NO164177B

NO164177B - Rekombinant dna-fremgangsmaate for fremstilling av et polypeptid med funksjon av human immun (gamma)-interferon.

Info

Publication number: NO164177B
Application number: NO823467A
Authority: NO
Inventors: David V Goeddel; Patrick W Gray
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 1981-10-19
Filing date: 1982-10-18
Publication date: 1990-05-28
Also published as: ZA827569B; DK163187B; PL153202B1; EP0077670A3; RU2092561C1; SK738982A3; GB2107718A; YU233582A; FI86559B; RU2107728C1; PT75696B; DE77670T1; US4727138A; DK163187C; GT198277746A; BG42527A3; ES516620A0; FI823528A0; NO164177C; ATE44289T1

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid med funksjon av human immun (y)-interferon, hvilket polypeptid inneholder aminosyresekvensen for rekombinant human immuno (y)-interferon.

Foreliggende oppfinnelse har sin opprinnelse delvis fra opp-dagelsen av DNA-sekvensen og utledet aminosyresekvens som koder for human interferon. Dertil tilveiebringer foreliggende oppfinnelse sekvensinformasjon om de 3'- og 5'-omgivende sekvenser til human immun (y)-interferongenet, hvilket letter in vitro bindingen derav i ekspresjpnshjelpemidler.

Især tilveiebringes 5'-DNA segmentet som koder for det som vanligvis ansees for å være det endogene signalpolypeptidet som kommer umiddelbart foran aminosyrefrekvensen til det som vanligvis ansees for å være det fullt utviklede human immun-interferonet. Disse oppdagelser har i sin tur muliggjort utviklingen av midlene og fremgangsmåtene for fremstilling, via rekombinant DNA teknologi, av tilstrekke-lige mengder human immun interferon, som igjen i sin tur har muliggjort bestemmelsen av dets biokjemiske egenskaper og bioaktiviteti

Publikasjonene bg annet materiale som her er brukt for å belyse bakgrunnen for oppfinnelsen, og i bestemte tilfelle for å tilveiebringe tilleggsdetaljer med hensyn til dets utførélse, er inntatt som henvisninger, og er henvist til ved hjelp av nummer av bekvemmelighetshénsyn i den følgende tekst, og opstilt i den medfølgende bibliografi.

A. Human immuri- interferori

Human interferon kan klassifiseres i tre grupper på basis

av forskjellig antigenvirkning og biologiske og biokjemiske egenskaper.

Den første gruppen omfatter en familie med leukocyt-interferoner (o-interferon, LelF eller IFN-a), som vanligvis fremstilles hovedsakelig av celler som er bestanddeler i humanblod, etter induksjon med virus. Disse er fremstilt mikrobielt bg funnet å være biologisk aktive (1, 2, 3). Deres biologiske egenskaper har bevirket bruken av den på sykehus som terapeutiske midler for behandlingen av virusinfeksjoner og ondartede tilstander (4) .

I den andre gruppen finner man human fibroblastinterferon (3-interferon, FIF eller IFN-3), som vanligvis fremstilles av fibroblaster etter .induksjon med virus, og som også er fremstilt mikrobielt og funnet å oppvise et bredt spekter av biologiske virkninger (5). Kliniske prøver indikerer også dets potensielle terapeutiske verdi. Leukocyt og fibroblast-interferonene oppviser'svært klare likheter i sine biologiske egenskaper til tross for det faktum av graden av homologi på aminosyrenlvået er relativt lav. Dertil inneholder begge grupper av interferoner fra 165 til 166 aminosyrer og er syrestabile proteiner.

Human immun-interferonet (IFN-y), som ellers også refereres til som human gammainterferon, som denne oppfinnelsen er rettet mot, er, i motsetning til a- og 3-interferonene,

pH 2 labil, fremstilles hovedsakelig etter mitogen-induksjon av lymfocytter og er også klart forskjellig med hensyn til antigenvirkning. Inntil nylig kunne human immun-interferon påvises bare i svært små nivåer, noe som hindret dets karakterisering. Nylig er en ganske utstrakt, men fremdeles delvis rensing av human immun-interferon blitt rapportert (6). Det ble hevdet at forbindelsen var fremstilt fra lymfocytkulturer stimulert med en kombinasjon av fytohaemagglutin og en forbolester og renset ved kromato-grafisk separasjon av sekvenser. Denne fremgangsmåten ga et produkt med en molekylvekt på 58.000.

Human immun-interferon er blitt fremstilt i svært små mengder ved å oversette mRNA i oocytter, noe som har gitt interferoirvirkning som er karakteristisk for human immun interferon, og gitt et håp om at immuninterferon cDNA kunne bli syntetisert og klonet (7).

Mengden av immun-interferon som hittil er erholdt, er ganske visst utilstrekkelig til å utføre utvetydige eksperimenter med hensyn til karakteriseringen av og de biologiske egenskapene til den rensede bestanddel. Både in vitro undersøkelser utført med råpreparater og in vivo eksperimenter med y-interferon-preparater fra rotter og mus antyder imidlertid at den primære funksjonen til immun-interf eron kan være som et immunregulerende middel (8,9). Immun-interferon har ikke bare en antiviral og anticellulær virkning felles med alle human interferoner, men viser en potensierende effekt på disse virkninger sammenlignet med a- og (3-interferon (10) . Dessuten rapporteres den in vitro antiformerende virkning av y-interferon på tumorceller å være ca. 10 til 100 ganger større enn den til andre inter-feronklasser (8, 11, 12). Dette resultat, sammen med dets tydelige immunregulerende rolle (8, 9), antyder en mye tydeligere antitumor inflydelse for IFN-y enn for IFN-a og IFN-3. In vivo eksperimenter med mus og murin IFN-y preparater viser virkelig en klar overlegenhet over antiviralt indusert interferoner med hensyn til dets antitumor virkning mot osteogen sarcoma (13).

Alle disse studier, frem til foreliggende oppfinnelse, måtte utføres med heller urene preparater på grunn av den svært lave tilgjengelighet. De antydet imidlertid svært viktige biologiske virkninger for immuninterferon. Immun interferon har ikke bare en sterk tilknyttet antiviral virkning, men sannsynligvis også en sterk immunregulerende og anti-tumorvirkning, noe som klart utpeker den som en potensielt svært lovende klinisk kandidat.

Man fornemmet at anvendelsen av rekombinant DNA-teknologi ville være en svært effektiv måte å tilveiebringe de nød-vendige større mengder av human immun interferon.

Enten de således fremstilte materialene ville omfatte glykosylering som ansees som karakteristisk for naturlig, humanavledet materiale, eller ikke, ville de sannsynligvis oppvise bioaktivitet som gir rom'for deres kliniske anvendelse i behandlingen av et vidt spekter av virale, neoplastiske og immunundertrykte tilstander eller sykdommer.

B. Rekombinant DNA teknologi

Rekombinant DNA teknologi har nådd frem til et trinn i utviklingen med et visst raffinement. Molekylærbiologer er i stand til å rekombinere forskjellige DNA sekvenser med en viss letthet og derved skape nye DNA molekyler som er i stand til å produsere rikelige mengder eksogent proteinprodukt i transformerte mikrober. De generelle midlene og fremgangsmåtene er tilgjengelige for in vitro ligeringen av forskjellige fragmenter av DNA med butte ender eller "klebrige" ender, hvilket gir sterke ekspresjonshjelpemidler som er nyttige ved transformering av bestemte organismer, og således styrer deres virksomme syntese av ønsket eksogent produkt. På en individuell produktbasis forblir imidlertid veien noe kronglete og videnskapen har ikke avansert til et stadium hvor regulære forutsigelser om suksess kan gjøres.

De som spår vellykkede resultater uten det underliggende eksperimentelle grunnlag, gjør virkelig dette med betraktelig risiko for at det ikke vil virke.

Plasmidet, en ikke-kromosomal sløyfe av dobbeltkjedet DNA

som finnes i bakterier og andre mikrober, ofte i flere kopier per celle, vedblir å være et grunnleggende element i rekombinant DNA-teknologi. Inkludert i informasjonen som er innkodet i plasmid DNA, er det som kreves for å reprodusere plasmidet i datterceller (dvs. et opphav for replikering) og vanligvis ett eller flere fenotypiske seleksjonskarakte-ristika slik som i tilfellet med bakterier, resistens mot antibiotika, hvilket gjør det mulig å gjenkjenne og fortrinnsvis dyrke i selektive media kloner av vertcellen som inneholder det interessante plasmidet. Nytten av plasmider

ligger i det faktum at.de kan spaltes spesifikt ved hjelp av.en eller annen restriksjonsendonuclease eller "restrik-sjonsenzym", som hver og en gjenkjenner et forskjellig sted på plasmid DNA-molekylet. Deretter kan heterologe gener eller genfragmenter innføres i plasmidet ved å bringe endene sammen på spaltingsstedet eller ved rekonstruerte ender som grenser opp til spaltingsstedet. På denne måten dannes såkalte

replikerbare ekspresjonshjelpemidler, DNA rekombinering utføres utenfor cellen, men det resulterende "rekombinante" replikerbare ekspresjonshjelpemiddel eller plasmidet kan innføres i celler ved en prosess kjent som transformasjon,

og store mengder av den rekombinante bæreren kan erholdes ved å dyrke transformanten. Videre kan, der hvor genet er korrekt innført m.h.t. deler av plasmidet som styrer transkripsjonen og translasjonen av det innkodede DNA-budskap,

den resulterende ekspresjonsbærer virkelig brukes til å produsere polypeptidsekvensen som det innførte genet koder for, en fremgangsmåte referert til som ekspresjon.

Ekspresjon initieres i et område kjent som promoteren, som gjenkjennes og bindes ved hjelp av RNA polymerase. I trans-kripsjonsfasen av ekspresjon vikles DNA ut og blottlegges som en mal for initiert syntese av mRNA fra DNA-sekvensen. mRNA translateres deretter til et polypeptid med aminosyre-sekvensen som mRNA koder for. Hver aminosyre kodes for av en nukleotidtriplett eller "kodon" som tilsammen utgjør det "strukturelle genet", dvs. den del som koder for aminosyre sekvensen til det uttrykte polypeptidproduktet. Translasjon initieres ved et "start"-signal (vanligvis ATG, som i den resulterende mRNA blir til AUG). Såkalte stopp-kodoner definerer slutten på translasjon og dermed på produksjonen av ytterligere aminosyreenheter.

Det resulterende produkt kan erholdes om nødvendig ved å lyse vertcellen i mikrobielle systemer og utvinne produktet ved passende rensing fra andre proteiner.

I praksis kan anvendelsen av rekombinant DNA-teknologi uttrykke fullstendig heterologe polypeptider, såkalt direkte ekspresjon, eller kan eventuelt uttrykke et heterologt polypeptid konden-sert til en del av aminosyresekvensen hos et homologt polypeptid. I de sistnevnte tilfellene gjøres produktet som er ment å skulle være bioaktivt, noen ganger bioinaktivt i det kondenserte, homologe/heterologe polypeptidet inntil det spaltes i ekstracellulært miljø. Se GB patent 2.007.676A og Wetzel, American Scientist 68, 664 (1980) .

.i

■i

C. Cellekultur- teknologi

Teknikken med celle- eller vevkulturer for å undersøke genetikk og cellefysiologi er vel etablert. Midler og fremgangsmåter er tilgjengelige for å opprettholde perma-nente cellelinjer fremstilt ved suksessive serieoverføringer fra isolerte normalceller- For bruk i forskning oppbevares slike cellelinjer på en fast bærer i væskemedium eller ved dyrking i suspensjon som inneholder nødvendig næring. Opp-skalering til fremstilling av store mengder synes bare å skape mekaniske problemer. For ytterligere bakgrunns-materiale henledes oppmerksomheten på Microbiology. 2nd Edition, Harper and Row, Publishers, Inc., Hagerstown (1973) spesielt sidene; 1122 og seq- og Scientific American 245, 66 et seq. (1981) .

