JPH03246232A - ヒト免疫インターフェロン - Google Patents

ヒト免疫インターフェロン

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JPH03246232A
JPH03246232A JP2278835A JP27883590A JPH03246232A JP H03246232 A JPH03246232 A JP H03246232A JP 2278835 A JP2278835 A JP 2278835A JP 27883590 A JP27883590 A JP 27883590A JP H03246232 A JPH03246232 A JP H03246232A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、組換えＤＮＡ技術の領域に係る。即ち本発明
は、組換えＤＮＡ技術を利用してヒト免疫インターフェ
ロンのＤＮＡ配列とそれから演纒推定されるアミノ酸配
列を解析するための手段と方法に係り、更にヒト免疫イ
ンターフェロンの製法及びこの製法により産生される種
々の産生物及びそれらの用途に係る。
より詳細には本発明は、ヒト免疫インターフェロンをコ
ードするＤＮＡ配列の単離及び同定、これらＤＮＡ配列
を発現プロモーター配列に有効に発現し得るように（正
しく読み取られるように）結合させて得られる組換えＤ
ＮＡ発現ベヒクルの構成並びにこうして構成される発現
ベヒクルに係る。本発明は更に、前記の如き発現ベヒク
ルで形質転換され従って前記ＤＮＡ配列を発現し得る培
養系、例えば種々の微生物及びを椎動物細胞培養（セル
カルチャー）に係る。更に本発明は、前記の如く発現し
た目的産生物をヒトの病気の予防処置又は治療処置に有
用な新規な完全体例えば薬剤に転換する手段及び方法に
係る。好ましい具体例によれば本発明は、ヒト免疫イン
ターフェロンが成熟した形態で宿主細胞から分泌される
ように正当に結合された特定の発現ベヒクルを提供する
。
更に本発明は、前記ＤＮＡ配列、発現ベヒクル、宿主培
養系、目的産生物及び該産生物を含む完全体の製造に有
用な種々の方法並びに対応するそれらの特定具体例に係
る。
本発明は、部分的には、ヒト免疫インターフェロンをコ
ードするＤＮＡ配列及びそれから推定される構成アミノ
酸配列を知見したことを端緒とする。更に本発明は、ヒ
ト免疫インターフェロン遺伝子の３′〜及び５′−フラ
ンキング（＋１ｉｎｋｉＢ）配列に関する配列情報を提
供する。その結果、インビトロ（ｉｎｖ白ｒＯ）で該配
列を発現ベヒクルへ結合することが容易になる。特に本
発明は、所謂成熟ヒト免疫インターフェロンのアミノ酸
配列の直前に位置する所謂内因性（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕ
ｇｌシグナルポリペブチドをコードする　５’−ＤＮＡ
セグメントを提供する。これらの知見に基いて、組換え
ＤＮＡ技術を用いることにより十分な量のヒト免疫イン
ターフェロンの産生手段及び方法の開発が次第に可能と
なり、従ってこの物質の生化学的特性及び生物活性の測
定も可能になった。
本発明のバックグラウンドを明らかにし且つ特定の場合
には本発明の実施に関する詳細を補う目的で、本文中に
多くの刊行物及び学術論文を参考として引用した。便宜
上、これらの参考文献に参照番号を付し、目録として本
明細書末尾に添付した。本文中では参考文献を参照番号
で示す。
ヒトインターフェロンは抗原性、生物学的特性、生化学
的特性の違いに基いて３つのグループに分類し得る。
第１グループはヒト白血球インターフェロン（α−イン
ターフェロン、Ｌｅ　ＩＦ又はＩＦＮ−α）類である。
このグループのインターフェロンは、通常、ヒト血液の
成分細胞のウィルス誘発によって主として産生ずる。Ｉ
ＦＮ−αは、既に、微生物で産生され、生物学的に活性
であることが知見され（後記参考文献１．２及び３参照
。以下、同様に、括弧でくくった参照番号によって後掲
の参考文献を引用して示す）、ウィルス感染症及び悪性
腫瘍状態の治療薬としての臨床使用が促進されている（
４） 第２グループはヒト線維芽細胞インターフェロン（β−
インターフェロン、ＰＩＦ又はＩＦＮ−β）である。こ
のグループのインターフェロンは、通常、繊維芽細胞の
ウィルス誘発によって産生ずる。ＩＦＮ−βも同じく微
生物で産生され、広い範囲の生物学的活性を示すことが
知見された（５）臨床試験もＩＦＮ−βの潜在的治療価
値を示唆している。
ＩＦＮ−αとＩＦＮ−βは、アミノ酸レベルでの相同（
’ｈｏｍｏｌｏｇ７）の程度が比較的低いにもかかわら
ず、生物学的特性が極めて類似している。更に、これら
のインターフェロンはいずれも、１６５乃至１６６個の
アミノ酸を含み且つ酸に対して安定なタンパクである。
本発明の目的たるヒト免疫インターフェロン（ＩＦＮ−
γ、ヒトガンマインターフェロンともいう）は、ＩＦＮ
−α及びＩＦＮ−βと対照的にｐＦｌ　２で不安定であ
り、主としてリンパ球のマイトゲン誘発によって産生じ
、しかも明らかに異なった抗原性を示す。すなわちヒト
ＩＦＮ−γはヒトＴＦＮ−γ抗血清により中和されるが
、ヒトＩＦＮ−αに対する抗体またはヒトＩＦＮ−βに
対する抗体のいずれによっても中和されない。
最近まで、ヒトＩＦＮ−γは極めて低いレベルでしか検
出されなかったため、特性決定が困難であった。最近に
なって、ヒトＩＦＮ−γのかなり進んだ精製が報告され
た（６）が、この精製もまだ部分的なものである。この
報告によれば、フィトヘムアグルチニン（ｐｈ７ｔｏｈ
ｘｅｍａｇｇｌｕｔｉｎ）　　とホルボールエステル（
ｐｈｏｒｂｏｌ　ｅｓｔｅｒ）　との組合せを用いてリ
ンパ球培地（カルチャー）を刺激して化合物（Ｉ　ＦＮ
−γ）を産生じ、一連のクロマトグラフ分離によってこ
の化合物を精製した。この方法で分子量５８．０００の
産生物が得られた。
ｍＲＮ　Ａを卵母細胞中で翻訳するとヒトＩＦＮ−γに
特有のインターフェロン活性を示す極めて少量のヒトＩ
ＦＮ−γが産生じた。これにより、ＩＦＮ−γ　ｃＤＮ
Ａの合成及びクローニングが可能であると予想された（
７） これまでは、十分な量のＩＦＮ−γが得られなかったた
め、精製した成分の特性決定及び生物学的特性を明らか
にするための実験を行なうことができなかった。しかし
乍ら、粗製剤を用いたインビトロ（ｉｎ月＋ｒｏ）テス
ト及びネズミＩＦＮ−γ製剤を用いたインビボ（ｉｎマ
１ｖｏ）テストにより、ＩＦＮ−γの主たる作用は免疫
調節剤たる作用であろうと推定されていた（８．９）　
　　ＩＦＮ−γは、全てのヒトインターフェロンに共通
の抗ウィルス活性及び抗細胞活性を有しており、加えて
、ＩＦＮ−α及びＩＦＮ−βの活性に相乗効果を与える
（ｌＯ）。更に、腫瘍細胞に対するＩＦＮ−γのｉｎ！
１ｆｒｏ抗増殖効果は、他のグループのインターフェロ
ンの約１０乃至１００倍であると報告された（８゜１ｔ
、ｉ２＋。この結果と顕著な免疫調節作用（１１，９１
とを合せて考慮すると、ＩＦＮ−γはＩＦＮ−α及びＩ
ＦＮ−βよりも遥かに顕著な抗腫瘍作用を有すると推定
される。事実、マウス及びネズミＩＦＮ−γ製剤を用い
たｉｎマｌマＯテストでは、骨肉腫に対する抗腫瘍作用
が、抗ウイルス的に誘発されたインターフェロンよりも
明らかにすぐれていることが証明された（１３）。
ＩＦＮ−γが極めて入手し難いため本発明以前の前記の
如きテストではいずれも、かなり粗な製剤を使用せざる
を得なかった。にもかかわらず、これらのテストからＩ
ＦＮ−γの極めて重要な生物学的作用を確信することが
できた。ＩＦＮ−γは、抗ウィルス活性を保有するのみ
でなく、多分強力な免疫調節及び抗腫瘍活性を有してお
り、極めて有望な治療薬になり得る筈である。
以上をまとめるならば、本発明以前にＩ　ＦＮ−γの存
在は知られその生物学的作用面における有効性が期待さ
れていたにもかかわらず、ＩＦＮγは純粋なかたちで単
離されていなかった。
組換えＤＮＡ技術を応用した方法によって、必要な量の
ヒトＩＦＮ−γを極めて有効に産生じ得ることが判明し
た。産生される物質は、天然のヒト由来物質の特徴であ
ると思われるグリコシレージョン（ｇ１７ｃｏｓ７１ａ
ｔｉｏｎ）を含むか否かに関わり無く、ウィルス、新生
（腫瘍）及び免疫抑制の見られる種々の症状又は病気の
治療のために臨床使用することが可能な生物活性を示す
であろう。
組換えＤＮＡ技術は、かなり複雑な応用の段階に到達し
た。分子生物学者は、種々のＤＮＡ配列をかなり容易に
組換えて、形質転換微生物中で大量の外因性（ｅｚｏｇ
ｅｎｏｏｓ）タンパク産物を産生じ得る新しいＤＮＡ完
全体を作成し得る。種々の平滑末端又は“付着”末端を
有するＤＮＡ断片を１ｎマ１ｔｒｏで結合し、特定微生
物の形質転換に使用し得る有効な発現ベヒクルを製造し
、これらのベヒクルに所望の外因性産物を有効に合成さ
せるための一般的な手段及び方法はすでに開発されてい
る。
しかし乍ら、個々の産物に関しては、技術がまだ開発途
上であり、常に成功を予測し得るほどには技術は進歩し
ていない。実際、実験による裏付けをもたずに結果の成
功を予言した学者もいるが、彼等の方法は、実行不能で
ある危険を含む。
プラスミド、すなわちしばしば細胞１個当りマルチコピ
ーとして細菌又は他の微生物中に見出される二本鎖ＤＮ
Ａの非染色体ループは依然として組換えＤＮＡ技術の基
本的要素である。プラスミドＤＮＡがコードする情報に
は、娘細胞内でプラスミドを再生するのに必要な情報、
すなわち複製の開始点（オリジン）が含まれ、さらに通
常は、所望のプラスミドを含有する宿主細胞のクローン
を識別し且つ選択培地で優先的に増殖させつるような１
つもしくはそれ以上の選択特性、たとえば抗生物質に対
する耐性が含まれる。プラスミドの有用性は、それぞれ
プラスミドＤＮＡ上の異なる部位を識別する成る種の制
限エンドヌクレアーゼすなわち「制限酵素」により特異
的に開裂させうる点にある。その後、開裂部位またはこ
の開裂部位に隣接して再構成した末端における末端−末
端結合により、異種遺伝子もしくは遺伝子断片をプラス
ミド中に挿入することができる。このようにして、いわ
ゆる複製可能な発現ベヒクルが形成される。ＤＮＡの組
換えは細胞の外部で行なわれ、得られた「組換え体」で
ある複製可能な発現ベヒクル、すなわちプラスミドを形
質転換として知られる過程により細胞中に導入し、この
形質転換体を増殖させることにより組換えベヒクルを多
量に得ることができる。さらに、コードされているＤＮ
Ａメツセージの転写及び翻訳を支配するプラスミドの部
分に対して遺伝子が適正に挿入されれば、得られる発現
ベヒクルを使用して挿入遺伝子がコードするポリペプチ
ド配列を実際に産生させることができる。この過程を発
現と名付ける。
発現は、プロモーターとして知られる領域で開始される
。ＲＮＡポリメラーゼがこのプロモーターを識別し結合
する。発現の転写期において、ＤＮＡはほどけて（ｕｎ
ｗｉｎｄｉｎｇ）　、Ｄ　Ｎ　Ａ配列からメツセンジャ
ーＲＮＡを合成する鋳型として露出させる。次いで、メ
ツセンジャーＲＮＡは、メツセンジャーＲＮＡがコード
していたアミノ酸配列を有するポリペプチドに翻訳され
る。各アミノ酸はヌクレオチドトリプレットすなわち「
コドン」によりコードされ、このコドンが集合して「構
造遺伝子」すなわち発現されるポリペプチド産生物のア
