HU202287B - Process for producing human immune interferon - Google Patents

Process for producing human immune interferon Download PDF

Info

Publication number
HU202287B
HU202287B HU823305A HU330582A HU202287B HU 202287 B HU202287 B HU 202287B HU 823305 A HU823305 A HU 823305A HU 330582 A HU330582 A HU 330582A HU 202287 B HU202287 B HU 202287B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
plasmid
dna
lys
human
ifn
Prior art date
Application number
HU823305A
Other languages
English (en)
Inventor
Goeddel David Norman Van
Patrick William Gray
Original Assignee
Genentech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=23211703&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HU202287(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Genentech Inc filed Critical Genentech Inc
Publication of HU202287B publication Critical patent/HU202287B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/57—IFN-gamma
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C12N15/71—Expression systems using regulatory sequences derived from the trp-operon
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/811—Interferon
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S930/00—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/01—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/14—Lymphokine; related peptides
    • Y10S930/142—Interferon
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S930/00—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/01—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/30—Signal or leader sequence

Description

A találmány a rekombináns DNS technológia területére vonatkozik; tárgyát a humán immuninterferon DNS-szekvenciának és levezetett aminosav-szekvenciájának felderítésére alkalmas technológiai eszközök és módszerek, valamint azoknak a humán immun interferon előállítására való alkalmazása képezi.
Közelebbről megjelölve, a találmány a humán immuninterferont kódoló DNS-szekuenciák elkülönítésére és azonosítására, valamint ilyen DNS-szekvenciákat tartalmazó és az expressziót eszközlő promoter-szekvenciákhoz működőképesen kapcsolt rekombináns DNS expresszió-hordozók felépítésére és az így felépített expresszió- hordozókra vonatkozik. Vonatkozik másrészről a találmány az íyen expresszióhordozókkal transzformált és így a fent említett DNSszekvenciák expressziójára irányított gazdasejt-kultúra rendszerekre, így például különféle ílymódon transzformált mikroorganizmus- és emlősállat-sejtkultúrákra is. A találmány körébe tartozik továbbá az említett expresszió végtermékeinek átalakítása különféle új termékekké, úgy mint emberek megelőző kezelésére és gyógykezelésére alkalmas gyógyszerkészítményekké. A találmány előnyös kiviteli alakjai olyan különleges expresszióhordozókra vonatkoznak, amelyek humán immun interferon termelésre és a gazdasejtből érett alakban történő kiválasztására képesek. A találmány körébe tartoznak végül az említett DNS-szekvenciák, expresszió-hordozók, sejtkultúra-rendszerek, végtermékek és az azokból képezett további termékek előállítására alkalmazott eljárások is.
A jelen találmány alapját elsősorban a humán immuninterferont kódoló DNS-szekvenciának és levezetett aminosav-szekvenciának a felismerése képezte. A találmányt megalapozó további felismerés a humán immuninterferon 3’- és 5’- szegélyező szekvenciájának felderítése volt, ami megkönnyítette annak in vitro bekapcsolását expresszió-hordozókba. így előállítottuk a feltételezett endogén szignál-polipeptidet kódoló 5’-DNS-szekvenciát, amely közvetlenül megelőzi a feltételezett érett humán immuninterferont. Ezek a felismerések viszont lehetővé tették azoknak az eszközöknek és módszereknek a kifejlesztését, amelyekkel a rekombináns DNS-technológia útján annyi humán immuninterferont állítottunk elő, amennyi elegendő volt e termék biokémiai tulajdonságainak és bioaktivitásának a meghatározására.
A találmány hátterének megvilágítására, valamint az eljárás egyes lépéseinek leírása során további részletes adatokra vonatkozólag számos helyen utalunk a korábbi irodalomra; a szövegben zárójelben álló számok a leírás végén közölt bibliográfiára utalnak.
A találmány technikai háttere
A. Humán interferon
A humán interferonok különböző antigén hatásuk, valamint biológiai és biokémiai tulajdonságaik alalpján három csoportba sorolhatók.
Az első csoportba a leukocita-interferonok családja (α-interferon, LelF vagy IFN-α) tartozik; ezeket rendes körülmények között főként az emberi vért alkotó sejtek termelik, vírusok általi indukció hatására. Ezeket már előállították mikrobiológiai úton is és biológiailag aktívnak találták őket (1, 2, 3). Biológiai tulajdonságaik alapján klinikailag is alkalmazták őket 2 vírusos fertőzések és rosszindulatú megbetegedések gyógykezelésére (4).
A második csoportba a humán fibroblaszt-interferon (β-interferon, FIF vagy IFN-β) tartozik, ezt rendes körülmények között a fibroblasztok termelik, vírusos indukció hatására; szintén előállították már mikrobiológiai úton és azt tapasztalták, hogy biológiai aktivitások széles körét fejti ki (5). Klinikai kísérletek alapján gyógyászati felhasználás is lehetségesnek látszik. A leukocita- és a fibroblaszt- interferonok biológiai tulajdonságaik szempontjából igen határozott hasonlóságot mutatnak, annak a ténynek az ellenére, hogy aminosav-szintjük homológia-foka viszonylag alacsony. Emellett az e két csoportba tartozó interferonok egyaránt 165—166 aminosavat tartalmazó és savakkal szemben stabil fehérjék.
A harmadik csoportba sorolható és a jelen találmány tárgyát képező humán immuninterferon (IFN-γ) vagy más néven humán gamma-interferon az a- és β- interferonokkal ellentétben a pH 2-nél labilis; ezt az interferont limfociták termelik mitogén indukció hatására s antigén tulajdonságai szempontjából is határozottan eltér az elobbiaktől. A humán immun interferont egészen a legutóbbi időkig csak igen kis mennyiségekben sikerült kimutatni és az a körülmény nyilvánvalóan gátolta közelebbi jellemzését. Legutóbb a humán immuninterferon eléggé messzemenő, de még mindig csak részleges tisztításáról számoltak be (6). A közlés szerint a vegyületet fitohemagglutin és forbol-észter kombinációjával gerjesztett leukocitakultúrák termelték és sorozatos kromatográfiai elválasztásokkal tisztították a terméket. Ez az eljárás egy 58 000 molekulatömegű terméket eredményezett.
Igen kis mennyiségekben állítottak elő humán immuninterferont mRNS oocitákban történő transzlációja útján; ez a termék a humán immuninterferonra jellemező interferon-aktivitást mutatott és a szerző véleménye szerint remélhető, hogy az immuninterferon cDNS szintetizálható és klónozható (7).
Az immuninterferon eddig előállított mennyiségei bizonyára nem elegendőek ahhoz, hogy egyértelmű eredményeket adó kísérleteket lehessen folytatni a tisztított termék jellemzésére és biológiai tulajdonságainak meghatározására. Azonban a nyers készítményekkel lefolytatott in vitro kísérletek, valamint az egér-γ- interferon készítményekkel folytatott in vivő kísérletek arra mutatnak, hogy az immuninterferon elsődlegesen valószínűleg immun-szabályozó szerként szerepel (8, 9). Az immuninterferonnak nem csak vírus-ellenes és anticelluláris aktivitása van (ami valamennyi humán interferon közös tualjdonsága), hanem fokozni is képes az a- és β-interferon ilyen irányú hatását (10). Emellett egyes közlések szerint a γ-interferon tumor-sejtekkel szembeni sejtszaporodást gátló hatása körülbelül 10100-szorosan nagyobb, mint az egyéb csoportokba tartozó interferonoké (8, 11, 12). Ezek a megállapítások, az immuninterferon határozott immun-szabályozó szerepével (8, 9) együtt arra mutatnak, hogy az IFN-γ sokkal határozottabb tumor-ellenes hatással rendelkezik, mint az IFN- α és IFN-β.
Valóban, az egér-IFN-γ készítményekkel in vivő folytatott kísérletek azt mutatták, hogy ennek az immuninterferonnak a hatása határozottan felülmúlja a vírus-ellenes indukált egyéb interferonok tumorellenes hatását oszteogén szarkóma ellen (13).
HU 202287 Β
Mindezeket a kísérleteket a jelen találmányt megelőző időben meglehetősen nyers készítményekkel kellett lefolytatni az immuninterferon ilyen nehéz hozzáférhetősége miatt. Eredményeik azonban kétségtelenül az immuninterferon rendkívül fontos biológiai szerepére mutatnak. Az immuninterferonnak nem csak erős vírus-ellenes hatása van, hanem valószínűleg erős immun- szabályozó és tumor-ellenes hatása is, ami határozottan az immuninterferon eredményes klinikai alkalmazásának a lehetőségére mutat.
Úgy találtuk, hogy a rekombináns DNS-technológia alkalmazása látszik a leghatékonyabb módszemek a humán immuninterferon szükséges nagyobb mennyiségeinek az előállítására. Feltételeztük, hogy az így kapott termékek, akár glikozilezettek lesznek akár nem (a glikozilezettséget a natív, humán eredetű termék jellemző tulajdonságának tartják), minden esetre mutatni fognak olyan bioaktivitást, ami lehetővé teszi klinikai alkalmazásukat a vírusos, neoplasztikus és immun-szuppresszált állapotok és megbetegedések széles körében.
B. Rekombináns DNS-technológia
A rekombináns DNS-technlógia ma már igen kifinomult módszerré fejlődött. A molekuláris biológia kutatói már viszonylag könnyen tudnak különböző DNS-szekvenciákat rekombinálni, így új DNS-féleségeket hoznak létre, amelyek bőséges mennyiségben termelnek exogén fehérje-termékeket a transzformált mikroorganizmusokban. Rendelkezésre állnak az eszközök és módszerek különböző tompavégű vagy „ragadós” végű DNS-fragmensek in vitro kapcsolására és így hatékony expresszió-hordozókat állítanak elő, amelyek bizonyos mikroorganizmusok transzformálására használhatók és ezzel irányítani tudják a kívánt exogen tennék szintézisét. Az egyedi termékek termelésére irányuló utak azonban még meglehetősen tekervényesek és így ez a tudomány még nem fejlődött olyan fokra, hogy a kívánt siker rendszeresen előre megjósolható legyen. Valójában azok, akik kísérleti megalapozás nélkül akarják adott esetben a módszer alkalmazásának sikeres eredményét előre megjósolni, ezt csak a sikertelen gyakorlati alkalmazás kockázatával tehetik.
A plazmid, ez a kettős-szálú DNS nem-kromoszóma hurok-képződménye, amely a baktériumokban és egyéb mikroorganizmusokban, sejtenként gyakran többszörös másolatban is található, továbbra is a rekombináns DNS-technológia alapvető eleme marad. A plazmid-DNS-ben kódolt információ magába foglalja a plazmidnak a leány-sejtekben történő reprodukálásához szükséges információt (vagyis a replikáció eredetét) is, valamint rendszerint egy vagy több fenotípusos szelekciós jellemzőt, mint például baktériumok esetében az antibiotikumokkal szembeni rezisztenciát, ami lehetővé teszi a kérdéses plazmidot tartalmazó gazdasejt kiónjainak felismerését és szelektív közegekben történő kedvezőbb szaporítását. A plazmidok hasznossága abból a tényből ered, hogy ezek a plazmidok az egyik vagy másik resztrikciós endonukleáz vagy „resztrikciós enzim” segítségével specifikusan hasíthatók, mert ezeknek az enzimeknek mindegyike más és más helyet „ismer fel” a plazmid-DNS-en. Ezt követően heterológ gének vagy gén-ffagmensek illeszthetők be a plazmidba, e fragmensek végeinek a hasítási helynél vagy a hasítási hellyel szomszédos rekonstruált végeknél történő kapcsolása útján. így képezik az úgynevezett replikálható expresszió-hordozókat. A DNS-rekombináció a sejten kívül megy végbe, de a keletkező „rekombináns” replikálható expresszió-hordozó vagy plazmid a „transzformáció” néven ismert eljárással bevihető a sejtekbe és a transzformáns tenyésztése útján a rekombináns hordozó nagy mennyigei nyerhetők. Emellett, ha a gén beillesztése a plazmidnak bekódolt DNS-üzenet transzkripcióját és transzlációját irányító részeihez viszonyítva helyesen történt akkor az így kapott expresszió-hordozó felhasználható a beillesztett gén által kódolt polipeptid-szekvencia tényleges termelésére; ezt az eljárást nevezik expressziónak.
Az expresszió a „promoter” néven ismert és az RNS-polimeráz által felismert és kötött tartományban kezdődik. Az expresszió transzkripciós fázisában a DNS kitekeredik és hozzáférhetővé teszi az említett DNS-szekvenciából származó tartományt templátként a „messenger”-RNS iniciált szintézise számára. A messenger-RNS viszont az általa kódolt aminosavszekvenciájú polipeptiddé transzlálódik. Minden egyes aminosavat egy-egy nukleotid-triplett vagy „kodon” kódol, ezek a kodonok együttesen képezik a „szerkezeti gént”, vagyis azt a részt, amely kifejezett polipeptid-termék aminosav-szekvenciáját kódolja. A transzláció egy „start”-szignálnál kezdődik (ez rendszerint ATG, amelyből a képződő messenger-RNS-ben AUG lesz).
A transzláció és egyúttal az aminosav képződés végét úgynevezett „stop”-kodon határozza meg. Az így keletkezett tennék mikrobiális rendszerek esetében, ha szükséges, a gazdasejt lízise és a terméknek a jelenlevő egyéb fehérjéktől való elkülönítésére alkalmas tisztítási műveletek útján nyerhető ki.
A gyakorlatban a rekombináns DNS-technológia útján teljesen heterológ polipeptidek expressziója úgynevezett „direkt expresszió” - vagy pedig egy homológ peptid aminoisav-szekvenciájának egy részéhez kötött heterológ peptid expressziója válik lehetségessé. Ez utóbbi esetekben az előállítani kívánt bioaktív termék olykor bioinaktívvá válik az összekepcsolt homológ/heterológ polipeptidben és csak akkor lesz aktív, ha valamely sejten kívüli környezetben lehasítják; vö.: 2 007 676 A sz. brit szabadalmi közrebocsátási irat, továbbá Wetzerl; American Scientist 68, 664 (1980).
C. Sejtkultúra-technológia
A sejt- vagy szövetkultúráknak a genetikai és sejtfiziológiai tanulmányok céljaira történő tenyésztési módszerei jól ismertek. Rendelkezésre állnak az eszközök és módszerek az elkülönített normális sejtekből folytatólagos sorozatos átvitelek útján előállított permanens sejtvonalak fenntartására. Az ilyen sejtvonalak kutatási célokra való fenntartása folyékony közegben tartott szilárd hordozón, vagy pedig a fenntartó tápanyagokat tartalmazó szuszpenzióban való tenyésztéssel történik. Úgylátszik, hogy a nagyméretben történő termelés céljaire való felnagyításhoz már csak mechanikai problémák merülnek fel. Az eddigi ismeretek további részleteire vonatkozólag utalunk a következő irodalomra: Microbiology, 2. kiad., Harper and Row Publishers Inc., Hagerstown, Maryland 3
HU 202287 Β (1973). Különösen az 1122 és köv. old., valamint Scientific American 245, 66. és köv. old. (1981).
A találmány összefoglalása
A jelen találmány azon a felismerésen alapul, hogy a rekombináns DNS-technológia sikeresen alkalmazható humán immuninterferon előnyösen közvetlen alakban és piacon való forgalmazás feltételéül szolgáló állatkísérletek és klinikai kísérletek elkezdéséhez és lefolytatásához elegendő mennyiségekben történő előállítására. A termék valamennyi alakjában alkalmazható embereknél vírusos fertőzések, malignus és immun-szupressziós vagy immun-hiányos állapotok megelőző vagy gyógyászati kezelésére. A tennék említett alakjai sorába különféle lehetséges oligomer, esetleg glikozilezett alakok tartoznak. A terméket genetikailag átalakított transzformáns mikroorganizmusok vagy sejtkultúrák termelik. így a találmány szerinti eljárással a humán immuninterferon az eddiginél hatékonyabb módon termelhető és nyerhető ki. A találmány előnyös kiviteli alakjának egyik jelentős vonása, hogy ezzel az eljárással a mikroorganizmusok vagy sejtkultúrák genetikailag irányíthatók arra, hogy humán immuninterferont izolálható mennyiségekben termeljenek és az érett alakban válasszák ki a gazdasejtből.
A találmány tárgya tehát elsősorban a humán immuninterferon előállítására szolgáló eljárás, amelynek részleteit az alábbiakban ismertetjük. A találmány körébe tartoznak továbbá a humán immuninterferont kódoló gén-szekvenciákat kifejezhető alakban magukban foglaló replikálható DNS expresszió-hordozók, valamint az említett expresszió-hordozókkal transzformáit és humán immuninterferon termelésére képes mikroorganizmus-törzsek és sejtkultúrák, úgyszintén az ilyen immuninterferon génszekvenciák, DNS expresszió-hordozók, mikroorganizmus-törzsek és sejtkultúrák előállítására alkalmas különféle eljárások és azok specifikus kiviteli alakjai is. Vonatkozik továbbá a találmány az említett mikroorganizmusok és sejtkultúrák fermentációjára alkalmas kultúráinak előállítására, valamint humán immuninterferonnak a kultúrák gazdasejtjeiből érett alakban kiválasztott közvetlen expressziős termékként történő előállítására is. Ebben az eljárásban az érett szekvenciáját kódoló gén és a szignál-polipeptidet kódoló 5’-oldallánc-DNS kerülhet alkalmazásra. A szignál-polipeptid feltehetően elősegíti a molekulának a gazdaszervezet sejtfalához való vitelét, majd ott hasad le az érett humán immuninterferon tennék kiválasztási folyamata alatt. Ily módon lehetővé válik a kívánt humán immuninterferon elkülönítése és tisztítása anélkül, hogy külön műveleteket kellene alkalmazni a gazdasejt intracelluláris fehérjéiből és sejt-törmelékekből álló szenynyezések eltávolítására.
Az „érett humán immuninterferon” kifejezésen e leírásban a mikroorganizmusok vagy sejtkultúrák által termelt olyan humán immuninterferont értünk, amelyhez nem kapcsolódik a humán immuninterferonmRNS transzlációját közvetlenül elősegítő szignálpeptid vagy előszekvencia-peptid. így a jelen találmány szerinti eljárással előállított első rekombináns humán immuninterferon metionint tartalmaz első aminosavként (amely az ATG start-szignál kodonnak a szerkezeti gén elé történt beillesztése következtében került oda), vagy ha a metionin intra- vagy extracellulárisan lehasadt, akkor a rendes körülmények között első aminosavként szereplő cisztein áll ezen a helyen. Az érett humán immuninterferon - összhangban a fentiekkel - előállítható valamely, a szokásos szignál-peptidtől különböző konjugált peptiddel együtt is; a konjugátum azután specifikusan lehasíthetó intra- vagy extracelluláris környezetben (vö.: 2 007 676 sz. brit szabadalmi közrebocsátási irat. Végül, előállítható az érett humán immuninterferon közvetlen expresszió útján is, anélkül, hogy bármilyen fölösleges kisérő polipeptidet kellene a termékről lehasítani. Ez különösen olyan esetekben fontos, amikor valamely adott gazdaszervezet nem képes eltávolítani a szignál-peptidet, az expresszió-hordozó viszont úgy van megalkotva, hogy az érett humán immuninterferont szignál-peptidjével együtt.
