupääteme-netelmällä (48) M13 vektori mp7:ään (49) suoritetun fragmenttien alakloonauksen jälkeen ja käyttäen Maxam-Gilber-tin kemiallista menetelmää (52). Pisin avoin lukukehys 15 koodaa 166 aminohappoa käsittävän proteiinin, joka on esitetty kuviossa 5. Ensimmäinen koodattu tähde on ensimmäinen metkodoni, joka tulee vastaan cDNArn 5'-päässä. Amino-päässä sijaitsevat 20 ensimmäistä tähdettä toimivat luultavasti jäljelle jäävän 146 aminohapon muodostumisen sig-20 naalisekvenssinä. Tällä oletetulla signaalisekvenssillä on yhteisiä piirteitä muiden karakterisoitujen signaalisek-venssien, kuten esim. koon ja hydrofobisuuden kanssa. Edelleen, oletetusta pilkkoutumissekvenssistä havaitut neljä aminohappoa (ser-leu-gly-cys) ovat identtisiä neljän 25 tähteen kanssa, jotka löytyvät monen leukosyytti-interferonin [LelF B, C, D, F ja H (2)] pilkkoutumiskohdasta. 146 aminohapon koodatun kypsän aminohapposekvenssin, johon tästä lähtien viitataan ilmaisulla "ihmisen yhdistelmä-immuuni-interferoni", molekyylipaino on 17 140.
30 Koodatussa proteiinisekvenssissä on kaksi mahdol lista glykosylointi-kohtaa, aminohapoissa 28 - 30 (asn-gly-thr) sekä aminohapoissa 100 - 102 (asn-tyr-ser). Näiden kohtien olemassaolo on yhdenmukainen ihmisen IFN-Y :n havaitun glykosyloinnin kanssa (6,51). Lisäksi ainoat, :· 35 kaksi kysteiinitähdettä (asemat 1 ja 3) ovat steerisesti 27 8 6 559 liian läheisiä muodostaakseen disulfidisillan, mikä vastaa pelkistimien, kuten esim. B-merkaptoetanolin (51), läsnäollessa havaittua IFN- γ:η stabilisuutta. Päätetty kypsä aminohapposekvenssi on yleisesti jokseenkin emäksinen, 5 siinä on kaikkiaan 30 lysiini-, arginiini- sekä histidii-nitähdettä ja vain kaikkiaan 19 asparagiinija glutamiini-happotähdettä.
IFN-Y :n mRNA-rakenne, kuten on päätetty plasmidi p69:n DNA-sekvenssin perusteella, eroaa selvästi IFN-o:n 10 (1, 2) tai IFN-B:n (5) mRNA:sta. Kuten kuviossa 6 on esi tetty, IFN-Y:n koodausalue on lyhyempi, kun taas 5'-trans-latoimattomat tai 3*-translatoimattomat alueet ovat pitempiä kuin IFN-α tai IFN-fl.
H. Ihmisen yhdistelmä-immuuni-interferonin ekspres-15 sio E. colissa
Viitaten kuvioon 7, 50 pg plasmidi p69:ää pilkottiin Pstlrllä ja 1 250 emäsparin pituinen insertti eristettiin 6 %:lla polyakryyliamidigeelillä suoritetulla gee-lielektroforeesilla. Geelistä elektroeluoitiin arviolta 20 noin 10 pg tätä inserttiä. 5 pg:aa tätä PstI-fragmenttia pilkottiin osittain kolmella yksiköllä BstNI:ä (Bethesda Research Labs) 15 minuutin ajan 37 °C ja reaktioseos puhdistettiin 6-%:isella polyakryyliamidigeelillä. Haluttua 1 100 emäspari-BstNI-Pstl-fragmenttia saatiin takaisin : : 25 arviolta 0,5 pg. Kaksi osoitettua desoksioligonukleotidiä, 5'-dAATTCATGTGTTATTGTC sekä 5'-dTGACAATAACACATG (kuvio 7), syntetisoitiin fosfotriesterimenetelmällä (53) ja fosfo-ryloitiin seuraavasti. 100 pmoolia kutakin desoksioligonukleotidiä yhdistettiin 30 pl:ssa 60 mM Tris-HCl:a (pH 30 8), 10 mM MgCl2:a, 15 mM β-merkaptoetanolia sekä 240 pCi (Y_32P)ATP:a (Amersham, 5000 Ci/mmoolia). Lisättiin 12 yksikköä T4-polynukleotidikinaasia ja reaktion annettiin edetä 37 °C:ssa 30 minuutin ajan. Lisättiin 1 pl 10 mM ATP:a ja reaktion annettiin jatkua vielä 20 minuutin ajan. 35 0-OH/CHCl3:11a suoritetun uuttamisen jälkeen oligomeerit 28 86559 yhdistettiin 0,25 pg:n kanssa 1100 emäsparia käsittävää BstNI-Pstl-fragmenttia ja seostettiin etanolilla. Nämä fragmentit liitettiin yhteen 20 °C:ssa kahden tunnin aikana, 30 pl:ssa 20 mM Tris-HCl:a (pH 7,5), 10 mM MgC12:a, 5 10 mM ditiotreitolia, 0,5 mM ATP;a ja 10 yksikköä T4 DNA- ligaasia. Seosta uutettiin tunnin ajan 39 yksiköllä Pstl:ä ja 30 yksiköllä EcoRI:tä (koossapysyvien päiden sitoutumisen kautta tapahtuvan polymeroitumisen eliminoimiseksi) ja suoritettiin elektroforeesi 6-%:isella polyakryyli-10 amidigeelillä. 1 115 emäsparia käsittävä tuote (110 000 cpm) saatiin takaisin elektroeluution avulla.
Plasmidi pLelF A trp 103 (kuvio 7) on plasmidi pLelF A 25:n (1) johdannainen, josta EcoRI-kohta distaali-sesti LelF A-geeniin nähden on poistettu (27). 3 pg pLelF 15 A trp 103:a pilkottiin 20 yksiköllä EcoRI:ä ja 20 yksiköllä Pstl:ä 90 minuutin ajan 37 °C:ssa ja suoritettiin elektroforeesi 6-%:isella polyakryyliamidigeelillä. Elektroeluution avulla saatiin takaisin suuri(“3 900 emäsparia) vektorifragmentti. 1 115 emäsparin pituinen EcoRI-Pstl 20 IFN-Y DNA-fragmentti liitettiin 0,15 pg:n kanssa tätä valmistettua vektoria E. coli K-12 kannan 294 (ATCC nro 31446) transformaatio antoi 120 tetrasykliinille resistenttiä pesäkettä. Plasmidi DNA valmistettiin 60:stä näitä transformantteja ja pilkottiin EcoRI:llä ja Pstl:llä. Kol-25 me näistä plasmideista sisälsi halutun 1 115 emäsparia käsittävän EcoRI-Pstl-fragmentin. DNA-sekvenssianalyysi varmisti, että näillä plasmideilla oli haluttu nukleotidi-sekvenssi liitoskohdissa trp-promoottorin, synteettisen DNA:n ja cDNA:n välillä. Yksi näistä plasmideista, pIFN-γ 30 trp 48 valittiin lisätutkimusta varten. Tätä plasmidia käytettiin transformoimaan E. coli K-12 kanta W3110 (ATCC nro 27325).
I. IFN- :a koodaavan sekvenssin geenirakenne
Southern-hybridisaation avulla analysoitiin IFN- :a : 35 koodaavan geenin rakenne. Tässä menetelmässä (54), 5 pg 29 86559 suurimolekyylipainoista ihmisen lymfosyytti-DNA:a (valmistettu kuten viitteessä 55 on esitetty) pilkotaan täydellisesti erilaisilla restriktioendonukleaaseilla, suoritetaan elektroforeesi l-%:isillä agaroosigeeleillä (56) ja 5 siirretään nitroselluloosasuodattimelle (54). Valmistettiin 32P-merkattu DNA-koetin (47) p69:n cDNA-insertion 600 bp:n Ddel-fragmentista ja hybridisoitiin (43) nitrosellu-loosa-DNAsiirroksen kanssa. Koetinta, jossa oli 107 pulssia minuutissa, hybridisoitiin 16 tunnin ajan ja sitten se 10 pestiin kuvatulla tavalla (43). Kahdeksan eri ihmisluovut-tajilta saatua genomi-DNA:a pilkottiin EcoRI-restriktio-endonukleaasilla ja hybridisoitiin p69 32P-merkatun koettimen kanssa. Kuten on esitetty kuviossa 9, havaittiin kaksi selvää hybridisaatiosignaalia 8,8 kiloemäsparin (kbp) ja 15 2,0 kbp:n koolla, jotka oli määritetty vertailemalla liik kuvuutta Hindlll:11a pilkotun YDNA:n kanssa. Tämä voisi olla tulos kahdesta IFN-Y -geenistä tai yhdestä ainoasta geenistä, joka on pilkottu EcoRI-kohdalta. Koska p69 cDNA ei sisällä mitään EcoRIkohtaa, lopullisessa mRNA-trans-20 kriptiossa ilmenemätön geenin osa (introni), sisäisen EcoRI-kohdan kanssa olisi välttämätön selittämään yksinkertaisen geenin. Näiden mahdollisuuksien välisen eron tekemiseksi suoritettiin toinen Southernhybridisaatio saman mallin kanssa yksinkertaisen ihmis-DNA:n viittä muuta '..25 endonukleaasi-pilkkoutumistuotetta vastaan (kuvio 10).
Havaittiin kaksi hybridisoituvaa DNA-fragmenttia kahden muun endonukleaasi-pilkkoutumistuotteen, PvuII:n (6,7 kbp ja 4,0 kbp) ja HincII:n (2,5 kbp ja 2,2 kbp) kanssa. Kuitenkin kolme endonukleaasipilkkomistapaa tuottavat vain 30 yhden ainoan hybridisoituvan DNA-fragmentin: HindiII (9,0 kbp), Bglll (11,5 kbp) sekä BamHI (9,5 kbp). Kaksi IFN-Y-geeniä tulisi olla liittyneenä epätavallisen läheisellä etäisyydellä (vähemmän kuin 9,0 kbp) sisältyäkseen samaan hybridisoituvaan Hindlll fragmenttiin. Tämä tulos viittaa 35 siihen, että ihmisen genomi-DNA:ssa on vain yksi homologi- 30 8 6 559 nen IFN-γ-geeni (erona, läheisiin IFN-a-geeneihin, josta on useampi) ja että tämä geeni on yhden tai useamman, EcoRI-, PvuII- ja Hindi-kohtia sisältämän intronin pilkkoma. Tätä käsitystä tuki hybridisaatio, joka suoritettiin 5 hybridisoimalla p69::stä cDNA:n 3'-alue, jolle ei translaatiota ole suoritettu (130 bp:n Ddel-fragmentti 860 bp -990 bp: kuviossa 5) ihmisen genomi-DNA:n EcoRI-pilkkomis-tuotetta vastaan. Vain 2,0 kbp:n EcoRI-fragmentti hybridi-soitui tähän malliin antaen aiheen olettaa, että tämä 10 fragmentti sisältää 3'-sekvenssejä, joille translaatiota ei ole suoritettu, kun taas 8,8 kbp:n EcoRI-fragmentti sisältää 5'-sekvenssejä. IFN-Y:n geenirakenne (yksi geeni, jossa on ainakin yksi introni) eroaa selvästi IFN-a:sta [multippeligeenejä (2) ilman introneja (56)] tai IFN-B:sta 15 [yksi geeni ilman introneja (57)].
J. Bakteeriuutteiden valmistus
Yli yön kasvatettua E. coli W3110/pIFN-^ trp 84:n viljelmää Luria-elatusliemessä, johon oli lisätty 5 pg tetrasykliiniä millilitraa kohti, käytettiin 1:100 laimen-20 nuksena M9 (58 )-elatusaineen, joka sisälsi 0,2 % glukoosia, 0,5 % kasaminohappoja sekä 5 pg tetrasykliiniä millilitraa kohti, ymppäykseen. Indoliakryylihappoa lisättiin lopulliseen konsentraatioon, joka oli 20 pg millilitraa kohti, kun A550 oli 0,l:n ja 0,2:n välillä. Sentrifugoimalla 25 koottiin 10 ml:n näytteet, joiden A550 * 1,0 ja suspensoi-tiin uudelleen välittömästi 1 ml:aan fosfaatilla puskuroitua keittosuolaliuosta, joka sisälsi häränseerumin albumiinia (PBS-BSA) 1 mg millilitraa kohti. Solut rikottiin äänikäsittelyllä ja solunpirstaleet poistettiin sentri-30 fugoimalla. Supernatantit säilytettiin 4 eC:ssa määritykseen saakka. Supernatantteihin sisältyvä interferonlaktii-vlsuus määritettiin 250 yksiköksi/ml sytopaattisen vaikutuksen (CPE) inhibiitiomäärityksen avulla vertaamalla IFN-α-standardeihin.
35 K. Hiivakantojen transformaatiot ja elatusaineet