Foreliggende oppfinnelse er basert på den oppdagelse at rekombinant DNA-teknologi med hell kan brukes til å fremstille human immun (y)-interferon, fortrinnsvis i direkte form, og i mengder tilstrekkelig store til å starte opp og gjennomføre dyreforsøk og klinisk utprøving som en forutsetning for god-kjenning og markedsføring. Produktet er i alle sine former egnet for bruk i den profylaktiske eller terapeutiske behandling av mennesker med, virusinfeksjoner og ondartede og immunundertrykte eller immunmanglende tilstander. Dets formei omfatter forskjellige mulige oligomere former som kan omfatte tilknyttet glykosylering. Produktet fremstilles ved hjelp av genetisk manipulerte transformante mikroorganismer eller transformante cellekultursystemer. Den her benyttede beteg-nelse "transformant celle" refererer til en celle i hvilken det er blitt innført DNA, hvilken DNA skriver seg fra eksogen DNA-rekombinasjon, og resultatet av enhver slik celle som bibeholder den således innførte DNA. Det finnes således nå et potensiale for å fremstille og isolere human interferon på en mer effektiv måte enn hva som har vært mulig. En betydningsfull faktor ved den foreliggende oppfinnelse i dens mest foretrukne utførelsesformer er evnen til genetisk å styre en mikroorganisme eller cellekultur til å produsere human immuninterferon i isolerbare mengder, utskilt fra vert-

cellen i fullt utviklet tilstand.

Ifølge foreliggende oppfinnelse er det således tilveie-

bragt en fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid med funksjon av human immun (y)-interferon, hvilket peptid inneholder aminosyresekvensen for rekombinant human immun (y)-interferon, og denne fremgangsmåten er kjennetegnet ved at polypeptidet kodes av følgende DNA-sekvens og alleliske og redundante variasjoner derav:

som eventuelt er bundet til følgende sekvens som koder for signalprotein:

og at DNA-sekvensen er operativt bundet til en DNA-sekvens som fremmer ekspresjon av nevnte polypeptid i en transformert . vertcelle i utvinnbar form.

Herved oppnås human immuno (y)-interferon som et direkte ekspresjonsprodukt utskilt fra vertcellen i fullt utviklet form. Denne fremgangsmåten kan utnytte genet som koder for sekvensen til det fullt utviklede human immun (y)-interferon pluss den 5' tilgrensende DNA som koder for signalpolypeptidet. Signalpolypeptidet antas å hjelpe til i transporten av molekylet til celleveggen hos vert organismene hvor det spaltes under utskillingsprosessen for det fullt utviklede human immun-interferon produktet. Denne utførelsesform muliggjør isoleringen og rensingen av det påtenkte, fullstendige immun-interferon uten å måtte ty til innviklede fremgangsmåter utformet for å eliminere forurensninger av intracellulært værts protein eller cellulære rester.

Henvisning hertil uttrykket "fullstendig human immun-interferon" betyr også den mikrobielle eller cellekultur-produksjonen av human immun-interferon som ikke er ledsaget av signal peptidet eller førsekvens peptid som umiddelbart besørger oversettelse av human immun-interferon mRNA.

Det fremstilles således et første rekombinant human immun-interferon ifølge foreliggende oppfinnelse som har metionin som sin første aminosyre (tilstede som en følge av ATG startsignal-kodoninnskuddet foran det strukturelle genet), eller, der hvor metioninet spaltes intra- eller ekstracellulært, som har sin normale første aminosyrecystein. Fullstendig human immun-interferon kan i overensstemmelse med dette også fremstilles sammen méd et annet konjugert protein enn det vanlige signalpolypeptidet, idet konjugatet er spesifikt spaltbart i et intra- eller ekstracellulært miljø, se GB patent 2.007.676A. Endelig kan det fullstendige human immuninterferonet fremstilles ved direkte ekspresjon uten at det er nødvendig å avspalte noe uvedkommende, overflødig polypeptid. Dette er spesielt viktig når en gitt vert ikke kan, eller ikke effektivt kan, fjerne et signalpeptid der hvor ekspresjons-hjelpemidlet er utformet for å uttrykke det fullstendige human interferon sammen med dets signalpeptid. Det således fremstilte fullstendige human immuninterferon utvinnes og renses til et nivå som passer til dets bruk i behandlingen av virus-, ondartede- og immunundertrykte eller immunmanglende tilstander.

Human immun (y)-interferon ble erholdt i henhold til det følgende:

1. Human vev, f.eks. human miltvev eller perifere blodlymfo-cytter, ble dyrket med mitogener .for å stimulere produksjonen av immuninterferon. 2. Cellepelléts fra slike cellekulturer ble ekstrahert i nærvær av ribonuklease inhibitor for å isolere alt cytoplasmisk RNA. 3. En oligo-dT kolonne isolerte hele mengden budbringer RNA (mRNA) i polyadenylert form. Denne mRNA ble størrelses-fraksjonert ved å bruke sukrose densitetsgradient og syre-urea gelelektroforese. 4. Den passende mRNA (12 til 18 S) ble omdannet til den tilsvarende enkjedede komplementære DNA (cDNA) fra hvilken det ble produsert dobbeltkjedet cDNA.

Etter poly-dC behandling av endene, ble den innført i

en vektor, slik som et plasmid som inneholdt en eller flere fenotype markører.

5. De således fremstilte vektorer ble brukt til å transformere bakterieceller, og det ble derved tilveiebragt en kolonisamling. Radioaktivt merket cDNA fremstilt både fra indusert og ikke-indusert mRNA, som var avledet som beskrevet ovenfor, ble brukt til hver for seg å undersøke duplikat-kolonisamlinger. Overskuddet cDNA ble deretter fjernet og koloniene eksponert mot røntgenfilm for å identifisere de induserte cDNA-klonene. 6. Tilsvarende plasmid DNA ble isolert fra de induserte cDNA-klonene og sekvensbestemt. 7. I en første utførelse ble sekvensbestemt DNA deretter behandlet i endene in vitro for innføring i et passende ekspresjonshjelpemiddel som ble brukt til å transformere en E. coli vert-celle, som deretter ble dyrket i en kultur og uttrykte det ønskede human-interferonprodukt. 8. Således uttrykt human interferon har uten tvil 146 aminosyrer i sin fullstendige form, begynner med cystein og har en svært basisk karakter. Dets monomere molekylvekt er beregnet til 17.140. Kanskje på grunn av nærværet av en rekke basiske rester, at det er hydrofobt, saltbrudannelse og så videre, kan molekylet forene seg med seg selv i oligomere former, f.eks. i dimer, trimer eller tetramer form. De høye molekylvektene som tidligere er observert hos naturlig materiale (6) og som ikke kan forklares på bakgrunn av aminosyresekvensen alene, kan skyldes slike oligomere former, så vel som bidraget av karbohydrat fra glykosylering etter translasjonen. 9. I disse vertcellesystemer, særlig når det er innskudd i et ekspresjonshjelpemiddel for å bli uttrykt sammen med sitt signalpeptid, føres human immuninterferonet i sin fullstendige form ut i cellekulturmediet, noe som er til umåtelig hjelp i utvinnings- og rensingsmetodene.

A. Mikroorganismer/ cellekulturer

<1.><Bakteriestammer>^<gromotor>e<r>

Det her beskrevne arbeidet ble utført ved å anvende blant annet mikroorganismen E.coli K-12 stamme 294 (ende A, Thi , hsr~, jchsm<+>) som er beskrevet i GB patentskrift nr. 2.055.382; Denne stammen er deponert ved American Type Culture collectioi AtCC tilvekst nr. 31446. Forskjellige andre mikrobielle stammer er imidlertid nyttige, deriblant kjente E. coli-stammer slik som E. coli B, E. coli X 1776 (ATCC Nr. 31537) og E. coli W 3110 (F~, prototrof) (ATCC Nr. 27325), eller andre mikrobielle stammer hvorav mange er deponert og (potensielt) tilgjengelig fra anerkjente deponerings-institusjoner for mikroorganismer, slik som American Type Culture Collection (ATCC)-, jfr. katalog-fortegnelsen til ATCC. Se også DE Off.skrift nr.2.644.432. Disse andre mikroorganismer omfatter f.eks. Bacilli slik

som Bacillus subtilis og andre enterobakteriaceae hvorav kan nevnes som eksempler Salmonella tyj>himurium og

Serratia marcesans, idet det anvendes plasmider som kan replikere og uttrykke heterologe gensekvenser i disse.

Som eksempler har beta laktamase og laktose promotor systemer med fordel blitt brukt til å initiere og opprettholde mikrobiell funksjon av heterologe polypeptider. Detaljer med hensyn til utstyret til og konstruksjonen av disse promotersystemer er publisert av Chang et al., Nature 275, 617 (1978) og Itakura et al., Science 198, 1056 (1977). Senere er et system basert på tryptofan, det såkalte trp promotersystem, blitt utviklet. Detaljer vedrørende utstyret til og konstruksjonen av dette system er publisert av Goeddel et al., Nucleic Acids Research 8, 4057 (1980) og Kleid et al., U.S.S.S.N. 133, 296 innsendt 24. mars 1980. Mange andre mikrobielle promoter er oppdaget og utnyttet og detaljer vedrørende deres nukleotidsekvenser, som setter en person med erfaring i stand til å binde den funksjonelt i plasmid-vektorer, er publisert, se f.eks. Siebenlist et al.,

Cell 20, 269 (1980) .

2• §i?E§£ammer/gjærgrgmgtgrer

Ekspresjonssystemet for disse kan også anvende plasmidet YRp7 (14, 15, 16), som er istand til seleksjon og replikasjon både i E. coli og gjæren, Saccharomyces eerevlsiae. For seleksjon i gjær inneholder plasmidet TRP1 gener (14, 15, 16) som komplementerér (tillater dyrking i fravær av tryptofan) gjær som inneholder mutasjoner i dette genet som finnes i kromosom IV hos gjær (17). Stammen som her ble brukt, var stammen RH218 (18) deponert hos American Type Culture Collection uten restriksjoner (ATCC nr. 44.076). Det vil imidlertid forståes at en hvilken som helst Saccharomyces cerevisiae stamme som inneholder en mutasjon som gjør cellen trpl, vil være en effektiv omgivelse for ekspresjon av plasmidet som inneholder ekspressjonssystemet. Et eksempel på

en annen stamme som kan brukes, er pep4-l (19). Denne tryptophanauxotrofe stamme har også en punktmutasjon i TRP1 genet.