Az így termelt érett humán immuninterferont azután elkülönítjük és olyan mértékben tisztítjuk, hogy a kapott tennék alkalmas legyen vírusos fertőzések malignu, immun-szupressziv vagy immun-hiányos állapotok gyógykezelésére.
A humán immuninterferon előállítása az alábbi módon történt:
1. Emberi szöveteket, például emberilépszöveteket vagy perifériális vérlimfocitákat mitogén anyagok jelenlétében tenyésztettünk, az immuninterferon termelésének serkentése céljából.
2. Az ilyen sejtkultúrákból kapott sejtpasztillákat ribonukleáz- inhibitor jelenlétében extraháltuk, az öszszes citoplazmás RNS elkülönítése céljából.
3. Egy oligo-dT oszlopon elkülönítettük az összes messenger-RNS-t (mRNS) poliadenilezett alakban. Ezt az mRNS-t méret szerint frakcionáltuk, szacharózsűrűség-grádiens és savas karbamid gélelektroforézis alkalmazásával.
4. Az alkalmas mRNS-frakciót (12-18 S) a megfelelő egyszálú komplementer DNS-sé (cDNS) alakítottuk át, majd ebből kettősszálú cDNS-t képeztünk. Poli-dC végrész-képzés után ezt egy vektorba, például valamely egy vagy több fenotípusos jelzőt (marker) hordozó plazmidba illesztettük be.
5. Az így készített vektorokat használtuk fel azután a baktérium- sejtek transzformálására és így egy kolónia-„könyvtárat” képeztünk. A fent leírt módon kapott indukált és indukálatlan mRNS-ből egyaránt radioaktívan jelzett cDNS-t állítottunk elő és ezt használtuk fel a duplikátum kolónia-„könyvtárak” külön-külön történő vizsgálatára. A cDNS feleslegét ezután eltávolítottuk és a kolóniákat röntgen filmre helyeztük az indukált cDNS-klónok azonosítása céljából.
6. Az indukált cDNS-klónokból elkülönítettük a megfelelő plazmid-DNS-t és szekvenáltuk.
7. A szekvenált DNS-t azután in vitro megfelelően elakítottuk egy alkalmas expresszió-hordozóba való beillesztésre, amelyet egy alkalmas gazdasejt transzformálására használtuk fel; ezt a gazdasejtet egy E. coli kultúrában szaporítottuk és hagytuk, hogy az kifejezze a kívánt humán interferon terméket.
8. A kifejezett humán immuninterferon érett alakjában kétségkívül 146 aminosavat tartalmaz, ciszteintől kezdődően, és igen bázisos jellegű. A monomer számított molekulatömege 17 140. A molekula talán
-4HU 202287 Β a számos aminosav jelenléte, a hidrofóbosság, a só-hídképzés stb. következtében oligomer-alakokba, tehát például dimer-, trimer- vagy tetramer-alakban asszociálódhat. A természetes anyag esetében korábban megfigyelt nagy molekulatömeg (6), amelyek nem magyarázhatók meg csupán az aminosav-szekvencia alapján, valószínűleg az ilyen oligomer-alakoknak, valamint a transzláció utáni glikozileződésből származó szénhidrát jelenlétének tulajdoníthatók.
9. Bizonyos gazdasejt-rendszerekben a humán immuninterferon, különösen ha az egy expressziós hordozóba van kötve és a 20 aminosavat tartalmazó szignál-peptidjével együtt kerül expresszióra, érett alakban kiválasztódik a sejtkultúra közegébe, ami rendkívüli módon megkönnyíti a humán immuninterferon kinyerési és tisztítási módszereit.
A találmány előnyös kiviteli alakjainak leírása
A. Mikroorganizmusok/sejtkultúrák
1. Baktérium-törzsek/promoterek
Az alábbiakban leírt munka során mikroorganizmusként többek között a 2 055 382 A sz. brit szabadalmi közrebocsátási iratban ismertetett E. coli K-12 294 törzset (vég A, thi, hsr, khsm+) alkalmaztuk. Ezt a törzset az American Type Culture Collection gyűjteményében ATCC 31446 sz. alatt helyeztük letétbe. Felhasználhatók azonban a leírt eljárásban adott esetben más mikroorganizmus-törzsek is, mint például az ismert E. coli Β, E. Coli X 1776 (ATCC 31537). E. col. W 3110 (F*, λ’, protrof) (ATCC 27325), valamint más, legnagyobbrészt különböző elismert mikroorganizmus- gyűjteményekben letétbe helyezett és onnan adott esetben beszerezhető mikroorganizmus-törzsek; vö.: például az American Type Culture Collection (ATCC) törzs-katalógusát, valamint a 2 644 432 sz. német szövetségi köztársaságbeli szabadalmi közrebocsátási iratot. Az ilyen mikroorganizmusok további példáiként Bacillus-fajok, mint a Bacillus subtilis és más enterobaktériumok, mint Salmonella typhimurium és Serratia marcesans említhetők; mindezekhez olyan plazmidok alkalmazhatók, amelyek képesek a bennük történő replikációra és heterolog génszekvenciák expressziójára.
Ezek példáiként megemlítjük a béta-laktamáz és laktóz promotar- rendszereket, amelyeket már előnyösen alkalmaztak heterológ polipeptidek mikrobiológiai termelésének iniciálására és fenntartására. Az ilyen promoter-rendszerek kialakítására vonatkozólag vö.: Chang és munkatársai: Natúré 275, 617 (1978), valamint Itakura és munkatársai: Science 198, 1056 (1977). Újabban egy triptofán-alapú rendszert is kifejlesztettek; ennek a trp promoter-rendszer néven ismert rendszernek a kialakítására és szerkezetére vonatkozólag Goeddel és munkatársai: Nucleic Acid Research 8, 4057 (1980), valamint Kleid és munkatársai az 1980. március 24-én bejelentett 133 296 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés leírása tartalmaznak további részleteket. Találtak és alkalmaztak számos másfajta mikrobiális promotert is; ezeknek a nukleotid-szekvenciájára vonatkozólag Siebenlist és munkatársai [Cell 20, 269 (1980)] ismertetnek részletes adatokat, amelyek a szakember számára elegendő kitanítást tartalmaznak ahhoz, hogy ezeket a promotereket funkcionálisan kapcsolhassák plazmid-vektorokba.
2. Élesztő-törzsek/élesztŐ promoterek Ezeknek az expressziós rendszere is képes hasznosítani az YRp7 plazmidot (14, 15, 16), amely mind E. coli sejtekben, mind pedig a Saccharomyces cerevisiae élesztősejtekben képes szelekcióra és replikációra. Az élesztőben való szelekcióhoz a plazmid a TRP1 gént (14, 15, 16) tartalmazza, amely kiegészíti (triptofán távollétében lehetővé teszi) az élesztő IV kromoszómájában talált gének mutációit (17). Ennél a műveletnél az RH218 törzset (18) alkalmaztuk. (Letétbe helyezve korlátozás nélkül az American Type Culture Collection gyűjteményében ATCC 44076 sz. alatt.) Megjegyzendő azonban, hogy bármely trpl sejtet eredményező mutációt tartalmazó Saccharomyces cerevisiae törzs alkalmas környezetül szogálhat az expresszió-rendszert tartalmazó plazmid expressziójához. A felhasználható egyéb törzsek példájaként a pep4-l törzset (19) említjük. Ez a triptofánauxotrof törzs szintén tartalmaz egy pont-mutációt a TRP1 génben.
Az élesztő-génből számazó 5’-szegélyező DNSszekvencia (promoter), ha valamely nem-élesztő gén 5’-oldalára helyezzük, elő képes segíteni valamely idegen génnek az élesztőben történő expresszióját, ha ezt a promotert az élesztő transzformálására alkalmazott plazmidba visszük. A nem-éllesztő génnek az élesztőben való helyes expressziójához a promoter mellett szükség van egy második, a plazmidon a nem-élesztő gén 3’-végéhez illesztett élesztő-szekvenciára is, amely így lehetőséget nyújt a megfelelő transzkripció-terminációra és poliadenilezésre az élesztőben. Ez a promoter megfelelően alkalmazható a jelen találmány szerinti eljárásban, de jól alkalmazhatók más megfelelő promoterek is (lásd alább). A találmány szerinti eljárás előnyös kiviteli alakja esetében az élesztő 3-foszfoglicerát-kináz-génjének 5’-szegélyező szekvenciáját a szerkezeti gén előtti helyre iktatjuk be, majd ezt ismét terminációs-poliadenilezési szignálokat tartalmazó DNS, pédául TRP1 gén (14, 15, 16) vagy PGK-gén (20) követi.
Minthogy az élesztő 5’-szegélyező szekvenciája (3’-terminációs élesztő-DNS-sel kapcsolatban lásd alább) elősegítheti idegen gének expresszióját az élesztőben, valószínűnek látszik, hogy bármely nagy mértékben kifejezett élesztő-gén 5’-szegélyező szekvenciái felhasználhatók fontos gén-termékek expreszsziójára. Minthogy bizonyos körülmények között az élesztő 65%-ig fejezte ki oldható fehérjéjét mint glikolitikus enzimet (21) és minthogy ez a magas expressziós szint láthatólag az egyedi mRNS-ek termelésének magas szintjéből (22) ered, feltehetőleg bármely más glikolitikus gén 5’-szegélyező szekvenciái felhasználhatók ilyen expressziós célokra; így az enoláz, gliceraldehid-3-foszfát- dehidrogenáz, hexokináz, piruvát-dekarboxiláz, foszfoffuktokináz, glükóz-6-foszfát-izomeráz, 3-foszfoglicerát-mutáz, piruvát-kináz, triózfoszfát-izomeráz, foszfoglükóz-izomeráz és glükokináz egyaránt alkalmazhatóknak látszanak erre a célra. E gének 3’-szegélyező szekvenciáinak bármelyike ugyancsak alkalmazható lehet a helyes befejezésre és mRNS-poliadenilezésre az ilyen expressziós rendszerben (lásd fentebb). Más alkalmas nagy expresszió-fokú génekként a savas foszfatázok génjei (23), valamint azok a gének említhetők, amelyeknél az expresszió magas szintje az 5'-szegélyező 5
HU 202287 Β tartományokban fellépő mutációknak tulajdonítható (az expressziót növelő mutánsok), ami rendszerint egy TY1 transzponálható elem jelenlétének a következménye (24).
Úgy véljük, hogy valamennyi fent említett gént az élesztő-RNS- polimeráz II írja át (24). Lehetséges, hogy az RNS-polimeráz I és ΠΙ promoterei, amelyek riboszómális RNS, 5S RNS és tRNS transzkripciójára képesek (24, 25), szintén felhasználhatók az ilyen expressziós rendszerekben.
Végül számos élesztő promoter transzkripciós kontrollt is tartalmaz, így ezek ki- vagy bekapcsolhatók a tenyésztés körülményeinek változtatásával. Az ilyenfajta élesztő-promoterek példáiként a következő fehérjéket kifejező gének említhetők: alkohol-dehidrogenáz II, izocitokrom-c, savas foszfatáz, nitrogénanyagcserével asszociált lebontó enzimek gliceraldehid- 3-foszfát-dehidrogenáz, valamint a maltóz- és galaktóz- hasznosítást eszközlő enzimek (22). Az ilyen szabályozási tartomány igen hasznos lenne a fehérje-termék expressziójának szabályozására, különösen olyan esetekben, amikor ezek termelődése toxikus hatású az élesztőre. Lehetséges lehetne így egy 5'-szegélyező szekvencia szabályozási tartományának az összehozása egy nagy expressziós-fokú génből származó promotert tartalmazó 5'-szegélyező szekvenciával, - ami egy hibrid promotert eredményezne; úgy véljük, hogy ennek lehetségesnek kellene lennie, minthogy a szabályozási tartomány és a promoter egymástól fizikailag különböző DNS-szekvenciáknak látszanak.
3. Sejtkultúra-rendszerek/sejtkultúra-vektorok
A gerincesek sejtjeinek kultúrákban történő szaporítása (szövet- kultúrák tenyésztése) az utóbbi években már rutinmódszerré vált (vö.: Tissue Culture, szerk.: Kruse és Patterson, Academic Press, 1973). Ehhez a COS-7 majomvese-fibroblaszt sejtvonalat alkamazták gazdasejtként humán immuninterferon termelésére (25a). Az itt részletezett kísérletek azonban lefolytathatók lennének bármilyen sejtvonalban amely képes egy kompatibilis vektor replikációjára és expressziójára, így például a WI38, ΒΗΚ, 3T3, CHO, VERŐ és Hela sejtvonalak bármelyikében is. Az expressziós vektorral szemben csupán az a követelmény áll fenn, hogy legyen egy replikációs kezdőpont és egy promoter az exprimálandó gén előtti helyzetben, az adott esetben szükséges riboszómakötési helyekkel, RNS-kapcsoló helyekkel, poliadenilezési helyekkel és transzkripciós terminátor- szekvenciákkal együtt. Bár az itt leírt kísérletekben az SV40 szekvencia e lényeges elemeit hasznosítottuk, meg kell jegyezni, hogy a találmány nincsen erre az előnyös kiviteli alakra, az itt szereplő szekvenciák alkalmazására korlátozva. így például felhasználhatók lennének más virális (például Polyoma, Adeno, VSV, BPV stb.) vektorok replikációs kezdő pontjai, valamint a DNS-replikáció integrálatlan állapotban funkcióképes celluláris kezdőpontjai is.
B. Vektor-rendszerek
1. Érett immuninterferon közvetlen expressziója E. coli sejtekben
Az IFN-γ E. coli sejtekben érett interferon- polipeptidként (mínusz szignál-szekvencia) történő köz6 vetlen expressziójának elérésére alkalmazott eljárás a korábban humán növekedési hormon (26) és humán leukocita-interferon (1) előállítására alkalmazott eljárásnak egy új változata volt, amennyiben szintetikus (N-terminális) és cDNS szekvenciák kombinációját alkalmaztuk.
Az alább ismertetett p69 nukleotid-szekvenciából levezethetően, valamint néhány IFN-α szignál-peptidje és az érett polipeptid közötti ismert hasítási hellyel való összehasonlítás alapján megállapítható, hogy az IFN-γ egy 20 aminosavat tartalmazó hidrofób szignálpeptidet tartalmaz, amelyet az érett IFN-γ 146 aminosav követ (5. ábra). Amint a 7. ábrából látható, egy BstNl resztrikciós endonukleáz hely célszerűen az érett IFN-γ 4helyzetű aminosavánál helyezkedik el. Két szintetikus oligodezoxinukleotidot szerkesztettünk, amelyek egy ATG transzláció-iniciáló kodont, valamint az 1., 2. és
3. aminosav (cisztein-tirozin-cisztein) kodonját foglalják magukban és egy EcoRI tapadó (kohezív) véget alkotnak. Ezeket az oligodezoxinukleotidokat a p69nek egy 100 bázis-párból álló BstNl-Pstl fragmentjéhez kapcsoltuk, hogy így egy 1115 bázispárból álló szintetikus-természetes hibridgént építsünk fel, amely az IFN-γ terméket kódolja és amely az EcoRI és PstI resztrikciós helyek által van határolva. Ezt a gént azután beillesztettük a pLelF A trp 103 plazmidba, az EcoRI és PstI helyek közé, és így a pIFN-γ trp 48 expresszió-plazmidot kaptuk. Ebben a plazmidban az IFNγ gén expressziója az E. coli trp promoter irányítása alatt történik. [A pLelF A trp 103 plazmid a pLelF A 25 olyan származéka, amelyben az LelF A géntől távoleső EcoRI hely el lett távolítva. Az említett EcoRI helynek az eltávolítására alkalmazott eljárást az irodalomban (27) más ismertették.]
2. Expresszió élesztőben
Valamely heterológ gén, például immuninterferon cDNS élesztőben történő expressziójához egy négy komponenst tartalmazó plazmid vektort kellett megszerkeszteni. Az első komponens az a rész, amely lehetőséget hagy a transzformációra mind E. coli, mind élesztősejtekben és ezért tartalmaznia kell egy szelektálható gént mindegyik organizmusból. (A jelen esetben ez az ampicillin- rezisztencia génje E. coliból és a TRPl gén élesztőből.) Ennek a komponensnek tartalmaznia kell továbbá egy replikációs kezdőpontot (origót) mindkét organizmusból, hogy plazmidként maradhasson fenn mindkét organizmusban. (A jelen esetben ez az E. coli kezdőpont a pBR322-ből és az arsl kezdőpont az élesztő III kromoszómájából.)
A plazmid második komponense egy nagy expressziós fokú élesztőgénből származó 5'-szegélyező szekvencia, amelynek célja, hogy elősegítse a hátrább elhelyezkedő szerkezeti gén transzkripcióját. A jelen esetben az élesztő 3-foszfoglicerát- kináz (GK) génjét alkalmazzuk e komponensként. A fragmens megszerkesztése olyan módon történt, hogy a PGK szerkezeti szekvenciából mind az ATG, mind az ATG előtti 8 bázispár eltávolításra kerüljön. Ezt a szekvenciát egy olyan szekvenciával helyettesítettük, amely mind Xbal, mind EcoRI restrikciós helyet tartalmaz, hogy ez az 5’-szegélyező szekvencia kapcsolódhasson a szerkezeti génhez.
A rendszer harmadik komponense egy szerkezeti gén, amely oly módon van megszerkesztve, hogy
HU 202287 Β egy ATG transzlációs startszignál és egy transzlációs stopszignált is tartalmazzon. Az ilyen gén elkülönítésének és megszerkesztésének a módját az alábbiak során ismertetjük.
A negyedik komponens egy élesztő DNSszekvencia, amely egy oly élesztőgén 3’-szegélyező szekvenciáját tartalmazza, amelyben megfelelő szignálok vannak jelen a transzkripció befejezésére és a poliadenilezésre.
Mindezeknek a komponenseknek a jelenlétében vált lehetségessé immun interferon élesztőben történő termeltetése.
3. Expresszió emlősállat-sejtkultúrában
Az immuninterferon emlősállat-sejtkultúrában történő szintézisének stratégiája egy olyan vektor kifejlesztésén alapul, amely képes mind az antonóm replikációra, mind pedig egy idegen génnek egy heterológ transzkripciós egység irányítása alatti expressziójára. E vektornak a szövetkultúrában történő replikációját oly módon értük el, hogy gondoskodtunk egy SV40 vírusbői szárazó DNS-replikációs kezdőpontról, emellett egy segítő funkciót (T-antigén) is létrehozunk a vektornak egy az antigént endogén módon kifejező sejtvonalban való bevezetése útján (28, 29). Az SV40 vírus késői promotere megelőzte az interferon szerkezeti génjét és biztosította a gén transzkripcióját.
Az IFN-γ expressziójának lefolytatására alkalmazott vektor pBR322 szekvenciákból állt, amelyek egy szelektálható jelzőt (marker) nyújtottak az E. coliban történő szelekcióhoz (ampicillin-rezisztencia), valamint egy E. coli kezdőpontját a DNS-replikációhoz. Ezeket a szekvenciákat a pML-1 plazmidból (28) nyertük; ezek átfogták az EcoRI és BamHI resztrikciós helyeket magukban foglaló tartományt. Az SV40-kezdőpontot egy 342 bázis-párt tartalmazó és ezt a tartományt átfogó PvuII-HindlII fragmensből (30, 31) nyertük (amelynek mindkét vége EcoRI végződéssé volt átalakítva). Ezek a szekvenciák, amellett hogy tartalmazzák a DNS-replikáció vírus-kezdőpontját, egyúttal kódolják mind a korai, mind a késői transzkripciós egység promoterjét is. Az SV40 kezdőpont tartományának orientációja olyan volt, hogy az interferont kódoló génnel a késői transzkripciós egység promotere volt szomszédos helyzetben.
A rajzok rövid ismertetése