Hiivakantoja transformoitiin aiemmin kuvatulla ta- 3i 86 559 valla (59). E. coll -kantaa JA300 (thr leuB6 thi thyA trpC1117 hsdm' hsdR* strR) (20) käytettiin toiminnallisen TRPI-geenin sisältävien plasmidien valintaan. Hiivakantaa RH218, jolla oli genotyyppi (a trpl gal2 SUC2 mal CUPI) 5 (18), käytettiin hiivan transformaation isäntänä. RH218 on talletettu rajoituksetta talletuslaitoksen American Type Culture Collection ATCC nro:lie 44076. M9 (minimaalinen elatusaine), jossa oli 0,25 % kasaminohappoja (CAA) sekä LB (rikas elatusaine) olivat Millerin (58) kuvaamien auto-10 klavoinnin ja jäähdytyksen jälkeen oli lisätty 20 pg/ml ampisilliiniä (Sigma). Hiiva kasvatettiin seuraavissa ela-tusaineissa: YEPD sisälsi 1 % hiivauutetta, 2 % peptonia ja 2 % glukoosia ± 3 % Difco-agaria. YNB + CAA sisälsi 6,7 g hiivan typpiperustaa (ilman aminohappoja) (YNB) (Difco), 15 10 mg adeniinia, 10 mg urasiilia, 5 g CAA:a, 20 g glukoo sia ja ± 30 g agaria litraa kohti.
L. Hiivan ekspressiovektorin konstruointi 1. 10 pg YRpT:a (14, 15, 16) pilkottiin EcoRl:llä. Syntyvät tahmeat päät tehtiin tylpiksi käyttämällä DNA-20 polymeraasi I:a (Klenow-fragmentti). Vektori ja insertti ajettiin l-%:isella agaroosi (Sea Kem)-geelillä, leikattiin geelistä, elektroeluoitiin ja uutettiin 2X yhtä suurilla tilavuuksilla kloroformia ja fenolia ennen etanolilla suoritettua saostusta. Syntyvät tylppäpäiset DNA-mole-25 kyylit sidottiin sitten yhteen 50 μ1:η lopullisessa tilavuudessa 12 tunnin aikana 12 °C:ssa. Tätä sidosseosta käytettiin sitten E. colin JA300 transformointiin ampisil-liiniresistentiksi ja tryptofaaniprototrofiksi. Eristettiin plasmidit, jotka sisälsivät TRPI-geenin molemmissa 30 suuntauksissa. pFRWl:llä oli TRPI-geeni samassa suunnassa kuin YRp7, kun taas pFRW2:lla TRPI-geeni oli vastakkaisesti suuntautunut.
20 pg:lle pFRW2 annettiin lineaarinen muoto HindIII:n avulla ja ajettiin elektroforeesi l-%:isella 35 agaroosigeelillä. Geelistä eluoitiin lineaariset molekyy- 32 8 6 559 lit ja sitten 200 ng liitettiin 500 ng:n kanssa plasmidin pBl (13) 3,1 kb:n Hindlll-inserttiä, joka on restriktio-fragmentti ja sisältää hiivan 3-fosfoglyseraattikinaasi-geenin. Ligaatioseosta käytettiin E. coli-kannan 294 5 transformointiin ampisilliinille resistentiksi ja tetrasy-kliinille herkäksi. Yhdestä sellaisesta rekombinantista valmistetulla plasmidilla oli intakti TRPl-geeni pBl:n insertti-DNA:n 3,1 kbp:n Hindlll-fragmentin ollessa tetra-sykliiniresistenssigeenin HindiII-kohdassa. Tämä plasmidi 10 on pFRM31. 5 pg pFRM31:a pilkottiin täydellisesti EcoRl:-llä, uutettiin kaksi kertaa fenolilla ja kloroformilla ja saostettiin sitten etanolilla. Molekyylin koossapysyvät päät täydennettiin käyttämällä DNA-polymeraasi I:a (Kle-now-fragmentti) reaktiossa, joka suoritettiin käyttäen 250 15 μΜ kutakin desoksinukleosiditrifosfaattia. Reaktio suoritettiin 20 minuutin aikana 14 °C:ssa, jonka ajan kuluttua DNA uutettiin kaksi kertaa fenoli-kloroformilla ja saostettiin sitten etanolilla. Uudelleen lietetty DNA pilkottiin sitten täydellisesti Clalrllä ja elektroforeesi suo-20 ritettiin 6-%:isella akryyliamidigeelillä. Vektorifrag- mentti eluoitiin geelistä, uutettiin fenoli-kloroformilla ja soastettiin etanolilla.
Ihmiseltä puhdistetun 3-fosfoglyseraattientsyymin kuusi N-terminaalista aminohappoa ovat seuraavat: 25 1-2-3-4-5-6 SER - LEU - SER - HSM - LYS - LEU -
Yksi 141 bp Sau3A-Sau3A-restriktiofragmentin DNA-30 sekvenssistä saaduista lukukehyksistä (sisältäen sisäisen
Hindi-kohdan; katso PGK-restriktiokartta, kuvio 11) tuottaa seuraavan aminohapposekvenssin.
1-2-3-4-5-6 35 MET - SER - LEU - SER - SER - LYS - LEU - 33 86 559
Alkuunpanija-metioniinin poistamisen jälkeen todetaan, että PGK:n terminaalisella aminohapposekvenssillä on Ihmisen PGK:n N-terminaalisen aminohapposekvenssin kanssa viisi aminohappohomologiaa kuudesta aminohaposta.
5 Tämän sekvenssinmuodostuksen perusteella oletetaan, että hiivan PGK-rakennegeenin alkua koodaa DNA, joka sijaitsee pBl:n 141bp Sau3A-restriktiofragmentissa. Aiemman työn (20) perusteella PGK-mRNA:a tarkoin määräävät DNA-sekvenssit saattavat olla peräisin Hindlll-fragmentin täs-10 tä alueesta. 141 bp Sau3A-fragmentin lisäsekventointi antaa vielä PGK-promoottorin DNA-sekvenssin (kuvio 12).
Standardimenetelmin syntetisoitiin synteettinen oligonukleotidi, jonka sekvenssi oli 5'ATTTGTTGTAAA3' [Crea et ai.. Nucleic Acids Res. 8, 2331 (1980)]. 100 ng 15 tätä aluetta merkattiin 5'-päässä käyttämällä 19 yksikköä T4-polynukleotidikinaasia 20 pl:ssa reaktioseosta, joka sisälsi myös 200 pCi (γ32-Ρ) ATP:ä. Tätä merkattua aluke-liuosta käytettiin alukekorjausreaktiossa, jonka oli suunniteltu olevan ensimmäisen vaiheen monivaiheisessa tapah-20 tumasarjassa EcoRI-restriktiokohdan sijoittamiseksi PGK 5'-sivuavaan DNA:hän, joka edeltää juuri PGK-rakennegeeni-sekvenssiä.
100 pg pBl:a (20) pilkottiin täydellisesti Haelll:-11a ja ajettiin sitten 6-%:isella polyakryyliamidigeelil-25 lä. Etidiumilla värjätyssä geelissä sijaitseva yksi vyöhyke (sisältäen PGK-promoottorialueen) eristettiin elektroe-luution avulla yllä kuvatulla tavalla. Tätä DNA:n 1 200 bp Haellipätkää käsiteltiin Hincli:11a ja ajettiin sitten 6-%:isella akryyliamidigeelillä. 650 bp-nauha eristettiin 30 elektroeluution avulla. Eristettiin 5 pg DNA:a. Tämä DNA:-n 650 bp:n Haelll-HincII-pätkä lietettiin uudelleen 20 pl-:aan H20:a, sekoitettiin sitten 20 pl:n kanssa fosforyloi-tua, yllä kuvattua alukeliuosta. Tätä seosta uutettiin kerran fenolikloroformilla ja saostettiin sitten etanolil-35 la. Kuivattu DNA lietettiin uudelleen 50 pl:aan H20:a ja 34 86 559 kuumennettiin sitten kiehuvassa vesihauteessa seitsemän minuutin ajan. Tämä liuos jäähdytettiin sitten nopeasti kuivajää-etanolihauteessa (10 - 20 sekuntia), siirrettiin sitten jää-vesihauteeseen. Tähän liuokseen lisättiin 50 μΐ 5 liuosta, joka sisälsi 10 μΐ kymmenkertaista DNA-polyme-raasi I-puskuria (Boehringer Mannheim), 10 μΐ aiemmin valmistettua liuosta, jossa oli 2,5 mM kutakin desoksinukleo-siditrifosfaattia (dATP, dTTP, dGTP ja dCTP), 25 μΐ H20:a sekä viisi yksikköä DNA-polymeraasi I:a, Klenow-fragment-10 tia. Tätä 100 μ1:η reaktioseosta inkuboitiin 37 °C:ssa neljän tunnin ajan. Liuosta uutettiin sitten kerran feno-li-kloroformilla, saostettiin etanolilla, kuivattiin lyo-filisaation avulla ja tuotetta käsiteltiin sitten perusteellisesti 10 yksiköllä Sau3A. Tämä liuos ajettiin sit-15 ten 6-%:isella akryyliamidigeelillä. 39 bp:n kokoa vastaava vyöhyke leikattiin geelistä ja eluoitiin sitten yllä kuvatulla tavalla elektroeluution avulla. Tällä 39 bp:n pituisella nauhalla on yksi tylppä pää ja yksi Sau3A tahmea pää. Tämä palanen kloonattiin modifioituun pFIF trp 20 69-vektoriin (5). 10 pg:lle pFIF trp 69:ää annettiin lineaarinen muoto Xbal:llä, uutettiin yhden kerran fenoli-kloroformilla ja saostettiin sitten etanolilla. Xbal:n tahmea pää täydennettiin käyttämällä DNA-polymeraasi I Klenow-fragmenttia 50 pl:ssa reaktioseosta, joka sisälsi 25 250 μΜ kutakin nukleosiditrifosfaattia. Tämä DNA pilkot tiin BamHI:llä ja ajettiin sitten 6-%:isella akryyliamidigeelillä. Vektorifragmentti eristettiin geelistä elektroeluution avulla ja lietettiin uudelleen 20 pl:aan H20:a. 20 ng tätä vektoria liitettiin 20 ng:n kanssa 39 bp-frag-30 menttia, joka oli edellä valmistettu, neljän tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Yksi viidesosa ligaatioseoksesta käytettiin E. coli kannan 294 transformaatioon ampisillii-niresistentiksi (LB + 20 pg/ml amp maljoilla). Näistä transformanteista saadut plasmidit tutkittiin pikaseulon-35 tamenetelmällä (44). Yksi plasmidi, pPGK-39, valittiin 35 86559 sekvenssianalyysiä varten. 20 pg tätä plasmidia pilkottiin Xbal:llä, saostettiin etanolilla, käsiteltiin sitten 1 000 yksiköllä bakteeriperäistä alkalista fosfaasia 68 °-C:ssa 45 minuutin ajan. DNA uutettiin kolme kertaa fenoli-5 kloroformilla, saostettiin sitten etanolilla. Defosfory-loidut päät merkattiin 20 pl:ssa reaktioseosta, joka sisälsi 200 pCi (γ32-Ρ) ATP;a sekä 19 yksikköä T4-polynukleo-tidikinaasia. Plasmidi leikattiin Sall:llä ja ajettiin 6-%:isella akryyliamidigeelillä.
10 Merkattu inserttivyöhyke eristettiin geelistä ja sekvenssi määritettiin kemiallisella pilkkomismenetelmällä (52). Tämän promoottoripätkän DNA-sekvenssi 3'-päässä oli odotusten mukainen.
2. 312 bp PvuI-EcoRI PGK promoottorifragmentin kon-15 struktio
25 pg pPGK-39:ää (kuvio 13) pilkottiin samanaikaisesti Sall:llä ja Xbal:llä (viisi yksikköä kutakin), ajettiin sitten elektroforeesi 6-%:isella geelillä. Elektro-eluution avulla eristettiin 390 bp:n pituinen nauha, joka 20 sisälsi 39 bp promoottoripalan. Uudelleen lietetty DNA
käsiteltiin Sau3A:lla, elektroforeesi ajettiin sitten etnisellä akryyliamidigeelillä. 39 bp PGK promoottorinauha eristettiin elektroeluution avulla. Tämä DNA sisälsi
Sau3A-XbaI-fragmentilla PGK-promoottorin 5'-päästä 39 25 bp:a.
25 pg pBl:a käsiteltiin Pvulrllä ja Kpnlrllä, sitten suoritettiin elektroforeesi 6-%:isella akryyliamidigeelillä. DNA:n 8 kbp-nauha eristettiin elektroeluution avulla, käsiteltiin sitten Sau3A:lla ja elektroforeesi 30 ajettiin 6-%:isella akryyliamidigeelillä. PGK-promootto- rista (kuvio 11) eristettiin elektroeluution avulla 265 bp :n nauha.
Tämä DNA liitettiin sitten edellä saadun 39 bp:n promoottorifragmentin kanssa kahden tunnin kuluessa, huo-35 neen lämpötilassa. Ligaatioseosta pilkottiin Xbal:llä ja 36 86559
