SK279535B6 - Ľudský imunitný interferón a jeho derivát, izolát - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka ľudského iminutného interferónu a jeho derivátu, izolátu DNA obsahujúceho DNA sekvenciu kódujúcu ľudský imunitný interferón, rekombinantného klonovacieho vektora obsahujúceho DNA sekvenciu kódujúcu ľudský imunitný interferón, replikovateľného expresného vektora schopného exprimovať v transformantnom mikroorganizme alebo bunkovej kultúre DNA sekvenciu kódujúcu ľudský imunitný interferón, rekombinantného mikroorganizmu alebo bunkovej kultúry schopnej exprimovať imunitný interferón, farmaceutického prípravku na liečenie tumorových alebo vírusových ochorení alebo imunosupresívnych stavov, spôsobu výroby ľudského imunitného interferónu a jeho použitia na prípravu uvedených farmaceutických prípravkov.

Vynález sa týka oblasti technológie rekombinácie kyseliny dezoxyribonukleovej (DNK), prostriedkov a metód využívajúcich túto technológiu na stanovenie DNK sekvencie a z nej odvodené aminokyselinové sekvencie ľudského imunitného interferónu, výroby uvedeného interferónu a rôznych produktov tejto výroby a ich použitie.

Vynález sa týka hlavne spôsobu izolácie a identifikácie DNK sekvencii kódujúcich ľudský iminitný interferón, zostrojovania nosičov schopných exprimovať rekombinované DNK, ktoré obsahujú uvedené DNK sekvencie operačne viazané na expresie vyvolávajúce promótorové sekvencie, a tiež takto zostrojených prostriedkov schopných expresie. Vynález sa ďalej týka, z iného hľadiska, systémov hostiteľských kultúr ako sú kultúry rôznych mikroorganizmov a bunkových kultúr stavovcov, transformovaných nosičmi schopných expresie a usmernených na expresiu uvedených DNK sekvencii. Ešte z ďalšieho hľadiska sa vynález týka prostriedkov a spôsobov na premenu konečných produktov uvedenej expresie na nové výrobky, ako na farmaceutické prostriedky, ktoré sa dajú používať na profylaktické alebo terapeutické liečenie ľudí. Vo vhodnom prevedení sa vynález týka zvlášť nosičov schopných expresie, ktoré sú vhodne sekvenované tak, aby bol z hostiteľskej bunky produkovaný a vylučovaný ľudský imunitný interferón v maturovanej forme. Vynález sa týka tiež rôznych postupov použiteľných na prípravu uvedených DNK sekvencii, nosičov schopných expresie, systémov hostiteľských kultúr, konečných produktov a výrobkov z nich, ako aj príslušných špecifických a pridružených uskutočnení.

Predložený vynález vznikol čiastočne na základe stanovenia DNK sekvencie a z nej odvodenej aminokyselinovej sekvencie ľudského imunitného interferónu. Vynález ďalej poskytuje sekvenčné informácie o 3'- a 5’- priľahlých sekvencii ľudského imunitného interferónového génu, čo uľahčuje jeho in vitro naviazanie do nosičov schopných expresie. Vynález zvlášť poskytuje informáciu o 5'-DNK úseku kódujúceho predpokladaný endogénny signálny polypeptid, ktorý bezprostredne predchádza aminokyselinovej sekvencii predpokladaného maturovaného imunitného interferónu. Tieto objavy umožnili následne vývoj prostriedkov a spôsobov na výrobu dostatočného množstva ľudského imunitného interferónu cestou technológie rekombinácie DNK, čo opäť umožnilo stanovenie jeho biochemických vlastností a bioaktivity.

Doterajší stav techniky

Ľudské interferóny je možné na základe rôznej antigenicity a rôznych bilogických a biochemických vlastností zatriediť do troch skupín.

Prvá skupina obsahuje druh leukocytámych interferónov (α-interferón, LeIF alebo IFN-α), ktoré sú normálne produkované základnými bunkami ľudskej krvi po vírusovej indukcii. Tieto interferóny je možné vyrábať mikrobiálne a zistilo sa, že i takto vyrobené interferóny sú biologicky aktívne (Goeddel et al., Náture 287, 411 (1980), Goeddel et al., Náture 290, 20, (1981) a Yelverton et al., Nucleic Acids Researc 9, 731 (1981)). Ich biologické vlastnosti podnietili ich použitie na klinikách ako terapeutické prostriedky na liečenie vírusových infekcii a maligných stavov (Gutterman et al., Annals of Int. Med. 93, 399 (1980)).

Do druhej skupiny je zaradený ľudský fibroblastový interferón (β-inerferón, FIF alebo IFN-β), ktorý je normálne produkovaný fibroblastami po vírusovej indukcii, ktorý je možné podobne ako je uvedený interferón vyrábať mikrobiálne a ktorý tiež mározsiahly rad biologických aktivít (Goeddel et al., Nucleic Acids Research 8, 4057 (1980)). Jeho potenciálnu terapeutickú hodnotu preukázali aj klinické pokusy. Leukocytárne a fibroblastové interferóny majú veľmi zjavnú podobnosť vo svojich biologických vlastnostiach napriek skutočnosti, že stupeň homologity na aminokyselinovej úrovni je relatívne nízky. Po chemickej stránke obsahujú obidve skupiny interferónov od 165 do 166 aminokyselín a sú to bielkoviny stále protikyselinám.

Do tretej skupiny je zaradený ľudský imunitný interferón (gama-interferón, IIF alebo IFN-gama), označovaný tiež ako ľudský gama interferón. Ľudský' imunitný interferón ku ktorému sa vzťahuje predložený vynález, je na rozdiel od a- a β-interferónov labilný pri pH 2; je produkovaný hlavne po mitogenetickej indukcii lymfocytov a je tiež zreteľne antigénovo odlišný. Až donedávna sa ľudský imunitný interferón dal sledovať len vo veľmi nízkych hladinách, čo bolo evidentne prekážkou pri jeho charakterizácii. Nedávno boli publikované rozsiahle, ale ešte len čiastočné spôsoby čistenia ľudského imunitného interferónu (Yip et al., Proc. Nat. Acad. Sci (USA) 78, 1601 (1981)). Uvádza sa, že východisková zlúčenina bola vyprodukovaná z lymfocytámych kultúr stimulovaných kombináciou fytohemaglutinu s forbolesterom, a že bola čistená radom chromatografických delení. Týmto postupom bol získaný produkt, ktorý mal molekulovú hmotnosť 58 000.

Ľudský imunitný interferón bol vyprodukovaný vo veľmi malých množstvách transláciou mRNK (informačná ribonukleová kyselina) v oocytoch; produkt mal rysy interferónovej aktivity ľudského imunitného interferónu a postup dával nádej, že je možné syntetizovať a klonovať imunitnú inteferónovú cDNK (komplementárnu kyselinu dezoxyribonukleovú) (Taniguchi et al., Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 78, 3469(1981)).

Množstvá imunitného interferónu, ktoré boli doteraz získané, určite nepostačovali k vykonaniu jednoznačných pokusov, ktoré by charakterizovali prečistenú zlúčeninu a stanovili jej biologické vlastnosti. Napriek tomu však štúdie vykonané in vitro so surovými preparátmi, a tiež pokusy in vivo s prečistenými preparátmi gama-interferónu naznačili, že primárny význam imunitného inteferónu môže byť v jeho použití ako imunoregulačného činidla (Bloom, Náture 289, 593 (1980) a Sonnenfeld et al., Cellular Im

SK 279535 Β6 munol. 40, 285 (1978)). Imunitný interferón má nielen antivírusovú a protibunkovú účinnosť, spoločnú pre všetky ľudské interferóny, ale má tiež potenciačnú účinnosť týchto aktivít pri a- a β-interferóne (Fleishmann et al., Infection and Immunity 26, 248 (1979)). Tiež sa publikovalo, že in vitro antiproliferačná účinnosť gama-inteferónu na nádorové bunky je približne 10 x až 100 x vyššia ako podobná účinnosť interferónov iných skupín (Bloom, Náture 289, 593 (1980), Blalock et al., Cellular Immunology 49, 390 (1980) a Rudin et al., Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 77, 5928 (1980)). Tento výsledok, spolu s vyslovenou imunoregulačnou úlohou (Bloom, Náture 289, 593 (1980) a Sonnenfeld et al., Cellular Immunol. 40, 285 (1978), naznačuje oveľa vyššiu protinádorovú účinnosť zmieneného IFN-gama oproti lFN-α a IFN-β. Pokusy in vivo s myšími a murine IFN-gama preparátmi dokázali ich zreteľnú nadradenosť nad antivirusovo indukované inteferóny v ich protinádorovom účinku proti osteogénnemu sarkómu (Crane et al., J. Natl. Cancerlnst. 61, 871 (1978)).

Všetky uvedené štúdie vykonané pred týmto vynálezom boli vzhľadom na veľmi malú dostupnosť imunitného inteferónu vykonané s pomerne surovými preparátmi. Napriek tomu naznačili veľmi dôležité biologické vlastnosti imunitného interferónu. Imunitný interferón má nielen silnú antivírusovú účinnosť, ale pravdepodobne aj silnú imunoregulačnú a protinádorovú účinnosť, ktoré ho jasne určujú ako potencionálne nádejného kandidáta ku klinickým skúškam.

Technológia rekombinácie DNK

Technológia rekombinácie DNK dosiahla štádium, v ktorom ľahko dochádza k niektorým chybným záverom. Molekulárni biológovia sú schopní rekombinovať rôzne DNK sekvencie s určitou ľahkosťou, a vytvárajú nové DNK jednotky, ktoré sú schopné produkovať rozsiahle množstvá exogénnych bielkovinových produktov v transformovaných mikróboch. K dispozícii sú všeobecné prostriedky a metódy pre in vitro ligáciu rôznych fragmetntov DNK s tupým alebo lepivým (kohéznym) koncom, ktoré produkujú potencionálne nosiče schopné expresie, ktoré sa môžu používať na transformovanie špecifických organizmov, a tým zamerať ich účinnú syntézu na žiadaný exogénny produkt. Ale napriek tomu, vo vzťahu na individuálny produkt, zostáva uvedená cesta o niečo zložitejšia a veda doteraz nepokročila do štádia, kedy by už bolo možné správne predpovedať úspech. A skutočne ti, ktorí predpovedajú úspešné výsledky bez predloženia experimentálnymi výsledkami, konajú tak so značným rizikom neúčinnosti.

Plazmid, slučka bez chromozómov dvojvláknovej DNK, ktorá sa našla v baktériách a v iných mikróboch, často v mnohnásobných kópiách v jednej bunke, zostáva základným prvkom technológie rekombinácie DNK. V informácii zakódovanej v plazmidovej DNK je včlenená informácia potrebná k reprodukcii plazmidov do dcérskych buniek (t. j. začiatok replikácie) a zvyčajne jedna alebo viac fenotypových selekčných charakteristík, ako je v prípade baktérií rezistencia proti antibiotikám; tieto selekčné charakteristiky umožňujú, že klóny hostiteľskej bunky obsahujúce plazmid, ktorý je predmetom našeho záujmu, môžu byť rozlíšené, vybrané a prednostne pestované v selektívnom rastovom prostredí. Užitočnosť plazmidov spočíva v skutočnosti, že je možné ich špecificky štiepiť jednou alebo druhou reštrikčnou endonukleázou čiže reštrikčným enzýmom, pričom každá z týchto endonukleáz rozpoznáva na plazmidovej DNK odlišné, špecifické miesto štiepenia. Po rozštiepení je možné vložiť do plazmidov heterologické gény alebo fragmenty génov buď priamym pripojením v mieste rozštiepenia, alebo pripojením na rekonštruovaných koncoch susediacich s miestom rozštiepenia. Tým sa vytvorí tzv. replikovateľný nosič schopný expresie. Rekombinácia DNK sa vykoná mimo bunky, ale vzniknutý rekombinovaný replikovateľný, expresie schopný nosič alebo plazmid, je možné zavádzať do buniek postupom známym ako transformácia, a kultiváciou získaného transformantu je možné pripravovať veľké množstvá rekombinovaného nosiča. Okrem toho, podľa toho kde sa gén vhodne zavedie vzhľadom na časti plazmidov, ktoré riadia tmaskripciu a transláciu zakódovaných DNK informácií, je možné získaný nosič schopný expresie použiť na aktuálnu produkciu polypeptidickej sekvencie, pre ktorú je vstavaný gén kódovaný; tento postup sa v opise vynálezu označuje ako expresia.

Expresia je iniciovaná v oblasti známej ako promótor, ktorá je rozpoznávaná a na ktorú sa viaže RNK polymeráza. V transkripčnej fáze expresie sa DNK odvíja a vystavuje ako templát na zahájenie syntézy informačnej RNK z DNK sekvencie. Informačná RNK sa ihneď premieňa do formy polypepetidu, ktorý má takú aminokysclinovú sekvenciu, aká je zakódovaná v mRNK. Každý aminokyselina je zakódovaná jediným nukleotidickým tripletom alebo kodónom, ktorých určitý súbor tvorí štrukturálny gén, t. j. tú časť, ktorá kóduje sekvenciu aminokyselín exprimovaného polypeptidového produktu. Transláciaje iniciovaná štartovacím signálom (čo je zvyčajne kodón ATG, ktorý sa vo vzniknutej informačnej RNK stane AUG). Koniec translácie, a tým aj koniec produkovania ďalších aminokyselinových jendotiek, určujú tzv. stop - kodóny. Vzniknutý produkt sa dá získať lýzou hostiteľkej bunky, jeho oddelením od ostatných bielkovín a čistením, použitím vhodných metód.

V praxi sa môže použitím technológie rekombinácie DNK exprimovať buď len heterológny polypeptid - tzv. priama expresia, alebo sa alternatívne môže exprimovať heterológny polypeptid viazaný na časť aminokyselinovej sekvencie homológneho polypeptidu. V tomto prípade sa žiadaný bioaktivny produkt niekedy stáva v vnútri fúzovaného homológno-heterológneho polypepetidu bioaktívnym až dovtedy, pokiaľ nie je zmienený fúzovaný produkt rozštiepený v extracelulámom prostredí; pozri britský patent číslo 2 007 676 A a publikáciu Wetzela v časopise Američan Scientist 68, 664 (1980).

Technológia kultivácie buniek

Spôsob prípravy bunkových alebo tkanivových kultúr na štúdium genetiky a bunkovej fyziológie je dobre prepracovaný. Sú k dispozícii prostriedky a metódy na udržiavanie permanentných bunkových línii, pripravených postupnými sériovými prenosmi z izolátu normálnych buniek. Na výskumné využitie sa takéto bunkové línie udržujú buď na pevnom nosiči v kvapalnom prostredí, alebo kutliváciou v suspenzii, ktorá obsahuje podporné živné látky. Zväčšovanie laboratórnych kutlivácií do veľkých výrobných násad je podľa všetkého spojené len s mechanickými problémami. Pokiaľ sa týka ďalších údajov, odkazujeme na monografiu Microbiology, 2. vydanie, Harper a Row Inc., Hagerstown, Maryland (1973) zvlášť na str. 1122 a ďalšie, a na časopis Scietific Američan 245, str. 66 a ďalšie (1981).