Når den plasseres på 5'-siden i et ikke-gjærgen, kan den 5'-tilgrensende DNA-sekvensen (promoter) fra et gjærgen (for alkohol dehydrogenase 1) bevirke ekspresjonen av et fremmed gen i gjær når den plasseres i et plasmid som anvendes til å transformere gjær. Ved siden av en promoter, krever korrekt ekspresjon av et ikke-gjærgen i gjær en annen gjær-sekvens plassert ved 3'-enden av ikke-gjærgenet i plasmidet for å gi korrekt transkripsjonsavslutning og polyadenylering i gjæren. Denne promoter kan passende anvendes ved foreliggende oppfinnelsellikesåvel som ved andre, se nedenunder. Ved de foretrukne utførelsesformer er den 5 *-tilgrensende sekvens hos 3-fosfoglycerat kinase-genet.fra gjær (20) plasert oppstrøms for det strukturelle genet og .etterfulgt av DNA inneholdende avslutnings-polyadenyleringssignaler, ;for eksempel, TRP1 (14, 15, 16) genet eller PGK (20) genet. ;Ettersom 5'-flankerende sekvens hos gjær ( i forbindelse med 3'-avsluttende.DNA hos gjær) (se nedenunder) kan virke til å fremme ekspressjon av fremmede gener i gjær, er det sann-synlig at de 5<1->tilgensende sekvenser hos ethvert gjærgen med høy ekspresjonsgrad kan brukes til ekspresjonen av viktige genprodukter. Ettersom gjær under visse omstendighet-er uttrykte opptil 65 prosent av sitt oppløselige protein som glykolytiske enzymer'(21) og ettersom dette høye nivå synes å skyldes produksjonen av høye nivåer av de individuelle mRNA^er (22), burde det være mulig å bruke de 5'-tilgrensende sekvenser hos hvilke som helst andre glykolytiske gener til slike ekspresjonsformål, f.eks. enolase, glyceraldehyd - 3-fosfatdehydrogenase,.heksokinase, pyruvatdekarboksylase, fosforfruktokinase, glukose - 6-fosfatisomerase, 3-fosfor-glyceratmutase, pyruvatkinase, triosefosfatisomerase, fosfoglukoseisomerase, og glukokinase. Hvilket som helst av de 3'-tilgrensende sekvenser hos disse gener kunne også brukes til passende avslutning og mRNA polyadenylering i et slikt ekspresjonssystem, jfr. ovenfor. Andre gener med høy ekspreskjonsgrad er de for de sure fosfataser (23) og de som uttrykker høye produksjonsnivåer på grunn av mutasjoner i de 5'-tilgrensende områder (mutanter som øker ;i ;ekspresjonen), vanligvis p.g.a. nærværet av TYl-transponerbart element (24) . ;Alle genene nevnt ovenfor synes å oversettes ved hjelp av RNA polymerase ;II fra gjær (24). Det er mulig at promoteme for ENA polymerase I og III som oversetter gener til ribosomal RNA, 5S RNA og tRNA-er (24, 25), også kan være nyttige i slike ekspresjonskonstruksjoner. ;Endelig inneholder mange gjærprcmoterer også trarislasj årskontroll slik at de kan slåes av og på ved variasjon i dyrkningsbetingelser. Noen eksempler på slike gjærpromoterer er genene som produserer de følgende proteiner: Alkoholdehydrogenase II, isocytokram-c, syrefosfatase, nedbrytende enzymer knyttet til nitrogenmetabolisme, glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenase og enzymer som er ansvarlige for utnyttelse av maltose og galaktose (22). ;Et slikt kontrollområde ville være svært nyttig for å kon-trollere ekspresjonen av proteinprodukt, særlig når fremstillingen er giftig for gjær. Det burde også være mulig å ;forene kontrollområdet til en 5'-tilgrensende sekvens med en 5'-tilgrensende sekvens som inneholder en promoter fra et gen med høy ekspresjonsgrad. Dette ville gi en hybridpromoter og burde være mulig ettersom kontroll- ;området og promoteren synes å være fysisk forskjellige DNA-sekvenser. 3 • ;Formering av hvirveldyrceller i kultur (vevkultur) er i ;senere år blitt en rutinefremgangsmåte ( se Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Patterson eds, 1973). Her ble ;det anvendt COS-7 linjen av apenyrefibroblaster som vert for produksjonen av immuninterferon (25a). Eksperimentene som her er beskrevet i detalj kunne imidlertid vært utført i en hvilken som helst cellelinje med evne til å gjennom- ;føre replikasjonen og ekspresjonen av en forenelig vektor, f.eks. WI38, BHK, 3T3, CHO, VERO og HeLa cellelinjer. ;Det som i tillegg kreves av vektoren er et opphav ;for replikasjon og én promoter lokalisert foran genet som skal uttrykkes, sammen med nødvendige steder for ribosom-binding, steder for RNA-tilknytning, polyadenylering og sekvenser for translasjonsavslutning. Selv om ;■i ;viktige elementene hos SV40 har vært utnyttet her, vil det forståes at oppfinnelsen,selv om det her er beskrevet ved hjelp av en foretrukket utførelsesform, ikke må betraktes som begrenset til disse frekvenser. F.eks. kan opphavet for replikasjon hos andre virale (f.eks. polyoma, Adeno, ;VSV, BPV og så videre) vektorer brukes, likesåvel som cellulære opphav for DNA-replikasjon som kunne virke i en ikke-integrert tilstand. ;B. Vektor systemer ;1. Direkte ekspresjon av fullstendig_immuninterf^rpn_i_E. coli Fremgangsmåten som ble anvendt for å oppnå direkte ekspresjon av IFN-y i E. coli som et fullstendig interferon polypeptid (minus signal sekvens) var en variant av den som tidligere ble brukt for human veksthormon (26) og human leukocyt interferon (1), for så vidt som den omfattet kombineringen av syntetisk (N-ende) og cDNA-er. ;Som utledet fra nukleotidsekvensen til p69, beskrevet ovenfor, og ved sammenligning med det kjente spaltningsstedet mellom signalpeptid og fullstendig polypeptid for flere IFN-a-er (2), har IFN-y et hydrofobt signalpeptid med 2o aminosyrer fulgt av 146 aminosyrer til fullstendig IFN-y (fig.5). Som vist i fig. 7, er BstNI restriksjonsendonukle-asested vanligvis lokalisert ved aminosyre 4 hos fullstendig IFN-Y- Det ble laget to syntetiske oligodeoksynukleo-tider som omfatter et ATG translasjonsinitieringskodon, kodoner for aminosyrer 1, 2 og 3 (cystein-tyrosin-cystein) ;og danner en EcpRI kohesiv ende. Disse deoksyoligonukleotider ble bundet til et 100 basepar BstNI-Pstl fragmen av p 69 for å lage et 1115 basepar stort syntetisk-naturlig hybridgen som koder for IFN-y og som er bundet ved EcoRI ;og Pstl restriksjonsstedene. Dette gen ble innført i plasmidet pLelF A trp 103 mellom EcoRI og Pstl stedene hvorved man fikk ekspresjonsplasmidet pIFN-y trp 48. I dette plasmid uttrykkes IFN-y genet under kontroll av E. coli trp promoteren. (pLelF A trp .103 er et derivat av pLelF A 25 ;hvori EcoRI setet som er fjernt fra LelF A genet ble fjernet. Fremgangsmåten som ble brukt for å fjerne dette EcoRI setet, er tidligere beskrevet (27)). ;<2.> 13SSgres^on_i_g jaer ;For å uttrykket et heterologt gen slik som cDNA for immun-interf eron i gjær, var det nødvendig å lage en plasmidvektor som inneholder fire bestanddeler. Den første bestanddel er den delen som muliggjør transformasjon av både E. coli og gjær, og må følgelig inneholde et selekterbart gen fra hver organisme. (I dette tilfelle er dette genet for ampicillin-resistense fra E. coli og genet TRPl fra gjær.) Denne komponent krever også et opphav for replikasjon fra begge organismer for å kunne opprettholdes som et plasmid DNA i begge organismer. (I dette tilfelle er dette E.coli-opphavet fra pBR322 og arsl opphavet fra kromosom III hos gjær.) ;Den andre bestanddelen i plasmidet er en 5'-tilgrensende sekvens fra et gjærgen med høy ekspresjonsgrad for å fremme transkripsjon av et strukturelt gen som er plasert nedstrøms. I dette tilfelle er den 5'-tilgrensende sekvens som brukes, den fra 3-fosfoglyceratkinase (PGK) genet hos gjær. Fragmentet ble bygd opp på en slik måte at man fjernet ATG hos den strukturelle sekvensen til PGK, samt 8 bp oppstrøms for denne ATG. Denne sekvens ble erstattet av en sekvens som inneholdt både et Xbal og EcoRI restriksjonssted for vanlig tilknytning av denne 5<1->tilgrensende sekvens til det strukturelle gen. ;Den tredje bestanddel i systemet er et strukturelt gen ;bygd opp på en slik måte at det inneholder både et ATG translasjonsstart- og translasjonsstopp-signaler. Isoleringen og oppbyggingen av et slikt gen er beskrevet ovenfor. ;Den fjerde bestanddel er en gjær DNA-sekvens som inneholder den 3'-tilgrensende sekvensen til et gjær-gen, som inneholder de rette signalene for transkripsjonsavslutning og polyadenylering. ;Med alle disse bestanddelene tilstede har immuninterferon blitt produsert i gjær. ;3. Ekspresjon_i_pattedyrcellekul ;Strategien for syntesen av immuninterferon 1 pattedyrcelle-kultur var avhengig av utviklingen av en vektor som var ;i stand til både autonom replikasjon og ekspresjon av et fremmed gen under kontroll av en heterolog transkripsjons-enhet. Replikasjonen av denne vektor i vevkultur ble ut-ført ved å tilveiebringe et DNA replikasjonsopphav (avledet fra SV40 virus) og tilveiebringer hjelperfunksjonen (T-antigen) ved innføringen av vektoren i en cellelinje som endogent uttrykte dette antigen (28, 29). Den forhenværende promoter til SV40 virus kom foran det strukturelle genet for interferon og sikret transkripsjonen av genet. ;Vektoren som ble brukt for å oppnå ekspresjon av IFN-y besto av sekvenser fra pBR322 som tilveiebragte en selekter-bar markør for seleksjon i E.coli (ampicillin resistens) samt et E.coli opphav for DNA replikasjon. Disse sekvenser ble avledet fra plasmidet pML-1 (28) og omsluttet området som omfattet restriksjonsstedene for EcoRI og BamHI. SV40 opphavet er avledet fra et PvuII-Hindlll fragment med 342 basepar som omslutter dette området (30, 31) (begge ender omdannes til EcoRIeender). I tillegg til å omfatte virus-opphavet for DNA-replikasjon, koder disse sekvenser for promoteren for både den tidlige og den sene transkripsjonsenheten. Orienteringen av området med opphav i SV40 var slik at promoteren for den sene transkripsjonsenheten var plasert nært opp til genet som koder for interferon. ;Fig. 1 viser en sukrosegradient centrifugering av indusert perifert blod lymfocyt (PBL) poly(A)+ RNA. Det ble observert to topper med interferonaktivitet (som vist med de skraverte søylene) med størrelser på 12S og 16S. Posisjonene for ribosomale RNA-markører (sentrifugert uavhengig) er avmerket over absorbsjonsprofilen. ;Fig. 2 viser en elektroforese av indusert PBL poly(A)+ ;RNA gjennom en syre-urea-agarose. Det ble observert kun en aktivitetstopp som fremkom sammen med 18S RNA. Posisjonene for ribosomal RNA markører som ble gjort til gjenstand for elektroforese i et tilgrensende felt og visuali-sert ved hjelp av ethidiumbromid-farving, er avmerket over aktivitetsprofilen. ;Fig.3 viser hybridiseringsmønstre for 96 kolonier med 32 ;induserte og ikke-induserte p-merkede cDNA-prøver. 9 6 individuelle transformanter ble dyrket på en mikrotiterplate, replika-utplatet på to nitrocellulosemembraner og deretter ble filtrene ;32 ;hybridisert med p-cDNA prøver fremstilt fra enten indusert mRNA (øverst) eller mRNA isolert fra ikke-induserte PBL-kulturer (ikke-indusert,nederst). Filtrene ble vasket for å fjerne ikke-hybridisert ;RNA og deretter eksponert mot røntgenfilm. Dette settet av filtere er representativt for 86 slike sett (8300 uavhengige kolonier). Et eksempel på et "indusert" klon er merket H12. ;Fig. 4 er et restriksjonsendonukleasekart for cDNA innskuddet i klon 69. cDNA innskuddet er bundet ved Pstl steder (punkter i begge ender) og oligo dC-dG-ender (enkle linjer). Antallet og størrel-sen av fragmenter fremstilt ved restriksjonsnukle-asespalting ble bestemt ved elektroforese gjennom 6 prosent akrylamidgeler. Posisjoner for steder ;ble bekreftet ved nukleinsyresekvensering (vist i fig.5). Det kodende området i den største ;åpne leserammen er angitt med en søyle og det skraverte området angir det som vanligvis antas å være sekvensen for det 20 rester store signalpeptid, mens det stiplede området angir sekvensen for det fullstendige INF (146 aminosyrer). 5'-enden til mRNA-en er til venstre mens 3'-enden er til høyre. ;Fig. 5 illustrerer nukleotidsekvensen til plasmid p69 ;cDNA-innskuddet, idet den illustrerer den meste vanlige alleliske form av IFN-y. Den utledede aminosyresekvensen til den lengste åpne leserammen er også angitt. Det som antas å være signal-sekvensen, er angitt med restene merket Sl til S20. Fig. 6 er en sammenligning av IFN-y mRNA struktur med den for leukocyt (IFN-a) og fibroblast (IFN-p) interferoner. mRNA-en for klon 69 (merket immun) inneholder betydelig større mengder av ikke-translaterte sekvenser. ;Fig.7 er et skjematisk diagram for oppbyggingen av ;IFN-y ekspresjonsplasmidet pIFN-y trp 48. Ut-gangsmateriålet er det 1250 basepar store Pstl cDNA innskuddet fra plasmid p69. ;Fig.8 viser et diagram for plasmid brukt til ekspresjon ;av IFN-y i apeceller. ;Fig. 9 viser en "Southern" hybridisering av åtte forskjellige EcoRI-spaltede human genom DNAer hybri-32 disert med et p-merket 600 basepar stort Ddel fragment fra cDNA innskuddet fra p69. To EcoRI fragmenter hybridiserer klart med prøven i hver DNA-prøve. ;Fig. 10 viser en "Southern" hybridisering av human ;genom DNA spaltet med seks forskjellige restriksjons endonukleaser hybridisert med den p-merkede prøve fra p69. ;Fig. 11 illustrerer skjematisk restriksjonskartet for det 3,1 kbp store Hindlll innskuddet av vektor pBl fra hvilken .PGK promoteren ble isolert. Innføringen av et^EcoRI sted og et Xbal sted i den 5<1->tilgrensende DNA i PGK genet er indikert. Fig. 12 illustrerer den 5'-tilgrensende sekvens pluss den første kodende sekvens for PGK genet før innføring av Xbal og EcoRI steder. Fig. 13 illustrerer skematisk teknikker som ble brukt for å innføre et Xbal sted i posisjon 8 i PGK promoteren og til å isolere et 39bp fragment-fra den 5'-tilgrensende sekvens av PGK som inneholder denne Xbal ende og en Sau3A ende. ;Fig. 14 illustrerer skjematisk oppbyggingen av et 300 ;bp fragment som inneholder det ovenfor 39bp-fragment, en ytterligere PGK 5'-tilgrensende sekvens (265bp) fra Pvul til Sau3A (se fig. 11), og et EcoRI sted som grenser opp til Xbal. ;Fig. 15 illustrerer skjematisk oppbyggingen av det 1500 bp store PGK.promoterfragmentet (Hindlll/ EcoRI) som' i tillegg til fragmentet konstruert ;i fig. 14, inneholder et 1300bp Hindlll til ;Pvul fragment fra. PGK 5*-tilgrensende sekvens

