JP2008526234A - Ｃｒｉｐｔｏ結合分子 - Google Patents

Ｃｒｉｐｔｏ結合分子 Download PDF

Info

Publication number
JP2008526234A
JP2008526234A JP2007550510A JP2007550510A JP2008526234A JP 2008526234 A JP2008526234 A JP 2008526234A JP 2007550510 A JP2007550510 A JP 2007550510A JP 2007550510 A JP2007550510 A JP 2007550510A JP 2008526234 A JP2008526234 A JP 2008526234A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
binding molecule
seq
sequence
amino acid
binding
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2007550510A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2008526234A5 (ja
Inventor
スコット グレーザー，
ブリジメン， ハーマン バン
アレクセイ アレクサンドロビッチ ルゴフスコイ，
ミシェル サニコラ−ナデル，
シュフェン ウー，
エレン ガーバー，
ホセ ウィリアム サルダナ，
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biogen Inc
Biogen MA Inc
Original Assignee
Biogen Inc
Biogen Idec Inc
Biogen Idec MA Inc
Biogen MA Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biogen Inc, Biogen Idec Inc, Biogen Idec MA Inc, Biogen MA Inc filed Critical Biogen Inc
Publication of JP2008526234A publication Critical patent/JP2008526234A/ja
Publication of JP2008526234A5 publication Critical patent/JP2008526234A5/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1045—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against animal or human tumor cells or tumor cell determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/53—Hinge
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Abstract

本発明は、抗ＣＲＩＰＴＯ抗体のヒト化形およびその一部に関する。１つの実施形態において、これらの抗体の可変領域またはそれらを含むポリペプチド（たとえば全長抗体またはドメイン欠失抗体）を使用して、癌などの障害を処置できる。本発明は少なくとも一部は、ＣＤＲグラフトおよび他のヒト化抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体の開発に基づく。本発明により、ヒト化抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体の複数の形が開発され、腫瘍成長について動物モデルで試験するためにメイタンソイドに接合させた。本実施例に示した結果は、生体内での腫瘍細胞成長を阻害するためのこれら抗体の有用性を証明している。これらのヒト化抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体は、ヒト被験体において使用するにはマウス抗体よりも適している。

Description

（関連出願）
この出願は、２００５年１月５日に出願された表題「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」のＵＳＳＮ６０／６４１６９１の利益を主張する。この出願は、２００３年６月２７日に出願された表題「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ」のＵＳＳＮ６０／４８３８７７、および２００３年１０月３日に出願された表題「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ」のＵＳＳＮ６０／５０８，８１０に関する。この出願はまた、２００４年６月２８日に出願された表題「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」のＵＳＳＮ１０／８８０，３２０にも関する。この出願はまた、２００４年９月２０日に出願された表題「Ｃｒｉｐｔｏ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」のＵＳＳＮ１０／９４５，８５３、２００３年１０月２３日に出願された表題「Ｃｒｉｐｔｏ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ」のＵＳＳＮ１０／６９３，５３８、ならびに２００２年３月２２日に出願された表題「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ Ｌｉｇａｎｄ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎ ｏｆ Ｃｒｉｐｔｏ」の同第６０／３６７，００２号、２００１年６月２６日に出願された表題「Ｃｒｉｐｔｏ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ」の同第６０／３０１，０９１号、２００１年５月１７日に出願された表題「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ Ｌｉｇａｎｄ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎ ｏｆ Ｃｒｉｐｔｏ」の同第６０／２９３，０２０号、および２００１年４月２６日に出願された表題「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ Ｌｉｇａｎｄ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎ ｏｆ Ｃｒｉｐｔｏ」の同第６０／２８６，７８２号に関する。これらの出願の内容は、それらの全体が参考として援用される。
（発明の背景）
抗体、および各種のその遺伝子組換え形は、各種の障害に苦しんでいる患者を処置するために現在使用されている有効な治療剤である。これらの抗体の一部は、腫瘍細胞表面に存在する抗原を認識する。Ｃｒｉｐｔｏは、多くの腫瘍細胞によって過剰発現された１８８アミノ酸細胞表面タンパク質である。Ｃｒｉｐｔｏは、ヒト胚性癌腫ライブラリのｃＤＮＡスクリーンで単離された（非特許文献１）。Ｃｒｉｐｔｏは当初、ＥＧＦファミリの一員として分類された（非特許文献１）；しかしながら続いての分析は、Ｃｒｉｐｔｏが公知のＥＧＦレセプタのいずれにも結合せず、そのＥＧＦ様ドメインがＥＧＦファミリから実際に異なっていたことを示した（非特許文献２）。
Ｃｒｉｐｔｏタンパク質の過剰発現は、多くの組織（これに限定されるわけではないが、脳、乳房、精巣、結腸、肺、卵巣、膀胱、子宮、子宮頸部、膵臓および胃を含む）における腫瘍に関連付けられる。非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５。
Ｃｒｉｐｔｏに結合するマウス抗体が説明されてきた。しかしながらマウス抗体はヒトでは治療剤としての適用性を有するが、それらはヒト起源のものではないため、それらは免疫原性でありうる。そのような抗体の投与は、中和抗体反応（ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）反応）を引き起こすことがあり、このことはたとえば慢性または再発性疾患状態の処置において反復して抗体を投与することが望ましい場合は特に問題である。またそれはマウス定常ドメインを含有するため、ヒトエフェクタ機能を示さないことがある。
免疫原性の懸念を緩和しようとする目的で、「ヒト化」抗体が産生されることが多い。１つのプロトコルにおいて、マウス起源の抗体からのＣＤＲはヒトフレームワーク領域に移行されて、「ＣＤＲグラフト」抗体を生じる。フレームワーク領域における抗原結合に潜在的に影響を及ぼすことができるアミノ酸残基はしばしば、相当するマウス残基に復帰突然変異（ｂａｃｋｍｕａｔｅｄ）される。
しかしながらヒトでのその潜在的に低い免疫原性のためにヒト化抗体が望ましいが、その産生は予測できない。たとえば抗体の配列修飾は、抗原結合親和性を実質的または完全に損失するか、あるいは結合特異性を損失し得る。加えて配列修飾にもかかわらず、「ヒト化抗体」はヒトにおいてなお免疫原性を示すことがある。ヒト化抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体の開発は、患者の細胞でのＣｒｉｐｔｏ発現の結果を抑制するのに大きな恩恵となる。加えてそのような抗体の開発は、抗腫瘍剤、たとえば毒素、放射性標識などを送達するための、Ｃｒｉｐｔｏ陽性腫瘍細胞をターゲティングする手段を提供する。
Ｃｉｃｃｏｄｉｃｏｌａら、ＥＭＢＯＪ．（１９８９）８：１９８７−９１ Ｂｉａｎｃｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９９）２７４：８６２４−２９ Ｐａｎｉｃｏら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（１９９６）６５：５１−５６ Ｂｙｒｎｅら、Ｊ．Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ（１９９８）１８５：１０８−１１ Ｄｅ Ａｎｇｅｌｉｓら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（１９９９）１４：４３７−４０
（発明の要旨）
本発明は少なくとも一部は、ＣＤＲグラフトおよび他のヒト化抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体の開発に基づく。以下でさらに詳細に述べるように、ヒト化抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体の複数の形が開発され、腫瘍成長について動物モデルで試験するためにメイタンソイドに接合された。本実施例に示した結果は、生体内での腫瘍細胞成長を阻害するためのこれら抗体の有用性を証明している。これらのヒト化抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体は、ヒト被験体において使用するにはマウス抗体よりも適している。
ヒト化全長抗体およびＣＨ２ドメインを欠失したヒト化抗体の両方を作製した。ＣＨ２ドメイン欠失抗体の構成は、異なるアイソフォームより成るダイマー結合分子（２個の重鎖部分であって、分子の一部分が少なくとも１個の鎖間ジスルフィド結合を介して結合された２個の重鎖部分を含む分子（フォームＡ）および少なくとも１個の鎖間ジスルフィド結合を介して結合されない２個の重鎖部分を含む分子の部分（フォームＢ））の混合物より成る。一方のフォームまたは他方は、たとえば疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用する分離によって、あるいはフォームＡまたはフォームＢのどちらかの優先的な生合成を引き起こす合成結合ペプチドの包含によって、優先的に得ることができる。本発明の結合ペプチドは、フォームＡおよびフォームＢのどちらも形成する傾向のあるいずれのダイマー分子、たとえば抗体分子、ドメイン欠失抗体分子（たとえばＣＨ２ドメインの一部または全部を欠失した）、ミニボディ、ダイアボディ、融合タンパク質などに包含させることができる。好ましい実施形態において、フォームＡの形成が高められる。フォームＡポリペプチドダイマーは、試験管内での安定性の向上および生体内での体内分布の向上を示す。
したがって、１つの態様において、本発明は：
Figure 2008526234
 ならびにヒトアクセプタ免疫グロブリン配列由来の可変フレームワーク領域配列から成る群より選択される少なくとも１個のＣＤＲ配列を含む結合分子に関し、該結合分子はヒトＣｒｉｐｔｏ抗原に特異的に結合する。