Podstata vynálezu

Predmetom vynálezu je ľudský imunitný interferón a jeho drivát, obidva s aminokyselinovou sekvenciou, znázornenou na pripojenom obr. 5, bez iného proteínu, s ktorým je obyčajne združený, ako i jeho alely.

Derivát ľudského imunitného interferónu s aminokyselinovou sekvenciou podľa obr. 5 a jeho alela majú vo forme kyselinového derivátu funkciu ľudského imunitného interferónu.

Výhodný derivát ľudského imunitného interferónu obsahuje aminokyselinový metionín na N-konci, najmä zrelej sekvencie.

Ľudský imunitný interferón s aminokysclinovou sekvenciou, znázornenou na obr. 5, alebo jeho alela, alebo derivát s funkciou ľudského imunitného interferónu, môžu byť bez pridruženej prirodzenej glykozylácie.

Ľudský imunitný interferón s aminokyselinovou sekvenciou podľa obr. 5, alebo jeho alela, alebo derivát s funkciou ľudského imunitného interferónu sú vytvárané expresiou DNA, kódujúcu aminokyselinovú sekvenciu interferónu, v rekombinantnej hostiteľskej bunke.

Ľudský imunitný interferón môže byť vytváraný expresiou kódujúcej rekombinantnej DNA sekvencie v bunkovej línii cicavcov, pričom bunkovou líniou cicavcov je najmä bunková línia COS-7 opíc.

Predmetom tohto vynálezu je tiež izolát DNA obsahujúci DNA sekvenciu, kódujúcu ľudský interferón, s aminokyselinovou sekvenciou, znázornenou na obr. 5, alebo jeho alela, alebo derivát s funkciou ľudského imunitného interferónu.

Ďalším predmetom vynálezu je rekombinantný klonovací vektor obsahujúci DNA sekvenciu, kódujúcu ľudský imunitný interferón, s aminokyselinovou sekvenciou podľa obr. 2, alebo jeho alela, alebo derivát s funkciou ľudského imunitného interferónu.

Predmetom tohto vynálezu jc tiež replikovateľný expresný vektor schopný exprimovať v transformantnom mikroorganizme alebo bunkovej kultúre DNA sekvenciu kódujúcu ľudský imunitný interferón, s aminokyselinovou sekvenciou znázornenou na obr. 5, alebo jeho alela, alebo derivát s funkciou ľudského imunitného interferónu.

Iným predmetom vynálezu je rekombinantný mikroorganizmus alebo bunková kultúra schopné exprimovať imunitný interferón s aminokyselinovou sekvenciou podľa obr. 5, alebo jeho alela, alebo derivát s funkciou ľudského imunitného interferónu.

Výhodným rekombinantným mikroorganizmom je kmeň E. coli alebo kvasinkový kmeň.

Bunkovou kultúrou je bunková línia cicavcov, najmä bunková línia opíc.

Ďalším predmetom tohto vynálezu je farmaceutický prípravok na liečenie tumorových alebo vírusových ochorení alebo imunosupresívnych stavov, ktorý ako účinnú látku obsahuje terapeuticky účinné množstvo ľudského imunitného interferónu podľa vynálezu v spojení s farmaceutický prijateľným nosičom, najmä určený na parenterálne podávanie.

Predmetom tohto vynálezu je ďalej spôsob výroby ľudského imunitného interferónu. Pritom sa rekombinantné hostiteľské bunky premenené expresným vektorom, obsahujúcim DNA kódujúcu ľudský imunitný interferón s aminokyselinovou sekvenciou, znázornenou na obr. 5, alebo jeho alelu, alebo derivát s funkciou ľudského imunitného interferónu, kultivujú v podmienkach umožňujúcich expresiu uvedenej DNA sekvencie za vzniku ľudského imunitného inteferónu, ktorý sa potom izoluje.

Posledným predmetom tohto vynálezu je použitie ľudského imunitného interferónu podľa vynálezu na prípravu farmaceutických prípravkov na liečenie tumorových alebo vírusových ochorení, alebo imunosupresívnych stavov.

Vynález je založený na zistení autorov, že sa technológia rekombinácie DNA dá úspešne používať na výrobu ľudského imunitného interferónu, výhodne v jeho priamo použiteľnej forme a to v množstvách dostatočných na začatie a uskutočnenie testov na zvieratách a klinických skúšok, ako nevyhnutného predpokladu na schválenie komerčných zámerov. Uvedenou technológiou získaný produkt je vhodný, vo všetkých svojich formách, na použitie na profylaktické alebo terapeutické ošetrovanie pacientov s vírusovými infekciami alebo s malígnymi, imunosuprimovanými alebo imunodeficitnými stavmi. Pod pojmom rôzne formy imunitného interferónu sú zahrnuté rôzne možné oligomérne formy, ktoré môžu zahrnovať i glykozylované formy. Produkt je možné vyrábať geneticky skonštruovanými transformovanými mikroorganizmami alebo systémami transforovaných bunkových kultúr. Termín transformovaná bunka, ako je tu používaný, sa týka buniek, do ktorých bola vložená DNA. Táto DNA vznikla rekombináciou exogénnej DNA. Termín transformovaná bunka, ako je tu používaný, sa týka potomstva akejkoľvek takejto kultúry, ktorá obsahuje takto zavedenú DNA.

Existuje tak teraz potenciál, ako pripraviť a izolovať ľudský imunitný interferón účinnejším spôsobom ako to bolo možné doteraz. Významným rysom predloženého vynálezu v jeho najvýhodnejšom uskutočnení je uskutočnenie genetického riadenia mikroorganizmu alebo bunkovej kultúry tak, aby produkovali ľudský imunitný interferón v izolovateľných množstvách, vylučovaných z hostiteľskej bunky v maturovanej forme.

Vynález sa týka ľudského imunitného interferónu produkovaného uvedeným postupom, prostriedkov a spôsobov na jeho výrobu. Vynález sa týka ďalej replikácie schopných DNK nosičov schopných expresie, ktoré obsahujú zakotvené génové sekvencie kódujúce ľudský imunitný interferón v exprimovateľnej forme. Vynález je tiež zameraný na kmene mikroorganizmov alebo na bunkové kultúry transformované opísanými nosičmi, schopnými expresie a na mikrobiálne alebo bunkové kultúry takto transformovaných kmeňov alebo kultúr, ktoré sú schopné produkovať ľudský imunitný interferón. Z iného pohľadu sa vynález týka rôznych postupov použiteľných na prípravu sekvencií génu na uvedený imunitný inteferón, DNK nosičov schopných expresie, potrebných kmeňov mikroorganizmov a bunkových kultúr, a ďalších špecifických prostriedkov. Vynález je tiež zameraný na prípravu fermentačných kultúr zmienených mikroorganizmov a bunkových kultúr. Vynález sa týka aj prípravy ľudského imunitného interferónu ako produktu priamej expresie, vylučovaného z hostiteľskej bunky v maturovanej forme. Týmto postupom sa môže využiť gén, ktorý· kóduje sekvenciu maturovaného ľudského imunitného interferónu plus 5' susediacou DNK, ktorá kóduje signálny polypeptid. Predpokladá sa, že signálny polypepetid podporuje transport molekuly k bunkovej stene hostiteľského organizmu, kde sa štiepi počas procesu vylučovania maturovaného ľudského interferónu. Tento spôsob umožňuje, že sa požadovaný maturovaný imunitný interferón môže izolovať a čistiť bez použitia postupov určených na elimináciu nečistôt povahy bunkových zvyškov alebo intracelulárnych bielkovín hostiteľa.

Výraz maturovaný ľudský imunitný interferón znamená mikrobiálnu alebo bunkovú kultivačnú produkciu ľudského imunitného interferónu, ktorý nie je sprevádzaný signálnym peptidom, alebo presekvenčným pepetidom, ktorý bezprostredne sprevádza transláciu ľudskej imunitnej interferónovej mRNK. Podľa vynálezu sa zistilo, že prvý rekombinantný ľudský imunitný interferón má vo svojej sekvencii ako prvú aminokyselinu metionín (prítomný prostredníctvom ATG štartovacieho signálneho kodónu, vloženého na začiatok štrukturálneho génu) alebo v prípade, že metionín je intra- alebo extracelulárne odštiepený, svoju normálne prvú aminokyselinu cysteín. Maturovaný ľudský imunitný interferón môže byť tiež podľa vynálezu produkovaný spolu s konjugovanou bielkovinou iného druhu ako je zvyčajný signálny polypeptid, pričom zmienený konjugát sa dá špecificky štiepiť v intra- alebo extracelulárnom prostredí; pozri tiež britský patent číslo 2 007 676 A. Potom môže byť produkovaný maturovaný ľudský imunitný interferón aj priamou expresiou, bez potreby odštiepenia akéhokoľvek cudzieho, nadbytočného polypeptidu. Tento spôsob je zvlášť významný vtedy, keď použitý hostiteľ nemôže, alebo nemôže dostatočne účinne, odstrániť signálny peptid v prípade, že nosič schopný expresie je určený k expresii maturovaného ľudského interferónu spolu s naviazaným signálnym peptidom. Vyprodukovaný maturovaný ľudský imunitný interferón sa izoluje a čistí až do úrovne vhodnej na použitie pri ošetrovaní vírusových, malígnych, imunosuprimovaných alebo imunodefícitných stavov.

Podľa vynálezu sa ľudský imunitný interferón získava nasledujúcim postupom:

1. Ľudské tkanivá, napríklad tkanivo ľudskej sleziny alebo periférne krvné lymfocyty, sa kultivujú v prítomnosti mitogénov, ktoré stimulujú produkciu imunitného interferónu.

2. Bunkové pelety z uvedených bunkových kultúr sa extrahujú v prítomnosti inhibítora ribonukleázy a izolujú sa všetky cytoplazmické RNK.

3. Na stĺpci oligo-deoxytyminribozidu (oligo-dT) sa izoluje celková mRNK v polyadenylátovej forme. Táto mRNK sa frakcionuje podľa veľkosti molekuly použitím sacharózovcho gradientu s rôznou hustotou a elektroforézy na kyselino-močovinovom géli.

4. Vhodná mRNK (s molekulovou hmotnosťou zodpovedajúcou sedimentačnej konštante 12 až 18S) sa prevedie na zodpovedajúcu dvojvláknovú komplementárnu DNK (cDNK). Po jej zakončení polydeoxycytidínom (poly-dC) sa vykoná inzercia tejto cDNK do vhodného vektora, napríklad do plazmidu, ktorý nesie jeden alebo viac fenotypových markérov.

5. Takto pripravené vektory sa použijú na transformáciu bakteriálnych buniek, z ktorých sa zostaví banka kolónií. Rádioaktívne označená cDNK pripravená z indukovanej ale aj z neindukovanej mRNK, odvodenej uvedeným spôsobom, sa použije na separátne preskúmanie duplikátu banky kolónií. Prebytočná cDNK sa potom odstráni a kolónie sa exponujú na film citlivý na X-lúče a tak sa identifikujú klóny s indukovanou cDNK.

6. Z klónov obsahujúcich indukovanú cDNK sa izoluje zodpovedajúca plzamidická DNK a vykoná sa stanovenie sekvencie báz nukleových kyselín.

7. V prvom usporiadaní sa potom DNK so stanovenou sekvenciou prispôsobí in vitro k inzercii do vhodného nosiča schopného expresie, ktorý sa potom použije k transformovaniu hositeľskej bunky E. coli, ktorá sa následne podrobí kultivácii v živnom prostredí, pri ktorej dochádza k expresii žiadaného ľudského imunitného interferónu.

8. Takto exprimovaný ľudský imunitný inteferón má v svojej maturovanej fome určite 146 aminokyselín, začína aminokyselinou cysteínom a má veľmi bázický charakter. Jeho monomerická molekulová hmotnosť bola vypočítaná na 17 140. Pravdepodobne v dôsledku prítomnosti mnohých bázických zvyškov, hydrofobicity, tvorby soľných mostíkov a podobných vplyvov sa jeho molekuly navzájom spájajú do oligomémych foriem, napríklad do formy diméru, triméru alebo tetraméru. Vysoké molekulové hmotnosti pozorované pri prirodzenom materiáli (Yip et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 78, 1601 (1981)), ktoré nemôžu byť vysvetlené len na základe samej aminokyselinovej sekvencie, môžu byť pripočítané na stranu uvedeným oligomérnym formám a tiež príspevku sacharidov z glykolyzácie, ku ktorej dochádza po translácii.

9. Maturovaná forma ľudského imunitného interferónu je v niektorých hostiteľkých bunkových systémoch, zvlášť keď je viazaná na nosič schopný expresie tak, aby bola exprimovaná spoločne s jeho signálnym peptidom, vylučovaná do živného prostredia bunkovej kultúry, čo významne pomáha pri izolácii produktu a pri čistiacich postupoch.

Výhodné vykonanie spôsobu podľa vynálezu je podrobne opísané.

A. Mikroorganizmy a bunkové kultúry

1. Bakteriálne kmene a promótory

Práce uvedené v opise vynálezu boli vykonané s použitím, okrem iných, mikroorganizmu Escherichia coli ΚΙ 2, kmeňa 294 (zakončenie A, thi-, hsr-, j<hsm^_), ktorý je opísaný v britskej patentovej publikácii číslo 2 055 382 A. Tento kmeň je uložený v Americkej zbierke typových kultúr (ATCC) pod ATCC príjmovým číslom 31 446. Použiteľné sú však i mnohé iné mikrobiálne kmene, ako aj známe kmene E. coli, napríklad E. coli B, E. coli x 1776 (ATCC číslo 31 537) a E. coli W 3110 F-, λ-, protrofický) (ATCC číslo 27 325), alebo ďalšie mikrobiálne kmene, z ktorých mnohé sú uložené a potenciálne dostupné v uznávaných ústavoch na ukladanie mikroorganizmov, ako už v menovej Americkej zbierke typových kultúr (ATCC); pozri ATCC katalógový zoznam. Pozri tiež NSR patentový zverejňovací spis 2 644 432. Ako príklad týchto ďalších mikroorganizmov je možné uviesť rôzne druhy Bacilli, ako je Bacillus subtilis a iné enterobakteriálne mikroorganizmy, z ktorých sú za zmienku napríklad mikroorganizmy Salmonella typhimurium a Serratia marcesans, využívajúce plazmidy, ktoré môžu replikovať a exprimovať heterolgické génové sekvencie, ktoré obsahujú.

Na iniciáciu a udržiavanie mikrobiálnej produkcie heterológnych polypeptidov je možné výhodne používať napríklad beta-laktamázové a laktózové promótorové systémy.

