DK163187B - Fremgangsmaader til fremstilling af humant immuninterferon (gamma-interferon) samt dna-fragmenter, rekombinante klonings- og udtrykkelsesvektorer og rekombinante mikroorganismer og cellekulturer til anvendelse herved - Google Patents

Description

i

DK 163187 B

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af humant immuninterferon (r-interferon) under udnyttelse af rekombinant-DNA-teknologien ved opklaringen af DNA-se-kvensen og den afledte aminosyresekvens for humant immun-5 interferon samt DNA-fragmenter, rekombinante klonings- og udtrykkelsesvektorer og rekombinante mikroorganismer og cellekulturer til anvendelse herved.

Nærmere bestemt angår opfindelsen isoleringen og identi-10 fikationen af DNA-sekvenser, der koder for humant immun interferon og konstruktionen af rekombinante DNA-udtryk-kelsesvektorer indeholdende sådanne DNA-sekvenser opera-belt forbundet med udtrykkelsesfremkaldende promotorsekvenser. Endvidere angår opfindelsen værtskultursystemer, 15 såsom forskellige mikroorganismer og hvirveldyrcellekulturer, transformeret med sådanne udtrykkelsesvektorer og således dirigeret til udtrykkelse af de ovennævnte DNA-sekvenser. 1 foretrukne udførelsesformer tilvejebringer opfindelsen bestemte udtrykkelsesvektorer, som er givet 20 den rette sekvens, således at der produceres og secerneres humant immuninterferon fra værtscellen i moden form.

Desuden beskrives forskellige fremgangsmåder, der er nyttige til fremstilling af de nævnte DNA-sekvenser, udtrykkelsesvektorer, værtskultursysterner og slutprodukter og 25 enheder deraf og bestemte og dermed sammenhørende udførelsesformer deraf.

Opfindelsen bygger delvis på opklaringen af den DNA-sekvens, der koder for humant immuninterferon, og den deraf 30 afledte aminosyresekvens. Desuden tilvejebringer opfindelsen sekvensinformation vedrørende de 3'- og 5'-flankerende sekvenser af det humane immuninterferon-gen, hvilket letter in vitro sammenkædningen deraf med udtrykkelsesvektorer. Især tilvejebringes det 5'-DNA-segment, der 35 koder for det formodede endogene signalpolypeptid, som kommer umiddelbart før aminosyresekvensen af det formodede modne humane immuninterferon. Disse erkendelser har 2

DK 163187 B

igen gjort det muligt at udvikle midler og fremgangsmåder til via rekombinant DNA-teknologi at producere tilstrækkelige mængder af humant immuninterferon til på den anden side at muliggøre bestemmelsen af dets biokemiske egen-5 skaber og bioaktivitet.

De publikationer, som i denne beskrivelse anvendes til at belyse opfindelsens baggrund og i særlige tilfælde til at give yderligere detaljer vedrørende dens udøvelse, er af 10 nemhedsgrunde samlet i den vedføjede bibliografi, til hvis numre der henvises i den følgende tekst.

Opfindelsens baggrund 15 A. Humant immuninterferon

Humane interferoner kan klassificeres i tre grupper på basis af forskellig antigenicitet og biologiske og biokemiske egenskaber.

20

Den første gruppe omfatter en familie af leukocyt-inter-feroner (α-interferon, LeIF eller IFN-a), som normalt produceres hovedsageligt af cellebestanddele af humant blod efter viral induktion. Disse er blevet fremstillet 25 mikrobiologisk og fundet at være biologisk aktive (1, 2, 3). Deres biologiske egenskaber har medført deres anvendelse i klinikken som terapeutiske midler til behandling af virusinfektioner og maligne tilstande (4).

30 I den anden gruppe er humant fibroblast-interferon (Æ-in-terferon, FIF eller IFN-Ø), som normalt produceres af fi-broblaster efter viral induktion, og som ligeledes er blevet fremstillet mikrobielt og fundet at udøve et bredt område af biologiske aktiviteter (5). Kliniske forsøg in-35 dicerer også dets potentielle terapeutiske værdi. Leuko-cyt- og fibroblast-interferonerne udviser meget klare ligheder i deres biologiske egenskaber til trods for, at

DK 163187 B

3 graden af homologi på aminosyreniveauet er relativt lav.

Desuden indeholder begge grupper af interferoner 165-166 aminosyrer og er syrestabile proteiner.

5 Det humane immuninterferon (IFN-r), også betegnet som humant t-interferon, som den foreliggende opfindelse er rettet mod, er i modsætning til a- og /3-interferonerne pH 2 labilt, produceres hovedsageligt efter mitogenisk induktion af lymphocytter og er også klart antigenisk ad-10 skilt. Indtil for kort tid siden kunne humant immuninter-feron kun detekteres i meget små niveauer, hvilket selvfølgelig hindrede dets karakterisering. For nylig er en ret omfattende, men stadig kun delvis rensning af humant immuninterferon blevet rapporteret (6). Forbindelsen hæv-15 dedes at være fremstillet ud fra lymphocytkulturer stimuleret med en kombination af phytohæmaglutin og en phor-bolester og renset ved sekventielle chromatografiske separationer. Denne procedure resulterede i et produkt med en molekylvægt på 58000.

20

Humant immuninterferon er blevet produceret i meget lave mængder ved translation af mRNA i oocyter, der viste interferon-aktivitet karakteristisk for humant immuninterferon og begrundede håbet om, at immuninterferon-cDNA 25 kunne syntetiseres og klones (7).

Den hidtil opnåede mængde immuninterferon er helt utilstrækkelig til at udføre sikre forsøg med hensyn til karakterisering og biologiske egenskaber af den rensede 30 komponent. Imidlertid tyder in vitro undersøgelser gennemført med rå præparater såvel som in vivo forsøg med r-interferon-præparater fra dyr tilhørende musefamilien, at den primære funktion af immuninterferon kan være som im-munoregulerende middel (8, 9). Immuninterferon har ikke 35 kun en antiviral og anticellulær aktivitet tilfælles med alle humane interferoner, men udviser en forstærkende virkning på disse aktiviteter med a- og ΰ-interferon 4

DK 163187 B

(10). Ligeledes er r-interferons formeringshæmmende virkning in vitro på tumorceller rapporteret at være tilnærmelsesvis 10-100 gange virkningen af de andre interferonklasser (8, 11, 12). Dette resultat, sammen med dets ud-5 talte immunoregulerende rolle (8, 9), tyder på en meget mere udtalt antitumoral styrke for IFN-r end for IFN-α og IFN-Æ. Faktisk viser in vivo forsøg med IFN-r fra mus og andre dyr af musefamilien en klar overlegenhed i forhold til antiviralt inducerede interferoner med hensyn til den 10 antitumorale virkning over for osteogent sarcom (13).

Alle disse undersøgelser er indtil den foreliggende opfindelse blevet gennemført med temmelig rå præparater på grund af den meget lave tilgængelighed. Imidlertid tyder 15 de sikkert på meget vigtige biologiske funktioner for immuninterferon. Ikke blot har immuninterferon en kraftig tilknyttet antiviral aktivitet, men sandsynligvis også en stærk immunoregulerende og antitumoral aktivitet, som klart peger på en potentielt meget lovende klinisk kandi-20 dat.

Det blev erkendt, at anvendelsen af rekombinant-DNA-teknologi ville være den mest effektive måde at tilvejebringe de nødvendige større mængder af humant immuninterferon 25 på. Hvad enten de således producerede materialer ville inkludere glycosylering, som anses for at være karakteristisk for nativt, fra mennesker afledt materiale, eller ej, ville de sandsynligvis udvise en bioaktivitet, som tillod deres anvendelse klinisk til behandling af et 30 bredt område af virale, neoplastiske og immunoundertrykte tilstande eller sygdomme.

B. Rekombinant DNA-teknologi 35 Rekombinant-DNA-teknologien har nået det ret forfinede stadium. Molekylærbiologer er i stand til at rekombinere forskellige DNA-sekvenser med nogen lethed og skabe nye 5

DK 163187 B

DNA-enheder, som er i stand til at frembringe rigelige mængder af exogent proteinprodukt i transformerede mikroorganismer. De almene midler og fremgangsmåder er til rådighed for in vitro ligeringen af forskellige stump-en-5 dede eller kohæsivt endede fragmenter af DNA til dannelse af kraftige udtrykkelsesvektorer, som er nyttige til transformering af bestemte organismer og dermed følgende dirigering af deres effektive syntese af et ønsket exogent produkt. Imidlertid er vejen på enkelt-produkt-basis 10 stadigvæk noget omstændelig, og videnskaben er ikke skredet frem til et stadium, hvor regulær forudsigelse af held kan foretages. Faktisk løber de, som påberåber sig heldige resultater uden dybere forsøgsgrundlag, en betydelig risiko for manglende gennemførbarhed.

15

Plasmidet, en ikke-chromosomal løkke af dobbeltstrenget DNA, der findes hos bakterier og andre mikroorganismer, ofte i flere kopier pr. celle, forbliver et grundelement i rekombinant-DNA-teknologien. Inkluderet i den informa-20 tion, som er indkodet i plasmid-DNA'en, er den, der kræves til at reproducere plasmidet i datterceller (dvs. et repliceringsorigin) og almindeligvis en eller flere fæno-typiske selektionsegenskaber, såsom, i tilfælde af bakterier, resistens over for antibiotica, som gør det muligt 25 at genkende kloner af værtscellen indeholdende det plasmid, som har interesse, og dyrke det med fortrin i selektive medier. Anvendeligheden af plasmider ligger i, at de kan spaltes specifikt af en eller anden restriktionsendo-nuclease eller "restriktionsenzym", som hver genkender et 30 forskelligt sted på plasmid-DNA'en. Derefter kan heterologe gener eller genfragmenter indsættes i plasmidet ved ende-mod-ende sammenføjning ved spaltningsstedet eller ved rekonstruerede ender op til spaltningsstedet. Således dannes såkaldte replicerbare udtrykkelsesvektorer. DNA-35 rekombination gennemføres uden for cellen, men den resulterende "rekombinante" replicerbare udtrykkelsesvektor eller plasmidet kan indføres i celler ved en proces, der 6

DK 163187 B

kendes som transformation, og store mængder af den rekom-binante vektor opnås ved dyrkning af transformanten. Hvor endvidere genet er indsat rigtigt med hensyn til dele af plasmidet, som styrer transkriptionen og translationen af 5 det indkodede DNA-budskab, kan den resulterende udtryk-kelsesvektor anvendes til faktisk at producere den poly-peptidsekvens, for hvilken det indsatte gen koder, en proces der betegnes som udtrykkelse.

10 Udtrykkelse startes i et område, kendt som promotoren, der genkendes af og bindes af RNA-polymerase. I tran-skriptionsfasen af udtrykkeisen vikles DNA'en ud og blotlægges som skabelon for startet syntese af mRNA fra DNA-sekvensen. mRNA'en translateres på sin side til et poly-15 peptid med den aminosyresekvens, som er indkodet af mRNA'en. Hver aminosyre er indkodet af en nucleotidtri-plet eller "codon", og codonerne udgør tilsammen "strukturgenet", dvs. den del, som koder for aminosyresekvensen af det udtrykte polypeptidprodukt. Translation startes 20 ved et "start-signal" (almindeligvis ATG, som i den resulterende mRNA bliver AUG). såkaldte stopcodoner definerer afslutningen af translationen og dermed produktionen af yderligere aminosyreenheder. Det resulterende produkt kan opnås ved, om nødvendigt, at lysere værtscellen i mi-25 krobielle systemer og udvinde produktet ved passende rensning fra andre proteiner.

I praksis kan anvendelsen af rekombinant-DNA-teknologi udtrykke helt heterologe polypeptider, såkaldt direkte 30 udtrykkelse, eller den kan alternativt udtrykke et heterologt polypeptid knyttet til en del af aminosyresekvensen af et homologt polypeptid. I de sidstnævnte tilfælde gøres det ønskede bioaktive produkt somme tider bioinaktivt i det sammensmeltede, homologt/heterologe polypep-35 tid, indtil det spaltes i et ekstracellulært miljø, se GB offentliggørelsesskrift nr. 2 007 676 A og Wetsel, American Scientist 68, 664 (1980).