(se fig. 11).

Fig. 16 illustrerer sammensetningen av en ekspresjonsvektor for human immuninterferon i gjær som inneholder den modifiserte PGK promoter, IFN-y cDNA og terminatorområdet til gjær PGK genet som er beskrevet mere detaljert nedenunder.

A. Kilde for IFN- y mRNA

Lymfoeytter fra perifert blod (PBLer) ble mottatt fra humangivere ved leukoforese. PBler ble ytterligere renset ved "Ficoll-Hypaque" gradientsentrifugering og deretter dyrket ved en konsentrasjon på 5x10^ celler/ml i RPMI 1640, 1 prosent L-glutamin, 25 mH HEPES og 1 prosent penicillin-streptomycin-oppløsning (Gibco, Grand Island, NY). Disse celler ble indusert til å produsere IFN-y ved hjelp av det mitogene stafylokokenterotoksin B (1,ug/ml) og dyrket i 24 til 48 timer ved 37 oC i 5 prosent C^. Desacetyltymosin-a-1 (0,lyug/ml) ble tilsatt til PBL kulturer for å øke det relative utbytte av IFN-y aktivitet.

B. mRNA- isolering

Alt RNA fra PBL kulturer ble ekstrahert i det vesentlige

som angitt av Berger, S.L. et al. (33). Celler ble pelletisert ved sentrifugerihg og deretter resuspendert i 10 mM NaCl,

10 mM tris-HCl (pH 7,5) , 1,5 mM MgCl2 og 10 mM ribonucleosid vanadylkompleks. Celler ble lysert ved tilsats av NP-40

(1 prosent sluttkonsentrasjon), og kjerner ble. pelletisert ved sentrifugering. Supernatanten inneholdt fast RNA som ble ytterligere renset ved flere fenol- og kloroformekstraksjoner. Den vandige fase ble gjort 0,2 M i NaCl og deretter ble alt RNA utfelt ved tilsetningen av to volumdeler etanol. RNA

fra ikke-induserte (ikkestimulerte) kulturer ble isolert ved de samme metodene. Oligo-dT cellulosekromatografering ble anvendt for å rense mRNA fra preparatene med alt RNA

(34). Typiske utbytter fra 1-2 liter dyrket PBL var 5-10

mg av alt RNA og 50-200^,ug poly(A)+ RNA.

C. Størrelsefraksjonerlng av mRNA

To metoder ble brukt for å fraksjonere mRNA preparater.

Disse metoder ble brukt hver for seg (heller enn sammen) og hver ga: en betydelig anrikning av IFN-y mRNA.

Sukrose gradientsentrifugering i nærvær av det denaturerende formamid ble brukt for å fraksjonere mRNA. Gradienter på 5 prosent til 25 prosent sukrose i 70 prosent formamid (32) ble sentrifugert ved 154.000 x g i 19 timer ved 20°C. På hverandre følgende fraksjoner (0,5 ml) ble deretter fjernet fra toppen av gradient, etanol utfelt og en prøve ble injisert i Xenopus laevis oocyter for translasjon av mRNA (35). Etter 24 timer ved værelsetemperatur ble så inkubasjons-mediet analysert for antivirusaktivitet i en standard ana-lysemetode for inhibering av cytopatisk virkning under anvendelse av vesikulart stomatitis virus (Indiana stamme) eller encefalomyokarditis virus på WISH (human amnion) celler som ble beskrevet av Stewart (36), med unntak av at prøvene ble inkubert med cellene i 24 timer (i stedet for 4) før angrep med virus. Følgelig ble det observert to aktivitet stopper i sukrosegradientfraksjonert RNA (fig. 1).

En topp avtegnet seg med en beregnet størrelse på 12S og inneholdt 100 - 400 enheter/ml antivirusaktivitet (sammenlignet med IFN-a-standard) per mikrogram injisert RNA. Den andre aktivitetstoppen avtegnet seg som 16S i størrelse og inneholdt omtrent halvparten av aktiviteten til den saktere avtegnende topp. Hver av disse aktivitetstopper synes å skyldes IFN-y, ettersom ingen aktivitet ble observert når de samme fraksjoner ble undersøkt på en cellelinje fra kveg (MDBK) som ikke er beskyttet av human IFN-y. Både IFN-a aktivitet og IFN-3 aktivitet ville lett blitt påvist ved hjelp av MDBK analyse (5).

Fraksjonering av mRNA (200 ^ug) ble også utført ved elektroforese gjennom syreurea-agarosegeler. Plateagarosegel (37, 38) var sammensatt av 1,75 prosent agarose, 0,025 M natrium-citrat, pH 3,8 og 6M urea. Elektroforese ble utført i 7 timer ved 25 milliamper og 4°C. Gelen ble deretter fraksjonert med et barberblad. De enkelte stykkene ble smeltet ved 70°C og ekstrahert to ganqer med fenol og en gang med kloroform. Fraksjoner ble så etanolfelt og deretter undersøkt for IFN-y mRNA ved injeksjon i Xenopus laevis oocyter og antiviralanalyse. Kun en aktivitetstopp ble observert i gelfraksjonerte prøver (fig. 2). Denne topp stemte overens med 18S RNA og hadde en aktivitet på 600 enheter pr. milli-liter pr. mikrogram injisert RNA. Denne aktivitet syntes også å være IFN-y spesifikk, ettersom den ikke beskyttet MDBK-celler.

Avviket i størrelse mellom aktivitetstopper observert på sukrosegradienter (12S og 16S) og syre-urea-geler (18S) kan forklares med den iakttagelse at disse uavhengige fraksjo-neringsmetodene ikke utføres under betingelser for fullstendig denaturering.

D. Fremstilling av en kolonisamling som inneholder IFN-y-sekvenser

3^ug gel-fraksjonert mRNA ble brukt for fremstillingen av dobbelkjedet cDNA ved standard fremgangsmåter (26, 39). cDNA-en ble størrelsesfraksjonert. på en 6 prosent polyakrylamidgel. To størrelsesfaksjoner ble elektroeluert, 800 ->1500 bp( 138 ng) og 1500 bp (204 ng). 35 ng porsjoner av hver størrelse cDNA ble forlenget med deoksy C-rester ved å bruke ende-deoksynukleotidyltransferase (40) og herdet med 300 ng av plasmidet pBR322 (41) som på lignende måte var blitt påhengt deoksyG-rester ved Pstl stedet (40). Hver herdet blanding ble så transformert inn i det E.coli K12 stamme 294. Man fikk omtrent 8000 transformanter med den 800-1500 bp store cDNA og 400 transformanter med den mere enn>1500 bp cDNA.

E. Undersøkelse av kolonisamling etter induserte cDNAer Koloniene ble hver for seg inokulert i brønner på mikrotiterplater som inneholdt LB. (58) + 5^.ug/ml tetracyklin og lagret ved -20°C etter tilsats av DMSO til 7 prosent. To kopier av kolonisamlingen ble dyrket opp på nitrocellulosefiltere og DNAen fra hver koloni fiksert til filteret ved Grunstein-Hogness fremgangsmåten (42).

32p-merkede cDNA prøver ble fremstilt ved å bruke 18S størrelse gelfraksjonert mRNA fra induserte og ikke-induserte PBL-kulturer. Som oppstarter ble det brukt oligo ^T^2-18°^ reaksjonsbetingelser er tidligere blitt beskrevet (1).