Az 1. ábra az indukált perifériális vér-limfocita (PBL) poli(A)+RNS szacharóz-grádienses centrifugálását szemlélteti. Az interferon-aktivitásnak két csúcsértéke volt megfigylehető vonalkázott oszlopokkal ábrázolva). 12S és 16S mérettel. A (fentiektől függetlenül centrifugált) riboszómás RNS-jelzők helyzetét az abszorbancia-profil felett jeleztük.
A 2. ábra az indukált PBL poli(A)+RNS savas karbamid-agarózon keresztüli elektroforézisét szemlélteti. Csak egy aktivitás- csúcsérték volt megfigyelhető, amely 18S RNS-sel migrált együtt. A szomszédos sávban vizsgált és etidium-bromidos festéssel láthatóvá tett riboszómás RNS-jelzők helyzetét az aktivitás- profil felett jeleztük.
A 3. ábra 96 kolónia indukált és indukálatlan 32P-jelzett cDNS-próbával kapott hibridizációs képét szemlélteti. 96 egyedi transzformánst szaporítottunk egy mikrotiter-lemezen, a replikátumot két nitrocellulóz-membránon terítettük, majd a szűrőket vagy indukált mRNS-ből (felső kép), vagy indukálatlan PBL-kultúrákból elkülönített mRNS-ből (alsó kép) kapott 32P-jelzett cDNS próbákkal hibridizáltuk. A szűrőket azután a nemhibridizált RNS eltávolítása céljából mostuk, majd röntgenfílmre helyeztük. Ezek a szűrőcsoportok 8300 független kolóniát tartalmazó 86 ilyen szűrőcsoport reprezentáns képviselőjének tekinthetők. Az „indukált” kiónok egyik például szolágló képviselőjét „H12”-ként jelöltük az ábrán.
A 4. ábra a 69-es klón cDNS inszertumának restrikciós endonukleáz „térképe”. A cDNS inszertum PstI helyek (pontok a két végen) és oligo dC-dG farkak (egyszerű vonalak) által van kötve. A resztrikciós nukleázzal végzett hasítás útján kapott fragmensek számát és méretét 5%-os akrilamid-gélen keresztül történő elektroforézis alapján becsültük. Az egyes helyek helyzetét (lásd 5. ábra) nukleinsav-szekvenálás útján azonosítottuk. A legnagyobb nyílt leolvasó fázis kódolási tartományát bekeretezve ábrázoltuk; a vonalkázott tartomány mutatja a feltételezett 20 maradék-szignál peptid-szekvenciát, míg a pontozott szakasz az érett HF szekvenciát (146 aminosav) képviseli. Az mRNS 5’-vége balra, a 3’-vég pedig jobbra van.
Az 5. ábra a p69 piazmid cDNS inszertumának nukleotid- szekvenciáját szemlélteti, az IFN-γ leggyakoribb allél-alakját mutatva. Látható a leghoszszabb nyílt leolvasófázis levezetett aminosavszekvenciája is. A feltételezett szignál-szekvenciát az „SÍ” és „S20” jelek közötti maradékok képviselik.
A 6. ábra az IFN-γ mRNS szerkezetének a leukocita (IFN-α) és fibroblaszt (IFN-β) interferon szekezetével való összehasonlítását mutatja. Az „Immun” jelzésű 69-es klón mRNS-e szignifikánsan nagyobb menynyiségben tartalmaz „lefordítatlan” szekvenciákat.
A 7. ábra az IFN-γ expressziós plazmidjának a pEFN-γ trp48 felépítésének vázlatos diagrammja. Kiindulási anyag a p69 plazmidból származó 1250 bázispárt tartalmazó PstI cDNA.
A 8. ábra az IFN-γ majom-sejtekben történő expressziójára alkalmazott piazmid diagrammja.
A 9. ábra nyolc különböző, EcoRI enzimmel kezelt humán genom DNS-nek a p69 piazmid tyha cDNS inszertumából származó, 32P-jelzett, 600 bázispárt tartalmazó Dde\ fragmemsével történő Southem-féle hibridizációját szemlélteti. Két EcoRI fragmens tisztán hibridizál a próbával mindegyik DNS-mintában.
A 10. ábra nyolc különböző resztrikciós endonukleázzal kezelt humán genomikus DNS-ének a p69 plazmidból származó 32P- jelzett szondával történő Southem-féle hibridizációját mutatja.
All. ábra a pBl vektor 3.1 kbp HintfíXi. inszertum (amelyből a PGK promoter elkülönítése történt) restrikciós térképét mutatja. Látható egy EcoRI helynek és egy Xbáí helynek a PGK gén 5’-szegélyező DNS-ébe való beiktatása.
A 12. ábra az 5’-szegélyező szekvenciát és a PGK gén kezdeti kódoló szekvenciáját mutatja az Xbaí és EcoRI helyek beiktatása előtt.
A 13, ábra egy Xbaí helynek a PGK promoter 8-helyzetébe történő beiktatására, valamint az említett ÁEűI-véget és egy SauiA véget tartalmazó PGK-5’szegélyező szekvencia 39bp fragmentjének elkülönítésére alkalmazott eljárást szemlélteti vázlatosan.
HU 202287 Β
A 14. ábra vázlatosan mutatja egy a fenti 39bp fragmenst, továbbá a Pvwl-től 5a«3A-ig terjedő 265bp PGK-5'-szegélyező szekvenciát (lásd 11. ábra és egy az ΧΑαΙ-hellyel szomszédos EcoRl helyet tartalmazó 300bp fragment felépítési módját.
A 15. ábra az 1500bp PGK promoter-fragmen (HindiíVEcoRl) felépítési módját szemlélteti vázlatosan; ez a fragmen a 14. ábrán vázolt módon felépített fragmens mellett egy ///zizflll-tól ΡνκΙ-ig terjedő 1300bp fragmenst is tartalmaz a PGK-5'-szegélyező szekvbenciából (lásd 11. ábra).
A 16. ábra egy humán immuninterferon élesztőben történő expressziójára alkalmas expressziós vektor összetételét szemlélteti; ez a vektor a módosított PGK-promotert, az IFN-γ cDNS-t és az élesztő-PGKgén terminátor- tartományát tartalmazza, amint ezt az alábbiakban részletesebben ismertetjük.
Az eljárás részletes leírása
A. Az IFN-γ mRNS eredete
Perifériális vér-limfocitákat (PBL) emberi donoroktól szereztünk leukoforézis útján. A PBLs-t Ficoll-hypaque grádiens- centrifugálással tisztítottuk tovább, majd 5xl06 sejt/ml koncentrációig tenyésztettük egy 1% L-glutamint, 25 mM HEPES-t és 1% penicillin-sztreptomicin-oldatot (Gibco, Grand Island, N. Y.) tartalmazó RPMI 1640 táptalajon. Ezeket a sejteket azután nitrogén staphylococcus-enterotoxin Β (1 pg/ml) segítségével indukáltuk IFN-γ termelésére 2448 óra hosszat tenyésztettük őket 37 ’C hőmérsékleten, 5% CÖ2 jelenlétében. A PBL-tenyészethez 0,1 pg/ml dezacetiltimozin-a-l-et adtunk az IFN-γ aktivitás viszonylagos hozamának növelése céljából.
B. A messenger-RNS elkülönítése
Az összRNS-nek a PBL kultúrákból való extrakcióját lényegileg az S. L. Berger és munkatársai (33) által leírt módszerrel végeztük. A sejteket centrifugálással tömörítettük, majd 10 mmól/1 nátrium-kloridot, 10 mmól/1 trisz-hidrokloridot (pH=7,5) 1,5 mmól/1 magnézium-kloridot és 10 mmól/1 ribonukleozid-vanadil-komplexet tartalmazó oldatban újra szuszpendáltuk őket. NP-40 (1%-os végkoncentrációban) való hozzáadásával lizáltuk a sejteket és a sejtmagokat centrifugálással tömörítettük. Az összRNS-t a szupematáns folyadék tartalmazta, ezt fenollal és kloroformmal való többszöri extrakcióval tisztítottuk tovább. A vizes fázishoz nátrium-kloridot adtunk 0,2 mól/1 koncentrációig, majd kétszeres térfogatú etanol hozzáadása útján az összRNS-t leválasztottuk. Az indukálatlan (nem-stimulált) kultúrákból ugyanezzel a módszerrel választottuk le az RNS-t. Oligo-dT cellulóz-kromatográfiát alkalmaztunk az mRNS-nek a teljes RNS-készítményekből történő tisztítására (34). 1-2 liter PBL kultúrából 5-10 mg összes RNS és 50-200 pg Poly(A)+RNS volt általában kinyerhető.
C. Az mRNS méret szerinti frakcionálása
Kétféle módszert alkalmaztunk az mRNS-készítmények frakcionálására. Ezeket a módszereket egymástól függetlenül (tehát nem együttesen) alkalmaztuk; mindkettővel az IFN-mRNS szignifikáns mértékű dúsítását értük el.
Az mRNS frakcionálására elsősorban formamid denaturálószer jelenlétében történő szacharóz-grádiens centrifugálást alkalmaztunk. 70%-os formamidban 5%-tól 25%-ig menő szacharóz- grádienssel (32) centrifugáltunk 154 000 g-vel, 20 ’C hőmérsékleten, 19 óra hosszat. 0,5 ml-es egymásutáni frakciókat vezettünk el a gárdiens tetejéről, ezeket etanollal lecsaptuk és egy-egy hányadrészt Xenopus laevis oocitákba injektáltunk az mRNS transzlációja céljából (35). 24 óra hosszat inkubáltunk szobahőmérsékleten, majd az inkubációs közeget vírusellenes aktivitásra vizsgáltuk a standard citopátiás hatás-gátlási módszerrel, vezikuláris sztomatitisz-vírus (Indiana-törzs), vagy enkefalomiokarditisz-vírus WISH (humán amnion) sejteken, a Stewart (36) által leírt módon, azzal az eltéréssel, hogy a mintákat 4 óra helyett 24 óra hosszat inkubáltuk a sejtekkel a vírussal történő fertőzés előtt. Minden esetben két aktivitásértéket figyeltünk meg a szacharóz-gradienssel frakcionált RNS-sel (1. ábra). Az egyik csúcs 12S számított méretnek megfelelően ülepedett és 1 mikrogramm injektált RNS-re számítva 100-400 egység/ml vírusellenes aktivitást tartalmazott (egy IFN-α standardhoz viszonyítva). A másik csúcs 16S méretnek megfelelően ülepedett és körülbelül fele akkora aktivitást mutatott, mint az előbbi, lassabban ülepedő csúcs. Úgy látszik, hogy mindkét aktivitási csúcs ΙΡΝ-γ-tól származik, mert ha ugyanezeket a frakciókat MDBK marha-sejtvonalonvizsgáltuk (amelyet a humán IFN-γ tudvalevőleg nem véd), akkor nem tapasztaltunk semmi aktivitást. Ha viszont IFN-α aktivitás illetőleg IFN-β aktivitás lett volna jelen, ez az MDBK próbával (5) könnyen kimutatható lett volna.
200 pg mRNS-t elektroforézissel is frakcionáltunk, savas karbamid-agaróz gélen keresztül. Az agaróz gél-lemez (37, 38) 1,75% agarózt, 0,025 mól/1 nátrium-citrátot (pH-3,8) és 6 mól/1 karbamidot tartalmazott. Az elektroforézist 25 milliamper árammal, 4 ’C hőmérsékleten, 7 óra hosszat végeztük. A gélt ezután borotvapengével szeleteltük frakciókra. Az egyes szeleteket 70 ’C hőmérsékleten megolvasztottunk, majd fenollal kétszer, kloroformmal pedig egyszer extraháltuk. A frakcióat ezután etanollal lecsaptuk, majd Xenopus laevis oocitákba történő injekció és vírusellenes próba útján vizsgáltuk IFN-γ mRNS tartalomra. A gél-frakció mintákban csupán egyetlen aktivitásértéket találtunk (2. ábra). Ez a csúcs a 18S RNS-sel együtt migrált és az injektált RNS 1 mikrogrammjára számítva 600 egység/ml aktivitást mutatott. Ez az aktivitás is specifikusan IFN-γ aktivitásnak mutatkozott, mintogy az MDBK sejteknek nem nyújtott védelmet.
A szacharóz-grádienssel történő frakcionálás aktivitás- csúcsértékei (12S és 16S) és a savas karbamid-gélen történő frakcionálás aktivitásértéke (18S) közötti eltérés azzal a megfigyeléssel magyarázható, hogy ezeket az egymástól független frakcionálási módszereket nem végeztük teljesen denaturáló körülmények között.
D. IFN-γ szekvenciákat tartalmazó kolónia-„könyvtár” előállítása pg gélen frakcionált mRNS-t alkalmaztunk kettősszálú cDNS standard eljárásokkal (26, 39) történő előállítására. A cDNS-t méret szerint ffakcionáltuk 6%-os poliakrilamid gélen. Elektroelúció útján két méret szerinti frakciót kaptunk, 800-1500 bázis-párral
-8HU 202287 Β (138 ng) illetőleg 1500 feletti bázis-párral (204 ng). Mindkét méretű eDNS frakcióból egy-egy 35 ng-nyi részt dezoxiC maradékkal hosszabbítottunk meg terminális dezoxinukleotidil-transzferáz (40) alkalmazásával és a PstI helyen hasonló módon dezoxiG maradékkal meghosszabbított pBR322 plazmiddal (300 ng) kezeltük őket (41). Mindkét ily módon kezelt elegyet azután E. coli K12 294-törzsbe transzformáltuk. Megközelítőleg 8000 transzformánst kaptunk a 800-1500 bp eDNS frakcióval és 400 transformánst az 1500 feletti bp eDNS frakcióval.
E. A kolónia-könyvtárak szűrővizsgálata indukált cDNS-re
Az egyes kolóniákat külön-külön beoltottuk mikrotiter-lemezek LB (58) mellett 5 pg/ml tetraciklint tartalmazó mélyedéseibe és dimetil-szulfoxid 7% koncentrációig történő hozzáadása után -20 ’C hőmérsékleten tároltuk a lemezeket. A kolónia-könyvtár két kópiáját hagytuk kifejlődni nitrocellulóz szűrőkön, majd mindegyik kolóniából a DNS-t Grunstein-Hogness (42) módszere szerint rögzítetük a szűrőhöz.
Indukált és indukálatlan PBL tenyészetekből 32Pvel jelzett eDNS próbákat készítettünk ezután, gélen frakcionált 18S mRNS felhasználásával. Oligo dTi2-i8 prímért alkalmaztunk és a reakciót a már leírt (1) körülmények között folytattuk le. A eDNS 600-1500 bp méretű frakcióiból kapott 8000 transzformánst, valamint eDNS 1500 bp méretű frakcióiból kapott 400 transzformánst tartalmazó szűrőket 20x106 cpm indukált 32P-cDNS-sel hibridizáltuk. Egy hasonló módon elkészített párhuzamos szűrő-sorozatot 20x10^ cpm indukálatlan 32P-cDNS-sel hibridizáltunk. A hibridizálást 16 óra hosszat folytattuk a Fritsch és munkatársai (43) által leírt körülmények között. A szűrőket ezután alaposan mostuk (43) majd 16-48 órai időtartamra Kodak XR-5 röntgen-filmre helyeztük őket Dupont „Lightning-plus” erősítő szűrő alkalmazásával. Mindegyik kolónia esetében összehasonlítottuk egymással a két próbával kapott hibridizáció- képet. A kolóniák körülbelül 40%-a tisztán megállapíthatóan hibridizált mindkét próbával, míg a kolóniák körülbelül 50%-a a szondák egyikével nem mutatott hibridizációt (lásd 3. ábra). 124 kolónia szignifikáns módon hibridizált az indukált próbával, de nem volt kimutatható (vagy igen gyenge volt) hibridizációjuk az indukálatlan próbával. Ezeket a kolóniákat azután külön-külön inokuláltuk mikrotiter-lemezek mélyedéseibe, hagytuk kifejlődni őket, majd nitrocellulózszűrőkre vittük át és ugyanazzal a két próbával hibridizáltuk őket a fent leírt módon. Valamennyi ilyen kolóniából elkülönítettük a plazmid DNS-t egy ismert gyors módszer (44) alkalmazásával, ezt szintén nitrocellulóz-szűrőkhöz kötöttük és hibridizáltuk (45) az indukált illetőleg indukálatlan próbákkal. 22 kolóniából kapott DNS csupán az indukált próbával hibridizált; ezeket „indukált” kolóniákként jelöltük meg.
F. Az indukált kolóniák jellemezése.
Öt indukált kolóniából plazmid-DNS-t készítettünk (46) és ezt a eDNS betétek jellemzésére használtuk fel. Az 5 indukált plazmid (p67, p68, p69, p71 és p72) restrikciós endonukleáz-térképe azt mutatta, hogy ezek közül négy plazmidnak hasonló restrikciós nukleáz térképe volt. E négy plazmid (p67, p69, p71 és p72) egyaránt 4 Ddel helyet, 2 Hinfl helyet és egyetlen Rsal helyet tartalmazott a eDNS inszertumban. Az 5. plazmid (p68) egy közönséges Ddel fragmenst tartalmazott és a másik négyhez viszonyítva rövid eDNS kiónnak látszott. A restrikciós nukleáztérképek által mutatott homológiát a hibridizáció eredménye is megerősített. A p67 plazmid egy 600 bp Ddel fragmenséből egy 32P-vel jelzett DNS próbát készítettünk (47) és ezt a többi indukált kolónia hibridizálására (42) alkalmaztuk. Mind az öt restrikciós nukleázzal térképezett kolónia kereszt-hibridizációt mutatott ezzel a próbával, ugyanúgy mint az indukált/indukálatlan szűrővizsgálattal kapott 124 kolóniából kiválasztott 17 további kolónia mindegyike is. Az ezekben a kereszt-hibridizáló plazmidok mindegyikében lévő eDNS inszertum hosszúságát PstI enzimes kezeléssel és gél-elektroforézissel határoztuk meg. Úgy találtuk, hogy a 69-es klón tartalmazza a leghosszabb eDNS inszertumot, ennek hossza 12001400 bázis-pár volt. Az összes további kísérlethez ezt a DNS-t alkalmaztuk; restrikciós endonukleáztérképét a 4. ábra mutatja.
A p69 cDNS-inszertuma nem más, mint az IFN-γ eDNS, amely három egymástól független expressziós rendszerben termelődött és vírusellenes aktivitást mutat, amint ezt az alábbiakban részletesebben ismertetjük.
G. A p69 cDNS-inszertumának szekvencia-analízise
A p69 plazmid cDNS-inszertumának teljes nukleotid-szekvenciáját a didezoxinukleotid lánc-terminációs módszerrel (48) határoztuk meg fragmenseknek az M13 mp7-vektorba történő szubklónozása (49) után; meghatároztuk továbbá ezt a szekvenciát a Maxam-Gilbert-féle kémiai eljárással (52) is. A leghossazbb nyílt leolvasó-fázis egy 166 aminosavból álló fehérjét kódol; ezt az 5. ábra szemlélteti. Az első kódolt maradék a eDNS 5’-végén elsőnek talált metkodon. Az amino-végen álló első 20 maradék valószínűleg szignál-szekvenciául szolgál a fennmaradó 146 aminosav szekréciójához. Ez a feltételezett szignál-szekvencia olyan vonásokat mutat - mint a méret és a hidrofobitás - amelyek közösek más már jellemzett szignál-szekvenciák megfelelő vonásaival. Emellett a feltételezett hasítási szekvenciánál talált négy aminosav (ser-leu-gly-cys) azonos több leukocita- interferon, mint a LelF B, C, D, F és H (2) hasítási pontjánál levő négy maradékkal. A kódolt érett, 146 aminosavat tartalmazó szekvencia (a továbbiakban „rekombináns humán immuninterferon”) molekulatömege 17140.
A kódolt fehérje-szekvenciában két lehetséges glikozilezési hely (50) van, a 28-30 aminosavaknál (asn-gly-thr) és a 100-102 aminosavaknál (asn-tyrser). E helyek létezése összhangban áll a humán-γ megfigyelt glikozileződésével (6, 51). Emellett a jelenlevő összesen két cisztein-maradék (az 1- és 3helyzetben) sztérikusan túlságosan közel van egymáshoz, hogy diszulfid-hidat képezhessen, ami szintén összhangban áll az IFN-γ redukálószerek, mint βmerkapto-etanol jelenlétében megfigyelt stabilitásával (51). A levezetett érett aminosav-szekvencia általában eléggé bázikus, 30 összes lizin-, arginin- és hiszti9
-9t din-maradékkal és csupán 19 összes aszparaginsavés glutaminsav-maradékkal.
A p69 plazmid DNS-szekvenciájából levezethetően az IFN-γ mRNS-jének szerkezete határozottan eltér az IFN-α (1, 2) illetőleg IFN-β (5) mRNS-jének szerkezetétől. Amint ezt a 6. ábra szemlélteti, az IFN-γ kódolási tartománya rövidebb, míg az 5’-lefordítatlan és 3’-lefordítatlan tartományok jóval hosszabbak, mint akár az IFN-α, akár az IFN-β megfelelő tartományai.
H. Rekombináns humán immuninterferon kifejeződése E. coli-ban
Amint a 7. ábra szemlélteti, 50 gg p69 plazmidot PstI enzimmel kezeltünk, majd az 1250 bázispárt tartalamzó inszertumot 6%-os poliakrilamid-gélen lefolytatott gélelektroforézissel különítettük el. Körülbelül 10 gg ilyen inszertumot elektroelúció útján nyertünk ki a gélből. 5 gg ilyen PstI fragmenst 3 egység BstNI enzimmel (Bethesda Research Labs) 15 percig kezeltünk 37 °C hőmérsékleten részlegesen lebontás céljából, majd a reakcióelegyet 6%-os poliakrilamid-gélen tisztítottuk. Körülbelül 0,5 gg mennyiségben nyertük ki a kívánt, 1100 bázispárt tartalmazó BstNl-Pstl fragmenst. A két említett dezoxioligonukleotidet 5 ’-dAATTCATGTGTTATTGTC és 5’-dTGACAATAACACATG (7. ábra) - a foszfotriészter-módszerrel (53) szintetizáltuk, majd az alábbi módon foszforileztük őket: mindkét dezoxioligonukleotidből 100 pmól mennyiséget egyesítettünk egymással 30 gl 60 mmól/1 trisz-HCl (pH-8), 10 mmól/1 magnézium-klorid, 15 mmól/1 β-merkaptoetanol és 240 gCi (γ-32Ρ)ΑΤΡ (Amersham, 5000 Ci/mmól) tartalmú elegyben. Ehhez az elegyhez azután 12 egység T4 polinukleotid- kinázt adtunk és az elegyet 30 percig hagytuk reagálni 37 ’C hőmérsékleten. Ezt követően 1 gl 10 mmól/1 ATP-oldatot adtunk hozzá és az elegyet további 20 percig hagytuk reagálni. Fenollal és kloroformmal történő extrakció után a kapott oligomereket a BstNl-Pstl 1100 bázispárt tartalmazó fragmens 0,25 gg-jával elegyítettük és etanollal lecsaptuk. Az így kapott fragmenseket 20 mmól/1 trisz-HCl (pH»7,5), 10 mmól/1 magnézium-klorid, 10 mmól/1 ditio-treitol, 0,5 mmól/1 ATP és 10 egység T4 DNS-ligáz tartalmú oldat 30 gl-jével óra hosszat kezeltük 20 ’C hőmérsékleten. Az elegyet azután a kohezív végek kapcsolódása révén fellépő polimerizáció kiküszöbölése céljából 1 óra hosszat kezeltüók 31 egység PstI és 31 egység EcoRI enzimmel, majd 6%-os poliakrilamid-gélen történő elektroforézisnek vetettük alá. Az 1115 bázispárt tartalmazó terméket (110 000 cpm) elektroelúció útján nyertük ki.