Pvul:llä, sitten suoritettiin elektroforeesi 6-%:isella akryyliamidigeelillä. 312 bp:n Xba-PvuI restriktiofrag-mentti eristettiin elektroeluution avulla, lisättiin sitten ligaatioseokseen, joka sisälsi 200 ng pBR322:a (41) 5 (eristetty aiemmin, vailla 162 bp:n PvuI-PstI restriktio-fragmenttia) sekä 200 ng Xbal-PstI LelF A cDNA-geeniä, joka on aiemmin eristetty 20 pg:sta pLelF trp A 25:a. Tätä kolmitekijäistä ligaatioseosta käytettiin transformoimaan E. coll kantaa 294 tetrasykliinille resistentiksi. Trans-10 formanttipesäkkeille suoritettiin pienoisseulonta ja yksi pesäkkeistä, pPGK-300 eristettiin, jolloin siinä oli 304 bp:a PGK 5’-sivuavaa DNA:a liittyneenä LelF A -geeniin pBR322 pohjaisessa vektorissa. LelF A -geenin 5'-päällä on seuraava sekvenssi. 5'-CTAGAATTC-3'. Täten Xbal-kohdan 15 liittäminen PGK-promoottorista tähän sekvenssiin tekee mahdolliseksi EcoRI-kohdan lisäämisen Xbal-kohtaan. Täten pPGK-300 sisältää osan PGK-promoottorista eristettynä PvuI-EcoRI-fragmenti ssa.
3. 1 500 pb:n EcoRI-EcoRI PGK promoottorifragmentin 20 konstruktio 10 pg pBlra pilkottiin Pvul:llä ja EcoRIrllä ja ajettiin 6-%:isella akryyliamidigeelillä. Elektroeluution avulla eristettiin 1,3 kb PvuI-EcoRI DNA-nauha PGK 5'-si vuavasta DNA:sta. 10 pg pPGK-300:a pilkottiin EcoRItn ja 25 Pvul:n avulla ja elektroeluution avulla eristettiin 312 bp:n promoottorifragmentti, sen jälkeen kun pilkkomis-seoksen elektroforeesi oli suoritettu 6-%:isella akryyliamidigeelillä. 5 pg FRL4 leikattiin EcoRI:n avulla, seostettiin etanolilla ja käsiteltiin sitten bakteeriperäi-30 sellä alkalisella fosfataasilla 68 eC:ssa 45 minuutin ajan. Fenoli/kloroformilla suoritetun kolmen uuttamisen, etanolisaostuksen ja 20 ml:aan H20:a suoritetun uudelleen-suspendoinnin jälkeen 200 ng vektoria liitettiin 100 ng:n kanssa 312 bp EcoRI PvuI DNA:a, joka oli peräisin pPGK-35 300:sta sekä 100 ng:n kanssa EcoRI-PvuI DNA:a, joka oli 37 86 559 peräisin pBl:stä. Ligaatioseosta käytettiin E, coli-kan-nan 294 transformointiin ampisilliinille resistentiksi. Yksi saaduista transformanteista oli pPGK-1500. Tämä plas-midi sisältää 1 500 bp:n PGK promoottorifragmentin DNA:n 5 EcoRI-EcoRI tai HindiII-EcoRI osana.
10 pg pPGK-1500 pilkottiin täydellisesti Clal:llä ja EcoRI:llä, sitten ajettiin pilkkomisseoksesta elektro foreesi 6-%:isella akryyliamidigeelillä. Elektroeluution avulla eristettiin 900 bp:n fragmentti, joka sisälsi PGK-10 promoottorin. 10 pg pIFN-γ trp 48:aa pilkottiin täydellisesti EcoRI:llä ja Hindi:llä ja siitä ajettiin elektroforeesi 6-%:isella akryyliamidigeelillä. Geelistä erotettiin elektroeluution avulla 938 bp:n nauha, joka sisälsi suoraan ekspressoituvan IFN-Y-cDNA:n.
15 Hiivan ekspressiovektori konstruoitiin kolmen fak torin reaktiossa liittämällä yhteen PGK-promoottorifrag-mentti (Clal-EcoRI-pätkällä), poistettu pFRM-31 ja edellä eristetty IFN-γ -cDNA. Sitomisreaktioseosta inkuboitiin 14 °C:ssa 12 tuntia. Ligaatioseosta käytettiin sitten 20 transformoimaan E. coli-kanta 294 ampisilliinille resistentiksi. Transformantteja analysoitiin sopivasti konstruoidun ekspressioplasmidin, pPGK-IFN-Y:n, läsnäolon suhteen (kuvio 16). Ekspressiojärjestelmän sisältämiä plasmideja käytettiin transformoimaan hiivakanta RH218:n sferoplaste-25 ja tryptofaaniprototrofeiksi agarissa, josta puuttui tryp-tofaani. Tämä rekombinanttihiiva analysoitiin ihmisen yh-distelmä-immuuniinterferonin läsnäolon suhteen.
Hiivauutteita valmistettiin seuraavasti: 10 ml viljelmiä kasvatettiin YNB + CAA:ssa, kunnes saavutettiin 30 A660“l-2, koottiin sentrifugoiden, lietettiin sitten uudel leen 500 pl:aan PBS-puskuria (20 mM NaH2P04, pH * 7,4, 150 mM NaCl). Lisättiin yhtä suuri tilavuus lasihelmiä (0,45 -0,5 mm) ja sitten seosta pyöritettiin kahden minuutin ajan. Uutteita sentrifugoitiin 30 sekuntia nopeudella 35 14 000 kierrosta minuutissa ja supernatantti poistettiin.
38 86 559
Supernatantin interferoniaktiivisuuden arvoksi määritettiin 16 000 yksikköä/ml käyttämällä CPE-inhibitiomääritys-tä ja vertaamalla IFN-a-standardiin.
M. Soluviljelmävektorin pSVf69:n konstruktio 5 342 emäsparin HindiII-PvuII-fragmentti, joka sulkee sisäänsä SV40 alun, muutettiin EcoRI-restriktiokohdan rajoittamaksi fragmentiksi. Hindlll-kohta muutettiin lisäämällä synteettinen oligomeeri (5'dAGCTGAATTC) ja PvuII-kohta muutettiin suorittamalla tylppäpääsidos EcoRI-koh-10 taan, joka täydennettiin käyttämällä polymeraasi I:a (Kle-now-fragmentti). Syntyvä EcoRI-fragmentti insertoitiin pML-l:n (28) EcoRIkohtaan. Plasmidi, jossa oli SV40 late-promoottori, joka oli suunnattu pois ampR-geenistä, modifioitiin edelleen poistamalla EcoRI-kohta, joka oli lähimpä-15 nä pML-l:n (27) ampR-geeniä.
Kloonatun HBV DNA:n (60) 1 023 emäsparin Hpal-Bgl-II-fragmentti eristettiin ja hepatitis B-viruksen HBV Hpalkohta muutettiin EcoRI-kohdaksi synteettisen oligomee-rin avulla (5'dGCGAATTCGC). Tämä EcoRI-Bglll rajoittunut 20 fragmentti kloonattiin yllä kuvatun plasmidin, jossa on SV40:n alku, EcoRI-BamHI-kohtiin.
Jäljelle jäävään EcoRI-kohtaan sijoitettiin IFN-Ύ-geeni p69:n 1 250 emäsparin Pstl-fragmentilla, sen jälkeen, kun Pstl-päät oli muutettu EcoRI-päiksi. Eristettiin 25 kloonit, joissa SV40 late-promoottori edelsi IFN-Y:n ra-kennegeeniä. Syntyvät plasmidit tuotiin sitten kudosvil-jelmäsoluihin (29) käyttämällä DEAE-dekstraani-tekniikkaa (61), joka oli siten modifioitu, että DEAE-dekstaanin läsnäollessa transfektio suoritettiin kahdeksan tunnin ku-30 luessa. Solujen elatusaineet vaihdettiin joka 2-3 päivän välein. Päivittäin poistettiin 200 μΐ interferonin elä-inkoetta varten. Tyypilliset saannot olivat 50 - 100 yksikköä/ml näytteissä, jotka määritettiin kolme tai neljä päivää transfektion jälkeen.
39 86 559
Analyysi osoittaa, että ekspressiotuotteelta puuttuu ihmisen yhdistelmä-immuuni-interferonin CYS-TYR-CYS-N-pääteosa (vrt. kuva 5), mikä tukee sitä, että signaali-peptidi pilkkoutuu CYS-GLN-liitoskohdassa (aminohapot 3 ja 5 4 kuvassa 5) niin, että kypsä polypeptidi itse asiassa koostuu 143 aminohaposta.
N. Ihmisen des-CYS-TYR-CYS-yhdistelmä-immuuni-in-terferonin osittainen puhdistus
Jotta tuotetaan suurempia eriä apinan soluista saa-10 tua ihmisen IFN-Y:a, kymmennellä 10 cm:n suuruisella maljalla transfektoitiin C0S-7-solujen tuoreita yksisoluker-roksia kaikkiaan 30 pg:lla pDL!F3:a, joka oli 110 ml:ssa DEAE-dekstraania (200 pg/ml DEAE-dekstraania 500 000 mole-kyylipaino, 0,05 M Tris pH, 7,5, DMEMrssä). 16 tunnin ku-15 luttua 37 °C:ssa maljoja pestiin kahdesti DMEM:llä. 15 ml tuoretta DMEM:a, johon oli lisätty 10 % naudan sikiöseeru-mia, 2 mM glutamiinia, 50 μ/ml penisilliini G:tä ja 50 mg/ml streptomysiiniä lisättiin sitten kullekin maljalle. Elatusaineet korvattiin seuraavana päivänä DMEM:llä, jossa 20 ei ollut seerumia. Tuoreita seerumittomia elatusaineita lisättiin sitten joka päivä. Kootut elatusaineet pidettiin 4°:ssa, kunnes ne määritettiin tai sidottiin CPGrhen. Kolmen ja neljän päivän ajalta saatujen transfektion jälkeisten, yhdistettyjen jakeiden havaittiin sisältävän oleelli-25 sesti kaiken aktiivisuuden.
O, 5 g CPG:a (kontrolloitu huokoinen lasi, Electro-nucleonics, CPG 350, huokoskoko 120/100) lisättiin 100 ml:aan solusupernatanttia ja seosta sekoitettiin kolmen tunnin ajan 4 °C:ssa. Pöytäsentrifugissa suoritetun lyhyen 30 sentrifugoinnin jälkeen laskeutuneet palloset pakattiin
pylvääseen ja pestiin perusteellisesti liuoksella, jossa oli 20 mM NaP04:a 1 M NaCl 0,1 % β-merkaptoetanolla, pH
7,2. Sitten aktiivisuus eluoitiin samalla puskurilla, joka sisälsi 30 % etyleeniglykolia ja jota seurasi lisäeluointi 35 yllä mainitulla puskurilla, joka sisälsi 50 % etyleenigly- 4o 86559 kolia. Pohjimmiltaan kaikki aktiivisuus oli sidottu CPG:-hen. 75 % eluoidusta aktiivisuudesta löydettiin fraktioissa, jotka eluoituivat 30-%:isella etyleeniglykolilla. Nämä jakeet yhdistettiin ja laimennettiin 20 mM NaP04-l M 5 NaCl:lla, pH 7,2, 10 %:n suuruiseen etyleeniglykolin lopulliseen konsentraatioon ja pantiin suoraan 10 ml:n suu-ruiseen Con A-Sepharose (Pharmacia) pylvääseen. 20 mM NaP04-l M NaClrlla, pH 7,2, suoritetun perusteellisen pesun jälkeen aktiivisuus eluoitiin 20 mM NaP04-l M NaCl-0,2 M a-10 metyyli-D-mannosidilla. Olennainen osa aktiivisuudesta (55 %) ei sitoutunut tähän lektiiniin. Aktiivisuudesta 45% eluoitui a-metyyli-D-mannosilla.
Farmaseuttiset koostumukset
Keksinnön mukaisia yhdisteitä voidaan formuloida 15 tunnetuilla menetelmillä farmaseuttisesti käyttökelpoisten koostumusten valmistamiseksi siten, että keksinnön mukainen interferonituote yhdistetään seokseksi farmaseuttisesti hyväksyttävän kantaja-apuaineen kanssa. Sopivia apuaineita ja niiden formulaatioita kuvaa E.W. Martin Remingto-20 nin Pharmaceutical Sciences -kirjassa, joka on viitteenä liitetty hakemukseen. Sellaiset koostumukset tulevat sisältämään tehokkaan määrän edellä kuvattua interferoni-proteiinia yhdessä sopivan määrän kanssa apuainetta isännälle tehokkaaseen annosteluun sopivien farmaseuttisesti 25 hyväksyttävien koostumusten valmistamiseksi.
A. Parenteraalinen annostelu
Edellä esitettyä ihmisen immuuni-interferonia saatetaan antaa parenteraalisesti kohteelle, joka tarvitsee kasvaimen- tai viruksenvastaista hoitoa sekä sellaisille, 30 joille aikaansaadaan immunosupressiivinen tila. Annos ja annostelunopeus saattaa olla yhdenmukainen muiden ihmis-interferonien kliinisissä tutkimuksissa yleisesti noudatetun käytön kanssa, esim. noin (1 - 10) x 106 yksikköä päivittäin ja kun on kysymyksessä 1 % suurempi aineiden puh-35 taus, todennäköisesti aina esim. 50 x 106 yksikköön saakka 4i 86 559 päivittäin. IFN-Ύ :n annokset voisivat olla merkittävästi suurempia suuremman tehon saavuttamiseksi, mikä johtuu siitä, että oleellisesti puuttuvat ihmisen proteiinit muut kuin IIN-Ύ mitkä proteiinit ihmiseltä peräisin olevissa 5 materiaaleissa saattavat indusoida ei-toivottuja vaikutuksia.