ミノ酸配列をコードする部分を構成する。翻訳は「開始
」信号（通常ＡＴＧであって、これは得られるメツセン
ジャーＲＮＡにおいてはＡＵＧになる）において開始す
る。いわゆる停止コドンは翻訳の終了を規定し、従って
それ以後アミノ酸ユニットは産生されない。産生じた産
生物は、必要に応じ微生物系で宿主細胞を溶菌しかつ他
の細菌蛋白質を適当に精製除去して産生物を回収するこ
とにより得られる。
実際、組換えＤＮＡ技術の使用により、いわゆる直接的
発現法により全く異種のポリペプチドの発現が可能にな
り、或いは同種ポリペプチドのアミノ酸配列の一部と融
合した異種ポリペプチドを発現させることもできる。後
者の場合、目的とする生物活性産物は、時に、融合した
同種／異種ポリペプチド中で、細胞外環境において開裂
されるまで、生物的に不活性の形で存在する。英国特許
出願公開第２００７６７６Ａ号及びＷｅｌｒｅｌ、　Ａ
ｍｅｒｉｅｚｎＳｃｉｅｎｔｉｓｔ、　６８．　６６４
（１９８０）ＩＩ照。
遺伝学及び細胞生理学を研究するための細胞培養又は組
織培養技術は十分に確立している。単離した正常細胞か
ら連続トランスファ処理により永久細胞系（ｐｅｒｍａ
ｎｅｎｔ　ｃｅｌｌ　１ｉｎｅｌを得てこれを維持する
手段及び方法もすでに知られている。研究に使用するた
めには、これらの細胞系を液体培地中の固体担体上に維
持するか、又は栄養支持体を含む懸濁液中で増殖させる
。機械的な問題さえ解決できれば量産は容易である。技
術の現状を更に十分に理解するために、ｌｄｉｃｒｏｂ
ｉｏｌｏｇ７．　第２版１Ｈａｒｐｅｒ　ｘｎｄ　Ｒｏ
ｔ、　？ｂｌｉｓｈｅｒｓ、　　Ｉｎｃ、　Ｈｘｇｅｒ
ｓ＋ｏｖｎＭａＢｌｘｎｄ　（１９７３）　　特に１１
２２頁以降、及び、５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｉｅ＋１
ｃｘｎ　　２４５．　６６頁以降（１９８１）を参考文
献として引用する。
本発明は、ヒトＩ　Ｆ　Ｎ−γが組換えＤＮＡ技術によ
って、好ましくは直接的な形態で、且つ市場で認可され
るための動物実験及び臨床試験を開始し且つ実施するに
充分な量で、上手く産生じ得るという知見に基いている
。産生物は、その全ての形態において、人間のウィルス
感染、悪性腫瘍及び免疫抑制又は免疫欠如状態に対する
予防又は治療処置での使用に適している。その形態は、
様々な可能性のあるオリゴマーの形態を含んでおり、又
、グリコシレージョン（ａｓｓｏｃｉｚｔｅｄｇ１７ｃ
ｏｓ７１ｇ＋１ｏｎ）を含むこともある。産生物は遺伝
学的に操作された微生物又は細胞培養系（セルカルチャ
ーシステム）により産生される。従って、従来よりもよ
り有効にヒトＩＦＮ−γを産生し、単離し得る可能性が
ある。その最適具体例は、単離し得る量且つ成熟形態（
ｍｒｔｕｒｅ　！ｏｒｍ）でヒト・ＩＦＮ−γが産生さ
れて宿主細胞から分泌されるように微生物又はセルカル
チャーを遺伝学的に製造する方法である。
本発明は、このように産生されるヒトＩ　ＦＮ−γ並び
にその産生手段及び方法を含む。本発明は更に、発現可
能な形態でヒトＩＦＮ−γをコードする遺伝子配列を含
む複製可能なりＮＡ発現ベヒクルに係る。更に本発明は
、前記発現ベヒクルで形質転換した微生物菌株又はセル
カルチャーに係り、又、ヒトＩＦＮ−γを産生し得る前
記の如く形質転換された菌株又はカルチャーの微生物カ
ルチャー又はセルカルチャーに係る。更に本発明は、前
記ＩＦＮ−γ遺伝子配列、ＤＮＡ発現ベヒクル、微生物
菌株及びセルカルチャーを調製するのに有用な種々の方
法並びに特定の具体例に係る。更に本発明は、前記微生
物及びセルカルチャーの醗酵カルチャー（培地）の調製
に係る。さらに本発明は、直接発現産物として成熟形態
で宿主細胞から分泌されるヒトＩＦＮ−γの製造に係る
。この方法は、成熟ヒトＩＦＮ−γの配列をコードする
遺伝子に加えて、シグナルポリペプチドをコードする　
５′−フランキングＤＮＡ配列を使用する。シグナルポ
リペプチドは、宿主生物の細胞壁へ分子を運搬する際に
補助的役割を果し、この細胞壁において成熟ヒトインタ
ーフェロン産生物の分泌過程中に開裂されると信じられ
ている。この具体例により、細胞内宿主タンパク質又は
細胞砕片の汚染物を除去するように設計された関連方法
を用いなくても、意図する成熟ＩＦＮ−γを単離且つ精
製し得るようになる。
本明細書中、「成熟ヒトＩＦＮ−γ」とは、シグナルペ
プチド又はプレシーケンスペプチドを伴わないヒトＩＦ
Ｎ−γの微生物又はセルカルチャー産生物を示し、この
シグナルペプチド又はプレシーケンスペプチドはヒトＩ
ＦＮ−γ　ｍＲＮＡの翻訳の際に常に存在するものであ
る。従って本発明は、第一アミノ酸としてのメチオニン
を有している（構造遺伝子の前にＡＴＧ開始シグナルコ
ドンを挿入することにより存在する）か、或いはメチオ
ニンが細胞内で又は細胞外で開裂されている場合は第一
アミノ酸としてのメチオニンを欠いている成熟ヒトＩＦ
Ｎ−γを提供する。成熟ヒトＩＦＮ−γは通常のシグナ
ルポリペプチド以外のものとの複合タンパク質として産
生され得、この複合体は細胞外環境で特定的に開裂され
得る（英国特許出願公開第２００７６７６Ａ号参照）。
最後に、成熟ヒトＩＦＮ−γは外因性の余分のポリペプ
チドを開裂除去する必要もなく直接発現により産生され
得る。発現ベヒクルがシグナルペプチドと成熟ヒトイン
ターフェロンとを一緒に発現し且つ所与の宿主がシグナ
ルペプチドを除去できないか或いは有効的に除去できな
い場合にはこのことは特に重要である。このように産生
された成熟ヒトＩＦＮ−γは、ウィルス病、悪性腫瘍及
び免疫抑制又は免疫欠如状態の治療に使用し得る適合レ
ベルにまで回収、精製される。
本発明の生理活性ポリペプチドは次のようにして得られ
た。
１、ヒト組織、例えばヒト牌組織又は末梢血液リンパ球
をＩＦＮ−γの産生を刺激するためマイトゲンと共に培
養した。
２、前記セルカルチャーからのセルペレットについて、
全細胞質ＲＮＡを単離するためリボヌクレアーゼ阻害剤
の存在下で抽出した。
３、オリゴｄＴ−カラムによりポリアデニル酸形態の全
メツセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を単離した。このｍ
ＲＮ　Ａをショ糖密度勾配と酸−尿素ゲル電気泳動法と
を用いてサイズ分画した。
４、適当なｍＲＮＡ（１２乃至１８Ｓ）を対応する一本
鎖相補ＤＮＡｆｃＤＮＡ）に転換し、これから二本鎖の
ｃＤＮＡを産生じた。ポリ−ｄＣテーリング（ｐｏｌｒ
　−ｄ　Ｃｔｇｉｌｉｎｇ　）の後、前記ＤＮＡを一つ
又は複数の表現型マーカーを有するプラスミドのような
ベクターの中に挿入した。
５、このように調製されたベクターを使用してコロニー
ライブラリを提供する細菌細胞を形質転換した。前記の
ように誘導された誘発及び非誘発ｍＲＮ　Ａから調製さ
れた同位体標識ｃＤＮＡを複数に移されたコロニーライ
ブラリ（ｄｕｐｌｉｃａｔｅｃｏｌｏｎｙ　１ｉｂｒａ
ｒｉｅｓ）を個別に試験するために用いた。次に余分の
　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを除去し、誘発ｃＤＮＡクローンを同
定するためコロニーをＸ線フィルムに露出させた。
６　誘発ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａクローンから対応するプラスミ
ドＤＮＡを単離し、配列決定した。
７、次に配列決定されたＤＮＡを適当な発現ベヒクルの
中に挿入するためにｉｎ　ｖｉｌｒｏ処理し、この発現
ベヒクルを適当な宿主細胞を形質転換するために用い、
この宿主細胞を今度は培地の中で増殖させ、所望のヒＭ
ＦＮ−γ産生物を発現させた。
８、このようにして産生じたヒトＩＦＮ−γは確かにシ
スティンで始まるその成熟形態で１４６個のアミノ酸を
有しており、その特性は非常に塩基性である。その単量
体分子量は１７．１４０と計算された。恐らく多くの塩
基性残基、疎水性、塩ブリッジ形成等が存在するため、
分子はオリゴマーの形で例えば二量体、三量体又は四量
体の形でそれ自身会合する。天然物質で以前に観察され
た高分子量（６）は、アミノ酸配列のみに基づいて計算
され得なかったものであり、翻訳後のグリコシレージョ
ンによる炭水化物の寄与と同様そのようなオリゴマーの
存在に基づくものかもしれない。
９、幾つかの宿主細胞システムでは、特に２０個のアミ
ノ酸のシグナルペプチドと共に発現されるように発現ベ
ヒクルに結合したとき、ヒトＩＦＮ−γの成熟形態はセ
ルカルチャー培地の中に運ばれ、回収及び精製方法にお
いて測り知れないほど助けとなる。
ここに記載する本発明の好適具体例は、とりわけ、英国
特許出願公開第２０５５３８２Ａ号に記載の微生物Ｅ、
　　ｃｏｌｉ　Ｋ−１２株２９４（ｅｎｄ　Ａ、　　！
ｈｉ　　ｈｓｒ、ｈａｍ　）を用いて実施した。この菌
株はブタペスト条約に基づいてアメリカン　タイプ　カ
ルチャコレクションに、ＡＴＣＣ寄託番号第３１４４６
号で寄託されている。しかし、他の種々の微生物菌株、
例えば、Ｅ、　　ｃｏｌｉ　Ｂ、　Ｅ、　　ｃｏｌｉ　
Ｘ１７７６　（ＡＴＣＣ第３１５３７号）　、　　Ｅ、
　　ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０　（Ｆ　　λ原始栄養株ｐ＋
ｏｆ＋ｏｐｈｉｃ）　　（Ａ　Ｔ　ＣＣ第２７３２５号
）のような公知のＥ、　　Ｃｏ１Ｉａ１株或いは他の微
生物菌株も有用であり、これらの微生物菌株の多くは寄
託されており、アメリカンタイプカルチャーコレクショ
ン（Ａ　Ｔ　ＣＣ）のような認可された微生物寄託施設
から入手しうる（可能性がある）。ＡＴＣＣカタログリ
スト参照。又、ドイツ公開公報第２６４４４３２号参照
。これらの他の微生物には、例のような他の腸内菌等が
あり、これらは異種遺伝子配列を複製し、発現し得るプ
ラスミドを用いて使用される。
例えば、ベータラクタマーゼ及びラクトースプロモータ
ーシステムが、異種ポリペプチドの微生物的産生を開始
させ且つ維持するために有利に用いられた。これらのプ
ロモーターシステムの構成と構造に関する詳細はＣｈａ
ｎｇ　ｅ＋　　１１．、　　Ｎ［ａｒｅ２７５、６１７
　（１９７８＋及び１ｌａｋｕｒｘ　ｃｔ　　ｔｌ、、
　５ｃｉｅｎｃｅ。
１９８、　１０５６　（１９７７）を参照されたい。最
近、トリプトファンに基くシステム、いわゆるｔｒｐプ
ロモーターシステムが開発された。このシステムの構成
と構造に関する詳細はＧｏｅｄｄｅｌ　ｅｌ　　！＋、
　　Ｎｕｃｌｅｉｃ＾ｃｉｄｉ　Ｒｅ５ｅｘｒｃｈ、　
　８．　４０５７（１９８Ｇ）及び１９８０年３月２４
日付で出願されたＫｌｅｉｄ　ｅｌ　　！１．　の米国
特許出願Ｕ、　Ｓ、　Ｓ、　Ｎ、第１３３．２９６号を
参照されたい。他の多くの微生物プロモーターが発見さ
れ利用されており、当業者がプラスミドベクター中に機
能的にそれらを結合し得るようにそのヌクレオチド配列
に関する詳細が発表されている。例えば５ｉｅｂｅｏｌ
ｉｉｌ　ｅｔ！ｌ、、　　Ｃｅ１ｌ、　　２Ｇ、　２６
９（１９８Ｇ）参照。
２、酵母菌株／酵母菌プロモーター ここで用いる発現システムはε　ｃｏｌｉと酵母菌の５
ｘｃｃｈＪｒｏｔＨｃｅｓ　ｅｅｒｅＢｘ：ｓｅとの両
方において選択と複製が可能なプラスミドＹ　Ｒｐ７　
（１４，１５，１６）でもよい。酵母菌での選択のため