7

DK 163187 B

C. Cellekultur-teknologi.

Celle- eller vævskultur-teknologien til genetiske og cellefysiologiske undersøgelser er veletableret. Midler og 5 fremgangsmåder er tilrådighed til opretholdelse af permanente cellelinier, fremstillet ved på hinanden følgende overførsler fra isolerede normalceller. Til brug i forskningen holdes sådanne cellelinier på et fast underlag i flydende medium eller dyrkes i suspension indeholdende 10 basisnæringsstoffer. Opskalering til store præparationer synes kun at frembyde mekaniske problemer. Til yderligere baggrundsoplysning henvises til Microbiology, 2nd Edition, Harper and Row, Publishers., Inc, Hagerstown, Maryland (1973) især side 1122 og følgende og til Scientific 15 American 245, side 66 og følgende (1981).

Sammenfatning af opfindelsen

Den foreliggende opfindelse bygger på den erkendelse, at 20 rekombinant-DNA-teknologi kan anvendes til med held at producere humant immuninterferon, fortrinsvis i direkte form, og i tilstrækkelige mængder til at starte og gennemføre dyreforsøg og klinisk prøvning som forudsætninger for markedsgodkendelse. Produktet er i alle dets former 25 egnet til brug ved profylaktisk eller terapeutisk behandling af mennesker for virusinfektioner og maligne og im-munoundertrykte eller immunodeficiente tilstande. Dets former inkluderer forskellige mulige oligomere former, som kan inkludere dermed forbundet glycosylering. Produk-30 tet produceres af genetisk manipulerede transformantmikroorganismer eller transformantcellekultursystemer. I denne beskrivelse med krav skal betegnelsen "transfor-mantcelle" henføre til en celle, hvori der er blevet indført DNA stammende fra exogen DNA-rekombination, og til 35 afkommet af enhver sådan celle, som bevarer den således indførte DNA. Således eksisterer der nu en mulighed for at fremstille og isolere humant immuninterferon på en me- 8

DK 163187 B

re effektiv måde end det hidtil har været muligt. En væsentlig faktor ved den foreliggende opfindelse i dens mest foretrukne udførelsesformer er, at det er lykkedes genetisk at dirigere en mikroorganisme eller cellekultur 5 til at producere humant immuninterferon i isolerbare mængder secerneret fra værtscellen i moden form.

I overensstemmelse hermed tilvejebringes ifølge opfindelsen et DNA-fragment omfattende en DNA-sekvens, som koder 10 for humant immuninterferon med den i fig. 5 afbildede aminosyresekvens eller et derivat deraf med funktion som humant immuninterferon.

Desuden tilvejebringes en rekombinant kloningsvektor om-15 fattende det ovennævnte DNA-fragment og en replicerbar udtrykkelsesvektor, som omfatter det ovennævnte DNA-fragment og er i stand til i en transformant-mikroorganisme eller -cellekultur at udtrykke den angivne DNA-sekvens.

20

Endvidere tilvejebringes rekombinante mikroorganismer eller cellekulturer, som indeholder en replicerbar udtrykkelsesvektor som angivet ovenfor. En sådan rekombinant mikroorganisme kan med fordel være en E. coli stamme el-25 ler en gærstamme, og en sådan rekombinant cellelinie kan med fordel være en pattedyrcellelinie, såsom en C0S7 abecellelinie.

Endelig tilvejebringer opfindelsen en fremgangsmåde til 30 fremstilling af humant immuninterferon, som omfatter: (a) dyrkning af rekombinante værtsceller, som er blevet transformeret med en udtrykkelsesvektor som angivet ovenfor under betingelser, der tillader udtrykkelse 35 af DNA-sekvensen til dannelse af det humane immunin terferon; og 9

DK 163187 B

(b) udvinding af det humane immuninterferon.

Fra begyndelsen inkluderer fremgangsmåden de indledende trin: 5 (i) fremstilling af en replicerbar udtrykkelsesvektor som angivet ovenfor; og (ii) transformering af en værtscellekultur til opnåelse 10 af de rekombinante værtsceller.

En særlig udførelsesform af opfindelsen er rettet mod fremstilling ^f humant immuninterferon som et direkte udtrykkel sesprodukt secerneret fra værtscellen i moden 15 form. Denne udførelsesform kan udnytte genet, der koder for sekvensen af det modne humane immuninterferon plus den 5'-flankerende præsekvens, der koder for signal-poly-peptidet. Signalpolypeptidet antages at hjælpe med ved transporten af molekylet til værtsorganismens cellevæg, 20 hvor det spaltes under sekretionsprocessen af det modne humane interferonprodukt. Denne udførelsesform gør det muligt at isolere og rense det ønskede modne immuninterferon uden at måtte gribe til indviklede procedurer udformet til at fjerne forureninger af intracellulært 25 værtsprotein eller cellerester.

Ved udtrykket "modent humant immuninterferon" skal her forstås det mikrobielt eller i cellekultur fremstillede humane immuninterferon uden ledsagelse af signalpeptidet 30 eller præsekvenspeptidet, som umiddelbart ledsager translation af human-immuninterferon-mRNA'en. Ifølge opfindelsen tilvejebringes således et første rekombinant humant immuninterferon med methionin som dets første aminosyre (til stede på grund af ATG-start-signalcodon-indsætningen 35 foran strukturgenet) eller, hvor methioninet fraspaltes intra- eller ekstracellulært, med dets normale første aminosyre, cystein. Modent humant immuninterferon kan

DK 163187B

10 ifølge opfindelsen også fremstilles sammen med et andet konjugeret protein end det konventionelle signalpolypep-tid, hvilket konjugat er specifikt fraspalteligt i et in-tra- eller ekstracellulært miljø, se GB offentliggørel-5 sesskrift nr. 2 007 676 A. Endelig kan det modne humane immuninterferon fremstilles ved direkte udtrykkelse uden nødvendigheden af at fraspalte noget fremmed, overflødigt polypeptid. Dette er særlig vigtigt, hvor en given vært ikke, eller ikke effektivt, ville fjerne et signalpeptid, 10 hvis udtrykkelsesmediet er udformet til at udtrykke det modne humane interferon sammen med dets signalpeptid. Det således fremstillede modne humane immuninterferon udvindes og renses til et niveau, der gør det anvendeligt til behandling af virale, maligne og immunoundertrykte eller 15 immunodeficiente tilstande.

Humant immuninterferon blev fremstillet som følger: 1. Humane væv, f.eks. humant miltvæv eller perifere blod-20 lymfocyter, blev dyrket med mitogener for at stimulere produktionen af immuninterferon.

2. Cellepiller fra sådanne cellekulturer blev ekstraheret i nærvær af ribonuclease-inhibitor for at isolere al cy- 25 toplasmatisk RNA.

3. En oligo-dT-søjle isolerede den totale mRNA i polyade-nyleret form. Denne mRNA blev størrelsesfraktioneret under anvendelse af en sucrosedensitetsgradient og syre- 30 urinstof-gel-elektroforese.

4. Den passende mRNA (12-18 S) blev omdannet til den til svarende enkeltstrengede komplementære DNA (cDNA) ud fra hvilken der blev fremstillet dobbeltstrenget cDNA. Efter 35 påsætning af en poly-dC-hale blev den indsat i en vektor, såsom et plasmid, bærende en eller flere fænotvpiske markører .

11

DK 163187 B

5. De således fremstillede vektorer blev anvendt til at transformere bakterieceller til opnåelse af en kolonisamling. Radiomærket cDNA fremstillet ud fra både induceret og uinduceret mRNA, afledt som beskrevet ovenfor, blev 5 anvendt til separat at sondere dobbelte kolonibiblioteker. Overskuddet af cDNA blev derpå fjernet, og kolonierne eksponeret på røntgenfilm for således at identificere de inducerede cDNA-kloner.

10 6. Fra de inducerede cDNA-kloner blev den tilsvarende plasmid-DNA isoleret og sekvensbestemt.

7. I en første udførelsesform blev sekvensbestemt DNA derpå tilpasset in vitro til indsætning i en passende ud- 15 trykkel ses vektor, som blev anvendt til at transformere en E. coli værtscelle, som igen fik lov at vokse i en kultur og udtrykke det ønskede humane immuninterferonprodukt, 8. Således udtrykt humant immuninterferon har 146 amino-20 syrer i dets modne form begyndede med cystein og er meget basisk. Dets monomere molekylvægt er blevet udregnet til 17 140. Måske på grund af tilstedeværelsen af talrige basiske rester,., hydrofobicitet, saltbrodannelse osv. kan molekylet forbinde sig med sig selv i oligomere former, 25 f.eks. i dimer, trimer eller tetramer form. De høje molekylvægte, som tidligere er iagttaget med naturligt materiale (6), og som ikke kan tilskrives aminosyresekvensen alene, kan skyldes sådanne oligomere former såvel som medvirkningen af carbonhydrat fra glycosylering efter 30 translationen.

9. I visse værtscellesystemer, især hvor den er ligeret ind i et udtrykkelsesmedium, således at den udtrykkes sammen med dens signalpeptid, eksporteres den modne form 35 af humant immuninterferon til celledyrkningsmediet, hvil ket umådeligt hjælper med til udvindings- og rensningsmetoderne .

12

DK 163187 B

Beskrivelse af foretrukne udførelsesformer A. Mikroorganismer/cellekulturer 1. Bakteriestammer/promotorer 5

Det heri beskrevne arbejde blev gennemført under anvendelse af bl.a. mikroorganismen E. coli K-12 stamme 294 (end A, thi", hsr~, ^hsm+), som beskrevet i GB offentliggørelsesskrift nr. 2 055 .382 A. Denne stamme er blevet 10 deponeret i the American Type Culture Collection under ATCC accessionsnr. 31446. Imidlertid er forskellige andre mikroorganismestammer anvendelige, herunder kendte E. coli stammer, såsom E. coli B, E. coli X 1776 (ATCC nr.

31537) og E. coli W 3110 (F~, λ", protrof) (ATCC nr.

15 27325), eller andre mikroorganismestammer eller andre mi kroorganismer, hvoraf mange er deponeret og (potentielt) tilgængelige fra anerkendte mikroorganismedeponeringsinstitutioner, såsom the American Type Culture Collection (ATCC), jfr. ATCC kataloget, se også DE offentliggørel-20 sesskrift nr. 2 644 432. Disse andre mikroorganismer inkluderer f.eks. baciller, såsom Bacillus subtilis, og andre enterobacteriaceae, blandt hvilke der som eksempler kan nævnes Salmonelle typhimurium og Serratia marcescens, under udnyttelse af plasmider, som kan replicere og 25 udtrykke heterologe gensekvenser deri.

Som eksempler er /5-lactamase- og lactose-promotor-syste-mer med fordel blevet anvendt til at starte og opretholde mikrobiel produktion af heterologe polypeptider. Detaljer 30 med hensyn til sammensætningen og konstruktionen af disse promotorsystemer er blevet publiceret af Chang et al.,

Nature 275, 617 (1978) og Itakura et al., Science 198, 1056 (1977). Nyligere er der blevet udviklet et system baseret på tryptophan, det såkaldte trp-promotorsystem.

35 Detaljer med hensyn til selve sammensætningen og konstruktionen af dette system er blevet publiceret af Nucleic Acids Research 8, 4057 (1980) og Klied et al., US

DK 163187B

13 patentansøgning nr. 133 296 indleveret den 24. marts 1980. Talrige andre mikrobielle promotorer er blevet opdaget og udnyttet, og detaljer vedrørende deres nucleo-tidsekvenser, der gør det muligt for en fagmand at ligere 5 dem funktionelt i plasmidvektorer, er blevet publiceret f.eks. af Siebenlist et al., Cell 20, 269 (1980).

2, Gærstammer/gærpromotorer 10 Det her omhandlede udtrykkelsessystem kan også anvende plasmidet YRp7 (14, 15, 16), som er i stand til at selekteres og repliceres i både E. coli og gærarten Saccharomyces cerevisiae. Til selektion i gær indeholder plasmidet TRPl-genet (14, 15, 16), som kompletterer (til-15 lader vækst i fravær af tryptophan) gær indeholdende mutationer i dette gen fundet på gærens kromosom IV (17).

Den her anvendte stamme var stammen RH218 (18) deponeret i the American Type Culture Collection uden begrænsning (ATCC nr. 44076). Imidlertid vil det forstås, at enhver 20 Saccharomyces cerevisiae stamme indeholdende en mutation, som gør cellen trpl, må være et effektivt miljø til ud-trykkelse af plasmidet indeholdende udtrykkelsessystemet.

Et eksempel på en anden stamme, som kunne anvendes er pep4-l (19). Denne tryptophan-auxotrofe stamme har også 25 en punktmutation i TRPl-genet.