Eräänä esimerkkinä tässä yhteydessä käyttökelpoisesta, oleellisesti homogeeniselle IFN-yrlle sopivasta an-nosmuodosta on 3 mg IFN-Yjonka spesifinen aktiivisuus on 10 sanokaamme 2 x 108 U/mg, ja jota saatetaan liuottaa 25 m-l:aan 5N seerumialbumiini(ihmisen)-USP:hen, liuos lasketaan bakteerisuodattimen läpi ja suodatettu liuos jaetaan aseptisesti 100 pulloon, joista kukin sisältää 6 x 106 yksikköä puhdasta interferonia, joka soveltuu parenteraali-15 seen annosteluun. Pullot säilytetään mieluummin kylmässä (-20 °C) ennen käyttöä.
Eläinkokeita koskevat tiedot A. Viruksenvastaisen aktiivisuuden karakterisointi
Vasta-aine-neutralointia varten näytteet laimennet-20 tiin tarvittaessa PBS-BSA:lla konsentraatioon 500 - 1 000 yksikköä/ml. Yhtä suuria näytetilavuuksia inkuboitiin 2 -12 tunnin ajan 4 asteessa kaniinin antihumaanileukosyytti-, fibroblasti tai immuuni-interferoniantiseerumien sar-jalaimennusten kanssa. Anti-IFN-α ja -B saatiin National 25 Institute of Allergy and Infectious Disseases:lta.
Anti-IFN-Y valmistettiin käyttämällä IFN-Ύ:a (5-20- %:inen puhtaus), joka oli puhdistettu stimuloiduista perifeerisen veren lymfosyyteistä. Näytteitä sentrifugoitiin kolmen minuutin ajan nopeudella 12 000 x g kolmen minuutin ajan 30 ennen määritystä. Stabiliteetin testaamiseksi pH 2:ssa, näytteet säädettiin pH 2:een lisäämällä N HC1, inkuboitiin 2-12 tuntia 4e:ssa ja neutraloitiin lisäämällä IN NaOH:a ennen määritystä. Natriumdodekyylisulaatti (SDS)-herkkyyden testaamiseksi näytteitä inkuboitiin yhtä suuren tila-35 vuuden kanssa 0,2-%:ista SDS:a 2-12 tunnin ajan 4°:ssa, ennen määritystä.
42 86 559
\ I -H
3 3 p h h οι -μ P o C in
C w ' to ' I
•H ι σ\ μ cm in ^
0 MO (0 lO V 00 CM V
03 I s. ¢3 i—I I—1
Η C0> U
m o co a) a; u a a p x « <o \ 0)
X 2 P
- (** 3 C H 3 H rl S ‘ O CM 00 O O 00 1 G H o oo in m v in in v
2 O H M< CM v CM CM
h «o una
HP . 00 U
•η ω 3 p c o
(0 X
e ή « 01 ^ P X Ί P >i 2 O O C" ^ O'—-fe in vo ^ m co v 3 M CM V V (M i—i P 0) 3
C 3 φ (0 CQ O -H I
3 > 2 in in inooin
Η Ή lii (M (M I (M V CM
Ο Ή Η ί—1 ί—1 rl ί—I
03 P I X C^ « to C 0 o a) ί U C 2 in in in co in m
•Hfii t"' C~^ C'' v M M
««H rococo coco n P 03 c « •H >
H C
- o a) c iii
O 03 ο -Η -Η -H
• x μ p μ μ
M3 *0 C C C
ί-ι E « « (0 • -H >i a) co
CQ > H H Q β C C
0) 0) CO ·Η ·Η Ή p μ cc c >_ P P <#> -Η β H CQ -H ^
H -H CM -H I -H I -H I
03 (0 HC2C2C2 «3 viOhiOpLiiOh « In! OiO Xh 3Ch «h 43 86 559 Tämä taulukko Ilmaisee IFN-α, β- ja Ύ-standardeille ominaisen käyttäytymisen erilaisten käsittelyjen jälkeen. E. coll W3110/pIFN-Ύ trp 48:n ja COS-7/pSVY69:n tuottama interferoniaktiivisuus on hapolle herkkää, SDS-herkkää ja 5 immuuni-interferoniantiseerumi neutraloi sen. Sitä eivät neutraloi IFN-a:n tai -6:n vasta-aineet. Nämä tulokset varmistavat, että tässä järjestelmässä tuotetut tuotteet ovat immuuni-interferoneja ja että plasmidin p69 cDNA-in-sertio koodaa IFN-Y:a.
10 Puhdistus
Menetelmää, jolla IFN-Y voidaan puhdistaa esim. bakteereista, voidaan kuvata seuraavalla yleisellä kaaviolla: 1. Solujen uuttaminen soluja liuottavassa puskuris-15 sa, jolla on korkea johtokyky (noin pH 8:ssa), laskemalla solut korkeassa paineessa homogenisaattorin läpi, jäähdyttämällä effluentti jäähauteessa.
2. DNA:n saostaminen polyetyleeni-imiinilisäyksen avulla, samalla sekoittaen esim. 4 °C:ssa.
20 3. Bakteeriperäisten proteiinien pH-saostus, jol loin IFN-Y jää jälleen liuokseen.
4. Kiinteiden aineiden erottaminen sentrifugoimalla, 4e-C:ssa.
5. Supernatantin konsentrointi (pH:n uudelleensää-25 dön jälkeen), kuten esim. ultrasentrifugoinnin avulla.
6. Konsentraatin dialyysi puskuria vastaan, jolla on alhainen johtokyky.
7. Kiinteiden aineiden poistaminen sentrifugoiden, siten että IFN-Y jää liuokseen.
30 8. Ioninvaihtokromatografia ioninvaihtopylväässä eluoiden gradientilla, jolla on lisääntyvä ionivahvuus.
9. Kromatografia kalsiumfosfaattigeelillä eluoiden gradientilla, jossa on nouseva ionivahvuus.
10. Ioninvaihtokromatografia karboksimetyylisellu- 35 loosalla, heikosti denaturoivissa olosuhteissa, eluoiden gradientilla, jossa on nouseva ionivahvuus.
44 86 559 11. Erotus geelifiltraatiokromatografian avulla.
Edellä esitetty menetelmä tekee mahdolliseksi aineen sannot, joiden puhtaus on suurempi kuin 95 %.
Kyseessä oleva immuuni-interferoni on määritelty 5 määrätyn DNA-geenin ja deduktiivisen aminohapposekvenssin avulla - vrt. kuvio 5. Tulee ymmärtää, että kyseessä olevalla interferonilla on olemassa luonnollisia alleelisia variaatioita ja ne esiintyvät yksilöstä toiseen. Näitä variaatioita voidaan näyttää toteen kokonaissekvenssin 10 aminohappoeroin tai deleetioin, substituutioin, inserti-oin, inversioin tai aminohappolisäyksin, joita esiintyy mainitussa sekvenssissä.
Todella on mahdollisuuksia käyttää yhdistelmä-DNA-teknologiaa erilaisten ihmisen IFN-Ύ -johdannaisten val-15 alistukseen, jotka on eri tavoin modifioitu tuloksena olevien yksinkertaisten tai multippeleiden aminohapposubsti-tuutioiden, -deleetioiden, lisäysten tai syrjäytysten avulla.
Käytettävissä olevalla DNA:11a ja IFN-Ύ :n aminohap-20 posekvensseillä (ks. kuvio 5) suotuisimpaan kyseessä olevan keksinnön käyttötapaan epäilemättä sisältyy joko täydellisen geenin valmistus synteettisin keinoin (ks. 26, esimerkiksi) tai synteettisten desoligonukleotidien valmistus, jolla cDNA-lähdettä voitaisiin tutkia geenin eris-25 tämiseksi standardi hybridisaatiotekniikan avulla. Jos vain on saatu nukleotidisekvenssi, joka koodaa tarvittavaa IFN-Ύ -proteiinia, keinoina ekspression, eristämisen ja puhdistuksen saavuttamiseksi tarkoituksena tuottaa erittäin puhtaita IFN-Ύ:n valmisteita, voisi olla yllä esite-30 tyn kuvauksen seuraaminen.
45 86559
Kirjallisuusviitteet 1. Goeddel et ai., Nature 287, 411 (1980).
2. Goeddel et ai., Nature 290, 20 (1981).
3. Yelverton et ai., Nucleic Acids Research 9, 731 (1981).
5 4. Gutterman et ai., Annals of Int. Med. 93, 399 (1980).
5. Goeddel et ai.. Nucleic Acids Researrch 8, 4057 (1980).
6. Yip et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 78, 1601 (1981).
7. Taniguchi et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 78, 3469 (1981) .
10 8. Bloom, Nature 289, 593 (1980).
9. Sonnenfeld et ai., Cellular Immunol. 40, 285 (1978).
10. Fleishmann et ai., Infection and Immunity 26, 248 (1979).
11. Blalock et ai., Cellular Immunology 49, 390 (1980).
12. Rudin et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 77, 5928 15 (1980).
13. Crane et ai., J. Natl. Cancer Inst. 61, 871 (1978).
14. Stinchcomb et ai., Nature 282, 39 (1979).
15. Kingsman et ai., Gene 7, 141 (1979).
16. Tschumpcr et ai., Gene 10, 157 (1980).
20 17. Mortimer et ai., Microbiological Rcvlerws 44, 519 (198 ).
18. Miozzari et ai., Journal of Bacteriology 134, 48 (1978).
19. Jones, Genetics 85, 23 (1977).
20. Hitzeman, et ai., J. Biol. Chem. 255, 12073 (1980).
21. Hess et ai., J. Adv. Enzyme Regul. 7, 149 (1968).
25 22. Holland et ai., Biochemistry 17, 4900 (1978).
23. Bostian et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 77, 4504 (1980) .
24. The Molecular Biology of Yeast (Aug 11-18, 1981), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.
30 25. Chambon, Ann. Rev. Biochemistry, 44, 613 (1975).
25a. Gluzman, Cell 23, 175 (1981).
26. Goeddel et al., Nature 281, 544 (1979).
27. Itakura et al., Science 198, 1956 (1977).
28. Lusky et al. , Nature 293, 79 (1981).
35 29. Gluzman et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol.
44, 293 (1980).
30. Fiers et al., Nature 273, 113 (1978).
46 86 559 31. Reddy et ai., Science 200, 494 (1978).
32. Boedtker et ai., Prog, in Nucleic Acids Res. Mol. Biol.
19, 253 (1976) .
33. Berger et ai., Biochemistry 18, 5143 (1979).
5 34. Aviv et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 69, 1408 (1972).
35. Gurdon et ai., J. Molec. Biol. 80, 539 (1975).
36. Stewart, The Interferon Syste,. Springer, New York, s. 13-26 (1979).
37. Lehrach et ai., Biochemistry 16, 4743 (1977).
10 38. Lynch et ai., Virology 98, 251 (1979).
39. Wickens et ai., J. Biol. Chem. 253, 2483 (1978).
40. Chang et ai., Nature 275, 617 (1978).
41. Bolivar et ai., Gene 2, 95 (1977).
42. Grunstein et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 72, 3961 15 (1975).
43. Fritsch et ai., Cell 19, 959 (1980).
44. Birnboim et ai., Nucleic Acids Res. 7, 1513 (1979).
45. Kafatos et ai., Nucleic Acids Res. 7, 1541 (1979).
46. Clewell et al., Biochemistry 9, 4428 (1970).
20 47. Taylor et ai., Biochim. Biophys. Acta 442, 324 (1976).
48. Smith, Methods Enzymol. 65, 560 (1980).
49. Messing et ai., Nucleic Acids Res. 9, 309 (1981).
50. Winzler, Hormonal Proteins and Peptides (ed. Li) Academic Press, New York, s. 1 (1973).
25 51. Nathan et al., Nature 292, 842 (1981).
52. Maxam et al., Methods In Enzymol. 65, 490 (1980).
53. Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 75, 5765 (1978).
54. Southern, J. Molec. Biol. 98, 503 (1975).
55. Blin et al., Nucleic Acids Res. 3, 2303 (1976).
30 56. Lawn et al., Science 212, 1 159 (1981 ) .
57. Lawn et al., Nucleic Acids Res. 9, 1045 (1981).
58. Miller, Experiments in Molecular Genetics, s. 431-3, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York (1972).
59. Beggs, Nature 275, 104 (1978).
35 60. Valenzuela et al., Animal Virus Genetics (ed. Fields, .'!! Jaenisch and Fox) s. 57, Academic Press, New York (1980).
61. McCuthan et al., J. Natl. Cancer Inst. 41, 351 (1968).