A pLelF A trp 103 plazmid (7. ábra) a pLelF A 25 plazmid (1) olyan származéka, amelyből a LelF A génhez távoleső EcoRI-helyet eltávolítottuk (27).
gg pLelF A trp 103 plazmidot 20 egység EcoRI és 20 egység PstI enzimmel kezeltünk 90 percig 37 ’C hőmérsékleten, majci 6%-os poliakrilamid-gélen elektroforizáltuk. A nagy (körülbelül 3900 bázispárt tartalmazó) vektor-fragmenst elektroelúció útján nyertük ki. Az 1115 bázispárt tartalmazó EcoRl-Pstl IFN-γ DNS-fragmentet 0,15 gg fenti módon előállított vektorba kapcsoltuk. Az É. coli K-12 294 törzs (ATCC 31 446 sz.) transzformációja 120 tetraciklinrezisztens kolóniát eredményezett.
Plazmid DNS-t állítottunk elő 60 fenti módon kapott transzformánsból, majd ezeket EcoRI és PstI enzimmel kezeltük. Az így kapott plazmidokból három tartalmazta a kívánt 1115 bázispártról álló EcoRl-Pstl fragmenst. A DNS szekvencia-analízise igazolta, hogy ezeknek a plazmidoknak a kívánt nukleotid- szekvenciájuk van a trp promoter, szintetikus DNS és cDNS közötti kapcsolódási helyeknél. A további vizsgálatokhoz e plazmidok egyikét, a pIFN-γ trp 48 plazmidot választottuk. Ezt aplazmidot használtuk föl az E. coli K-12 W3110 törzs (ATCC 27 325 sz.) transzformálására.
I. Az IFN-y-kódoló szekvencia génszerkezete
Az IFN-γ-1 kódoló gén szerkezetét a Southem-féle hibridizációs módszerrel vizsgáltuk. E módszer (54) szerint 5 gg nagy molekulatömegű humán limfocita DNS-t [amelyet az irodalomban (55) leírt módon állítottunk elő] különböző restrikciós endonukleázokkal kezeltünk az emésztés befejezéséig, majd 1,0%-os agaróz-gélen (56) elektroforézisnek vetettük alá és nitrocellulóz-szűrűre (54) itattuk fel a terméket. A p69 cDNS-inszertumának 600 bázispárt tartalmazó Ddel fragmentjéből egy 32P-jelzett DNS-próbát állítottunk elő (47) és ezt a fenti nitrocellulóz-DNS készítménnyel hibridizáltuk (43). A próba 107 cpm/percet számláló mintáját 16 óra hosszat hibridizáltuk, majd az irodalomban (43) leírt módon mostuk. Különböző humán donorokból származó 8 genomos DNS-mintát az EcoRI restrikciós endonukleázzal kezeltünk, majd ezeket is hibridizáltuk a p69 32P-jelzett szondával. Amint ezt a 9. ábrán szemléltetjük, két tiszta hibridizácós szignál volt megfigyelhető, amelyek mérete 8,8 kilo-bázispár (kbp). illetőleg 2,0 kbp volt (a HindHl enzimmel kezelt LDNS mobilitásával való összehasonlítás alapján becsült értékek). Ez az eredmény vagy két IFN-γ géntől, vagy pedig egyetlen, egy EcoRI hely által hasított géntől származhat. Minthogy a p69 cDNS nem tartalmaz EcoRI helyet, egy belső EcoRI helyet tartalmazó közbelépő (intron) szekvenciára volna szükség ahhoz, hogy egyetlen gén feltételezésével magyarázzuk meg a fenti eredményt. Abból a célból, hogy a fenti két lehetőség között különbséget tehessünk, egy további Southem-féle hibridizációt végeztünk ugyanazzal a szondával, egyetlen humán DNS 5 további endonukleázos emésztési termékével (10. ábra). Két hibridizáló DNS-fragmentet kaptunk két további endonukleázos emésztési termékből: EvmII (6,7 kbp és 4,0 kbp) és HincTl (2,5 kbp és 2,2 kbp). Három endonukleázos emésztés adott csupán egyetlen hibridizáló DNS-fragmenst, HindlII (9,0 kbp), Bglil (11,5 kbp) és BamHI (9,5 kbp). Két IFN-γ gént kellett volna kapcsolni szokatlanul kis távolságra egymástól (kevesebb, mint 9,0 kbp) ahhoz, hogy ezek ugyanabban a HindlII hibridizáló fragmentben foglaljanak helyet. Ez az eredmény arra mutat, hogy csupán egyetlen homológ IFN-γ gén (számos rokon IFN-α géntől eltérően) van jelen a humán genomiális DNS-ben és hogy ezt a gént egy vagy több, EcoRI, PvuII és HincH helyeket tartalmazó intron hasítja. Ezt a feltevést támogatja az a hibridizációs kísérlet is, amelyet éppen a p69 cDNS 3’-lefordítatlan tartományából készített 32P-jelzett (47) fragmenssel (103 bp Ddel fragment 860 bp-től 990 bp-ig az 5. ábrán) végeztünk egy humán
-101
HU 202287 Β genomiális DNS EcoRI emésztési termékkel szemben. Ehhez a próbához csak a 2,0 kbp EcoRI fragmens hibridizált, ami arra mutat, hogy ez a fragment a 3’-lefordítatlan szekvenciát tartalmazza, míg a 8,8 kbp EcoRI fragmens tartalmazza az 5’-lefordítatlan szekvenciát. Az IFN-γ gén szerkezete (egy gén, legalább egy intronnal) határozottan eltér az IFN-α [több gén (2) intronok nélkül (56)] és az IFN-P-tól [egy gén intronok nélkül (57)].
J. Baktérium-kivonatok készítése
Az E. coli W3110 pEFN-γ trp 48 törzs éjjelen át inkubált kultúráját pIFN-γ trp 48 hozzáadásával (Luria húsfőzet+5 pg/ml tetraciklint tápközegben) alkalmaztuk egy 0,2% glükózt, 0,5% kazamínosavat és 5 pg/ml tetraciklint 1:100 hígításban tartalmazó M9 tápközeg (58) beoltására. Ehhez azután indol- akrilsavat adtunk 20 pg/ml végkoncentrációig, amikor az A550 érték 0,1 és 0,2 között volt. A550-l,O-nál centrifugálás útján 10 ml-es mintákat dolgoztunk fel és a kinyert terméket azonnal újra szuszpendáltuk 1 ml foszfát puffer sóoldatban, amely 1 mg/ml marha szérum-albumint tartalmazott (PBS-BSA). A sejteket szonikálás útján feltártuk és a sejt-törmelékeket centrifugálással eltávolítottuk. Az elkülönített szupematáns oldatot a további feldolgozásig 4 °C hőmérsékleten tároltuk. A szupematáns oldatok interferon-aktivitását IFN-α standardokkal való összehasonlítás útján a citopátiás hatást (CPE) gátlási próbával határoztuk meg és 250 egység/ml-nek találtuk.
K. Élesztő-törzsek transzformációja és közegek
Az élesztő-törzsek transzformációja az irodalomban (59) leírt módszerekkel történt. Az E. coli JA300 (thr LeuB6 thi thyA trp (1117) hsdm' hsdR' strR) törzsek (20) alkalmaztuk funkcionális TRPI gént tartalmazó plazmidok szelektálására. Az (a trpl gall SUC2 mai CUP I) genotípusú RH21 8 élesztő-törzset alkalmaztuk élesztőtranszformálására gazdaszervezetként. Az RH218 törzset az American Type Culture Collection gyűjteményében ATCC 44076 sz. alatt helyeztük letétbe korlátozás nélkül. A Miller (58) által leírt M9 minimális tápközeget 0,25% kazaminosav (CAA). LB dús tápközeggel és 20 pg/ml, ampicillin hozzáadásával autoklávban sterilizátuk és lehűtöttük. Az élesztő szaporítására 1% élesztőkivonatot, 2% peptont és 2% glükózt ±3% Difco agart tartalmazó YEPD tápközeget és 6,7 g/1 aminosavak nélküli élesztő- nitrogénbázist (YNB, Difco), 10 mg/1 adenint, 10 mg/1 uracilt, 5 g/1 kazamínosavat (CAA), 20 g/1 glükózt és ± 30 g/1 agart tartalmazó YNB+CAA tápközeget alkamaztunk.
L. Élesztő expressziós vektorfelépítése
1. lOpg Yrp7-et (14, 15, 16) EcoRI enzimmel kezeltük. A kapott tapadó DNS-végeket DNS-polimeráz I (Klenow-fragmen) alkalmazásával tettük tompákká. A vektrot és az inszertumot 1%-os agaróz-gélen (SeaKem) futtatok, kivágtok a gélről, elektroeluáltuk, egyenlő térfogatú kloroform és fenol elegyével kétszer extraháltuk, majd etanollal kicsapatuk. A kapott tompavégú DNS-molekulákat 50 ml végtérfogatban 12 óra hosszat ligáltuk 12 °C hőmérsékleten. Ezt a ligációs elegyet használtuk fel azután az E. coli JA300 törzs transzformálására ampicillin-rezisztenciára és triptofán-prototró. A TRPI gént mindkét orientációban tartalmazó palzmidokat különítettünk el. A pFRWl plazmid a TRPI gént ugyanolyan orientációban tartalmazta, mint az Yrp7, míg a pFRW2 plazmid a TRPI gént az ellenkező orientációban tartalmazta.
ug pFRW2 plazmidot //í'nJIII-mal linearizáltunk és 1%-os agarózgélen elektroforizáltuk. A lineáris molekulákat eluáltuk a gélről és 200 ng-ot a pBl plazmid (13) 3.1 kb HindllI inszertumának 500 ngjával kapcsoltunk (ez utóbbi egy restrikciós fragmens, amely az élesztő 3-foszfoglicerát-kináz génjét tartalmazza). A ligációs elegyet hasnáltuk fel azután az E. coli 294 törzs ampicilin-rezisztenciára és tetraciklin- szenzitivitásra való transzformálására. Az egy ilyen rekombinánsból előállított plazmid egy intakt TRPI gént tartalmazott, a pBl betét-DNS 3.1 kbp Hindin fragmentjével a tetraciklin-rezisztencia gén Hindin helyén. Az így kapott termék a pFRM31 plazmid. 5 pg pFRM31 plazmidot teljesen lebontottuk EcoRI enzimmel; a terméket fenollal és kloroformmal kétszer extraháltuk, majd etanollal kicsaptok. A kapott molekula kohezív végeit DNS-polimeráz I (Klenow fragmens) alkalmazásával betöltöttük, oly reakcióelegyben, amelyben mindegyik dezoxinukleozid-trifoszfátot 250 pmól koncentrációra állítottuk be. A reakciót 20 percig folytattuk 14 °C hőmérsékleten, ekkor a DNS-t fenol és kloroform elegyével kétszer extraháltuk és etanollal kicsaptuk a terméket. Az újból szuszpendált DNS-t azután Clal enzimmel teljesen lebontottuk, majd 6%-os akrilamidgélen elektroforizáltuk. A vektor-fragmenst eluáltuk a gélről, fenol és klorform elegyével extraháltuk és etanollal kicsaptuk.
A humán eredetű tisztított 3-foszfoglicerát enzim hat N-terminális aminosava a következő volt:
1- 2 - 3-4 - 5-6
SER - L'EU - SER - HSM - LYS - LEU A belső Hincll helyet tartalmazó 141 bp Sau 3A-Sau 3A restrikciós fragmens (lásd a PGK restrikciós térképet a 11. ábrán) DNS-szekvenciájából kapott transzlációs leolvasófázisok egyike az alábbi aminosav-szekvenciát képezi:
1-2-3-4-5-6
Met - SER - LEU - SER - SER - LYS - LEU A kezdeti metoinin eltávolítása után látható, hogy a PGK N-terminális aminosav-szekvenciájának 6 aminosava közül 5 homológ a humán PGK N-terminális aminosav-szekvenciájával.
Ez a szekvencia-meghatározási eredmény arra mutat, hogy a pBl plazmid 141 bp Sau3A restrikciós fragmensében a DNS az élesztő-PGK szerkezeti gén kezdeti szakaszát kódolja. Korábbi kutatások (20) azt mutatták, hogy a PGK mRNS-t képező DNS-szekvenciák a Hindui fragmens tartományában foglalhatnak helyet. A 141 bp Sau3A fragmens további szekvencia-képzése a PGK promoter több DNS-szekvenciáját eredményezte (12. ábra).
Egy 5’ATTTGTTGTAAA3’ szekvenciájú szintetikus oligonukleotidot szintetizáltunk a szokásos módszerekkel [vö.: Crea és munkatársai: Nucleic Acids Rés. 8, 2331 (1980)]. E primer 100 ng-ját az 5’-végnél 32P-vel jeleztük 10 egység T4 plinukleotid-kináz alkalmazásával egy 200 pCi [γ^2-Ρ] ATP-t is tartalmazó 20 pl reakcióelegyben. Ezt a jelölt primer-oldatot 11
-111
HU 202287 Β használtuk fel azután egy primer-javítási reakcióban, amely úgy volt megtervezve, hogy első lépés legyen egy többlépéses eljárásban egy EcoRI restrikciós helynek a PGK szerkezeti gén szekvenciáját éppen megelőző PGK-5'-szegélyező DNS-be való bevitelére.
100 pg pBl plazmidot (20) teljesen lebontottunk HaellI enzimmel, majd 6%-os poliakrilamid-gélen futattuk. Az etidummal megfestett gél legfelső sávját (amely a PGK promoter- tartományt tartalmazza) a fentebb ismertetett módon, elektroleució útján elkülönítettük. Az így kapott terméket, amely a DNS 1200 bp HaellI darabja, fíincll-vel emésztettük, majd 6%-os akrilamid-gélen futtattuk. A 650 bp sávot elektroelúció útján elkülönítettük. 5 pg DNS-t kaptunk. A DNS mellett a 650 bp-os HaeUl-Hincll darabját 20 pl vízben újból szuszpendáltuk, majd a fent leírt foszforilezett primer-oldat 20 pl-jével elegyítettük. Ezt az elegyet fenol és kloroform elegyével egyszer extraháltuk, majd etanollal lecsaptuk a terméket. A szárított DNS-t 50 pl vízben újból szuszpendáltuk, majd egy forrásban levő vízfíirdőben 7 percig melegítettük. Az oldatot azután szárazjég-etanol fürdőben hirtelen (10-20 másodperc alatt) lehűtöttük, majd jeges vízfürdőbe vittük át. Ehhez az oldathoz 50 pl olyan oldatot adtunk, amely 10 pl 10X DNSpolimeráz I puffért (Boehringer Mannheim), mindegyik dezoxinukleozid- trifoszfát 10 ml-jét (dATP, dTTP, dGTP és dCTP) 2,5 mmól/1 koncentrációban tartalmazó oldatot, 25 pl vizet és 5 egység DNSpolimeráz I Klenow-fragmenst tartalmazott. Ezt a 100 pl reakcióelgyet 4 óra hosszat inkubáltuk 37 °C hőmérsékleten. Ezután fenol-kloroform elegyével egyszer extraháltuk, a terméket etanollal kicsaptuk, liofileztük és 10 egység &zu3A-val teljesen emésztettük. A kapott oldatot 6%-os poliakrilamid-gélen futtattuk. A 39 bázispár méretnek megfelelő sávot levágtuk a gélről, majd elektroleució útján a fent leírt módon elkülönítettük a terméket. Ennek a 39 bp terméknek egy tompa vége és egy -Saw3A tapadó vége van. Ezt a fragmenst egy módosított pFIF trp 69 vektorba (5) klónoztuk. 10 pg pFIF trp 69-et ΧάαΙ-gyel linearizáltunk és fenol-kloroform elegyével egyszer extraháltuk, majd etanollal lecsaptuk. Az Xbal tapadóvég betöltésére DNS-polimeráz I Klenow-fragmenst alkalmaztunk egy 50 pl térfogatú, mindegyik nukleozid-trifoszfátot 250 pmól koncentrációban tartalmazó reakcióelegyben. Ezt a DNS-t BamHI alkalmazásával levágtuk, majd 6%-os poliakrilamid gélen futattuk. A vektor- fragmenst elektroelúció útján elválasztottuk a gélből, majd 20 pl vízben újra szuszpendáltuk. E vektor 20 ng-ját 20 ng fenti módon előállított 39 bp fragmenssel ligáltuk szobahőmérsékleten 4 óra hoszszat. A ligáviós reakcióelegy 1/5 részét használtuk fel az E. coli 294 törzs ampicillin- rezisztenciára való transzfomálására (LB+20 pg/ml amp lemezeken). A transzformánsokból kapott plazmidokat egy gyors szkrin-módszerrel (44) vizsgáltuk. Egy plazmidot a pPGK-39-t választottuk ki szekvencia-analízis céljára. E plazmid 20 pg-ját Xbal enzimmel kezeltük, etanollal kicsaptuk, majd 1000 egység bakteriális alkalikus foszfázzal kezeltük 68 ’C hőmérsékleten 45 percig. Ezt a DNS-t fenol-kloroform elegyével háromszor extraháltuk, maid etanollal lecsaptuk. A defoszforilezett végeket 32P-vel jeleztük egy 200 pCi [γ32?] ATP-t és 10 egység T4polinukleotid-kinázt tartalmazó 12 pl reakcióelegyben. A plazmidot Sa/I-gyel vágtuk és 6%-os poliakrilamid-gélen futtattuk.
A 32P-jelzett inszertum-sávot elválasztottuk a géltől és kémiai lebontási módszerrel (52) szekvencia-vizsgálatnak vetettük alá. Ezen promoter-darab 3’-végén a DNS-szekvencia a várakozásnak megfelelő volt.
2. A 312 bp-os Pvul-EcoRl PGK promoter-fragment felépítése pg pPGK-39 plazmidot (13. ábra) egyidejűleg kezeltünk 5-5 egység Sail és Xbal enzimmel, majd 6%-os gélen elektroforézisnek vetettük alá. A 39 bp-os promoter-darabot tartalmazó 390 bp sávot elektroelúció útján elkülönítettük. Az újra szuszpendált DNS-t 5au3A-val emésztettük majd 8%-os akrilamid-gélen elektroforizáltuk. A 39 bp-os PGK promoter- sávot elektroeluálással elkülönítetük. Ez a DNS 39 bázispárt tartalmazott a PGK promoter 5’végéről egy Sau3A-Xbal fragmensen.
pg pBl-et Pvul és Kpnl alkalmazásával emésztettük, majd 6%-os akrilamid-gélen elektroforizáltuk. A DNS 0,8 kbp sávját elektroelúció útján elkülönítettük, majd Sű«3A-val emésztettük és 6%-os akrilamid-gélen elektroforizáltuk. A PGK promoter 265 bp sávját (11. ábra) elektroelücióval elkülönítettük.
Ezt a DNS-t azután a fenti 39 bp promoter-fragmenssel ligáltuk szobahőmérsékleten 2 óra hosszat. A ligációs elegyet Xbal és Pvul alkalmazásával emésztettük, majd 6%-os akrilamid-gélen elektroforizáltuk. A 312 bp Xba-Pvul restrikciós fragmen eletroelúció útján elválasztottuk, majd hozzáadtuk egy 200 ng pBR322-t (41) (amelyet előzőleg különítettünk el és amelyből hiányzott a 162 bp Pvul-Pstl restrikciós fragment) és 200 ng Xbal-Pstl LelF A cDNS gént (amelyet előzőleg különítettünk el 20 pg pLelF trp A 25-ből) tartalmazó ligációs elegyhez. Ezt a három-faktoros ligációs elegyet használtuk fel az E. coli 294 törzs tetraciklin-rezisztenciára való transzformálására. A transzformáns kolóniákat miniszkrineltük (44) és az egyik kolóniát (pPGK-300) elkülönítettük, ez 304 bázispárt a PGK 5’-szegélyező DNS-ből, a LelF génhez kapcsolva egy pBR322-alapú vektorban. A LelF A gén 5’-végének a következő szekvenciája van: 5’-CTAGAATTC-3’. így a PGK promoter-fragmensből származó Xbal helynek e szekvenciába való fúz iója lehetőseget nyújt egy EcoRI helynek az Xbal helyhez való hozzáadására. A pPGK300 tehát tartalmazza a PGK-promoter egy részét egy Pvul-EcoRl fragmensben elkülönítve.
3. Egy 1500 bp EcoRI-EcoRI PGK promoter-fragmens felépítése pg pBl-t Pvul és EcoRI enzimmel kezeltünk és egy 6%-os akrilamid-gélen futtattuk. A PGK 5'-szegélyező DNS-ből számazó 1.3 kb Pvul-EcoRl DNSsávot elektroeluálással elkülönítettünk. 10 pg pPGK300-at EcoRI és Pvul enzimmel kezeltünk és a 312 bp promoter-fragmenst az így kapott enzimes kezelési reakcióelegy 6%-os akrilamid-gélen történő elekroforézise után elektroelücióval elkülönítettük. 5 pg pFRL4-et EcoRI-vel hasítottunk, etanollal kicsaptuk, majd bakteriális alkalikus foszfatázzal kezeltük 68 ’C hőmérsékleten 45 percig. A kapott elegyet fenol kloroform elegyével háromszor extraháltuk, az így kapott DNS-t etanollal kicsaptuk, majd e vektor 200 ng-ját
-121
HU 202287 Β ml vízben újból szuszpendáltuk és 100 ng 312 bp EcoRl-Pvul DNS-sel (pPGK-300-ból) és 100 ng EcoRl-Pvul DNS-sel (pB 1-ből) kapcsoltuk. A ligációs elegyet használtuk fel ezután az E. coli 294 törzs ampicillin-rezisztenciára való transzformálására. A kapott transzformánsok egyike pPGK-1500 volt. Ez a plazmid az 1500 bp PGK promoter-fragmenst tartalmazza, a DNS EcoRI-EcoRI vagy Hindlll-EcoRl darabjaként.