１つの実施形態において、結合分子はＣＤＲ Ｈ３配列
Figure 2008526234
 （配列番号：１４）を含む。
別の実施形態において、ＣＤＲ Ｈ２配列
Figure 2008526234
 （配列番号：１３）。
１つの実施形態において、結合分子はＣＤＲ Ｈ１配列
Figure 2008526234
 （配列番号：１２）を含む。
１つの実施形態において、結合分子はＣＤＲ Ｌ３配列
Figure 2008526234
 （配列番号：１１）を含む。
１つの実施形態において、結合分子はＣＤＲ Ｌ２配列
Figure 2008526234
 （配列番号：１０）を含む。
１つの実施形態において、結合分子はＣＤＲ Ｌ１配列
Figure 2008526234
 （配列番号：９）を含む。
１つの実施形態において、可変フレームワーク領域配列の少なくとも１個のフレームワーク残基は、相当するマウスＢ３Ｆ６可変領域配列由来の対応するアミノ酸残基と置換される。
別の態様において、本発明は：配列番号：３９のＣＤＲ１〜３およびヒトアクセプタ免疫グロブリン軽鎖配列由来の可変フレームワーク領域を含む軽鎖可変領域と、配列番号：４０のＣＤＲ１〜３およびヒトアクセプタ免疫グロブリン重鎖由来の可変フレームワーク領域を含む重鎖可変領域から成る結合分子に関し、該結合分子はヒトＣｒｉｐｔｏ抗原に特異的に結合する。
１つの実施形態において、ヒトアクセプタ免疫グロブリン重鎖由来の可変フレームワーク領域は、配列番号：４０のフレームワークおよびＣＤＲ領域と少なくとも約５０％は同一である。
１つの実施形態において、ヒトアクセプタ免疫グロブリン重鎖由来の可変フレームワーク領域は、ヒトサブグループ１配列、ヒトサブグループ１コンセンサス配列、またはヒト生殖系列配列に由来する。
１つの実施形態において、ヒトアクセプタ免疫グロブリン重鎖由来の可変フレームワーク領域は配列番号：４６に示すアミノ酸配列を含む。
１つの実施形態において、ヒトアクセプタ免疫グロブリン軽鎖配列由来の可変フレームワーク領域は、配列番号：３９のフレームワークおよびＣＤＲ領域と少なくとも約６０％は同一である。
１つの実施形態において、ヒトアクセプタ免疫グロブリン軽鎖配列由来の可変フレームワーク領域は、ヒトサブグループＫａｐｐａ ２配列、ヒトサブグループＫａｐｐａ ２コンセンサス配列、またはヒト生殖系列配列に由来する。
１つの実施形態において、ヒトアクセプタ免疫グロブリン軽鎖配列由来の可変フレームワーク領域は、配列番号：４５に示すアミノ酸配列を含む。
１つの実施形態において、ヒトアクセプタ免疫グロブリン重鎖由来の可変フレームワーク領域の少なくとも１個のフレームワーク残基は、配列番号：４０に示すマウスアミノ酸配列由来の対応するアミノ酸残基と置換され、少なくとも１個のアミノ酸残基は
ａ）標準残基、
ｂ）インタフェースパッキング残基、
ｃ）結合部位に近接した異常または希少な残基、
ｄ）ＣＤＲ内のある原子の約３オングストローム単位以内の側鎖原子を有する残基、
である。
１つの実施形態において、少なくとも１個のフレームワーク残基はＨ１、Ｈ４８、Ｈ６７、Ｈ７１、Ｈ７３、Ｈ８１、Ｈ８２ｂ、Ｈ９３、およびＨ１１２から成る群より選択される（Ｋａｂａｔ番号付け規則）。
１つの実施形態において、少なくとも１個のフレームワーク残基は、Ｈ４８、Ｈ６７、Ｈ７１、Ｈ７３、Ｈ９３、およびＨ１１２を含む。
１つの実施形態において、少なくとも１個のフレームワーク残基は、Ｈ７１およびＨ１１２である。
１つの実施形態において、少なくとも１個のフレームワーク残基は、Ｈ１、Ｈ４８、Ｈ７１、Ｈ８１、Ｈ８２ｂ、およびＨ１１２を含む。
１つの実施形態において、ヒトアクセプタ免疫グロブリン軽鎖配列由来の可変フレームワーク領域の少なくとも１個のフレームワーク残基は、配列番号：３９で示すマウス配列由来の対応するアミノ酸残基によって置換され、少なくとも１個のアミノ酸残基は
ａ）標準残基、
ｂ）インタフェースパッキング残基、
ｃ）結合部位に近接した異常または希少な残基、
ｄ）ＣＤＲ内のある原子の約３オングストローム単位以内の側鎖原子を有する残基、
である。
１つの実施形態において、ヒトアクセプタ免疫グロブリン軽鎖配列由来の可変フレームワーク領域は、Ｌ２またはＬ１００である（Ｋａｂａｔ番号付け規則）。
１つの実施形態において、ヒトアクセプタ免疫グロブリン軽鎖配列由来の可変フレームワーク領域は、Ｌ２である。
１つの実施形態において、ヒトアクセプタ免疫グロブリン軽鎖配列由来の可変フレームワーク領域は、Ｌ２またはＬ１００を含む。
別の態様において、本発明は：配列番号：４７、配列番号：５０、配列番号：５２のアミノ酸残基１〜１１２から成る群より選択されるＶＬ配列に示されるＣＤＲおよびフレームワークアミノ酸配列と；場合によりシグナル配列とを含む軽鎖と、配列番号：４８、配列番号：４９、配列番号：５１、配列番号：５５のアミノ酸残基１〜１２１から成る群より選択されるＶＨ配列に示されるＣＤＲおよびフレームワークアミノ酸配列と；場合により、シグナル配列とを含む重鎖から成る結合分子に関し；該結合分子はヒトＣｒｉｐｔｏ抗原に特異的に結合する。
１つの実施形態において、結合分子は、配列番号：５２のアミノ酸１〜１１２で示すフレームワークおよびＣＤＲアミノ酸配列と、場合によりシグナル配列とを含む軽鎖と、配列番号：５５のアミノ酸１〜１２１に示すフレームワークおよびＣＤＲアミノ酸配列と、場合によりシグナル配列とを含む重鎖とを含む。
１つの実施形態において、結合分子は、配列番号：４７で示すフレームワークおよびＣＤＲアミノ酸配列と、場合によりシグナル配列とを含む軽鎖と、配列番号：４８で示すフレームワークおよびＣＤＲアミノ酸配列と、場合によりシグナル配列とを含む重鎖とを含む。
１つの実施形態において、結合分子は、配列番号：４７で示すフレームワークおよびＣＤＲアミノ酸配列と、場合によりシグナル配列とを含む軽鎖と、配列番号：４９で示すフレームワークおよびＣＤＲアミノ酸配列と、場合によりシグナル配列とを含む重鎖とを含む。
１つの実施形態において、結合分子は、配列番号：４７で示すフレームワークおよびＣＤＲアミノ酸配列と、場合によりシグナル配列とを含む軽鎖と、配列番号：５１で示すフレームワークおよびＣＤＲアミノ酸配列と、場合によりシグナル配列とを含む重鎖とを含む。
１つの実施形態において、結合分子は、配列番号：５０で示すフレームワークおよびＣＤＲアミノ酸配列と、場合によりシグナル配列とを含む軽鎖と、配列番号：４８で示すフレームワークおよびＣＤＲアミノ酸配列と、場合によりシグナル配列とを含む重鎖とを含む。
１つの実施形態において、結合分子は、配列番号：５０で示すフレームワークおよびＣＤＲアミノ酸配列と、場合によりシグナル配列とを含む軽鎖と、配列番号：４９で示すフレームワークおよびＣＤＲアミノ酸配列と、場合によりシグナル配列とを含む重鎖とを含む。
１つの実施形態において、結合分子は、配列番号：５０で示すフレームワークおよびＣＤＲアミノ酸配列と、場合によりシグナル配列とを含む軽鎖と、配列番号：５１で示すフレームワークおよびＣＤＲアミノ酸配列と、場合によりシグナル配列とを含む重鎖とを含む。
１つの実施形態において、結合分子重鎖は、ＶＨ、ＶＬ、またはＣＨ１ドメインに合成結合ペプチドを介して遺伝的に融合したＣＨ３ドメインを含む。
１つの実施形態において、結合分子重鎖は、ＣＨ２ドメインの全部または一部を欠失している。
１つの実施形態において、結合分子は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４から成る群より選択されるアイソタイプの抗体に由来する定常領域を含む。
１つの実施形態において、結合分子は、γ１ヒンジ、γ２ヒンジ、γ３ヒンジ、およびγ４ヒンジから成る群より選択されるヒンジ領域に由来するアミノ酸配列を含む。
１つの実施形態において、結合分子はキメラヒンジを含む。
１つの実施形態において、結合分子は、ＩｇＧ１ヒンジドメインの少なくとも部分、ＩｇＧ３ヒンジドメインの少なくとも部分を含む。
１つの実施形態において、結合分子は、位置２３９または２４２（Ｋａｂａｔ番号付けシステム）にシステイン残基を含む重鎖定常領域を含む。
１つの実施形態において、結合分子は、野生型Ｆｃ領域と比較して少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む重鎖定常領域を含む。１つの実施形態において、該修飾は、哺乳類細胞内で改変体が発現されたときに実質的にグリコシル化されるように、ＥＵ位置２９７〜２９９のいずれかにアミノ酸置換を含む。
１つの実施形態において、結合分子は、野生型Ｆｃ領域を有する結合分子と比較して低下したエフェクタ機能を有する。
１つの実施形態において、結合分子は、低下した抗原依存性細胞毒性を有する。
１つの実施形態において、結合分子は、延長された半減期を有する。
１つの実施形態において、修飾Ｆｃ領域は、少なくとも１個の操作されたシステイン残基を有する。１つの実施形態において、組換えられたシステイン残基は、Ｆｃ領域のＣＨ３ドメイン内にある。
１つの実施形態において、本発明はエフェクタ部分に接合された結合分子に関する。１つの実施形態において、エフェクタ部分は、細胞毒、プロドラッグ、生体毒素、および放射性同位体から成る群より選択される。
１つの実施形態において、エフェクタ部分は、アミド結合を介して接合される。
１つの実施形態において、エフェクタ部分は、メイタンシノイドである。
１つの実施形態において、軽鎖は配列番号：５３で示すフレームワークおよびＣＤＲアミノ酸配列を含み、重鎖は配列番号：５６で示すフレームワークおよびＣＤＲアミノ酸配列を含む。
１つの実施形態において、軽鎖は配列番号：５３で示すフレームワークおよびＣＤＲアミノ酸配列を含み、重鎖は配列番号：５７で示す配列で示すフレームワークおよびＣＤＲアミノ酸配列を含む。
１つの実施形態において、結合分子は、γ１アイソタイプの重鎖定常領域を含む。
１つの実施形態において、結合分子は、配列番号：７１で示す重鎖定常領域配列を含む。
別の態様において、本発明は、アクセション番号 でＡＴＣＣに寄託された細胞系によって産生されたヒト化抗Ｃｒｉｐｔｏモノクローナル抗体に関する。
１つの実施形態において、結合分子は、配列番号：５３で示す配列を含む軽鎖と、配列番号：５８で示す重鎖配列とを含む。
１つの実施形態において、結合分子は、配列番号：５４で示す配列を含む軽鎖から成り、重鎖は配列番号：５６で示す配列を有する。
１つの実施形態において、結合分子は、配列番号：５４で示す配列を含む軽鎖と、配列番号：５７で示す重鎖配列とを含む。
１つの実施形態において、本発明の結合分子は、配列番号：５４で示す配列を含む軽鎖と、配列番号：５８で示す重鎖配列とを含む。
１つの実施形態において、本発明の結合分子は、配列番号：５２で示す配列を含む軽鎖から成り、重鎖は配列番号：５５で示す配列を有する。
別の態様において、本発明は、配列番号：５２、配列番号：５３、および配列番号：５４から成る群より選択される軽鎖可変領域（ＶＬ）配列を含む軽鎖と；配列番号：５５；配列番号：５６、配列番号：５７、および配列番号：５８から成る群より選択される重鎖可変領域（ＶＨ）配列を含む重鎖とを含むＣＨ２ドメイン欠失結合分子に関し；該結合分子はヒトＣｒｉｐｔｏ抗原に特異的に結合する。
１つの実施形態において、軽鎖は配列番号：５３で示す配列を有し、重鎖は配列番号：６０で示す配列を有する。
１つの実施形態において、軽鎖は配列番号：５３で示す配列を有し、重鎖は配列番号：６１で示す配列を有する。
１つの実施形態において、軽鎖は配列番号：５３で示す配列を有し、重鎖は配列番号：６２で示す配列を有する。
１つの実施形態において、軽鎖は配列番号：５４で示す配列を有し、重鎖は配列番号：６０で示す配列を有する。
１つの実施形態において、軽鎖は配列番号：５４で示す配列を有し、重鎖は配列番号：６１で示す配列を有する。
１つの実施形態において、軽鎖は配列番号：５４で示す配列を有し、重鎖は配列番号：６２で示す配列を有する。
１つの実施形態において、軽鎖は配列番号：５２で示す配列を有し、重鎖は配列番号：５９で示す配列を有する。
１つの実施形態において、結合分子は、結合分子の少なくとも１個のＣＤＲ内に少なくとも１個の保存的アミノ酸置換を含むように改変される。
１つの実施形態において、本発明の結合分子は、二重特異性である。
１つの実施形態において、本発明の結合分子は、４価である。
１つの実施形態において、本発明の結合分子は、全長抗体である。
１つの実施形態において、本発明の結合分子は、抗体断片である。
別の態様において、本発明は、少なくとも２個の結合部位および少なくとも２個のポリペプチド鎖を有するポリペプチドダイマーを含む組成物に関し、少なくとも２個の結合部位のうち少なくとも１個がヒト化Ｂ３Ｆ６可変領域を含み、少なくとも２個のポリペプチド鎖が少なくとも１個の重鎖部分および合成結合ペプチドを含み、ポリペプチドダイマーの約７０％超が少なくとも１個の鎖間ジスルフィド結合を介して結合されるポリペプチド鎖を含み、結合ペプチドがＫａｂａｔ番号付けシステムの位置２４３にプロリン残基を含む。