、プラスミドはＴＲＰＩ遺伝子（１４，１５，１６）を
含有し、この遺伝子は酵母菌の第■染色体に見い出され
るこの遺伝子上の突然変異（１７）を含む酵母菌を補足
する（すなわちトリプトファンの不在下での増殖を許容
する）。ここではアメリカンタイプカルチャーコレクシ
ョンに制限なしに寄託されているＳｘｃｃｈａｒｏｍ７
ｃｅｓ　ｃｅｒｒｖｉｓｉｇｅ菌株ＲＨ２１１１（ＡＴ
ＣＣ寄託番号第４４０７６号）　　（１８）を用いた。
しかし、菌体をｔａｐ　ｌにする突然変異を含むどの５
ｚｅｃｈｘ＋ｏｍ７ｃｅ＋ｃｅｒｅｖｉｓｉｘｅ菌株も
発現システムを含むプラスミドの発現のための有効な環
境となり得るということが理解されよう。他の菌株ｐｅ
ｐ　４−１　　（１９）も用い得る。このトリプトファ
ン栄養要求菌株も又ＴＲＰＩ遺伝子上に点突然変異を有
している。
（アルコール脱水素酵素１用の）酵母菌遺伝子由来５′
　−フランキングＤＮＡ配列（プロモーター）を非酵母
菌遺伝子の５′−側に配置し、外来遺伝子をプラスミド
中に配置し、これを用いて酵母菌を形質転換すると、酵
母菌中で異種遺伝子の発現を促進（プロモート）し得る
。プロモーターの他に更に、酵母菌での非酵母菌遺伝子
の適正な発現には第二の酵母菌配列を必要とし、この第
二の配列は酵母菌での適正な転写終了とポリアデニル化
とを許容するためプラスミド上で非酵母菌遺伝子の３′
−末端に配置される。このプロモーターも他のものと同
様に本発明で好適に用いられ得る（以下参照）。好まし
い具体例では、酵母Ｗ！３−ホスホグリセリン酸キナー
ゼ遺伝子（２０）の５′−フランキング配列を構造遺伝
子の上流に配置し、この構造遺伝子に続いて更に終了−
ポリアデニル化シグナル含有ＤＮＡ、例えばＴＲＰ　１
遺伝子（１４，１５，１６）又はＰＧＫ遺伝子（２０）
を配置して使用する。
酵母Ｎ　５’　−フランキング配列は（３′　−酵母菌
終了ＤＮＡと共に使用すると、後述）酵母菌での外来遺
伝子の発現を促進し得るため、高度に発現されたいかな
る酵母菌遺伝子の５′−フランキング配列も重要な遺伝
子産物の発現に用い得る。
成る環境の下で酵母菌は糖分解酵素としての可溶性蛋白
質を６５％まで発現しく２１）、且つこの高レベルは個
々のｍＲＮ　Ａの高レベル産生の結果と思われる（２２
）から、いかなる他の糖分解遺伝子の５′一フランキン
グ配列もそのような発現目的に使用し得る筈である。例
えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−燐酸デヒ
ドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸脱炭酸酵素
、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−燐酸イソ
メラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン
酸キナーゼ、三次糖燐酸イソメラーゼ、ホスホグルコー
スイソメラーゼ及びグルコキナーゼ等。
これらの遺伝子の　３′−フランキング配列のいずれも
上述のような発現システムで適正な終了及びｍＲＮ　Ａ
ポリアデニル化に用いられ得る。他の幾つかの高度に発
現された遺伝子は酸性ホスファターゼ（２３）遺伝子で
あり、５′　−フランキング領域での突然変異（発現を
高める突然変異体）、通常ＴＹ１転移可能要素（ｌｒａ
ｎｓｐｏｓｘｂｌｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ）　（２４）の存
在により高レベルの産生を発現する遺伝子である。
前記遺伝子は全て酵母菌ＲＮＡポリメラーゼ■（２４）
により転写されると考えられる。リボゾームＲＮＡ、５
Ｓ　　ＲＮＡ及び＋ＲＮ　Ａ　（２４，２５）に対する
遺伝子を転写するＲＮＡポリメラーシー及び■に対する
プロモーターも又そのような発現構成で有用であり得る
。
最後に、多くの酵母菌プロモーターは又転写制御作用を
有しており、従って増殖条件の変化によりオフにしたり
オンにしたりし得゛る。そのような酵母菌プロモーター
は例えば次の蛋白質を産生ずる遺伝子である。即ち、ア
ルコールデヒドロゲナーゼ■、イソチトクロム−Ｃ９酸
性ホスファターゼ、窒素代謝と関連した分解酵素、グリ
セルアルデヒド−３−燐酸デヒドロゲナーゼ、麦芽糖と
ガラククトース利用に関係する酵素（２２）等である。
そのような制御領域はタンパク産生物の発現を制御する
のに、特にそれらの産生が酵母菌に対し有毒であるとき
、非常に有用であろう。又高度に発現された遺伝子由来
のプロモーター含有５′−フランキング配列を一つの５
′−フランキング配列の制御領域と組み合わせることも
可能であろう。
この結果ハイブリッドプロモーターが生じ、制御領域と
プロモーターは物理的に別個のＤＮＡ配列であると思わ
れるためこの組み合わせは可能であろう。
３、セルカルチャーシステム／セルカルチャーベクター 培養（組織培養）でのを椎動物細胞の増殖は最近では通
常の方法となった（Ｔｉ＋＋ｕｅ　ＣｕＮｕ＋ｅＡｃａ
ｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓ＋　　ｌ：＋ｃ＋ｅ　ｚｎｄ　Ｐ
ｘＮｅｒ＋ｏｎ　ｅｄｓ１９７３参照）。ここではＩＦ
Ｎ−γ産生用宿主としてＣＯ３−７系サル腎線維芽細胞
を用いた（２５１）しかし、ここに詳細に説明する実験
は、適合性のベクターを複製及び発現し得るいかなる細
胞系でも遂行され得る。例えば、ＷＩ３８．ＢＨＫ。
３Ｔ３．ＣＨＯ，ＶＥＲＯ，及びＨｅＬａ細胞系等。更
に発現ベクターに必要とされるものは、複製のオリジン
（開始点）並びに発現されるべき遺伝子の前に配置され
たプロモーターであり、これらは必要なりボゾーム結合
部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、及
び転写終了配列と共に配置される。本発明ではＳＶ４０
のこれらの本質的な要素を使用し、好ましい具体例とし
て本発明を説明するが、本発明はこれらの配列に限定さ
れるべきでないことが理解されよう。例えば、宿主ＤＮ
Ａに組み込まれていない状態で機能し得るＤＮＡ複製の
細胞性オリジンと同様、他のウィルス（例えば、Ｐｏ１
７ｏｍｘ、　　Ａｄｅｎｏ、　　ＶＳＶ、　　ＢＰＶ等
）性ベクターの複製オリジンも用い得る。
成熟インターフェロンポリペプチド（マイナスシグナル
配列）としてＥ、　　ｃｏｌｉでＩＦＮ−γを直接発現
させるために用いた方法は、それが合成Ｎ−末端と　ｃ
ＤＮＡの結合を含んでいるので、ヒト成長ホルモン（２
６）とヒトＩＦＮ−α（１）に対して以前に用いた方法
の変形である。
後述されるＩ＋６９のヌクレオチド配列から、並びに幾
つかのＩＦＮ−α（２）のシグナルペプチドと成熟ポリ
ペプチドとの間の公知の開裂部位との比較により推論さ
れるように、ＩＦＮ−γは、２０個のアミノ酸から成る
疎水性シグナルペプチド及びそれに続く成熟ＩＦＮ−γ
の　１４６個のアミノ酸を有している（第５図）。第７
図に示されているように、Ｂ＋ｔＮＩ制限エンドヌクレ
アーゼ部位は、好都合なことに、成熟ＩＦＮ−γの第四
アミノ酸に位置している。ＡＴＧ翻訳開始コドン、第一
二、三アミノ酸（システィン−チロシン−システィン）
のコドンを導入し且つＥｃｏＲＩ付着末端を創出するた
めに、２つの合成デオキシオリゴヌクレオチドが設計さ
れた。これらのデオキシオリゴヌクレオチドをｐ６９の
１１００塩基対ＢｓｔＮＩ−ＰｓｔＩ断片に結合し、Ｉ
ＦＮ−γをコードし且つＥｅｏＲＩ及びＰｓｊＩ制限部
位を末端に有する１１１５塩基対の合成−天然ハイブリ
ッド遺伝子を構成した。この遺伝子をＥＣ０ＲＩとＰ＋
ｌＩ部位間でプラスミドｐＬｅｌＦ　Ａ　ｊｒｐ　１０
３に挿入し、発現プラスミド　ｐＩＦＮ−γ　ｔｒｐ　
４８を構成した。このプラスミドではＩＦＮ−７遺伝子
はＥ、　　ｃｏｌｉ　　ｔａｐミルプロモーター御下で
発現される。（ｐＬｅＩＦ　Ａ　Ｈ９１０３はｐＬｅｌ
Ｆ　Ａ　２５の誘導体であり、ＬｅｌＦ　Ａ遺伝子から
遠位のＥｃｏＲＩ部位が除去されている。このＥｅｏＲ
Ｉ部位を除去するために用いられた方法については既に
公表されている（２７）。尚、プラスミドｐＬｅｌＦ　
Ａ　２５は、大腸菌中でヒト白血球インターフェロン　
（ヒト　ｔｅｌＦ）を高レベルで発現させるのに適して
おり、ｐＢＲ３２２から構成されたものである（１）。
） ２、酵母菌での発現 ＩＦＮ−γをコードする　ｃＤＮＡのような異種遺伝子
を酵母菌で発現するため、４つの成分を含むプラスミド
ベクターを構成することが必要であった。最初の成分は
Ｅ、　　ｃｏｌｉと酵母菌の両方の形質転換を可能にす
る部分であり、従って各画の選択し得る遺伝子を含んで
いなければならない。
（ここでは、これはＥ、　　ｃｏｌｉのアンピシリン耐
性遺伝子及び酵母菌のＴＲＰＩ遺伝子である。）この成
分は又両方の生体中でプラスミドＤＮＡとして維持され
るために両方の生体の複製オリジンを必要とする。（こ
こでは、これは９ＢＲ３２２のＥＣｏｌｉＣｏｌミオリ
ジン菌の第ｍ染色体の１！５１オリジンである。） プラスミドの第二の成分は、下流に位置する構造遺伝子
の転写をプロモートするための、高度に発現された酵母
菌遺伝子の５′−フランキング配列である。ここで用い
た５′〜フランキング配列は酵母菌３−ホスホグリセリ
ン酸キナーゼ（ＰＧＫ）遺伝子の配列である。断片はＰ
ＧＫ構造遺伝子配列のＡＴＧからこのＡＴＧから上流の
３　ｂｐｔでを切り出すようにして構成された。５′−
フランキング配列に構造遺伝子がうまく結合するように
、この５′　−フランキング配列はＸｂａＩ及びＥｃｏ
ＲＩ制限部位の両方を含む配列で置換されている。
システムの第三の成分はＡＴＧ翻訳開始シグナルと翻訳
停止シグナルの両方を含むように構成された構造遺伝子
である。そのような遺伝子の単離と構成については以下
で説明する。
第四の成分は酵母菌遺伝子の３′−フランキング配列を
含む酵母菌ＤＮＡ配列であり、これは転写終了とポリア
デニル化の適正なシグナルを含んでいる。これらの成分
が全て存在した場合に、ＩＦＮ−γが酵母菌で産生され
た。
３、哺乳動物セルカルチャーでの発現 哺乳動物細胞培養（セルカルチャー）での免疫インター
フェロンの合成方法は、異種転写ユニットの制御下で外
来遺伝子の自律的複製と発現の両方が可能なベクターの
開発に依存していた。
組織培養でのこのベクターの複製は、ベクターに（ＳＶ
４Ｇウィルス由来の）ＤＮＡ複製オリジンを提供するこ
とと、ヘルパー機能としてＴ抗原を内因的に発現する細
胞系（２８，２９１へベクターを導入することで達成さ
れた。ＳＶ４０ウィルスの後期プロモーターはインター
フェロンの構造遺伝子の上流に存在し、遺伝子の転写を
確保していた。
ＩＦＮ−γを発現させるために用いたベクターは、ＤＮ
Ａ複製のＥ、　　ｃｏｌｉオリジンとともにＥｃｏｌｉ
での選択のために選択し得るマーカー（アンピシリン耐
性）を提供するｐＢＲ３２２配列で構成されていた。こ
れらの配列は、プラスミドｐＭＬ−１（２８）から誘導
され、ＥｃｏＲＩ及びＢｘｍＨＩ制限部位に及ぶ領域を
含んでいた。ＳＶ４０オリジンはこの領域（３Ｇ、３１
）を含む３４２塩基対ＰｙｕＩｆ−Ｈｉｎｄ　ｍ断片か
ら誘導される（両方の末端はＥｃｏＲＩ末端に転換され
る）。これらの配列は、ＤＮＡ複製のウィルス性オリジ
ンを含むのに加えて、初期及び後期転写ユニットの両方