Claims (12)

86559
1. DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että se käsittää sekvenssin, joka koodaa polypeptidiä, joka kä- 5 sittää ihmisen yhdistelmä-immuuni-inteferonin aminohappo- sekvenssin, joka on 1 10 CYS TYR CYS GLN ASP PRO TYR VAL LYS GLU ALA GLU ASN LEU 20
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että se on toimivasti liittynyt DNA-sekvenssiin, joka pystyy saamaan aikaan mainitun po- 40 lypeptidin ekspression.
3. Replikoituva ekspressiovektori, tunnet-t u siitä, että se pystyy ekspressoimaan patenttivaatimuksessa 1 mainitun polypeptidin transformanttibakteeris-sa, -hiivassa tai -nisäkässolulinjassa. 48 86559
4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen ekspressiovekto-ri, tunnettu siitä, että se on plasmidi pIFN-Ύ-trp 48, joka on esitetty kuviossa 7, pSV- γ -69, joka on esitetty kuviossa 8 tai pPGK-IFN- Ύ, joka on esitetty ku- 5 viossa 16.
5. Patenttivaatimuksen 3 mukainen ekspressiovekto-ri, tunnettu siitä, että se pystyy ekspressoi-maan patenttivaatimuksessa 1 mainitun polypeptidin E. colissa tai apinan munuaisfibroblastin C0S-7-solulinjas- 10 sa.
6. Menetelmä geenin ekspressoimiseksi, tunnettu siitä, että bakteerissa, hiivassa tai nisäkäs-solulinjassa ekspressoidaan geeni, joka käsittää sekvenssin, joka koodaa polypeptidia, joka käsittää ihmisen yh- 15 distelmä-immuuni-interferonin tai ihmisen des-CYS-TYR- CYS-yhdistelmä-immuuni-interferonin aminohapposekvenssin, jonka yhdistelmä-immuuni-interferonin aminohapposekvenssi on 1 10 20 CYS TYR CYS GLN ASP PRO TYR VAL LYS GLU ALA GLU ASN LEU 20 LYS LYS TYR PHE ASN ALA GLY HIS SER ASP VAL ALA ASP ASN 25 30 40 GLY THR LEU PHE LEU GLY ILE LEU LYS ASN TRP LYS GLU GLU 50 SER ASP ARG LYS ILE MET GLN SER GLN ILE VAL SER PHE TYR 30 60 70 PHE LYS LEU PHE LYS ASN PHE LYS ASP ASP GLN SER ILE GLN 80 LYS SER VAL GLU THR ILE LYS GLU ASP MET ASN VAL LYS PHE 35 90 PHE ASN SER ASN LYS LYS LYS ARG ASP ASP PHE GLU LYS LEU 100 110 40 THR ASN TYR SER VAL THR ASP LEU ASN VAL GLN ARG LYS ALA 120 ILE HIS GLU LEU ILE GLN VAL MET ALA GLU LEU SER PRO ALA 49 86559 130 140 ALA LYS THR GLY LYS ARG LYS ARG SER GLN MET LEU PHE ARG 146 GLY ARG ARG ALA SER GLN. 5
7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siltä, että geeni ekspressoidaan E. co-lissa tai apinan munuaisfibroblastien C0S-7-solulinjassa.
8. Menetelmä patenttivaatimuksessa 1 mainitun po- 10 lypeptidin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että viljellään bakteeri, hiiva tai nisäkässolulinja, joka on transformoitu replikoituvalla ekspressiovektorilla, ja tuotetaan mainittua polypeptidiä ja otetaan mainittu po-lypeptidi talteen.
9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että viljellään E. colia tai apinan munuaisfibroblastien C0S-7-solulinja.
10. Menetelmä patenttivaatimuksen 3 mukaisen eks-pressiovektorin valmistamiseksi, tunnettu siitä, 20 että muodostetaan ensimmäinen DNA-sekvenssi, joka koodaa patenttivaatimuksessa 1 mainittua polypeptidiä ja liitetään mainittu ensimmäinen DNA-sekvenssi toimivasti toiseen DNA-sekvenssiin, joka pystyy saamaan aikaan mainitun ensimmäisen DNA-sekvenssin ekspression.
10 LYS LYS TYR PHE ASN ALA GLY HIS SER ASP VAL ALA ASP ASN 30 40 GLY THR LEU PHE LEU GLY ILE LEU LYS ASN TRP LYS GLU GLU 50
15 SER ASP ARG LYS ILE MET GLN SER GLN ILE VAL SER PHE TYR 60 70 PHE LYS LEU PHE LYS ASN PHE LYS ASP ASP GLN SER ILE GLN 80
20 LYS SER VAL GLU THR ILE LYS GLU ASP MET ASN LYS PHE PHE 90 ASN SER ASN LYS LYS LYS ARG ASP ASP PHE GLU LYS LEU THR 100 110 25 ASN TYR SER VAL THR ASP LEU ASN VAL GLN ARG LYS ALA ILE 120 HIS GLU LEU ILE GLN VAL MET ALA GLU LEU SER PRO ALA ALA 30 130 140 LYS THR GLY LYS ARG LYS ARG SER GLN MET LEU PHE ARG 146 GLY ARG ARG ALA SER GLN 35 tai sen des-CYS-TYR-CYS-aminohapposekvenssin.
11. Menetelmä transformantin muodostamiseksi, tunnettu siitä, että bakteeri, hiiva tai nisäkässolulinja transformoidaan vektorilla, joka transforman-tissa pystyy aikaansaamaan patenttivaatimuksessa 1 mainitun polypeptidin ekpression.
12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että transformoitava solu on E. coli tai apinan fibroblastien C0S-7-solulinja. 50 86559
FI823528A 1981-10-19 1982-10-15 Foerfarande foer framstaellning av humant immuninterferon, daervid anvaendbara medel och dessas framstaellning. FI86559C (fi)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US31248981A 1981-10-19 1981-10-19
US31248981 1981-10-19