Når den anbringes på 5'-siden af et ikke-gær-gen, kan den 5'-flankerende DNA-sekvens (promotor) fra et gærgen (for alkoholdehydrogenase 1) promotere udtrykkeisen af et 30 fremmed gen i gær, når den anbringes i et plasmid, der anvendes til at transformere gær. Foruden en promotor kræver rigtig udtrykkelse af et ikke-vært-gen i gær en anden gærsekvens anbragt ved 3'-enden af ikke-gær-genet på plasmidet for at tillade rigtig transkriptionsafslut-35 ning og polyadenylering i gær. Denne promotor er velegnet til anvendelse ifølge den foreliggende opfindelse ligesom andre, se nedenfor. I de foretrukne udførelsesformer an-

DK 163187B

14 bringes den 5'-flankerende sekvens af gær-3-phosphoglyce-ratkinase-genet (20) ovenfor strukturgenet efterfulgt igen af DNA indeholdende afslutnings-polyadenylerings-signaler, f.eks. TRPl-genet (14, 15, 16) eller PGK-genet 5 (20).

Eftersom en 5'-flankerende sekvens fra gær (sammen med 3 *-afslutnings-DNA fra gær, se nedenfor) kan promotore udtrykkelse af fremmede gener i gær, forekommer det sand-10 synligt, at de 5'-flankerende sekvenser af ethvert kraftigt udtrykt gærgen vil kunne anvendes til udtrykkelse af vigtige genprodukter. Da gær under visse omstændigheder udtrykte op til 65 % af dets opløselige protein som gly-colytiske enzymer (21), og da dette høje niveau synes at 15 bero på produktionen af høje niveauer af de individuelle mRNA’er (22), skulle det være muligt at anvende de 5'-flankerende sekvenser af hvilke som helst andre glycoly-tiske gener til sådanne udtrykkelsesformål, f.eks. eno-lase, glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase, hexokinase, 20 pyruvatdecarboxylase, phosphofructokinase, glycose-6-phosphat-isomerase, 3-phosphoglyceratmutase, pyruvatki-nase, triosephosphatisomerase, phosphoglucoseisomer’ase og glucokinase. Enhver af de 3'-flankerende sekvenser af disse gener vil også kunne anvendes til rigtig afslutning 25 og mRNA-polyadenylering i et sådant udtrykkelsessystem, jvf. ovenfor. Nogle andre kraftigt udtrykte gener er dem, der koder for de sure phosphataser (23), og dem, der udtrykker høje produktionsniveauer på grund af mutationer i de 5'-flankerende områder (mutanter der forøger udtryk-30 kelsen), sædvanligvis på grund af tilstedeværelsen af et TYl-flytbart element (24).

Alle de ovennævnte gener antages at transcriberes af gær-RNA-polymerase II (24). Det er muligt, at promotorerne 35 for RNA-polymerase I og III, som transkriberer gener for ribosomal RNA, 5S RNA og tRNA'er (24, 25), også kan være anvendelige ved sådanne udtrykkelseskonstruktioner.

15

DK 163187 B

Endelig indeholder gærpromotorer også transkriptionskon-trol, således at de kan sluttes fra eller til ved variation i vækstbetingelserne. Nogle eksempler på sådanne gærpromotorer er generne, der producerer de følgende pro-5 teiner: alkoholdehydrogenase II, isocytochrom-c, sur phosphatase, nedbrydende enzymer forbundet med nitrogen-metabilismen, glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase og enzymer, der er ansvarlige for maltose- og galactoseud-nyttelse (22). Et sådant kontrolområde ville være meget 10 nyttigt til styring af udtrykkeisen af et proteinprcdukt, især når produktionen deraf er toxisk for gæren. Det skulle også være muligt at sætte kontrolområdet af en 5'-flankerende sekvens sammen med en 5'-flankerende sekvens indeholdende en promotor fra et kraftigt udtrykt gen.

15 Dette ville resultere i en hybrid promotor og skulle være muligt, da kontrolområdet og promotoren synes at være fysisk adskilte DNA-sekvenser.

3. Cellekultursystemer/cellekulturvektorer 20

Formering af hvirveldyrceller i kultur (vævskultur) er blevet en rutineprocedure i de seneste år (se Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Patterson eds, 1973).

Heri anvendtes C0S-7-linien af abenyrefibroblaster som 25 vært for produktionen af immuninterferon (25a). Imidlertid kunne de her beskrevne forsøg gennemføres i enhver cellelinie, som er i stand til at replicere og udtrykke en kompatibel vektor, f.eks. WI38, ΒΗΚ, 3T3, CHO, VERO og HeLa cellelinier. Desuden er det, der kræves af udtryk-30 kelsesvektoren, et repliceringsorigin og en promotor lokaliseret foran genet, som skal udtrykkes, sammen med eventuelle nødvendige ribosombindingssteder, RNA-splejs-ningssteder, polyadenyleringssted og transkriptionsafslutningssekvenser. Selv om der i denne beskrivelse er 35 anvendt sådanne nødvendige elementer fra SV40, vil det forstås, at opfindelsen ikke skal anses for at være begrænset til disse sekvenser. F.eks. kunne replicerings-

DK 163187B

16 originet fra andre virale (f.eks. Polyoma, Adeno, VSV, BPV osv.) vektorer anvendes, såvel som cellulære DNA-re-pliceringsoriginer, som kunne fungere i en ikke-integre-ret tilstand.

5 B. Vektorsystemer 1. Direkte udtrykkelse af modent immuninterferon i E. coli.

10

Den procedure, som anvendtes til at opnå direkte udtrykkelse af IFN-r i E. coli som et modent interferon-poly-peptid (minus signalsekvens) var en variant af den, der tidligere er anvendt for humant væksthormon (26) og hu-15 mant leukocyt interferon (1), for så vidt som den indebærer kombinationen af syntetisk (N-terminal) DNA og cDNA.

Som udledt af nucleotidsekvensen af p69, beskrevet nedenfor, og ved sammenligning med det kendte spaltningssted 20 mellem signalpeptidet og det modne polypeptid for flere IFN-a (2), har IFN-r et hydrofobt signalpeptid på 20 aminosyrer efterfulgt af 146 aminosyrer af modent’ IFN-r (fig. s). Som vist i fig. 7 er et BstNI restriktionsendo-nucleasested hensigtmæssigt lokaliseret ved aminosyre 4 i 25 det modne IFN-r. Der blev udformet to syntetiske oligode-oxynucleotider, som inkorporerer en ATG-translations-startcodon, codoner for aminosyrerne 1, 2 og 3 (cystein-tyrosin-cystein) og har skabt en EcoRI-kohæsiv ende.

Disse deoxyoligonucleotider blev ligeret til et 100 base-30 par BstNI-Pstl-fragment af p69 til konstruktion af et 1115 basepar syntetisk-naturligt hybridgen, som koder for IFN-r, og som er afgrænset af EcoRI og Pstl-restrik-tionssteder. Dette gen blev indsat i plasmidet pLeIF A trp 103 mellem EcoRI- og PstI-stederne til dannelse af 35 udtrykkelsesplasmidet pIFN-r trp 48. I dette plasmid udtrykkes IFN-r-genet under kontrol af E. coli trp promotoren (pLeIF A trp 103 er et derivat af pLeIF A 25, hvori

DK 163187B

17

EcoRI-stedet fjernest fra LeIF A genet var fjernet. Proceduren, der blev anvendt til at fjerne dette EcoRI-sted, er blevet beskrevet tidligere (27)).

5 2. Udtrykkelse i gær

For at udtrykke et heterologt gen, såsom cDNA'en for immuninterferon, i gær var det nødvendigt at konstruere en plasmidvektor indeholdende fire komponenter. Den første 10 komponent er den del, som tillader transformation af både E. coli og gær og således må indeholde et selekterbart gen for hver organisme. (I dette tilfælde er dette genet for ampicillinresistens fra E. coli og genet TRP1 fra gær). Denne komponent kræver også et repliceringsorigin 15 fra begge organismer for at opretholdes som plasmid-DNA i begge organismer. (I dette tilfælde er dette E. coli ori-ginet fra pBR322 og arsi originet fra kromosom III i gær).

20 Den anden komponent af plasmidet er en 5'-flankerende sekvens fra et kraftigt udtrykt gærgen til at promotore transkription af et nedenfor anbragt strukturgen. I dette tilfælde anvendes den 51-flankerende sekvens fra gær-3-phosphoglyceratkinase (PGK)-genet. Fragmentet blev kon-25 strueret på en sådan måde, at ATG-codonen af PGK-struk-tursekvensen såvel som 8 bp opad fra denne ATG-codon blev fjernet. Denne sekvens blev erstattet med en sekvens indeholdende både et Xbal- og EcoRl-restriktionssted til hensigtsmæssig tilknytning af denne 5'-flankerende 30 sekvens til strukturgenet.

Systemets tredie komponent er et strukturgen konstrueret på en sådan måde, at det indeholder både et ATG-transla-tionsstartsignal og translationsstopsignaler. Isoleringen 35 og konstruktionen af et sådant gen er beskrevet nedenfor.

DK 163187B

18

Den fjerde komponent er en gær-DNA-sekvens indeholdende den 3'-flankerende sekvens af et gærgen, som indeholder de rette signaler for transkriptionsafslutning og poly-adenylering.

5

Med alle disse komponenter til stede er der blevet produceret immuninterferon i gær.

3. Udtrykkelse i pattedyrcellekultur 10

Strategien for syntesen af immuninterferon i pattedyrcellekultur hvilede på udviklingen af en vektor, som er i stand til både autonom replicering og udtrykkelse af et fremmed gen under kontrol af en heterolog transkriptions-15 enhed. Repliceringen af denne vektor i vævskultur blev opnået ved at tilvejebringe et DNA-repliceringsorigin (afledt fra SV40 virus) og at tilvejebringe hjælperfunktion (T antigen) ved indførelse af vektoren i en cellelinie, der endogent udtrykker dette antigen (28, 29). Den 20 sene promotor af SV40 virus kom foran strukturgenet af interferon og sikrede transkriptionen af genet.

Vektoren, der blev anvendt til at opnå udtrykkelse af IFN-r bestod af pBR322 sekvenser, som tilvejebragte en 25 selekterbar markør til selektion i E. coli (ampicillinre-sistens) såvel som et E. coli origin for DNA-replicering.

Disse sekvenser blev afledt fra plasmidet pML-1 (28) og omfattede det område, som spændte over EcoRI og BamHI restriktionsstederne. SV40 originet er afledt fra et 342 30 basepar PvuII-Hindlll fragment omfattende dette område (30, 31) (hvor begge ender var omdannet til EcoRI-ender). Foruden at omfatte det virale origin for DNA-replicering har disse sekvenser indkodet promotoren for både den tidlige og den sene transkriptionsenhed. Orienteringen af 35 SV40 originområdet var sådan, at promotoren for den sene transkriptionsenhed var anbragt nærmest ved genet, der koder for interferon.

19

DK 163187 B

Kort beskrivelse af tegningerne

Fig. 1 viser en saccharosegradientcentrifugering af induceret perifer-blod-lymfocyt(PBL)-poly(A)+RNA. To maxima 5 for interferonaktivitet blev iagttaget (som vist ved de skraverede kasser) med størrelser på 12S og 16S. Positionerne af ribosomale RNA-markører (centrifugeret for sig) er mærket over absorbansprofilen.

10 Fig. 2 viser en elektroforese af induceret-PBL-poly-(A)+RNA igennem en syre-urinstof-agarose. Der blev kun iagttaget et aktivitetsmaximum, som vandrede sammen med 18S RNA. Positionerne af ribosomale RNA-markører, som blev elektroforeret i et nabospor og gjort synligt ved 15 ethidiumbromidfarvning, er mærket over aktivitetsprofilen.

Fig. 3 viser hybridiseringsmønster af 96 kolonier med in- 32 ducerede og uinducerede p-mærkede cDNA-sonder. 96 indi- 20 viduelle transformanter blev dyrket på en mikrotiterpla- de, replicater blev udpladet på to nitrocellulosemembra- 32 ner, og derpå blev filtrene hybridiseret med p-cDNA-sonder fremstillet ud fra enten induceret mRNA (for oven) eller mRNA isoleret fra uinducerede PBL-kulturer (uindu-25 ceret, for neden). Filtrene blev vasket for at fjerne ik-ke-hybridiseret RNA og derpå eksponeret på røntgenfilm.

Dette sæt filtre er repræsentativt for 86 sådanne sæt (8300 uafhængige kolonier). Et eksempel på en "induceret" klon er mærket som H12.