に対するプロモーターをコードしている。ＳＶ４０オリ
ジン領域の方向性は、後期転写ユニットに対するプロモ
ーターがインターフェロンをコードする遺伝子の近くに
配置されるようにした。
第１図は、誘発末梢血リンパ球（Ｐ　Ｂ　Ｌ）ポリ（Ａ
ｌ　＋　ＲＮ　Ａの蔗糖密度勾配遠心分離の結果を示し
ている。インターフェロン活性を有する２つのピークが
１２３と１６３のサイズで観察された（斜線を付したヒ
ストグラムにより示されている）。リポソームＲＮＡマ
ーカー（別個に遠心分離した）の位置は吸収プロフィー
ルの上方に示した。
第２図は、誘発ＰＢＬポリ（Ａ）＋ＲＮＡの酸−尿素−
アガロース電気泳動の結果を示している。
１８ｓ　　ＲＮＡと共に移動するたった一つの活性ピー
りが観察された。隣接するレーンで電気泳動にかけ且つ
臭化エチジウム染色により可視化したリポソームＲＮＡ
マーカーの位置は活性プロフィールの上方に示した。
第３図は、誘発及び非誘発の３２Ｐ−標識ｃＤＮＡプロ
ーブと９６個のコロニーとのハイブリダイゼーションパ
ターンを示す。９６個の個々の形質転換体をマイクロタ
イタープレートで成育させ、レプリカ（＋ｅｐｌｉｃｘ
　）を２枚のニトロセルロース膜上に移し、次にフィル
ターを誘発ｍＲＮＡ（第３図Ａ）か或いは非誘発ＰＢＬ
カルチャーから単離したｍＲＮＡ（誘発されていない、
東３図Ｂ）から調製した３２Ｐ−ｃＤＮＡプローブとハ
イブリダイズした。フィルターをハイブリダイズしてい
ないＲＮＡを除去するため洗浄し、次にＸ線フィルムに
露出させた。このフィルターのセットはそのような８６
個のセット（８３００個の独立したコロニー）の典型例
を表わしている。「誘発」クローンの例はＨＩ３として
示されている。
第４図は、クローン６９　ｃＤＮＡ挿入物の制限エンド
ヌクレアーゼマツプである。ｃＤＮＡ挿入物はＰｓｔＩ
部位（両端に点で示す）とオリゴｄＣ−ｄＧテール（１
本線で示す）を末端に有している。
制限ヌクレアーゼ開裂により生成する断片の数と大きさ
は６％アクリルアミドゲル電気泳動により評価した。部
位の位置は核酸配列（第５図に表示）により確認された
。最大のオーブン解読フレームのコード領域は箱型に囲
われており、斜線領域は推定した２０残基シグナルペプ
チド配列を表わし、他方点の領域は成熟ＩＦＮ配列（１
４６アミノ酸）を表わしている。ｍＲＮ　Ａの　５′末
端は左側にあり、３′末端は右側にある。
第５図は、プラスミドｐ５９　　ｃＤ　Ｎ　Ａ挿入物の
ヌクレオチド配列を示している。しかしながら、この配
列はＩＦＮ−γ中の最も普遍的な相同形（ｘｌｌｅｌｉ
ｃ　ｆｏｒｍ）を示している。最大のオープン解読フレ
ームの推定アミノ酸配列も示されている。
推定シグナル配列はＳｌから３２０で示す残基により表
わされている。
第６図は、ＩＦＮ−７ｍＲＮＡ構造とＩＦＮα及びｒＦ
Ｎ−βの構造との比較図である。クローン６９　ｍＲＮ
Ａ　（Ｉ　ＦＮ−γ）はかなり多量の翻訳されない配列
を含んでいる。
策７図は、ＩＦＮ−γ発現プラスミドｐＩＦＮ−γ　ｔ
ａｐ　４Ｂの構成を示す模式図である。出発物質はプラ
スミドｐ６９からの１２５０塩基対ＰｓｔＩｃＤＮＡ挿
入物である。
第８図は、サル細胞でのＩＦＮ−γの発現に用いられる
プラスミドの構造を示す図である。
第９図は、８種のＥｃｏＲＩ消化ヒトゲノムＤＮＡをｐ
６９のｃＤＮＡ挿入物からの３２Ｐ−標識６００塩基対
ＤｄｅＩ断片とハイブリダイズする５ｏｕｔｈｅｒｎハ
イブリダイゼーシヨンの結果を示す。２つのＥｃｏＲＩ
断片は明らかに各々のＤＮＡサンプル中でプローブとハ
イブリダイズする。
第１０図は、６Ｎの制限エンドヌクレアーゼで消化した
ヒトゲノムＤＮＡを９６９由来３２Ｐ−標識プローブと
ハイブリダイズする５ｏａｆｈｅｒｎハイブリダイゼー
シヨンの結果を示す。
第１１図は、ＰＧＫプロモーターが単離されたベクター
ｐＢｌの３．１　ｋｂｐ　　Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ挿入物の
制限マツプを示す。ＰＧＫ遺伝子の５′−フランキング
ＤＮＡへのＥｅｏＲＩ部位及びＸｂａＩ部位の挿入が示
されている。
第１２図は、ＸｂａＩ部位及びＥｃｏＲＩ部位の挿入前
のＰＧＫ遺伝子に対する初期コード配列を加えた５′〜
フランキング配列を示す。
第１３図は、ＰＧＫプロモーター上の位置−８にＸｂｘ
Ｉ部位を挿入するために、及びこのＸ　ｂｚ　Ｉ末端及
びＳ！Ｕ３Ａ末端を含むＰＧＫの５′−フランキング配
列の３９　ｂｐ断片を単離するために用いられた技術を
図式的に示す。
第１４図は、上記３９　ｂｐ断片、ＰｗｕＩから５ｘｕ
３Ａまでの付加ＰＧＫ５’　−フランキング配列（２６
５ｂｐ）　（第１１図参照）とＸ　ｂｘ　Ｉに隣接する
Ｅ　ｃｏＲＩ部位とを含む３００　ｂｐ断片の構成を図
式的に示す。
第１５図は、第１４図で構成された断片に加えて、ＰＧ
Ｋ５’−フランキング配列のＨｉｏｄＩ［［からＰｖａ
Ｉまでの１３００ｂｐ断片（第１１図参照）を含む１５
［１０ｂｐＰ　Ｇ　Ｋプロモーター断片（Ｈｉｎｄ　ｍ
ｌ　Ｅｃ。
ＲＩ）の構成を図式的に示す。
第１６図は、改良ＰＧＫプロモーター　ＩＦＮγ　ｃＤ
ＮＡ及び酵母菌ＰＧＫ遺伝子の終了領域とを含む酵母菌
でのヒトＩＦＮ−γに対する発現ベクターの構成を示す
。これについては以下に詳細に説明する。
Ａ、ＩＦＮ−７ｍＲＮＡの起源 末梢血リンパ球（Ｐ　Ｂ　Ｌ）を白血球泳動法により人
間の提供者から採取した。ＰＢＬを更にフィコール−ハ
イバック（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈ７ｐｘｑｕｅ）勾配遠心法
により精製し、次にＲＰ　Ｍ　Ｉ　１６４０．１％Ｌ−
グルタミン、　２５　ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒド
ロキシエチルピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸
）及び１％ペニシリン−ストレプトマイシン溶液（Ｇｉ
ｂｃｏ、　Ｇｒａｎｄ　　ｌ５ｌａｎｄ、　ＮＹ）中５
×１ｏ６個／ｍｌの細胞濃度で培養した。これらの細胞
をマイトゲンぶどう球菌エンテロトキシンＢ　（１ｎ／
　ｍｌ　）により誘発してＩＦＮ−γを産生させ、５％
ＣＯ２中３７℃で２４時間から４８時間培養した。ＴＦ
Ｎ−γ活性の相対収率を増加させるためデスアセチルチ
モシンーα−１（θ、ｌ埒／ｍｌ）をＰＢＬ培養物に加
えた。
Ｂ、メツセンジャーＲＮＡの単離 ＰＢＬ培養物からの全ＲＮＡを本質的にＢｅｒｇｅｒ。
Ｓ、　Ｌ、　　ｅ＋　　！１．　　（３３）により報告
されているようにして抽出した。細胞を遠心によってペ
レットにし、次に１０　ｍＭのＮａＣｊ！、ｌ０ｍＭの
トリス−ＨＣｐ（ｐＨ７，５）、１．５ｍＭのＭ　ｇ　
Ｃｊ！　２及び１０　ｍＭのりボヌクレオシドバナジル
複合体中に再懸濁した。
細胞をＮＰ−４０（最終濃度１％）の添加により溶解し
、核を遠心によりペレットにした。上澄みは全ＲＮＡを
含んでおり、これを多数回のフェノール及びクロロホル
ム抽出により更に精製した。水相をＮａＣｆ　　Ｏ，２
Ｍにし、次に全ＲＮＡを２倍量のエタノールの添加によ
り沈殿させた。非誘発（刺激しない）培養物からＲＮＡ
を同じ方法により単離した。オリゴ−ｄＴセルロースク
ロマトグラフィーを全ＲＮＡ標本（３４）からｍＲＮ　
Ａを精製するために用いた。培養したＰＢＬＩ〜２２か
らの典型的な収量は、全ＲＮＡが５乃至１０■であり、
ポリ（Ａ）＋ＲＮＡが５０乃至２００／４９であった。
Ｃ，ｍＲＮＡのサイズ分画 ｍＲＮＡ標本を分画するため２つの方法を用いた。これ
らの方法は（−緒によりもむしろ）別々に用いられ、そ
の結果各々でかなりの量のＩＦＮ−γ　ｍＲＮＡが得ら
れた。
ＩＩＩＲＮ　Ａを分画するために、変性剤ホルムアミド
の存在下でのショ糖勾配遠心法を用いた。７０％のホル
ムアミド中の５％乃至２５％のショ糖勾配（３２）を２
０℃で１９時間１５４．０ＯＯＸ　ｇで遠心した。次に
連続画分（０，５ｍ１）を勾配の頂部から除去し、エタ
ノール沈殿し、その一定量をｍＲＮＡの翻訳のためＸｅ
ｎｏｐｕｓ　１ａｅｖｉ＋卵母細胞の中に注入した（３
５）。
室温に２４時時間−た後、５ｔｅｖａｒ＋　（３６）に
より説明されたＷＩＳＨ（ヒト羊膜）細胞上でＶｅｓｉ
ｃｕｌａｒＳｔｏｍａｔｉｔｉｓウィルス（インデイア
ナ株）又はεｏｅｅｐｂｉｌｏｍ７ｏｅｚｒｄｉｔ口ウ
ィルスを用いる標準的細胞変性効果抑制試験でインキュ
ベーション培地の抗ウィルス活性を分析した。ただし、
ここでは、ウィルス感染に先立ち（４時間のかわりに）
２４時間サンプルを細胞とインキュベートした。２つの
活性ピークが常にショ糖密度勾配分画ＲＮＡで観察され
た（第１図）。片方のピークは１２Ｓの計算値（サイズ
）で沈降し、注入ＲＮＡｌ１１ｇにつき（ＩＦＮ−ａ基
準で）　１００−４００−Ｌ　ニット／　ｍｌの抗ウィ
ルス活性を存していた。活性の他方のピークはサイズ１
６Ｓで沈降し、遅い沈殿ピークの活性の約半分を有して
いた。ヒトＩＦＮ−γが効果を有しないウシ細胞系（Ｍ
Ｄ　Ｂ　Ｋ）で同じ画分を分析しても活性が観察されな
かったことから、これらの各々の活性ピークはＩＦＮ−
γによるものと思われる。ＩＦＮ−α活性とＩＦＮ−β
活性の両方ともＭＤＢＫ分析で容易に検出される筈であ
る（５） ｍＲＮ　Ａ　（２００ＩＩ９）の分画を、酸−尿素−ア
ガロースゲル電気泳動法でもおこなった。スラブアガロ
ースゲル（３７，３８）を、１．７５％アガロース、０
、０２５Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ３，８）及び６Ｍ
尿素で構成した。電気泳動を２５ミリアンペア、４℃で
７時間おこなった。次にゲルをかみそりの刃で細分した
。個々の薄片を７０℃で溶解し、フェノールで二度、ク
ロロホルムで一度抽出した。次に両分をエタノール沈殿
させ、その後Ｘｅｎｏｐｕ＋　１ａｅｖ目卵母細胞に注
入し抗ウイルス分析によりＩＦＮ−γ　ｍＲＮＡを分析
した。たった一つの活性ピークがゲル分画サンプルで観
察された（第２図）。
このピークは１８Ｓ　ＲＮＡと共に移動し、注入ＲＮＡ
Ｉ鱈につき　６００ユニツト／　ｍｌの活性を有してい
た。この活性は、又ＭＤＢＫ細胞を保護せず、ＩＦＮ−
γに特異的と思われる。
ショ糖密度勾配（！２Ｓおよび１６Ｓ）と酸−尿素ゲル
（１８ｓ）で観察された活性ピーク間のサイズの相異は
これらの別々の分画方法が全く同一の変性条件下では遂
行されないことにより説明され得る。
Ｄ、、ＩＦＮ−γ配列を含むコロニーライブラリの調製 ゲル分画した３ｕｉのｍＲＮＡを使用し、標準操作法（
２６，３９）で二本鎖ｃＤＮＡを調製した。６％ポリア
クリルアミドゲルでｃＤＮＡをサイズ分画した。２種の
サイズ画分８００−１５００ｂｐ　（１３８ｎｇ）　と
＞　１５００ｂｐ　（２０４ｎｇ）　　とを電気泳動溶
出した。各サイズの　ｃＤＮＡのサンプル３５ｎｇにタ
ーミナルデオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼ（
４Ｇ）を用いてデオキシ−Ｃ残基をつなぎ、同様にＰ＋
ｔＩ部位（４Ｇ）にデオキシ−Ｃ残基をテーリングした
３００　ｎＨのプラスミドｐＢ　Ｒ３２２（４１）　　
とアニール（ｘｎｎｅ！ｌ）した。アニール後の各混合
物を用いてＥ、　　Ｃ０Ｋ−１２株２９４を形質転換し