Publications (4)

Publication Number Publication Date
FI823528A0 FI823528A0 (fi) 1982-10-15
FI823528L FI823528L (fi) 1983-04-20
FI86559B true FI86559B (fi) 1992-05-29
FI86559C FI86559C (fi) 1992-09-10

Family

ID=23211703

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI823528A FI86559C (fi) 1981-10-19 1982-10-15 Foerfarande foer framstaellning av humant immuninterferon, daervid anvaendbara medel och dessas framstaellning.

Country Status (43)

Country Link
US (4) US4762791A (fi)
EP (1) EP0077670B1 (fi)
JP (3) JPS5890514A (fi)
KR (1) KR840001837A (fi)
AT (1) ATE44289T1 (fi)
AU (1) AU561343B2 (fi)
BG (2) BG42527A3 (fi)
BR (1) BR8206068A (fi)
CA (1) CA1341590C (fi)
CH (1) CH663619A5 (fi)
CZ (1) CZ282154B6 (fi)
DD (1) DD208822A5 (fi)
DE (4) DE19375065I2 (fi)
DK (1) DK163187C (fi)
DZ (1) DZ467A1 (fi)
ES (1) ES8402351A1 (fi)
FI (1) FI86559C (fi)
FR (1) FR2514783B1 (fi)
GB (1) GB2107718B (fi)
GR (1) GR78391B (fi)
GT (1) GT198277746A (fi)
HK (1) HK66289A (fi)
HU (1) HU202287B (fi)
IE (1) IE54371B1 (fi)
IL (1) IL66992A (fi)
IT (1) IT1153265B (fi)
LU (1) LU88327I2 (fi)
MX (2) MX166499B (fi)
MY (1) MY102546A (fi)
NL (1) NL930040I2 (fi)
NO (2) NO164177C (fi)
NZ (1) NZ202190A (fi)
OA (1) OA07233A (fi)
PH (1) PH26963A (fi)
PL (1) PL153202B1 (fi)
PT (1) PT75696B (fi)
RO (1) RO89534A (fi)
RU (3) RU2056460C1 (fi)
SG (1) SG76988G (fi)
SK (1) SK738982A3 (fi)
YU (1) YU45871B (fi)
ZA (1) ZA827569B (fi)
ZW (1) ZW22282A1 (fi)