2. Kvasinkové kmene a kvasinkové promótory

Systém schopný expresie týchto mikroorganizmov môže byť tiež využívaný plazmidom YRp7 (Stinchcomb ct al., Narutre 282, 39 (1979), Kingsman et al., Gene 7, 141 (1979) a Tschumper et al., Gene 10, 157 (1980)), ktorý je schopný selekcie a replikácie tak v mikroorganizme E. coli, ako i v kvasinkách Sacharomyces cerevisiae. Pre selekciu v kvasinkách obsahuje tento plazmid gén TRPÍ (Stinchcomb et al., Náture 282, 39 (1979), Kingsman et al., Gene 7, 141 (1979) a Tschumper et al., Gene 10, 157 (1980)), ktorý doplňuje (t. j. pripúšťa rast v neprítomnosti tryptofanu) kvasinky, ktoré majú mutácie na tomto géne (objavené na chromozóme IV kvasiniek, Mortimer et al., Microbiological Reviews 44, 519 (1980). Pri spôsobe podľa vynálezu je používaný kvasinkový kmeň RH 218 (Miozzari et al., Journal of Bacteriology 134, 48 (1978)), ktorý je uložený v Americkej zbierke typových kultúr pod ATCC číslom 44 076. Je však zrejmé, že akýkoľvek kmeň Sacharomyces cerevisiae obsahujúci mutáciu, ktorá vytvára bunkový typ 1, môže byť účinným prostredím k expresii plazmidov, ktoré obsahujú systém schopný expresie. Príkladom ďalšieho kmeňa, ktorý sa môže používať na tieto účely, je pep4-l (Jones, Genetics 85, 23 (1977)). Tento tryptoľanový auxotrofný kmeň má tiež bodovú mutáciu v TRPÍ géne.

Keď sa umiestni na 5'-stranu nekvasinkového génu 5^a-priľahlá DNK sekvencia (promótor) a z kvasinkového génu (pre alkoholdehydrogenázu 1), môže tento gén podporovať expresiu cudzieho génu v kvasinkách, keď sa umiestni do plazmidu použitého k transformovaniu kvasinky. Správna expresia nekvasinkového génu v kvasinkách vyžaduje vedľa promótora ešte druhú kvasinkovú sekvenciu umiestnenú na 3'-konci nekvasinkového génu v plazmide, ktorá umožňuje vhodnú termináciu transkripcie a polyadenylácie v kvasinkách. Vo výhodnom prevedení sa 5' priľahlá sekvencia kvasinkového 3-fosfoglycerátkinázového génu (Hitzeman, et al., J. Biol. Chem. 255, 12073 (1980)) umiestnia proti prúdu od štrukturálneho génu a potom nasleduje opäť DNK obsahujúca signály pre termináciu - polyadenyláciu, napríklad TRPÍ gén (Stinchcomb et al., Náture 282, 39 (1979), Kingsman et al., Gene 7, 141 (1979) a Tschumper et al., Gene 10, 157 (1980)) alebo fosfoglycerátkinázový gén (PGK) (Hitzeman, et al., J. Biol. Chem. 255, 12073 (1980)).

Pretože kvasinková 5' - priľahlá sekvencia (v spojení s 3' - kvasinkovou terminálnou DNK) môže fungovať ako promótor expresieschopných cudzorodých génov v kvasinkách, je možné analogicky predpokladať, že sa pre expresiu dôležitých génových produktov môže používať 5'priľahlých sekvencií akéhokoľvek vysoko exprimovaného kvasinkového génu. Pretože pri niektorých okolnostiach exprimujú kvasinky až 65 % svojej rozpustnej bielkoviny vo forme glykolytických enzýmov [Hess et al., J. Ady. Enzýme Regúl. 7, 149 (1968)] a pretože sa ukazuje, že toto vysoké množstvo vyplýva z produkcie vysokých hladín individuálnych mRNK [Holland et al., Biochemistry 17, 4900 (1978)], bolo možné používať 5' - priľahlých sekvencií akéhokoľvek iného glykolitického génu na uvedené exprimačné účely, napríklad enolázy, glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázy, hexokinázy, pyruvátdekarboxylázy, fosfofruktokinázy, glukózo-6-fosfátizomerázy, 3-fosfoglycerátmutázy, pyruvátkinázy, triozofosfátizomerázy, fosfoglukózoizomerázy a glukokinázy. Akékoľvek 3'-priľahlé sekvencie týchto génov by bolo možné používať tiež na vhodnú termináciu a mRNK polyadenyláciou v takomto expresie schopnom systéme. Niektoré iné vysokoexprimované gény sú napríklad gény pre kyslé fosfatázy [Bostian et al., Prac. Natl. Acad. Sci. (USA) 77, 4504 (1980)] a gény, ktoré exprimujú vysoké hladiny produktov v dôsledku mutácií v 3' - priľahlých oblastiach (mutanty, ktoré zvyšujú expresiu), zvyčajne v dôsledku prítomnosti TY 1 prevoditeľného prvku [The Molecular Biology of Yeast (Aug

11-18, 1981), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York],

Predpokladá sa, že všetky uvedené gény sú transkribované kvasinkovou RNK polymerázou II [The Molecular Biology of Yeast (Aug 11-18, 1981), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York], Je možné, aby v podobných konštrukciách schopných expresie boli tiež použiteľné RNK polymerázy I a III, ktoré transkribujú gény pre ribozomálne RNK, 5 S RNK a tRNK [The Molecular Biology of Yeast (Aug 11-18, 1981), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York a Chambon, Ann. Rev. Biochemistry, 44, 613 (1975)].

Mnohé kvasinkové promótory obsahujú tiež transkripčné kontroly, takže ich možno odpojiť alebo zapojiť zmenou rastových podmienok. Ako príklady takýchto kvasinkových promótorov je možné uviesť gény, ktoré produkujú nasledujúce bielkoviny: alkoholdehydrogenáza II, izocytochróm-c, kyslá fosfatáza, degradačné enzýmy spojené s metabolizmom dusíka, glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenáza a enzýmy zodpovedné za využívanie maltózy a galaktózy [Holland et al., Biochemistry 17, 4900 (1978)]. Uvedená kontrolná oblasť by mohla byť veľmi užitočná pri kontrole expresie bielkovinového produktu, zvlášť keď tieto produkty sú toxické proti kvasinke. Tiež by bolo možné pripojiť kontrolnú oblasť jednej 5' - priľahlej sekvencie na 5' - priľahlú sekvenciu, ktorá obsahuje promótor z vysoko exprimovaného génu. Viedlo by to však k hybridnému promótoru a bolo by to možné, pretože sa zdá, že kontrolná oblasť a promótor majú fyzikálne odlišné DNK sekvencie.

3. Systémy bunkových kultúr a vektory bunkových kultúr

Propagácia buniek stavovcov v kultúre (tkanivová kultúra ) sa stala v posledných rokoch rutinnou záležitosťou. Pri spôsobe podľa vynálezu sa používali fibroblasty z obličiek opíc línie COS-7 ako hostitelia na produkciu imunitného interferónu [Gluzman, Celí 23, 175 (1981)]. Ale pokusy, ktoré sú tu detailne opísané, je možné vykonať s akoukoľvek bunkovou líniou, ktorá je schopná replikácie a expresie kompatibilného vektora, napríklad s bunkovými líniami WI 38, ΒΗΚ, 3T3, CHO, VERO a HeLa buniek. Pokiaľ sa týka požiadaviek na expresie schopný vektor, vyžaduje sa tiež prítomnosť zdroja replikácie a promótora umiestneného v čele exprimovaného génu, spolu s požiadavkou prítomnosti ribozómových viažucich miest, miest na spájanie RNK, miest na polyadenyláciu a sekvencie na transkripčné terminátory. I keď tieto základné prvky obsiahnuté vo víruse SV 40 sú využívané pri spôsobe podľa tohto vynálezu, je potrebné zdôrazniť, že vynález, aj keď je opísaný na príkladoch výhodného prevedenia, nie je obmedzený len na tieto sekvencie. Tak napríklad je možné používať ako zdroje replikácie iné vírusové vektory (napríklad polyoma, adeno, VSV, BPV a tak ďalej), a tiež bunkové zdroje DNK replikácie, ktoré môžu plniť svoju funkciu v neintegrovanom stave.

B. Vektorové systémy

1. Priama expresia maturovaného imunitného interferónu v E. coli.

Postup použitý na dosiahnutie priamej expresie imunitného IFN-gama v mikroorganizme E. coli vo forme maturovaného interferónového polypeptidu (mínus signálna sekvencia) je variantom postupu použitého predtým na expresiu ľudského rastového hormónu [Goeddel et al.. Náture 281, 544 (1979] a ľudského leukocytárneho interferónu [Goeddel et al., Náture 287, 411 (1980)], pokiaľ sa týka kombinácie syntetických (N-terminálnych) a cDNK kyselín.

Uvažovalo sa, že z nukleotidickej sekvencie plazmidu p 69, ktorý je opísaný, a z porovnania so známym miestom štiepenia medzi signálnym peptidom a maturovaným polypeptidom v prípade niekoľkých interferónov IFN-α [Goeddel et al., Náture 290, 20 (1981)], má interferón IFN-gama hydrofóbny signálny peptid s 20 aminokyselinami nasledovaný 146 aminokyselinami maturovaného IFN-gama (pozri obrázok 5). Ako je znázornené na obrázku 7, miesto štiepenia reštrikčnou endcnukleázou BstNl je umiestnené výhodne pri aminokyseline 4 maturovaného IFN-gama. Boli zostavené dva syntetické deoxyoligonukleotidy, ktoré obsahujú ATG kodón pre iniciáciu translácie, kodóny pre aminokysliny 1, 2 a 3 (cysteín - tyrozín - cysteín) a vytvárajú EcoRI kohézny koniec. Tieto deoxyoligonukleotidy boli naviazané na BstNl až PstI fragment plazmidu p69 so 100 pármi báz a bol skonštruovaný synteticko-prirodzený hybridný gén so 1115 pármi báz, ktorý kóduje interferón IFN-gama a ktorý je viazaný EcoRI a PstI reštrikčnými miestami. Tento gén bol vložený do plazmidu pLelF A typ 103 medzi jeho EcoRI a PstI reštrikčné miesta a bol získaný plazmid pIFN-gama typ 48 schopný expresie. V tomto plazmide je exprimovaný IFN-gama gén pod kontrolou typ promótora E. coli. Plazmid pLelF A typ 103 je derivátom plazmidu pLelF A 25, v ktorom EcoRI reštrikčné miesto umiestnené na povrchu LelF A génu bolo odstránené; postup používaný na odstránenie tohto EcoRI miesta bol opísaný už skôr [Itakuraetal., Science 198, 1056 (1977)].

2. Expresia v kvasinkách

S cieľomom expresie heterológncho génu, ako je cDNK pre imunitný interferón, v kvasinke je potrebné skonštruovať plazmidický vektor, ktorý obsahuje štyri komponenty. Prvým komponentom je časť, ktorá berie do úvahy transformáciu obdivoch mikroorganizmov, tak E. coli ako aj kvasinky, a preto musí obsahovať gén schopný výberu z každého tohto organizmu; v prípade spôsobu podľa vynálezu je to gén pre ampicilínovú rezistenciu z E. coli a gén TRPÍ z kvasiniek. Tento komponent vyžaduje tiež zdroj replikácie z obidvoch organizmov, aby sa mohla udržovať plazmidická DNK v obidvoch organizmoch; v tu uvedenom prípade jc to E. coli zdroj z plazmidu pBR 322 a ars 1 zdroj z chromozómu III kvasinky.

Druhým komponentom plazmidu je 5' - priľahlá sekvencia z vysoko exprimovaného kvasinkového génu, ktorá podporuje transkripciu „po prúde“ umiestneného štrukturálneho génu. V prípade tu uvedenom, sa ako 5' - priľahlá sekvencia používa sekvencia z kvasinkového génu pre 3-fosfoglycerátkinázu (PGK). Tento fragment bol skonštruovaný takým spôsobom, že bol odstránený ATG kodón z PGK štrukturálnej sekvencie a ďalej ešte 8 párov báz (bp) „proti prúdu“ od tohto ATG. Uvedená sekvencia bola nahradená sekvenciou, ktorá obsahuje nielen Xbal ale aj EcoRI reštrikčné miesta, s cieľom vhodného naviazania tejto 5' - priľahlej sekvencie na štrukturálny gén.

Tretím komponentom systému je štrukturálny gén, ktorý bol skonštruovaný takým spôsobom, aby obsahoval nielen ATG štartovací signál pre transláciu, ale aj ATG stop signál pre transláciu. Izolácia a skonštruovanie takéhoto génu je opísané.

Štvrtým komponentom je kvasinková DNK sekvencia, obsahujúce 3' - priľahlú sekvenciu kvasinkového génu, ktorá obsahuje vhodné signály na zakončenie transkripcie a na polyadenyláciu.

Keď sú prítomné všetky uvedené komponenty, môže byť v kvasinkách produkovaný imunitný interferón.

3. Expresia v bunkovej kultúre cicavcov

Stratégia syntézy imunitného interferónu v bunkovej kultúre cicavcov spočíva na vyvinutí vektora schopného nielen autonómnej replikácie, ale i expresie cudzorodého génu kontrolou heterológnej transkripčnej jednotky. Replikácie tohto vektora v tkanivovej kultúre boli dosiahnuté tým, že sa získal zdroj DNK replikácie (odvodený od vírusu SV 40) a že sa umožnila pomocná funkcia (T antigén) zavedením vektoru do bunkovej línie, ktorá endogénne exprimuje tento antigén [Lusky et al., Náture 293, 79 (1981) a Gluzman et al., Cold Spring Harbor...]. Niekdajší promótor vírusu SV 40 predchádza štrukturálny gén interferónu a zaisťuje transkripciu génu.

Vektor, používaný na dosiahnutie expresie interferónu IFN-gama sa skladá zo sekvencií plazmidu pBR 322, ktoré zabezpečujú nielen voliteľný markér pre selekciu v E. coli (ampicilínovú rezistenciu), ale aj E. coli zdroj pre DNK replikáciu. Tieto sekvencie sú odvodené z plazmidu pML-1 [Lusky et al., Náture 293, 79 (1981)] a obsahujú oblasť, ktorá zahrnuje EcoRI a BamHl reštrikčné miesta. Zdroj SV 40 je odvodený z PvuII až Hindlll fragmentu s 342 pármi báz, ktorá zahrnuje túto oblasť [Fiers et al., Náture 273, 113 (1978) a Reddy et al., Science 200, 494 (1978)]; obidva konce sú pritom prevedené na EcoRI zakončenie. Tieto sekvencie, okrem toho, že obsahujú vírusový zdroj DNK replikácie, kódujú promótor nielen pre prvotnú ale aj pre neskoršiu transkripčnú jednotku. Orientácie oblasti zdroja SV 40 je taká, že promótor je pre neskoršiu transkripčnú jednotku umiestnený bližšie ku génu kódujúcemu interferón.