１つの実施形態において、ポリペプチドダイマーの９０％超が少なくとも１個の鎖間ジスルフィド結合を介して連結される。
１つの実施形態において、合成結合ペプチドは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムの位置２３９または２４２にシステイン残基をさらに含む。
１つの実施形態において、ポリペプチド鎖の少なくとも１個が、結合ペプチドを介してＶＬ、ＶＨまたはＣＨ１ドメインに連結されたＣＨ３ドメインを含む。
１つの実施形態において、合成結合ペプチドは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムの位置２４４にアラニン残基を、位置２４５にプロリン残基をさらに含む。
別の態様において、本発明は、配列番号：５３で示す軽鎖アミノ酸配列と、配列番号：５７で示す重鎖アミノ酸配列とを含むヒト化抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体に関し、抗体はメイタンソイドに接合される。
別の態様において、本発明は、結合分子と、製薬的に許容される担体とを含む組成物に関する。
１つの実施形態において、結合分子は、配列番号：５３で示す軽鎖アミノ酸配列と、配列番号：５７で示す重鎖アミノ酸配列とを含むヒト化抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体の改変体であり、該改変体は少なくとも１個の保存的アミノ酸置換を含み、該改変体は、ヒトＣｒｉｐｔｏに特異的に結合する能力を保持する。
別の実施形態において、本発明は、結合分子の重鎖または軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子あるいは高ストリンジェンシー条件下でその相補体にハイブリダイズする核酸分子に関する。１つの実施形態において、核酸分子はベクター内にある。
１つの実施形態において、本発明は、そのようなベクターを含む宿主細胞に関する。
別の実施形態において、本発明は、結合分子が産生されるような条件下で宿主細胞を培養するステップと、結合分子を宿主細胞または培養物から単離するステップとを含む、結合分子を産生する方法に関する。
別の実施形態において、本発明は、本発明の結合分子による処置から恩恵を得る被験体を処置する方法に関し、該方法は、結合分子をそのような処置が行われる被験体に投与するステップを含む。
別の実施形態において、本発明は、悪性疾患が患者にて処置されるように、請求項１〜８０のいずれか一項に記載の結合分子をコード化する核酸分子を、結合分子が発現されるような条件下で悪性疾患を有する患者に投与するステップを含む、悪性疾患を処置する方法に関する。
１つの実施形態において、被験体は癌に罹患している。
１つの実施形態において、該方法は、追加の薬剤を投与するステップをさらに含む。
１つの実施形態において、追加の薬剤は、化学療法剤である。
１つの実施形態において、追加の薬剤は、ナタリズマブ、トラスツズマブ、ベバシズマブ、インフリキシマブ、リツキシマブ、イブリツモマブチウキセタン、セツキシマブ、塩酸レバミゾール、トシツモマブ、アレムツズマブ、ＩＭＣ−Ｃ２２５、メシル酸イマチニブ、フルベストラント、アナストロゾール、エキセメスタン、レトロゾール、タモキシフェン、インターフェロンアルファ、デニロイキンディフチトクス、オブリマーセン、エルロチニブＨＣｌ、ボルテゾミブ、サリドマイド、およびエンドスタチンから成る群より選択される。
別の態様において、本発明は、患者に本発明の結合分子の有効投薬量を投与するステップを含む、患者の細胞におけるＣｒｉｐｔｏ発現の効果を阻害する方法に関する。
１つの実施形態において、結合分子の有効投薬量は、少なくとも約５ｍｇ／ｋｇである。
別の実施形態において、結合分子の有効投薬量は、少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇである。
１つの実施形態において、結合分子は腹腔内に、経口的に、経鼻的に、皮下に、筋肉内に、局所的に、または静脈内に投与される。
１つの実施形態において、患者は、脳、乳房、精巣、結腸、肺、卵巣、膀胱、子宮、子宮頸部、膵臓および胃から成る群より選択される器官の癌に罹患している。
（発明の詳細な説明）
本発明は、少なくとも一部は、ＣＤＲグラフトおよび他のヒト化抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体の開発に基づく。さらに詳細には、これらの抗体はマウス抗体Ｂ３Ｆ６に由来する。本明細書で述べるように、ヒト化抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体の複数の形が開発され、腫瘍細胞モデルでの試験のためにメイタンソイドに結合された。結果は、生体内での腫瘍細胞成長の阻害のためのこれら抗体の有用性を証明する。これらのヒト化抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体は、ヒト被験体で使用するためのマウス抗体よりも適している。
ヒト化全長抗体およびＣＨ２ドメインを欠失したヒト化抗体の両方が作製された。通例、細胞培養物中で産生された組換えＣＨ２ドメイン欠失抗体は、ヒンジ異質性を引き起こし、これは溶液中での抗体の２つのフォームの存在をもたらす。未変性溶液において、これらのフォームの両方は二量体タンパク質として存在する（重鎖１個および軽鎖１個から成る各モノマー）。１つの免疫グロブリン分子は、鎖内重鎖ジスルフィド結合によって保持された、約１５０〜１６０ｋＤａの安定な４鎖構築物（フォームＡ）を含み、１つはダイマーが鎖間ジスルフィド結合を介して結合されない形（フォームＢ）を含む。フォームＢは、未変性条件下で安定なダイマーも形成するが、変性非還元条件下で識別でき、そこでは重鎖が解離して７５〜８０ｋＤａ分子を産生する。これらのフォームは、ＭＡｂ親和性精製の後ですら分離するのがきわめて困難であった。
各種の未変性ＩｇＧアイソタイプでのＢフォームの出現頻度は、これに限定されるわけではないが、ＭＡｂ分子のヒンジ領域アイソタイプに関連する構造上の相違による。実際に、ヒトＩｇＧ４ヒンジのヒンジ領域における単一のアミノ酸置換は、Ｂフォームの出現を（Ａｎｇａｌ ｅｔ ａｌ．１９９３．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３０：１０５）ヒトＩｇＧ１ヒンジを使用して通例認められるレベルまで著しく低下させることができる。しかしながらこの同じアミノ酸置換をＣＨ２ドメイン欠失抗体に適用することは、フォームＢを調製物から除去しない。
本明細書で述べるように、ある結合ペプチドの本発明のヒト化Ｃｒｉｐｔｏ結合分子への包含は、少なくとも１個の鎖間ジスルフィド結合を介して結合される、または少なくとも１個の鎖間ジスルフィド結合を介して結合されないポリペプチドダイマーの優先的生合成を引き起こす。
本発明のさらなる説明のために、便宜上、ある用語を次に説明する。
Ｉ．定義
本発明の結合分子は、ヒトＣｒｉｐｔｏ分子に特異的に結合する結合部位を含む少なくとも１個の結合ドメインを含むポリペプチド分子である。ヒトＣｒｉｐｔｏの例示的な配列は、配列番号：６（ＣＲ−１）および配列番号：７（ＣＲ−３）に示される。ＣＲ−１を未分化ヒト奇形癌細胞にて発現されたヒトＣｒｉｐｔｏタンパク質をコードする構造遺伝子に対応し、ＣＲ−３は、サイレントおよびリプレイス置換の両方を表す、コード領域内に７塩基置換を含有するｍＲＮＡの完全なコピーに相当する。ＣＲ−１は染色体３に位置し、ＣＲ−３はＸｑ２１−ｑ２２に位置する。Ｄｏｎｏ ｅｔ ａｌ．１９９１．Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．１９９１ ４９：５５５。
本発明の結合分子は、マウスＢ３Ｆ６抗体に由来する少なくとも１個のＣＤＲを含む。マウスＢ３Ｆ６抗体は、Ｃｒｉｐｔｏのアミノ酸残基４６〜６２に亘るドメイン内のエピトープに結合する。マウスＢ３Ｆ６抗体（Ｂ３Ｆ６．１７とも呼ばれる）を作製するハイブリドーマは、アクセション番号ＰＴＡ−３３１９でＡＴＣＣに寄託された）。抗体は、マウスをＣＨＯ細胞内で発現されたＣｒｉｐｔｏ融合タンパク質で免疫化することによって作製された。免疫化に使用される融合タンパク質は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメイン（構成物は、ＣＲ（ｄｅｌＣ）−Ｆｃと呼ばれる）に融合された、Ｃｒｉｐｔｏのアミノ酸残基１〜１６９［配列番号：６のアミノ酸１〜１６９］を含んでいた。Ｂ３Ｆ６抗体を作製する方法は、たとえばＷＯ ０２／０８８１７０にさらに詳細に述べられている。
本明細書で使用するように、指定されたタンパク質「に由来する」という用語は、ポリペプチドの起源を指す。１つの実施形態において、特定の開始ポリペプチドに由来するポリペプチドまたはアミノ酸配列は、ＣＤＲ配列またはそれに関連する配列である。１つの実施形態において、特定の開始ポリペプチドに由来するアミノ酸配列は連続していない。たとえば１つの実施形態において、１個、２個、３個、４個、５個、または６個のＣＤＲは、開始抗体に由来する。１つの実施形態において、特定の開始ポリペプチドまたはアミノ酸配列に由来するポリペプチドまたはアミノ酸配列は、開始配列のそれ、またはその部分であって、少なくとも３〜５個のアミノ酸、５〜１０個のアミノ酸、少なくとも１０〜２０個のアミノ酸、少なくとも２０〜３０個のアミノ酸、または少なくとも３０〜５０個のアミノ酸より成るその部分と本質的に同じである、あるいはそうでなければ当業者によって開始配列にその起源を有すると認められるアミノ酸配列を有する。１つの実施形態において、開始抗体に由来する１個以上のＣＤＲ配列は、改変体ＣＤＲ配列を産生するために改変され、該改変体ＣＤＲ配列はＣｒｉｐｔｏ結合活性を維持する。
当業者によって、本発明の結合分子が、それらの由来するＢ３Ｆ６分子からのアミノ酸配列が異なるように修飾されることも理解されるであろう。たとえば「非必須」アミノ酸残基における保存的置換または変化につながるヌクレオチドまたはアミノ酸置換を作製できる（たとえばＣＤＲおよび／またはフレームワーク残基において）。本発明の結合分子はＣｒｉｐｔｏに結合する能力を維持する。
ポリペプチドの非天然改変体をコードする単離核酸分子は、１個以上のアミノ酸置換、付加または欠失がコード化タンパク質内に導入されるように、１個以上のヌクレオチド置換、付加または欠失を免疫グロブリンのヌクレオチド配列内に導入することによって作製できる。変異は、標準技法、たとえば部位特異的変異誘発およびＰＣＲ仲介変異誘発によって導入できる。好ましくは保存的アミノ酸置換は、１個以上の非必須アミノ酸残基で作製される。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基によって置換えられた置換である。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリは、塩基性側鎖（たとえばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（たとえばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（たとえばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（たとえばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖（たとえばトレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（たとえばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含めて、当分野で定義されている。それゆえ免疫グロブリンポリペプチド内の非必須アミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリからの別のアミノ酸残基とリプレイスすることができる。別の実施形態において、アミノ酸の鎖は、側鎖ファミリメンバの順序および／または組成が異なる構造的に同様の鎖によってリプレイスすることができる。
あるいは別の実施形態において、変異は、免疫グロブリンコード配列の全部または一部に沿ってランダムに導入できる。
１つの実施形態において、結合分子は１個の結合部位を含む。別の実施形態において、結合分子は少なくとも２個の結合部位を含む。１つの実施形態において、結合分子は２個の結合部位を含む。１つの実施形態において、結合分子は３個の結合部位を含む。別の実施形態において、結合分子は４個の結合部位を含む。