pg pPGK-1500-at Clal és EcoRl enzimmel teljesen lebontottunk, majd az enzimes lebontási reakcióelegyet 6%-os akrilamid-gélen elektroforézisnek vetettük alá. A PGK promotert tartalmazó 900 bp ffagmenét elektroelúció útján elkülönítettük. 10 pg pIFN-ytrp 48-at EcoRl és Hincli enzimmel teljesen lebontottunk és 6%-os akrilamid-gélen elektroforizáltuk. A közvetlen expresszióra alkalmas IFN-γ cDNS-t tartalmazó 938 bp sávot elektroelúció útján elkülönítettük a gélről.
Az élesztő expressziós vektort egy 3 faktort tartalmazó reakcióelegyben építettük fel, a PGK promoterfragmen (egy Clal-EcoRl darabon), a deléciós pFRM31 és a fent leírt módon elkülönített IFN-γ cDNS ligációja útján. A ligációs reakcióelegyet 12 óra hosszat inkubáltuk 14 °C hőmérsékleten. Ezt a ligációs elegyet használtuk fel azután az E. coli 294-törzs ampicillinrezisztenciára való transzformálására. A transzformánsokat azután vizsgáltuk, hogy jelen van-e bennük a helyesen felépített pPGK-IFN-γ expresszós plazmid (16. ábra). Az expressziós rendeszert tartalmazó plazmidokat használtuk fel az RH218 élesztő-törzs szferoplasztjainak triptofán-prototrofiára való transzformálására triptofánt nem tartalmazó agarban. Ezeket a rekombináns élesztősejteket azután rekombináns humán immuninterferon jelenlétére vizsgáltuk.
Az élesztőkivonatokat a következő módon állítottuk elő: YNB+CAA tápközegben 10 ml-es kultúrákat tenyésztettünk A660-~l-2 eléréséig, majd a sejteket centrifugálással összegyűjtöttük és újból szuszpendáltuk 500 pl PBS pufferoldatban (20 mmól/1 NaH2PO4, pH=7,4, 150 mmól/1 NaCl). A szuszpenzióhoz úgyanolyan össztérfogatban üveggyöngyöket(0,45-0,5 mm átmérőjű) adunk, majd az elegyet 2 percig kevertetjük. Az így készített kivonatot 30 percig centrifugáljuk percenként 14 000 fordulattal, majd a szupematáns folyadékot elkülönítjük és meghatározzuk benne az interferon-aktivitást, amely a citopátiás hatás gátlásán alapuló módszerrel mérve és IFN-α standarddal öszszehasonlítva 16 000 egység/ml volt.
M. A pSV 69 vektor sejtkultúrájának felépítése
Az SV40-eredetű 342 bázispárt tartalmazó HindlΙΙ-ΕνκΠ fragmenst egy EcoRl restrikciós helyhez kötött fragmenssé alakítottuk át. A HindllI helyet egy 5’-dAGCTGAATTC szintetikus oligomer hozzáadása útján konvertáltuk, míg a PvuII helyet egy EcoRl helybe történő tompavég-ligáció útján és ennek betöltésére polimeráz I Klenow-fragmenst alkalmaztunk. Az így kapott EcoRl fragmenst a pML-1 EcoRl helyébe iktattuk be (28). Az ampR géntől elfelé orientált SV40 késői promotert tartalmazó plazmidot azután tovább módosítottuk a pML-1 ampR génjéhez legközelebb eső EcoRl hely eltávolítása útján. (27).
A klónozott HBV DNS 1023 bázispárt tartalmazó Hpal-Bglíl fragmentjét (60) elkülönítettük és a hepatitisz-B vírus (HBV) Hpal helyét egy 5’dGCGAATTCGC szintetikus oligomer alkalmazásával egy EcoRl hellyé alakítottuk át. Ezt az EcoRI-Bg/II kötött fragmentet közvetlenül klónoztuk az SV4O-eredetű plazmid fent leírt EcoRI-SaznHI helyeibe.
A fennmaradó EcoRl helyre azután az IFN-γ gént iktattuk be a p69 egy 1250 bázipárt tartalmazó PstI fragmentjén, a PstI végeknek EcoRl végekké való átalakítása után. Olyan kiónokat különítetünk el, amelyekben az SV40 késői promoter megelőzte az IFN-γ szerkezeti génjét. A kapott plazmidokat azután szövettenyészet sejtjeibe vezettük be (29) egy olyan módosított DEAE-dextrán módszer alkalmazásával, amelyben a DEAE-dextrán jelenlétében történő transzfekciót 8 óra hosszat folytattuk. A sejtközeget 2-3 naponként cseréltük. 200 mikroliter közeget vettünk el naponta biológiai interferon-meghatározás céljára. A transzfekció után 3 vagy 4 nappal a vizsgált mintákban általában 50-100 egység/ml interferont találtunk.
Az elemzési adatok azt mutatják, hogy a kifejezett-termékből hiányzik a rekombináns humán immuninterferon N-terminális CYS-TYR-CYS része (vö.: 5. ábra), továbbá, hogy egy szignál-peptid hasítás van a CYS-GLN kapcsolatnál (az 5. ábra szerinti 3. és 4. aminosavnál); ezek szerint úgy látszik, hogy az érett polipeptid ténylegesen 143 aminosavból áll.
N. A majomsejtekből kapott immuninterferon részleges tisztítása
Annak érdekében, hogy a majomsejtekből származó humán IFN-γ nagyobb mennyiségeit termelhessük, 10 darab 10 cm-es lemezen COS-7 sejtek friss egysejt-rétegeit fertőztük át összesen 30 pg pDLIF3mal 110 ml DEAE-dextrános közegben, amely 200 pg/ml DEAE-dextránt (molekulatömeg: 500 000) és 0,05 mól/1 7,5 pH-értékű triszt tartalmazott DMEMben. 37 ’C hőmérsékleten lefolytatott 16 órai inkubálás után a lemezeket DMEM-mel kétszer mostuk. 10% borjúembriószérumot (FBS) 2 mmól/1 glutamint. 50 pg/ml G-penicillint és 50 mg/ml sztreptomicint tartalmazó 15 ml friss DMEM-et adtunk azután mindegyik lemezhez. A következő napon a közeget szérummentes DMEM-re cseréltük ki, majd minden nap szérummentes közeget adtunk a lemezekhez. A közegeket összegyűjtöttük és 4 ’C hőmérsékleten tároltuk az elemzésig illetőleg a szabályozott pórusú üveghez (CPG) való kötésig. A transzfekció után 3 és 4 nappal kivett minták összegyűjtött frakcióit megelemezve azt találtuk, hogy lényegileg valamennyi minta tartalmazott aktivitást.
100 ml sejt-szupematánshoz 0,5 g aprószemcséjű szabályozott pórusú üveget (CPG 350, az Electronucleonics cég gyártmánya, szitafinomság 120/200) adtunk és az elegyet 4 ’C hőmérsékleten 3 óra hosszat kevertettük, majd rövid ideig centrifugáltuk egy asztali centrifugában. A leülepedett üvegyöngyöket egy oszlopra vittük és alaposan mostuk egy 20 mmól/1 nátrium-foszfátot, 1 mól/1 nátrium-kloridot és 0,1% béta-merkapto-etanolt tartalmazó, pH-7,2 értékű puffer oldattal. Az aktivitást azután ugyanilyen, de 30% etilénglikolt is tartalmazó pufferoldattal eluáltuk, majd ugyanilyen, de 50% etilénglikolt tartalmazó pufferoldattal folytattuk az eluálást. Az aktivitás lényegileg teljesen a szabályozott pórusú üvegyöngyökhöz volt kötve; az eluálás során az eluált aktivitás 13
-131
HU 202287 Β
75%-a a 30% etilénglikolt tartalmazó pufferoldattal eluált frakciókban jelent meg. Ezeket a frakciókat egyesítettük és egy 20 mmól/1 nátrium-foszfátot és 1 mól/1 nátrium-kloridot tartalmazó, pH-7,2 értékű pufferoldattal 10% etilénglikol-koncentrációra hígítottuk és közvetlenül felvittük egy 10 ml Con A Sepharose adszorbenst (Pharmacia) tartalmazó oszlopra. Az oszlopot a 20 mmól/1 nátrium-foszfátot és 1 mól/1 nátrium-kloridot tartalmazó, pH-7,2 értékű pufferral alaposan mostuk, majd az aktivitást a fentivel egyező, de 0,2 mól/1 α-metil-D-mannozidot is tartalmazó pufferoldattal eluáltuk. Az aktivitás számottevő része (55%) nem kötődött ehhez a lektinhez. Az aktivitás 45%-a eluálódott a-metil-D-mannoziddal.
Gyógyszerkészítmények
A találmány szerinti eljárással előállított termékekből a szakmabeliek általjól ismert módszerekkel készíthetünk gyógyászati célokra felhasználható készítményeket; ennek során a találmány szerint előállított humán immuninterferon terméket gyógyászati szempontból elfogadható vivőanyagokkal keverjük össze. Az ilyen célra alkalmas vivőanyagokra és felhasználásuk módjaira vonatkozólag utalunk például E. W. Martin: Remington’s Pharmaceutical Sciences c. munkára. Az ilyen készítmények a találmány szerinti eljárással előállított interferon-fehérje hatásos mennyiségeit tartalmazhatják, alkalmas vivőanyagokkal elegyítve, oly módon, hogy a készítmények megfelelő módon adagolhatóak legyenek a gyógyászati kezelést igénylő személyeknek.
A. Parenterális beadásra szolgáló készítmények
A humán immuninterferon parenterális úton adható be tumorellenes vagy vírusellenes gyógykezelést igénylő vagy immunoszupresszív állapotokat mutató betegeknek. Az adagolás és a beadás módja hasonló lehet a klinikai vizsgálatokra jelenleg alkalmazott másfajta humán interferonokéhoz, így például naponta körülbelül lxlí^-lOxlO6 egység, 1 %-nál nagyobb tisztasági fokú anyagok esetében pedig például 50x1ο6 egységig is emelkedhet a napi adag. A találmány szerinti eljárással előállított IFN-yadagjai a hatás fokozása céljából még számottevő mértékben tovább is növelhetők, minthogy ebből a termékbő lényegileg hiányoznak az olyan egyéb humán fehérjék, amelyek embereknek beadva nem kívánatos mellékhatásokat okozhatnak.
A lényegileg homogén IFN-γ parenterális úton beadható adagjának példájaként 3 mg 2x1ο8 egység/mg specifikus aktivitású IFN-y-t 25 ml 5 N humán szérum-albuminban oldhatunk (gyógyszerkönyvi minőségű szérum-albumint alkalmazva erre a célra), az oldatot egy bakteriológiai szűrőn átszűrjük, majd a leszűrt oldatot aszeptikus módon 100 ampullába osztjuk szét; ily módon egy-egy ampullában 6xl06 egység tiszta interferont kapunk parenterális beadásra alkalmas készítmény alakjában. Az így ampullázott készítményt, célszerűen hidegen, -20 ’C hőmérsékleten tároljuk felhasználásig.
A készítmény biológiai értékmérése
A. A vírusellenes aktivitás jellemzése.
Antitest-semlegesítés céljaira a mintákat a szükséghez képest 500-1000 egység/ml koncentrációra hígítjuk foszfát-puffer sóoldat és marhaszérum-albumin (PBS-BSA) elegyével. Egyenlő térfogatú mintákat 2-12 óra hosszat inkubálunk 4 ’C hőmérsékleten, nyúl antihumán-leukocita, fibroblaszt vagy immuninterferon antiszérum hígítás-sorozatával. Az ennek során alkalmazott anti-IFN-α és -β a National Institute of Allergy and Infectious Diseases intézet terméke volt. Az anti-IFN-y-t 5-20%-os tisztaságú autentikus IFN-y-ból állítottuk elő; ez utóbbit stimulált perifériális vér-limfocitákból nyertük és tisztítottuk. A mintákat a vizsgálat előtt 3 percig centrifugáltuk 12 000 g-vel. A készítmény pH-2 értéken mutatott stabilitásának vizsgálata céljából a mintákat IN sósavoldattal p-2 értékre állítottuk be, majd 4 ’C hőmérsékleten 2-12 óra hosszat inkubáltuk és a mérés előtt IN nátrium-hidroxid-oldattal semlegesítettük őket. A nátrium-dodecil-szulfáttal (SDS) szembeni érzékenység vizsgálata céljából a mintákat azonos térfogatú 0,2%os SDS-oldattal inkubáltuk 4 ’C hőmérsékleten 2-12 óra hosszat, majd ezután vetettük őket alá mérésnek.
B. Az E. coli és COS-7 sejtek által termelt IFN-jellemzése
Az IFN-a, IFN-β és IFN-γ standard minták különféle kezelések után mutatott jellemző viselkedésének adatait az alábbi táblázatban foglaltuk össze:
Vírusellenes aktivitás (egység/ml)
Kezelés IFNa IFN-β IFN-γ E. coli W3110/ pIFN-γ trp48 kivonat COS-7 sejt/ pSV y 69 szupernatáns
Kezeletlen 375 125 250 250 62,5
pH~2 375 125 <6 <12 <4
0,1% SDS 375 - <4 <8
nyúl anti-IFN-a <8 125 250 250 187
nyúl anti-IFN-β 375 <8 187 250 125
nyúl anti-IFN-y 375 125 <4 <8 <4
-141
HU 202287 Β
Amint a fenti táblázat adataiból látható, az E. coli W3110/pIFN-7 trp 48 és a COS-7/pSV γ 69 által termelt interferon-aktivitás savérzékeny, SDS-érzékeny és az immuninterferon-antiszérum semlegesíti. Az IFN-α és IFN-β antitestei nem semlegesítik. Ezek az adatok tehát megerősítik, hogy a fent leírt rendszer által termelt hatóanyagok immun interferonok, továbbá, hogy a p69 plazmid cDNS inszertum az IFN-y-t kódolja.
A tennék tisztítása
Az BFN-γ szennyezésektől, például baktériumoktól való tisztításának egy lehetséges módját az alábbi általános eljárás-vázlat szemlélteti:
1. A sejtek extrakciója nagy vezetőképességű lízis-pufferoldatban (körülbelül 8 pH-értéken), egy homogenizátoron nagy nyomáson történő átvezetése, majd a távozó folyadék jégfürdőben történő lehűtése útján.
2. A DNS kicsapása a polietilén-iminnel keverés közben, például 4 ’C hőmérsékleten,
3. A baktérium-fehérjék lecsapása a pH-érték módosítása útján, az IFN-γ ezúttal is oldatban marad.
4. A szilárd részek elkülönítése 4 ’C hőmérsékleten történő centrifugálással.
5. A szupematáns betöményítése (a pH-érték újbóli beállítása után) például ultraszűréssel.
6. A koncentrátum dialízise kis vezetőképességű pufferoldattal szemben.
7. A szilárd részek eltávolítása centrifugálással; az IFN-γ ezúttal is oldatban marad.
8. Ioncseréló-kromatográfia karboximetil-cellulózon; eluálás növekvő ionerősségű grádienssel.
9. Kromatografálás kalcium-foszfát-gélen; eluálás növekvő ionerősségű grádienssel.
10. Ioncserélő kromatográfia karboxilmetil-cellulózon gyengén denaturáló körülmények között; eluálás növekvő ionerősségű grádienssel.
11. Elválasztás gélszűréses kromatográíiával.
A fenti tisztítási eljárás alkalmazásával 95%-ot meghaladó tisztaságú terméket állíthatunk elő.
A találmány szerinti eljárással előállított immuninterferon fehérjét meghatározott DNS-gén és deduktív aminosav-szekvencia meghatározás alapján definiáltuk (vö.: 5. ábra). A szakemberek számára nyilvánvaló, hogy az itt konkrétan leírt interferon esetében természetes alléi variációk létezhetnek és ilyenek egyénenkénti különbségekkel elő is fordulnak. Ezek a variációk az általános szekvencában mutatkozó aminosav-különbségekben, deléciókban, szubsztitúciókban, inszerciókban, inverziókban, egy vagy több aminosav hozzáadásában nyilvánulhatnak meg. Az összes ilyen alléi variációk is a jelen találmány körébe esnek.
A találmány lényege ugyanis a rekombináns DNStechnológia alkalmazása különféle humán IFN-y-származékok előállítására; ezek különbözőképpen módosíthatók egy vagy több aminosav-szubsztitúció, deléció, addició vagy más aminosavval való kicserélés útján. Mindezek a módosulatok a humán IFN-γ oly változatai, amelyek a jellemző humán IFN-γ aktivitást mutatják és így ezek előállítása egyaránt a jelen találmány tárgykörébe tartozik. A jelen leírásban konkrétan ismertetett DNS-t és aminosav-szekvenciát tartalmazó IFN-γ (vö.: 5. ábra) előállítási eljárásának legelőnyösebb reprodukálási módja kétségtelenül a teljes gén szintetikus úton történő előállítása - erre vonatkozólag vö. például a (26) alatt idézett irodalmat -, de eljárhatunk oly módon is, hogy szintetikus dezoxi- oligonukleotidokat állítunk elő, amelyekkel a cDNS-forrás szondázható abból a célból, hogy a standard hidridizációs módszerekkel különítsük el a gént. Ha a kívánt IFN-γ fehérjét kódoló nukleotidszekvencia már egyszer rendelkezésére áll, az IFN-γ nagy tisztaságban történő előállításához szükséges expressziós, elkülönítési és tisztítási műveleteket a fenti leírásban ismertetett módon folytathatjuk le.
Bár a jelen leírásban a találmány szerinti eljárás különlegesen előnyös kiviteli módjaira utaltunk, nyilvánvaló, hogy a találmány köre nem korlátozódik ezekre a különösen előnyös módozatokra; a találmány körét természetszerűleg az alábbi igénypontok határozzák meg.
Idézett irodalom
1. Goeddel etc., Natura 287, 411 (1980).
2. Goeddel etc., Natúré 290, 20 (1981).
3. Yelverton etc., Nucleic Acids Research 9, 731 (1981).
4. Gutterman etc., Annals of Int. Med. 93, 399 (1980).
5. Goeddel etc., Nucleic Acids Research 8, 4057 (1980).
6. Yip etc., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 78, 1601 (1981).
7. Taniguchi etc., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 78, 3469 (1981).
8. Bloom, Natúré 289, 593 (1980).
9. Sonnenfeld etc., Cellular Immunoi. 40, 285 (1978).
10. Fleishman etc., Infection and Immunity 26, 248 (1979).
11. Blalock etc., Cellular Immunology 49, 390 (1980).
12. Rudin etc., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77, 5928 (1980).
13. Crane etc., J. Natl. Cancer Inst. 61, 871 (1978).
14. Stinchcomb etc., Natúré 282, 39 (1979).
15. Kingsman etc., Gene 7, 141 (1979).
16. Tschumper etc., Gene 10, 157 (1980).
17. Mortimer etc., Microbiological Reviews 44, 519 (198 ).
18. Miozzari etc., Journal of Bacteriology 134, 48 (1978).
19. Jones, Genetics 85, 23 (1977).
20. Hitzeman etc., J. Bioi. Chem. 255, 12073 (1980).
21. Hess etc., J. Adv. Enzyme Regül. 7, 149 (1968).
22. Holland etc., Biochemistry 17, 4900 (1978).
23. Bostian etc., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77, 4504 (1980).
24. The Molecular Biology of Yeast (1981. Aug.
11-18.), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.
25. Chambon, Ann. Rév. Biochemistry, 44, 613 (1975).
25a. Glzman, Cell 23, 175 (1981).
26. Goeddel etc., Natúré 281, 544 (1979).
27. Itakura etc., Science 198, 1056 (1977).
-151
HU 202287 Β
28. Lusky etc., Natúré 293, 79 (1981).
29. Glzman etc., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Bioi. 44, 293 (1980).
30. Fiers etc., Natúré 273, 113 (1978).
31. Reddy etc., Science 200, 494 (1978).
32. Boedtker etc., Prog. in Nucleic Acids Rés. Mól. Bioi. 19, 253 (1976).
33. Berger etc., Biochemistry 18, 5143 (1979).
34. Aviv etc., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 1408 (1972).
35. Gurdon etc., J. Molec. Bioi. 80, 539 (1975).
36. Stewart, The Interferon System. Springer, New York, 13-26 old. (1979).
37. Lehrach etc., Biochemistry 16, 4743 (1977).
38. Lynch etc., Virology 98, 251 (1979).
39. Wickens etc., J. Bioi. Chem. 253, 2483 (1978).
40. Chang etc., Natúré 275, 617 (1978).
41. Bolivár etc., Gene 2, 95 (1977).
42. Grunstein etc., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 72, 3961 (1975).
43. Fritsch etc., Cell 19, 959 (1980).
44. Bimbóim etc., Nucleic Acids Rés. 7, 1513 (1979).
45. Kafatos etc., Nucleic Acids Rés. 7, 1541 (1979).
46. Clewel etc., Biochemistry 9, 4428 (1970).
47. Taylor etc., Biochim. Biophys. Acta 442, 324 (1976).
48. Smith, Methods Enzymol. 65, 560 (1980).
49. Messing etc., Nucleic Acids Rés. 9, 309 (1981).
50. Winzler, Hormonal Proteins and Peptides (szerk. Li), Academic Press, New York, p. 1 (1973).
51. Náthán etc., Nutre 292, 84- (1981).
52. Maxam etc., Methods in Enzymol. 65, 490 (1980).
53. Crea etc., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 75, 5765 (1978).
54. Southern, J. Molec. Bioi. 98. 503 (1975).
55. Blin etc., Nucleic Acids Rés. 3, 2303 (1976).
56. Lawn etc., Science 272, 1159 (1981).
57. Lawn etc., Nucleic Acids Rés. 9, 1045 (1981).
58. Miller, Experiments in Molecular Genetics, p.
431-3, Cold Spring Harbor Láb., Cold Spring Harbor, New York (1972).
59. Beggs, Natúré 275, 104 (1978).
60. Valenzuela etc., Animál Vírus Genetics (szerk.
Fields, Jaenisch és Fox) p. 57, Academic Press, New York (1980).
61. McCuthan etc., J. Natl. Cancer Inst. 41, 351 (1968).