Autori vynálezu predpokladali, že aplikácia technológie rekombinácie DNK by bola najefektívnejšou cestou na zaistenie potrebného veľkého množstva ľudského imunitného interferónu. Či už bude alebo nebude takto vyprodukovaný materiál glykozylovaný, čo sa pokladá za charakteristické pre natívnu, z ľudských zdrojov získanú surovinu, bude pravdepodobne mať bioaktivitu umožňujúcu jeho klinické použitie na liečenie širokého okruhu vírusových, neoplastických a imunosuprimovaných stavov alebo ochorení.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Na obrázku 1 je znázornená sacharózová gradientová centrifugácia indukovanej periférnej krvnej lymfocytámej (PBL) poly (A) + RNK (5 až 25 % sacharóza v 70 % formamide). Boli pozorované dve maximá interferónovej aktivity (ako je znázornené vyčiarkovanými stĺpcami) veľkosti odpovedajúcej sedimentačnej konštante 12S a 16S. Umiestnenie ribozomálnych RNK markérov (ktoré boli odstreďované nezávisle) je označené nad krivkou absorbance.

Na obrázku 2 je znázornený priebeh elektroforézy indukovanej PBL poly (A) + RNK na kyselino-močovinovej agaróze (1,75 % agaróza v 6 M močovine). Pozorovaný bol len jeden vrchol aktivity, ktorý sa pohybuje spoločne so štandardou RNK vo veľkosti 18S. Polohy ribozomálnych RNK markérov, ktoré boli podrobené súčasne elektroforéze na vedľajšej dráhe a ktoré boli detegované vyfarbením etidiumbromidom, sú označené nad profilom aktivity.

Obrázok 3 znázorňuje hybridizačné vzorky 96 kolónií s indukovanými a neindukovanými sondami cDNK, značenými rádioaktívnymi 32p Na mikrotitračnej doštičke bolo vypestovaných 96 individuálnych transformantov, bola zhotovená ich kópia na dvoch nitrocelulózových membránach a potom boli membrány hybridizované so skúšobnými vzorkami 32p._c£)NK, pripravenými buď z indukovanej mRNK (horný obrázok), alebo z mRNK izolovanej z neredukovaných PBL kultúr (neredukované sondy, spodný obrázok ). Membrány boli premyté, aby sa odstránila nehybridizovaná RNK a potom boli exponované na film citlivý na X-lúče. Uvedený súbor membrán je reprezentatívnym typom 86 takýchto súborov (8300 nezávislých kolónií). Príklad „indukovaného klónu“ je označený ako H 12.

Na obrázku 4 je znázornená mapa reštrikčných endonukleázových miest klónu 69 s cDNK inzerciou. cDNK inzercia je naviazaná PstI reštrikčnými miestami (na obrázku znázornené malými krúžkami na obidvoch koncoch) a oligo dC-dG úsekmi (znázornené jednoduchou čiarou na obidvoch koncoch). Počet a veľkosť fragmentov, ktoré vznikli štiepením reštrikčnými nukleázami bol stanovený elektroforézou na 6 % akrylamidovom géli. Umiestnenie reštrikčných miest bolo potvrdené stanovením sekvencie nukleotidov (uvedené na obrázku 5). Kódovacia oblasť najväčšej otvorenej čítacej jednotky je označená prázdnym rámčekom, vyčiarkovaná oblasť označuje predpokladanú sekvenciu signálneho peptidu s 20 zvyškami a vybodkovaná oblasť znamená sekvenciu maturovaného IIF so 146 aminokyselinami. 5'-koniec mRNK je na ľavej strane obrázka, zatiaľ čo 3'-koniec je napravo.

Na obrázku 5 je znázornená nukleotidiová sekvencia cDNK inzercie plazmidu p69, ktorá ilustruje najbežnejšiu alelickú formu IFN-gama. Tiež je uvedená predpokladaná aminokyselinová sekvencia najdlhšej otvorenej čítacej jednotky. Predpokladaná signálna sekvencia je reprezentovaná zvyškami označenými SI až 520.

Na obrázku 6 je znázornené porovnanie štruktúry imunitného IFN-gama mRNK s analogickou štruktúrou leukocytámeho (IFN-α) a fibroblastového (IFN-β) interferónu. mRNK z klónu 69 (označená ako imúnna) obsahuje signifikantne väčšie množstvá nepreložených sekvencií.

Na obrázku 7 je uvedený schematický diagram skonštruovania plazmidu pIFN-gama typ 48 exprimujúceho interferónu IFN-gama. Východiskovým materiálom pre uvedenú konštrukciu je PstI cDNK inzercia plazmidu p69 s 1250 pármi báz.

Na obrázku 8 je znázornený diagram plazmidu používaného na expresiu IFN-gama v opičích bunkách.

Na obrázku 9 je znázornená Southemova hybridizácia ôsmich rôznych ľudských genomových DNK štiepených reštrikčným enzýmom EcoRI a hybridizovaných s 32p značeným Ddel fragmentom cDNK inzercie plazmidu p69 so 600 pármi báz. Dva uvedené EcoRI fragmenty zreteľne hybridizujú so skúšobnou vzorkou v každej DNK vzorke.

Na obrázku 10 je znázornená Southemova hybridizácia fragmentov získaných štiepením ľudskej genomovej DNK šiestimi rôznymi reštrikčnými endonukleázami a hybridi zovaných s 32p značenou skúšobnou vzorkou z plazmidu p69.

Na obrázku 11 je schematicky znázornená reštrikčná endonukleázová mapa inzercie HindlII vektora pBI s 3100 pármi báz, z ktorej bol izolovaný PGK promótor. Je uvedená inzercia EcoRI a Xbal reštrikčného miesta v 5' -priľahlej DNK PGK génu pre 3-fosfoglycerát.

Na obrázku 12 je uvedená 5' -priľahlá sekvencia plus iniciačná kódovacia sekvencia pre PGK gén pred inzerciou Xbal a EcoRI reštrikčných miest.

Na obrázku 13 je schematicky znázornená pracovná technika použitá na inzerciu Xbal miesta do polohy 8 v PGK promótore a na izoláciu fragmentu s 39 pármi báz z 5' -priľahlej sekvencie PGK, ktorá obsahuje toto Xbal zakončenie a Sau3A zakončenie.

Na obrázku 14 je schematicky znázornené skonštruovanie fragmentu s 300 pármi báz, obsahujúceho uvedený fragment s 39 pármi báz, ďalší PGK 5' -priľahlú sekvenciu (s 265 pármi báz) od Pvul až po Sau3A reštrikčné miesto (pozri obrázok 11), a EcoRI reštrikčné miesto susediace s Xbal miestom.

Na obrázku 15 je schematicky znázornené skonštruovanie fragmentu PGK promótora s 1500 pármi báz (HindlII až EcoRI), ktorý obsahuje, okrem fragmentu skonštruovaného podľa obrázku 14, fragment HindlII až Pvul s 1300 pármi báz z PGK 5' -priľahlej sekvencie (pozri obrázok 11).

Na obrázku 16 je znázornené zloženie expresie schopného vektora pre ľudský imunitný interferón v kvasinke, obsahujúci modifikovaný PGK promótor, interferónovú IFN-gama, cDNK a terminačnú oblasť kvasinkového PGK génu, ako je podrobnejšie opísané v nasledujúcom opise.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad

A. Zdroj interferónovej IFN-gama mRNK

Periférne krvné lymfocyty (PBL) boli získané od ľudských darcov leukoforézou. Získané PBL boli čistené ďalej Ficoll-Hypaque gradientovou centrifugáciou a potom kultivované pri koncentrácii 5 x 10^ buniek/ml na živnej pôde RPM I 1640 obsahujúcej 1 % L-glutamín, 25 mM HEPES a 1 % roztok penicilínu so streptomycínom (Gibco, Grand Island, NY). Bunky boli indukované k produkcii interferónu-gama mitogénnym stafylokokovým enterotoxínom B (pri koncentrácii lpg/ml) a kultivované 24 až 48 h pri 37 °C v prostredí s 5 % kysličníkom uhličitým. S cieľom zvýšiť relatívny výťažok IFN-gama aktivity bol k PBL kultúram pridávaný dezacetyltymozín-a-1 (pri koncentrácii 0,1 pg/ml).

B. Izolácia informačnej RNK

Celková RNK bola extrahovaná z PBL kultúr v podstate spôsobom, ktorý opísal Berger S. L. so spolupracovníkmi [Berger et al., Biochemistry 18, 5143 (1979)]. Bunky boli peletované odstredením a opäť suspendované v roztoku 10 mM chloridu sodného, 10 nM hydrochloride tris-hydroxymetylamínometánu (TnsHCl) (pH 7,5), 1,5 nM bezvodom chloride horečnatom a 10 nM ribonukleozidvanádylovom komplexe. Bunky boli lýzované pridaním

NP-40 (tak, aby jeho výsledná koncentrácia bola 1 %) a bunkové jadrá boli peletované odstredením. Supernatant, ktorý obsahoval celkovú RNK, bol niekoľkonásobne extrahovaný fenolom a chloroformom. Vodná fáza bola upravená chloridom sodným na koncentráciu 0,2 M NaCl a potom bola celková RNK vyzrážaná pridaním dvoch objemov etanolu. RNK z neredukovaných (nestimulovaných) kultúr sa izolovala rovnakými metódami. Na izoláciu mRNK z vyzrážanej celkovej RNK bola použitá chromatografia na oligo-dT celulóze [Aviv et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 1408 (1972)]. Typické výťažky z 1 až 2 litrov kultivovaných PBL lymfocytov boli 5 až 10 mg celkovej RNK a 50 až 200 pg poly (A) + RNK.

C. Frakcionácia mRNK podľa veľkosti molekuly

Na frakcionáciu mRNK preparátov boli použité dve metódy. Tieto metódy boli aplikované nezávisle od seba (skôr ako súčasne) a každá viedla k signifikantnému obohateniu IFN-gama mRNK.

Na frakcionáciu mRNK bola použitá centrifugácia na sacharózovom gradiente v prítomnosti formamidu ako denaturačného činidla. Odstreďovanie sa vykonalo v 70 % formamide s gradientom sacharózy od 5 do 25 % pri 154 000 násobku zemského gravitačného zrýchlenia (g) počas 19 h pri 20 °C [Boedtker et al., Prog. In Nucleic Acids Res. Mol. Biol. 19, 253 (1976)]. Z hornej časti gradientu boli postupne odoberané frakcie po 0,5 ml, vyzrážané etanolom a alikvotný podiel bol injikovaný do oocytov žaby Xenopus laevis na účel translácie mRNK [Gurdon et al., J. Molec. Biol. 80, 539 (1975)]. Po inkubácii počas 24 h pri izbovej teplote bolo testované kultivačné prostredie na antivírusovú účinnosť pomocou štandardného testu inhibície cytopatického účinku, pomocou vírusu vezikulóznej stomatitídy (kmeň Indiana) alebo vírusu encefalomyokarditídy na W1SH bunkách (ľudské amniónové), spôsobom opísaným Stewartom [Stewart, The Interferon Systém. Springer, New York, p. 13-26 (1979)], s tým rozdielom, že vzorky boli inkubované s bunkami počas 24 h (namiesto 4 h) predtým, ako boli vystavené pôsobeniu vírusu. Pri RNK získanej frakcionáciou použitím sacharózového gradientu boli pozorované zhodne dva vrcholy aktivity (pozri obrázok 1). Jeden vrchol zodpovedal vypočítanej veľkosti molekuly so sedimentačnou konštantou 12S (svedbergov) a obsahoval 100 až 400 jednotiek antivírusovej účinnosti v 1 ml (v porovnaní so štandardou IFN-ct) na mikrogram injikovanej RNK. Druhý vrchol aktivity zodpovedal veľkosti molekuly so sedimentačnou konštantou 16S a mal asi polovičnú aktivitu pomalšie sedimentujúcej molekuly. Je samozrejmé, že každý z týchto vrcholov aktivity je potrebné pripísať intcrfcrónu IFN-gama, pretože nebola pozorovaná žiadna aktivita, keď boli tie isté frakcie testované na línii hovädzích buniek (MDBK), ktorá nie je chránená ľudských IFN-gama. Aktivita IFN-α a IFN-β sa dá ľahko detegovať zmieneným MDBK testom [Goeddel et al., Nucleic Acids Research 8, 4057 (1980)].

Frakcionácia mRNK (200 pg) bola podľa druhej metódy vykonaná elektroforézou na kyselino-močovinových agarózových géloch. Doštička s uvedeným agarózovým gélom [Lehrach et al., Biochemistry 16, 4743 (1977) a Lynch et al., Virology 98, 251 (1979)] sa skladá z 1,75 % agarózy, 0,025 M citrátu sodného s pH 3,8 a 6 M močoviny. Elektroforéza sa vykonávala počas 7 h pri 25 mA a pri 4 °C. Potom sa gél rozrezal žiletkou podľa frakcií. Jednotlivé plátky boli roztavené pri 70 °C a dvakrát extrahované fenolom a raz chloroformom. Získané frakcie boli potom vyzrážané etanolom a potom sa stanovovala prítomnosť interferónovej IFN-gama mRNK antivírusovým testom po injikovaní do oocytov Xenopus laevis. Len jeden vrchol aktivity bol pozorovaný vo vzorkách rozfrakcionovaného gélu (pozri obrázok 2). Tento vrchol aktivity sa pohybuje spoločne s RNK so sedimentačnou konštantou 18S a mal aktivitu 600 jednotiek/ml na mikrogram injikovanej RNK. Táto aktivita bola tiež špecifická pre interferon IFN-gama, pretože nechránila MDBK bunky.

Rozdiely pozorované medzi veľkosťami molekuly zodpovedajúce vrcholom aktivity pri frakcionácii pomocou sacharózového gradientu (sedimentačné konštanty 12S a 16s) a pomocou kyselino-močovínového gélu (18S) sa môžu vysvetliť pozorovaním, že tieto nezávislé frakcionačné metódy neboli vykonané pri úplne denaturujúcich podmienkach.

D. Príprava banky kolónií obsahujúcich sekvencie IFN-gama mRNK (3 pg) pripravená gélovou frakcionáciou bola použitá na prípravu dvojvláknovej cDNK štandardnými postupmi [Stewart, The Interferon Systcm, Springer, New York, p. 13-26 (1979) a Wickens et al., J. Biol. Chem. 253, 2483 (1978)]. Získaná DNK bola frakcionovaná podľa veľkosti molekuly na 6 % polyakrylamidovom géli. Elektroelúciou boli získané frakcie s dvomi veľkosťami molekuly, jedna s 800 až 1500 pármi báz (138 ng) a druhá s viac ako 1500 pármi báz (204 ng). Podiely po 35 ng každej uvedenej veľkosti cDNK boli predĺžené deoxycytidínovými (deoxy-C) zvyškami použitím terminálnej deoxynukleodyltransferázy [Chang et al., Náture 275, 617 (1978)] a anelované s 300 ng plazmidu pBR 322 [Bolivar et al., Gene 2, 95 (1977)], ktorý bol podobne zakončený deoxyguanosinovými (deoxy-G) zvyškami v mieste Pstl štiepenia [Chang et al., Náture 275, 617 (1978)]. Každá, takto získaná anelovaná zmes bola potom transformovaná do mikroorganizmu E. coli K 12 kmeňa 294. Získalo sa približne 8000 transformantov s cDNK s 800 až 1500 pármi báz a 400 transformantov s cDNK s viac ako 1500 pármi báz.