１つの実施形態において、本発明の結合分子はモノマーである。別の実施形態において、本発明の結合分子はマルチマーである。たとえば１つの実施形態において、本発明の結合分子はダイマーである。１つの実施形態において、本発明のダイマーは、２個の同一モノマーサブユニットより成るホモダイマーである。別の実施形態において、本発明のダイマーは、２個の同一でないモノマーサブユニットより成るヘテロダイマーである。ダイマーのサブユニットは、１個以上のポリペプチド鎖を含むことができる。たとえば１つの実施形態において、ダイマーは少なくとも２個のポリペプチド鎖を含む。１つの実施形態において、ダイマーは２個のポリペプチド鎖を含む。別の実施形態において、ダイマーは４個のポリペプチド鎖を含む（たとえば抗体分子の場合と同様に）。
本発明の好ましい結合分子は、ヒトアミノ酸配列に由来するフレームワークおよび定常領域アミノ酸配列を含む。しかしながら結合ポリペプチドは、別の哺乳類種に由来するフレームワークおよび／または定常領域配列を含むことができる。たとえば霊長類フレームワーク領域（たとえば非ヒト霊長類）、重鎖部分、および／またはヒンジ部分は、対象結合分子に含まれうる。１つの実施形態において、１個以上のマウスアミノ酸は、結合ポリペプチドのフレームワーク領域に存在でき、たとえばヒトまたは非ヒト霊長類フレームワークアミノ酸配列は、相当するマウスアミノ酸残基が存在する１個以上のアミノ酸復帰突然変異を含むことができる。本発明の好ましい結合分子は、開始Ｂ３Ｆ６マウス抗体よりも免疫原性が低い。
本明細書で使用するように、「重鎖部分」という用語は、免疫グロブリン重鎖に由来するアミノ酸配列を含む。重鎖部分を含むポリペプチドは：ＣＨ１ドメイン、ヒンジ（たとえば上部、中間および／または下部ヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、あるいはその改変体または断片の少なくとも１つを含む。１つの実施形態において、本発明のポリペプチドは、ＣＨ１ドメインと、ヒンジドメインの少なくとも一部と、ＣＨ２ドメインとを含むポリペプチド鎖を含む。別の実施形態において、本発明のポリペプチドは、ＣＨ１ドメインおよびＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖を含む。別の実施形態において、本発明のポリペプチドは、ＣＨ１ドメインと、ヒンジドメインの少なくとも一部と、ＣＨ３ドメインとを含むポリペプチド鎖を含む。別の実施形態において、本発明のポリペプチドは、ＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖を含む。１つの実施形態において、本発明のポリペプチドは、ＣＨ２ドメインの少なくとも一部（たとえばＣＨ２ドメインの全部または一部）を欠失している。別の実施形態において、本発明のポリペプチドは完全なＩｇ重鎖を含む。上で述べたように、これらのドメイン（たとえば重鎖部分）を天然発生型免疫グロブリン分子とはアミノ酸配列が異なるように修飾できることが、当業者によって理解されるであろう。
１つの実施形態において、本発明の結合分子のポリペプチド鎖の少なくとも２個が抗体または免疫グロブリン分子に由来する少なくとも１個の重鎖部分を含む。１つの実施形態において、本発明のポリペプチドの少なくとも２個の重鎖部分が異なるポリペプチド鎖上に存在して、たとえば少なくとも１個のジスルフィド結合を介して（フォームＡ）または非共有相互作用を介して（フォームＢ）相互作用し、二量体ポリペプチドを形成し、該ダイマーの各モノマーは少なくとも１個の重鎖部分を含む。
１つの実施形態において、ダイマーの１個のポリペプチド鎖の重鎖部分は、ダイマーの第２のポリペプチド鎖のそれらと同じである。１つの実施形態において、本発明のダイマーのモノマー（またはハーフマー）は、相互に同一である。別の実施形態において、それらは同一でない。たとえば各モノマーは、異なる標的結合部位を含むことができる。
１つの実施形態において、本発明のダイマーは、共有相互作用、たとえばジスルフィド結合によって結合される。１つの実施形態において、本発明のダイマーは、１個以上のジスルフィド結合によって結合される。別の実施形態において、本発明のダイマーは１個以上の、好ましくは２個のジスルフィド結合によって結合される。別の実施形態において、本発明のダイマーは、１個以上の、好ましくは３個のジスルフィド結合によって結合される。別の実施形態において、本発明のダイマーは、１個以上の、好ましくは４個のジスルフィド結合によって結合される。別の実施形態において、本発明のダイマーは１個以上の、好ましくは５個のジスルフィド結合によって結合される。別の実施形態において、本発明のダイマーは、１個以上の、好ましくは６個のジスルフィド結合によって結合される。別の実施形態において、本発明のダイマーは、１個以上の、好ましくは７個のジスルフィド結合によって結合される。別の実施形態において、本発明のダイマーは、１個以上の、好ましくは８個のジスルフィド結合によって結合される。別の実施形態において、本発明のダイマーは、１個以上の、好ましくは９個のジスルフィド結合によって結合される。別の実施形態において、本発明のダイマーは、１個以上の、好ましくは１０個のジスルフィド結合によって結合される。さらなる実施形態において、本発明のダイマーはジスルフィド結合によって結合されないが、たとえば非共有相互作用によって結合される。
ポリペプチドの重鎖部分は、異なる免疫グロブリン分子に由来できる。たとえばポリペプチドの重鎖部分は、ＩｇＧ１分子に由来するＣＨ１ドメインと、ＩｇＧ３分子に由来するヒンジ領域とを含むことができる。別の例において、重鎖部分は、一部はＩｇＧ１分子に由来して、一部はＩｇＧ３分子に由来するヒンジ領域を含むことができる。別の例において、重鎖部分は、一部はＩｇＧ１分子に由来して、ＩｇＧ４分子に由来するキメラヒンジを含むことができる。
本明細書で使用するように、「軽鎖部分」という用語は、免疫グロブリン軽鎖に由来するアミノ酸配列を含む。好ましくは、軽鎖部分はＶＬまたはＣＬドメインの少なくとも１つを含む。
１つの実施形態において、本発明のポリペプチドは、Ｉｇ分子に由来しないアミノ酸配列または１個以上の部分を含む。例示的な修飾は、以下でさらに詳細に説明する。たとえば１つの実施形態において、本発明のポリペプチドは柔軟性リンカー配列を含むことができる。別の実施形態において、ポリペプチドは１個以上の官能性部分を付加するために修飾できる（たとえばＰＥＧ、薬物、プロドラッグ、および／または検出可能な標識）。
「キメラ」タンパク質は、それが実際には自然に結合しない第２のアミノ酸配列と結合した第１のアミノ酸配列を含む。アミノ酸配列は通常、融合ポリペプチドにおいて結合される独立したタンパク質中に存在するか、またはそれらは通常、同じタンパク質中に存在するが、融合ポリペプチド中で新たな並びで配列される。キメラタンパク質は、たとえば化学合成によって、またはペプチド領域が所望の関係でコードされるポリヌクレオチドを作製および翻訳することによって作製できる。例示的なキメラポリペプチドは、融合タンパク質および本発明のキメラヒンジ結合ペプチドを含むことができる。
１つの実施形態において、本発明の結合ポリペプチドは融合タンパク質である。１つの実施形態において、本発明の融合タンパク質は、結合ドメイン（少なくとも１個の結合部位を含む）およびダイマー化ドメイン（少なくとも１個の重鎖部分を含む）を含むキメラ分子である。重鎖部分は、いずれかの免疫グロブリン、たとえばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４サブタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤまたはＩｇＭからでありうる。１つの実施形態において、融合タンパク質は合成結合ペプチドをさらに含む。
本発明の別の実施形態において、結合分子は「抗体−融合タンパク質キメラ」である。そのような分子は、抗体の少なくとも１個の結合ドメインを少なくとも１個の融合タンパク質と結合させる分子を含む。好ましくは２個のポリペプチド間のインタフェースが免疫グロブリン分子のＣＨ３ドメインである。
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに利用されるような「異種の」という用語は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、それが比較される実体の残りのそれらから遺伝子型で識別できる実体に由来することを意味する。たとえば異種ポリヌクレオチドまたは抗原は、異なる種、異なる細胞型、または識別できる個体の同じ型の細胞に由来できる。
「リガンド結合ドメイン」または「リガンド結合部分」という用語は本明細書で使用するように、いずれかの未変性レセプタ（たとえば細胞表面レセプタ）あるいは少なくとも定性的リガンド結合能力、好ましくは相当する未変性レセプタの生物活性を保持するいずれかの領域またはその誘導体を指す。
「レセプタ結合ドメイン」または「レセプタ結合部分」という用語は本明細書で使用するように、未変性リガンドあるいはレセプタ結合能力、好ましくは相当する未変性リガンドの生物活性を保持するいずれかの領域またはその誘導体を指す。
１つの実施形態において、本発明の結合分子は、「抗体」または「免疫グロブリン」分子、たとえば天然発生型抗体または免疫グロブリン分子（またはその抗原結合断片）あるいは同様の方法で抗原を抗体分子に結合する遺伝子組換え抗体分子である。本明細書で使用するように「免疫グロブリン」という用語は、それがいずれかの関連する特異的免疫反応性を所有するかどうかにかかわらず、２個の重鎖および２個の軽鎖の組合せを有するポリペプチドを含む。「抗体」は、興味のある抗原（たとえば腫瘍関連抗原）に対して著しい既知の特異的免疫反応活性を有するそのようなアセンブリを指す。抗体および免疫グロブリンは、その間の鎖内共有結合を伴って、または伴わずに軽鎖および重鎖を含む。脊椎動物系の基本免疫グロブリン構造は比較的十分に理解されている。
以下でさらに詳細に述べるように、「免疫グロブリン」という総称は、生化学的に区別できる抗体の５つの識別可能なクラスを含む。抗体の５つのクラスはすべて本発明の範囲内であり、以下の議論は一般に、免疫グロブリン分子のＩｇＧクラスに関する。ＩｇＧに関して、免疫グロブリンは、分子量が約２３，０００ダルトンの２個の同一のポリペプチド軽鎖と、分子量が５３，０００〜７０，０００の２個の同一の重鎖を含む。４個の鎖ははジスルフィド結合によって「Ｙ」配置で結合され、そこで軽鎖は、「Ｙ」の口にて開始し、可変領域を通じて続く重鎖を一まとめにする。
軽鎖および重鎖の両方は、構造的および機能的に相同な領域に分割される。「定常」および「可変」という用語は機能的に使用される。この点で、軽（ＶＬ）および重（ＶＨ）鎖部分の両方の可変ドメインが抗原認識および特異性を決定することが認識されるであろう。反対に軽鎖（ＣＬ）および重鎖（ＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３）の定常ドメインは、重要な生物特性、たとえば分泌、経胎盤性可動性、Ｆｃレセプタ結合、補体結合などを与える。慣例により、定常領域ドメインの番号付けは、抗体の抗原結合部位またはアミノ末端からより遠くなるにつれて増加する。Ｎ末端は可変領域であり、Ｃ末端では定常領域である；ＣＨ３およびＣＬドメインは実際に、重鎖および軽鎖それぞれの炭素末端を含む。
本明細書で使用するように「可変領域ＣＤＲアミノ酸残基」という用語は、配列または構造ベースの方法を使用して識別されるようなＣＤＲ、すなわち相補性決定領域内のアミノ酸を含む。本明細書で使用するように、「ＣＤＲ」または「相補性決定領域」という用語は、重鎖および軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域内に見出される非連続抗原結合部位を意味する。これらの特定の領域は、Ｋａｂａｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２５２，６６０９−６６１６（１９７７）およびＫａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ．（１９９１）によって、Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）によって、ｂｙ ＭａｃＣａｌｌｕｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２−７４５（１９９６）によって説明されており、該定義は、相互に比較したときにアミノ酸残基の重複およびサブセットを含む。上に引用した参考文献それぞれによって定義されるＣＤＲを含むアミノ酸残基は、比較のために説明される。好ましくは「ＣＤＲ」という用語は、配列比較に基づいてＫａｂａｔによって定義されるＣＤＲである。
Figure 2008526234
 １残基番号付けは、Ｋａｂａｔら、ｓｕｐｒａの命名法に従う
２残基番号付けは、Ｃｈｏｔｈｉａら、ｓｕｐｒａの命名法に従う
３残基番号付けは、ＭａｃＣａｌｌｕｍら、ｓｕｐｒａの命名法に従う