30

Fig. 4 er et restriktionsendonucleasekort over klon 69 cDNA indsætningen. cDNA-indsætningen er afgrænset af Pstl-steder (prikker ved begge ender) og oligo-dC-dG-haler (enkelte linier). Antallet og størrelsen af frag-35 menter frembragt ved restriktionsendonucleasespaltning blev bedømt ved elektroforese igennem 6 % acrylamidgeler. Positioner af steder blev bekræftet ved nucleinsyrese-

DK 163187 B

20 kvensbestemmelse (vist i fig. 5). Kodningsområdet af den største åbne aflæsningsramme er indrammet, og det skraverede område repræsenterer signalpeptidsekvensen på formentligt 20 rester, medens det stiplede område repræsen-5 terer den modne IIF-sekvens (146 aminosyrer). 5'-enden af mRNA’en er til venstre, medens 3'-enden er til højre.

Fig. 5 belyser nucleotidsekvensen af plasmid p69-cDNA-indsætningen, men viser den mest almindelige allele form 10 af IFN-r. Den udledte aminosyresekvens af den længste åbne aflæsningsramme er også vist. Den formentlige signalsekvens er repræsenteret ved resterne mærket S1-S20.

Fig. 6 er en sammenligning af IFN-r mRNA-strukturen med 15 strukturen af leukocyt (IFN-α)- og fibroblast (IFN-Æ)-interferoner. Klon 69 mRNA'en (mærket immun) indeholder væsentligt større mængder utranslaterede sekvenser.

Fig. 7 er et skematisk diagram af konstruktionen af IFN-20 r-udtrykkelsesplasmidet pIFN-r trp 48. Udgangsmaterialet er 1250 basepar Pstl-cDNA-indsætningen fra plasmid p69.

Fig. 8 viser et diagram af plasmidet, der blev anvendt til udtrykkelse af IFN-r i abeceller.

25

Fig. 9 afbilder en Southern-hybridisering af otte forskellige EcoRI-nedbrudte humane genomiske DNA'er hybridi-32 seret med et P-mærket 600 bp Ddel- fragment fra cDNA-indsætningen i p69. To EcoRI-fragmenter hybridiserer 30 klart med sonden i hver DNA-prøve.

Fig. 10 afbilder en Southern-hybridisering af human geno- misk DNA nedbrudt med seks forskellige restriktionsendo- 32 nucleaser hybridiseret med den P-mærkede sonde fra p69.

Fig. 11 belyser skematisk restriktionskortet af 3,1 kbp Hindlll-indsætningen i vektor pBl, hvorfra PGK-promotoren 35 21

DK 163187 B

var isoleret. Angivet er indsætningen af et EcoRI-sted og et Xbal-sted i den 5'-flankerende DNA af pGK-genet.

Fig. 12 belyser den 5'-flankerende sekvens plus den be-5 gyndende kodesekvens for PGK-genet før indsætning af XbaX- og EcoRI-steder.

Fig. 13 belyser skematisk de teknikker, der blev anvendt til at indsætte et Xbal-sted i position 8 i PGK-promoto-10 ren og til at isolere et 39 bp fragment af den 5'-flankerende sekvens af PGK indeholdende denne Xbal-ende og en Sau3A-ende.

Fig. 14 belyser skematisk konstruktionen af et 300 bp 15 fragment indeholdende det ovennævnte 39 bp fragment, yderligere PGK-5'-flankerende sekvens (265 bp) fra Pvul til Sau3A (se fig. 11) og et EcoRI-sted op til Xbal-ste-det.

20 Fig. 15 belyser skematisk konstruktionen af 1500 bp PGK-promotorfragmentet (Hindlll-EcoRI), som foruden det i fig. 14 konstruerede fragment indeholder et 1300 bp Hindlll-Pvul-fragment fra den PGK-5'-flankerende sekvens (se fig. 11).

25

Fig. 16 belyser sammensætningen af en udtrykkelsesvektor for humant immuninterferon i gær indeholdende den modificerede PGK-promotor, IFN-r cDNA'en og slutområdet af gær-PGK-genet som beskrevet mere detaljeret i det følgende.

30

Detailbeskrivelse a. Kilde til IFN-r mRNA

35 Perifere blodlymfocyter (PBL) blev afledt fra humane donorer ved leukophorese. PBL'erne blev yderligere renset ved Ficoll-Hypaque-gradientcentrifugering og derpå dyrket 22

DK 163187 B

g i en koncentration på 5 x 10 celler/ml i RPMI 1640, 1 % L-glutamin, 25 mM HEPES og 1 % penicillin-streptomycin-opløsning (Gibco, Grand Island, NY, U.S.A.). Disse celler blev induceret til at producere IFN-r ved hjælp af mito-5 gen-staphylococenterotoxin B (1 ng/ml) og dyrket i 24-48 timer ved 37 °C i 5 % Desacetyl thymosin-a-1 (0,1 ug/ml) sattes til PBL-kulturerne for at forøge det relative udbytte af IFN-r-aktivitet.

10 B. Budbringer-RNA-isolering

Total RNA fra PBL-kulturerne blev ekstraheret i hovedsagen som rapporteret af Berger, S.L. et al., (33). Cellerne blev pelleteret ved centrifugering og derpå gensuspen-15 deret i 10 mM NaCl, 10 mM "Tris"-HCl (pH 7,5), 1,5 mM

MgCl^ og 10 mM ribonucleosid-vanadyl-kompleks. Cellerne blev lyseret ved tilsætning af NP-40 (1 procent slutkon-centration), og kernerne blev pelleteret ved centrifugering. Supernatanten indeholdt den totale RNA, som blev 20 yderligere renset ved flere phenol- og chloroform-eks-traktioner. Den vandige fase blev gjort 0,2 M mht. NaCl, og derpå blev den totale RNA udfældet ved tilsætning af to volumener ethanol. RNA fra uinducerede (ikke stimulerede) kulturer blev isoleret ved de samme metoder. Oligo-25 dT-cellulose-chromatografi blev anvendt til at rense mRNA fra de totale RNA-præparater (34). Typiske udbytter for 1-2 liter dyrkede PBL'er var 5-10 mg total RNA og 50-200 ug poly(A)+RNA.

30 C. Størrelsesfraktionering af mRNA

To metoder blev anvendt til at fraktionere mRNA-præpara-ter. Disse metoder blev anvendt hver for sig (frem for tilsammen) og hver resulterede i en væsentlig berigelse 35 mht. IFN-r mRNA.

23

DK 163187 B

Saccharose-gradient-centrifugering i nærvær af denatureringsmidlet formamid anvendtes til at fraktionere mRNA. Gradienter på 5-25 procent saccharose i 70 procent formamid (32) blev centrifugeret ved 154 000 x G i 19 timer 5 ved 20 °C. Successive fraktioner (0,5 ml) blev derpå fjernet fra toppen af gradienten, ethanolfældet, og en aliquot blev injiceret i Xenopus laevis oocyter til translation af mRNA'en (35). Efter 24 timer ved stuetemperatur blev inkubationsmediet prøvet for antiviral akti-10 vitet ved en standard cytopathisk-effekt-inhiberingsprøv-ning under anvendelse af Vesiculær Stomatitis Virus (Indiana-stamme) eller Encephalomyocarditis Virus på WISH (human amnion) celler som beskrevet af Stewart (36), undtagen at prøverne blev inkuberet med cellerne i 24 timer 15 (i stedet for 4) før udsættelsen for viruset. Der blev vedvarende iagttaget to aktivitetsmaxima i saccharosegra-dientfraktioneret RNA (fig. 1). Et maximum sedimenterede med en beregnet størrelse på 12S og indeholdt 100-400 enh./ml antiviral aktivitet (sammenlignet med en IFN-a 20 standard) pr. ug injiceret RNA. Det andet aktivitetsmaxi-mum sedimenterede som 16S i størrelse og indeholdt omkring den halve aktivitet af det langsommere sedimenterende maximum. Hvert af disse aktivitetsmaxima viser sig at skyldes IFN-r, da der ikke blev iagttaget nogen akti-25 vitet, når de samme fraktioner blev prøvet på en oksecellelinie (MDBK), som ikke beskyttes af humant IFN-r. Både IFN-a aktivitet og IFN-0 aktivitet ville let være blevet sporet med MDBK-prøvningen (5).

30 Fraktionering af mRNA (200 ug) blev også gennemført ved elektroforese igennem syre-urinstof-agarosegeler. Agaro-segelpladen (37, 38) var sammensat af 1,75 % agarose, 0,025 M natriumcitrat, pH 3,0, og 6M urinstof. Elektrofo-resen blev gennemført i 7 timer ved 25 mA og 4 °C. Gelen 35 blev derpå fraktioneret med et barberblad. De enkelte skiver blev smeltet ved 70 °C og ekstraheret to gange med phenol og en gang med chloroform. Fraktioner blev derpå

DK 163187B

24 ethanolfældet og derefter prøvet for IFN-τ mRNA ved injektion i Xenopus laevis oocyter og antiviral prøvning.

Der blev kun iagttaget ét aktivitetsmaximum i gelfraktionerede prøver (fig. 2). Dette maximum vandrede sammen med 5 18S RNA og havde en aktivitet på 600 enh./ml pr. ug inji ceret RNA. Denne aktivitet viste sig også at være iFN-r-specifik, da den ikke beskyttede MDBK-celler.

Uoverensstemmelsen i størrelse mellem aktivitetsmaxima 10 iagttaget på saccharosegradienter (12S og 16S) og syre-urinstof-geler (18S) kan forklares ved den iagttagelse, at disse uafhængige fraktioneringsmetoder ikke gennemføres under betingelser for total denaturering.

15 D. Fremstilling af en kolonisamling indeholdende IFN-r-sekvenser 3 ug gelfraktioneret mRNA blev anvendt til fremstilling af dobbeltstrenget cDNA ved standardprocedurer (26, 39).

20 cDNA'en blev størrelsesfraktioneret på en 6 % polyacryl-amidgel. To størrelsesfraktioner blev elektroelueret, 800-1500 bp (138 ng) og >1500 bp (204 ng). 35 ng portioner af hver størrelse cDNA blev forlænget med deoxyC-rester under anvendelse af terminal deoxynucleotidyl-25 transferase (40) og sammenføjet med 300 ng af plasmidet pBR322 (41), som på lignende måde var blevet påsat en hale af deoxyG-rester ved Pstl-stedet (40). Hver sammensmeltet blanding blev derpå transformeret ind i E. coli K12 stamme 294. Der blev opnået omkring 8000 transforman-30 ter med cDNA'en på 800-1500 bp og 400 trans formanter med cDNA'en på >1500 bp.

E. Screening af kolonibibliotek for inducerede cDNA'er 35 Kolonierne blev hver for sig podet ind i huller på mikro-titerplader indeholdende LB (58) + 5 ug/ml tetracyclin og opbevaret ved -20 °C efter tilsætning af dimethylsulfoxid

DK 163187 B

25 til 7 %. To kopier af kolonisamlingen blev opdyrket på nitrocellulosefiltre, og DNA'en fra hver koloni fixeret på filtret ved Grunstein-Hogness-proceduren (42).

32 5 P-mærkede cDNA-sonder blev fremstillet under anvendelse af mRNA gelfraktioneret til en størrelse på 18S fra inducerede og uinducerede PBL-kulturer. 01igo-dT12_^g var den anvendte primer, og reaktionsbetingelserne er tidligere beskrevet (1). Filtre indeholdende 8000 transformanter 10 fra cDNA størrelsesudskæringen på 600-1500 bp og 400 transformanter fra cDNA størrelsesudskæringen på >1500 bp 6 32 blev hybridiseret med 20 x 10 cpm induceret P-cDNA. Et duplikeret sæt filtre blev hybridiseret med 20 x 10^ cpm 32 uinduceret P-cDNA. Hybridiseringen gennemførtes i 16 15 timer under anvendelse af betingelser beskrevet af Fritsch et al. (43). Filtrene blev grundigt vasket (43) og derpå eksponeret på Kodak XR5 røntgenfilm med DuPont "Lightning-Plus" intensiveringsskærme i 16-48 timer. Hver kolonis hybridiseringsmønster med de to sonder blev sam-20 menlignet. Omkring 40 % af kolonierne hybridiserede klart med begge sonder, medens omkring 50 % af kolonierne ikke hybridiserede med nogen af sonderne (vist i fig. 3). 124 kolonier hybridiserede signifikant med den inducerede sonde, men umærkeligt eller svagere med den uinducerede 25 sonde. Disse kolonier blev hver for sig indpodet i huller på mikrotiterplader, dyrket og overført til nitrocellulosefiltre og hybridiseres med de samme to sonder som beskrevet ovenfor. Plasmid-DNA isoleret fra hver af disse kolonier ved en hurtig metode (44) blev også bundet til 30 nitrocellulosefiltre og hybridiseret (45) med den inducerede og den uinducerede sonde. DNA fra 22 kolonier hybridiserede med kun den inducerede sonde og blev betegnet "inducerede" kolonier.