E. Triedenie banky kolónií na kolónie s indukovanou cDNK

Kolónie boli individuálne inokulované do jamiek mikrotitračných doštičiek obsahujúcich živnú pôdu LB [Miller Experiments in Molecular Genetics, p. 431-3, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York (1972)] plus 5 pg/ml tetracyklínu, doštičky boli po pridaní dimetylsulfoxidu (DMSO) pri koncentrácii 7 % uložené pri -20 °C. Vypestovali sa dve kópie banky kolónií na nitrocelulózových filtroch a DNK z každej kolónie boli fixované na filtri Grunsteinovým-Hognessovým postupom [Grunstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci U. S. A. 72, 3961 (1975)].

Použitím mRNK veľkosti zodpovedajúcej 18S, získanej gélovou frakcionáciou z indukovaných ale aj neindukovaných PBL kultúr boli pripravené skúšobné vzorky cDNK značené rádioaktívnym 32p. Ako primér bol použitý oligo-dT j 2-18 (oligo-deoxytymínribozid), za reakčných podmienok už skôr opísaných [Goeddel et al., Náture 287, 411 (1980)]. Membrány obsahujúce 8000 transformantov z fragmentu cDNK veľkosti 600 až 1500 párov báz a 400 transformantov z fragmentu cDNK veľkosti vyššej ako 1500 párov báz boli hybridizované s 20 x KÚ cpm indukovaných 32p._c£)NK Duplikát banky kolónií ma membránach bol hybridizovaný s 20 x 1OÔ cpm neindukovaných 32p__cDNK Hybridizácia bola vykonávaná počas 16 h použitím podmienok opísaných Fritschom a spolupracovníkmi [Fritsch et al., Celí 19, 959 (1980)].

Membrány boli dôkladne premyté [Fritsch et al., Celí 19, 959 (1980)] a potom exponované na film Kodak XR-5, citlivý na X-lúče, použitím DuPont Lightning-Plus zosilovacej fólie počas 16 až 48 h. Hybridizačná vzorka z každej kolónie bola porovnaná s uvedenými dvomi skúšobnými vzorkami. Približne 40 % kolónií zreteľne hybridizovalo s obidvomi skúšobnými vzorkami, a približne 50 % kolónií nehybridizovalo s ani jednou vzorkou (porovnaj s obrázkom 3). 124 kolónií hybridizovalo signifikantne s indukovanou skúšobnou vzorkou, ale nedetegovateľne alebo oveľa slabšie hybridizovalo s neindukovanou skúšobnou vzorkou. Uvedené kolónie boli individuálne inokulované do jamiek mikrotitračných doštičiek, kultivované, prenesené na nitrocelulózové membrány a hybridizované s rovnakými dvomi skúšobnými vzorkami uvedeným spôsobom. Plazmidická DNK izolovaná z každej z týchto kolónií zrýchlenou metódou [Bimboim et al., Nucleic Acids Res. 7, 1513 (1979)] bola tiež fixovaná na nitrocelulózových membránach a hybridizovaná [Kafatos et al., Nucleic Acids Res. 7, 1541 (1979)] s indukovanými a neindukovanými skúšobnými vzorkami. DNK z 22 kolónii hybridizovali len s indukovanou skúšobnou vzorkou a boli označené ako „indukované kolónie“.

F. Charakterizácia indukovaných kolónii

Z 5 indukovaných kolónií sa pripravili plazmidové DNK [Clewel et al., Biochemistry 9,4428 (1970)] a použili sa na charakterizáciu cDNK inzercií. Mapovanie piatich indukovaných plazmidov (p67, p68, p69, p71 a p72) pomocou reštrikčných endonukleáz naznačilo, že štyri z nich majú podobné reštrikčné nukleázové mapy. Každý z týchto štyroch plazmidov (p67, p68, p69, p71 a p72) má štyri Ddel miesta štiepenia, dve Hinfl miesta a jedno Rsal miesto v cDNK inzercii. Piaty plazmid (p68) obsahuje spoločný Ddel fragment a zdá sa, že to je krátky cDNK klón, príbuzný s ostatnými štyrmi. Homológia, naznačená reštrikčným endonukleázovým mapovaním bola potvrdená hybridizáciou. Z Ddel fragmentu plazmidu p67 so 600 pármi báz bola pripravená 32p označená DNK skúšobná vzorka [Taylor et al., Biochim. Biophys. Acta 442, 324 (1976)], ktorá bola použitá k hybridizácii [Grunstein et al., Proch. Natl. Acad. Sci U.S.A. 72, 3961 (1975)] s ostatnými indukovanými kolóniami. Všetkých päť zmapovaných kolónií pomocou reštrikčných nukleáz, skrížené hybridizovalo s touto skúšobnou vzorkou, rovnako tak, ako 17 ostatných indukovaných kolónii vybraných zo 124 kolónií pri triedení na indukované a neindukované. PstI natrávenim a gélovou elektroforézou bola stanovená dĺžka uvedených cDNK inzercií v každom z týchto skrížené hybridizujúcich plazmidov. Klónom s najdlhšou cDNK inzerciou je klón 69 s dĺžkou inzercie 1200 až 1400 párov báz. Táto DNK bola používaná pri všetkých ďalších pokusoch, a jej reštrikčná endonukleázová mapa je znázornená na obrázku 4.

Pomocou produktov expresie produkovaných v troch nezávislých systémoch, schopných expresie, majúce antiví rusovú aktivitu, ako je podrobnejšie opísané, preukázalo sa, že cDNK inzercia v plazmide p69 jc intcrfcrónová IFN-gama cDNK.

G. Sekvenčná analýza cDNK inzercie plazmidu p69

Úplná neukleotidová sekvencia cDNK inzercie plazmidu p69 bola stanovená nielen terminačnou metódou dideoxynukleotidovaného reťazca [Smith, Methods Enzymol. 65, 560 (1980)] po subklónovaní fragmentov do M13 vektora mp7 [Messing et al., Nucleic Acids Res. 9, 309 (1981)] ale tiež chemickým postupom podľa Maxama a Gilberta [Maxam et al., Methods in Enzymol. 65, 490 (1980)]. Najdlhšia otvorená čítacia jednotka kóduje bielkovinu so 166 aminokyselinami, znázornenú na obrázku 5. Prvým zakódovaným aminokyselinovým zvyškom je prvý met kodón umiestnený na 5' konci cDNK. Prvých 20 aminokyselinových zvyškov na aminokonci slúži pravdepodobne ako signálna sekvencia na sekréciu zvyšných 146 aminokyselín. Táto myslená signálna sekvencia má spoločné vlastnosti s ostatnými charakteristickými signálnymi sekvenciami, ako je veľkosť a hydrofobicita. Okrem toho štyri aminokyseliny, ktoré sa našli v myslenej štiepnej sekvencii (ser-leu-gly-cys) sú identické so štyrmi aminokyselinovými zvyškami, ktoré sa našli v mieste štiepenia mnohých leukocytových interferónov (LeIF B, C, D, F a H) [Goeddel et al., Náture 290, 20 (1981)]. Zakódovaná maturovaná aminokyselinová sekvencia 146 aminokyselín (tu označená ako „rekombinantný ľudský interferón“) má molekulovú hmotnosť 17 140.

V zakódovanej bielkovinovej sekvencii sú dve potenciálne miesta glykozylácie [winzler, Hormonal Proteins and Peptides (ed. Li) Academic Press, New York. p. 1 (1973)], pri aminokyselinách na pozíciách 28 až 30 (asn-tyr-ser). Existencia týchto miest je v súlade s pozorovanou glykozyláciou ľudského interferónu IFN-gama [Yip et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 78, 1601 (1981) a Nathan et al., Náture 292, 842 (1981)]. Okrem toho sú prítomné len dva cysteínové zvyšky (v polohách 1 a 3) stéricky veľmi nahustené, takže nemôžu tvoriť disulfidický môstik, čo je v súlade s pozorovanou stabilitou interferónu IFN-gama v prítomnosti redukčných činidiel, ako β-merkaptoetanolu [Nathan et al., Náture 292, 842 (1981)]. Odvodená maturovaná aminokyselinová sekvencia je vo všeobecnosti dosť bázická, spolu s 30 zvyškami lyzínu, arginínu a histidinu, a len s 19 zvyškami kyseliny asparágovej a kyseliny glutámovej.

mRNK štruktúra interferónu IFN-gama, tak ako bola odvodená z DNK sekvencie plazmidu p69, t.j. úplne odlišná od štruktúry interferónovej IFN-α [Goeddel et al., Náture 287, 411 (1980) a Goeddel et al., Náture 290, 20 1981)] alebo IFN-β [Goeddel et al., Nucleic Acids Research 8, 4057 (1980)] mRNK. Ako je znázornené na obrázku 6, kódovacia oblasť interferónu IFN-gama je kratšia, pretože 5' -nepreložené a 3' -nepreložené oblasti sú oveľa dlhšie ako analogické oblasti nielen v interferóne IFN-α, ale aj v IFN-β·

H. Expresia rekombinantného ľudského interferónu v mikroorganizme E. coli

Tak, ako je znázornené na obrázku 7, bolo 50 pg plazmidu p69 štiepených reštrikčnou endonukleázou PstI. Elektroforézou na 6 % polyakrylamidovom géli bola izolo10 vaná inzercia s 1250 pármi báz. Elektroelúciou sa z gélu získalo približne asi 10 pg uvedenej inzercie. 5 pg tohto fragmentu PstI sa parciálne štiepilo 3 jednotkami endonukleázy BstNI (dodávateľ Behtesda Research Labs.) počas 15 min. pri 37 °C a reakčná zmes sa čistila na 6% polyakrylamidovom géli. Izolovalo sa približne 0,5 pg požadovaného BstNI - PstI fragmentu s 1100 pármi báz. Fosfotriesterovou metódou [Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 75, 5765 (1978)] boli syntetizované dva deoxyoligonuklcotidy (uvedené na obrázku 7) 5'dAATTCATGTGTTATTGTC a 5'-dTGACAATAACACATG, ktoré boli fosforylované nasledujúcim spôsobom. Do roztoku 100 pmol každého z uvedených deoxyloginukleotidov v 30 mikrolitroch obsahujúcich 60 mM Tris-HC1 (pH 8), 10 mM chlorid horečnatý, 15 mM β- merkaptoetanol a 240 pCi (gama’32p) ATP (dodávateľ Amersham, aktivita 5000 Ci/mmol) bolo pridaných 12 jednotiek T4 polynukleotidkinázy a reakčná zmes sa nechala reagovať 30 min. pri 37 °C. K reakčnej zmesi sa pridal 1 mikroliter 10 mM ATP a reakcia prebiehala ďalších 20 min. Po extrakcii reakčnej zmesi fenol-chloroformom sa získali oligoméry kombinované sBstNI-Pstl fragmentom s 1100 pármi báz a produkty sa vyzrážali etanolom. Ligácia fragmentov bola vykonávaná pri 20 °C počas 2 h v 30 mikrolitroch obsahujúcich 20 mM Tris-Hcl (pH 7,5), 10 mM bezvodý chlorid horečnatý, 10 mM ditiotreitol, 0,5 mM ATP a 10 jednotiek T4 DNK-ligázy. Zmes sa po skončení reakcie štiepila 1 h 30 jednotkami endonukleázy PstI a 30 jednotkami EcoRI (na účely odstránenia polymerizačných produktov, ktoré vznikli počas ligácie na kohéznych koncoch) a podrobená elektroforéze na 6 % polyakrylamidovom géli. Elektroelúciou sa získal produkt s 1115 pármi báz (110 000 cpm).

Plazmid pLelF A typ 103 (pozri obrázok 7) je derivátom plazmidu pLelF A 25 [Goeddel et al., Náture 287, 411 (1980)], v ktorom bolo odstránené EcoRI miesto štiepenia distálne k LeIF A génu [Itakura et al., Science 198, 1056 (1977)]. 3 pg plazmidu pLelF A typ 103 boli štiepení 20 jednotkami endonukleázy EcoRI a 20 jednotkami PstI počas 90 min. pri 37 °C a zmes sa podrobila elektroforéze na 6% polyakrylamidovom géli. Elektroelúciou bol izolovaný veľký vektorový fragment s asi 3900 pármi báz. Uvedený EcoRI-PstI IFN-gama DNK fragment s 1115 pármi báz bol naviazaný do 0,15 pg takto pripraveného vektora. Transformáciou do E. coli K-12 kmeňa 294 (ATCC číslo 31 446) sa získalo 120 kolónií rezistentných na tetracyklín. Zo 60 z týchto transformantov sa pripravila plazmidická DNK a štiepila sa endonukleázami EcoRI a PstI. Tri z uvedených plazmidov obsahovali požadovaný EcoRI-PstI fragment s 1115 pármi báz. DNK sekvenčnou analýzou bolo overené, že tieto plazmidy majú požadovanú nukleotidovú sekvenciu pri spojení medzi typ promótorom, syntetickou DNK a cDNK. Jeden z týchto plazmidov označený pIFN-gama typ 48, bol vybraný na ďalšie štúdium. Tento plazmid bol použitý k transformovaniu E. coli K-12 kmeňa W3110 (uložený pod ATCC číslom 27 325).