本明細書で使用するように「可変領域フレームワーク（ＦＲ）アミノ酸残基」という用語は、Ｉｇ鎖のフレームワーク領域内のそのようなアミノ酸を指す。「フレームワーク領域」または「ＦＲ領域」という用語は本明細書で使用するように、可変領域の一部であるが、ＣＤＲの一部でないアミノ酸残基を含む（たとえばＣＤＲのＫａｂａｔ定義を使用して）。したがって可変領域フレームワークは長さが約１００〜１２０アミノ酸であるが、ＣＤＲの外側のアミノ酸のみ含む。重鎖可変領域の具体的な例では、そしてＫａｂａｔらによって定義されたＣＤＲでは、フレームワーク領域１は、アミノ酸１〜３０を含む可変領域のドメインに相当する；フレームワーク領域２は、アミノ酸３６〜４９を含む可変領域のドメインに相当する；フレームワーク領域３は、アミノ酸６６〜９４を含む可変領域のドメインに相当し、フレームワーク領域４は、アミノ酸１０３から可変領域の末端までの可変領域のドメインに相当する。軽鎖のフレームワーク領域は、軽鎖可変領域ＣＤＲそれぞれによって同様に分離される。同様に、ＣｈｏｔｈｉａらまたはＭａｃＣａｌｌｕｍらによるＣＤＲの定義を使用して、フレームワーク領域境界は上述したような各ＣＤＲ末端によって分離される。好ましい実施形態において、ＣＤＲはＫａｂａｔによって定義される。
天然発生型抗体では、各モノマー抗体に存在する６個のＣＤＲは、抗体が水性環境でその３次元配置を取るときに特異的に配置されて抗原結合部位を形成する、アミノ酸の短い非連続配列である。重および軽可変ドメインの残りは、アミノ酸配列でより小さい分子間可変性を示し、フレームワーク領域と呼ばれる。フレームワーク領域は大部分はβシートコンフォメーションをを採用し、ＣＤＲはβシート構造を連結し、場合によってはその一部を形成するループを形成する。それゆえこれらのフレームワーク領域は、鎖間非共有相互作用による６個のＣＤＲの正しい向きへの配置を与える骨格を形成するように作用する。位置決めされたＣＤＲによって形成された抗原結合部位は、免疫反応性抗原上のエピトープに相補性である表面補体を画成する。この相補性表面は、抗体の免疫反応性抗原エピトープへの非共有結合を促進する。ＣＤＲの位置は、当業者によってただちに識別できる。
以前に示したように、各種の免疫グロブリンクラスの定常領域のサブユニット構造および３次元配置は公知である。本明細書で使用するように「ＶＨドメイン」という用語は、免疫グロブリン重鎖のアミノ末端可変ドメインを含み、「ＣＨ１ドメイン」という用語は、免疫グロブリン重鎖の第１の（最もアミノ末端の）定常領域ドメインを含む。ＣＨ１ドメインは、ＶＨドメインに隣接して、免疫グロブリン重鎖分子のヒンジ領域よりもアミノ末端側である。
本明細書で使用するように「ＣＨ２ドメイン」という用語は、従来の番号付けスキームを使用して、たとえば抗体のおおよそ残基２４４〜残基３６０に延在する重鎖分子の部分を含む（残基２４４〜３６０、Ｋａｂａｔ番号付けシステム；残基２３１〜３４０、ＥＵ番号付け体系、Ｋａｂａｔ ＥＡ ｅｔ ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．ベセズダ、ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ．１９９１）。ＣＨ２ドメインは、別のドメインと密接に対になっていないという点でユニークである。むしろ２本のＮ結合分岐炭化水素鎖が無傷の未変性ＩｇＧ分子２個のＣＨ２ドメイン間に挿入される。ＣＨ３ドメインがＣＨ２ドメインからＩｇＧ分子のＣ末端まで延在して、約１０８残基を含むことも詳細に記録されている。
本明細書で使用するように「ヒンジ領域」という用語は、ＣＨ１ドメインをＣＨ２ドメインに結合する重鎖分子の部分を含む。このヒンジ領域は約２５残基を含み、柔軟性であり、それゆえ２個のＮ末端抗原結合領域を独立して移動させる。ヒンジ領域は３つの識別可能なドメイン：上部、中間、および下部ヒンジドメインに再分割できる（Ｒｏｕｘ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８ １６１：４０８３）。
軽鎖はカッパまたはラムダのどちらかとして分類される（κ、λ）。各重鎖クラスは、カッパまたはラムダ軽鎖のどちらかと結合できる。一般に軽鎖および重鎖は相互に共有結合され、免疫グロブリンがハイブリドーマ、Ｂ細胞または遺伝子組換え宿主細胞のいずれかによって産生されるときに、２本の重鎖の「尾」部分は共有ジスルフィド結合または非共有結合によって相互に結合される。重鎖において、アミノ酸配列はＹ配置の分岐端におけるＮ末端から各鎖の底部におけるＣ末端まで延在する。当業者は、重鎖がガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロン（γ、μ、α、δ、ε）として、それらの間のあるサブクラス（たとえばγ１〜γ４）を用いて分類されることを認識するであろう。この鎖の性質は、抗体の「クラス」をＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ、またはＩｇＥとしてそれぞれ決定することである。免疫グロブリンサブクラス（アイソタイプ）、たとえばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１などは特徴がはっきりしており、機能分化を付与することが公知である。これらのクラスおよびアイソタイプそれぞれの修飾バージョンは、本発明に照らして当業者にはただちに認識可能であり、本発明の範囲内である。
上で示したように、可変領域は、抗体に抗原上のエピトープを選択的に認識させて、特異的に結合させる。すなわち抗体のＶＬドメインおよびＶＨドメインは結合して、３次元抗原結合部位を画成する可変領域を形成する。この４次抗体構造は、Ｙの各アーム端部に存在する抗原結合部位を形成する。さらに詳細には、抗原結合部位は、ＶＨおよびＶＬ鎖それぞれの３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）によって画成される。
「断片」という用語は、無傷の、または完全な抗体または抗体鎖よりも少ないアミノ酸残基を含む、抗体または抗体鎖の一部または部分を指す。「抗原結合断片」という用語は、抗原に結合する、または抗原結合（すなわち特異的結合）のために無傷の抗体と（すなわちそれらが由来する無傷の抗体と）競合する免疫グロブリンまたは抗体のポリペプチド断片を指す。本明細書で使用するように、抗体分子の「断片」という用語は、抗体の抗原結合断片、たとえば抗体軽鎖（ＶＬ）、抗体重鎖（ＶＨ）、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、および単ドメイン抗体断片（ＤＡｂ）を含む。断片はたとえば無傷の、または完全な抗体または抗体鎖の化学または酵素処理を介して、あるいは組換え手段によって得ることができる。
本明細書で使用するように「結合部位」という用語は、興味のある標的分子（たとえば抗原、リガンド、レセプタ、基質またはインヒビタ）への選択的結合に関与するポリペプチドの領域を含む。結合ドメインは少なくとも１個の結合部位を含む。例示的な結合ドメインは、抗体可変ドメイン、リガンドのレセプタ結合ドメイン、レセプタのリガンド結合ドメインまたは酵素ドメインを含む。
本明細書で使用するように「価数」という用語は、ポリペプチド内の潜在的な標的結合部位の数を指す。各標的結合部位は１個の標的分子または標的分子の特定部位を特異的に結合する。ポリペプチドが１個を超える標的結合部位を含むとき、各標的結合部位は、同じまたは異なる分子に特異的に結合できる（たとえば異なるリガンドまたは異なる抗原、または同じ抗原上の異なるエピトープに結合できる）。本結合分子は、ヒトＣｒｉｐｔｏ分子に特異的な少なくとも１個の結合部位を有する。
「特異性」という用語は、所与の標的と特異的に結合する（たとえば免疫反応する）能力を指す。ポリペプチドは単一特異性であり、標的を特異的に結合する１個以上の結合部位を含有できるか、またはポリペプチドは多重特異性であり、同じまたは異なる標的を特異的に結合する２個以上の結合部位を含有できる。
１つの実施形態において、本発明の結合分子は１個を超える標的に対して特異性である。たとえば１つの実施形態において、本発明の多重特異性結合分子は、Ｃｒｉｐｔｏおよび腫瘍細胞で発現された第２の分子に結合する。腫瘍細胞で発現された抗原に結合する抗原結合部位を含む例示的な抗体は当分野で公知であり、そのような抗体からの１個以上のＣＤＲを本発明の結合分子に含むことができる。例示的な抗体は：２Ｂ８、Ｌｙｍ １、Ｌｙｍ ２、ＬＬ２、Ｈｅｒ２、Ｂ１、ＭＢ１、ＢＨ３、Ｂ４、Ｂ７２．３、５Ｅ８、および５Ｅ１０を含む。好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドは、ＣＤ２０に結合するＣ２Ｂ８抗体である。別の好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドは、ＴＡＧ７２を認識するＣＣ４９抗体である。
１つの実施形態において、本発明の結合分子は結合ペプチドを含む。本発明の結合ペプチドは合成である。本明細書で使用するようにポリペプチドに関する「合成」という用語は、天然発生型でないアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。たとえば天然発生型ポリペプチドの修飾形（たとえば付加、置換または欠失などの変異を含む）である、またはそれが実際には自然に連結しないアミノ酸の直線配列で第２のアミノ酸配列（天然発生型でも、そうでなくてもよい）に連結された第１のアミノ酸配列（天然発生型でも、そうでなくてもよい）を含む、非天然発生型ポリペプチド。
本発明の結合ペプチドは、本発明の結合分子の２個のドメイン（たとえば結合ドメインおよびダイマー化ドメイン）を結合する。たとえば結合ペプチドは、重鎖部分を、結合部位を含む結合ドメインに結合する。１つの実施形態において、結合ペプチドは、ポリペプチド鎖の直鎖アミノ酸配列内で、２個の重鎖定常領域ドメイン、たとえばＣＨ１およびＣＨ２ドメイン；ＣＨ１およびＣＨ３ドメイン；ヒンジおよびＣＨ１ドメイン；ヒンジおよびＣＨ３ドメイン；ＶＨおよびヒンジドメイン、またはＣＨ３ドメインおよび非免疫グロブリンポリペプチド）を結合する。好ましくは、そのような結合ペプチドは、結合分子への柔軟性を提供し、ジスルフィド結合を介してダイマー化を促進する。１つの実施形態において、本発明の結合ペプチドは、１個以上の重鎖ドメイン（たとえばドメイン欠失構築物における定常領域ドメインの少なくとも一部（たとえばＣＨ２ドメインの少なくとも一部）および／またはヒンジ領域の少なくとも一部（たとえば下部ヒンジ領域ドメインの少なくとも一部））をリプレイスするために使用する。たとえば１つの実施形態において、ＶＨドメインは結合ペプチドを介してＣＨ３ドメインに縮合される（結合ペプチドのＣ末端はＣＨ３ドメインのＮ末端に接合され、結合ペプチドのＮ末端はＶＨドメインのＣ末端に接合される）。別の実施形態において、ＶＬドメインは結合ペプチドを介してＣＨ３ドメインに縮合される（結合ペプチドのＣ末端はＣＨ３ドメインのＮ末端に接合され、結合ペプチドのＮ末端はＶＬドメインのＣ末端に接合される。別の実施形態において、ＣＨ１ドメインは、結合ペプチドを介してＣＨ３ドメインに縮合される（結合ペプチドのＣ末端はＣＨ３ドメインのＮ末端に付着され、結合ペプチドのＮ末端のＣＨ１ドメインのＣ末端に付着される）。
１つの実施形態において、合成結合ペプチドは定常領域ドメインの部分を含む。たとえば１つの実施形態において、ＣＨ２ドメインをリプレイスする結合ペプチドは、ＣＨ２ドメインの部分を含みうる。
１つの実施形態において、結合ペプチドは、ｇｌｙ−ｓｅｒリンカーを含むか、またはｇｌｙ−ｓｅｒリンカーより成る。本明細書で使用するように、「ｇｌｙ−ｓｅｒリンカー」という用語は、グリシンおよびセリン残基より成るペプチドを指す。例示的なｇｌｙ／ｓｅｒリンカーは、アミノ酸配列ＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧ（配列番号：８）を含む。１つの実施形態において、本発明の結合ペプチドは、上部ヒンジ領域の少なくとも一部（たとえばＩｇＧ１、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４分子に由来する）、中間ヒンジ領域の少なくとも一部（たとえばＩｇＧ１、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４分子に由来する）およびｇｌｙ／ｓｅｒアミノ酸残基（たとえばＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧ（配列番号：８）などのｇｌｙ／ｓｅｒリンカー）を含む。１つの実施形態において、結合ペプチドは、天然発生型ＩｇＧ１またはＩｇＧ３ヒンジ領域と比較して１個以上のアミノ酸の置換を含む。別の実施形態において、結合ペプチドはＷＯ ０２／０６０９５５に述べるようなアミノ酸配列を含む。結合ペプチド以下でさらに詳細に述べる。