Claims (13)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás rekombináns humán gamma- vagy immuninterferon előállítására, azzal jellemezve, hogy emberi szövetből mRNS-t nyerünk ki vagy ilyent szintetizálunk az mRNS-ből cDNS könyvtárat készítünk, ezt megfelelő plazmidba iktatjuk, és ezt a plazmidot valamely alkalmas baktériumba, előnyösen E. coliba transzformálva transzformánsokat készítünk, a transzformánsokat radioaktív vizsgáló mintával (próbával) átvizsgáljuk, a hibridizáló telepekből plazmidokat készítünk, ezek cDNS-ének szerkezetét megvizsgáljuk, az immuninterferon tulajdonságainak megfelelő polipeptidet kódoló cDNS-t magában foglaló plazmidot kiválasztjuk, ebből a humán immuninterferont kódoló DNS-szakaszt elkülönítjük és megfelelő szabályozó rendszerrel rendelkező vektorba iktatjuk, a vektort megfelelő baktérium törzsbe, élesztőtörzsbe vagy állati szövettenyészetbe transzformáljuk, a transzformánsokat megfelelő tápközegben tenyésztjük, és a tenyészetből a humán immuninterferont kinyerjük.
  2. 2. Eljárás a
    1 10
    CYS TYR CYS GLN ASP PRO TYR VAL LYS GLU ALA GLU ASN
    LEU LYS LYS TYR PHE ASN ALA GLY HIS SER ASP VAL ALA 30
    ASP ASN GLY THR LEU PHE LEU GLY ILE LEU LYS ASN TRP
    40 50
    LYS GLU GLU SER ASP ARG LYS ILE MET GLN SER GLN ILE
    VAL SER PHE TYR PHE LYS LEU PHE LYS ASN PHE LYS ASP 70
    ASP GLN SER ILE GLN LYS SER VAL GLU THR ILE LYS GLU 80 90
    ASP MET ASN VAL LYS PHE PHE ASN SER ASN LYS LYS LYS 100
    ARG ASP ASP PHE GLU LYS LEU THR ASN TYR SER VAL THR 110
    ASP LEU ASN VAL GLN ARG LYS ALA ILE HIS GLU LEU ILE 120 130
    GLN VAL MET ALA GLU LEU SER PRO ALA ALA LYS THR GLY 140
    LYS ARG LYS ARG SER GLN MET LEU PHE ARG GLY ARG ARG 146
    ALA SER GLN
    -161
    HU 202287 Β szekvenciájú, humán gamma- vagy immuninterferon polipeptidet kódoló DNS szekvencia előállítására, azzal jellemezve, hogy
    a) emberi szövetből mRNS-t nyerünk ki, ebből az mRNS-ből cDNS könyvtárat készítünk, ezt megfelelő plazmidba iktatva, és ezt a plazmidot valamely baktériumba, előnyösen E. coli-ba transzformálva transzformánsokat készítünk, a transzformánsokat radioaktív vizsgáló mintával (próbával) átvizsgáljuk, a hibridizáló telepekből plazmidokat készítünk, ezek cDNS-ének szerkezetét megvizsgáljuk, és a tárgyi kör szerinti szerkezetnek megfelelő polipeptidet kódoló plazmidot, előnyösen a p69 plazmidot kiválasztjuk, és ebből a humán immuninterferont kódoló DNS szakaszt elkülönítjük, vagy
    b) a tárgyi körben megadott aminosav-szekvenciának megfelelő DNS szakaszt vegyi úton szintetizáljuk.
  3. 3. Eljárás a 2. igénypontban megadott szekvenciájú humán immuninterferont kódoló DNS szekvenciát tartalmazó vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely 2. igénypont szerinti DNS szakaszt a megfelelő szabályozó rendszerrel rendelkező vektorba iktatjuk.
  4. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás a humán immuninterferont kódoló DNS szekvenciát tartalmazó, E. coliban replikálódni képes pIFN-γ trp48 plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy p69 plazmidot Pstl-gyel és BstNI-gyel emésztünk, az N-terminális első 5 aminosavát kódoló DNS-en belül a DNS szekvenciát elhasítjuk, majd szintetikus DNS-t építünk az N-terminális végre olyan módon, hogy az eredeti N-terminálist kódoló vég helyreálljon, és ezen kívül még egy MET kód is legyen az N-terminális végén, és az így kapott plazmidot EcoRI-gyel és Pstl-gyel hasított pLEIF A trp 103 plazmidba építjük, és a pIFN-γ trp48 plazmidot kinyerjük.
  5. 5. A 3. igénypont szerinti eljárás a humán immuninterferont kódoló DNS szekvenciát tartalmazó, élesztőben replikálódni képes pPGK-IFN-γ plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy IFN-γ trp48 plazmidot, EcoRI-gyel emésztett pFRM31 plazmidot és Clal-gyel, valamint EcoRI-gyel emésztett pPGK-1500 plazmidot ligálunk, és a pPGK-IFN-γ plazmidot kinyerjük.
  6. 6. A 3. igénypont szerinti eljárás a humán immuninterferont kódoló DNS szekvenciát tartalmazó, állati szövettenyészetben replikálódni képes pSV 69 plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy SV40 origót magában foglaló EcoRI restrikciós fragmentumot pML-1 plazmidba iktatjuk, az így létrejött plazmidba HBV bázispárokat tartalmazó fragmentumot iktatunk, az így létrejött plazmidban p69 plazmidból eredő IFN-y-gént iktatunk, és így a pSV 69 plazmidot nyerjük.
  7. 7. Eljárás a 2. igénypontban megadott szekvenciájú humán immuninterferont kódoló DNS szekvenciát tartalmazó transzformáns E. coli vagy élesztő törzs, vagy állati szövettenyészet előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely 3. igénypont szerinti vektort E. coli, vagy élesztő törzsbe, vagy állati szövetsejtbe transzformálunk.
  8. 8. A 7. igénypont szerinti eljárás a 2. igénypotban megadott szekvenciájú humán immuninterferont kódoló DNS szekvenciát tartalmazó transzformáns E. coli törzs előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely E. coli törzset a 4. igénypont szerinti pIFN-y-trp48 plazmiddal transzformálunk.
  9. 9. A 7. igénypont szerinti eljárás a 2. igénypontban megadott szekvenciájú humán immuninterferont kódoló DNS szekvenciát tartalmazó transzformáns élesztőtörzs előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely élesztőtörzset az 5. igénypont szerinti pPGK-IFN plazmiddal transzformálunk.
  10. 10. A 7. igénypont szerinti eljárás a 2. igénypontban megadott szekvenciájú humán immuninterferont kódoló DNS szekvenciát tartalmazó transzformáns állati szövetsejt előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely állati szövetsejtet a 6. igénypont szerinti pSV 69 plazmiddal transzformálunk.
  11. 11. Eljárás a 2. igénypontban megadott szekvenciájú humán immuninterferon, illetve N-terminálisán CYS-TYR-CYS aminosavszekvenciát nélkülöző származéka előállítására, azzal jellemezve, hogy a 7-10. igénypontok bármelyike szerinti transzformáns E. coli vagy élesztősejtet vagy állati szövetsejtet megfelelő tápközegben tenyésztjük, és a tenyészetből transzformáns E. coli és élesztősejtek tenyésztése eseténben a 2. igénypontban megadott szekvenciájú polipeptidet, illetve az állati szövetsejtek tenyésztése esetében ennek CYS-TYR-CYS aminosavszekvenciát nélkülöző származékát kinyerjük.
  12. 12. A 11. igénypont szerinti eljárás a 2. igénypontban megadott szekvenciának N-terminálisán CYSTYR-CYS amianosavszekvenciát nélkülöző származékát jelentő humán gamma interferon előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely 7. vagy
    10. igénypont szerinti transzformáns állati szövetsejtet megfelelő tápközegben tenyésztünk, és a tárgyi körben jellemzett szekvenciájú humán gamma interferont kinyerjük.
  13. 13. Eljárás a rekombináns humán gamma interferont tartalmazó immun-szabályozó gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1.,
    11. és 12. igénypontok bármelyike szerint előállított rekombináns humán gamma interferont gyógyászatilag elfogadható segédanyagokkal gyógyászati készítménnyé keverjük.
HU823305A 1981-10-19 1982-10-19 Process for producing human immune interferon HU202287B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US31248981A 1981-10-19 1981-10-19