た。８００−１５００ｂｐｃＤＮＡから約８Ｈｆ１株、
　　＞　１５ＱＩｌｌ＋ｐの　ｃＤＮＡから約４００株
の形質転換体が得られた。
Ｅ、誘発ｃＤＮＡのコロニーライブラリのスクリニング 各コロニーを、Ｌ　Ｂ　（５８）　＋　５１１９７　ｍ
ｌのテトラサイクリンを入れたマイクロタイタープレー
トのウェル（ｗｅｌｌ）に別々に接種し、ＤＭＳＯ（ジ
メチルスルホキシド）を７％まで加えた後−２０℃で貯
蔵した。コロニーライブラリの２種のコピーをニトロセ
ルロースフィルター上で増殖させ、各コロニーから得ら
れるＤＮＡをＧｒｏｎｓｌｅｉｎ−Ｈｏｇｎｅｓｓ法（
４２）でフィルターに固定した。
誘発および非誘発ＰＢＬ培地からゲル分画したｍＲＮＡ
のサイズ１８Ｓ画分を用いて３２Ｐ−標識ｅＤＮＡプロ
ーブを調製した。ブライマーとしてオリゴｄＴ　　　　
を使用し既報（１）の反応条件２−１８ を用いた。６００−１５００ｂｐサイズの　ｃＤＮＡ画
分から得た８０００株の形質転換体と＞　１５００ｂｐ
サイズのｃＤＮＡ画分から得た４００株の形質転換体と
を含む１組のフィルターを、２０Ｘ　１０　　ｃｐｍ　
（７）誘発３２ＰｃＤＮＡとハイブリダイズさせた。も
う一組のフィルターを２０Ｘ　１０　　ｃｐｍの非誘発
３２Ｐ−ｃＤＮＡとハイブリダイズさせた。Ｆｒｉ＋ｓ
ｅｈ等（４３）が示した条件でハイブリダイゼーション
を１６時間継続した。フィルターをよく洗浄しく４３）
、ＤｕＰｏｏ＋　Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ−Ｐｌｕｓ増感板
を密着させたＫｏｄｇｋＸＲ−５Ｘ線フィルムに１６〜
４８時間篇出した。２種のプローブに関して各コロニー
のハイプリダイゼーシタンパターンを比較した。約４０
％のコロニーは明らかに双方のプローブとハイブリダイ
ズし、約５０％のコロニーはいずれのプローブともハイ
ブリダイズしなかった（第３図）。＋２４個のコロニー
は誘発プローブとかなり／Ｘイブリダイズしたが、非誘
発プローブについては検出不能な程弱いものであった。
これらの各コロニーをマイクロタイタープレートのウェ
ルに個別に接種シ、増殖させてニトロセルロースフィル
ターに移し、前記と同様に２種のプローブとハイブリダ
イズさせた。同様に各コロニーから急速法（ｒａｐｉｄ
ｍｅｔｈｏｄ）　（４４）によって単離したプラスミド
ＤＮＡをニトロセルロースフィルターに付着させ、誘発
及び非誘発プローブとハイブリダイズさせた（４５）。
２２個のコロニーから得たＤＮＡは誘発プローブのみと
ハイブリダイズした。これらを“誘発”コロニーと名付
けた。
Ｆ、誘発コロニーの特性決定 ２２個の誘発コロニーのうちから任意に選択した５つの
コロニーからプラスミドＤＮＡを調製しく４６）、これ
を用いて挿入ｃＤＮＡの特性決定を行なった。５つの誘
発プラスミド（ｐ６７、　ｐ６８．　ｐ６９９７１及び
ｐ７２）の制限エンドヌクレアーゼマツプピングによれ
ば４つのプラスミドが同様の制限ヌクレアーゼマツプを
有すると推定された。これらの４種のプラスミド（ｐ６
７、　ｐ６９．　ｐ７１．　ｐ７２）　は夫々、挿入ｃ
ＤＮＡ中に４個のＤ　ｄｅ　Ｉ部位と２個のＨｉｎｆ■
部位と１個のＲｓａ　Ｉ部位とを有していた。第５のプ
ラスミド（ｐ５８）は共通のＤ　ｄｅ　Ｉ断片を有して
おり、他の４種に比較して短い　ｃＤＮＡクローンであ
ると思われた。制限ヌクレアーゼマツピングによって推
定された相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）はハイブリダイゼ
ーションによって確認された。プラスミドｐ６７の６０
０ｂｐのＤｄｅＴ断片から３２Ｐ−標識ＤＮＡプローブ
を調製しく４７）、これを使用して他の誘発コロニーと
のハイブリダイゼーション（４２）を実施した。制限ヌ
クレアーゼでマツピングされた５つのコロニー全部がこ
のプローブとクロスハイブリダイズした。誘発／非誘発
スクリーニングに選択した１２４個のうちの他の１７個
のコロニーも同様であった。クロスハイブリダイズする
これらのプラスミドの各個における挿入ｃＤＮＡの長さ
を、ＰｓｔＩ消化及びゲル電気泳動法によって測定した
。
最長の挿入ｃＤＮＡを有するクローンは挿入物長１２０
０−１４００ｂｐのクローン６９と考えられる。以後の
実験全部にこのＤＮＡを使用した。この制限エンドヌク
レアーゼマツプを第４図に示す。
９６９の挿入ｃＤＮＡは、３つの独立発現系で産生され
た発現産物によって抗ウィルス活性を生ずるＩＦＮ−γ
　ｃＤＮＡであることが証明された。
これに関して以下に詳述する。
Ｇ、　ｐ６９の挿入ｃＤＮＡの配列解析プラスミドｐ６
９の挿入ｅＤＮＡの完全ヌクレオチド配列を決定するた
めに、断片をＭ１３ベクターｍｐ７　（４９）でサブク
ローニング後にジデオキシヌクレオチドチェーンターミ
ネーションメソッド（４８）で処理しＭａｘｘｍ　−Ｇ
１１ｂｅｔｔ法（５２）で処理した。最長のオープン解
読フレームは、第５図に示す１６６個のアミノ酸から成
るタンパクをコードしている。
コードされた第一残基は、ｃＤＮＡの５′−末端の第一
ｍｅｔ　コドンである。アミノ末端の最初の２０個の残
基は残りの１４６個のアミノ酸の分泌のためのシグナル
配列として機能すると推定される。この推定シグナル配
列は、別の特性付けされたシグナル配列と共通の特徴、
例えばサイズ及び疎水性を有する。更に、推定された開
裂配列に見られる４個のアミノ酸（Ｓｅｔ−１ｅｕ　−
ｇｌｙ−ａｙｓ）は、数種の１ＦＮ−ａ　（ＬｅｌＦ　
　Ｂ、　　Ｃ，Ｄ、　　ＦおよびＨ２（２））の開裂点
で見られる４個の残基に等しい。
１４６個のアミノ酸から成るコードされた成熟アミノ酸
配列は分子量１７．１４０である。
コードされたタンパク配列中のアミノ酸２８−３０（ｘ
ｓｎ　−ｇ１７−　ｔｈｅ）及びアミノ酸１００−１０
２　（ａｒｎ　−ｔ７ｒ　−＋ｅ＋）にグリコシレージ
ランが可能な２個の位置（５０）が存在する。このよう
な位置の存在は、ヒトＩＦＮ−γ（６，５＋）の周知の
グリコシレージョンに一致する。更に、２個しかないシ
スティン残基（位置１及び３）は立体配置から見て余り
にも近接しているためジスルフィドブリッジを形成し得
ない。このことは、β−メルカプトエタノール（５１）
の如き還元剤の存在中でのＩＦＮ−γの周知の安定性に
一致する。推定された成熟アミノ酸配列はほぼ完全に塩
基性であり、全部で３０個のリジン、アルギニン、ヒス
チジン残基を有しており、アスパラギン酸及びグルタミ
ン酸残基は全部で１９しかない。
プラスミドｐ６９のＤＮＡ配列から推定されたＩＦＮ−
γのｍＲＮ　Ａ構造は、ＩＦＮ−α（１，２）又はＩＦ
Ｎ−β（５）のｍＲＮＡとは明らかに異なる。
第６図に示す如く、ＩＦＮ−α又はＩＦＮ−βに比較し
てＩＦＮ−γのコード領域はより短く、５′及び３′の
未翻訳領域はより長い。
Ｈ，Ｅ、　　ｃｏｌｉ内での成熟ＩＦＮ−７の直接発現
第７図に示す如＜、５０ｅのプラスミドｐ６９をＰ＋ｔ
Ｉで消化し、６％ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動
で１２５（ｌｂｐの挿入物を単離した。約１０鱈の挿入
物がゲルから電気泳動溶出した。このＰｔｔ工断片５埒
を３ユニツトのＢ　ｈ＋Ｎ　Ｉ　　（Ｂｅｔｈｅｓｄａ
Ｒｅｓｅａｒｅｈ　Ｌａｂ＋）で３７℃で１５分間部分
消化し、６％ポリアクリルアミドゲルを用いて反応混合
物を精製した。所望の１１００塩基対ＢｒｆＮ　ｒ−Ｐ
ｌ（１’ｌｆｒ片約０．５Ｉ１ｇを回収した。ホスホト
リエステル法（５３）によって図示の２個のデオキシオ
リゴヌクレオチド即ち　５’−ｄＡＡＴＴＣＡＴＧＴＧ
ＴＴＡＴＴＧＴＣと　５’　−ｄＴＧＡＣＡＡＴＡＡＣ
ＡＣＡＴＧ　（第７図）とを合成し、下記の如くリン酸
化した。３［１ｕｌの６０　ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ８）と１０　ｍＭのＭ　ｇ　Ｃ１！　２と１５　ｍＭ
のβ−メル３２ カプトエタノールと　２４０μ　Ｃｉ（γ　　Ｐ）ＡＴ
Ｐ（ＡＩＩｌｅｒｓｈａｍ、　５１１００　Ｃｉ／ｍｏ
ｌｅ）中で各デオキシオリゴヌクレオチド１０Ｇ　ｐｍ
ｏｌｅを合せた。１２ユニツトのＴ４ポリヌクレオチド
キナーゼを添加し、３７℃で３０分間反応させた。１０
　ｍＭのＡＴＰをｌｌ１Ｉｌ添加し更に２０分間反応さ
せた。φ−ＯＨ／　ＣＨＣｌ　３抽出後、オリゴマーを
０．２５＃のＢ＋１ＮＩ−Ｐｓｌ１１１００塩基対断片
と合せてエタノール沈殿した。３Ｇ成の２０ｍＭトリス
−ＨＣｊ！　　（ｐＨ７，５）と１０　ｍＭのＭｇＣｌ
２と１０　ｍＭジチオスレイトールと　０．５ｍＭのＡ
ＴＰと１１）ユニットのＴ４　ＤＮＡリガーゼ中で前記
の断片を２０℃で２時間給合した。（付着末端の結合に
よる重合体を排除すべく）混合物を３０ユニツトのＰｓ
ｌＩと３０ユニツトのＥｃｏＲＩとによって１時間消化
し、６％ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動にか
けた。電気泳動溶出により１１１５塩基対の産生物（１
１Ｇ、（１００ｃｐｍ）を回収した。
プラスミドｐＬｅｌＦ＾＋＋ｐ　１Ｇ３　（第７図）は
ＬｅｌＦ人遺伝子から離れたＥｃｏＲＩ部位が除去され
た（２７）プラスミドｐＬｅｌＦ　Ａ　２５（１）の誘
導体である。
３ｑのｐＬｅｌＦ　Ａ　＋ｒｐ　１０３を２Ｏ−Ｌ−ｙ
トのＥｃｏＲｌと２０ユニツトのＰ＋ｔＩとを用いて３
７℃で９０分間消化し、６％ポリアクリルアミドゲルを
用いて電気泳動にかけた。（〜３９００塩基対の）大き
いベクター断片を電気泳動溶出により回収した。このよ
うに調製した０、　１ｓ趨のベクターに１１１５塩基対
のＥｅ。
ＲＩ−ＰｓｔＩ　Ｉ　ＦＮ−γ　ＤＮＡ断片を結合した
。
Ｅ、　　ｃｏｌｉ　Ｋ−１２株　２９４　（Ａ　Ｔ　Ｃ
ＣＮｏ、　３１４４６）を形質転換して１２０個のテト
ラサイクリン耐性コロニーを得た。これらの形質転換体
６０個からプラスミドＤＮＡを調製し、ＥｃｏＲＩおよ
びＰｓｌＩで消化した。これらのプラスミドのうちの３
個が所望の１１１５塩基対ＥｃｏＲＩ−ＰｓｊＩ断片を
含んでいた。
ＤＮＡ配列の解析により、これらのプラスミドが、＋ｒ
ｐプロモーター、合成りＮＡ及びｅＤＮＡ間の・結合部
に所望のヌクレオチド配列を有することが確認された。
これらのプラスミドの１っｐｌＦＮ−γ　）ｒｐ４８を
選択して更に研究を続けた。該プラスミドを用いてＥ、
　　ｃｏｌｉ　　Ｋ−Ｌ２株Ｗ３１１ｆｌ　（ＡＴ　Ｃ
ＣＮｏ、　２７３２５）を形質転換した。
Ｉ、ＩＦＮ−γをコードする配列の遺伝子構造ＩＦＮ−
γをコードする遺伝子の構造を５ｏａｆｌ＋ｅｒＩ＋ハ
イブリダイゼーシヨンによって解析した。この方法（５
４）では、５ＩｉＳの高分子量ヒトリンパ球ＤＮＡ（５
５の如く調製）を種々の制限エンドヌクレアーゼで完全
消化し、１．０パーセントのアガロースゲルを用いて電
気泳動にかけ（５６）、ニトロセルロースフィルター（
５４）に塗抹した。３２Ｐ−標識ＤＮＡプローブをｐ６
９の挿入ｃＤＮＡの６００ｂｐ　　ＤｄｅＩ断片から調
製しく４７）、ニトロセルロ−スに移したＤＮＡとハイ
ブリダイズした（４３）。１分間当り１０７カウントの
プローブを１６時間ハイブリダイズし、前記（４３）の
如く洗浄した。別々の提供者から得た８個のゲノムＤＮ
Ａサンプルを制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩで消化