35 26

DK 163187B

F. Karakterisering af inducerede kolonier

Plasmid DNA blev fremstillet ud fra 5 af de inducerede kolonier (46) og anvendt til karakterisering af cDNA-ind-5 sætningerne. Restriktionsendonuclease-kortlægning af 5 inducerede plasmider (p67, p68, p69, p71 og p72) tydede på, at fire havde meget ens restriktionsendonucleasekort.

Disse fire (p67, p69, p71 og p72) havde hver fire DdeT-10 steder, to Hinfl-steder og et enkelt Rsal-sted i cDNA-indsætningen. Det femte plasmid (p68) indeholdt et fælles Ddel-fragment og viste sig at være en kort cDNA-klon beslægtet med de andre fire. Homologien, der blev antydet af restriktionsendonuclease-kortlægningen, blev bekræftet 32 15 ved hybridisering. En P-mærket DNA-sonde blev fremstillet (47) ud fra et 600 bp Ddel-fragment af plasmidet p67 og anvendt til hybridisering (42) til de andre inducerede kolonier. Alle fem af de restriktionsendonuclease-kort-lagte kolonier krydshybridiserede med denne sonde, lige-20 som 17 andre kolonier af de 124, der var udvalgt ved in-duceret/uinduceret-screeningen. Længden af cDNA-indsæt-ningen i hvert af disse krydshybridiserede plasmider blev bestemt ved PstI-nedbrydning og gelelektroforese. Klonen med den længste cDNA-indsætning viste sig at være klon 69 25 med en indsætningslængde på 1200-1400 bp. Denne DNA blev anvendt til alle yderligere forsøg, og dens restriktions-endonuclease-kort er vist i fig. 4.

cDNA-indsætningen i p69 blev vist at være IFN-τ cDNA ved 30 dens udtrykkelsesprodukter, produceret i tre uafhængige udtrykkelsessysterner, som gav antiviral aktivitet som beskrevet mere detaljeret nedenfor.

G. Sekvensanalyse af cDNA-indsætning i p69.

Den fuldstændige nucleotidsekvens af plasmid-p69-cDNA-indsætningen blev bestemt ved dideoxynucleotid-kædeaf- 35 27

DK 163187 B

slutningsmetoden (48) efter subkloning af fragmenter ind i M13 vektoren mp7 (49) og ved den kemiske Maxam-Gilbert-procedure (52). Den længste åbne aflæsningsramme koder for et protein på 166 aminosyrer, som vist i fig. 5. Den 5 første indkodede rest er den første met-codon, der mødes i 5'-enden af cDNA'en. De første 20 rester ved aminoenden tjener sandsynligvis som signalsekvens for sekretionen af de resterende 146 aminosyrer. Denne formentlige signalsekvens har træk tilfælles med andre karakteriserede sig-10 nalsekvenser, såsom størrelse og hydrofobicitet. Endvidere er de fire aminosyrer, som findes i den formentlige spaltningssekvens (ser-leu-gly-cys), identiske med fire rester, som findes ved spaltningspunktet af flere leuco-cyt-interferoner (LeIF B, C, D, F og H (2)). Den inkodede 15 modne aminosyresekvens på 146 aminosyrer (i det følgende betegnet som "rekombinant humant immuninterferon") har en molekylvægt på 17140.

Der er to potentielle glycosyleringspositioner (50) i den 20 indkodede proteinsekvens, ved aminosyrerne 28-30 (asn-gly-thr) og aminosyrerne 100-102 (asn-tyr-ser). Eksistensen af disse positioner stemmer overens med den iagttagne glycosylering af humant IFN-r (6, 51). Desuden er de eneste to cysteinrester (position 1 og 3) sterisk for nær 25 sammen til at danne en disulfidbro, hvilket stemmer overens med den iagttagne stabilitet af IFN-r i nærvær af reducerende midler, såsom Ø-mercaptoethanol (51). Den udledte modne aminosyresekvens er i almindelighed helt basisk med i alt 30 lysin-, arginin- og histidinrester og 30 kun i alt 19 asparaginsyre- og glutaminsyrerester.

mRNA-strukturen af IFN-7 som udledt fra DNA sekvensen af plasmid p69 er klart forskellig fra IFN-α (1, 2) eller IFN-/) (5) mRNA. Som vist i fig. 6 er kodningsområdet for 35 IFN-r kortere, medens de 5'-utranslaterede og 3'-utrans-laterede områder er meget længere end for såvel IFN-α som IFN-/5.

28

DK 163187 B

H. Udtrykkelse af rekombinant immuninterferon i E. coli

Med henvisning til fig. 7 blev 50 ug plasmid p69 nedbrudt med PstI og 1250 bp indsætningen isoleret ved gelelektro-5 forese på en 6 % polyacrylamidgel. Omkring 10 ug af denne indsætning blev elektroelueret fra gelen. 5 ug af dette PstI-fragment blev delvis nedbrudt med tre enheder BstNI (Bethesda Research Labs) i 15 minutter ved 37 °C, og reaktionsblandingen blev renset på en 6 % polyacrylamid-10 gel- Omkring 0,5 ug af det ønskede BstNI-Pstl-fragment på 1100 bp blev udvundet. De to angivne deoxyoligonucleoti-der, 5 *-dAATTCATGTGTTATTGTC og 5'-dTGACAATAACACATG (fig.

7) , blev syntetiseret ved phosphotriestermetoden (53) og phosphoryleret som følger: 100 pmol af hvert deoxyoligo-

15 nucleotid blev kombineret i 30 ul 60 mM "Tris"-HCl (pH

8) , 10 mM MgCl9, 15 mM Ø-mercaptoethanol og 240 uCi (r-p)ATP (Amersham, 5000 Ci/mmol). Der tilsattes 12 enheder T^-polynucleotidkinase, og reaktionen fik lov at foregå ved 37 °C i 30 minutter. Der tilsattes 1 ul 10 mM

20 ATP, og reaktionen fik lov at foregå i yderligere 20 minutter. Efter phenol/chloroform-ekstraktion blev de oli-gomere kombineret med 0,25 ug af BstNI-PstI-fragmentet på 1100 bp og ethanolfældet. Disse fragmenter blev ligeret ved 20 °C i 2 timer i 30 ul 20 mM "Tris"-HCl (pH 7,5), 10 25 mM MgC^, 10 mM dithiothreitol, 0,5 mM ATP og 10 enheder T^-DNA-ligase. Blandingen blev nedbrudt i en time med 30 enheder PstI og 30 enheder EcoRI (for at eliminere poly-merisering fra ligering af kohæsive ender) og underkastet elektroforese på en 6 % polyacrylamidgel. Produktet på 30 1115 bp (110000 cpm) blev udvundet ved elektroeluering.

Plasmidet pLeIF A trp 103 (fig. 7) er et derivat af plas-midet pLeIF A 25 (1), hvori EcoRI-stedet distalt til LeIF A genet er blevet fjernet (27). 3 ug pLeIF A trp 103 blev 35 nedbrudt med 20 enheder EcoRI og 20 enheder PsrI i 90 minutter ved 37 “C og underkastet elektroforese på en 6 % polyacrylamidgel. Det store (ca. 3900 bp) vekzorfragment

DK 163187B

29

blev udvundet ved elektroeluering. 1115 bp EcoRI-PstI

IFN-r-DNA-fragmentet blev ligeret ind i 0,15 ug af denne fremstillede vektor. Transformation af E. coli K-12 stamme 294 (ATCC nr. 31446) gav 120 tetracyclinresistente 5 kolonier. Plasmid-DNA blev fremstillet ud fra 60 af disse transformanter og nedbrudt med EcoRI og Pstl. Tre af disse plasmider indeholdt det ønskede 1115 bp EcoRI-Pstl-fragment. DNA-sekvens-analyse bekræftede, at disse plasmider havde den ønskede nucleotidsekvens ved samlingerne 10 mellem trp-promotoren, syntetisk DNA og cDNA. Et af disse plasmider pIFN-7 trp 48 blev udvalgt til yderligere undersøgelse. Dette plasmid blev anvendt til at transformere E. coli K-12 stamme W3110 (ATCC nr. 27325).

15 I. Genstruktur af IFN-r-kodesekvensen

Strukturen af genet, der koder for IFN-r, blev analyseret ved Southern-hybridisering. Ved denne procedure (54) nedbrydes 5 ug højmolekylær human lymphocyt-DNA (fremstillet 20 som i 55) fuldstændigt med forskellige restriktionsendo-nucleaser, underkastes elektroforese på 1,0 % agarosege- ler (56) og duppes på et nitrocellulosefilter (54). En 32 p-mærket DNA-sonde blev fremstillet (47) ud fra et 600 bp Ddel-fragment af cDNA-indsætningen i p69 og hybridise- 7 25 ret (43) med nitrocellulose-DNA-dupningen. 10 tællinger pr. minut af sonden blev hybridiseret i 16 timer og derpå vasket som beskrevet (49). Otte genomiske DNA-prøver fra forskellige humane donorer blev nedbrudt med EcoRI-re- 32 striktionsendonuclease og hybridiseret med den p-mærke-30 de p69-sonde. Som vist i fig. 9 iagttages to klare hybri-diseringssignaler med størrelser på 8,8 kbp og 2,0 kbp som bedømt ved sammenligning af mobiliteter med HindiIlnedbrudt λDNA. Dette kunne være resultatet af to IFN-r-gener eller et enkelt gen delt af et EcoRI-sted. Da p60-35 cDNA*en ikke indeholder noget EcoRI-sted, ville en mel lemliggende sekvens (intron) med et indre EcoRI-sted være nødvendig for at forklare et enkelt gen. For at skelne 30

DK 163187 B

mellem disse muligheder blev der gennemført en anden Southern-hybridisering med den samme sonde over for fem andre endonuclease-nedbrydninger af enkelt human DNA (fig. 10). To hybridiserende DNA-fragmenter blev iagtta-5 get med to andre endonucleasenedbrydninger, PvuII (6,7 kbp og 4,0 kbp) og Hindi (2,5 kbp og 2,2 kbp). Imidlertid giver tre endonucleasenedbrydningsmønstre kun et enkelt hybridiserende DNA-fragment: HindiII (9,0 kbp),

Bglll (11,5 kbp) og BamHI (9,5 kbp). To IFN-r-gener måtte 10 være forbundet i en usædvanligt lille afstand (mindre end 9,0 kbp) for at være indeholdt i det samme HindiII-hybridiserende fragment. Dette resultat antyder, at der kun er et enkelt homologt IFN-r-gen til stede i human genomisk DNA (i modsætning til mange beslægtede IFN-α-gener), og 15 at dette gen er delt af et eller flere introner indeholdende EcoRI-, PvuII- og HindI-steder. Denne forudsigelse 32 blev støttet ved hybridisering af et p-mærket (47) fragment fremstillet ud fra netop det 3'-utranslaterede område af cDNA'en fra p69 (130 bp Ddel-fragmentet fra 860 20 bp til 990 bp i fig. 5) over for en EcoRI-nedbrydning af human genomisk DNA. Kun 2,0 kbp EcoRI-fragmentet hybridi-serede til denne sonde, hvilket tyder på, at dette fragment indeholder de 3 *-utranslaterede sekvenser, medens 8,8 kbp EcoRI-fragmentet indeholder 5'-sekvenserne.

25 Genstrukturen af IFN-r (ét gen med mindst én intron) er klart forskellig fra IFN-α (flere gener (2) uden introner (56)) eller IFN-0 (ét gen uden introner (57)).

J. Fremstilling af bakterieekstrakter 30

En kultur af E. coli W3110/pIFN-r trp 48 i Luria-væske + 5 ug/ml tetracyclin, dyrket natten over, blev anvendt til at pode M9 (58) medium indeholdende 0,2 % glucose, 0,5 % casaminosyrer og 5 tig/ml tetracyclin i en fortynding på 35 1:100. Der tilsattes indolacrylsyre til en slutkoncentra- tion på 20 ag/ml, da var mellem 0,1 og 0,2. Prøver på 10 ml blev indhøstet ved centrifugering ved A^j-q = 1,0

DK 163187B

31 og øjeblikkeligt gensuspenderet i 1 ml phosphatpufret saltopløsning indeholdende 1 mg/ml okseserumalbumin (PBS-BSA). Cellerne blev åbnet ved lydbehandling og befriet for rester ved centrifugering. Supernatanterne blev opbe-5 varet ved 4 °C indtil prøvningen. Interferon-aktiviteten i supernatanterne blev bestemt til at være 250 enh./ml ved sammenligning med IFN-α-standarder ved cytopatisk-effekt (CPE)-inhiberingsprøvningen.