I. Génová štruktúra sekvencie kódujúca interferón IFN-gama

Štruktúra génu kódujúca interferón IFN-gama bola analyzovaná pomocou Southernovej hybridizácie. Pri tomto postupe [Souther, J. Molec. Biol. 98, 503 (1975)] sa 5 pg ľudskej lymfocytovej DNK s vysokou molekulovou hmot nosťou [pripravenej spôsobom podľa Blin et al., Nucleic Acids Res. 3, 2302 (1976)] štiepilo až do dokončenia rôznymi reštrikčnými endonukleázami, zmes sa podrobila elektroforéze na 1 % agarózových géloch [Lawn et al., Science 212, 1159 (1981)] a škvrny fragmentov prenesené na nitrocelulózový filter [Souther, J. Molec. Biol. 98, 503 (1975)]. Z Ddel fragmentu so 600 pármi báz z cDNK inzercie plazmidu p69 bola pripravená 32p-_znač_ena skúšobná vzorka DNK [Taylor et al., Biochim. Biophys. Acta 442, 324 (1976)] a hybridizovaná [Fritsch et al., Celí 19, 959 (1980)] so škvrnou DNK na nitrocelulózovom filtri. Skúšobná vzorka s 107 impulzmi za minútu bola hybridizovaná počas 16 hodín a potom bol filter premytý opísaným spôsobom [Fritsch et al., Celí 19, 959 (1980)] Osem genómových DNK vzoriek od rôznych ľudských darcov sa štiepilo reštrikčnou endonukleázou EcoRI a fragmenty sa hybridizovali s 32p_ značenou skúšobnou vzorkou z plazmidu p69. Tak ako je znázornená na obrázku 9, boli pozorované dva zreteľné hybridizačné signály zodpovedajúce veľkosti 8,8 tisícom párov báz (kbp) a 2,0 kbp, ako sa odhadlo porovnaním ich pohyblivosti s pohyblivosťou fragmentu, ktorý sa získal natrávením XDNK endonukleázou Hind III. Tento výsledok by zodpovedal buď dvom génom IFN- gama alebo jedinému génu rozštiepenému v Ecol mieste štiepenia. Pretože plazmidické p69 cDNK neobsahuje EcoRI miesto štiepenia, bola by potrebná na vysvetlenie možnosti jediného génu intervenujúca sekvencia (intrón) s interným miestom EcoRI štiepenia. Na účely rozlíšenia týchto možností bola vykonaná ďalšia Southernová hybridizácia rovnakej skúšobnej vzorky s piatimi odlišnými fragmentárni endonukleázových štiepení jedinej ľudskej DNK (pozri obrázok 10). Boli pozorované dva hybridizujúce DNK fragmenty s dvomi inými fragmentárni endonukleázového štiepenia, PvuII (6,7 kbp a 4,0 kbú) HincII (2,5 kbp a 2,2 kbp). Tri vzorky z endonukleázového štiepenia poskytli však len jeden hybridizujúci DNK fragment; HindlII (9,0 kbp), BglII (11,5 kbp) a BamHI (9,5 kbp). Dva gény IFN-gama b museli byť viazané v neobvykle blízkej vzdialenosti (menej ako 9,0 kbp), aby boli obsiahnuté v rovnakom HindlII hybridizujúcom fragmente. Tento výsledok naznačuje, že v ľudskej genómovej DNK je prítomný len jediný homológny interferónový IFN-gama gén (na rozdiel od mnohých príbuzných IFN- a génov) a že tento gén je štiepený v oblasti jedného alebo viacerých intrónov, ktoré obsahujú EcoRI, PvuII a HincII miesta štiepenia. Táto predpoveď bola podporená hybridizáciou 32p._znaj_eného fragmentu [Taylor ct al., Biochim. Biophys, Acta 442, 324 (1976)] pripraveného z 3' -nepreloženej oblasti cDNK z plazmidu p69 (Ddel fragmen so 130 pármi báz od 860 páru báz k 990 páru báz, pozri obrázok 5) s EcoRI fragmentárni získanými natrávením ľudskej genomickej DNK. S uvedenou skúšobnou vzorkou hybridizoval len EcoRI fragment s 2,0 kbp, podľa čoho možno usudzovať, že tento fragment, obsahuje 3' -nepreložené sekvencie, zatiaľ čo EcoRI fragment s 8,8 kbp obsahuje 5' sekvencie. Štruktúra génu IFN-gama (génu, ktorý obsahuje aspoň jeden intrón) je zreteľne odlišná od interferónového génu IFN-α /niekoľkonásobný gén [Goeddel et al., Náture 290, 20 (1981)] bez intrónov [Lawn et al., Science 212, 1159 (1981)]/ alebo IFN-β /jediný gén bez intrónov [Lawn et al., Nucleic Acids. Res. 9, 1045 (1981)]/.

J. Príprava bakteriálnych extraktov

Kultúra E. coli W 3110/pIFN-gama typ 48 kultivovaná cez noc na živnej pôde Luria, ktorá obsahovala 5 pg/ml tetracyklínu, sa použila na inokuláciu živnej pôdy M9 [Mitier, Experiments in Molecular Genetics, p. 431-3, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York (1972)] obsahovala 0,2 hmotnostných % glukózy, 0,5 hmotnostných % kazamino-kyselín (CAA; zmes aminokyselín získaná kydrolýzou kazeínu) a 5 pg/ml tetracyklínu, zriedené 1 : 100. Keď dosiahla absorbcia pri 550 nm /A550) hodnotu 0,1 až 0,2, pridala sa do média kyselina indolylakrylová tak, aby sa dosiahla výsledná koncentrácia 20 pg/ml. Po dosiahnutí Aj 5 q = 1,0 sa 10 ml vzorky kultúry centrifugovali a získaná biomasa sa ihneď opäť suspendovala v 1 ml roztoku fosfátového pufra v roztoku chloridu sodného, obsahujúceho 1 mg/ml hovädzieho sérumalbumínu (PBS-BSA). Bunky sa rozrušili ultrazvukom a bunkové zvyšky boli odstránené odstredením. Supematanty boli uložené pri 4 °C až do otestovania aktivity. Porovnaním so štandardou IFN-α sa pomocou testu inhibície cytopatického účinku (CPE) stanovilo, že interferónová aktivita super natantov je 250 jednotiek/ml.

K. Transformácia kvasinkových kmeňov a živné prostredia

Kvasinkové kmene boli transformované už skôr opísaným spôsobom [Beggs, Náture 275, 104 (1977)]. Na výber plazmidov obsahujúcich funkčný TRP I gén bol použitý mikroorganizmus E. coli kmeňa JA300 (thr leuBó thi thyA trpCl 117 hsdirr hsdR str^j [Hitzeman, et al., J. Biol. Chem. 255, 12073 (1980)]. Ako kvasinkový transformačný hostiteľ sa použil kvasinkový kmeň RH 218, ktorý mal genotyp /trpí gal2 SUC2 mal CUPI) [Miozari et al., Joumal of Bacteriology 134, 48 (1978)]. Kmeň RH 218 je uložený v Americkej zbierke typových kultúr pod ATCC číslom 44 076. K minimálnemu živnému prostrediu M9 s 0,25 hmotn. % CAA a k bohatému médiu LB, ktoré opísal Miller [Miller, Experiments in Molecular Genetics, p. 431-3, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York (1972)], sa pridalo 20 pg/ml ampicilínu (firmy Sigma) po autoklávovaní a ochladení. Kvasinky sa kultivovali v nasledujúcich živných pôdach: YEPD, ktorá obsahuje 1 hmotnostné % kvasničného extraktu, 2 hmotnostné % peptonu, 2 hmotnostné % glukózy a 3 hmotnostné % agaru Difco; YNB + CAA, obsahujúce 6,7 g kvasinkových dusíkatých látok (bez aminokyselín) (YNB) Difco, 10 mg adenínu, 10 mg uracilu, 5 g CAA, 20 g glukózy a 30 g agaru v jednom litri.

L. Konštrukcia expresie schopného kvasinkového vektora

1. 10 pg plazmidu Yrp7 [Stinchcomb et al., Náture 282, 39 (1979), Kingsman et al., Gene 7, 141 (1979) a Tschuper et al., Gene 10, 157 (1980)] sa digerovalo reštrikčnou endonukleázou EcoRI. Kohézne (lepivé) konce získanej DNK boli prevedené pomocou DNK polymerázy I (Klenowov fragment) na „tupé“. Vektor a inzercia sa naniesli na 1 % agarózový gél (SeaKem), po rozdelení boli frakcie vyrezané, elektroeluované, vyextrahované 2 x rovnakými objemami chloroformu a fenolu a produkt sa vyzrážal etanolom. Získané molekuly DNK s tupými koncami sa podrobili vzájomnej ligácii počas 12 h pri 12 °C vo výslednom objeme 50 mikrolitrov. Získaná ligačná zmes sa použila na transformovanie E coli kmeňa JA 300 na ampicilinovú rezistenciu a tryptofánovú prototrófiu. Izolovali sa plazmidy obsahujúce TRPÍ gén v obidvoch orientáciách: plazmid pFRWl mal TRPÍ gén v rovnakej orientácii ako plazmid Yrp7, zatiaľ čo plazmid pFRW2 mal TRPÍ gén v opačnej orientácii.

pg plazmidu pFRW2 sa linearizovalo reštrikčným enzýmom HindlII a získaná zmes sa delila elektroforézou na 1 % agarózovom géli. Lineárne molekuly boli z génu eluované a 200 ng produktu sa potom podrobilo ligácii s 500 ng HindlII inzercie plazmidu pBl s 3,1 kbp [Crane et al., J. Nat. Cancer Inst. 61, 871 (1978)], ktorá je reštrikčným fragmentom obsahujúcim kvasinkový 3-fosfoglycerátkinázový gén. Ligačná zmes sa použila na transformovanie E. coli kmeňa 294 na rezistneciu proti ampicilínu a citlivosť proti tetracyklínu. Plazmid pripravený zjedného takéhoto rekombinantu mal neporušený TRPÍ gén s HindlII fragmentom s 3,1 kbp z DNK inzercie plazmidu pBl v HindlII mieste štiepenia tetracyklínovej rezistencie génu. Tento plazmid bol označený ako pFRM31. 5 pg uvedeného plazmidu pFRM31 sa úplne štiepilo endonukleázou EcoRI, zmes sa dvakrát extrahovala fenolom a chloroformom a produkt sa vyzrážal etanolom. Kohézne konce molekuly sa vyplnili použitím DNK polymerázy I (Klenowov fragment); na reakciu sa použilo 250 pM každého deoxynukleozidtrifosfátu. Reakcia prebiehala 20 minút pri 14 °C, potom sa DNK extrahovala dvakrát fenolom a chloroformom a produkt sa vyzrážal etanolom DNK sa opäť suspendovala, kompletne štiepila reštrikčným enzýmom Clal a zmes sa delila elektroforézou na 6 % akrylamidovom géli. Vektorový fragment bol z gélu eluovaný, extrahovaný fenolom a chloroformom, vyzrážaný etanolom.

Šesť N-terminálnych aminokyselín 3-fosfoglycerátového enzýmu prečisteného po izolácii z ľudských zdrojov má nasledujúce zloženie:

1-2-3-4-5-6

SER - LEU - SER - HSM - LYS - LEU - .

Jedna z translačných čítacích jednotiek, generovaná z DNK sekvencie Sau3A až Sau3A reštrikčného fragmentu so 141 pármi báz (obsahujúca vnútorne HincII miesto štiepenia; pozri PGK reštrikčnú mapu na obrázku 11) produkuje nasledujúcu aminokyselinovú sekvenciu:

1-2-3-4-5-6

MET - SER - LEU - SER - SER - LYS - LEU Je zrejmé, že po odstránení iniciačnej aminokyseliny metionínu má N-terminálna aminokyselinová sekvencia PGK 5 zo 6 aminokyselín homológnych s N-terminálnou aminokyselinovou sekvenciou ľudského PGK.

Výsledok tohto určenia sekvencie naznačuje, že štart kvasinkového PGK štrukturálneho génu je kódovaný pomocou DNK, ktorá je vSau3A reštrikčnom fragmente plazmidu pBl so 141 pármi báz. Predchádzajúce práce [Hitzeman, et al., J. Biol. Chem. 255, 12073 (1980)] naznačili, že DNK sekvencie špecifikujúce PGK mRNK by mohli byť v oblasti HindlII fragmentu. Ďalšie sekvenovanie Sau3A fragmentu so 141 pármi báz poskytlo podrobnejšie údaje o DNK sekvencii PGK promótora (pozri obrázok 12).

Štandardnými metódami sa syntetizoval syntetický oligonukleotid so sekvenciou 5'-. ATTTGTTGTAAA3¹ [pozri Crea a spolupracovníci, Nucleic Acids Res. 8, 2331 (1980)]. 100 ng tohto priméru sa označilo na 5' -konci použitím 10 jednotiek T4 polynukleotidkinázy v objeme 20 mikrolitrov reakčnej zmesi, ktorá obsahovala tiež 200 pCi (gama-32p) . A'ľP. Roztok získaného značeného priméru sa použil na reakciu obnovenia párov báz, plánovanú ako prvý stupeň v mnohostupňovom postupe zameranom na zavedenie EcoRI reštrikčného miesta do PGK 5' -koncovej DNK, predchádzajúcej sekvencie PGK štrukturálneho génu.

100 pg plazmidu pBl [Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255, 12073 (1980)] sa úplne štiepilo reštrikčným enzýmom HaelII a zmes sa rozdelila na 6 % polyakrylamidovom géli. Prvý pás fragmentu na géli po etídiumbromidovej detekcii (ktorá obsahuje časť PGK promótora) sa izoloval elektroelúciou opísaným spôsobom. Získaný HaelII fragment DNK s 1200 pármi báz sa rozštiepil nukleázou HincII a zmes sa rozdelila na 6 % akrylamidovom géli. Elektroelúciou sa izoloval pás obsahujúci fragment so 650 pármi báz; získalo sa 5 pg DNK. Táto HaelII až HincII časť DNK so 650 pármi báz sa opäť suspendovala v 20 mikrolitroch vody a roztok sa zmiešal s 20 mikrolitrami roztoku fosforylovaného priméru pripraveného opísaným spôsobom. Zmes sa extrahovala jedenkrát fenolom a chloroformom, produkt sa vyzrážal etanolom. Vysušená DNK bola resuspendovaná v 50 mikrolitroch vody a zmes sa zahrievala 7 min. na vriacom vodnom kúpeli. Roztok sa rýchle ochladil v kúpeli suchý ľad - etanol (10 až 20 s) a potom sa preložil do kúpeľa ľad - voda. K roztoku sa pridalo 50 mikrolitrov roztoku zloženého z 10 mikrolitrov roztoku 10 x DNK polymerázy I v pufri (Boehringer, Mannheim), 10 mikrolitrov roztoku vopred upraveného na 2,5 mM každého z použitých deoxynuklcotidtrifosfátov (dATP, dTTP, dGTP a dCTP), 25 mikrolitrov vody a z 5 jednotiek DNK polymerázy I (Klenowov fragment). Táto reakčná zmes s objemom 100 pl sa inkubovala 4 h pri 37 “C. Potom sa roztok extrahoval jedenkrát fenolom a chloroformom, produkt sa vyzrážal etanolom, vysušil sa lyofilizáciou a potom sa štiepil 10 jednotkami reštrikčnej endonukleázy Sau3A. Získaná zmes sa naniesla na 6 % polyakrylamidový gél a delila sa elektroforézou. Pás, obsahujúci fragment zodpovedajúcej veľkosti 39 párom báz sa z gélu vyrezal a produkt sa izoloval eletroelúciou opísaným spôsobom. Získaný fragment s 39 pármi báz má jeden koniec tupý a jeden kohézny Sau3A koniec. Tento fragment bol naklonovaný do modifikovaného vektora pFIF typ 69 [Goeddel et al., Nucleic Acids Research 8, 4057 (1980)] nasledujúcim spôsobom: 10 pg plazmidu pFIF typ 69 bolo linearizovaných pôsobením enzýmu Xbal, zmes sa extrahovala jedenkrát fenolom a chloroformom, produkt sa vyzrážal etanolom. Xbal kohézny koniec sa vyplnil použitím DNK polymerázy I (Klenowov fragment) v 50 pl reakčnej zmesi obsahujúcej po 250 pM každého použitého nukleozidtrifosfátu. Získaná DNK bola rozštiepená enzýmom BamHI a zmes sa delila eletroforézou na 6 % polyakrylamidovom géli. Vektorový fragment sa z gélu izoloval elektroelúciou a opäť suspendoval v 20 pl vody. 20 ng tohto vektora sa podrobilo ligácii s 20 ng fragmentu s 39 pármi báz pripraveného uvedeným spôsobom, počas 4 h pri izbovej teplote. Jedna pätina ligačnej zmesi sa použila k transformovaniu mikroorganizmu E. coli kmeňa 294 na rezistenciu proti ampicilínu (doštičky s LB živnou pôdou + 20 pg/ml ampicilínu). Plazmidy z transformantov sa hodnotili rýchlou vyhľadávacou metódou [Bimboim et al., Nucleic Acids Res. 7, 1513 (1979)]. Jeden z týchto plazmidov, pPGK-39, bol zvolený na sekvenčnú analýzu. 20 pg tohto plazmidu sa štiepilo endonukleázou Xbal, produkt sa vyzrážal etanolom a potom sa na neho pôsobilo 1000 jednotkami bakteriálnej alkalickej fosfatázy 45 min. pri 68 °C. DNK sa extrahovala trikrát fenolom a chloroformom, potom sa vyzrážala etanolom. Defosforylované konce sa potom rádioaktívne označili v 20 pl reakčného roztoku obsahujúceho 200 pCi (gama’32p) ATP a 10 jednotiek T4 polynukleotidkinázy. Plazmid sa rozštiepil endonukleázou Sali a zmes sa delila elektroforézou na 6 % polyakrylamidovom géli. Pás, obsahujúci značenú inzerciu, sa z gélu vyizoloval a podrobil sa sekvenčnej analýze chemickou degradačnou metódou [Maxam et al., Methods in Enzymol. 65, 490 (1980)]. DNK sekvencia na 3' - konci tejto promótorovej časti mala očakávané poradie.