本明細書で使用するように「ジスルフィド結合」という用語は、２個の硫黄原子間に形成された共有結合を含む。アミノ酸システインは、第２のチオール基とジスルフィド結合またはブリッジを形成できるチオール基を含む。大半の天然発生型ＩｇＧ分子では、ＣＨ１およびＣＬ領域は、ジスルフィド結合によって結合され、２本の重鎖は２個のジスルフィド結合によって、Ｋａｂａｔ番号付けシステムを使用した２３９および２４２に相当する位置で結合される（位置２２６または２２９、ＥＵ番号付け体系）。
１つの実施形態において、本発明の結合分子は抗体結合部位を含む。たとえば１つの実施形態において、本発明の結合分子は全長抗体分子である。別の実施形態において、本発明の結合分子は抗体分子の断片である。別の実施形態において、本発明の結合分子は、修飾または合成抗体分子である。
本発明の結合分子は、当分野で公知の技法を使用して作製できる。１つの実施形態において、本発明のポリペプチドは、「組換え産生」された、すなわち組換えＤＮＡ技術を使用して産生される抗体分子である。抗体分子を作製する例示的な技法は、以下でさらに詳細に述べる。
１つの実施形態において、本発明のポリペプチドは修飾抗体である。本明細書で使用するように、「修飾抗体」という用語は、天然発生型でないように改変された抗体の合成形、たとえば少なくとも２個の重鎖部分を含むが、２個の完全な重鎖は含まない抗体（ドメイン欠失抗体またはミニボディ）；２つ以上の異なる抗原または単一の抗原上の異なるエピトープに結合するように改変された、抗体の多重特異性形（たとえば二重特異性、三重特異性など））；ｓｃＦｖ分子に結合された重鎖分子などを含む。ｓｃＦｖ分子は当分野で公知であり、たとえばＵＳ ｐａｔｅｎｔ ５，８９２，０１９に述べられている。加えて「修飾抗体」という用語は、抗体の多価形（たとえば３価、４価など、同じ抗原の３つ以上のコピーに結合する抗体）を含む。別の実施形態において、本発明の結合分子は、ＣＨ２ドメインを欠失した少なくとも１個の重鎖部分を含み、レセプタリガンド対の１個の構成要素の連結部分を含むポリペプチドの結合ドメインを含む融合タンパク質である。
１つの実施形態において、本発明による「修飾抗体」という用語は、ほぼ同じ免疫原性の完全な未改変の抗体と比較したときに、非共有的に二量体化する能力、腫瘍部位に局在化する能力の向上、または血清半減期の短縮を提供するために定常領域ドメインの１つ以上の少なくとも一部が欠失しているか、そうでなければ改変されている、免疫グロブリン、抗体、あるいは免疫反応性断片またはその組換えを含む。好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖と似たポリペプチド鎖を含むが、１個以上の重鎖ドメインの少なくとも部分を欠失しているドメイン欠失抗体である。さらに好ましくは、修飾抗体の定常領域の１個のドメイン全体が欠失しており、なおさらに好ましくはＣＨ２ドメインの全部および一部が欠失するであろう。
好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドはヒトにおける有害な免疫反応を誘発しないであろう。
１つの実施形態において、本発明の結合分子は、野生型定常領域と比べて修飾されている定常領域、たとえば重鎖定常領域を含む。すなわち本明細書で開示した本発明のポリペプチドは、３個の重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３）の１個以上に対する、および／または軽鎖定常領域ドメイン（ＣＬ）に対する改変または修飾を含みうる。例示的な修飾は、１個以上のドメイン内に１個以上のアミノ酸の付加、欠失または置換を含む。
本明細書で使用するように、「悪性疾患」という用語は、非良性腫瘍または癌を指す。本明細書で使用するように、「癌」という用語は、無秩序な、または制御できない細胞成長を特徴とする悪性疾患を含む。例示的な癌は：癌腫、肉腫、白血病、およびリンパ腫を含む。「癌」という用語は、原発性悪性疾患（たとえばその細胞が元の腫瘍部位以外の、対象体内の位置へ移動していない腫瘍）および二次悪性疾患（たとえば転移から生じる腫瘍、元の腫瘍の部位とは異なる二次部位への腫瘍細胞の移動）を含む。
本明細書で使用するように「疎水性相互作用に基づいてポリペプチドを分離する培地」という用語は、マトリクスに共有結合した疎水性リガンド（たとえばアルキルまたはアリール基）を含む培地を含む。そのような培地は、ポリペプチド表面上のアクセス可能な非極性基と、培地の疎水性リガンドとの間の相互作用に基づいて、ポリペプチドを分離するために使用できる。例示的な培地は、Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅより入手できるフェニル５ＰＷ−ＨＲである。
本明細書で使用するように、「伝導率」という用語は、マイクロシーメンス／ｃｍ（以前はマイクロオーム／ｃｍ）で測定されるような溶液の導電率を含む。溶液のイオン含有率が高くなればなるほど、溶液の伝導率が高くなる。伝導率は、当分野で公知である技法を使用してただちに測定できる（たとえば２個の電極間を通過する電流を測定することによって）。
本発明の分離方法は、酸性から中性の範囲のｐＨ、たとえば約ｐＨ３．５〜ほぼ中性のｐＨを有する溶液を用いて使用できる。本明細書で使用するように「ほぼ中性のｐＨ」という用語は、約７のｐＨ値を含む。たとえば１つの実施形態において、本発明の分離方法は約３、約４、約５、約６、約７、または約８のｐＨを有する溶液（たとえば緩衝液）を使用して実施できる。好ましくは溶液のｐＨは、約６または約７である。１つの実施形態において、溶液のｐＨは、約４．０、約４．１、約４．２、約４．３、約４．４、約４．５、約４．６、約４．７、約４．８、約４．９、約５．０、約５．１、約５．２、約５．３、約５．４、約５．５、約５．６、約５．７、約５．８、約５．９、約６．０、約６．１、約６．２、約６．３、約６．４、約６．５、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９、約７．０、約７．１、約７．２、約７．３、約７．４、約７．５、約７．６、約７．７、約７．８、約７．９、または約８．０である。
本明細書で使用するように「親和性マトリクス」という用語は、親和性リガンドが付着するマトリクス、たとえばアガロース、制御孔ガラス、またはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンを含む。親和性リガンドは所望のポリペプチドに結合し、汚染ポリペプチドは親和性リガンドに結合されない。所望のポリペプチドは公知のプロトコルを使用して親和性マトリクスから溶離させることができる。
本明細書で使用するように「組換えた」という用語は、核酸またはポリペプチド分子の合成手段（たとえば組換え技法、試験管内ペプチド合成によって、ペプチドの酵素または化学カップリングあるいはこれらの技法のある組合せによって）による操作を含む。好ましくは、本発明の結合分子は組換えられて、たとえば本発明の結合ペプチドを発現する。
本明細書で使用するように「連結した（ｌｉｎｋｅｄ）」、「融合した（ｆｕｓｅｄ）」または「融合（ｆｕｓｉｏｎ）」という用語は互換的に使用される。これらの用語は、化学結合または組換え手段を含む何らかの手段によって２個以上の要素または成分を結合することを指す。「フレーム内融合」は、元のＯＲＦの正しい読み枠を維持する方法で、２個以上の開いた読み枠（ＯＲＦ）を結合して連続したより長いＯＲＦを形成することを指す。それゆえ得られた組換え融合タンパク質は、元のＯＲＦによってコードされたポリペプチドに相当する２個セグメント（そのセグメントは実際には、通常そのように結合されない）を含有する単一のタンパク質である。そのように作製された読み枠は融合セグメントを通じて連続的であるが、セグメントはたとえばフレーム内リンカー配列によって物理的または空間的に分離できる。
ポリペプチドの文脈では、「直鎖配列」または「配列」は、配列内で相互に隣接する残基がポリペプチドの一次構造において連続している、アミノからカルボキシル末端方向へのポリペプチド内でのアミノ酸の順序である。
本明細書で使用するように「結合分子の投与により恩恵を受ける被験体」という句は、たとえば結合分子によって認識される抗原の検出のための（たとえば診断手順のための）使用した結合分子の投与から、および／または結合分子によって認識される標的を削減または除去するための結合分子による処置から恩恵を受ける被験体、たとえば哺乳類被験体を含む。たとえば１つの実施形態において、被験体は循環または血清からの溶解性または粒子状分子（たとえば毒素または病原体）の削減または除去により、あるいは標的を発現する細胞（たとえば腫瘍細胞）の個体群の削減または除去により恩恵を受けることができる。本明細書でさらに詳細に述べるように、結合分子は非接合形で使用できるか、あるいはたとえば薬物、プロドラッグ、またはアイソトープに接合させることができる。
ＩＩ．ヒト化
１つの実施形態において、本発明の結合分子は、少なくとも１個のヒト化Ｂ３Ｆ６抗体可変領域、たとえば軽鎖または重鎖可変領域を含むか、またはそれらに由来する。
「ヒト化抗体」という用語は、実質的にヒト抗体鎖（「アクセプタ抗体」と呼ばれる）からの可変領域フレームワーク残基を含む少なくとも１個の鎖と、実質的に非ヒト抗体（「ドナー抗体」と呼ばれる）からの少なくとも１個の相補性決定領域（「ＣＤＲ」）とを含む抗体を指す。定常領域も存在する場合、実質的に、または完全にヒト免疫グロブリンからである。
マウスＢ３Ｆ６のＣＤＲを次の表１に示す：
表１：Ｂ３Ｆ６ ＣＤＲ配列（Ｋａｂａｔ定義）
Figure 2008526234
 １つの実施形態において、本発明の抗原結合分子は、Ｂ３Ｆ６抗体分子の少なくとも１個の重鎖または軽鎖ＣＤＲを含む。別の実施形態において、本発明の抗原結合分子は、Ｂ３Ｆ６抗体分子の少なくとも２個のＣＤＲを含む。別の実施形態において、本発明の抗原結合分子は、Ｂ３Ｆ６抗体分子による少なくとも３個のＣＤＲを含む。別の実施形態において、本発明の抗原結合分子は、Ｂ３Ｆ６抗体分子による少なくとも４個のＣＤＲを含む。別の実施形態において、本発明の抗原結合分子は、Ｂ３Ｆ６抗体分子による少なくとも５個のＣＤＲを含む。別の実施形態において、本発明の抗原結合分子は、Ｂ３Ｆ６抗体分子による少なくとも６個のＣＤＲを含む。１つの実施形態において、少なくとも１個のＣＤＲ（または結合分子内に存在する１個を超えるＢ３Ｆ６ ＣＤＲによる少なくとも１個のＣＤＲ）を修飾して、Ｂ３Ｆ６に結合する能力をなお維持したまま、天然発生型Ｂ３Ｆ６分子のＣＤＲとは配列を変更させる。
ヒト化抗体は組換えＤＮＡ技術を使用して産生でき、たとえばたとえばＱｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，（１９８９），８６：１００２９−１００３３；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，（１９８６），３２１：５２２−２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，（１９８８），３３２：３２３−２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，（１９８８），２３９：１５３４−３６；Ｏｒｌａｎｄｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，（１９８９），８６：３８３３−３７；ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ．ＵＳ ５，２２５，５３９；５，５３０，１０１；５，５８５，０８９；５，６９３，７６１；５，６９３，７６２；６，１８０，３７０を参照。
ヒト化のために好ましい非ヒトドナー抗体が選択されると、たとえば発現ヒト抗体遺伝子の配列データベースから、複数のヒト抗体の生殖系列Ｉｇ配列またはコンセンサス配列から適切なヒトアクセプタ抗体を得ることができる。ヒト可変ドメインフレームワークがＣＤＲが生じた非ヒト可変フレームワークに対して同じまたは同様の配座を利用する場合、非ヒトＣＤＲのヒト可変ドメインフレームワークへの置換は、その正しい空間配向の保持をもたらしやすい。これはフレームワーク配列がＣＤＲの由来した非ヒト可変フレームワークドメインとの高度の配列同一性を示すヒトアクセプタ抗体からヒト可変ドメインを得ることによって達成される。重鎖および軽鎖可変フレームワーク領域は、同じまたは異なるヒト抗体配列に由来できる。好ましくはヒトアクセプタ抗体は、ドナー抗体の標準およびインタフェース残基を保持する。加えてヒトアクセプタ抗体は、好ましくはＣＤＲループの長さに実質的な類似性を有する。Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ４：７７３（１９９１）；Ｋｏｌｂｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ６：９７１（１９９３）およびＣａｒｔｅｒら、ＷＯ ９２／２２６５３を参照。