10 K. Transformation af gær, stammer og medier Gærstammer blev transformeret som tidligere beskrevet (59). E. coli stamme JA300 (thr leuB6 thi thyA trpC117 **· — p hsdm hsdR str ) (20) blev anvendt til at selektere for 15 plasmider indeholdende funktionelt TRPI-gen. Gærstammen RH218, som har genotypen (a trpl gal2 SUC2 mal CUPI) (18), blev anvendt som gærtransformationsvært. RH218 er blevet deponeret uden begrænsning i the American Type Culture Collection, ATCC nr. 44076. M9 (minimal-medium)

20 med 0,25 % casaminosyrer (CAA) og LB (rigt medium) var som beskrevet af Miller (58) med tilsætning af 20 ug/ml ampicillin (sigma) efter at medierne er autoklave'ret og afkølet. Gær blev dyrket på de følgende medier: YEPD

indeholdt 1 % gærekstrakt, 2 % pepton, 2 % glucose og om-25 kring 3 % Difco-agar. YNB + CAA indeholdt 6,7 g gærnitro-genbase (uden aminosyrer) (YNB) (Difco), 10 mg adenin, 10 mg uracil, 5 g casaminosyrer (CAA), 20 g glucose og omkring 30 g agar pr. liter.

30 L. Konstruktion af gærudtrykkelsesvektor 1. 10 ug YRp7 (14, 15, 16) blev nedbrudt med EcoRI. Re sulterende kohæsive DNA-ender blev gjort stumpe ved anvendelse af DNA-polymerase I (Klenow-fragment). Vektor og 35 indsætning blev kørt på 1 % agarosegel (SeaKerr. , udskåret fra gelen, elektroelueret og ekstraheret 2 gange med lige store volumener chloroform og phenol før fældning med 32

DK 163187 B

ethanol. De resulterende stumpendede DNA-molekyler blev derpå ligeret sammen i et slutvolumen på 50 nl i 12 timer ved 12 “C. Denne ligeringsblanding blev derpå anvendt til at transformere E. coli stamme JA300 til ampicillinresi-5 stens og tryptophanprototrofi. Plasmider indeholdende TRPI-genet i begge orienteringer blev isoleret. pFRWl havde TRPI-genet i den samme orientering som YRp7, medens pFRW2 havde TRPI-genet i den modsatte orientering.

10 20 ug pFRW2 blev lineariseret med Hindlll og underkastet elektroforese på en 1 % agarosegel. Lineære molekyler blev elueret fra gelen, og 200 ng blev derpå ligeret med 500 ng af 3,1 kbp Hindlll-indsætningen i plasmid pBl (13), som er et restriktionsfragment indeholdende gær-3-15 phosphoglyceratkinase-genet. Ligeringsblandingen blev an vendt til at transformere E. coli stamme 294 til ampicil-linresistens og tetracyclinfølsomhed. Plasmid fremstillet ud fra en sådan rekombinant havde et intakt TRPI-gen med 3,1 kbp HindiII-fragmentet fra pBl-indsætnings-DNA i 20 HindiII-stedet af tetracyclinresistensgenet. Dette plasmid er pFRM31. 5 ug pFRM31 blev fuldstændigt nedbrudt med EcoRI, ekstraheret 2 gange med phenol og chloroform og derpå ethanolfældet. Molekylets kohæsive ender blev fyldt ud under anvendelse af DNA-polymerase I (Klenov:-fragment) 25 i en reaktionsblanding, som blev gjort 250 uM med hensyn til hvert deoxynucleosidtriphosphat. Reaktionen blev gennemført i 20 minutter ved 14 °C, hvorefter DNA’en blev ekstraheret 2 gange med phenolchloroform og derpå fældet med ethanol. Den gensuspenderede DNA blev derpå fuldstæn-30 digt nedbrudt med Clal og underkastet elektroforese på en 6 % polyacrylamidgel. Vektorfragmentet blev elueret fra gelen, phenol/chloroform-ekstraheret og ethanolfældet.

De seks N-terminale aminosyrer i 3-phosphoglyceratenzy-35 met, renset fra mennesker, er som følger 33

DK 163187 B

1-2-3-4-5-6 SER - LEU - SER - HSM - LYS - LEU - 5 En af translationsaflæsningsrammerne skabt ud fra DNA-se-kvensen af 141 bp Sau3A-Sau3A-restriktionsfragmentet (indeholdende det indre HindI-sted; se PGK-restriktionskortet fig. 11) producerer den følgende aminosyresekvens: 10 1-2-3-4-5-6 MET - SER - LEU - SER - SER - LYS - LEU -

Efter fjernelse af startermethionin ses det, at den N-15 terminale PGK-aminosyresekvens har 5 af 6 aminosyrer homologe med den N-terminale aminosyresekvens af human PGK.

Dette sekvensbestemmelsesresultat tydede på, at starten af gær-PGK-strukturgenet kodes for af DNA i 141 bp Sau3A-20 restriktionsfragmentet af pBl. Tidligere arbejde (20) har antydet, at DNA-sekvenserne, der specificerer PGK-mRNA'en, kan ligge i dette område af HindiII-fragmentet. Yderligere sekvensbestemmelse af 141 bp Sau3A-fragmentet giver mere DNA-sekvens af PGK-promotoren (fig. 12).

25

Et syntetisk oligonucleotid med sekvensen 5'ATTTGTTGTAAA3' blev syntetiseret ved standardmetoder (Crea et al., Nucleic Acids Res. 8, 2331 (1980)). 100 ng af denne primer blev mærket ved 5'-enden under anvendelse 30 af 10 enheder T.-polynucleotidkinase i en 20 μΐ reak- 4 32 tionsblanding, der også indeholdt 200 wCi [r- P] ATP.

Denne mærkede primeropløsning blev anvendt ved en primer- reparations-reaktion beregnet til at være det første trin i en flertrinsfremgangsmåde til at anbringe et EcoRI-re- 35 striktionssted i den 5'-flankerende PGK-DNA lige før PGK- strukturgensekvensen.

DK 163187B

34 100 ug pBl (20) blev fuldstændig nedbrudt med Haelll og derpå kørt på en 6 % polyacrylamidgel. Det øverste bånd på den ethidiumbromidfarvede gel (indeholdende PGK-promo-torområdet) blev isoleret ved elektroeluering som beskre-5 vet ovenfor- Dette HaelII-stykke DNA på 1200 bp blev nedbrudt med Hindi og derpå kørt på en 6 % polyacrylamidgel. Båndet på 650 bp blev isoleret ved elektroeluering.

Der blev isoleret 5 ag DNA. Dette Haell-HincII-stykke DNA på 650 bp blev gensuspenderet i 20 »1 vand og derpå blan-10 det med de ovenfor beskrevne 20 ml phosphoryleret primeropløsning. Denne blanding blev phenol/chloroform-ekstra-heret 1 gang og derpå ethanolfældet. Den tørrede DNA blev gensuspenderet i 50 al vand og derpå opvarmet i et kogende vandbad i 7 minutter. Denne opløsning blev derpå hur-15 tigt afkølet i et tøris/ethanol-bad (10-20 sekunder) og derefter overført til is-vand-bad. Til denne opløsning sattes 50 al af en opløsning indeholdende 10 al 10X DNA-polymerase I puffer (Boehringer Mannheim), 10 al af en opløsning, som tidligere var gjort 2,5 mM med hensyn til 20 hvert deoxynucleosidtriphosphat (dATP, dTTP, dGTP og dCTP), 25 al vand og 5 enheder DNA-polymerase I, Klenow-fragment. Denne reaktionsblanding på 100 al blev Inkuberet ved 37 “C i 4 timer. Opløsningen blev derpå phe-nol/chloroform-ekstraheret 1 gang, ethanolfældet, tørret 25 ved lyofilisering og derpå fuldstændigt nedbrudt med 10 enheder Sau3A. Denne opløsning blev derpå kørt på en 6 % polyacrylamidgel. Båndet svarende til 39 bp i størrelse blev udskåret fra gelen og derpå isoleret ved elektroeluering som beskrevet ovenfor. Dette 39 bp bånd har en 30 stump ende og en Sau3A-kohæsiv ende. Dette fragment blev klonet ind i en modificeret pFIF trp 69 vektor (5). 10 ag pFIF trp 69 blev lineariseret med Xbal, phenol/chloro-form-ekstraheret en gang og derpå ethanolfældet.

35 Den Xbal-kohæsive ende blev fyldt ud under anvendelse af DNA-polymerase I (Klenow-fragment) i en 50 al reaktionsblanding, som var 250 aM mht. hvert nucleosidtriphosphat.

DK 163187B

35

Denne DNA blev klippet med BamHI og derpå kørt på en 6 % polyacrylamidgel. Vektorfragmentet blev isoleret fra gelen ved elektroeluering og derpå gensuspenderet i 20 nl vand. 20 ng af denne vektor blev ligeret med 20 ng af det 5 ovenfor fremstillede 39 bp fragment i 4 timer ved stuetemperatur. En femtedel af denne ligeringsblanding blev anvendt til at transformere E. coli stamme 294 til ampi-cillinresistens (på LB + 20 ug/ml amp plader). Plasmider fra transformanterne blev undersøgt ved en hurtig udvæl-10 gelsesprocedure (44). Et plasmid, pPGK-39, blev udvalgt til sekvensanalyse. 20 ug af dette plasmid blev nedbrudt med xbal, ethanolfældet og derpå behandlet med 1000 enheder bakteriel alkalisk phosphatase ved 68 °C i 45 minutter. DNA'en blev phenol/chloroform-ekstraheret tre gange 15 og derpå ethanolfældet. De dephosphorylerede ender blev derpå mærket i en 20 ul reaktionsblanding indeholdende 32 200 uCi [r- P] ATP og 10 enheder T^-polynucleotidkinase. Plasmidet blev klippet med Sall og kørt på en 6 % polyacryl amidgel .

20

Det mærkede indsætningsbånd blev isoleret fra gelen og sekvensbestemt ved den kemiske nedbrydningsmetode' (52). DNA-sekvensen ved 3'-enden af dette promotorstykke var som forventet.

25 2. Konstruktion af 312 bp Pvul-EcoRI PGK-promotorfragment 25 ug pPGK-39 (fig. 13) blev nedbrudt samtidigt med Sall og Xbal (5 enheder hver) og derpå underkastet elektrofo-30 rese på en 6 % gel. 390 bp båndet indeholdende 39 bp promotorstykket blev isoleret ved elektroeluering. Den gensuspenderede DNA blev nedbrudt med Sau3A og derpå underkastet elektroforese på en 8 % polyacrylamidgel. 39 bp PGK-promotorbåndet blev isoleret ved elektroeluering.

35 Denne DNA indeholdt 39 bp af 5'-enden af PGK-promotoren på et Sau3A-XbaI-fragment.

36

DK 163187 B

25 Mg pBl blev nedbrudt med Pvul og Kpnl og derpå underkastet elektroforese på en 6 % polyacrylamidgel. DNA-bån-det på 0,8 kbp blev isoleret ved elektroeluering og derpå nedbrudt med Sau3A og underkastet elektroforese på en 6 % 5 polyacrylamidgel- 265 bp båndet fra PGK-promotoren (fig.

11) blev isoleret ved elektroeluering.

Denne DNA blev derpå ligeret med det ovenfor fremstillede 39 bp promotorfragment i 2 timer, ved stuetemperatur. Li-10 geringsblandingen blev nedbrudt med Xbal og Pvul og derpå underkastet elektroforese på en 6 % polyacrylamidgel. Xbal-Pvul restriktionsfragmentet på 312 bp blev isoleret ved elektroeluering og derpå sat til en ligeringsblanding indeholdende 200 ng pBR322 (41) (tidligere isoleret uden 15 Pvul-PstI restriktionsfragmentet på 162 bp) og 200 ng af Xbal-PstI LeIF A cDNA-genet, som tidligere var isoleret fra 20 ug pLeIF trp A 25. Denne tre-faktor-ligeringsblanding blev anvendt til at transformere E. coli stamme 294 til tetracyclinresistens. Transformantkolonier blev mini-20 screenet (44), og én af kolonierne, pPGK-300, blev isoleret som havende 304 bp 51-flankerende PGK-DNA knyttet til LeIF A genet i en pBR322-baseret vektor. 5'-enden a'f LeIF A genet har følgende sekvens: 5'-CTAGAATTC-3'. Således gør indføjelsen af Xbal-stedet fra PGK-promotorfragmentet 25 i denne sekvens det muligt at tilføj'e et EcoRI-sted til Xbal-stedet. pPGK-300 indeholder således en del af PGK-promotoren isoleret i et Pvul-EcoRI-fragment.