し、ｐ６！ｌ　”’Ｐ−標識プローブとハイブリダイズ
した。第９図に示す如く、２個の明白なハイブリダイゼ
ーションシグナルが見られた。）（ｉｎｄＩ［消化λＤ
ＮＡとの移動度比較によれば、これらは夫々、８８キロ
塩基対（ｋｂｐｌ　及び２．０ｋｂｐを有すると推定さ
れた。
これは２個のＩＦＮ−γ遺伝子があるか、又は１個の遺
伝子がＥｃｏＲＩ部位によって切断（ｓｐｌｉｔ）され
た結果であろう。ｐ６９　　ｃＤ　Ｎ　ＡがＥｃｏＲＩ
部位を含まないので、１個の遺伝子を発現させるには内
部ＥｃｏＲＩ部位を有する介在配列（イントロン）が必
要であった。これらの可能性を見分けるために、異なる
他の５種のエンドヌクレアーゼで消化した１個のヒトＤ
ＮＡ　（第１０図）に対して同じプローブを用いて５ｏ
ｕｔｈｅｒｎハイブリダイゼーシコンを実施した。２種
の他のエンドヌクレアーゼＰｖｕＩＩ、　　Ｈｉｎｃ　
ＩＩでは夫々２個のハイブリダイズＤＮＡ断片（ｐｖａ
ｌＩでは６．７ｋｂｐと４．ｌ］ｋｂｐＨｉｎｅＩＩで
は２．５ｋｂｐと　２．２　ｋｂｐ）が見られた。
しかし乍ら３種のエンドヌクレアーゼＨｉｎｄ　ｍ。
Ｂｇ　ｌ　ＩＩ、　　ＢｘｍＨＩによる消化パターンで
は夫々１個のハイブリダイズＤＮＡ断片（Ｈｉｎｄｎ［
では９．０　ｋｂｐ、　　Ｂｇ　ｆ！ＩＩでは１１．５
　ｋｂｐ、　　Ｂａ＋ｎＨＩでは９、５　ｋｂ＋＋）　
Ｌか得られなかった。同−ＨｉｎｄＤＩハイブリダイズ
断片に含まれるためには２個のＩＦＮ−γ遺伝子が異常
に接近して（９，０ｋｂｐ未満）結合していなければな
らない。この結果より、ヒトゲノムＤＮＡには（多数存
在したＩＦＮ−α遺伝子と違って）ひとつの同質の（ｈ
ｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）　Ｉ　Ｆ　Ｎ　−γ遺伝子が存在
しておりこの遺伝子がＥ　ｃｏＲＩ　。
ＰｖｕｌＩ、　Ｈｉｎｅ　ＩＩ部位を含む１個以上のイ
ントロンによって切断されると推定される。この推定を
確認するために、ｐ６９から得たｃＤＮＡの３′未翻訳
領域のみから調製した３２Ｐ標識断片（第５図の　８６
０番目から　９９０番目までの　１３０塩基対のＤｄｅ
Ｉ断片）をＥｃｏＲＩ消化したヒトゲノムＤＮＡにハイ
ブリダイズした（４７）。２．Ｏｋｂｐ　ＥｃｏＲＩ断
片のみがこのプローブにハイブリダイズした。
このことは、この断片が３′−未翻訳配列を含んでおり
８．８　ｋｂｐ　ＥｃｏＲＩ断片が５′−配列を含むこ
とを示す。ＩＦＮ−γの遺伝子構造（少くとも１個のイ
ントロンを有する１個の遺伝子）は、ＩＦＮ−α（イン
トロン（５６）を有さない多数遺伝子（ｍｕｌｔｉｐｌ
ｅ　ｇｅｎｅｓ）　（２１）又はＩＦＮ−β（イントロ
ン（５７）を有さない１個の遺伝子）と明らかに異なっ
ている。
Ｊ、細菌抽出物の調製 ｓｕ　／　ｍｌのテトラサイクリンを加えたＬｕｒロブ
ロスで１晩培養したＥ、　　ｃｏｌｉ　Ｗ３１１Ｇ／　
ｐｌＦＮ−γｔｒｐ　４８を、０．２％のグルコースと
　０．５％のカザミノ酸と５　ｎ　／　ｍｌのテトラサ
イクリンとを含むＭ９（５８）培地に希釈度１　：　Ｉ
Ｎで接種した。Ａ　　が５０ ０１乃至０．２のときに最終濃度２０　ｐ９　／　ｍｌ
になるまでインドールアクリル酸を添加した。Ａ３５０
−１．０で遠心して１０１１のサンプルを採取し、１■
／ｍｌのウシ血清アルブミンを含む１　ｍｌの燐酸塩緩
衝食塩水（ＰＢＳ−ＢＳＡ）に直ちに再懸濁させた。
超音波で細胞を破砕し残渣を遠心で除去した。アッセイ
（分析）を行なうまで上清を４℃で保存した。細胞変性
効果（ＣＰ　Ｅ）阻止アッセイで標準ＩＦＮ−αと比較
すると、上清中のインターフェロン活性は２５０ユニツ
ト／　ｍｌと測定された。
に、酵母の形質転換／′菌株及び培地 酵母菌を既報（５９）に準じて形質転換した。Ｅｃｏｌ
ｉ株Ｊ　Ａ３００（ＡＴＣＣＮｏ、３３５８８）　（ｌ
ｈ＋　ｌｅｕ　Ｂ６１ｈｉｔｈｙ　Ａ　＋Ｉｆｌ　Ｃ１
１１７ｈ＋ｄ＋ｎ　ｈｓｄ　Ｒ５ｉｔＲ（２０）を用い
て発現能のあるＴＲＰ　１遺伝子を含むプラスミドを選
択した。遺伝子型ｆａ　Ｈ９１Ｈｌ　２５ＵＣ２ｍａｌ
　ＣＵＰ　Ｉ）　（１８）を有する酵母菌５ｉｃｃｈａ
＋ｏｚ７ｃｅｓｃｅ＋ｅｖｉ＋１ａｅＲＨ２１ｇを酵母
形質転換宿主として使用した。Ｓ、　　ｃｅ＋ｅｖｉｓ
ｉａｅＲＨ２１８は、アメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクション（ＡＴＣＣＮｏ、　４４０７６）に寄託
されている。０．２５％のカザミノ酸（ＣＡＡ）を含む
Ｍ９　　（最小栄養培地）およびＬＢ（す・ソチ培地）
は、Ｍｉｌｌｅｒ（５ｇ）によって記載されているよう
に、培地をオートクレーブで処理し冷却してから２０　
ｕ９　／　ｍｌのアンピシリン（ＳｉｇｌＩｌａ）を添
加して得られた。下記の培地によって酵母を増殖させた
。１％の酵母抽出物と２％のペプトンと２％のグルコー
ス、これに所望により３％Ｄｉｆｃｏ寒天とを含むＹ　
Ｅ　Ｐ　Ｄ０１４！中に６．７ｇの酵母窒素塩基　（ア
ミノ酸非含有）　（Ｙ　Ｎ　Ｂ　）　（Ｄｉｆｃｏ）と
１０■のアデニンと１０■のウラシルと　５ｇのＣＡＡ
と２０ｇのグルコース、これに所望により３０ｇの寒天
とを含むＹＮＢ＋ＣＡＡ０ Ｌ、酵母発現ベクターの構成 １．１０４のＹ　Ｒｐ　７　（１４，１５，１６）をＥ
ｃｏＲＩで消化した。得られたＤＮＡの付着末端をＤＮ
Ａポリメラーシー　（Ｋｌｅｎｏｖ断片）で平滑末端化
した。ベクターと挿入物とを１％のアガロース（Ｓｅａ
ｋｅｍ）ゲルに流し、ゲルから切り取り、電気泳動溶出
して等容量のクロロホルムとフェノールとで２回抽出し
、エタノール沈殿した。得られた平滑末端ＤＮＡ分子を
最終容量５０成で１２℃で１２時間結合させた。
この結合混合物（ｌｉｇａ＋ｉｏｎ　ｍ１ｘ）でＥ、　
　ｃｏｌｉ株ＪＡ３０Ｇをアンピシリン耐性及びトリプ
トファン原栄養性に形質転換した。夫々反対の方向を向
いたＴＲＰＩ遺伝子を含むプラスミドを単離した。
ｐＦＲＷｌはＹＲｐ７と同方向のＴＲＰＩ遺伝子を有し
ており、ｐＦＲＷ２はＹＲｐ７と反対方向を向いたＴＲ
ＰＩ遺伝子を有していた。
２０埒の　ｐＦＲＷ２を±ｉｎｄ　Ｉ［で直線化し、１
％のアガロースゲルを用いて電気泳動にかけた。直線状
分子をゲルから溶出し、次に２（ｌＱｎｇを、酵母３−
ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子を含む制限断片であ
るプラスミドｐＢｌ（＋３）の３，１ｋｂＨｉ口ｄｌ［
Ｉ挿入物５００ｎｇと結合させた。結合混合物を用いて
Ｅ、　　ｃｏｌｉ株２９４をアンピシリン耐性及びテト
ラサイクリン感受性に形質転換した。このような組換体
の１つから調製したプラスミドは、テトラサイクリン耐
性遺伝子のＨｉｎｄＩＩ［部位にｐＢｌ挿入ＤＮＡの３
．１　ｋｂｐ　　Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ断片を有する完全な
ＴＲＰＩ遺伝子を有していた。このプラスミド（よりＦ
ＲＭ　３１である。５埒の　ｐＦＲＭ３１を４旦ＲＩで
完全に消化し、フェノール及びクロロホルムで２回抽出
しエタノール沈殿した。夫々　２５０μＭのデオキシヌ
クレオシドトリホスフェートを用いた反応でＤＮＡポリ
メラーシー　（Ｋｌｅｎｏｖ断片）を用いて分子の付着
末端を充填した。反応を１４℃で２０分間継続後、フェ
ノール−クロロホルムで２回抽出し、ＤＮＡをエタノー
ルで沈殿させた。次にＤＮＡを含む再懸濁液をＣ１ａＩ
で完全に消化し、６％アクリルアミドゲルを用いて電気
泳動にかけた。ベクター断片をゲルから溶出し、フェノ
ール−クロロホルム抽出し、エタノール沈殿した。
ヒトから精製した３−ホスホグリセリン酸キナーゼ酵素
の６個のＮ−末端アミノ酸は下記の配列を有していた。
１−２−３−４−５−６ ＳＥＲ−ＬＥＵ−３ＥＲ−ＳＥＲ−ＬＹＳ−ＬＥＵ１４
１塩基対の５ｚｕ３Ａ−３ｉｕ３Ａ制限断片のＤＮＡ配
列から生成した翻訳解読フレームの１個は、（内部Ｈｉ
ｎｃＩ［部位を含む。第１１図のＰＧＫ制限マツプ参照
）下記のアミノ酸配列を生成する。
１−２−３−４−５−６ ＭＥＴ−３ＥＲ−ＬＥＵ−ＳＥＲ−３ＥＲ−ＬＹＳ−Ｌ
Ｅｔｌイニシエーターたるメチオニンを除くとＰＧＫの
Ｎ−末端アミノ酸配列は、ヒトＰＧＫのＮ−末端アミノ
酸配列と５乃至６個のアミノ酸の相同性（ｈｏｍｏｌｏ
ｇ７）を示した。
この配列決定により酵母ＰＧＫ構造遺伝子の起点が、ｐ
Ｂｌの１４１塩基対５ａｕ３Ａ制限断片中のＤＮＡによ
りコードされると推定できる。従来の研究（２０）では
、ＰＧＫ　ｍＲＮＡを特定化するＤＮＡ配列がＨｉｎｄ
ｍ断片のこの領域に存在するであろうと推定されていた
。更に１４１塩基対５ａｕ３Ａ断片の配列にはより多く
のＰＧＫプロモーターのＤＮＡ配列が含まれている（第
１２図）。
配列５’　−ＡＴＴＴＧＴＴＧＴＡＡ人−３′を有する
合成オリゴヌクレオチドを標準法により合成した（Ｃ＋
ｅｔ他、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、
、　　　８．　　２３３１　　　（１９８０））１００
ｎＨのプライマーの５′−末端を２０μｓの反応液３２ 中で２００μＣ１の［γ　　Ｐ］　ＡＴＰ及び１０ユニ
ツトのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで標識した。
この標識プライマー溶液を用いてプライマー修復反応（
ｐｒｉｍｅｒ−ｒｅｐａｉｒ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）を実
施した。この反応は、ＰＧＫ構造遺伝子配列の直前に位
置するＰＧＫ５’　−フランキングＤＮＡにＥｃｏＲＩ
制限部位を入れる多段階プロセスの第１段階である。
１１００Ｉ１のｐ　Ｂ　１　（２０）をＨａｅｍで完全
消化し６％のポリアクリルアミドゲルで電気泳動する。
エチジウム染色ゲル上の最上部のバンド（ＰＧＫプロモ
ーター領域を含む）を前記の如き電気泳動溶出により単
離した。このＤＮＡの１２００塩基対Ｈｘｅｎ［断片を
ＨｉｎｃＩＩで消化し、次に６％アクリルアミドゲルで
電気泳動した。電気泳動溶出により６５０塩基対のバン
ドを単離した。５埒のＤＮＡを単離した。ＤＮＡの６５
０塩基対Ｈｇｅｍ　−Ｈｉｃｅ　ＩＩ断片を２０ｇのＨ
２Ｏに再度懸濁させ、次に２０μｓの前記の燐酸化プラ
イマー溶液と混合した。この混合物をフェノール−クロ
ロホルムで１回抽出し次にエタノール沈殿させた。乾燥
したＤＮＡを５０ＩｉＩｌのＨ２Ｏに再度懸濁させ、次
に沸騰水浴で７分間加熱した。この溶液をドライアイス
−エタノール浴で（ｌ［ｌ乃至２０秒間）急冷し、氷水
浴に移した。
次に、この溶液に、１０Ｉｉ１のＤＮＡポリメラーシー
の１０倍緩衝液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍｉｎｎｈｅ
ｉｍ）とデオキシヌクレオシドトリホスフェ−ト（ｄＡ
ＴＰ、　ｄＴＴＰｄＧＴＰ及びｄＣＴＰ）を夫々　２．
５ｍＭにした１０Ｉ１１の溶液と２清のＨ２Ｏと５ユニ
ツトのＤＮＡポリメラーシー　Ｋｌｅｎｏｗ断片とを含
む溶液５０μｓを添加した。この１００ＩＪｉの反応溶
液を３７℃で４時間インキュベートした。次に溶液をフ
ェノール−クロロホルム抽出し、エタノール沈殿し、凍