Filtere som inneholdt 8000 transformanter fra det 600-1500 bp store cDNA størrelsesintervalet og 400 transformanter fra det mere enn 1500 bp store cDNA størrelsesintervallet, ble

6 32

hybridisert med 20 x 10 cpm indusert p-cDNA. Et dublett sett filtere ble hybridisert med 20 x IO<6> cpm ikke-indusert 32

p-cDNA. Hybridisering varte i 16 timer under anvendelse av betingelser beskrevet av Fritsch et al. (43). Filteret ble grundig vasket (43) og deretter eksponert mot Kodak XR-5 røntgenfilm med DuPont "Lightning-Plus" for sterkskjermer i 16 til 48 timer. Hver kolonis hybridiseringsmønster med de to prøver ble sammenlignet. Omtrent 40 prosent av koloniene hybridiserte tydelig med begge prøver, mens omtrent 50 prosent av koloniene ikke hybridiserte med noen av prøvene(gjengitt i fig. 3). 124 kolonier hybridiserte signifikant med den induserte prøve, men ikke påvisbart eller svakere med den ikke-induserte prøve. Disse kolonier ble hver for seg inokulert i brønner på mikrotiterplater, dyrket og overført til nitrocellulosefiltere, og hybridisert med de samme to prøver som beskrevet ovenfor. Plasmid DNA

isolert fra hver av disse kolonier ved en hurtigmetode (44) ble også bundet til nitrocellulosefiltere og hybridisert (45) med de induserte og ikke-induserte prøver. DNA fra 22 kolonier hybridiserte med bare den induserte prøve og ble betegnet "induserte" kolonier.

F. Karakterisering av Induserte kolonier

Plasmid DNA ble fremstilt fra 5 av de induserte kolonier (46) og brukt til karakterisering av cDNA inskuddene. Kart-legging med restriksjons endonuklease av fem induserte plasmider" (p67, p68, p69, p71 og p72) antydet at fire hadde like restriksjonsnukleasekart. Disse fire (p67, p69, p71 og p72) hadde hver fire Ddel steder, 2 Hinfl steder og ett enkelt Rsal sted i cDNA-innskuddet. Det femte plasmid (p68) inneholdt et felles Ddel fragment og syntes å være en kort cDNA klon i forhold til de andre fire. Homologien antydet av restriksjonsnuklease-kartleggingen ble bekreftet ved hybridisering. En <32>p-merket DNA prøve ble fremstilt (47) fra et 600 bp Ddel fragment av p67 plasmidet og brukt til hybridiserin- (42) til de andre induserte kolonier. Alle fem av de restriksjonsnuklease kartlagte kolonier kryss-hybridiserte med denne prøve, noe som også 17 andre kolonier av de 124 utvalgte i indusert/ikke-indusert undersøkelse gjorde. Lengden av cDNA innskuddet i hver av disse kryss-hybridiserte plasmider ble bestemt ved Pstl nedbryting og gel elektroforese. Klonen med det lengste cDNA-innskudd syntes å være klon 69 med en innskuddlengde på 1200-1400 bp. Dette DNA ble brukt til alle videre eksperimenter og dens restriksjonsendonuklease kart er vist i fig. 4.

cDNA-innskuddet i p69 ble påvist å være IFN-y cDNA gjennom dets ekspresjonsprodukter/ fremstilt i tre uavhengige ekspre-sjonssystemer, som ga antivirusaktivitet, som beskrevet mere detaljert nedenfor.

G. Sekvensanalyse av cDNA- innskudd i p69

Den fullstendige,nukleetidsekvens til plasmid p69 cDNA innskuddet ble bestemt ve- dideoksynukleotid kjedeavslutnings-metoden (48) etter subkloning av fragmenter inn i Ml3 vektoren mp7 (49) og ved den kjemiske fremgangsmåten til Maxam-Gilbert (52). Den lengste åpne leseramme koder for

et protein med 166 aminosyrer, gjengitt i fig. 5. Den første resten som det kodes for er det første metkodon som faller sammen med 5'-enden av cDNA-en. De 20 første restene ved aminoenden tjener sannsynligvis,som en signalsekvens for utskillelsen av de gjenværende 146 aminosyrene. Denne antatte signalsekvens hår egenskaper til felles med andre karakteriserte signalsekvenser, slik som størrelse og hydro-fobisitet. Videre er de fire aminosyrene som ble funnet ved

den antatte spaltingssekvensen (ser-leu-gly-cys), identiske med fire rester som er funnet ved spaltingspunktet hos flere leukocyttinterferoner (lelF B, C, D, F og H (2)). Den fullstendige aminosyresekyensen på 146 aminosyrer (i det følgende betegnet "rekombinant human immun-interferon") som det koder for, har en molekylvekt på 17.140.

Det er to potensielle glykosyleringsposisjoner (50) i protein-sekvensen som det kodes for, ved aminosyrene 28 til 30 (asn-gly-thr) og aminosyrer 100 til 102 (asn-tyr-ser). Eksistensen av disse posisjoner er i overensstemmelse med

den observerte glykosylering av human-IFN-Y-(6,51). I tillegg er de to eneste cysteinrester (posisjoner 1 og 3) sterisk for nære hverandre til å danne en disulfidbru, noe som er i overensstemmelse med den observerte stabilitet av IFN-y i nærvær av reduksjonsmidler slik som (i-merkaptoetanol (51). Den antatt fullstendige aminosyresekvens er vanligvis svært basisk, med i alt 30 lysin-, arginin-, og histidin-rester og bare ialt 19 asparaginsyre- og glutaminsyrerester.

mRNA-strukturen til IFN-y slik den utledes fra DNA-sekvensen til plasmid p69, er klart forskjellig fra IFN-a (1, 2) eller IFN-3 (5) mRNA. Som det fremgår av fig. 6, er det kodede området i IFN-y kortere mens de 5' ikke-oversatte og 3' ikke-oversatte områder mye lengre enn hos både IFN-a og

IFN-B.

H. Ekspresjon av rekombinant human immun- interferon i E. coli Under henvisning til fig. 7 ble 50^ug plasmid p69 brutt ned med Pstl og det 1250 bp innskuddet isolert ved gelelektroforese på en 6 prosent polyakrylamidgel. Omtrent 10 ^ug av dette innskudd ble elektroeluert fra gelen. 5^ug av dette Pstl fragment ble delvis brutt ned med 3 enheter BstNI (Bethesda Research Labs) i 15 minutter ved 37°C og reaksjons-blandingen ble renset på en 6 prosent polyakrylamidgel. Omtrent 0,5^,ug av det ønskede 1100 bp BstNI - Pstl fragment ble utvunnet. De to angitte deoksyoligonukleotider, 5'-dAATTCATGTGTTATTGTC og 5'-dTGACAATAACACATG (fig.7), ble syntetisert ved fosfortriestermetoden (53) og fosforylert på følgende måte. 100 pmol av hver deoksyoligonukleotid ble slått sammen i 30,ul 60 mM tris-HCl (ph 8), 10 mM MgCl-,

15 mM fJ-merkaptoetanol og 240 ^uCi (y- p)ATP (Amersham,

5000 Ci/mmol). 12 enheter T4 polynukleotidkinase ble tilsatt og reaksjonen utført ved 37°C i 30 minutter. 1^.1 av 10 mM ATP ble tilsatt og omsetningen fortsatt i ytterligere

20 minutter. Etter 0-0H/CHC13 ekstraksjon ble oligomerene slått sammen med 0,25 ^ug av BstNI-Pstl 1100 basepar fragmentet og etanol utfelt. Disse fragmenter ble bundet sammen ved 20°C i 2 timer i 30^ul 20 mM tris-HCl (ph 7,5), 10 mM MgCl2, 10 mM ditiotreitol, 0,5 mM ATP og 10 enheter T4 DNA ligase. Blandingen ble brutt ned i 1 time med 30 enheter Pstl og 30 enheter EcoRI (for å eliminere polymerisering gjennom ligering av kohesive ender) og gjort til gjenstand for elektroforese på en 6 prosent polyakrylamidgel. 1115 bp produktet (110.000 cpm) ble utvunnet ved elektroeluering.

Plasmidet pLelF A trp 103 (fig. 7) er et derivat av plasmidet pLelF A 25 (1) hvori EcoRI stedet som ligger langt fra LelF A genet er blitt fjernet (27) 3^ug pLelF A trp 103

ble brutt ned med 20 enheter EcoRI og 20 enheter Pstl i 90 minutter ved 37°C og gjort til gjenstand for elektroforese på en 6 prosent polyakrylamidgel. Det store ( ~ 3900 bp) vektorfragmentet ble utvunnet ved elektroeluering. Det 1115bp EcoRI-Pstl IFN-y DNA fragmentet ble bundet sammen i 0,15 ^ug av denne fremstilte vektor. Transformasjon av E. coli K-12 stamme 294-(ATCC nr. 31446) ga 120 tetracyklin-resistente kolonier. Plasmid DNA ble fremstilt fra 60 av disse transformantene og brutt ned med EcoRI og Pstl. Tre av disse plasmider inneholdt det ønskede 1115 bp EcoRI-Pstl fragmentet. DNA sekvensanalyse verifiserte at disse plasmider hadde den ønskede nukleotidsekvens ved sammenkoblingen mellom trp-promoteren, syntetisk DNA og cDNA. Ett av disse plasmider pIFN-y trp 48 ble valgt ut for ytterligere undersøkelse. Dette

plasmid ble brukt til å transformere E.coli K-12 stamme W3110 (ATCC nr. 27325).

I. Genstruktur av den IFN- y kodende sekvens

Strukturen av genet som koder for IFN-y ble analysert ved "Southern" hybridisering. Ved denne fremgangsmåte (54) brytes 5 mikrogram human lymfocyt DNA med høy molekylvekt (fremstilt som i 55) fullstendig ned med forskjellige restriksjonsendonukleaser, gjøres til gjenstand for elektroforese på 1,0 prosent agarosegeler (56) og strykes ut på et nitrocellulosefilter (54). En <32>p-merket DNA-

prøve ble fremstilt (47) fra 600 bp Ddel-fragment av cDNA innskuddet i p69 og hybridisert (43) med nitrocellulose-DNA utstrykingen. 10 tellinger pr. minutt av prøven ble hybridisert i 16 timer og deretter vasket som beskrevet (43).

Åtte genom DNA prøver fra forskjellige humangivere ble brutt ned med EcoRI restriksjonsendonuklease og hybridisert med

32

den p69 p-merkede prøve. Som angitt i fig. 9, ble det observert to klare hybridiseringssignaler med størrelse på 8,8 kilobasepar (kbp) og 2,0 kbp som anslått ved sammenligning av mobilitet med Hindlll nedbrutt XDNA. Dette kunne være resultatet av to IFN-y-gener eller en enkelt genspalting av et EcoRI sted. Ettersom p69 cDNA-en ikke inneholder noe EcoRI sted, ville en intervenerende sekvens (intron) med et indre EcoRI sted være nødvendig for å forklare et enkelt gen. For å skille mellom disse muligheter, ble en annen "Southern" hybridisering utført med den samme prøven mot fem andre endonukleasenedbrytinger av en enkel human DNA (fig. 10). To hybridiserende DNA-fragmenter ble observert med to andre endonuklease nedbryt-inger, PvuII (6,7 kbp og 4,0 kbp) og HincII (2,5 kbp og 2,2 kbp). Tre nedbrytningsmønstere med endonuklease gir imidlertid bare et enkelt hybridiserende DNA fragment: Hindlll (9,0 kbp), Bglll (11,5 kbp) og BamHI (9,5 kbp).