3. Konstruktion af et 1500 bp EcoRI-EcoRI PGK-promotor-30 fragment 10 ug pBl blev nedbrudt med Pvul og EcoRI og kort på en 6 % polyacrylamidgel- 1,3 kbp Pvul-EcoRI DNA-båndet fra den 35 PGK-5'-flankerende DNA blev isoleret ved elektroeluering.

10 Mg pPGK-300 blev nedbrudt med EcoRI og Pvul, og 312 bp promotorfragmentet blev isoleret ved elektroeluering ef- 37

DK 163187 B

ter elektroforese af nedbrydningsblandingen på en 6 % polyacrylamidgel. 5 ag pFRL4 blev klippet med EcoRI, ethanolfældet og derpå behandlet med bakteriel alkalisk phosphatase ved 68 °C i 45 minutter. Efter tre ekstrak-5 tioner af DNA med phenol/chloroform, ethanol fældning og gensuspendering i 20 ml vand blev 200 ng af denne vektor ligeret med 100 ng 312 bp EcoRI-PvuI DNA fra pPGK-300 og 100 ng EcoRI-PvuI DNA fra pBl. Ligeringsblandingen blev anvendt til at transformere E. coli stamme 294 til ampi-10 cillinresistens. En af de opnåede transf ormanter var pPGK-1500. Dette plasmid indeholder 150 bp PGK-promotorfragmentet som et EcoRI-EcoRI eller Hindlll-EcoRI stykke DNA.

15 10 ag pPGK-1500 blev fuldstændig nedbrudt med Clal og

EcoRI, hvorefter nedbrydningsblandingen blev underkastet elektroforese på en 6 % polyacrylamidgel. 900 bp fragmentet indeholdende PGK-promotoren blev isoleret ved elektroeluering. 10 ag pIFN-r trp 48 blev fuldstændig 20 nedbrudt med EcoRI og Hindi og underkastet elektroforese på en 6 % polyacrylamidgel. 938 bp båndet indeholdende den direkte udtrykkelige IFN-r-cDNA blev isolerét fra gelen ved elektroeluering.

25 Gærudtrykkelsesvektoren blev konstrueret i en tre-faktor reaktionsblanding ved ligering af PGK-promotor-fragmentet (på et Clal-EcoRI stykke) sammen med det fjernede pFRM-31 og den ovenfor isolerede IFN-r-cDNA. Ligeringsblandingen blev inkuberet ved 14 °C i 12 timer og blev derpå anvendt 30 til at transformere E. coli stamme 294 til ampicillinre-sistens. Transformanter blev analyseret for tilstedeværelsen af det rigtigt konstruerede udtrykkelsesplasmid, pPGK-IFN-» (fig. 16). Plasmider indeholdende udtrykkel-sessystemet blev anvendt til at transformere sfæreoplas-35 ter af gær stamme RH218 til tryptophan-prototrofi i agar uden tryptophan. Disse rekombinante gærceller blev derpå prøvet for tilstedeværelsen af rekombinant humant immun- 38

DK 163187 B

interferon.

Gærekstrakter blev fremstillet som følger: 10 ml kulturer blev dyrket i YNB+CAA, indtil de nåede A^q ca. 1-2, de 5 blev opsamlet ved centrifugering og derpå gensuspenderet i 500 ul PBS-puffer (20 mM NaH2P04 pH = 7,4, 150 mM

NaCl). Der tilsattes et lige så stort volumen glasperler (0,45 - 0,5 mm) og blandingen blev derpå slynget i 2 minutter. Ekstrakterne blev centrifugeret i 30 sekunder ved 10 14000 omdr./min, og supernatanten skilt fra: Interferon aktiviteten i supernatanten blev bestemt til at være 16000 enh./ml ved sammenligning med IFN-α standard ved anvendelse af CPE inhiberingsprøvningen.

15 M. Konstruktion af cellekulturvektor pSVr69 342 bp Hindlll-PvuII fragmentet omfattende SV40-originet blev omdannet til et EcoRI-restriktionssted-afgrænset fragment. Hindlll-stedet blev omdannet ved tilsætning af 20 en syntetisk oligomer (5'dAGCTGSSTTC), og PvuII-stedet blev omdannet ved stump-ende-ligering til et EcoRI-sted udfyldt ved anvendelse af polymerase I (Klenov;-fragment).

Det resulterende EcoRI-fragment blev indsat i EcoRI-ste- det af pML-1 (28). Et plasmid med den sene SV40-promotor 25 orienteret bort fra amp -genet blev yderligere modifice-

R

ret ved fjernelse af EcoRI-stedet nærmest amp -genet i pML-1 (27).

1023 bp Hpal-BgIII-fragmentet af klonet HBV-DNA (60) blev 30 isoleret, og Hpal-stedet af hepatitis B virus (HBV) blev omdannet til et EcoRI-sted med en syntetisk oligomer (5'dGCGAATTCGC). Dette EcoRI-BgIII-afgrænsede fragment blev direkte klonet ind i EcoRI-BamHI-stederne af det ovenfor beskrevne plasmid bærende originet af SV40.

I det resterende EcoRI-sted indsatte IFN-t-genet på et 1250 bp Pstl-fragment af p69 efter omdannelse ?stl-ender- 35 39

DK 163187 B

ne til EcoRI-ender. Der blev isoleret kloner, hvori den sene SV40-promotor kom foran strukturgenet for IFN-r. De resulterende plasmider blev derpå indført i vævskulturceller (29) under anvendelse af en DEAE-dextrans-teknik 5 (61) modificeret således, at transfektionen i nærvær af DEAE-dextran blev udført i 8 timer. Cellemedier blev skiftet for 2-3 dage. 200 ul blev fjernet dagligt til in-terferon-bioprøvning. Typiske udbytter var 50-100 enh./ml på prøver prøvet 3 eller 4 dage efter transfektionen.

10

Analyse viste, at udtrykkelsesproduktet manglede den N-terminale Cys-Tyr-Cys del af rekombinant humant immuninterferon (sammenlign fig. 5), hvilket bekræfter forekomsten af signalpeptid-spaltning ved Cys-Gln-forbindelsen 15 (aminosyrerne 3 og 4 i fig. 5), således at det modne pep tid faktisk består af 143 aminosyrer.

N. Delvis rensning af des-Cys-Tyr-Cys rekombinant humant immuninterferon 20

For at producere større mængder af det abecelle-afledte humane IFN-r, blev friske monolag af COS-7 celler i' ti cm plader transficeret med ialt 30 ug pDLIF3 i 110 ml DEAE-dextran (200 ug/ml DEAE-dextran med molekylvægt 500000,

25 0,05 M "Tris" pH 7,5, i DMEM). Efter 16 timer ved 37 °C

blev pladerne vasket 2 gange med DMEM. 15 ml frisk DMEM suppleret med 10 % f.b.s., 2 mM glutamin, 50 ug/ml penicillin G og 50 mg/ml streptomycin sattes derpå til hver plade. Medierne blev den følgende dag erstattet med se-30 rumfrit DMEM. Friske serumfri medier tilsattes derpå hver dag. De opsamlede medier holdtes ved 4 °C, indtil de enten var prøvet eller bundet til CPG. De sammenhældte fraktioner fra prøver taget 3 og 4 dage efter transfek-tion fandtes at indeholde i hovedsagen al aktiviteten.

35 O, 5 g CPG (controlled pore glass, dvs. glas med kontrolleret porestørrelse, Electronucleonics "CPG 350", parti-

DK 163187B

40 kelstørrelse mellem maskevidde 74 og 125 um) sattes til 100 ml cellesupernatant, og blandingen blev omrørt i 3 timer ved 4 eC. Efter en kort centrifugering i en bordcentrifuge blev de bundfældede perler pakket i en søjle 5 og grundigt vasket med en puffer, som var 20 mM NaPO^, 1 M NaCl, 0,1 % /5-mercaptoethanol pH 7,2. Aktiviteten blev derpå elueret med den samme puffer indeholdende 30 % ethylenglycol efterfulgt af yderligere eluering med den ovennævnte puffer indeholdende 50 % ethylenglycol. X ho-10 vedsagen al aktiviteten blev bundet til CPG'et. 75 % af den eluerede aktivitet fandtes i fraktionerne elueret med 30 % ethylenglycol- Disse fraktioner blev hældt sammen og fortyndet med 20 mM NaPO^, 1 M NaCl pH 7,2 til en slut- koncentration på 10 % ethylenglycol og direkte påsat en 15 10 ml "Con A Sepharose" (Pharmacia) søjle. Efter en grundig vaskning med 20 mM NaP04, 1 M NaCl pH 7,2 blev aktiviteten elueret med 20 mM NaPO^, 1 M NaCl, 0,2 M «- methyl-D-mannosid. En væsentlig mængde af aktiviteten (55 %) forbandt sig ikke med denne lectin. 45 % af aktivite-20 "ten blev elueret med a-methyl-D-mannosid.

Farmaceutiske præparater

De ifølge opfindelsen fremstillede forbindelser kan sam-25 mensættes ifølge kendte metoder til fremstilling af farmaceutisk nyttige præparater, hvorved det omhandlede humane immuninterferonprodukt kombineres i blanding med et farmaceutisk acceptabelt bæremedium. Egnede medier og deres sammensætning er beskrevet i Remington's 30 Pharmaceutical Sciences af E. W. Martin. Sådanne præparater vil indeholde en effektiv mængde af det omhandlede interferoriprotein sammen med en egnet mængde medium til at fremstille farmaceutisk acceptable præparater, som er egnet til effektiv indgivning til en patient.

35 41

DK 163187 B

A. Parenteral indgivning

Det omhandlede humane immuninterferon kan indgives paren-teralt til individer, som har behov for antitumor eller 5 antiviral behandling, og til individer, som udviser immu-noundertrykte tilstande. Dosering og doseringshyppighed kan svare til den, som for tiden er i brug ved kliniske undersøgelser af andre humane interferoner, f.eks. om- g kring (1-10) x 10 enheder dagligt og i tilfælde af mate-10 rialer med en renhed på over 1 % sandsynligvis op til f.eks. 50 x 10^ enheder dagligt. Doseringer af IFN-r kunne forøges væsentligt med henblik på større virkning på grund af det væsentlige fravær af andre humane proteiner end IFN-r, hvilke proteiner i humant afledte materialer 15 kunne inducere visse ubehagelige virkninger.

Som et eksempel på en passende doseringsform for i det væsentlige homogent IFN-r i parenteral form kan 3 mg IFN- g r med en specifik aktivitet på f.eks. 2 x 10 enh./mg op-20 løses i 25 ml 5 N serumalbumin (humant) - U.S. Pharmacopiea, opløsningen sendes igennem et baktereolo-gisk filter, og den filtrerede opløsning aseptisk under-opdeles i 100 ampuller, som hver indeholder 6 x 10^ enheder rent interferon, der er egnet til parenteral indgiv-25 ning. Ampullerne opbevares fortrinsvis i kulden (-20 °C) før brugen.

Bioprøvningsdata 30 A. Karakterisering af antiviral aktivitet

Til antistofneutraliseringer blev prøver, om nødvendigt, fortyndet til en koncentration på 500-1000 enh./ml med PBS-BSA. Lige store volumener prøve blev inkuberet i 2-12 35 timer ved 4 °C med rækkefortyndiriger af kaniner.tisera for humant leukocyt-, fibroblast- eller immuninterferon. An-ti-IFN-α- og -Æ-serumet blev fremskaffet fra the National 42

DK 163187 B

Institute of Allergy and Infectious Diseases. Anti-IFN-r-serumet blev fremstillet under anvendelse af autentisk IFN-r (5-20 % renhed) renset fra stimulerede perifere blodlymfocyter. Prøver blev centrifugeret i 3 minutter 5 ved 12000 x G før prøvningen. Til prøvning af stabilitet ved pH 2 blev prøverne indstillet til pH 2 ved tilsætning af IN HC1, inkuberet i 2-12 timer ved 4 eC og neutraliseret ved tilsætning af IN NaOH før prøvningen. Til prøvning af natriumdodecylsulfat (SDS)-følsomhed blev prøver-10 ne inkuberet med et lige så stort volumen 0,2 % SDS i 2-12 timer ved 4 °C før prøvningen.