Families Citing this family (188)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ199722A (en) 1981-02-25 1985-12-13 Genentech Inc Dna transfer vector for expression of exogenous polypeptide in yeast;transformed yeast strain
ZW18282A1 (en) * 1981-08-31 1983-03-23 Genentech Inc Preparation of polypeptides in vertebrate cell culture
AU561343B2 (en) * 1981-10-19 1987-05-07 Genentech Inc. Human immune interferon by recombinant dna
JPS58146281A (ja) * 1981-10-19 1983-08-31 Suntory Ltd 酵母細胞の形質転換法
JPS58110548A (ja) * 1981-12-24 1983-07-01 Asahi Chem Ind Co Ltd 新規な生理活性ペプチド
JPS62223191A (ja) * 1981-12-24 1987-10-01 Asahi Chem Ind Co Ltd 新規な生理活性ペプチドの製法
ZA831094B (en) * 1982-02-22 1983-11-30 Biogen Nv Dna sequences,recombinant dna molecules and processes for producing human immune interferon-like polypeptides
GB8406910D0 (en) * 1984-03-16 1984-04-18 Biogen Nv Gamma interferon
US5004689A (en) * 1982-02-22 1991-04-02 Biogen, Massachusetts DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing human gamma interferon-like polypeptides in high yields
US5827694A (en) * 1982-03-08 1998-10-27 Genentech, Inc. DNA encoding non-human animal interferons, vectors and hosts therefor, and recombinant production of IFN polypeptides
US6432677B1 (en) 1982-03-08 2002-08-13 Genentech, Inc. Non-human animal interferons
IE54592B1 (en) * 1982-03-08 1989-12-06 Genentech Inc Anumal interferons, processes involved in their production, compositions containing them, dna sequences coding therefor and espression vehicles containing such sequences and cells transformed thereby
IL68100A0 (en) * 1982-03-24 1983-06-15 Takeda Chemical Industries Ltd Novel dna and use thereof
US6936694B1 (en) * 1982-05-06 2005-08-30 Intermune, Inc. Manufacture and expression of large structural genes
JPH0787797B2 (ja) * 1982-05-20 1995-09-27 サントリー株式会社 ヒト・ガンマ・インタ−フエロン様ポリペプチドの製造法
AU577259B2 (en) * 1982-08-13 1988-09-22 Zymogenetics Inc. Glycolytic promters for regulated protein expression protease inhibitor
AU571460B2 (en) * 1982-09-27 1988-04-21 Cancer Institute Of Japanese Foundation For Cancer Research Alpha interferon dna, recombinant plasmid, engineered organism and alpha interferon polypeptide
AU575301B2 (en) * 1982-10-08 1988-07-28 Juridical Foundation, Japanese Foundation For Cancer Research Novel vector
US4966843A (en) * 1982-11-01 1990-10-30 Cetus Corporation Expression of interferon genes in Chinese hamster ovary cells
US5831023A (en) * 1982-11-01 1998-11-03 Genentech, Inc. Recombinant animal interferon polypeptides
WO1984002129A1 (en) * 1982-11-22 1984-06-07 Takeda Chemical Industries Ltd Human immune interferon protein and process for its preparation
US4511503A (en) * 1982-12-22 1985-04-16 Genentech, Inc. Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins
US4511502A (en) * 1982-12-22 1985-04-16 Genentech, Inc. Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins
US4518526A (en) * 1982-12-22 1985-05-21 Genentech, Inc. Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins
US4512922A (en) * 1982-12-22 1985-04-23 Genentech, Inc. Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins
US4620948A (en) * 1982-12-22 1986-11-04 Genentech, Inc. Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins
GR79124B (fi) * 1982-12-22 1984-10-02 Genentech Inc
US4599197A (en) * 1982-12-22 1986-07-08 Genentech, Inc. Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins
JPH0740925B2 (ja) * 1983-03-14 1995-05-10 協和醗酵工業株式会社 新規ヒトインタ−フエロン−γポリペプチド
US7198919B1 (en) * 1983-04-25 2007-04-03 Genentech, Inc. Use of alpha factor sequences in yeast expression systems
ZA843275B (en) * 1983-05-05 1984-12-24 Hoffmann La Roche Novel vectors for interferon expression
ZA844082B (en) * 1983-06-01 1985-09-25 Hoffmann La Roche Polypeptides having interferon activity
JP2551746B2 (ja) * 1983-07-19 1996-11-06 サントリー株式会社 改良プラスミドベクタ−およびその利用
EP0133767B1 (en) * 1983-08-04 1991-04-03 The Green Cross Corporation Gamma interferon composition
JPS6034919A (ja) * 1983-08-04 1985-02-22 Green Cross Corp:The ガンマ・インタ−フェロン組成物
IL72773A0 (en) * 1983-08-29 1984-11-30 Meloy Lab Production of immune interferon and its mrna
US4681930A (en) * 1983-09-20 1987-07-21 Hoffmann-La Roche Inc. Immune interferon and a method for its extraction and purification
ZA846554B (en) * 1983-09-20 1985-04-24 Hoffmann La Roche Immune interferon and method for its purification
US4604284A (en) * 1983-09-20 1986-08-05 Hoffmann-La Roche Inc. Homogeneous immune interferon fragment
US4476049A (en) * 1983-09-20 1984-10-09 Hoffmann-La Roche Inc. Method for the extraction of immune interferon
JPS6079000A (ja) * 1983-10-04 1985-05-04 Takeda Chem Ind Ltd ヒトγ型インタ−フエロン単量体の製造法
JPH0788398B2 (ja) * 1983-10-17 1995-09-27 サントリー株式会社 新規生理活性ポリペプチドおよびその製造法
GB8328820D0 (en) * 1983-10-28 1983-11-30 Searle & Co Synthetic human gamma interferon gene
FR2556365B1 (fr) * 1983-12-09 1987-07-31 Transgene Sa Vecteurs de clonage et d'expression de l'interferon-g, bacteries transformees et procede de preparation de l'interferon-g
US4703008A (en) * 1983-12-13 1987-10-27 Kiren-Amgen, Inc. DNA sequences encoding erythropoietin
NZ210501A (en) * 1983-12-13 1991-08-27 Kirin Amgen Inc Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence
KR850004274A (ko) * 1983-12-13 1985-07-11 원본미기재 에리트로포이에틴의 제조방법
MX9203641A (es) * 1983-12-16 1992-07-01 Genentech Inc Interferones gamma recombinantes que poseen estabilidad mejorada y metodos biotecnologicos para su obtencion.
US4855238A (en) * 1983-12-16 1989-08-08 Genentech, Inc. Recombinant gamma interferons having enhanced stability and methods therefor
JPS60145098A (ja) * 1984-01-09 1985-07-31 Suntory Ltd 糖付加ポリペプチドの製造法
WO1985004420A1 (en) * 1984-03-29 1985-10-10 Takeda Chemical Industries, Ltd. Novel dna and its use
DE3414831A1 (de) * 1984-04-19 1985-10-31 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Herstellung von polypeptiden mit human-gammainterferon-aktivitaet
GB8414354D0 (en) * 1984-06-05 1984-07-11 Biogen Nv Purifying protein
IL75302A0 (en) * 1984-06-06 1985-09-29 Takeda Chemical Industries Ltd Novel polypeptide and production thereof
WO1985005618A1 (en) * 1984-06-06 1985-12-19 Takeda Chemical Industries, Ltd. Process for preparing interferon derivative
JPS60262594A (ja) * 1984-06-11 1985-12-25 Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd ヒトインタ−フエロン−γ
CA1302320C (en) * 1984-06-11 1992-06-02 Hideo Niwa Expression of human cromosomal interferon-_ in animal cells
GB8414911D0 (en) * 1984-06-12 1984-07-18 Searle & Co Producing human gamma interferon
JPS6124599A (ja) * 1984-07-11 1986-02-03 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 新規ヒトインタ−フエロン−ｒポリペプチド誘導体
GB2164650A (en) * 1984-09-25 1986-03-26 Fujisawa Pharmaceutical Co Process for production of y-interferon
ATE66375T1 (de) * 1984-10-05 1991-09-15 Bioferon Biochem Substanz Verwendung von interferon-gamma (ifn-gamma) enthaltenden praeparationen zur systemischen behandlung von verschiedenen erkrankungen des menschen in niedriger dosierung.
DE3436638C2 (de) * 1984-10-05 1992-10-08 Bioferon biochemische Substanzen GmbH & Co, 7958 Laupheim Verwendung von Interferon-gamma (IFN-gamma) enthaltenden Präparationen zur Behandlung rheumatischer Erkrankungen
JPS6188875A (ja) * 1984-10-05 1986-05-07 Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd ヒトインタ−フエロン−γ
US4946674A (en) * 1984-10-05 1990-08-07 Bioferon Biochemische Substanzen Gmbh & Co. Process for treatment of rheumatic diseases
IL76591A0 (en) * 1984-10-05 1986-02-28 Bioferon Biochem Substanz Pharmaceutical compositions containing ifn-ypsilon and processes for the preparation thereof
JPS61108397A (ja) * 1984-10-31 1986-05-27 Green Cross Corp:The インタ−フエロン−γ蛋白質の製造法
KR930007429B1 (ko) * 1984-12-27 1993-08-10 산도리 가부시기가이샤 인터페론의 정제방법
JPS6156195A (ja) * 1985-03-01 1986-03-20 Asahi Chem Ind Co Ltd 新規生理活性ペプチド
GB8508340D0 (en) * 1985-03-29 1985-05-09 Creighton T E Production of protein
JP2615027B2 (ja) * 1985-04-08 1997-05-28 アムジェン インコーポレイテッド 外来遺伝子の転写を制御するための方法及びハイブリッドプロモーター
US4873312A (en) * 1985-04-25 1989-10-10 Amgen Method for purifying interferon and composition of matter produced thereby
FR2583429B1 (fr) * 1985-06-18 1989-11-03 Transgene Sa Vecteur d'expression de l'interferon u dans les cellules de mammifere, procede pour sa mise en oeuvre et produit obtenu et composition pharmaceutique contenant l'interferon u
US4845196A (en) * 1985-06-24 1989-07-04 G. D. Searle & Co. Modified interferon gammas
US5104795A (en) * 1985-11-13 1992-04-14 Zoma Corporation Shortened phosphoglycerate kinase promoter
WO1987003008A1 (en) * 1985-11-13 1987-05-21 International Genetic Engineering, Inc. Shortened phosphoglycerate kinase promoter
EP0237019A3 (en) * 1986-03-14 1988-03-09 Toray Industries, Inc. Interferon conjugate and production thereof using recombinant gene
US5198343A (en) * 1986-08-05 1993-03-30 Transgene, S.A. Method for expressing a heterologous protein in a dapD- mutant of E. coli and the strain obtained
US6238889B1 (en) * 1986-12-16 2001-05-29 Dsm N.V. Molecular cloning and expression of the Pro8 isoform of human IL-3
US4939088A (en) * 1987-02-18 1990-07-03 Meloy Laboratories Inc. Sustained production of recombinant gamma interferon using an Epstein-Barr virus replicon
US4944941A (en) * 1987-08-07 1990-07-31 Genentech, Inc. Methods and compositions for the treatment of lung conditions
US6384194B1 (en) * 1987-12-16 2002-05-07 Dsm N.V. Expression and purification of human interleukin-3 and muteins thereof
US5258287A (en) * 1988-03-22 1993-11-02 Genentech, Inc. DNA encoding and methods of production of insulin-like growth factor binding protein BP53
IL90021A0 (en) * 1988-04-25 1989-12-15 Phillips Petroleum Co Process for the production of interferon
US5198212A (en) * 1988-10-31 1993-03-30 University Of Lousville Research Foundation Incorporated Method and compositions for treatment of trauma-associated sepsis with gamma interferon
US6451600B1 (en) * 1989-12-22 2002-09-17 Genzyme Corporation Enzymatically active recombinant glucocerebrosidase
US20020168750A1 (en) * 1988-12-23 2002-11-14 James Rasmussen Enzymatically active recombinant glucocerebrosidase
US5236838A (en) * 1988-12-23 1993-08-17 Genzyme Corporation Enzymatically active recombinant glucocerebrosidase
US5112605A (en) * 1989-03-17 1992-05-12 Genentech, Inc. Temporal gamma-interferon administration for allergies
US5196191A (en) * 1989-03-17 1993-03-23 Genentech, Inc. Temporal gamma-interferon administration for allergies
WO1990012877A1 (en) * 1989-04-19 1990-11-01 Cetus Corporation Multifunctional m-csf proteins and genes encoding therefor
DE4009268A1 (de) * 1990-03-22 1991-09-26 Consortium Elektrochem Ind Sekretion von hirudinderivaten
US5281520A (en) * 1990-09-12 1994-01-25 Zymogenetics, Inc. Method for producing acyloxyacyl hydrolase
WO1992006115A1 (en) * 1990-09-27 1992-04-16 Schering Corporation Antagonists of human gamma interferon
EP0487298A3 (en) * 1990-11-21 1992-12-16 Schering Corporation Human gamma interferon antagonist/agonist screen
AU1268192A (en) * 1991-01-04 1992-08-17 Board Of Regents, The University Of Texas System Cloning and expression of tissue transglutaminases
US5272078A (en) * 1991-01-29 1993-12-21 Brigham And Women's Hospital CDNA encoding the type I iodothyronine 5'deiodinase
WO1992013077A1 (en) * 1991-01-29 1992-08-06 Brigham And Women's Hospital A cDNA ENCODING THE TYPE I IODOTHYRONINE 5' DEIODINASE
US6180602B1 (en) 1992-08-04 2001-01-30 Sagami Chemical Research Center Human novel cDNA, TGF-beta superfamily protein encoded thereby and the use of immunosuppressive agent
WO1994003599A1 (en) * 1992-08-04 1994-02-17 Sagami Chemical Research Center HUMAN cDNA AND PROTEIN WHICH SAID cDNA CODES FOR
WO1994010296A1 (en) * 1992-11-03 1994-05-11 Oklahoma Medical Research Foundation Transglutaminase gene
US6558661B1 (en) * 1992-12-29 2003-05-06 Genentech, Inc. Treatment of inflammatory bowel disease with IFN-γ inhibitors
EP0716148B1 (en) 1993-09-15 2004-01-02 Chiron Corporation Recombinant alphavirus vectors
WO1997038087A2 (en) 1996-04-05 1997-10-16 Chiron Corporation Alphaviral vector with reduced inhibition of cellular macromolecular synthesis
JP2001500738A (ja) 1996-09-17 2001-01-23 カイロン コーポレイション 細胞内疾患を処置するための組成物および方法
US20020168634A1 (en) * 1999-05-05 2002-11-14 Christine Marie Debouck Methods for identifiying genes essential to the growth of an organism
US7153943B2 (en) * 1997-07-14 2006-12-26 Bolder Biotechnology, Inc. Derivatives of growth hormone and related proteins, and methods of use thereof
CN1269805A (zh) * 1997-07-14 2000-10-11 博尔德生物技术公司 生长激素和相关蛋白的衍生物
US20080076706A1 (en) 1997-07-14 2008-03-27 Bolder Biotechnology, Inc. Derivatives of Growth Hormone and Related Proteins, and Methods of Use Thereof
US6753165B1 (en) * 1999-01-14 2004-06-22 Bolder Biotechnology, Inc. Methods for making proteins containing free cysteine residues
ES2314786T3 (es) 1998-04-02 2009-03-16 Genentech, Inc. Uso de interferon gamma para el tratamiento de la hipertrofia cardiaca.
AU2221600A (en) 1998-12-31 2000-07-31 Chiron Corporation Improved expression of hiv polypeptides and production of virus-like particles
US7935805B1 (en) 1998-12-31 2011-05-03 Novartis Vaccines & Diagnostics, Inc Polynucleotides encoding antigenic HIV Type C polypeptides, polypeptides and uses thereof
US8288126B2 (en) 1999-01-14 2012-10-16 Bolder Biotechnology, Inc. Methods for making proteins containing free cysteine residues
CN1309423C (zh) 1999-11-12 2007-04-11 马克西根控股公司 干扰素γ偶联物
JP2003513681A (ja) 1999-11-12 2003-04-15 マキシゲン・ホールディングス・リミテッド インターフェロンガンマ・コンジュゲート
CA2405557C (en) 2000-04-12 2013-09-24 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
EP1284987B1 (en) * 2000-05-16 2007-07-18 Bolder Biotechnology, Inc. Methods for refolding proteins containing free cysteine residues
CN100420482C (zh) * 2000-11-03 2008-09-24 精达制药公司 ω干扰素在制备用于治疗丙型肝炎的药物中的用途
WO2002067760A2 (en) * 2001-01-09 2002-09-06 Baylor Research Institute Methods for treating autoimmune diseases in a subject and in vitro diagnostic assays
US7038015B2 (en) 2001-04-06 2006-05-02 Maxygen Holdings, Ltd. Interferon gamma polypeptide variants
US6958388B2 (en) 2001-04-06 2005-10-25 Maxygen, Aps Interferon gamma polypeptide variants
US20030198621A1 (en) 2001-07-05 2003-10-23 Megede Jan Zur Polynucleotides encoding antigenic HIV type B and/or type C polypeptides, polypeptides and uses thereof
WO2003004620A2 (en) 2001-07-05 2003-01-16 Chiron, Corporation Polynucleotides encoding antigenic hiv type c polypeptides, polypeptides and uses thereof
JP4383534B2 (ja) * 2001-08-17 2009-12-16 コーリー ファーマシューティカル ゲーエムベーハー 改善した活性を有する組み合わせモチーフ免疫刺激オリゴヌクレオチド
IL161630A0 (en) * 2001-11-06 2004-09-27 Applied Research Systems Methods of treating endometreosis
JP2005509647A (ja) * 2001-11-06 2005-04-14 アプライド リサーチ システムズ エーアールエス ホールディング ナームロゼ フェンノートシャップ エストロゲン応答性乳癌の治療方法
KR20040053291A (ko) * 2001-11-09 2004-06-23 바이오메디신즈 인코포레이티드 오메가 인터페론을 이용한 질환 치료 방법
JP2005517648A (ja) * 2001-12-07 2005-06-16 インターミューン インコーポレイテッド 肝炎ウイルス感染症を治療するための組成物および方法
EP2261250B1 (en) 2001-12-21 2015-07-01 Human Genome Sciences, Inc. GCSF-Albumin fusion proteins
US6790641B2 (en) 2002-05-01 2004-09-14 Cell Genesys, Inc. Lentiviral vector particles resistant to complement inactivation
US7524931B2 (en) 2002-07-03 2009-04-28 Maxygen Holdings Ltd. Full-length interferon gamma polypeptide variants
WO2004004643A2 (en) * 2002-07-03 2004-01-15 The Brighamn And Women's Hospital, Inc. Interferon gamma in the detection and treatment of angiomyolipomas
US7335743B2 (en) * 2002-10-16 2008-02-26 Amgen Inc. Human anti-IFN-γ neutralizing antibodies as selective IFN-γ pathway inhibitors
US7731947B2 (en) 2003-11-17 2010-06-08 Intarcia Therapeutics, Inc. Composition and dosage form comprising an interferon particle formulation and suspending vehicle
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
WO2005047327A2 (en) 2003-11-12 2005-05-26 Biogen Idec Ma Inc. NEONATAL Fc RECEPTOR (FcRn)-BINDING POLYPEPTIDE VARIANTS, DIMERIC Fc BINDING PROTEINS AND METHODS RELATED THERETO
JP4896745B2 (ja) 2004-02-02 2012-03-14 アンブレツクス・インコーポレイテツド 修飾されたヒトインターフェロンポリペプチドおよびこれらの使用
CN101072585A (zh) 2004-11-01 2007-11-14 诺华疫苗和诊断公司 产生免疫应答的组合方法
EP2364995A1 (en) 2004-12-23 2011-09-14 Molmed SpA Conjugation product
EP1838736B1 (en) 2005-01-05 2013-03-06 Biogen Idec MA Inc. Cripto binding molecules
CA2595276C (en) 2005-01-27 2014-03-11 Novimmune S.A. Anti-interferon gamma antibodies and methods of use thereof
US11246913B2 (en) 2005-02-03 2022-02-15 Intarcia Therapeutics, Inc. Suspension formulation comprising an insulinotropic peptide
WO2006083761A2 (en) 2005-02-03 2006-08-10 Alza Corporation Solvent/polymer solutions as suspension vehicles
US20100196336A1 (en) 2006-05-23 2010-08-05 Dongsu Park Modified dendritic cells having enhanced survival and immunogenicity and related compositions and methods
CA2651855C (en) 2006-05-30 2011-08-02 Intarcia Therapeutics, Inc. Two-piece, internal-channel osmotic delivery system flow modulator
ES2422864T3 (es) 2006-08-09 2013-09-16 Intarcia Therapeutics, Inc Sistemas de liberación osmótica y unidades de pistón
EP2102355B1 (en) 2006-12-14 2016-03-02 Bolder Biotechnology, Inc. Long acting proteins and peptides and methods of making and using the same
PT2157967E (pt) 2007-04-23 2013-04-03 Intarcia Therapeutics Inc Formulações de suspensões de péptidos insulinotrópicos e suas utilizações
WO2008137471A2 (en) * 2007-05-02 2008-11-13 Ambrx, Inc. Modified interferon beta polypeptides and their uses
US20090155838A1 (en) * 2007-11-28 2009-06-18 Smart Tube, Inc. Devices, systems and methods for the collection, stimulation, stabilization, and analysis of a biological sample
CA2712606A1 (en) 2008-02-08 2009-08-13 Ambrx, Inc. Modified leptin polypeptides and their uses
EP2240155B1 (en) 2008-02-13 2012-06-06 Intarcia Therapeutics, Inc Devices, formulations, and methods for delivery of multiple beneficial agents
EP2248903A1 (en) 2009-04-29 2010-11-10 Universitat Autònoma De Barcelona Methods and reagents for efficient and targeted gene transfer to monocytes and macrophages
KR101823699B1 (ko) 2009-09-28 2018-01-30 인타르시아 세라퓨틱스 인코포레이티드 실질 항정상태 약물 전달의 신속 확립 및/또는 종결
NZ605400A (en) 2010-07-09 2015-05-29 Biogen Idec Hemophilia Inc Chimeric clotting factors
US20120208755A1 (en) 2011-02-16 2012-08-16 Intarcia Therapeutics, Inc. Compositions, Devices and Methods of Use Thereof for the Treatment of Cancers
RU2446172C1 (ru) * 2011-03-24 2012-03-27 Общество С Ограниченной Ответственностью "Фармапарк" Способ получения зрелого интерферона альфа-2 человека с использованием дрожжей saccharomyces cerevisiae и штамм-продуцент интерферона альфа-2 человека (варианты)
EA023379B1 (ru) * 2011-06-21 2016-05-31 Общество С Ограниченной Ответственностью "Фарма Ген" ШТАММ ESCHERICHIA COLI BL21(DE3)-pIE-GAMMA И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА НАТИВНОГО РЕКОМБИНАНТНОГО ИНТЕРФЕРОНА ГАММА ЧЕЛОВЕКА
WO2013012733A1 (en) 2011-07-15 2013-01-24 Biogen Idec Ma Inc. Heterodimeric fc regions, binding molecules comprising same, and methods relating thereto
WO2013024158A1 (en) 2011-08-17 2013-02-21 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Combinations of protein kinase inhibitors and interferons or of protein kinase inhibitors and direct acting antivirals for the treatment and the prevention of hcv infection
WO2013024156A2 (en) 2011-08-17 2013-02-21 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Combinations of anti-hcv-entry factor antibodies and interferons for the treatment and the prevention of hcv infection
CA2860579A1 (en) 2012-01-10 2013-07-18 Biogen Idec Ma Inc. Enhancement of transport of therapeutic molecules across the blood brain barrier
US20140350087A9 (en) 2012-03-22 2014-11-27 Halozyme, Inc. Oncovector Nucleic Acid Molecules and Methods of Use
US9732144B2 (en) 2012-07-05 2017-08-15 Ohio State Innovation Foundation Infectious bursal disease (IBDV) vaccine compositions
WO2014033266A1 (en) 2012-08-31 2014-03-06 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Anti-sr-bi antibodies for the inhibition of hepatitis c virus infection
SG11201505926VA (en) 2013-03-15 2015-09-29 Biogen Ma Inc Factor ix polypeptide formulations
EP2940128A1 (en) 2014-04-30 2015-11-04 Institut d'Investigació Biomèdica de Bellvitge (IDIBELL) Adenovirus comprising an albumin-binding moiety
US9889085B1 (en) 2014-09-30 2018-02-13 Intarcia Therapeutics, Inc. Therapeutic methods for the treatment of diabetes and related conditions for patients with high baseline HbA1c
US11761951B2 (en) 2015-02-04 2023-09-19 Bristol-Myers Squibb Company Methods of selecting therapeutic molecules
TW201641691A (zh) 2015-02-04 2016-12-01 必治妥美雅史谷比公司 Ｔａｕ反義寡聚物及其用途
US11091543B2 (en) 2015-05-07 2021-08-17 Swedish Orphan Biovitrum Ag Methods, compositions and dosing regimens for treating or preventing interferon-gamma related indications
KR20180004254A (ko) 2015-05-07 2018-01-10 노비뮨 에스 에이 높은 수준의 cxcl9 및 다른 바이오마커를 갖는 환자에서의 질병의 진단 및 치료를 위한 방법 및 조성물
US10925639B2 (en) 2015-06-03 2021-02-23 Intarcia Therapeutics, Inc. Implant placement and removal systems
CN108348593B (zh) 2015-08-31 2022-08-16 泰克诺瓦克斯股份有限公司 基于人呼吸道合胞病毒(hrsv)病毒样颗粒(vlps)的疫苗
CA3020426A1 (en) 2016-04-13 2017-10-19 Synthetic Genomics, Inc. Recombinant arterivirus replicon systems and uses thereof
KR102574993B1 (ko) 2016-05-16 2023-09-06 인타르시아 세라퓨틱스 인코포레이티드 글루카곤-수용체 선택적 폴리펩티드 및 이들의 이용 방법
USD860451S1 (en) 2016-06-02 2019-09-17 Intarcia Therapeutics, Inc. Implant removal tool
USD840030S1 (en) 2016-06-02 2019-02-05 Intarcia Therapeutics, Inc. Implant placement guide
AU2017347725B2 (en) 2016-10-17 2024-01-04 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Recombinant virus replicon systems and uses thereof
AU2017372731B2 (en) 2016-12-05 2024-05-23 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for enhancing gene expression
KR20190104039A (ko) 2017-01-03 2019-09-05 인타르시아 세라퓨틱스 인코포레이티드 Glp-1 수용체 효능제의 연속적인 투여 및 약물의 동시-투여를 포함하는 방법
AU2018321893A1 (en) 2017-08-23 2020-03-19 Wayne State University In vivo immunoimaging of interferon-gamma
EA202091513A1 (ru) 2017-12-19 2020-09-09 Янссен Сайенсиз Айрлэнд Анлимитед Компани Вакцины против вируса гепатита b (hbv) и их применение
EA202091517A1 (ru) 2017-12-19 2020-11-03 Янссен Сайенсиз Айрлэнд Анлимитед Компани Способы и устройство для доставки вакцин против вируса гепатита b (hbv)
US11020476B2 (en) 2017-12-19 2021-06-01 Janssen Sciences Ireland Unlimited Company Methods and compositions for inducing an immune response against Hepatitis B Virus (HBV)
US11083786B2 (en) 2018-01-19 2021-08-10 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Induce and enhance immune responses using recombinant replicon systems
TW202200197A (zh) 2020-03-19 2022-01-01 英商崔澤爾有限公司 溫度反應型病毒儲存系統
CN115666618A (zh) 2020-03-30 2023-01-31 崔泽尔有限公司 用于治疗癌症的组合物和方法