ドナー抗体および適切なヒトアクセプタ抗体のＣＤＲを同定したら、次のステップは、得られたヒト化抗体の特性を最適化するため、これらの成分からの残基が存在する場合、そのどちらを置換すべきか決定することである。通例、抗原結合に必要な非ヒト、ドナー免疫グロブリン軽鎖または重鎖のアミノ酸の一部または全部（たとえば１個以上のＣＤＲ）が、ヒトアクセプタ抗体の軽鎖または重鎖からの相当するアミノ酸を置換するために使用される。ヒトアクセプタ抗体は、抗原結合に必要のないアミノ酸の一部または全部を保持する。概して、マウス残基の導入はヒトにおけるヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）反応を誘発する抗体のリスクを上昇させるため、ヒトアミノ酸残基のマウスによる置換は最小限に抑えるべきである。特定の患者における、または臨床試験中のＨＡＭＡ反応を監視するために、決定免疫反応の当分野で認識された方法を実施することができる。ヒト化抗体を投与された患者に前記治療の投与の開始時に、または投与中を通して、免疫原性アセスメントを与えることができる。ＨＡＭＡ反応は、表面プラスモン共鳴技術（ＢＩＡＣＯＲＥ）および／または固相ＥＬＩＳＡ分析を含む当分野で公知の方法を使用して、患者からの血液サンプル中でたとえばヒト化治療用試薬に対して抗体を検出することによって測定される。
必要な場合、ヒト化抗体の抗原への結合親和性を保存するために、ヒトフレームワーク領域内の１個以上の残基をマウス抗体内の相当する位置の残基に変更することができる。この変更は時には「復帰突然変異」と呼ばれる。ヒト可変領域フレームワーク残基からのあるアミノ酸は、ＣＤＲ配座および／または抗原への結合に対するその考えられる影響に基づいて復帰突然変異のために選択される。マウスＣＤＲ領域のヒト可変フレームワーク領域による置換えは配座上の制限を引き起こし、これはあるアミノ酸残基の置換によって補正されない限り、結合親和性の消失をもたらす。
１つの実施形態において、復帰突然変異のためのアミノ酸残基の選択は、一部はコンピュータモデリングによって、当分野で認識された方法を使用して決定できる。一般に分子モデルは、その免疫グロブリン鎖またはドメインについて解明された構造から開始して作製できる。モデル化される鎖は、アミノ酸配列類似性について解明された三次元構造（たとえばＸ線構造）の鎖またはドメインと比較され、最大の配列類似性を示す鎖またはドメインが分子モデル構築のための開始点として選択される。解明された開始構造は、モデル化される免疫グロブリン鎖またはドメインにおける実際のアミノ酸と、開始構造におけるそれらとの違いについて修飾される。修飾された構造は次に複合免疫グロブリン内へ構築される。最後にモデルは、エネルギー最小化によって、そしてすべての原子が相互から適切な距離内にあることと、結合長および角度が化学的に許容される範囲内にあることとを確認することによって改良される。
別の実施形態において、知識ベースの手法またはデータベース解析をヒト化に使用できる。たとえばそのようなヒト化方法は、Ｒｏｓｏｋ ｅｔ ａｌ（Ｒｏｓｏｋ ＭＪ，ｅｔ ａｌ，１９９６．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２２６１１−２２６１８）で述べられている方法により、Ｖ領域配列の目視検査および解析に基づくことができる。標準決定基、表面残基、および潜在的接触残基が同定される。潜在的接触残基が注目されており、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．（Ｃｈｏｔｈｉａ Ｃ ａｎｄ Ｌｅｓｋ ＡＭ．１９８７．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７）によって定義されたＣＤＲループの構造定義に従って、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（Ｋａｂａｔ ＥＡ，Ｗｕ ＴＴ，Ｒｅｉｄ−Ｍｉｌｌｅｒ Ｍ、Ｐａｒｒｙ ＨＭ，およびＧｏｔｔｅｓｍａｎ ＫＳ．１９８７．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ．ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ，ベセズダ，ＭＤ）によって定義された配列超可変性に従って、そしてＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．（ＭａｃＣａｌｌｕｍ ＲＭ，Ｍａｒｔｉｎ ＡＣＲ，およびＴｈｏｒｔｏｎ ＪＭ．１９９６．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２−７４５）によって定義された潜在的抗原接触残基に従って広範に分類される。Ｋａｂａｔ番号付けおよび定義によるマウスＣＤＲループは、その全体がアクセプタヒトフレームワーク上へグラフトされる。Ｐａｄｌａｎ（Ｐａｄｌａｎ ＥＡ．１９９１．Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９−４９８）によって定義されたパッキング残基が同定され、Ｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｓｉｎｇｅｒ ＩＩ ｅｔ ａｌ．１９９３．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：２８４４−２８５７）で述べられた方法に従ってパッキング残基を保存する試みが行われる。フレームワーク配列内の各残基は、Ｈａｒｒｉｓ ａｎｄ Ｂａｊｏｒａｔｈ（Ｈａｒｒｉｓ Ｌ ａｎｄ Ｂａｊｏｒａｔｈ Ｊ．１９９５．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ４：３０６−３１０）で述べられているように、抗体ヒト化に関して低、中、または高「リスク位置」が割り当てられる。
一般に低リスク位置はヒトに維持される。同一でない中および高リスクアミノ酸位置の多くについては、ヒト化抗体配列の公開または専有コレクションを参照することができる。以前のヒト化抗体配列を再検討すると、ヒトまたはマウス（復帰突然変異）アミノ酸残基の包含が機能的結合活性を引き起こしたかどうかには注目されていなかった。置換が検討されるこれらの場合では、残基の機能的互換性を確認するためにアミノ酸置換マップ（Ｄ．Ｂｏｒｄｏ ａｎｄ Ｐ．Ａｒｇｏｓ．１９９１．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１７：７２１−７２９）を参照することができる。
置換のためのアミノ酸残基の選択は一部は、特定の位置におけるアミノ酸の特徴の調査、あるいは特定のアミノ酸の置換または変異誘発の効果の経験的観察によっても決定できる。たとえばアミノ酸が非ヒト可変領域フレームワーク残基と選択したヒト可変領域フレームワーク残基との間で異なるとき、ヒトフレームワークアミノ酸は通常、ドナー抗体からのアミノ酸が標準残基、インタフェースパッキング残基、または結合部位に近い異常または希少な残基である場合は、非ヒトドナー抗体からの同等のフレームワークアミノ酸によって置換されるべきである。
１つの実施形態において、本発明の結合分子は、ヒトアミノ酸残基の、アミノ酸残基がインタフェースパッキング残基である相当するマウスアミノ酸残基への少なくとも１つの復帰突然変異をさらに含む。「インタフェースパッキング残基」は、たとえばＮｏｖｏｔｎｙ ａｎｄ Ｈａｂｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：４５９２−６６（１９８５）によって定義されるような、ＶＬとＶＨとの間のインタフェースにおける残基を含む。
１つの実施形態において、本発明の結合分子は、ヒトアミノ酸残基の、標準残基である相当するマウスアミノ酸残基への少なくとも１つの復帰突然変異をさらに含む。「標準残基」は、ＣＤＲ配座にとって重要であることが公知である、標準または構造クラス内の保存フレームワーク残基である（Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２１５：１７５（１９９０）、そのすべてが参照により本明細書によって組み入れられている）。標準残基は、軽鎖の２、２５、２７Ｂ、２８、２９、３０、３３、４８、５１、５２、６４、７１、９０、９４および９５ならびに重鎖の残基２４、２６、２７ ２９、３４、５４、５５、７１および９４を含む。追加の残基（たとえばＣＤＲ構造決定残基）は、Ｍａｒｔｉｎ ａｎｄ Ｔｈｏｒｔｏｎ（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：８００の方法に従って同定できる。
１つの実施形態において、本発明の結合分子は、ヒトアミノ酸残基の、アミノ酸残基がＣＤＲと相互作用できる位置にある相当するマウスアミノ酸残基への少なくとも１つの復帰突然変異をさらに含む。特に軽鎖の位置２、４８、６４および７１ならびに重鎖の２６〜３０、７１および９４におけるアミノ酸（Ｋａｂａｔによる番号付け）は、多くの抗体におけるＣＤＲと相互作用できることが公知である。軽鎖内の位置３５ならびに重鎖内の９３および１０３におけるアミノ酸もＣＤＲと相互作用しやすい。
置換のためのフレームワーク残基の選択の例示的な技法は、たとえばＵＳ ｐａｔｅｎｔ ５，５８５，０８９に述べられている。その特許には、改変できるヒトフレームワークアミノ酸の複数のカテゴリが述べられている。１つの実施形態において、カテゴリ２アミノ酸は相当するマウス残基に復帰突然変異される。特にカテゴリ２アミノ酸は、珍しい（すなわち「まれ」、それは本明細書で使用するようにその位置にて、代表的なデータバンクにおいてヒト重（それぞれ軽）鎖Ｖ領域配列の約２０％未満で、しかし通常は約１０％未満で発生するアミノ酸を示す）ヒトアクセプタ免疫グロブリンのフレームワーク内のアミノ酸であり、その位置のドナーアミノ酸がヒト配列にとって典型的である場合（すなわち「一般的」、それは本明細書で使用するように代表的なデータバンクにおいて配列の約２５％超で、通常は約５０％超で発生するアミノ酸を示す）、ヒトアクセプタアミノ酸ではなく非ヒトドナーアミノ酸（たとえばマウスアミノ酸）が選択される。この基準は、ヒトフレームワーク内の異型アミノ酸が抗体構造を妨害しないようにするのを補助する。その上、異型アミノ酸をヒト抗体にとってたまたま典型的であるドナー抗体からのアミノ酸で置換することによって、ヒト化抗体をより低い免疫原性で作製できる。
すべてのヒト軽鎖および重鎖可変領域配列は、相互に対して特に相同性であり、ある決定的な位置に同じアミノ酸を有する配列の「サブグループ」にそれぞれグループ化される（Ｋａｂａｔら、ｏｐ．ｃｉｔ）。ヒトアクセプタ配列内のアミノ酸がヒト配列で「まれ」または「一般的」かどうかを判定するときに、同じサブグループ内のヒト配列のみをアクセプタ配列と見なすことがしばしば好ましい。
１つの実施形態において、カテゴリ３アミノ酸は相当するマウス残基に復帰突然変異される。カテゴリ３内の残基は、ヒト化免疫グロブリン鎖の一次配列内の３ＣＤＲの１個以上に隣接しており、アクセプタアミノ酸ではなくドナーアミノ酸を選択できる。これらのアミノ酸はＣＤＲ内のアミノ酸と特に相互作用しやすく、アクセプタから選択された場合、ドナーＣＤＲを歪ませて、親和性を低下させやすい。その上、隣接アミノ酸は抗原と直接相互作用でき（Ａｍｉｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３３，７４７−７５３（１９８６））、これらのアミノ酸をドナーから選択することは、元の抗体で親和性を提供するすべての抗原接触を維持するために望ましい。
１つの実施形態において、カテゴリ４アミノ酸は、相当するマウス残基に復帰突然変異される。カテゴリ４アミノ酸は、元のドナー抗体に特有な３次元モデルにおいて、ＣＤＲ外部のあるアミノ酸がＣＤＲに近接しており、ＣＤＲ内のアミノ酸と水素結合、ファンデルワールス力、疎水性相互作用などによって相互作用する良好な可能性を有することを示すアミノ酸である。これらのアミノ酸位置では、アクセプタ免疫グロブリンアミノ酸ではなくドナー免疫グロブリンアミノ酸を選択できる。この基準によるアミノ酸は一般に、ＣＤＲ内の一部の原子の約３オングストロームユニット以内の側鎖原子を有し、上に挙げたような樹立された化学的力に従ってＣＤＲ原子と相互作用できる原子を含有する必要がある。
水素結合を形成できる原子の場合、３オングストロームはその核間で測定されるが、結合を形成しない原子では、３オングストロームはそのファンデルワールス表面間で測定される。それゆえ後者の場合、核は相互作用が可能であると見なされる原子では、約６オングストローム以内でなければならない（３＋ファンデルワールス半径の和）。多くの場合、核は４または５〜６Å離れるであろう。アミノ酸がＣＤＲと相互作用できるかを判定するには、構造の観点からこれらの８アミノ酸がよりフレームワークの一部として挙動するため、重鎖ＣＤＲ２の最後の８アミノ酸をＣＤＲの一部と見なさないことが好ましい。