2. Konštrukcia PvuT až EcoRI PGK promótorového fragmentu s 312 pármi báz pg plazmidu pPGK-39 (pozri obrázok 13) bolo súčasne štiepené reštrikčnými endonukleázami Sali a Xbal (po 5 jednotkách z každej) a získaná zmes sa podrobila elektroforéze na 6 % géli. Elektroelúciou sa izoloval fragment s 390 pármi báz obsahujúci promótorovú časť s 39 pármi báz. Získaná DNK bola resuspendovaná vo vode, štiepená endonukleázou Sau3A a zmes sa delila elektroforézou na 8 % polyakrylamidovom géli. Elektroelúciou sa izoloval pás obsahujúci PGK promótorovú časť s 39 pármi báz. Táto DNK obsahovala 39 párov báz z 5' - konca PGK promótora na Sau3A až Xbal fragmente.

pg plazmidu pBl sa rozštiepilo reštrikčnými enzýmami Pvul a KpnI a zmes sa delila elektroforézou na 6 % akrylamidovom géli. Elektroelúciou sa izoloval pás obsahujúci DNK s 800 pármi báz; uvedená DNK bola rozštiepená reštrikčnou endonukleázou Sau3A a zmes sa delila elektroforézou na 6 % polyakrylamidovom géli. Elektroelúciou sa izoloval pás obsahujúci fragment z PGK promótora s 265 pármi báz (pozri obrázok 11).

Získaná DNK sa podrobila ligácii vyššie uvedeným promótorovým fragmentom s 39 pármi báz počas dvoch hodín pri izbovej teplote. Zmes sa po ligácii rozštiepila endonukleázami Xbal a Pvul a rozdelila sa elektroforézou na 6 % polyakrylamidovom géli. Elektroelúciou sa izoloval Xbal až Pvul reštrikčný fragment s 304 pármi báz. Tento fragment bol vložený do ligačnej zmesi obsahujúcej 200 ng fragmentu plazmidu pBR322 [Boliver et al., Gene 2, 95 (1977)] získaného po odstránení Pvul až PstI reštrikčného fragmentu so 162 pármi báz a 200 ng Xbal až PstI fragmentu LeIF Ac DNK génu izolovaného predtým z 20 pg plazmidu pLelF typ A 25. Táto trojzložková ligačná zmes sa použila na transformovanie E. coli kmeňa 294 na rezistenciu proti tetracyklínu. Kolónie transformantov sa podrobili skrátenému triedeniu [Bimboim et al., Nucleic Acids Res. 7, 1513 (1979)] a izolovala sajedna z kolónií, pPGK-300, ktorá má fragment PGK 5' -priľahlej DNK s 304 pármi báz fúzovaný na LeIF A gén vo vektore založenom na plazmide pBR 322. 5' -koniec LeIF A génu má nasledujúcu nukleotidickú sekvenciu: 5' -CTAGAATTC-3'. Fúzia Xbal reštrikčného miesta z PGK promótorového fragmentu do tejto sekvencie dovoľuje adíciu EcoRI reštrikčného miesta na uvedené Xbal miesto. Plazmid pPGK-300 tak obsahuje časť PGK promótora izolovaného v Pvul až EcoRI fragmente.

3. Konštrukcia EcoRI až EcoRI PGK promótorového fragmentu s 1500 pármi báz.

pg plazmidu pBl bolo štiepené reštrikčnými endonukleázami Pvul a EcoRI a zmes sa delila elektroforézou na 6 % polyakrylamidovom géli. Elcktroclúciou sa izoloval pás obsahujúci Pvul až EcoRI časť DNK s 1,3 kbp z PGK 5' -priľahlej DNK. 10 pg plazmidu pPGK-300 sa štiepilo endonukleázami EcoRI a Pvul a po rozdelení zmesi elektroforczou na 6 % polyakrylamidovom géli bol elektroelúciou izolovaný promótorový fragment s 312 pármi báz. 5 pg plazmidu pFRL4 sa rozrezalo endonukleázou EcoRI, produkt sa vyzrážal etanolom a potom sa na neho pôsobilo 45 min. pri 68 °C bakteriálnou alkalickou fosfatázou. DNK bola trikrát extrahovaná fenolom a chloroformom, vyzrážaná etanolom a resuspendovaná v 20 ml vody ; 200 ng tohto vektora sa podrobilo ligácii so 100 ng EcoRI až Pvul fragmentu DNK z pPGK-300 s 312 pármi báz a so 100 ng EcoRI až Pvul fragmentu DNK zplazmidu pBl. Táto trojzložková ligačná zmes sa použila na transformáciu E. coli kmeňa 294 na rezistenciu proti ampicilínu. Jeden zo získaných transformantov sa označil pPGK-1500. Tento plazmid obsahuje PGK promótorový fragment s 1500 pármi báz ako EcoRI až EcoRI alebo HindlI až EcoRI časť DNK.

pg získaného plazmidu pPGK-1500 sa kompletne štiepilo enzýmami Clal a EcoRI a získaná zmes sa rozdelila elektroforézou na 6 % polyakrylamidovom géli. Elektroelúciou sa izoloval fragment s 900 pármi báz obsahujúci PGK pormótor. 10 pg plazmidu pIFN-gama typ 48 sa kompletne digerovalo enzýmami EcoRI a HincII a zmes sa delila elektroforézou na 6 % polyakrylamidovom géli. Elektroelúciou sa z gélu izoloval pás obsahujúci priamo exprimovateľnú IFN-gama cDNK s 938 pármi báz.

Vektor schopný kvasinkovej expresie bol skonštruovaný v trojzložkovej reakcii vzájomnou ligáciou PGK pormótorového fragmentu (na Clal až EcoRI časti), deletovaného plazmidu pFRM-31 a zhora izolovanej IFN-gama cDNK. Ligačná zmes sa inkubovala 12 h pri 14 °C. Potom sa získaná ligačná zmes použila na transformovanie mikroorganizmu E. coli kmeňa 294 na ampicilínovú rezistenciu. Získané transformanty boli analyzované na prítomnosť správne skonštruovaného expresie schopného plazmidu pPGK-IFN-gama (pozri obrázok 16). Plazmidy, obsahujúce expresie schopný systém, sa použili na transformovanie sféroblastov kvasinkového kmeňa RH 218 na tryptofánovu prototrofiu v agarovej pôde, s chýbajúcim tryptofánom. Tieto rekombinované kvasinky sa potom analyzovali na prítomnosť rekombinantného ľudského imunitného interferónu.

Kvasinkové extrakty sa pripravili nasledujúcim spôsobom: kultúry v objeme 10 ml sa kultivovali na YNB + + CAA živnej pôde až do dosiahnutia A ggQ asi 1 až 2, potom sa bunky odstredili a opäť suspendovali v 500 μΐ PBS pufra (20 mM dihydrofosforečnanu sodného s pH 7,4 a 150 mM chlorid sodný). Po pridaní rovnakého objemu sklenených perál (priemeru 0,45 až 0,5 mm) sa zmes intenzívne miešala počas 2 min. Extrakty sa odstred’ovali 30 s pri 14 000 otáčkach za minútu a v supematante bola stanovená interferónová aktivita; v porovnaní s IFN-α štandardou a použitím testu inhibície CPE sa našla aktivita 16 000 jednotiek/ml.

M. Konštrukcia bunkovej kultúry s vektorom pSV gama 69

HindlII až PvuII fragment s 342 pármi báz obsahujúci SV 40 zdroj bol premenený na fragment s naviazaným EcoRI reštrikčným miestom. HindlII reštrikčné miesto sa konvertovalo adíciou syntetického oligoméru (5' - dAGCTGAATTC) a PvuII reštrikčné miesto sa konvertovalo „tupou“ ligáciou na vyplnené EcoRI miesto použitím polymerázy I (Klenowov fragment). Získaný EcoRI fragment bol vložený do EcoRI reštrikčného miesta plazmidu pML-1 [Lusky et al., Náture 293, 79 (1981)]. Plazmid s SV 40, bývalým promótorom orientovaným ďaleko do génu pre ampicilínovú rezistenciu (ampR), sa ďalej modifikoval odstránením EcoRI reštrikčného miesta najbližšieho k ampR génu plazmidu pML-1 [Itakura et al., Science 198, 1056 (1977)].

Bol izolovaný Hpal až BglII fragment s 1023 pármi báz, klonované HBV DNK [Valenzuela et al., Animal Vírus Genenics (ed. Fields, Jaenisch and Fox) p. 57, Academic Press, New York (1980)] a Hpal reštrikčné miesto vírusu hepatitídy B (HBV) sa konvertovalo na EcoRI reštrikčné miesto syntetickým oligomérom (5' -dGCGAATTCGC). Tento EcoRI až BglII naviazaný fragment bol priamo naklonovaný do EcoRI až BamHl reštrikčných miest uvedeného plazmidu nesúceho zdroj SV 40.

Do zvyškového EcoRI reštrikčného miesta sa vložil interferónový IFN-gama gén na PstI fragmente plazmidu p 69 s 1250 pármi báz, po konverzii jeho PstI koncov na EcoRI konce. Izolovali sa klony, v ktorých bývalý promótor SV 40 predchádzal štrukturálnemu génu interferónu IFN-gama. Získané plazmidy boli potom zavedené do buniek tkanivovej kultúry [Gluzman et al., Cold Spring Harbor ...] použitím dietylaminoetyldextránovej (DEAE-dextránovej) pracovnej techniky [McCuthan et al., J. Natl. Cancer Inst. 41, 351 (1968)], modifikovanej tým spôsobom, že transformácia v prítomnosti DEAE-dextránu prebiehala počas 8 h. Bunkové médium sa menilo každé 2 až 3 dni. Denne sa odoberalo 200 μΐ kvapaliny pre biologické hodnotenie interferónovej aktivity. Typické výťažky boli 50 až 100 jednotiek/ml vo vzorkách testovaných za tri až štyri dni po transfekcii.

Podľa analýzy chýba v produkte expresie časť CYS-TYR-CYS na N-konci ľudského imunitného interferónu (porovnaj obrázok 5). Z toho vyplýva, že na spojení CYS-GLN (aminokyseliny 3 a 4 na obrázku 5) dochádza k štiepeniu signálneho peptidu, takže maturovaný polypeptid by sa v skutočnosti skladal zo 143 aminokyselín.

N. Čiastočné čistenie des-CYS-TYR-CYS rekombinantného ľudského imunitného interferónu

Na účely produkcie väčšieho množstva ľudského interferónu IFN-gama, ktorý pochádza z buniek opíc, boli transfektované čerstvé monomolekulárne vrstvy buniek COS-7 na desiatich 10 cm doštičkách s 30 pg pDLIF 3 v 110 ml DEAE-dextránu (obsahujúcich 200 pg/ml DEAE-dextránu molekulovej hmotnosti 500 000, 0,05 M Tris s pH 7,5 v DMEM). Po 16 hodinách inkubácie pri 37 °C sa doštičky premyli dvakrát DMEM. Na každú doštičku sa potom pridalo 15 ml čerstvého DMEM doplneného 10 hmôt. % f. b. s. séra, 2 mM glutaminu, 50 pU/ml penicilínu G, 50 mg/ml streptomycínu. Nasledujúci deň bolo médium nahradené DMEM bez séra. Čerstvé médium bez séra sa pridávalo každý deň. Média sa zbierali a uchovávali pri 4 °C pokiaľ neboli otestované; podiely, ktoré mali aktivitu boli spracované použitím CPG na viazanie aktívnych zložiek (pozri nižšie). Testovaním sa zistilo, že média odobrané za 3 a za 4 dni po transfekcii vzoriek obsahovali v podstate všetku aktivitu.