To IFN-y gener ville måtte tilknyttes i en uvanlig kort avstand fra hverandre (mindre enn 9,0 kbp) for å komme innenfor det samme Hindlll hybridiserende fragment. Dette resultat antyder at bare et enkelt homologt IFN-y-gen (i motsetning til de mange beslektede IFN-a-gener) er tilstede i human genom DNA og at dette gen er oppdelt av ett eller flere introner som inneholder EcoRI, PvuII og HincII steder. Denne antagelse ble understøttet ved hybridisering av et 32p-merket (47) fragment fremstilt nettopp fra det 3' ikke-translaterte området i cDNA fra p69

(130 bp Ddel fragment fra 860 bp til 990 bp i fig. 5)

mot en EcoRI nedbrytning av human genom DNA. Bare det 2,0 kbp EcoRI fragment hybridiserte med denne prøve, noe som antyder at dette fragment inneholder de 3' ikke-translaterte sekvenser, mens det 8,8 kbp EcoRI fragment inneholder 5'-sekvensene. Genstrukturen til IFN-y (ett gen med minst ett intron) er klart forskjellig fra IFN-a (flere gener (2) uten introner (56)) eller IFN-p (ett gen med ingen introner (57)).

J. Fremstilling av bakterieekstrakter

En kultur av E. coli W3110/pIFN-y trp 48 dyrket over natten

i Lur ia næringsmedium + 5 mikrogram per ml tetracyklin ble brukt til å inokulere M9 (58) medium som inneholdt 0,2 prosent glukose, 0,5 prosent kasaminosyrer, og 5 mikrogram per ml tetracyklin i en fortynning på 1:100. Indolakryl-syre ble tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 20 mikrogram pr. ml når A^^0 var mellom 0,1 og 0,2. Ti ml store prøver ble tatt ut ved sentrifugerin ved A550<=> 1'°°9 resuspendert umiddelbart i 1 ml fosfatbufferet saltvannsoppløsning som inneholdt 1 mg pr. ml sérumalbumin fra kveg (PBS-BSA). Celler ble åpnet ved hjelp av lydbølger og fraskilt rester ved sentrifugering. Supernatantene ble lagret ved 4°C frem til de skulle analyseres. Interferonaktivitet i supernatantene ble bestemt til å være 250 enheter/ml ved sammenligning med IFN-a standarder ved hjelp av inhiberingsanalysen av den cytopatiske effekt (CPE)}.

K. Transformasjon av gjær/ stammer og media

Gjærstammer ble transformert som tidligere beskrevet (59).

E. coli stamme JA300 (thr leu B6 thi thy A trp_C1117 hsdm" hsdR~ str<R>) (20) ble brukt til å velge ut plasmider som inneholdt funksjonelt TRPI gen. Gjærstamme RH218 med det genotype (a trpl 2al2 SUC2 mal CUPI) (18) ble brukt som gjærtransformasjonsvert. RH218 er deponert uten restriksjoner i American Type Culture Collection, ATCC nr. 44076. M9 (minimalmedium) med 0,25 prosent kasaminosyrer (CAA) og LB (rikt medium) var som beskrevet av Miller (58) med tilsats av 20^,ug/ml ampicillin (Sigma) etter at media er autoklavert og avkjølt. Gjær ble dyrket på de følgende media: YEPD inneholdt 1 prosent gjærekstrakt, 2 prosent pepton og 2 prosent glukose +3 prosent Difco agar.

YNB+CAA inneholdt 6,7 gram gjærnitrogenbase (uten aminosyrer) (YNB)(Difco), 10 mg adenin, 10 mg uracil, 5 gram CAA, 20 gram glukose og + 30 gram agar pr. liter.

L. Oppbygging av gjær ekspresjonsvektor

1. Kyig YRp7 (14,15,16) ble brutt ned med EcoRI. Resulterende utstikkende DNA ender ble gjort butte ved å bruke DNA polymerase I (Klenow fragment). Vektor og innskudd ble kjørt på 1 prosent agarose (SeaKem) gel, skåret ut fra gelen, elektroeluert og ekstrahert 2x med like store volumer kloroform og fenol før utfelling med etanol. De resulterende DNA molekyler med butte ender ble deretter bundet sammen i et sluttvolum på 50^ul i 12 timer ved 12°C. Denne ligeringsblanding ble så brukt til å transformere E. coli stamme JA300 til ampicillin resistans og tryptofanprototrofi. Plasmider som inneholdt TRPI genet i begge orienteringer,ble isolert. pFRWl hadde TRPI genet i samme orientering som YRp7, mens pFRW2 hadde TRPI genet i den motsatte orientering. 20 ^ug pFRW2 ble gjort lineært med Hindlll og utsatt for elektroforese på en 1 prosent agarosegel. Lineære molekyler ble eluert fra gelen og 200 ng ble deretter bundet sammen med 500 ng av det 3,1 kb Hindlll inskuddet i plasmid pBl (13), som er et restriksjonsfragment som inneholder gjær 3-fosforglyceratkinasegenet. Sammenbindingsblandingen ble brukt til å transformere E. coii stamme 294 til ampicillinresistens og tetracyklinsensitivitet. Plasmid fremstilt fra en slik rekombinant hadde et intakt TRPI gen med det 3,1 kbp store Hindlll fragmentet fra pBl innskutt DNA i Hindlll stedet til genet for tetracyklinresistene. Dette plasmid er pFRM31. 5^ug av pFRM31 ble fullstendig brutt ned med EcoRI, ekstrahert to ganger med fenol og kloroform og deretter etanolutfelt. De kohesive endene til molekylet ble bundet ved å bruke DNA polymerase I (Klenow fragment) i en omset-ning som ble utført med 250,uM av hvert deoksynukleosid6-trifosfat. Omsetningen ble utført i 20 minutter ved 14 C hvoretter DNA ble' ekstrahert to ganger med fenol-kloroform og deretter utfelt med etanol. Den resuspenderte DNA ble så fullstendig brutt ned med Clal og utsatt for elektroforese på en 6 prosent akrylamidgel. Vektorfragmentet ble eluert fra gelen, ekstrahert med fenol-kloroform og utfelt med etanol.

De seks aminosyrene i N-enden av 3-fosfoglyceratenzymet isolert fra mennesker er som følger:

En av translasjons-leserammene frembragt fra DNA-sekvensen

i det 141 bp store Sau3A-til Sau3A restriksjonsfragmentet (som inneholder det indre HincII sted; se PGK restriksjons-kart fig 11) gir den følgende aminosyresekvens.

Etter fjerning av initiator metionin, sees det at PGK N-endeaminosyresekvens har 5 av 6 aminosyrehomologi med N-ende aminosyresekvens i human PGK.

Dette sekvensresultatet antydet at starten i gjær PGK strukturgenet kodes for av DNA i 141bp store Sau3A restrikr-sjonsfragmentet til pBl. Tidligere arbeid (20) har antydet at DNA sekvensene som angir PGK mRNA kan foreligge i dette området av Hindlll fragmentet. Videre sekventering av 141 bp Sau3A fragmentet gir ytterligere DNA sekvens fra PGK promoter (fig. 12).

Et syntetisk oligonukleotid med sekvensen 5'ATTTGTTGTAAA3' ble syntetisert ved hjelp av standardmetoder (Crea et al., Nucleic Acids Res. 8, 2331 (1980)). 100 ng av denne oppstarter ble merket ved 5' ender ved å bruke 10 enheter T4 polynukleotidkinase i 3e2 n 20',ul reaksjonsblanding som også inneholdt 200 ^uCi [ y -p] ATP. Denne merkede oppstarteropp-løsning ble brukt i en oppstarter-reparasjonsreaksjon utformet til å bli det første trinn i en flertrinns fremgangsmåte for' å innføre et EcoRI restriksjonssted i den PGK 5'-tilgrensende DNA som kommer like foran strukturgen-sekvensen for PGK.

lOO^ug pBl (20) ble fullstendig brutt ned med Haelll og deretter kjørt på en 6 prosent polyakrylamidgel. Det øverste båndet på den etidium fargede gel (inneholdende PGK promoter-område) ble isolert ved elektroeluering som beskrevet ovenfor. Dette 1200 bp Haelll stykke DNA ble kuttet opp med HincII og deretter kjørt på en 6 prosent akrylamidgel.

650 bp båndet ble isolert ved elektroeluering. 5^ug DNA ble isolert. Dette 650 bp HaeIII-til-HincII stykket DNA ble resuspendert i 20 ^ul H20 og deretter blandet med 20^ul av den fosforylerte oppstarteroppløsning beskrevet ovenfor. Denne blandingen ble ekstrahert en gang med fenol-kloroform og deretter utfelt med etanol. Tørket DNA ble resuspendert i 50 ^ul H20 og deretter oppvarmet i et kokende vannbad i syv minutter. Denne oppløsning ble så hurtig avkjølt i et tørris-etanolbad (10-20 sekunder) og deretter overført til et ls-vannbad. Til denne oppløsningen ble det tilsatt 50^,ul av en oppløsning som inneholdt lO^ul 10X DNA polymerase I buffer (Boehringer Mannheim), lO^ul av en oppløsning som

på forhånd var gjort 2,5 mM med hensyn på hvert deoksynukleo-sidtrifosfat (dATP, dTTP, dGTP og dCTP) , 25^,1 H20 og 5 enheter DNA polymerase I, Klenow fragment. Denne lOCyul reaksjonsblanding ble inkubert ved 37°C i 4 timer. Oppløsningen ble så ekstrahert lx med fenol-kloroform, utfelt med etanol, tørket ved lyofilisering og deretter grundig kuttet opp med 10 enheter Sau3A. Denne oppløsning ble så kjørt på en 6 prosent akrylamidgel. Båndet som svarer til 39 bp i størrelse ble skåret ut fra gelen og deretter isolert ved elektroeluering beskrevet ovenfor. Dette 39 bp bånd har en butt ende og en Sau3A fremstikkende ende. Dette fragment ble klonet inn i en modifisert pFIF trp 69 vektor (5). lO^ug pFIF trp 69 ble gjort lineært med Xbal, ekstrahert en gang med fenol-kloroform og deretter utfelt med etanol. Den Xbal utstikkende ende ble utfylt ved å bruke DNA polymerase I Klenow fragment i 50^ul reaksjonsoppløsning som inneholdt 250^uM av hvert nukleosid trifosfat. Denne DNA ble kuttet med BamHI og deretter kjørt på en 6 prosent akrylamidgel. Vektorfragmentet ble isolert fra gelen ved elektroeluering og deretter resuspendert i 20 ^ul H20. 20 ng av denne vektor ble bundet med 20 ng av det 39bp store fragmentet fremstilt ovenfor i 4 timer ved værelsetemperatur. En femtedel av ligeringsblandingen ble brukt til å transformere E. coli stamme 294 til. ampicillin resistens(på LB+20^ug/ml amp plater). Plasmider fra transformantene ble undersøkt ved hjelp av en hurtig sorteringsfremgangsmåte (44) . Et plasmid, pPGK-39, ble valgt ut for sekvensanalyser. 20^-ug av dette plasmid ble brutt ned med Xbal, utfelt med etanol og deretter behandlet med 1000 enheter bakterielt alkali-fosfase ved 68°G i 45 minutter. DNA-en ble ekstrahert tre ganger med fenol-kloroform og deretter utfelt med etanol. De defosforylerte ender ble så merket i en 20 ,ul reaksjons-32 blanding som inneholdt 200 ^uCi [y -P] ATP og 10 enheter T4 polynukleotidkinase. Plasmidet ble kuttet med Sali og kjørt på en 6 prosent akrylamidgel.