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HU202287B true HU202287B (en) 1991-02-28

Family

ID=23211703

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU823305A HU202287B (en) 1981-10-19 1982-10-19 Process for producing human immune interferon

Country Status (43)

Country Link
US (4) US4762791A (hu)
EP (1) EP0077670B1 (hu)
JP (3) JPS5890514A (hu)
KR (1) KR840001837A (hu)
AT (1) ATE44289T1 (hu)
AU (1) AU561343B2 (hu)
BG (2) BG44877A3 (hu)
BR (1) BR8206068A (hu)
CA (1) CA1341590C (hu)
CH (1) CH663619A5 (hu)
CZ (1) CZ282154B6 (hu)
DD (1) DD208822A5 (hu)
DE (4) DE3238554A1 (hu)
DK (1) DK163187C (hu)
DZ (1) DZ467A1 (hu)
ES (1) ES516620A0 (hu)
FI (1) FI86559C (hu)
FR (1) FR2514783B1 (hu)
GB (1) GB2107718B (hu)
GR (1) GR78391B (hu)
GT (1) GT198277746A (hu)
HK (1) HK66289A (hu)
HU (1) HU202287B (hu)
IE (1) IE54371B1 (hu)
IL (1) IL66992A (hu)
IT (1) IT1153265B (hu)
LU (1) LU88327I2 (hu)
MX (2) MX166499B (hu)
MY (1) MY102546A (hu)
NL (1) NL930040I2 (hu)
NO (2) NO164177C (hu)
NZ (1) NZ202190A (hu)
OA (1) OA07233A (hu)
PH (1) PH26963A (hu)
PL (1) PL153202B1 (hu)
PT (1) PT75696B (hu)
RO (1) RO89534A (hu)
RU (3) RU2056460C1 (hu)
SG (1) SG76988G (hu)
SK (1) SK279535B6 (hu)
YU (1) YU45871B (hu)
ZA (1) ZA827569B (hu)
ZW (1) ZW22282A1 (hu)

Families Citing this family (187)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ199722A (en) 1981-02-25 1985-12-13 Genentech Inc Dna transfer vector for expression of exogenous polypeptide in yeast;transformed yeast strain
ZW18282A1 (en) * 1981-08-31 1983-03-23 Genentech Inc Preparation of polypeptides in vertebrate cell culture
JPS58146281A (ja) * 1981-10-19 1983-08-31 Suntory Ltd 酵母細胞の形質転換法
AU561343B2 (en) * 1981-10-19 1987-05-07 Genentech Inc. Human immune interferon by recombinant dna
JPS58110548A (ja) * 1981-12-24 1983-07-01 Asahi Chem Ind Co Ltd 新規な生理活性ペプチド
JPS62223191A (ja) * 1981-12-24 1987-10-01 Asahi Chem Ind Co Ltd 新規な生理活性ペプチドの製法
GB8406910D0 (en) * 1984-03-16 1984-04-18 Biogen Nv Gamma interferon
ZA831094B (en) * 1982-02-22 1983-11-30 Biogen Nv Dna sequences,recombinant dna molecules and processes for producing human immune interferon-like polypeptides
US5004689A (en) * 1982-02-22 1991-04-02 Biogen, Massachusetts DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing human gamma interferon-like polypeptides in high yields
US6432677B1 (en) 1982-03-08 2002-08-13 Genentech, Inc. Non-human animal interferons
IE54592B1 (en) * 1982-03-08 1989-12-06 Genentech Inc Anumal interferons, processes involved in their production, compositions containing them, dna sequences coding therefor and espression vehicles containing such sequences and cells transformed thereby
US5827694A (en) * 1982-03-08 1998-10-27 Genentech, Inc. DNA encoding non-human animal interferons, vectors and hosts therefor, and recombinant production of IFN polypeptides
IL68100A0 (en) * 1982-03-24 1983-06-15 Takeda Chemical Industries Ltd Novel dna and use thereof
US6936694B1 (en) * 1982-05-06 2005-08-30 Intermune, Inc. Manufacture and expression of large structural genes
JPH0787797B2 (ja) * 1982-05-20 1995-09-27 サントリー株式会社 ヒト・ガンマ・インタ−フエロン様ポリペプチドの製造法
AU577259B2 (en) * 1982-08-13 1988-09-22 Zymogenetics Inc. Glycolytic promters for regulated protein expression protease inhibitor
AU571460B2 (en) * 1982-09-27 1988-04-21 Cancer Institute Of Japanese Foundation For Cancer Research Alpha interferon dna, recombinant plasmid, engineered organism and alpha interferon polypeptide
EP0121569B1 (en) * 1982-10-08 1990-08-22 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Novel vector
US4966843A (en) * 1982-11-01 1990-10-30 Cetus Corporation Expression of interferon genes in Chinese hamster ovary cells
US5831023A (en) * 1982-11-01 1998-11-03 Genentech, Inc. Recombinant animal interferon polypeptides
WO1984002129A1 (en) * 1982-11-22 1984-06-07 Takeda Chemical Industries Ltd Human immune interferon protein and process for its preparation
US4599197A (en) * 1982-12-22 1986-07-08 Genentech, Inc. Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins
US4512922A (en) * 1982-12-22 1985-04-23 Genentech, Inc. Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins
US4518526A (en) * 1982-12-22 1985-05-21 Genentech, Inc. Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins
US4511503A (en) * 1982-12-22 1985-04-16 Genentech, Inc. Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins
US4511502A (en) * 1982-12-22 1985-04-16 Genentech, Inc. Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins
US4620948A (en) * 1982-12-22 1986-11-04 Genentech, Inc. Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins
GR79124B (hu) * 1982-12-22 1984-10-02 Genentech Inc
JPH0740925B2 (ja) * 1983-03-14 1995-05-10 協和醗酵工業株式会社 新規ヒトインタ−フエロン−γポリペプチド
US7198919B1 (en) * 1983-04-25 2007-04-03 Genentech, Inc. Use of alpha factor sequences in yeast expression systems
ZA843275B (en) * 1983-05-05 1984-12-24 Hoffmann La Roche Novel vectors for interferon expression
DK265384A (da) * 1983-06-01 1984-12-02 Hoffmann La Roche Polypeptider med interferonaktivitet
JP2551746B2 (ja) * 1983-07-19 1996-11-06 サントリー株式会社 改良プラスミドベクタ−およびその利用
JPS6034919A (ja) * 1983-08-04 1985-02-22 Green Cross Corp:The ガンマ・インタ−フェロン組成物
DE3484374D1 (de) * 1983-08-04 1991-05-08 Green Cross Corp Gamma-interferonzusammensetzung.
IL72773A0 (en) * 1983-08-29 1984-11-30 Meloy Lab Production of immune interferon and its mrna
US4681930A (en) * 1983-09-20 1987-07-21 Hoffmann-La Roche Inc. Immune interferon and a method for its extraction and purification
US4604284A (en) * 1983-09-20 1986-08-05 Hoffmann-La Roche Inc. Homogeneous immune interferon fragment
ZA846554B (en) * 1983-09-20 1985-04-24 Hoffmann La Roche Immune interferon and method for its purification
US4476049A (en) * 1983-09-20 1984-10-09 Hoffmann-La Roche Inc. Method for the extraction of immune interferon
JPS6079000A (ja) * 1983-10-04 1985-05-04 Takeda Chem Ind Ltd ヒトγ型インタ−フエロン単量体の製造法
JPH0788398B2 (ja) * 1983-10-17 1995-09-27 サントリー株式会社 新規生理活性ポリペプチドおよびその製造法
GB8328820D0 (en) * 1983-10-28 1983-11-30 Searle & Co Synthetic human gamma interferon gene
FR2556365B1 (fr) * 1983-12-09 1987-07-31 Transgene Sa Vecteurs de clonage et d'expression de l'interferon-g, bacteries transformees et procede de preparation de l'interferon-g
US4703008A (en) * 1983-12-13 1987-10-27 Kiren-Amgen, Inc. DNA sequences encoding erythropoietin
KR850004274A (ko) * 1983-12-13 1985-07-11 원본미기재 에리트로포이에틴의 제조방법
NZ210501A (en) * 1983-12-13 1991-08-27 Kirin Amgen Inc Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence
MX9203641A (es) * 1983-12-16 1992-07-01 Genentech Inc Interferones gamma recombinantes que poseen estabilidad mejorada y metodos biotecnologicos para su obtencion.
US4855238A (en) * 1983-12-16 1989-08-08 Genentech, Inc. Recombinant gamma interferons having enhanced stability and methods therefor
JPS60145098A (ja) * 1984-01-09 1985-07-31 Suntory Ltd 糖付加ポリペプチドの製造法
WO1985004420A1 (en) * 1984-03-29 1985-10-10 Takeda Chemical Industries, Ltd. Novel dna and its use
DE3414831A1 (de) * 1984-04-19 1985-10-31 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Herstellung von polypeptiden mit human-gammainterferon-aktivitaet
GB8414354D0 (en) * 1984-06-05 1984-07-11 Biogen Nv Purifying protein
IL75302A0 (en) * 1984-06-06 1985-09-29 Takeda Chemical Industries Ltd Novel polypeptide and production thereof
WO1985005618A1 (en) * 1984-06-06 1985-12-19 Takeda Chemical Industries, Ltd. Process for preparing interferon derivative
CA1302320C (en) * 1984-06-11 1992-06-02 Hideo Niwa Expression of human cromosomal interferon-_ in animal cells
JPS60262594A (ja) * 1984-06-11 1985-12-25 Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd ヒトインタ−フエロン−γ
GB8414911D0 (en) * 1984-06-12 1984-07-18 Searle & Co Producing human gamma interferon
JPS6124599A (ja) * 1984-07-11 1986-02-03 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 新規ヒトインタ−フエロン−ｒポリペプチド誘導体
GB2164650A (en) * 1984-09-25 1986-03-26 Fujisawa Pharmaceutical Co Process for production of y-interferon
IL76591A0 (en) * 1984-10-05 1986-02-28 Bioferon Biochem Substanz Pharmaceutical compositions containing ifn-ypsilon and processes for the preparation thereof
JPS6188875A (ja) * 1984-10-05 1986-05-07 Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd ヒトインタ−フエロン−γ
ATE66375T1 (de) * 1984-10-05 1991-09-15 Bioferon Biochem Substanz Verwendung von interferon-gamma (ifn-gamma) enthaltenden praeparationen zur systemischen behandlung von verschiedenen erkrankungen des menschen in niedriger dosierung.
DE3436638C2 (de) * 1984-10-05 1992-10-08 Bioferon biochemische Substanzen GmbH & Co, 7958 Laupheim Verwendung von Interferon-gamma (IFN-gamma) enthaltenden Präparationen zur Behandlung rheumatischer Erkrankungen
US4946674A (en) * 1984-10-05 1990-08-07 Bioferon Biochemische Substanzen Gmbh & Co. Process for treatment of rheumatic diseases
JPS61108397A (ja) * 1984-10-31 1986-05-27 Green Cross Corp:The インタ−フエロン−γ蛋白質の製造法
AU598455B2 (en) * 1984-12-27 1990-06-28 Suntory Limited Method for purifying an interferon
JPS6156195A (ja) * 1985-03-01 1986-03-20 Asahi Chem Ind Co Ltd 新規生理活性ペプチド
GB8508340D0 (en) * 1985-03-29 1985-05-09 Creighton T E Production of protein
WO1986006077A1 (en) * 1985-04-08 1986-10-23 Amgen A method and a hybrid promoter for controlling exogenous gene transcription
US4873312A (en) * 1985-04-25 1989-10-10 Amgen Method for purifying interferon and composition of matter produced thereby
FR2583429B1 (fr) * 1985-06-18 1989-11-03 Transgene Sa Vecteur d'expression de l'interferon u dans les cellules de mammifere, procede pour sa mise en oeuvre et produit obtenu et composition pharmaceutique contenant l'interferon u
US4845196A (en) * 1985-06-24 1989-07-04 G. D. Searle & Co. Modified interferon gammas
EP0245479B1 (en) * 1985-11-13 1993-02-17 Xoma Corporation Shortened phosphoglycerate kinase promoter
US5104795A (en) * 1985-11-13 1992-04-14 Zoma Corporation Shortened phosphoglycerate kinase promoter
EP0237019A3 (en) * 1986-03-14 1988-03-09 Toray Industries, Inc. Interferon conjugate and production thereof using recombinant gene
US5198343A (en) * 1986-08-05 1993-03-30 Transgene, S.A. Method for expressing a heterologous protein in a dapD- mutant of E. coli and the strain obtained
US6238889B1 (en) * 1986-12-16 2001-05-29 Dsm N.V. Molecular cloning and expression of the Pro8 isoform of human IL-3
US4939088A (en) * 1987-02-18 1990-07-03 Meloy Laboratories Inc. Sustained production of recombinant gamma interferon using an Epstein-Barr virus replicon
US4944941A (en) * 1987-08-07 1990-07-31 Genentech, Inc. Methods and compositions for the treatment of lung conditions
US6384194B1 (en) * 1987-12-16 2002-05-07 Dsm N.V. Expression and purification of human interleukin-3 and muteins thereof
US5258287A (en) * 1988-03-22 1993-11-02 Genentech, Inc. DNA encoding and methods of production of insulin-like growth factor binding protein BP53
IL90021A0 (en) * 1988-04-25 1989-12-15 Phillips Petroleum Co Process for the production of interferon
US5198212A (en) * 1988-10-31 1993-03-30 University Of Lousville Research Foundation Incorporated Method and compositions for treatment of trauma-associated sepsis with gamma interferon
US6451600B1 (en) * 1989-12-22 2002-09-17 Genzyme Corporation Enzymatically active recombinant glucocerebrosidase
US20020168750A1 (en) * 1988-12-23 2002-11-14 James Rasmussen Enzymatically active recombinant glucocerebrosidase
US5236838A (en) * 1988-12-23 1993-08-17 Genzyme Corporation Enzymatically active recombinant glucocerebrosidase
US5196191A (en) * 1989-03-17 1993-03-23 Genentech, Inc. Temporal gamma-interferon administration for allergies
US5112605A (en) * 1989-03-17 1992-05-12 Genentech, Inc. Temporal gamma-interferon administration for allergies
WO1990012877A1 (en) * 1989-04-19 1990-11-01 Cetus Corporation Multifunctional m-csf proteins and genes encoding therefor
DE4009268A1 (de) * 1990-03-22 1991-09-26 Consortium Elektrochem Ind Sekretion von hirudinderivaten
US5281520A (en) * 1990-09-12 1994-01-25 Zymogenetics, Inc. Method for producing acyloxyacyl hydrolase
ATE132162T1 (de) * 1990-09-27 1996-01-15 Schering Corp Humane gammainterferonantagonisten
EP0487298A3 (en) * 1990-11-21 1992-12-16 Schering Corporation Human gamma interferon antagonist/agonist screen
WO1992012238A1 (en) * 1991-01-04 1992-07-23 The Board Of Regents, University Of Texas System Cloning and expression of tissue transglutaminases
US5272078A (en) * 1991-01-29 1993-12-21 Brigham And Women's Hospital CDNA encoding the type I iodothyronine 5'deiodinase
AU1337092A (en) * 1991-01-29 1992-08-27 Brigham And Women's Hospital A cdna encoding the type i iodothyronine 5' deiodinase
WO1994003599A1 (en) * 1992-08-04 1994-02-17 Sagami Chemical Research Center HUMAN cDNA AND PROTEIN WHICH SAID cDNA CODES FOR
US6180602B1 (en) 1992-08-04 2001-01-30 Sagami Chemical Research Center Human novel cDNA, TGF-beta superfamily protein encoded thereby and the use of immunosuppressive agent
WO1994010296A1 (en) * 1992-11-03 1994-05-11 Oklahoma Medical Research Foundation Transglutaminase gene
DE69322289T2 (de) * 1992-12-29 1999-05-20 Genentech Inc Behandlung von entzündlichen darmerkrankungen mit interferon-gamma-inhibitoren
EP0814154B1 (en) 1993-09-15 2009-07-29 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Recombinant alphavirus vectors
JP4383530B2 (ja) 1996-04-05 2009-12-16 ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス， インコーポレーテッド 細胞巨大分子合成の阻害が減少したアルファウイルスベクター
EP0935659A1 (en) 1996-09-17 1999-08-18 Chiron Corporation Compositions and methods for treating intracellular diseases
US20020168634A1 (en) * 1999-05-05 2002-11-14 Christine Marie Debouck Methods for identifiying genes essential to the growth of an organism
US20080076706A1 (en) 1997-07-14 2008-03-27 Bolder Biotechnology, Inc. Derivatives of Growth Hormone and Related Proteins, and Methods of Use Thereof
US6753165B1 (en) * 1999-01-14 2004-06-22 Bolder Biotechnology, Inc. Methods for making proteins containing free cysteine residues
US7153943B2 (en) * 1997-07-14 2006-12-26 Bolder Biotechnology, Inc. Derivatives of growth hormone and related proteins, and methods of use thereof
BR9812267B1 (pt) 1997-07-14 2013-11-26 Hormônio de crescimento recombinante.
AU757910B2 (en) 1998-04-02 2003-03-13 Genentech Inc. Treatment of cardiac hypertrophy
JP2002533124A (ja) 1998-12-31 2002-10-08 カイロン コーポレイション Ｈｉｖポリペプチドの改善された発現およびウイルス様粒子の生成
US7935805B1 (en) 1998-12-31 2011-05-03 Novartis Vaccines & Diagnostics, Inc Polynucleotides encoding antigenic HIV Type C polypeptides, polypeptides and uses thereof
US8288126B2 (en) 1999-01-14 2012-10-16 Bolder Biotechnology, Inc. Methods for making proteins containing free cysteine residues
KR20020065517A (ko) 1999-11-12 2002-08-13 맥시겐 홀딩스 리미티드 인터페론 감마 접합체
YU32402A (sh) 1999-11-12 2005-03-15 Maxygen Holdings Ltd. Konjugati gama interferona
CA2405912A1 (en) 2000-04-12 2001-10-18 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
ATE367398T1 (de) * 2000-05-16 2007-08-15 Bolder Biotechnology Inc Verfahren zur rückfaltung von proteinen mit freien cysteinresten
AU2002225870B2 (en) * 2000-11-03 2006-09-21 Intarcia Therapeutics, Inc. Method for short-term and long-term drug dosimetry
CN101612402A (zh) * 2001-01-09 2009-12-30 贝勒研究院 干扰素拮抗剂和Flt3L拮抗剂的用途
US7038015B2 (en) 2001-04-06 2006-05-02 Maxygen Holdings, Ltd. Interferon gamma polypeptide variants
US6958388B2 (en) 2001-04-06 2005-10-25 Maxygen, Aps Interferon gamma polypeptide variants
CA2452119C (en) 2001-07-05 2013-10-15 Chiron Corporation Polynucleotides encoding antigenic hiv type b and/or type c polypeptides, polypeptides and uses thereof
WO2003004620A2 (en) 2001-07-05 2003-01-16 Chiron, Corporation Polynucleotides encoding antigenic hiv type c polypeptides, polypeptides and uses thereof
CN1604795B (zh) * 2001-08-17 2010-05-26 科勒制药股份公司 具有提高的活性的组合基序免疫刺激寡肽
JP2005509647A (ja) * 2001-11-06 2005-04-14 アプライド リサーチ システムズ エーアールエス ホールディング ナームロゼ フェンノートシャップ エストロゲン応答性乳癌の治療方法
JP2005511580A (ja) * 2001-11-06 2005-04-28 アプライド・リサーチ・システムズ・エーアールエス・ホールディング・エヌ・ヴィ 子宮内膜症の処置法
KR20040053291A (ko) * 2001-11-09 2004-06-23 바이오메디신즈 인코포레이티드 오메가 인터페론을 이용한 질환 치료 방법
WO2003049760A1 (en) * 2001-12-07 2003-06-19 Intermune, Inc. Compositions and method for treating hepatitis virus infection
ES2545090T3 (es) 2001-12-21 2015-09-08 Human Genome Sciences, Inc. Proteínas de fusión de albúmina y GCSF
AU2003228751A1 (en) 2002-05-01 2003-11-17 Cell Genesys, Inc. Lentiviral vector particles resistant to complement inactivation
EP1539814A2 (en) 2002-07-03 2005-06-15 Maxygen Holdings Ltd. c/o Close Brothers (Cayman) Limited Full-length interferon gamma polypeptide variants
US7229614B2 (en) * 2002-07-03 2007-06-12 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Interferon gamma in the detection and treatment of angiomyolipomas
WO2004034988A2 (en) * 2002-10-16 2004-04-29 Amgen Inc. Human anti-ifn-ϝ neutralizing antibodies as selective ifn-ϝ pathway inhibitors
US7731947B2 (en) 2003-11-17 2010-06-08 Intarcia Therapeutics, Inc. Composition and dosage form comprising an interferon particle formulation and suspending vehicle
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
JP2008504002A (ja) 2003-11-12 2008-02-14 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド 新生児Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）結合ポリペプチド改変体、ダイマーＦｃ結合タンパク質、およびそれらに関連する方法
NZ586034A (en) 2004-02-02 2011-10-28 Ambrx Inc Modified human growth hormone polypeptides and their uses
WO2006050394A2 (en) 2004-11-01 2006-05-11 Novartis Vaccines And Diagnostics Inc. Combination approaches for generating immune responses
JP2008525424A (ja) 2004-12-23 2008-07-17 モルメド エスピーエー 複合生成物
JP2008526234A (ja) 2005-01-05 2008-07-24 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド Ｃｒｉｐｔｏ結合分子
DK1848744T3 (da) * 2005-01-27 2012-03-19 Novimmune Sa Humane anti-interferon-gamma-antistoffer og fremgangsmåder til anvendelse heraf
WO2006083761A2 (en) 2005-02-03 2006-08-10 Alza Corporation Solvent/polymer solutions as suspension vehicles
US11246913B2 (en) 2005-02-03 2022-02-15 Intarcia Therapeutics, Inc. Suspension formulation comprising an insulinotropic peptide
US20100196336A1 (en) 2006-05-23 2010-08-05 Dongsu Park Modified dendritic cells having enhanced survival and immunogenicity and related compositions and methods
JP5143131B2 (ja) 2006-05-30 2013-02-13 インターシア セラピューティクス，インコーポレイティド 浸透圧送出システムの二片構成内部チャネル型の流れモジュレータ
PL2359808T3 (pl) 2006-08-09 2013-10-31 Intarcia Therapeutics Inc Osmotyczne systemy dostawcze i zespoły tłokowe
WO2008076933A2 (en) 2006-12-14 2008-06-26 Bolder Biotechnology, Inc. Long acting proteins and peptides and methods of making and using the same
MX2009011123A (es) 2007-04-23 2009-11-02 Intarcia Therapeutics Inc Formulaciones de suspensiones de peptidos insulinotropicos y sus usos.
NZ580686A (en) * 2007-05-02 2012-11-30 Ambrx Inc Modified interferon beta polypeptides and their uses
US20090155838A1 (en) * 2007-11-28 2009-06-18 Smart Tube, Inc. Devices, systems and methods for the collection, stimulation, stabilization, and analysis of a biological sample
US9938333B2 (en) 2008-02-08 2018-04-10 Ambrx, Inc. Modified leptin polypeptides and their uses
EP2240155B1 (en) 2008-02-13 2012-06-06 Intarcia Therapeutics, Inc Devices, formulations, and methods for delivery of multiple beneficial agents
EP2248903A1 (en) 2009-04-29 2010-11-10 Universitat Autònoma De Barcelona Methods and reagents for efficient and targeted gene transfer to monocytes and macrophages
NZ598686A (en) 2009-09-28 2014-05-30 Intarcia Therapeutics Inc Rapid establishment and/or termination of substantial steady-state drug delivery
EA201291482A1 (ru) 2010-07-09 2013-10-30 Байоджен Айдек Хемофилия Инк. Химерные факторы коагуляции
US20120208755A1 (en) 2011-02-16 2012-08-16 Intarcia Therapeutics, Inc. Compositions, Devices and Methods of Use Thereof for the Treatment of Cancers
RU2446172C1 (ru) * 2011-03-24 2012-03-27 Общество С Ограниченной Ответственностью "Фармапарк" Способ получения зрелого интерферона альфа-2 человека с использованием дрожжей saccharomyces cerevisiae и штамм-продуцент интерферона альфа-2 человека (варианты)
EA023379B1 (ru) * 2011-06-21 2016-05-31 Общество С Ограниченной Ответственностью "Фарма Ген" ШТАММ ESCHERICHIA COLI BL21(DE3)-pIE-GAMMA И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА НАТИВНОГО РЕКОМБИНАНТНОГО ИНТЕРФЕРОНА ГАММА ЧЕЛОВЕКА
US9738707B2 (en) 2011-07-15 2017-08-22 Biogen Ma Inc. Heterodimeric Fc regions, binding molecules comprising same, and methods relating thereto
WO2013024158A1 (en) 2011-08-17 2013-02-21 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Combinations of protein kinase inhibitors and interferons or of protein kinase inhibitors and direct acting antivirals for the treatment and the prevention of hcv infection
WO2013024156A2 (en) 2011-08-17 2013-02-21 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Combinations of anti-hcv-entry factor antibodies and interferons for the treatment and the prevention of hcv infection
BR112014016887A2 (pt) 2012-01-10 2018-08-14 Biogen Idec Inc potencialização do transporte de moléculas terapêu-ticas através da barreira hematoencefálica
US20140350087A9 (en) 2012-03-22 2014-11-27 Halozyme, Inc. Oncovector Nucleic Acid Molecules and Methods of Use
EP2870238A4 (en) 2012-07-05 2016-03-09 Ohio State Innovation Foundation COMPOSITIONS AND METHODS ASSOCIATED WITH VIRAL VACCINES
WO2014033266A1 (en) 2012-08-31 2014-03-06 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Anti-sr-bi antibodies for the inhibition of hepatitis c virus infection
CA2899089C (en) 2013-03-15 2021-10-26 Biogen Ma Inc. Factor ix polypeptide formulations
EP2940128A1 (en) 2014-04-30 2015-11-04 Institut d'Investigació Biomèdica de Bellvitge (IDIBELL) Adenovirus comprising an albumin-binding moiety
US9889085B1 (en) 2014-09-30 2018-02-13 Intarcia Therapeutics, Inc. Therapeutic methods for the treatment of diabetes and related conditions for patients with high baseline HbA1c
CN107636159B (zh) 2015-02-04 2022-06-14 百时美施贵宝公司 选择治疗性分子的方法
MA41586A (fr) 2015-02-04 2017-12-13 Hoffmann La Roche Oligomères antisens de la protéine tau et leurs utilisations
US11091543B2 (en) 2015-05-07 2021-08-17 Swedish Orphan Biovitrum Ag Methods, compositions and dosing regimens for treating or preventing interferon-gamma related indications
AU2016257023B2 (en) 2015-05-07 2022-06-30 Swedish Orphan Biovitrum Ag Methods and compositions for diagnosis and treatment of disorders in patients with elevated levels of CXCL9 and other biomarkers
AU2016270984B2 (en) 2015-06-03 2021-02-25 Intarcia Therapeutics, Inc. Implant placement and removal systems
US11324816B2 (en) 2015-08-31 2022-05-10 Technovax, Inc. Human respiratory syncytial virus (HRSV) virus-like particles (VLPS) based vaccine
WO2017180770A1 (en) 2016-04-13 2017-10-19 Synthetic Genomics, Inc. Recombinant arterivirus replicon systems and uses thereof
CN109310743A (zh) 2016-05-16 2019-02-05 因塔西亚制药公司 胰高血糖素受体选择性多肽及其使用方法
USD840030S1 (en) 2016-06-02 2019-02-05 Intarcia Therapeutics, Inc. Implant placement guide
USD860451S1 (en) 2016-06-02 2019-09-17 Intarcia Therapeutics, Inc. Implant removal tool
EP3526332A1 (en) 2016-10-17 2019-08-21 Synthetic Genomics, Inc. Recombinant virus replicon systems and uses thereof
BR112019011661A2 (pt) 2016-12-05 2020-01-07 Synthetic Genomics, Inc. Composições e métodos para aumentar expressão de gene
EP3565580B1 (en) 2017-01-03 2024-03-06 i2o Therapeutics, Inc. Continuous administration of exenatide and co-adminstration of acetaminophen, ethinylestradiol or levonorgestrel
US11389531B2 (en) 2017-12-19 2022-07-19 Janssen Sciences Ireland Unlimited Company Methods and apparatus for the delivery of hepatitis B virus (HBV) vaccines
EA202091513A1 (ru) 2017-12-19 2020-09-09 Янссен Сайенсиз Айрлэнд Анлимитед Компани Вакцины против вируса гепатита b (hbv) и их применение
EA202091516A1 (ru) 2017-12-19 2020-11-03 Янссен Сайенсиз Айрлэнд Анлимитед Компани Способы и композиции для индукции иммунного ответа против вируса гепатита b (hbv)
AU2019210189A1 (en) 2018-01-19 2020-08-06 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Induce and enhance immune responses using recombinant replicon systems
IL296520A (en) 2020-03-19 2022-11-01 Trizell Ltd A virus storage system that responds to temperature
JP2023519709A (ja) 2020-03-30 2023-05-12 トライゼル リミテッド がんを治療するための組成物及び方法