結乾燥して１０ユニツトの５ａｏ３Ａで完全に消化した
。溶液を６％アクリルアミドゲルで電気泳動した。３９
塩基対のサイズに相当するバンドをゲルから切取り前記
の電気泳動溶出で単離した。この３９塩基対のバンドは
１個の平滑末端と１個の５ａｏ３Ａ付着末端とを有する
。この断片を改造したｐＦＩＦ　ｌｒｐ　６９ベクター
（５）にクローニングした。１０／１ｇの　ｐＦＩＦ　
ｔｒｐ　６９をＸｂ１工で直線化し、フェノール−クロ
ロホルムで１回抽出し、エタノール沈殿した。ヌクレオ
シドトリホスフェートを夫々　２５０μＭ含む５０／ｌ
／ｊ２の反応溶液中でＤＮＡポリメラーシー　Ｋｌｅｎ
ｏｖ断片を使用してＸｂｘｌ付着末端を充填した。この
ＤＮＡをＢａｍＨＩで切取り６％アクリルアミドゲルで
電気泳動した。ベクター断片を電気泳動溶出によってゲ
ルから単離し次に２０４の８２０に再度懸濁させた。
２ＯｎＨのこのベクターと前記で調製した２Ｑｎｇの３
９塩基対断片とを室温で４時間給合させた。結合混合物
の１１５量を使用してＥ、　　ｃｏｌｉ株２９４を（Ｌ
Ｂ＋２０ＩＬｉ／ｍｌ　　ａｍｐｍ−プレート上アンピ
シリン耐性に形質転換した。形質転換体から得たプラス
ミドをクイックスクリーンプロセス（ｑｕｉｃｋ　５ｃ
ｒｅｅｎｐ＋ｏｅｅｄｕ＋＋）　（４４）でテストした
。配列解析のためにプラスミド　ｐ、ＰＧＫ−３９を選
択した。２０埒のプラスミドをＸ　ｂａ　Ｉで消化し、
エタノール沈殿後１０００ユニットの細菌由来アルカリ
性ホスファターゼと共に６８℃で４５分間処理した。Ｄ
ＮＡを３回フェノール−クロロホルム抽出し、エタノー
ル沈殿させ−３ま た。　２００μＣ１の［γ　　Ｐ］　ＡＴＰと１０ユニ
ツトのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼとを含む２ＱＩＩ
Ｊｌの反応溶液中で脱リン酸末端を標識した。プラスミ
ドを５ｓｌＩで切断し６％のアクリルアミドゲルで電気
泳動した。
標識した挿入バンドをゲルから単離し、Ｍａ！ａｍＧｉ
ｌｂｅ＋を法（５２）によって配列を決定した。このプ
ロモーター断片の３′　−末端のＤＮＡ配列は予想通り
であった。
２５ｕｇの９ＰＧＫ−３９（第１３図）を（夫々５ユニ
ツトの）ＳａｌＩとＸｂａＩとで同時に消化し６％ゲル
を用いて電気泳動にかけた。３９塩基対のプロモーター
断片を含む３９Ｇ塩基対のバンドを電気泳動溶出により
単離した。再懸濁Ｄ　Ｎ　Ａを５ａｕ３Ａで消化し、８
％アクリルアミドゲルを用いて電気泳動にかけた。３９
塩基対ＰＧＫプロモーターバンドを電気泳動溶出により
単離した。このＤＮＡは、５ａＩ１３Ａ−ＸｂａＩ断片
にＰＧＫプロモーターの５′−末端の３９塩基対を含ん
でいた。
２５埒のｐＢｌをＰｖａＩとＫｐｎＩとで消化し、６％
アクリルアミドゲルを用いて電気泳動にかけた。
ＤＮＡの０．８ｋｈｐバンドを電気泳動溶出により単離
し、５ａｕ３Ａで消化して、６％アクリルアミドゲルを
用いて電気泳動にかけた。ＰＧＫプロモーターから得た
２６５ｂ９バンド（第１１図）を電気泳動溶出により単
離した。
次ニ、このＤＮＡと前記の３９ｂｐプロモ一ター断片と
を室温で２時間給合した。結合混合物をＸｂａｌとＰ　
ｖｕ　Ｉとで消化し、６％アクリルアミドゲルを用いて
電気泳動にかけた。３０４　ｈｐ　　Ｘｂａｌ　−Ｐｖ
ｕＩ断片を電気泳動溶出により単離し、これを２００ｎ
Ｈの（先に単離したＰｖａｌ−ＰｉｔＩ　　１６２塩基
対断片の欠如した）　　ｐＢ　Ｒ３２２ｆ４１）と、２
０１１ｎｇのＸｂｘＩ−ＰｉｔＩ　　ＬｅｌＦ　Ａ　　
ｃＤＮＡ遺伝子とを含む結合混合物に添加した。このＬ
ｅｌＦ　Ａ　ｃＤＮＡ遺伝子は先に２０／４９のｐＬｅ
ｌＦ　ｔｒｐ　Ａ　２５から単離されている。この３因
子結合混合物を用いてＥ、　　ｃｏｌｉ株２９４をテト
ラサイクリン耐性に形質転換した。形質転換体コロニー
をミニスクリーニングしく４４）、コロニーの１つ、即
ち　ｐＢＲ３２２をベースとするベクター中でＬｅｌＦ
　Ａ遺伝子に融合した３０４塩基対のＰＧＫ５’　−フ
ランキングＤＮＡを有する　ｐｐＧ　Ｋ　３００を単離
した。ＬｅｌＦ　Ａ遺伝子の５′−末端は、配列５’　
−ＣＴＡＧＡＡＴＴＣ−３’　を有する。従ってこの配
列にＰＧＫプロモーター断片からＸｂｘＩ部位が融合す
ると、ＸｂａＩ部位にＥｃｏＲＩ部位が付加することが
可能になる。従ってｐＰＧＫ３００はＰｖｕＩ−Ｅｅｏ
ＲＩ断片中に単離されたＰ　、ＧＫプロモータ一部分を
含む。
１０ｕ９（ＤｐＢｌ をＰ　ｙｏ　Ｉ及びＥｅｏＲＩで消化し６％アクリルア
ミ ドゲルで電気泳動した。１．３ｋｂの Ｐ！ＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ　　ＤＮＡバンドをＰＧＫ５’
フランキングＤＮＡから電気泳動溶出により単離した。
ｌＯ鱈の　９ＰＧＫ−３０１１をＥｃｏＲＩ及びＰｙｕ
工で消化し、６％アクリルアミドゲルを用いて消化混合
物（ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ　ｍｉｘ　）を電気泳動にかけ
、次に電気泳動溶出して３１２　ｂｐのプロモーター断
片を単離した。５埒のｐＦＲＬ　４をＥｃｏＲＩで切断
し、エタノール沈殿させ、６８℃で細菌由来アルカリ性
ホスファターゼで４５分間処理した。フェノール／クロ
ロホルムで３回抽出し、ＤＡＮをエタノール沈殿させ、
２０ｍ１のＨ２Ｏに再懸濁させた。２０１ｇのベクター
を、ｐＰＧＫ−３００から単離した１００結合させた。
結合混合物を用いてＥ、　　ｃｏｌｉ株２９４をアンピ
シリン耐性に形質転換した。得られた形質転換体の１つ
がｐｐ　Ｇ　Ｋ　−１５００であった。このプラスミド
は、ＤＮＡのＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ又はロモーター断
片を含んでいた。
１０埒のｐＰＧＫ−１５００をＣ１ａＩ及びＥｃｏＲＩ
で完全消化し、消化混合物を６％アクリルアミドゲル電
気泳動にかけた。電気泳動溶出によりＰＧＫプロモータ
ーを含む９００ｂｌｌの断片を単離した。１０／ｉのｐ
ｉ　ＦＮ−７ｔｒｐ　４８をＥｅｏＲＩ及びＨｉｎｃＩ
Ｉで完全消化し、６％アクリルアミドゲル電気泳動にか
けた。電気泳動溶出により直接発現できる■ＦＮ−γ　
ｃＤＮＡを含む９３８ｂｐのバンドがゲルから単離され
た。
（Ｃ１ａＩ−ＥｅｏＲＩ断片上の）ＰＧＫプロモーター
断片と欠失９ＦＲＭ−３１と前記の単離ＩＦＮγ　ｃＤ
ＮＡとを３断片結合反応によって酵母発現ベクターを構
成した。結合反応は１４℃にて１２時間行なわれた。次
にこの結合混合物を用いてＥｃｏｌｉ　Ｋ−１２株２９
４をアンピシリン耐性に形質転換した。形質転換体を分
析し、適正な構成の発現プラスミドｐＰＧＫ−ＩＦＮ−
γの存在を確認した（第１６図）。発現系を含むプラス
ミドを用い、トリプトファン欠失寒天中で酵母菌ＲＨ２
＋８のスフェロプラストをトリプトファン原栄養性に形
質転換した。これらの組換え酵母に対し、ＩＦＮ−γの
存在を調べるアッセイを実施した。
酵母抽出物を下記の如く調製した。１０ｍ１の培養液を
ＹＮＢ＋ＣＡＡ中でＡ　　〜１−２まで増殖６０ させ、遠心により集め、５００μｓのＰＢＳ緩衝液（２
０ｍＭのＮａＨＰＯ、ｐＨ＝７．４　、１５０ｍＭの４ ＮａＣｊ＋）に再懸濁させた。等容量のガラスピーズ（
０，４５−０，５ｍ）を添加し、混合物を２分間撹拌し
た。抽出物を１４．　ＧＯＯ＋ｐｍで３０秒間遠心し、
上清を取出した。ＣＰＥ阻止アッセイを用いて標準ＩＦ
Ｎ−αと比較すると、上溝中のインターフェロン活性の
測定値は１６．０００ユニツト／　ｍｌであった。
■断片をＥｃｏＲＩ制限部位末端を有する断片に変えた
。Ｈｉｎｄｎ［部位に合成オリゴ７−（５’　−ｄＡＧ
ＣＴＧＡＡＴＴＣ）を添加して、ポリメラーゼＩ　（Ｋ
ｌｅｎｏｖ断片）を作用させて充填し、ＰｖｏＩＩ部位
は平滑末端結合によってＥＣｏＲＩ部位に変えた。得ら
れたＥｃｏＲＩ断片をｐＭＬ−１（２ｇ）のＥｃｏＲＩ
部位に挿入した。ｉｍｐ　Ｒ遺伝子に逆向きとなるＳＶ
４０後期プロモーターを有するプラスミドに於いて、ｐ
Ｍ　Ｌ　−１（２７）のａｍｐＲ遺伝子に最も近イＥｃ
。
ＲＩ部位を除去してこのａＩＩｌｐＲ遺伝子を更に改造
した。
クローンＨＢＶ　　ＤＮＡ（６０）ノ１０２３ｂｐのＨ
ｐａＩ−Ｂｇ　ｌ　ＩＩ断片を単離し、Ｂ型肝炎ウィル
ス（ＨＢＶ）のＨｐａＩ部位を合成オリゴ７−（５’　
　−ｄＧＣＧＡＡＴＴＣＧＣ）でＥｃｏＲＩ部位に転換
した。このＥｃｏＲｌ−Ｂｇｌｍの付いた断片をＳＶ４
０のオリジンをもつ前記プラスミドのＥｃｏＲＩ−Ｂｘ
ｍＨＩ部位に直接クローニングした。
９ｆｉ９の１２５（ｌｂｐ　　Ｐ　ｓｆ　Ｉ断片に於い
てＰＮＩ末端をＥｃｏＲＩ末端に転換し、残りのＥ　ｃ
ｏＲＩ部位にＩＦＮ−γ遺伝子を挿入した。ＩＦＮ−γ
の構造遺伝子の前に５Ｖ４Ｇ後期プロモーターを有する
クローンを単離した。ＤＥＡＥ−デキストランの存在中
でトランスフェクションを８時間行なうように改変した
ＤＥＡＥ−デキストラン法（６１）を用いて、前記で得
られたプラスミドを組織培養細胞（２９）に導入した。
細胞培地を２〜３日毎に交換した。毎日　２００ρずつ
取出してインターフェロンのバイオアッセイを行なった
。トランスフェクションの３〜４日後に検定したサンプ
ルでの典型的な収率は５０乃至１００ユニツト／　ｍｌ
であった。
Ｎ、サル細胞由来ＩＦＮ−γの部分精製サル細胞がつく
るヒトＩＦＮ−γをより多量に製造するために、１０個
の１０ｃｍプレート内の新しい単層Ｃ０８−７に、１１
０ｍ１のＤＥＡＥ−デキストランｆ２［１０埒／ｍｌの
ＤＥＡＥデキストラン５００．０００ＭＷ、０．０５Ｍ
のトリス、ＰＯ７，５、ＤＭＥＭ中）中の総量３０〜の
ｐＤＬＩＦ３をトランスフェクトした。３７℃で１６時
間維持し、プレートをＤＭＥＭで２回洗浄した。１０％
のｔ、　ｂ、　ｓ、と２　　ｍＭのグルタミンと５０／
ＪＩＦ　／　＋１１１のペニシリンＧを加えた１５ｍ１
の新シいＤＭＥＭを補充し、次に５０■／　ｍｌのスト
レプトマイシンを各プレートに添加した。翌日、培地を
血清を含まないＤＭＥＭに代えた。以後、この血清を含
まない培地を毎日新しく添加した。収集した培地をアッ
セイを行なう迄又はＣＰＧに結合する迄４℃に維持した
。トランスフェクションの３〜４日後のサンプルからプ
ールした画分は活性をほぼ全部含むことが判明した。
０．５ｇのＣＰＧ　（コンドロールド−ポアガラス、Ｅ
ｌｅｃｊ＋ｏｎｏｃｌｅｏｎｉｃＳＳＣＰ　Ｇ３５０　
ｓメツシュサイズ１２０／２００１をｌ　００　ｍｌの
細胞上清に添加し、混合物を４℃で３時間攪拌した。ベ
ンチト・ツブ遠心機で短時間遠心し、沈降ビーズをカラ
ムに詰め、２０　ｍＭリン酸ナトリウム（Ｎａ３Ｐ０４
゜Ｎａ　　ＨＰＯ、ＮａＨＰＯ４又はＰＢＳ）、２　　
　　４　　　　　　２ １ＭＮａＣ！、　０．１％β−メルカプトエタノール（
ｐＨ７，２）で完全に洗浄した。３０％のエチレングリ
コールを含む前記緩衝液及び５０％のエチレングリコー
ルを含む前記緩衝液を順次用いて活性を溶出させた。は
ぼ全部の活性がＣＰＧに付着していた。７５％の溶出活
性は、３０％エチレングリコールで溶出した画分中に存
在した。これらの両分をプールし２０石Ｍリン酸ナトリ
ウム、ＩＭのＮａＣｊ！、ｐＨ７、２で希釈し最終濃度
をエチレングリコール１０％にして、１０ｍ１のＣｏｎ