B. Karakterisering af IFN-r produceret af E. coli og COS-7 celler 15

Antiviral aktivitet (enh./ml) E. coli W3110/ COS-7 cel-pIFN-r trp48 ler PSVr69 20 Behandling IFN-0 IFN-a IFN-r ekstrakt_ supernatant

Ubehandlet 375 125 250 250 62,5 pH 2 375 125 <6 12 <4 0,1 % SDS 375 - <4 <8 25 Kanin-anti-IFN-a <8 125 250 250 187

Kanin- an ti -1 FN- /5 375 <8 187 250 125

Kanin-anti-IFN-r 375 125 <4 <8 <4

Denne tabel viser den karakteristiske opførsel af IFN-a, 30 -0 og -r standarder efter forskellige behandlinger. In terferonaktiviteten produceret af E. coli W3110/pIFN-T trp 48 og af C0S-7/pSV 69 er syrefølsom, SDS-følsom og neutraliseres af immuninterferon-antiserum. Den neutraliseres ikke af antistoffer over for IFN-a eller -0. Disse 35 data bekræfter, at de i disse systemer producerede produkter er immuninterferoner, og at cDNA-indsstningen i plasmid p69 koder for IFN-r.

DK 163187B

43

Rensning

En metode, hvorved IFN-r kan renses fra f.eks. bakterier, er beskrevet i den følgende almene oversigt: 5 1. Ekstraktion af cellerne i lysepuffer med høj ledningsevne (ved omkring pH 8) ved passage igennem en homogenisator ved højt tryk, afkøling af gennemløbet i et isbad.

10 2. Udfældning af DNA ved tilsætning af polyethyienirair; under omrøring, f.eks. ved 4 °C.

3. pH-fældning af bakterielle proteiner under bevarelse 15 af IFN-r i opløsning.

4. Fraskillelse af de faste stoffer ved centrifugering ved 4 °C.

20 5. Koncentrering af supernatanten (efter genindstilling af pH-værdien) f.eks. ved ultrafiltrering.

6. Dialyse af koncentratet over for en puffer med lav ledningsevne.

25 7. Fjernelse af fast stof ved centrifugering under bevarelse af IFN-r i opløsning.

8. Ionbytterchromatografi på carboxymethylcellulose un- 30 der eluering med en gradient af stigende ionstyrke.

9. Chromatografi på calciumphosphatgel ved eluering med en gradient af stigende ionstyrke.

35 10. Ionbytterchromatografi på carboxymethylcellulose un der svagt denaturerende betingelser ved eluering med en gradient af stigende ionstyrke.

44

DK 163187 B

11. Separation ved gelfiltreringschromatografi-

Den ovenstående fremgangsmåde muliggør udbytter af materialet med over 95 % renhed.

5

Det her omhandlede immuninterferonprotein er blevet defineret ved hjælp af det bestemte DNA-gen og den udledte aminosyresekvens, jvf. fig- 5. Det vil forstås, at der for det her omhandlede bestemte interferon eksisterer na-10 turlige allele variationer fra individ til individ. Disse variationer kan påvises ved en eller flere aminosyrefor-skelle i den samlede sekvens eller ved deletioner, udskiftninger, indsætninger, ombytninger eller tilføjelser af en eller flere aminosyrer i sekvensen. Alle sådanne 15 allele variationer skal anses for at ligge inden for opfindelsens omfang.

Faktisk er der ved anvendelse af rekombinant DNA-teknolo-gi ifølge opfindelsen mulighed for fremstilling af for-20 skellige humane IFN-r-derivater, modificeret på forskellig vis ved resulterende udskiftninger, deletioner, tilføjelser eller erstatninger af en enkelt eller flere aminosyrer. Alle sådanne modifikationer, der resulterer i sådanne derivater af humant IFN-r er inkluderer inden for 25 opfindelsens omfang, så længde den grundlæggende karakteristiske humane IFN-r-aktivitet forbliver upåvirket mht. art.

Med DNA- og aminosyre-sekvenserne af IFN-r for hånden (se 30 fig. 5) vil den mest foretrukne vej til reproduktion af den foreliggende opfindelse uden tvivl involvere fremstillingen af enten det fuldstændige gen ved syntese (se f.eks. 26) eller syntetiske deoxyoligonucleotider, hvormed cDNA-kilden kan sonderes for at isolere genet ved 35 standard hybridiseringsteknik. Når først man har opnået den nucleotidsekvens, der koder for det ønskede IFN-r-protein, kan foranstaltningerne til opnåelse af udtryk- 45

DK 163187 B

kelse, isolering og rensning til fremstilling af meget rene præparater af iFN-r følges i henhold til den forudgående beskrivelse.

5 10 15 20 25 30 35 46

DK 163187 B

Bibliografi 1. Goeddel ejt aj_., Na tu re 23 7, 411 (1930).

5 2. Goeddel e_t a_K, Nature 290 , 20 (1931 ).

3. Yel verton et a]_., Nucleic Acids Research 9 , 731 (1981).

4. Gutterman et aj_. , Annals of Int. fled. 93 , 399 (1980) - 5. Goeddel et al., Nucleic Acids Reseach 8, 4057 (1980).

10 6. Yip et aK, Proc. Na ti. Ac<ad. Sci. (USA) 78, 1601 (1981 ).

7. Taniguchi et al., Proc. Hati. Acad. Sci. (USA) 78, 3469 (1981). ' 8. Bloom, Nature 289, 593 (1980).

15 9. Sonnenfeld et aj_., Cell ular Immunol. 40, 285 (1978).

10. Fleishmann et al., Infection and Immunity 26, 248 (1979).

11. Bl aloe k ej: aK , Cellular Immunology 49, 390 (1980).

„„ 12. Rudin et al-, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77 , 5928 20 (1980).

13. Crane et al., J. Natl 1 Cancer Inst. 61, 871 (1978).

14. Stinchcomb et al., Nature 282, 39 (1979).

15. Kingsman et al., Gene 7, 141 (1979).

25 ---- 16. Tschumper et a_K, Gene 10, 157 (1980).

17. Mortimer et^ aK, Microbiological Reviews 44, 519 (198 ).

18. Miozzari et al_., Journal of Bacteriology 134, 48 (197.8).

30 19. Jones, Genetics 85, 23 (1977).

20. Hitzeman, et_ £l_., J~. Biol . Chem. 255, 12073 (1980).

21. Hess et ajU, J. Adv. Enzyme Regul . 7_, 149 (1968).

22. Holland e_t al_., Biochemistry 17 , 4900 (1978).

35 23. Bostian et al . , Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77 , 4504 (1980).

DK 163187B

47 24. The Molecular Biology of Yeast (Aug 11-18, 1981), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.

25. Chambon, Ann. Rev. Biochemistry, 44 , 613 (1975 ).

5 25a. Gluzman, Cell 23, 175 (1981 ).

26. Goeddel iet aK, Nature 281 , 544 (1979 ).

27. Itakura e_t aj_., Science 198 , 1056 (1977).

23. Lus ky et. £]_. , Hatu re 293 , 79 (1981 ).

10 29. Gluzman et al., Cold «Spring Harbor Symp. Quant. Biol.

44_, 293 ΤΓ98υ).

30. Fiers e_t aj_. , Na tu re 273 , 1 13 ( 1978 ).

31. Reddy et al., Science 200, 494 (1973).

15 32. Boedtker et al., Prog, in Nucleic Acids Res. Mol. Biol.

Γ9, 253 (ΠΓ7δΤ. --- 33. Berge r e_t aj_. , Biochemistry 18 , 5143 (1979 ).

34. Aviv et aj_. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 59 , 1403 (1972).

20 35. Gurdon ejt , J . Hoi ec . 8i ol . 80, 539 (1975 ).

36. Stewart, The Interferon System. Soringer, New York, p. 13-26 (1979~T

37. Lehrach et_ aj_., Biochemistry 16 , 4743 (1977 ).

25 38. Lynch et al., Virology 98, 251 (1979).

39. Wickens et_ aj_-, J. Biol . Chem. 253 , 2483 (1978).

40. Chang et aj_., Nature 275, 617 (1978).

41. Bol i var et aj_., Gene 2, 95 (1977 ).

'in 42. Grunstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72, 3961 (1975). ; 43. Fritsch et al., Cel 1 19 , 959 (1980).

44. Bi rn boim e_t aj_., Nucleic Acids Res. 1513 (1979).

35 45. Kafatos e_t £l_-, Nucleic Acids Res. 7_, 1541 (1979 ).

DK 163187 B

48 46. Clewell £t a_K, Biochemi s try £, 4428 (1970) - 47. Taylor e^t al_., Biochim. Biophys. Acta 442 , 324 (1976 }.

48. Smith, Methods Enzymol. 65, 550 (1980).

5 49. Messing £t aK, Nucleic Acids Res. 9, 309 (1981 ).

50. Winzler, Hormonal Proteins and Peptides (ed. Li) Academic Press, New York, p- i (1973 ).

51. Nathan et aj_., Nature 292, 842 (1981 ).

10 52. Maxam el: aj_., Methods in Enzymol. 65, 490 (1980).

53. Crea ejt al_., Proc. Hati. Acad. Sci. (USA) 7,5, 5765 (1978).

54. Southern, <3. Mol ec. Bio). 98 , 503 (1975).

55. Blin £t a_K, Nucleic Acids Res. 3, 2303 (1976).

56. Lawn al_., Science 212, 1159 (1981 ).

57. Lawn et al., Nucleic Acids Res. 9, 1045 (1981).

58. Miller, Experiments in Mol ecul ar Genetics, p. 431-3, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York (1972).

20 59. Beggs, Nature 275, 104 (1978).

60. Valenzuela e_t £l_., Animal Virus Genetics (ed. Fields, Jaenisch and Fox) p. 57, Academic Press, New York (1930).

61. HcCuthan e_t al_. , J. Natl. Cancer Inst. 41, 351 (1968) 25 ~ ' — 30 35

Claims (16)

1. DNA-fragment omfattende en DNA-sekvens, som koder for 5 humant immuninterferon med den i fig. 5 afbildede amino- syresekvens eller et derivat deraf med funktion som humant immuninterferon.

2. Rekombinant kloningsvektor omfattende et DNA-fragment 10 ifølge krav 1.

3. Replicerbar udtrykkelsesvektor omfattende et DNA-frag-ment ifølge krav 1, og som er i stand til i en transforman tmikroorganisme eller -cellekultur at udtrykke en DNA- 15 sekvens ifølge krav 1.

4. Rekombinant mikroorganisme eller cellekultur, som indeholder en vektor ifølge krav 3.

5. Mikroorganisme ifølge krav 4, som er en E. coli stam me.

6. Mikroorganisme ifølge krav 4, som er en gærstamme.

7. Cellekultur ifølge krav 4, som er en pattedyrcelle linie.

8. Cellekultur ifølge krav 7, hvor cellelinien er en COS-7 abecellelinie. 30

9. Cellekultur ifølge krav 8, hvori det nævnte DNA-fragment inkluderer præsekvensen for humant immuninterferon.

10. Fremgangsmåde til fremstilling af humant immuninter-35 feron, som omfatter: DK 163187B (a) dyrkning af rekombinante værtsceller, som er blevet transformeret med en udtrykkelsesvektor ifølge krav 3 under betingelser, der tillader udtrykkelse af DNA-sekvensen til dannelse af det humane immuninterferon; 5 (b) udvinding af det humane, immuninterferon.

11. Fremgangsmåde ifølge krav 10, som inkluderer de ind- 10 ledende trin; (i) fremstilling af en replicerbar udtrykkelsesvektor ifølge krav 3; og 15 (ii) transformering af en værtscellekultur til opnåelse af de rekombinante værtsceller.

12. Fremgangsmåde ifølge krav 10 eller 11, hvor værten er en E. coli stamme. 20

13. Fremgangsmåde ifølge krav 10 eller 11, hvor værten er en gærstamme-

14. Fremgangsmåde ifølge krav 10 eller 11, hvor værtscel- 25 len er en pattedyrcellelinie.

15. Fremgangsmåde ifølge krav 14, hvor cellelinien er en C0S-7 abecellelinie.

16. Fremgangsmåde ifølge krav 15, hvor det nævnte DNA- fragment inkluderer præsekvensen for modent humant immuninterferon. 35