K 100 ml bunkového supcmatantu sa pridalo 0,5 g CPG (porézne sklo s kontrolovateľnou veľkosťou pórov, CPG 350 firmy Electronucleonics, veľkosť pórov 120/200) a zmes sa miešala 3 h pri 4 °C. V podstate všetka aktivita sa naviazala na CPG. Po krátkom odstredení zmesi na stolnej odstredivke sa usadené guličky preniesli do trubice a stĺpec sa dôkladne premyl roztokom pufra, ktorý’ obsahoval 20 mM metafosforečnanu sodného IM chloridu sodného a 0,1 hmôt. % β-merkaptoetanolu, pH 7,2. Potom bola aktivita eluovaná rovnakým pufrom, ktorý obsahoval 30 hmôt. % etylénglykolu a ďalej sa eluovala uvedeným pufrom obsahujúcim 50 hmotn. % etylénglykolu. 75 hmotn. % všetkej aktivity sa našlo vo frakciách eluovaných pufrom s 30 hmotn. % etylénglykolu. Tieto frakcie sa spojili a roztok sa zriedil pufrom, ktorý obsahoval 20 mM metafosforečnan sodný a 1 M chlorid sodný s pH 7,2 tak, aby výsledná koncentrácia etylénglykolu bola 10 hmotn. %, a zmes sa naniesla priamo na stĺpec pripravený z 10 ml Con A Sepharozy (firmy Pharmacia). Po dôkladnom premytí stĺpca pufrom, ktorý obsahoval 20 inM metafosforečnan sodný a 1 M chlorid sodný s pH 7,2 sa aktivita eluovala roztokom, ktorý obsahoval 20 mM metafosforečnan sodný, 1 M chlorid sodný a 0,2 M α-metyl-D-manozid. Podstatné množstvo aktivity (55 hmotn. %) sa na uvedený lektín nenaviazalo; 45 hmotn. % aktivity sa eluovalo a-metyl-D-manozidom.

O. Farmaceutické prípravky

Zlúčeniny podľa vynálezu je možné, na účely farmaceutický použiteľných prípravkov formulovať známymi metódami, pri ktorých sa známy ľudský imunitný interferón mieša s farmaceutický vhodným nosným vehikulom. Vhodné vehikulum a vhodné spôsoby formulovania do formy farmaceutických aplikačných foriem sú opísané E. W. Martinom v monografii „Remington's Pharmaceutical Sciences“, na ktorú tu odkazujeme. Vhodné farmaceutické kompozície obsahujú účinné množstvo interferónovej bielkoviny podľa vynálezu spolu s vhodným množstvom vehikula, čím sa získajú farmaceutický prípustné prípravky vhodné na účinné podávanie chorým.

Ľudský imunitný interferón podľa vynálezu je možné pareneterálne podávať jedincom, ktorí potrebujú antitumorálnu alebo antivírusovú liečbu, alebo ktorí majú imunosupresívne stavy. Dávkovanie alebo počet dávok sú analogické tým, že sa bežne používajú pri klinických skúškach iných ľudských interferónov, napríklad približne (1 až 10) x 1 ()6 jednotiek denne a v prípade materiálu s vyššou čistotou ako 1 hmotn. %, účelne rovnako až do tejto čistoty, napríklad 50 x 10^ jednotiek denne. Dávkovanie interferónu IFN-gama je možné s cieľom zvýšiť účinok podstatne zvýšiť vzhľadom na to, že v ňom nie sú v podstate prítomné okrem IFN-gama žiadne iné ľudské bielkoviny, ktoré pri materiáloch získaných z ľudských zdrojov môžu indukovať niektoré nežiaduce účinky.

Vhodná dávkovacia forma pre v podstate homogénny IFN-gama na parenterálnu aplikáciu sa pripraví napríklad nasledujúcim spôsobom: 3 mg interferónu IFN-gama so špecifickou aktivitou napríklad 2 x 1()8 U/mg sa rozpustí v ml 5 N ľudského sérumalbumínu (čistoty podľa USP), roztok sa prefiltruje cez bakteriologický filter a filtrát sa rozdelí do 100 ks injekčných ampuliek, z ktorých každá obsahuje 6 x 10^ jednotiek čistého interferónu vhodného na parenterálne podanie. Injekčné ampulky sa pred použitím účelne skladujú v mrazničke pri teplote -20 °C.

P. Biologická účinnosť

a) Charakterizácia antivírusovej účinnosti

Na stanovenie neutralizácie antivírusovej účinnosti protilátkami rôzneho pôvodu sa vzorky zriedili podľa potreby pufrom PBS-BSA (pozri vyššie) na koncentráciu 500 až 1000 jednotiek/ml. Rovnaké objemy vzorky sa inkubovali 2 až 12 h pri 4 °C so sériovo riedenými vzorkami králičieho protihumánneho, leukocytámeho, fibroblastového alebo imunitného interferónového antiséra. Anti-IFN-α a anti-IFN-β sa získali z ústavu „National Inštitúte of Allergy and Infectious Diseases“. Anti-IFN-gama sa pripravila použitím autentického interferónu IFN-gama (čistoty 5 až 20 hmotn. %), ktorá sa získala čistením stimulovaných periférnych krvných lymfocytov. Tri minúty pred testovaním sa vzorky odstreďovali počas 3 minút pri preťažení 12 000 x g. Na testovanie stability pri pH 2 sa vzorky upravili na pH 2 pridaním 1 M kyseliny chlorovodíkovej, inkubovali sa 2 až 12 h pri 4 °C a pred hodnotením sa zneutralizovali pridaním 1 M hydroxidu sodného. Na testovanie citlivosti proti dodecylsulfátu sodnému (SDS) sa inkubovali všetky vzorky s rovnakým objemom 0,2 hmotn. % SDS počas 2 až 12 h pri 4 °C.

b) Charakterizácia interferónu IFN-gama produkovaného E. coli a bunkami COS-7

Antivírucová účinnoeť (jednotky/*!) extrakt E.coli W

Supematant bunky COS—

3110/pIFN- —7/pSV—flaeaPOsobenle činidle! IFN-κ IFN—e IFN-y* gaaa—Cyp48 ó?

Bez úpravy vzorky

PH 2

0.1 heotn. Z SDS králičie anti-IFN—« králičie anti-IFN-*. králičie anti-1FN-y

375 125250

375 125l 6

375 -í 4 < 8 125250

375 < 8187

375 125( 4

250ŕ>2.5 <12<4 <8

250187

250125 <8<4

V tabuľke je uvedené charakteristické chovanie štandardov interferónov IFN-a, IFN-β a IFN-gama pôsobením rôznych činidiel. Interferónová aktivita produkovaná mikroorganizmom E. coli W3110/pIFN-gama typ 48 a bunkami COS-7/pSVgama69 má citlivosť proti kyselinám, citlivosť voči SDS a je neutralizovaná antísérom imunitného interferónu; nie je neutralizovaná protilátkami proti IFN-a alebo IFN-β. Tieto výsledky potvrdzujú, že produkty produkované v uvedených systémoch sú imunitné interferóny a že cDNK inzercia plazmidu p69 kóduje interferón IFN-gama.

R. Čistenie interferónu IFN-gama

Jedna z metód, ktorou je možné čistiť interferón IFN-gama, ktorý pochádza napríklad z baktérií, je opísaná v nasledujúcej všeobecnej schéme:

1. Bunky sa extrahujú v lýzujúcom pufri s vysokou vodivosťou (asi pri pH 8) pasážou homogenizátorom pri vysokom tlaku a eluent sa chladí v ľadovom kúpeli.

2. DNK sa vyzráža pridaním polyetylénimínu za miešania pri teplote napríklad 4 °C.

3. Bakteriálne bielkoviny sa vyzrážajú pri vhodnom pH, pričom IFN-gama zostane v roztoku.

4. Pevné podiely sa oddelia odstredením pri 4 °C.

5. Supernatant sa skoncentruje (po úprave pH) napríklad ultrafdtráciou.

6. Koncentrát sa dialyzuje oproti pufru s nízkou vodivosťou.

7. Pevné podiely sa odstránia odstredením a získa sa roztok intcrfcrónu IFN-gama.

8. Vykoná sa ionexová chromatografia na karboxymetylcelulóze, použitím gradientovej elúcie so vzrastajúcou iónovou silou.

9. Produkt sa čistí chromatograficky na kalciumfosfátovom géli použitím gradientovej elúcie so vzrastajúcou iónovou silou.

10. Vykoná sa ionexová chromatografia na karboxymetylcelulóze, za mierne denaturujúcich podmienok, použitím gradientovej elúcie so vzrastajúcou iónovou silou.

11. Produkt sa separuje gélovou filtračnou chromatografiou.

Uvedeným postupom sa získa materiál čistoty vyššej ako 95 hmotn. %.

Imunitná interferónová bielkovina podľa vynálezu je definovaná pomocou stanoveného DNK génu a z neho odvodenej aminokyselinovej sekvencie - pozri obrázok 5. Je zrejmé, že k tomuto špeciálnemu interferónu, uvádzanému na tomto mieste, existujú individuálne sa vyskytujúce rôzne alclické variácie. Tieto variácie je možné demonštrovať ako rozdiel(y) v druhu jednotlivých aminokyselín v celkovej aminokyselinovej sekvencii interferónu alebo delécie, substitúcie, inzercie, inverzie alebo adície jednej alebo viacerých aminokyselín v uvedenej sekvencii. Všetky takéto alelické variácie patria do rozsahu tohto vynálezu.

Skutočne existuje možnosť použiť technológiu rekombinácie DNK na prípravu rôznych derivátov ľudského interferónu IFN-gama rôzne modifikovaných výslednou jednotlivou alebo niekoľkonásobnou substitúciou, deléciou, adíciou alebo náhradou aminokyseliny. Všetky takého modifikácie vedúce k príslušným derivátom ľudského interferónu IFN-gama sú začlenené do rozsahu tohto vynálezu, pokiaľ druh základnej charakteristickej aktivity ľudského IFN-gama zostáva nezmenený.

Teraz, keď je k dispozícii poznanie DNK a aminokysclinovej sekvencie IFN-gama (pozri obrázok 5), bude najvýhodnejší spôsob reprodukcie predloženého vynálezu viesť k príprave buď kompletného génu syntetickými prostriedkami [Goeddel et al., Náture 281, 544 (1979)], alebo k príprave syntetických deoxyoligonukleotidov, s ktorými bude možné vyšetrovať cDNK zdroje na účely izolácie génu štandardnými hybridizačnými pracovnými technikami. Keď už bola stanovená nukleotidová sekvencia kódujúca požadovanú IFN-gama bielkovinu, mohli by sa podľa uvedeného opisu sledovať rôzne prostriedky na dosiahnutie expresie, izolácie a čistenie, ktoré zabezpečujú vysokú čistotu preparátov IFN-gama.

Napriek tomu, že bola opísaná špecifická výhodná podstata vynálezu, je zrejmé, že predložený vynález nie je limitovaný uvedeným opisom a že jeho právoplatný rozsah vyplýva z nasledujúceho predmetu vynálezu.

Priemyselná využiteľnosť

Produkt, získavaný uvedenou technológiou, je vhodný vo všetkých svojich formách na použitie k profylaktickému alebo terapeutickému ošetrovaniu pacientov s vírusovými infekciami alebo s malígnymi, imunosuprimovanými alebo imunodeficitnými stavmi.

Pod pojmom „rôzne formy“ imunitného interferónu sú zahrnuté rôzne možné oligomérne formy, ktoré môžu obsahovať aj glykozylované formy. Produkt je možné vyrábať s geneticky skonštruovanými transformovanými mikroorganizmami alebo systémami transformovaných bunkových kultúr, t.j. do ktorých bola vložená DNK, ktorá vznikla rekombináciou exogénnej DNK.

Teraz existuje potenciál, ako pripraviť a izolovať ľudský imunitný interferón účinnejším spôsobom ako to bolo možné doteraz. Významným rysom predloženého vynálezu, v jeho najvýhodnejšej podstate, je uskutočnenie genetického riadenia mikroorganizmu alebo bunkovej kultúry tak, aby produkovali ľudský imunitný interferón v izolovateľných množstvách, vylučovaných z hostiteľskej bunky v maturovanej forme.

Claims (18)

1. Ľudský imunitný interferón a jeho derivát, obidva s aminokyselinovou sekvenciou znázornenou na obr. 5, bez iného proteínu, s ktorými je obyčajne spojený, ako i jeho alely.

2. Derivát ľudského imunitného interferónu podľa nároku 1, s aminokyselinovou sekvenciou znázornenou na obr. 5, a jeho alela, pričom kyselinový derivát má funkciu ľudského imunitného interferónu.

3. Derivát ľudského imunitného interferónu podľa nároku 2 s aminokyselinovým metionínom na N-konci.

4. Ľudský imunitný interferón podľa nároku 1, s aminokyselinovým metionínom na N-konci zrelej sekvencie.

5. Ľudský imunitný interferón podľa nároku 1, s aminokyselinovou sekvenciou, znázornenou na obr. 5, alebo jeho alela, alebo derivát s funkciou ľudského imunitného interferónu bez pridruženej prirodzenej glykozylácie.

6. Ľudský imunitný interferón podľa nároku 1 s aminokyselinovou sekvenciou, znázornenou na obr. 5, alebo jeho alela, alebo derivát s funkciou ľudského imunitného interferónu, vytvárané expresiou DNK, kódujúcej aminokyselinovú sekvenciu interferónu v rekombinantnej hostiteľskej bunke.

7. Ľudský imunitný interferón podľa nároku 6, vytváraný expresiou kódujúcej rekombinantnej DNK sekvencie v bunkovej línii cicavcov.

8. Ľudský imunitný interferón podľa nároku 7, v ktorom bunkovou líniou je bunková línia COS-7 opíc.

9. Izolát DNK obsahujúci DNK sekvenciu kódujúcu ľudský imunitný interferón, s aminokyselinovou sekvenciou, znázornenou na obr. 5, alebo jeho alela alebo derivát s funkciou ľudského imunitného interferónu.

10. Replikovateľný expresný vektor schopný exprimovať v transformantnom mikroorganizme alebo v bunkovej kultúre DNK sekvenciu, kódujúcu ľudský imunitný interferón, s aminokyselinovou sekvenciou znázornenou na obr. 5, alebo jeho alela, alebo derivát s funkciou ľudského imunitného interferónu.

11. Rekombinantný mikroorganizmus alebo bunková kultúra schopné exprimovať imunitný interferón s aminokyselinovou sekvenciou, znázornenou na obr. 5, alebo jeho alela, alebo derivát s funkciou ľudského imunitného interferónu.

12. Rekombinantný mikroorganizmus podľa nároku 11, ktorým je kmeň E. coli.

13. Rekombinantný mikroorganizmus podľa nároku 11, ktorým je kvasinkový kmeň.

14. Bunková kultúra podľa nároku 11, ktorou je bunková línia cicavcov.

15. Bunková kultúra podľa nároku 11, ktorou je bunková línia opíc.

16. Farmaceutický prípravok na liečenie tumorových alebo vírusových ochorení, alebo imunosupresívnych stavov, vyznačujúci sa tým, že ako účinnú látku obsahuje terapeuticky účinné množstvo ľudského imunitného interferónu podľa niektorého z nárokov 1 až 8 v spojení s farmaceutický prijateľným nosičom.

17. Farmaceutický prípravok podľa nároku 16, vyznačujúci sa tým, že účinná látka s farmaceutický prijateľným nosičom je vo forme na parenterálne podávanie.

18. Použitie ľudského imunitného interferónu podľa niektorého z nárokov 1 až 8 na prípravu farmaceutických prípravkov na liečenie tumorových alebo vírusových ochorení alebo imunosupresívnych stavov.