　Ａセファ０−ス（Ｐｈｘｔｍｉｃｉｓ）カラムに直接
かけた。２０　ｍＭリン酸ナトリウム、ＩＭのＮａＣｆ
１ＳｐＨ７，２で完全洗浄後、２［１ｍＭリン酸ナトリ
ウム、ＩＭのＮａＣ１，０，２Ｍのα−メチル−Ｄ−マ
ンノサイドで活性を溶出した。かなりの量の活性（５５
％）がこのレクチンに付着しなかった。α−メチル−Ｄ
−マンノサイドによって４５％の活性が溶出した。
薬剤組成物 薬剤として有用な組成物を製造するための公知の方法に
準じて本発明物質を製剤化し得る。即ち、本発明により
得られたヒトＩＦＮ−γ産生物を、薬剤上許容し得る賦
形剤と混合組合せる。適当な賦形剤及びその製剤化はＥ
Ｊ、　ｈｌ！ｒｊｉｎ、　Ｒｅｍｉｎｇｆｏ。
のＰｈｘｒｍ＊ｃｅｎｊｉｃｒｌ　５ｅｉｅ＋ｃｅｓに
記載されている。
この書物を参考文献としてここに引用する。このような
組成物は、宿主に有効投与するのに適した薬剤上許容し
得る組成物を調製するために有効量の本発明のインター
フェロンタンパク質を適正量の賦形剤と組合せて得られ
る。
Ａ、非経口投与 本発明のヒトｒＦＮ−γを、抗腫瘍治療又は抗ウイルス
治療を要する患者、又は、免疫抑制状態を示す患者に非
経口投与し得る。用法及び用量は、他のヒトインターフ
ェロンの臨床研究で常用の用法及び用量に準じる。例え
ば日用量約１乃至１０×ｌＯ６ユニツトで使用され、純
度１％より下と考えられる物質は従来と同様に例えば５
０Ｘ　１０６ユニツト／日で使用される。ＩＦＮ−γ以
外のヒトタンパク質即ちヒト由来物質中に存在すると成
る種の好ましくない作用を生じる恐れのあるタンパク質
がほぼ全く混在しないので、効能を良くするためにＩＦ
Ｎ−γの用量をかなり増すことができる。
はぼ同型のＩＦＮ−γの非経口投与に適した剤形の一例
としては、特異的比活性例えば２Ｘ　１０８ユニツト／
■のＩＦＮ−γ　３■を２５ｍ１の５Ｎ血清アルブミン
（ヒト）−ＵＳＰに溶解し、溶液を滅菌フィルターに通
し、濾過した溶液を無菌的に１００本のバイアルに分注
する。各バイアルは、非経口投与に適した純インターフ
ェロン６×１０６ユニツトを収容している。使用するま
でバイアルを低温（−２０℃）保存するのが好ましい。
抗体中和のために、必要ならば、サンプルをＰＢＳ−Ｂ
ＳＡで５００〜１０００ユニツト／　ｍｌの濃度まで希
釈する。希釈度を順次増加したラビットの抗ヒトＩＦＮ
−α抗血清、抗ヒト１ＦＮ−β抗血清又は抗ヒｈＩＦＮ
−γ抗血清を夫々用い、等容量ずつのサンプルを４℃に
て２〜１２時間インキュベートした。Ｎａｔｉｏｎａｌ
　１ｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏ［Ａ１１ｅ＋ｇ７■ｄ　Ｉｎ
ｆｅｃｔｉｏｎｓ　Ｄｉｓｅ＊ｇｅｓから抗ＩＦＮ−ａ
と抗ｒＦＮ−βとを入手した。刺激末梢血リンパ球から
精製した（純度５〜２０％）の標準ＩＦＮ−γを用いて
抗ＩＦＮ−γを調製した。アッセイを行なう前にサンプ
ルを１２．　ｌ１ＨＸ　ｇで３分間遠心した。
ｐＨ２の安定度をテストするためにアッセイ以前にＩＮ
のＨＣｐを添加してサンプルをｐＨ２に調整し、４℃に
て　２〜１２時間インキュベートし、ＩＮのＮａＯＨを
添加して中和した。ドデシル硫酸ナトリウム（Ｓ　Ｄ　
Ｓ）感受性をテストするためにアッセイ以前にサンプル
を等容量の０．２％ＳＤＳと共に４℃で２〜１２時間イ
ンキュベートした。
抗ウィルス活性（ユニット／ｍｌ） この表は、種々の処理後の標準ＩＦＮ−α、β、γの作
用特性を示す。辷　■ｌｉ　　Ｗ３１１０／９　Ｉ　Ｆ
　Ｎ−７１＋ｐ４８及びＣ０８−７／ｐＳＶ７６９によ
り産生じたインターフェロン活性は、酸感受性、ＳＤＳ
感受性でありＩＦＮ−γ抗血清により中和されるが、Ｉ
ＦＮ−α又はβに対する抗体によって中和されない。こ
れらのデータより、前記の系に於いて産生じたインター
フェロンがＩＦＮ−７でありプラスミドｐ６９の挿入ｃ
ＤＮＡがＩＦＮ−γをコードしていることが確認される
。
精　　製 たとえば細菌等からＩＦＮ−γを精製する一方法を以下
に述べる一般的な大要に従って記載する。
１、　高電導性の溶菌バッファー（ｐＨ約８．０）中で
細胞を高圧力でホモゲナイザー中を通過させ、次いで水
浴中で流出物を冷却することによる、細胞からの抽出、 ２、　　撹拌下例えば約４℃でのポリエチレン−イミン
添加によるＤＮＡの沈殿、 ３、　　溶液中にＩＦＮ−γを再び残しつつ細菌タンパ
ク質のｐＨによる沈殿除去、 ４．４℃での遠心分離による固相分離、５、　　　（ｐ
Ｈの再調整後）限外濾過等による上澄みの濃縮、 ６、低伝導性バッファーによる濃縮物の透析、７、　遠
心分離による固相除去によって、溶液中にＩＦＮ−γを
残すこと、 ８、　　イオン強度を順次増加する溶出法による、カル
ボキシメチルセルロース上でのイオン交換クロマトグラ
フィー ９、　　イオン強度を順次増加する溶出法による、燐酸
カルシウムゲル上でのクロマトグラフィー１０、　　　
イオン強度を順次増加する溶出法による、弱い変性条件
下でのカルボキシメチルセルロース上イオン交換クロマ
トグラフィー １１、　　ゲル濾過クロマトグラフィーによる分離。
この方法によれば、９０％以上、更には９５％以上の純
度を有する物質の精製が可能である。
本発明のＩＦＮ−γタンパク質の構造は、ＤＮＡ遺伝子
を決定し、それに基いてアミノ酸配列を決定することに
よって解明されたー第５図参照。
本文に記載したこの特定インターフェロンについて自然
に起こ７た相同変異（ａｌｌｅｌｉｃ　ｖａｒｉＮｉｏ
ｎ）が存在しこの変異が個々人の間で起こることが理解
されるであろう。これらの相同変異は、ある場合には全
体配列中の１個（又は複数）のアミノ酸の違いにより示
され、又ある場合には該配列中の１個（又は複数）のア
ミノ酸の欠失、置換、挿入、転位又は付加により示され
る。このような相同変異の全部が本発明の範囲内に包含
される。実際、種々のヒＭＦＮ−γ誘導体の製造に組換
えＤＮＡ技術を使用することに大きな可能性が存在する
。
この誘導体は単一の又は多数のアミノ酸の置換、欠失、
付加又は順序の置き挽えによって種々修飾されたもので
ある。これらヒトＩＦＮ−γ誘導体を生成する前記のご
とき修飾は全て、基本的な特性であるヒトＴＦＮ−γ活
性が不変のまま残っている限り、本発明の範囲に含まれ
る。
上記ＩＦＮ−γのＤＮＡ及びアミノ酸配列（第５図参照
）を用いて、本発明を疑いを残さずに追試するのに最適
な方法は、（例えば２６に示すごとき）合成手段による
完全な遺伝子の製造であり、又は合成デオキシオリゴヌ
クレオチドを製造し、この合成デオキシオリゴヌクレオ
チドをプローブに使って、ヒトゲノムライブラリ又は他
のｃＤＮＡソースから、標準的なハイブリダイゼーショ
ン技術によって目的遺伝子を単離する方法である。
必要とするＩＦＮ−γタンパク質をコードしているヌク
レオチド配列が一旦既知となれば発現をさせ、単離し、
高度の純化したＩＦＮ−γの製剤を製造する方法は上記
記載の方法に従って実施し得る。
好ましい特定具体例に基いて本発明を説明してきたが、
本発明はこれらの特定具体例に限定されＡと１１６９の
挿入ｃＤ　Ｎ　Ａ　”’Ｐ−標識標識−ローブＳｏ＋ｕ
ｈｅｒｎハイブリダイゼーションの結果を示す図、第１
０図は、６種の制限エンドヌクレアーゼで消化したヒト
ゲノムＤＮＡとｐ６９由来３２Ｐ−標識プローブとの５
ｏｕｔｈｅｒｎハイブリダイゼーシヨンの結果を示す図
、 第１１図は、ベタクーｐＢ１の　３．１Ｋｂｐ　Ｈｉｎ
ｄ　ＩＩＩ挿入物の制限マツプ、 第１２図は、酵母３−ホスホグリセリン酸キナーゼ構造
遺伝子の５′−末端部及び５′−フランキングＤＮＡの
ＤＮＡ配列を示す図、 第１３図は、ＰＧＫプロモーターにＸｂａＩ部位を挿入
し且つＰＧＫ５’　−フランキング配列の３９ｂｐ断片
を単離する工程図、 第１４図は、プラスミド　ｐＰＧＫ−３９から得た３９
から得た３９ｂｐ断片とｐＢｌから得た２６５ｂｐ　Ｐ
　ｖｕ　ｌ５ａｕ３Ａ付加ＰＧＫ５’　−フランキング
配列とｐＬｅｌＦ　ｒｒｐ＾から得たＸｂａＩに隣接す
るＥＣｏＲＩ部位とを有する３００　ｂｐ断片の構成を
示す図、第１５図は、第１４図の３００　ｂｐ断片に加
えてＰＧＫ５′−フランキング配列から得た１３００　
ｈｐ　Ｈｉｎｄｍ−ＰｖａＩ断片を有する１５００　ｂ
ｐ　Ｐ　Ｇ　Ｋプロモーター断片の構成を示す図、 第１６図は、酵母菌中でヒトＩＦＮ−γを発現するベク
ターｐＰＧＫ−Ｉ　ＦＮ−γの構成を示す図である。
仕＞７ｉＪ＆人：　ジーネンテツフ、Ｘ〉コーエ・−テ
ント・。

Claims (13)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）成熟ヒト免疫インターフェロンのアミノ酸配列を
    含むポリペプチドから主として構成される組成物。
  2. （２）インターフェロン活性を有することを特徴とする
    特許請求の範囲第１項に記載の組成物。
  3. （３）ヒト由来の他のタンパクを実質的に含まないこと
    を特徴とする特許請求の範囲第１項又は第２項に記載の
    組成物。
  4. （４）主として成熟ヒト免疫インターフェロンのアミノ
    酸配列からなる約９０％より高い純度のポリペプチドを
    含むセルカルチャー抽出物であることを特徴とする特許
    請求の範囲第１項乃至第３項のいずれかに記載の組成物
    。
  5. （５）形質転換された微生物またはセルカルチャー中で
    、成熟ヒト免疫インターフェロンのアミノ酸配列を含む
    ポリペプチドを発現し得る複製可能な発現ベヒクル。
  6. （６）プラスミドが、ｐＩＦＮ−γ−ｔｒｐ４８、ｐＳ
    Ｖ−γ−６９およびｐＰＧＫ−ＩＦＮ−γからなるグル
    ープから選択されることを特徴とする特許請求の範囲第
    ５項に記載のベヒクル。
  7. （７）成熟ヒト免疫インターフェロンのアミノ酸配列を
    含むポリペプチドを発現し得る複製可能な発現ベヒクル
    で形質転換された微生物又はセルカルチャー。
  8. （８）プラスミドが、ｐＩＦＮ−γ−ｔｒｐ４８、ｐＳ
    Ｖ−γ−６９及びｐＰＧＫ−ＩＦＮ−γからなるグルー
    プから選択されることを特徴とする特許請求の範囲第７
    項に記載の微生物又はセルカルチャー。
  9. （９）ＣＯＳ−７系サル腎線維芽細胞を形質転換するこ
    とにより得られることを特徴とする特許請求の範囲第７
    項又は第８項に記載のセルカルチャー。
  10. （１０）大腸菌（Ｅ，ｃｏｌｉ）株を形質転換すること
    により得られることを特徴とする特許請求の範囲第７項
    又は第８項に記載の微生物。
  11. （１１）酵母菌株を形質転換することにより得られるこ
    とを特徴とする特許請求の範囲第７項又は第８項に記載
    の微生物。
  12. （１２）ヒト免疫インターフェロンを成熟した形態で産
    生し得る形質転換細胞のカルチャー。
  13. （１３）成熟ヒト免疫インターフェロンのアミノ酸配列
    を含むポリペプチドをコードする第一ＤＮＡ配列を構成
    し、第一ＤＮＡ配列を発現させ得る第二ＤＮＡ配列と有
    効に結合させることからなる、形質転換された微生物又
    はセルカルチャー中で前記ポリペプチドを発現し得る発
    現ベヒクルの製造方法。
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