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4332892A (en) * 1979-01-15 1982-06-01 President And Fellows Of Harvard College Protein synthesis
JPS5598118A (en) * 1979-01-18 1980-07-25 Hayashibara Takeshi Preparation of type-2 interferon and drug containing the same
AU538665B2 (en) * 1979-10-30 1984-08-23 Juridical Foundation, Japanese Foundation For Cancer Research Human interferon dna
IL58765A (en) * 1979-11-21 1986-09-30 Yeda Res & Dev Process for the production of essentially pure messenger rna of human fibroblast interferon and process for the production of interferon beta
GB2068970B (en) * 1980-02-06 1983-06-22 Searle & Co Recombinant dna technique for the preparation of a protein resembling human interferon
DE3005897A1 (de) * 1980-02-16 1981-09-03 Hoechst Ag, 6000 Frankfurt Genprodukt eines hoeheren organismus aus einem dieses gen enhtaltenden mikroorganismus
US4338397A (en) * 1980-04-11 1982-07-06 President And Fellows Of Harvard College Mature protein synthesis
US4460685A (en) * 1980-05-29 1984-07-17 New York University Method of enhancing the production of human γ Interferon
FI64813C (fi) * 1980-12-31 1984-01-10 Ilkka Antero Palva Foerfarande foer producering av ett utvalt aeggviteaemne och vid foerfarandet anvaenda rekombinantplasmidvektorer
US4376821A (en) * 1981-04-17 1983-03-15 Meloy Laboratories, Inc. Production of human IFN-gamma (immune) interferon
IL65475A0 (en) * 1981-04-17 1982-07-30 Meloy Lab Production of immune interferon and its mrna
AU561343B2 (en) * 1981-10-19 1987-05-07 Genentech Inc. Human immune interferon by recombinant dna

Also Published As

Publication number Publication date
IT8223795A0 (it) 1982-10-18
JPH03246232A (ja) 1991-11-01
GB2107718A (en) 1983-05-05
DE77670T1 (de) 1987-09-03
FI823528L (fi) 1983-04-20
NL930040I1 (nl) 1993-08-02
IT1153265B (it) 1987-01-14
PL238671A1 (en) 1983-07-18
US4925793A (en) 1990-05-15
NO164177C (no) 1990-09-12
IE54371B1 (en) 1989-09-13
OA07233A (fr) 1984-04-30
DE19375065I2 (de) 2004-07-01
HU202287B (en) 1991-02-28
IL66992A0 (en) 1983-02-23
ZW22282A1 (en) 1983-05-11
BG42527A3 (en) 1987-12-15
MX9206041A (es) 1994-04-29
IL66992A (en) 1991-07-18
ATE44289T1 (de) 1989-07-15
EP0077670A2 (en) 1983-04-27
SK279535B6 (sk) 1998-12-02
RU2092561C1 (ru) 1997-10-10
DE3238554C2 (fi) 1989-11-23
YU233582A (en) 1985-03-20
NO823467L (no) 1983-04-20
AU8935282A (en) 1983-04-28
US4727138A (en) 1988-02-23
DZ467A1 (fr) 2004-09-13
YU45871B (sh) 1992-09-07
GT198277746A (es) 1984-04-11
LU88327I2 (fr) 1994-05-04
FI823528A0 (fi) 1982-10-15
DK163187B (da) 1992-02-03
RU2107728C1 (ru) 1998-03-27
PH26963A (en) 1992-12-28
MY102546A (en) 1992-07-31
GR78391B (fi) 1984-09-27
PT75696A (en) 1982-11-01
JPS62265986A (ja) 1987-11-18
US4929554A (en) 1990-05-29
NO164177B (no) 1990-05-28
DK163187C (da) 1992-06-22
FR2514783A1 (fr) 1983-04-22
DE3238554A1 (de) 1983-05-05
DK460882A (da) 1983-05-27
HK66289A (en) 1989-08-25
NL930040I2 (nl) 1993-09-16
JP2515308B2 (ja) 1996-07-10
RO89534A (ro) 1986-07-30
GB2107718B (en) 1985-11-20
CH663619A5 (de) 1987-12-31
JPS5890514A (ja) 1983-05-30
SG76988G (en) 1989-03-23
ES516620A0 (es) 1984-02-01
PT75696B (en) 1987-03-24
BR8206068A (pt) 1983-09-13
FI86559C (fi) 1992-09-10
PL153202B1 (en) 1991-03-29
CA1341590C (en) 2009-02-03
JPH07106144B2 (ja) 1995-11-15
ES8402351A1 (es) 1984-02-01
EP0077670A3 (en) 1984-07-04
SK738982A3 (en) 1998-12-02
EP0077670B1 (en) 1989-06-28
CZ738982A3 (en) 1997-03-12
CZ282154B6 (cs) 1997-05-14
DD208822A5 (de) 1984-04-11
IE822517L (en) 1983-04-19
US4762791A (en) 1988-08-09
KR840001837A (ko) 1984-06-07
FR2514783B1 (fr) 1985-11-29
JPH0135639B2 (fi) 1989-07-26
RU2056460C1 (ru) 1996-03-20
MX166499B (es) 1993-01-12
AU561343B2 (en) 1987-05-07
BG44877A3 (bg) 1989-02-15
DE3279788D1 (en) 1989-08-03
ZA827569B (en) 1983-11-30
NZ202190A (en) 1987-06-30
NO1994025I1 (no) 1994-12-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI86559B (fi) Foerfarande foer framstaellning av humant immuninterferon, daervid anvaendbara medel och dessas framstaellning.
US5096705A (en) Human immune interferon
US4853332A (en) Structural genes, plasmids and transformed cells for producing cysteine depleted muteins of biologically active proteins
AU601675B2 (en) Purification, production and use of tumor necrosis factors
US5582824A (en) Recombinant DES-CYS-TYR-CYS human immune interferon
US4588585A (en) Human recombinant cysteine depleted interferon-β muteins
US6610830B1 (en) Microbial production of mature human leukocyte interferons
FI100972B (fi) Pesäkkeitä stimuloivaa tekijä-1:tä (CSF-1) koodaava DNA-sekvenssi ja m enetelmä CSF-1-proteiinin valmistamiseksi
DK170054B1 (da) DNA-sekvenser, transformerede værtsorganismer, polypeptid med biologisk aktivitet som gamma-hesteinteferon, fremgangsmåde til fremstilling heraf og farmaceutisk præparat indeholdende polypeptidet
US4801685A (en) Microbial production of mature human leukocyte interferon K and L
US4810645A (en) Microbial production of mature human leukocyte interferon K and L
EP0546099B1 (en) Use of human Interferon gamma 4-134
WO1985005618A1 (en) Process for preparing interferon derivative
BG61060B2 (bg) Човешки имунен интерферон
HRP950157A2 (en) Polypeptide with human interferon (ifn-gamma) characteristics
BG60889B2 (bg) Човешки имунен интерферон
Goeddel Microbial production of mature human leukocyte interferons
BG60890B2 (bg) Човешки имунен интерферон
PH26492A (en) Recombinant human immune interferon
NZ214261A (en) Human immune interferon: production by recombinant dna technology
BG60939B2 (bg) Човешки имунен интерферон

Legal Events

Date Code Title Description
SPCG Supplementary protection certificate granted

Spc suppl protection certif: L81

Extension date: 20061016

ND Supplementary protection certificate (spc) granted
MA Patent expired

Owner name: GENENTECH, INC.