Båndet for<;>det merkede innskudd ble isolert fra gelen og sekvensert ved hjelp av den kjemiske avbygningsmetode (52). DNA-sekvensen i 3'-enden til dette promoterstykket var som forventet. 2. Oppbygging av 312 bp Pvul- til- EcoRI PGK promoterfragment 25^ug pPGK-39 (fig. 13) ble brutt ned samtidig med Sali og Xbal (5 enheter av hver) og deretter utsatt for elektroforese på en 6 prosent gel. 390 bp båndet som inneholdt 39 bp promoter-stykket, ble isolert ved elektroeluering. Den resuspenderte DNA ble kuttet opp med Sau3A og deretter utsatt for elektroforese på en 8 prosent akrylamidgel. 39 bpPGK pro-moterbåndet ble isolert ved elektroeluering. Denne DNA inneholdt 39 bp av 5' enden til PGK promoter på et Sau3A-til-Xbal-f ragment.

25^,ug pBl ble kuttet opp med Pvul og Kpnl og deretter utsatt for elektroforese på 6 prosent akrylamidgel. 0,8 kbp DNA båndet ble isolert ved elektroeluering og deretter kuttet opp med Sau3A og utsatt for elektroforese på en 6 prosent akrylamidgel. 265 bp båndet fra PGK-promoten (fig. 11) ble isolert ved elektroeluering.

Denne DNA ble så bundet sammen med 39 bp promoterfragmentet omtalt ovenfor i to timer ved værelsetemperatur. Sammenbindingsblandingen ble kuttet opp med Xbal og Pvul og deretter utsatt for elektroforese på en 6 prosent akrylamidgel. 312 bp Xba-til-Pvul restriksjonsfragmentet ble isolert ved élektroeluering, deretter tilsatt til en sammenbindings-blanding som inneholdt 200 ng pBR322 (41) (tidligere isolert manglende 162 bp PvuI-til-Pstl restriksjonsfragmentet) og 200 ng av Xbal-til-Pstl LelF A cDNA genet tidligere isolert fra 20^ug pLelF trp A 25. Denne ligeringsblanding med tre faktorer ble brukt til å transformere E.coli stamme 294 til tetracyklinresistens. Transformantkolonier ble minisortert (44) og en av koloniene, pPGK-300,ble isolert idet man antok at den hadde 304 bp av PGK 5'-tilgrensende DNA bundet til LelF A genet i en pBR322 basert vektor.

5' enden i LelF A genet har den følgende Sekvens: 5'-CTAGAATTC-3'. Sammensmelting av Xbal stedet fra PGK promoterfragmehtet inn i denne sekvens muliggjør følgelig å legge til Xbal stedet et EcoRI sted. pPGK-300 inneholder således en del av PGK promoteren isolert i et Pvul-til-EcoRI fragment. 3. Oppbygging av 1500 bp EcoRI- til- EcoRI PGK promoterfragment

10 ^.ug pBl ble brutt ned med Pvul og EcoRI og kjørt på en

6 prosent akrylamidgel. 1,3 kb Pvul-til-EcoRI DNA båndet fra PGK 5'-tilgrensende DNA ble isolert ved elektroeluering. lO^ug pPGK-300 ble brutt ned med EcoRI og Pvul og 312 bp promoter fragmentet ble isolert ved elektroeluering etter at nedbrytningsblandingen var utsatt for elektroforese på en 6 prosent akrylamidgel. 5^ug av pFRL4 ble kuttet med EcoRI, utfelt med etanol og deretter behandlet med bakterielt alkalisk fosfatase ved 68°C i 45 minutter. Etter tre ekstraksjoner av DNA med fenol/kloroform, utfelling med etanol og resuspendering i 20 ml 1^0; ble 200 ng av vektoren bundet sammen med 100 ng 312 bp EcoRI-til-PvuI DNA fra pPGK-300 og 100 ng av EcoRI-til-PvuI DNA fra pBl. Sammenbindingsblandingen ble brukt til å transformere E.coli stamme 294 til ampicillin resistens. En av de oppnådde transformantene var pPGK-1500. Dette plasmid inneholdt det 1500 bp store PGK promoter fragmentet som et EcoRI-til-EcoRI eller HindIII-til-EcoRI stykket DNA. 10 ^,ug pPGK-1500 ble fullstendig brutt ned med Clal og EcoRI og deretter ble nedbrytningsblandingen utsatt for elektroforese på en 6 prosent akrylamidgel. 900 bp fragmenter som inneholdt PGK promoteren ble isolert ved elektroeluering. 10 ^ug pIFN-Y trp 48 ble fullstendig brutt ned med EcoRI og HincII og utsatt for elektroforese på en 6 prosent akrylamidgel. 938 bp båndet som inneholdt den direkte uttrykkbare IFN-y cDNA ble tisolert fra gelen ved elektroeluering.

Gjærekspresjonsvektoren ble bygd opp i en reaksjon med

tre faktorer ved å binde sammen PGK promoterfragmentet (p et Clal-til-EcoRI stykke), det utslettede pFRM-31 og det ovenfor isolerte IFN-y cDNA. Ligeringsreaksjons-blandingen ble inkubert ved 14°C i 12 timer. Sammenbindingsblandingen ble så økt til å transformere E.coli stamme 294 til ampicillinresistens. Transformanter ble analysert for nærvær av det korrekt oppbygde ekspresjonsplasmidet, pPGK-IFN-Y (figur 16). Plasmider som inneholdt ekspressjonssystemet ble brukt til å transformere sferoplaster fra gjærstamme RH218 til tryptofanprototrofi i agar uten tryptofan. Denne rekobinante gjær ble deretter undersøkt for nærvær av rekombinant human immuninterferon.

Gjærekstrakter ble fremstilt på følgende måte: ti ml kulturer ble dyrket i YNB+CAA inntil man nådde A660~l-2, samlet opp ved sentrifugering og deretter resuspendert 1

500 ^ul PBS buffer (20 mM NaH2P04, pH=7,4, 150 mM NaCl).

Et like stort volum glasskuler (0,45-0,5 mm) ble tilsatt

og blandingen ble deretter omrørt hurtig i 2 minutter. / Ekstraktene ble sentrifugert 30 sekunder ved 14.000 rpm

og supernatant fjernet. Interferonaktivitet i supernatanten ble bestemt til å være 16.000 enheter/ml ved sammenligning med IFN-a standard under anvendelse av CPE inhiberings-analyse.

M. Oppbygging av cellekulturvektor pSVy69

342 basepar Hindlll-PvuII fragmentet sam omslutter SV40 opphavet, ble omdannet til et EcoRI restriksjonssted bundet fragment. Hindlll setet ble omdannet ved tilsetning av en syntetisk oligomer (5'dAGCTGAATTC) og PvuIH stedet ble omdannet ved butt-ende ligering i et EcoRI sted som var utfylt ved å bruke polymerase I (Klenow fragment).

Det resulterende EcoRI fragment ble innført i EcoRI stedet til pML-1 (28). Et plasmid med den forhenværende SV40 promoteren orientert bort fra amp R genet ble videre modifisert ved å fjerne EcoRI stedet nærmest amp R genet til pML-1 (27)►

1023 basepar Hpal-Bglll fragmentet av klonet HBV DNA (60)

ble isolert og Hpal stedet tii hepatitis B virus (HBV) omdannet til et EcoRI sted med en syntetisk oligomer (5'dGCGAATTCGC). Dette EcoRI-BgllI bundne fragment ble direkte klonet inn i EcoRI-BamHI stedene til plasmidet beskrevet ovenfor som bærer SV40 opphavet.

Inn i det gjenværende EcoRI sted ble innført IFN-Y-genet på

et 1250 basepar Pstl fragment til p69 etter omdannelse av Pstl endene til<EcoRI ender. Kloner ble isolert hvori den forhenværende SV40 promoteren kom foran det strukturelle genet for IFN-y. De resulterende plasmider ble deretter innført i vevkulturceller (29) ved å bruke en DEAE-dekstran-teknikk (61) modifisert slik at transfeksjonen i nærvær av DEAE-dekstran ble utført i 8 timer. Cellemedia ble skiftet hver 2-3 dag. 200 mikroliter ble fjernet daglig for interferonbioanalyse. Typiske utbytter var 50-100 enheter/ml på prøver analysert tre eller fire dager etter transfeksjon.

Analyse viser at ekspresjonsproduktet mangler CYS-TYR-CYS N-terminaidelen i rekombinant human immun-interferon (kfr. fig. 5), som understøtter forekomsten av signal peptidspalting ved CYS-GLN-sammenføyningen (aminosyrer 3 og 4 på fig. 5) slik at det ferdige polypeptidet faktisk vil bestå av 143 aminosyrer.

N.. Delvis rensing av des- CYS- TYR- CYS rekombinant human imir. un-interferon

For å fremstille større mengder av det apecelleavledede

human IFN-y, ble friske monolag av COS-7 celler i 10

10 cm plater transfisert med ialt 30^ug pDLTF3 i 110 ml DEAE-dekstran (200/,ug/ml DEAE Dekstran ned molekylvekt 500.000,I-X),05 M Tris pH 7,5, i DMEM): Etter 16 timer

ved 37°C ble platene vasket tp ganger med DMEM. 15 ml friskt DMEM supplert med 10 prosent f.b.s., 2 mM glutamin, 50^,u/ml penicillin G og 50 mg/ml streptomycin ble deretter tilsatt til hver plate.' Mediene ble den følgende dag erstattet med serumfritt DMEM. Friske serumfrie media ble

deretter tilsatt hver dag. De oppsamlede mediene ble holdt ved 4°C inntil de enten ble analysert eller bundet til CPG. De sammenslåtte fraksjoner fra prøver tatt 3 og 4 dager etter transfeksjon ble funnet å inneholde i det vesentlige all aktivitet.

0,5 g CPG (kontrollert poreglass, elektronukleoniks, CPG 350, mesh størrelse 120/200) ble tilsatt til 100 ml celle supernatant og blandingen omrørt i 3 timer ved 4°C. Etter

en kort sentrifugering i en mindre centrifuge, ble de bunn-felte kuler pakket i en kolonne og vasket kraftig med 20 mM NaP04, 1 M NaCl, 0,1 prosent 3-merkaptoetanol, pH 7,2. Aktiviteten ble deretter eluert med den samme buffer som inneholdt 30 prosent etylenglykol etterfulgt av ytterligere eluering med den ovenfor nevnte buffer, inneholdende 50% etylenglykol. Praktisk talt all aktiviteten ble bundet til CPG. 75 prosent av den eluerte aktivitet ble funnet i fraksjonene eluert med 30 prosent etylenglykol. Disse fraksjoner ble slått sammen og fortynnet med 20 mM NaP04, 1 M NaCl, pH 7,2 til en sluttkonsentrasjon på 10 prosent etylenglykol og direkte tilført til en 10 ml Con A sefarose (Pharmacia) kolonne. Etter en grundig vask med 20 mM NaP04,

1 M NaCl, pH 7,2, ble aktiviteten eluert med 20 mM NaP04,

1 M NaCl 0,2 M a-metyl-D-mannosid. En betydelig mengde av aktiviteten (55 prosent) bant seg ikke til denne lektin. 45 prosent av aktiviteten eluerte med a-metyl-D-mannosid.

Forbindelsene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse kan formuleres i henhold til kjente metoder for å fremstille farma-søytisk nyttige preparater, hvorved human immun-interferon-produktet kombineres i blanding med en farmasøytisk akseptabel bærer. Passende bærere og deres utforming er beskrevet i Remington's Pharmaceutical Sciences av E. W. Martin. Slike preparater vil inneholde en effektiv mengde av interferon-proteinet sammen med en passende mengde bærer for å fremstille farmasøytisk akseptable preparater egnet for effektiv administrering av verten. Human immuninterferonet kan administreres parenteralt til individer som trenger antitumor, eller anti-virus behandling, og tii dem som oppviser Imnunundertrykte tilstander. Dosering og doseringshastighet kan være i overensstemmelse med det som vanligvis brukes ved klinisk utprøvinger av andre human interferoner, f.eks. ca. (1-10) x IO6 enheter daglig, og i tilfelle med materialer med renhet større enn 1%, rimeligvis opp til f.eks. 50 x IO<6> enheter daglig. Doseringer av IFN-y kan, på grunn av det viktige fraværet

av humanproteiner bortsett fra IFN-y, hvilke proteiner i humanavledede materialer kan indusere visse uønskede virkninger, økes betraktelig for å oppnå større virkning.