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4332892A (en) * 1979-01-15 1982-06-01 President And Fellows Of Harvard College Protein synthesis
JPS5598118A (en) * 1979-01-18 1980-07-25 Hayashibara Takeshi Preparation of type-2 interferon and drug containing the same
AU538665B2 (en) * 1979-10-30 1984-08-23 Juridical Foundation, Japanese Foundation For Cancer Research Human interferon dna
IL58765A (en) * 1979-11-21 1986-09-30 Yeda Res & Dev Process for the production of essentially pure messenger rna of human fibroblast interferon and process for the production of interferon beta
GB2068970B (en) * 1980-02-06 1983-06-22 Searle & Co Recombinant dna technique for the preparation of a protein resembling human interferon
DE3005897A1 (de) * 1980-02-16 1981-09-03 Hoechst Ag, 6000 Frankfurt Genprodukt eines hoeheren organismus aus einem dieses gen enhtaltenden mikroorganismus
US4338397A (en) * 1980-04-11 1982-07-06 President And Fellows Of Harvard College Mature protein synthesis
US4460685A (en) * 1980-05-29 1984-07-17 New York University Method of enhancing the production of human γ Interferon
FI64813C (fi) * 1980-12-31 1984-01-10 Ilkka Antero Palva Foerfarande foer producering av ett utvalt aeggviteaemne och vid foerfarandet anvaenda rekombinantplasmidvektorer
IL65475A0 (en) * 1981-04-17 1982-07-30 Meloy Lab Production of immune interferon and its mrna
US4376821A (en) * 1981-04-17 1983-03-15 Meloy Laboratories, Inc. Production of human IFN-gamma (immune) interferon
AU561343B2 (en) * 1981-10-19 1987-05-07 Genentech Inc. Human immune interferon by recombinant dna

Also Published As

Publication number Publication date
ZA827569B (en) 1983-11-30
KR840001837A (ko) 1984-06-07
BG42527A3 (en) 1987-12-15
IL66992A0 (en) 1983-02-23
ZW22282A1 (en) 1983-05-11
NO1994025I1 (no) 1994-12-20
BG44877A3 (hu) 1989-02-15
PT75696A (en) 1982-11-01
FI823528L (fi) 1983-04-20
JPH03246232A (ja) 1991-11-01
CA1341590C (en) 2009-02-03
GT198277746A (es) 1984-04-11
NL930040I2 (nl) 1993-09-16
RU2107728C1 (ru) 1998-03-27
JPS5890514A (ja) 1983-05-30
ES8402351A1 (es) 1984-02-01
ATE44289T1 (de) 1989-07-15
US4925793A (en) 1990-05-15
YU45871B (sh) 1992-09-07
HK66289A (en) 1989-08-25
DE3279788D1 (en) 1989-08-03
CZ738982A3 (en) 1997-03-12
IE54371B1 (en) 1989-09-13
GB2107718A (en) 1983-05-05
NO164177B (no) 1990-05-28
NZ202190A (en) 1987-06-30
RU2092561C1 (ru) 1997-10-10
BR8206068A (pt) 1983-09-13
EP0077670A3 (en) 1984-07-04
CZ282154B6 (cs) 1997-05-14
FI823528A0 (fi) 1982-10-15
IT1153265B (it) 1987-01-14
DZ467A1 (fr) 2004-09-13
NO823467L (no) 1983-04-20
SG76988G (en) 1989-03-23
RO89534A (ro) 1986-07-30
AU561343B2 (en) 1987-05-07
IL66992A (en) 1991-07-18
IE822517L (en) 1983-04-19
GR78391B (hu) 1984-09-27
JPS62265986A (ja) 1987-11-18
DK460882A (da) 1983-05-27
DD208822A5 (de) 1984-04-11
NL930040I1 (nl) 1993-08-02
IT8223795A0 (it) 1982-10-18
EP0077670A2 (en) 1983-04-27
US4762791A (en) 1988-08-09
US4929554A (en) 1990-05-29
SK738982A3 (en) 1998-12-02
MY102546A (en) 1992-07-31
YU233582A (en) 1985-03-20
MX9206041A (es) 1994-04-29
FR2514783A1 (fr) 1983-04-22
CH663619A5 (de) 1987-12-31
JPH0135639B2 (hu) 1989-07-26
RU2056460C1 (ru) 1996-03-20
NO164177C (no) 1990-09-12
PL153202B1 (en) 1991-03-29
US4727138A (en) 1988-02-23
DE3238554C2 (hu) 1989-11-23
EP0077670B1 (en) 1989-06-28
LU88327I2 (fr) 1994-05-04
FI86559B (fi) 1992-05-29
PT75696B (en) 1987-03-24
DE77670T1 (de) 1987-09-03
DE3238554A1 (de) 1983-05-05
FR2514783B1 (fr) 1985-11-29
OA07233A (fr) 1984-04-30
MX166499B (es) 1993-01-12
PL238671A1 (en) 1983-07-18
FI86559C (fi) 1992-09-10
AU8935282A (en) 1983-04-28
JP2515308B2 (ja) 1996-07-10
DK163187B (da) 1992-02-03
GB2107718B (en) 1985-11-20
DK163187C (da) 1992-06-22
SK279535B6 (sk) 1998-12-02
JPH07106144B2 (ja) 1995-11-15
PH26963A (en) 1992-12-28
DE19375065I2 (de) 2004-07-01
ES516620A0 (es) 1984-02-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU202287B (en) Process for producing human immune interferon
US5096705A (en) Human immune interferon
EP0043980B1 (en) Mature human leukocyte interferon a, process for its microbial preparation, intermediates therefor and compositions containing it.
Yelverton et al. Bacterial synthesis of a novel human leukocyte interferon
US4853332A (en) Structural genes, plasmids and transformed cells for producing cysteine depleted muteins of biologically active proteins
US4588585A (en) Human recombinant cysteine depleted interferon-β muteins
US6610830B1 (en) Microbial production of mature human leukocyte interferons
US5582824A (en) Recombinant DES-CYS-TYR-CYS human immune interferon
US4801685A (en) Microbial production of mature human leukocyte interferon K and L
US5827694A (en) DNA encoding non-human animal interferons, vectors and hosts therefor, and recombinant production of IFN polypeptides
US6432677B1 (en) Non-human animal interferons
BG61060B2 (bg) човешки имунен интерферон
PH26492A (en) Recombinant human immune interferon
BG60888B2 (bg) човешки имунен интерферон
BG60889B2 (bg) човешки имунен интерферон
BG60890B2 (bg) човешки имунен интерферон
NZ214261A (en) Human immune interferon: production by recombinant dna technology
IL63197A (en) Intraferons for mature human oocytes, their preparation and preparations containing them
BG60939B2 (bg) човешки имунен интерферон
HRP950157A2 (en) Polypeptide with human interferon (ifn-gamma) characteristics