Som et eksempel på en passende doseringsform for i det vesentlig homogent IFN-y i parenteral form som er anvendbar, kan .3 mg IFN-y med spesifik aktivitet på f.eks. 2 x 10g enheter pr. mg oppløses i 25 ml 5 N serumalbumin (human) - USP, oppløsningen sendes gjennom et bakteriologisk filter

og den filtrerte oppløsning oppdeles aseptisk i 100 ampuller, hvorav hver inneholder 6 x 10^ enheter rent interferon egnet for parenteral administrering. Ampullene lagres fortrinnsvis kalt (-20°C) før bruk.

A. Karakterisering av antivirusaktivitet

For antistoff nøytraliseringer ble prøver fortynnet om nødvendig til en konsentrasjon på 500-1000 enheter/ml med PBS-BSA. Like store volumer med prøver ble inkubert i

2-12 timer ved 4 grader med seriefortynninger av kanin-antihuman leukocytt, fibroblast eller immuninterferon antisera. Anti-IFN-a og (3 ble erholdt fra National Institute of Allergy and Infectious Diseases. Anti-IFN-y ble fremstilt ved å bruke autentisk IFN-y (5-20 prosent renhet) renset fra stimulerte lymfocytter fra perifert blod.

Prøver ble sentrifugert 3 minutter ved 12.000 x g i 3 minutter før analyse. For å undersøke stabilitet ved pH2, ble prøver justert til pH 2 ved tilsats av IN HC1, inkubert i 2-12 timer ved 4°C og nøytralisert ved tilsats av IN NaOH før analyse. For å undersøke sensitivitet mot natrium-dodecylsulfat (SDS), ble prøver inkubert med et like stort volum 0,2 prosent SDS i 2-12 timer ved 4°C før analyse.

B. Karakterisering av IFN-y fremstilt av E. coli og COS-7

celler

Denne tabell viser den karakteristiske oppførsel til IFN-a,

3 og y standarder etter forskjellige behandlinger. Interferon aktiviteten produsert av E. coli W3110/pIFN-Y trp 48 og av COS-7/pSVY69 er syre-sensitiv, SDS-sensitiv og nøytraliseres av immuninterferonantiserum. Den nøytraliseres ikke av antistoffer mot IFN-a eller 3- Disse dataer bekrefter at produkter fremstilt i disse systemer er immun-interferoner og at cDNA-innskuddet i plasmid p69 koder for IFN-y.

Rensing

En fremgangsmåte hvorved IFN-y kan renses fra f.eks. bakterier er beskrevet i det følgende generelle skjema: 1. Ekstraksjon av cellene i lyse-buffer med høy ledningsevne (ved ca pH 8) ved passering gjennom en homo-genisator ved høyt trykk, avkjøling av utløpsvæsken i et isbad. 2. Utfelling av DNA ved polyetylen-imintilsats under omrøring, f.eks. ved 4°C. 3. pH utfelling av bakterieproteiner, som igjen etter-later IFN-y i oppløsning. 4. Separering av de faste stoffene ved sentrifugering ved 4°C. 5. Konsentrering av supernatanten (etter ny justering av pH) f.eks. ved ultrafiltrering. 6. Dialyse av konsentratet mot en buffer med lav ledningsevne.

7. Fjerning av faste stoffer ved sentrifugering idet

IFN-y forblir i oppløsning.

8. Ionebytterkromatografi på karboksymetylcellulose, eluering med en gradient av økende ionestyrke. 9. Kromatografi på kalsiumfosfatgel ved å eluere med en gradient av økende ionestyrke. 10. Ionebytterkromatografi på karboksymetylcellulose under svakt denaturerende betingelser ved å eluere med en gradient av økende ionestyrke.

11. Separering ved gelfiltreringskromatografi.

Den ovenfor angitte fremgangsmåte muliggjør utbytter av materiale med mere enn 95% renhet.

Det her beskrevne immuninterferonprotein er blitt definert

ved hjelp av DNA-bestemmende gen- og deduktiv aminosyre-sekvensering, jfr. fig 5. Det vil forståes at for dette bestemte interferon, som her er omfattet, eksisterer det naturlige alleliske variasjoner som opptrer fra individ til individ. Disse variasjoner kan demonstreres ved (en) amino-syreforskjell(er) i den totale sekvensen eller ved utslettinger, substitusjoner, inskudd, inversjoner eller tillegg av (en) aminosyre(er) i nevnte sekvens. Alle slike alleliske variasjoner er inkludert innen omfanget av denne oppfinnelse.

Det foreligger virkelig et potensiale i bruken av rekombinant DNA-teknologi til å fremstille forskjellige human IFN-y derivater, variert modifisert ved resulterende enkle eller multiple aminosyresubstitusjoner, utelatelser, tillegg eller erstatninger. Alle slike modifikasjoner som resulterer i slike derivater av human IFN-y, er inkludert innenfor området for denne oppfinnelse så lenge som den essensielle, karakteristiske human IFN-y-aktiviteten forblir upåvirket i sitt slag.

Med kjennskap til DNA-en og aminosyresekvensene til IFN-y (se fig. 5), ville den mest foretrukne vei for å reprodusere den foreliggende oppfinnelse utvilsomt omfatterfremstil-lingen av enten det fullstendige genet ved syntesehjelpe-midler (se 26, f.eks.), eller syntetiske deoksyoligonukleotider ved hjelp av hvilke cDNA kilden kunne utprøves for å isolere genet ved hjelp av standart hybridiserings-teknikker. Når man først har erholdt nukleotidsekvensen som koder for det nødvendige IFN-y-protein, ville midlene for å oppnå ekspresjon, isolering og rensing til preparater av IFN-y med høy renhetsgrad kunne følges i henhold til beskrivelsen ovenfor.

Bibliografi;

1. Goeddel et al., Nature 287, 411 (1980).

2. Goeddel et al., Nature 290, 20 (1981).

3. Yelverton et al., Nucleic Acids Research 9, 731 (1981).

4. Gutterman et al., Annals of Int. Med. 93, 399 (1980).

5. Goeddel et al., Nucleic Acids Research 8, 4057 (1980).

6. Yip et al., Proe. Nati. Acad. Sei. (USA) 78, 1601 (1981).

7. Taniguchi et al., Proe. Nati. Acad. Sei. (USA) 78,

3469 (1981).

8. Bloom, Nature 289, 593 (1980).

9. Sonnenfeld et al., Cellular Im munol. 40, 285 (1978).

10. Fleishmann et al., Infection and Immunity_ 26, 248 (1979).

11. Blalock et al., Cellular Immunology 49, 390 (1980).

12. Rudin et al., Proe. Nati. Acad. Sei. (USA) 77, 5928 (1980).

13. Crane et al., J.Natl. Cancer Inst. 61, 871 (1978).

14. Stinchcomb et al., Nature 282, 39 (1979).

15. Kingsman et al., Gene 7, 141 (1979).

16. Tschumper et al., Gene 10, 157 (1980).

17. Mortimer et al. , Microbiological Rev.iews 44, 519 (198).

18. Miozzari et al., Journal of Bacteriology 134, 48 (1978).

19. Jones, Genetics 85, 23 (1977).

20. Hitzeman, et al., J. Biol. Chem. 255, 12073 (1980).

21. Hess et al., J.Adv. Enzyme Re5ul. 7, 149 (1968).

22. Holland et al., Biochemistry 17, 4900 (1978).

23. Bostian et al., Proe. Nati. Acad. Sei. (USA) 77, 4504 (1980). 24. The Molecular Biology of Yeast (Aug 11-18, 1981), Cold

Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.

25. Chambon, Ann. Rev. Biochemistry, 44, 613 (1975).

25a Gluzman, Cell 23, 175 (1981).

26. Goeddel et al., Nature 281, 544 (1979).

27. Itakura et al., Science 198, 1056 (1977)

28. Lusky et al., Nature 293, 79 (1981).

29. Gluzman et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant.Biol. 44,

293 (1980).

30. Fiers et al., Nature 273, 113 (1978).

31. Reddy et al., Science 200, 494 (1978).

32. Boedtker et al., Prog. in Nucleic Acids Res. Mol. Biol. 19, 253 (1976).

33. Berger et al., Biochemistry 18, 5143 (19 79).

34. Aviv et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 69, 1408 (1972)

35. Gurdon et al., J. Molec. Biol. 80, 539 (1975).

36. Stewart, The Interferon System. Springer, New York, p. 13-26 (1979).

37. Lehrach et al., Biochemistry 16, 4743 (1977).

38. Lynch et al., Virology 98, 251 (1979).

39. Wickens et al., J. Biol. Chem. 253, 2483 (1978).

40. Chang et al., Nature 275, 617 (1978).

41. Bolivar et al., Gene 2, 95 (1977).

42. Grunstein et al., Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 72, 3961

(1975) .

43. Fritsch et al., Cell 19, 959 (1980).

44. Birnboim et al., Nucleic Acids Res. 7, 1513 (1979).

45. Kafatos et al., Nucleic Acids Res. 7, 1541 (1979).

46. Clewell et al., Biochemistry 9, 4428 (1970).

47. Taylor et al., Biochim. Biophys. Acta 442, 324 (1976).

48. Smith. Methods Enzymol. 65, 560 (1980).

49. Messing et al., Nucleic Acids Res. 9, 309 (1981).

50. Winzler, Hormonal Proteins and Peptides (ed. Li) Academic

Press, New York, p. 1 (1973).

51. Nathan et al., Nature 292, 842 (1981).

52. Maxam et al., Methods in Enzymol. 65, 490 (1980).

53. Crea et al., Proe. Nati. Acad. Sei. (USA) 75, 5765 (1978).

54. Southern, J. Molec. Biol. 98, 503 (1975).

55. Blin et al., Nucleic Acids Res. 3, 2303 (1976).

56. Lawn et al., Science 212, 1159 (1981).

57. Lawn et al., Nucleic Acids Res. 9, 1045 (1981).

58. Miller, Experiments in Molecular Genetics, p. 431-3,

Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York

(1972) 59. Beggs, Nature 275, 104 (1978). 60. Valenzuela et al., Animal Virus Genetics (ed. Fields,

Jaenisch and Fox) p. 57, Academic Press, New York (1980). 61. McCuthan et al., J. Nati. Cancer Inst. 41, 351 (1968).

Claims

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid med funksjon av human immun ("y )-interferon, hvilket polypeptid inneholder aminosyresekvensen for rekombinant human immun ("Y )-interferon, karakterisert ved at polypeptidet kodes av følgende DNA-sekvens og alleliske og redundante variasjoner derav: som eventuelt er bundet til følgende sekvens som koder for signalprotein: og at DNA-sekvensen er operativt bundet til en DNA-sekvens som fremmer ekspresjon av nevnte polypeptid i en transformert vertcelle i utvinnbar form.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at plasmidene pIFN-'Y-trp48, pSV--Y-69, eller pPGK-IFN-y anvendes som vektorer.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at E. coli, C0S-7-linjen av apenyrefibroblaster eller gjærstamme anvendes som vertceller.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den definerte sekvensen som benyttes, starter med CAG GAC CCA TAT....