ＣＤＲ内のアミノ酸と相互作用できる、したがってカテゴリ４に属するフレームワークのアミノ酸は、別の方法で区別できる。各フレームワークアミノ酸の表面積にアクセスできる溶媒は２つの方法で：（１）無傷の抗体において、（２）抗体と、除去されたそのＣＤＲより成る仮説上の分子において計算される。約１０平方オングストローム以上のこれらの数の間の著しい差は、フレームワークアミノ酸の溶媒へのアクセスがＣＤＲによって少なくとも部分的に遮断されることと、したがってアミノ酸がＣＤＲと接触を行うこととを示す。アミノ酸の溶媒がアクセス可能な表面積は、当分野で公知であるアルゴリズムを使用して、抗体の３次元モデルに基づいて計算できる（たとえばＣｏｎｎｏｌｌｙ，Ｊ． Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔ．１６，５４８（１９８３）およびＬｅｅ ａｎｄ Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５５，３７９（１９７１））。フレームワークアミノ酸も場合により、次にＣＤＲと接触する別のフレームワークアミノ酸の配座に影響をア及ぼすことによってＣＤＲと間接的に相互作用できる。
フレームワーク内の複数の位置におけるアミノ酸は、特に軽鎖の位置２、４８、６４および７１ならびに重鎖の２６−３０、７１および９４（Ｋａｂａｔによる番号付け、ｏｐ．ｃｉｔ）における多くの抗体でのＣＤＲと相互作用できることが公知であり（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６，９０１（１９８７），Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ３４２，８７７（１９８９）、およびＴｒａｍｏｎｔａｎｏら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，１７５（１９９０）、そのすべてが参照により本明細書によって組み入れられている）、したがってこれらのアミノ酸は概してカテゴリ４にあるだろう。通例、本発明のヒト化免疫グロブリンは、これらに加えてカテゴリ４にドナーアミノ酸（異なる場合）を含むであろう。軽鎖の位置３５および重鎖の９３および１０３にあるアミノ酸も、ＣＤＲと相互作用しやすい。したがって、１つの実施形態において、アクセプタアミノ酸よりもむしろ１個以上のドナーアミノ酸（それらが異なるとき）をヒト化免疫グロブリン内に含むことができる。これに対して、軽鎖の最初の５アミノ酸などの、カテゴリ４内のある位置は場合により、ヒト化免疫グロブリンでの親和性を失うことなくアクセプタ免疫グロブリンから選択できる。
ヒト化免疫グロブリン内のアミノ酸をドナーから選ぶときを説明する上のカテゴリに加えて、ヒト化免疫グロブリン内のあるアミノ酸は、それらがカテゴリ５に含まれる場合は、ドナーからもアクセプタからも選んではいけない。ドナー免疫グロブリン内の所与の位置のアミノ酸がヒト配列にとって「まれ」であり、上述したようにアクセプタ免疫グロブリン内のその位置のアミノ酸もヒト配列にとって「まれ」である場合、ヒト化免疫グロブリン内のその位置のアミノ酸は、ヒト配列に特有のあるアミノ酸となるように選択できる。好ましい選択は、アクセプタ配列と同じサブグループに属する公知のヒト配列内のその位置で最も頻繁に発生するアミノ酸である。
１つの実施形態において、本発明の結合分子は、３個のＢ３Ｆ６軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３）およびヒト軽鎖フレームワーク領域を含む。１つの実施形態において、本発明の結合分子は、２および１００から成る群より選択される少なくとも１つの位置における、ヒトアミノ酸残基の相当するマウスアミノ酸残基への少なくとも１つの復帰突然変異をさらに含む。１つの実施形態において、本発明の結合分子は、２および１００から成る群より選択される１つの位置における、ヒトアミノ酸残基の相当するマウスアミノ酸残基への１つの復帰突然変異をさらに含む。別の実施形態において、結合分子は、ヒト化Ｂ３Ｆ６軽鎖の位置２および１００における復帰突然変異を含む。別の実施形態において、本発明の結合分子は、ヒト化Ｂ３Ｆ６軽鎖の位置２における復帰突然変異（ｂａｃｋｍｕａｔｉｏｎ）および少なくとも１つの追加の復帰突然変異を含む。別の実施形態において、本発明の結合分子は、ヒト化Ｂ３Ｆ６軽鎖の位置１００における復帰突然変異および少なくとも１つの追加の復帰突然変異を含む。
１つの実施形態において、本発明の結合分子は、３個のＢ３Ｆ６重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３）ならびにヒト重鎖フレームワーク領域を含む。１つの実施形態において、本発明の結合分子は、１、４８、６７、７１、７３、８１、８２ｂ、９３、および１１２から成る群より選択される少なくとも１つの位置における、ヒトアミノ酸残基の相当するマウスアミノ酸残基への少なくとも１つの復帰突然変異を含む。１つの実施形態において、本発明の結合分子は、１、４８、６７、７１、７３、８１、８２ｂ、９３、および１１２から成る群より選択される１つの位置における、ヒトアミノ酸残基の相当するマウスアミノ酸残基への１つの復帰突然変異を含む。１つの実施形態において、本発明の結合分子は、１、４８、６７、７１、７３、８１、８２ｂ、９３、および１１２から成る群より選択される２つの位置における、ヒトアミノ酸残基の相当するマウスアミノ酸残基への２つの復帰突然変異を含む。１つの実施形態において、本発明の結合分子は、１、４８、６７、７１、７３、８１、８２ｂ、９３、および１１２から成る群より選択される３つの位置における、ヒトアミノ酸残基の相当するマウスアミノ酸残基への３つの復帰突然変異を含む。１つの実施形態において、本発明の結合分子は、１、４８、６７、７１、７３、８１、８２ｂ、９３、および１１２から成る群より選択される４つの位置における、ヒトアミノ酸残基の相当するマウスアミノ酸残基への４つの復帰突然変異を含む。１つの実施形態において、本発明の結合分子は、１、４８、６７、７１、７３、８１、８２ｂ、９３、および１１２から成る群より選択される５つの位置における、ヒトアミノ酸残基の相当するマウスアミノ酸残基への５つの復帰突然変異を含む。１つの実施形態において、本発明の結合分子は、１、４８、６７、７１、７３、８１、８２ｂ、９３、および１１２から成る群より選択される６つのｔｈｒｅｅ位置における、ヒトアミノ酸残基の相当するマウスアミノ酸残基への６つの復帰突然変異を含む。１つの実施形態において、本発明の結合分子は、１、４８、６７、７１、７３、８１、８２ｂ、９３、および１１２から成る群より選択される７つの位置における、ヒトアミノ酸残基の相当するマウスアミノ酸残基への７つの復帰突然変異を含む。１つの実施形態において、本発明の結合分子は、１、４８、６７、７１、７３、８１、８２ｂ、９３、および１１２から成る群より選択される８つの位置における、ヒトアミノ酸残基の相当するマウスアミノ酸残基への復帰突然変異をさらに含む。１つの実施形態において、本発明の結合分子は、１、４８、６７、７１、７３、８１、８２ｂ、９３、および１１２から成る群より選択されるヒトアミノ酸残基の相当するマウスアミノ酸残基への９つの復帰突然変異を含む。
１つの実施形態において、本発明は、Ｂ３Ｆ６抗体のヒト化可変領域およびそのようなヒト化可変領域を含むポリペプチドに関する。
１つの実施形態において、本発明の結合分子は、配列番号：５２のアミノ酸１〜１１２で示すＣＤＲグラフト軽鎖可変領域配列を含む。１つの実施形態において、本発明の結合分子は、配列番号：５５のアミノ酸１〜１２１で示すＣＤＲグラフト軽鎖可変領域配列を含む。
１つの実施形態において、本発明の結合分子は、配列番号：４７で示す軽鎖バージョン１可変領域配列を含む。１つの実施形態において、本発明の結合分子は、配列番号：４８で示す重鎖バージョン１可変領域配列を示す。１つの実施形態において、本発明の結合分子は、配列番号：４９で示す重鎖バージョン２可変領域配列を含む。
別の実施形態において、本発明の結合分子は配列番号：５０で示す軽鎖バージョン２可変領域配列を含む。１つの実施形態において、本発明の結合分子は、配列番号：５１で示す重鎖バージョン３可変領域配列を含む。
１つの実施形態において、本発明の結合分子は、配列番号：５２で示すＣＤＲグラフト軽鎖を含む。１つの実施形態において、本発明の結合分子は、配列番号：５３で示すバージョン１軽鎖を含む。１つの実施形態において、本発明の結合分子は、配列番号：５４で示すバージョン２軽鎖を含む。
１つの実施形態において、本発明の結合分子は、配列番号：５５で示すＣＤＲグラフト重鎖を含む。１つの実施形態において、本発明の結合分子は、配列番号：５６で示すバージョン１重鎖を含む。１つの実施形態において、本発明の結合分子は、配列番号：５７で示すバージョン２重鎖を含む。１つの実施形態において、本発明の結合分子は配列番号：５８で示すバージョン３重鎖を含む。
１つの実施形態において、本発明の結合分子は、配列番号：５９で示すＣＤＲグラフトドメイン欠失重鎖を含む。１つの実施形態において、本発明の結合分子は、配列番号：６０で示すバージョン１ドメイン欠失重鎖を含む。１つの実施形態において、本発明の結合分子は、配列番号：６１で示すバージョン２ドメイン欠失重鎖を含む。１つの実施形態において、本発明の結合分子は、配列番号：６２で示すバージョン３ドメイン欠失重鎖を含む。
１つの実施形態において、本発明の結合分子は、任意のシグナル配列を含む、配列番号：６３で示すＣＤＲグラフト軽鎖配列を含む。１つの実施形態において、本発明の結合分子は、任意のシグナル配列を含む、配列番号：６４で示すバージョン１軽鎖配列を含む。１つの実施形態において、本発明の結合分子は、任意のシグナル配列を含む、配列番号：６５で示すバージョン２軽鎖配列を含む。
１つの実施形態において、本発明の結合分子は、任意のシグナル配列を含む、配列番号：６６で示すＣＤＲグラフト重鎖配列を含む。１つの実施形態において、本発明の結合分子は、任意のシグナル配列を含む、配列番号：６７で示すバージョン１重鎖配列を含む。１つの実施形態において、本発明の結合分子は、任意のシグナル配列を含む、配列番号：６８で示すバージョン２重鎖配列を含む。１つの実施形態において、本発明の結合分子は、任意のシグナル配列を含む、配列番号：６９で示すバージョン３重鎖配列を含む。
１つの実施形態において、マウスＢ３Ｆ６ ＣＤＲおよびヒトフレームワーク領域を含む軽鎖は、マウスＢ３Ｆ６ ＣＤＲおよびヒトフレームワーク領域を含む重鎖と組合される。１つの実施形態において、マウスＢ３Ｆ６ ＣＤＲおよびヒトフレームワーク領域を含む軽鎖は、ヒトフレームワークアミノ酸残基の相当するマウスアミノ酸残基への少なくとも１個の復帰突然変異を含むＢ３Ｆ６重鎖のヒト化バージョンと組合される。別の実施形態において、ヒトフレームワークアミノ酸残基の相当するマウスアミノ酸残基への少なくとも１個の復帰突然変異を含むＢ３Ｆ６軽鎖のヒト化バージョンは、ヒトフレームワークアミノ酸残基の相当するマウスアミノ酸残基の少なくとも１個の復帰突然変異を含むＢ３Ｆ６重鎖のヒト化バージョンと組合される。別の実施形態において、マウスＢ３Ｆ６ ＣＤＲおよびヒトフレームワーク領域およびヒトフレームワークアミノ酸残基の相当するマウスアミノ酸残基への少なくとも１個の復帰突然変異を含む軽鎖は、Ｂ３Ｆ６重鎖のヒト化バージョンと組合される。例示的な組合せは、本実施例でさらに詳細に述べる。たとえば１つの実施形態において、本実施例のヒト化Ｌ１軽鎖は、バージョン１ヒト化Ｂ３Ｆ６抗体を作製するために、本実施例のＨ１重鎖と組合される。別の実施形態において、本実施例のヒト化Ｌ１軽鎖は、バージョン２ヒト化Ｂ３Ｆ６抗体を作製するために、本実施例のＨ２重鎖と組合される。別の実施形態において、本実施例のヒト化Ｌ１軽鎖は、バージョン３ヒト化Ｂ３Ｆ６抗体を作製するために、本実施例のＨ３重鎖と組合される。別の実施形態において、本実施例のヒト化Ｌ２軽鎖は、バージョン４ヒト化Ｂ３Ｆ６抗体を作製するために、本実施例のＨ１重鎖と組合される。別の実施形態において、本実施例のヒト化Ｌ２軽鎖は、バージョン５ヒト化Ｂ３Ｆ６抗体を作製するために、本実施例のＨ２重鎖と組合される。別の実施形態において、本実施例のヒト化Ｌ２軽鎖は、バージョン６ヒト化Ｂ３Ｆ６抗体を作製するために、本実施例のＨ３重鎖と組合される。そのような組合せが本発明の範囲内であることは当業者に明らかになるであろう。
１つの実施形態において、本発明の結合分子は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，マナッサス、バージニア州、２０１１０に、ブダベスト条約の条項の下でＡＴＣＣアクセション番号 で寄託された細胞系によって作製された抗体である。
ＩＩ．結合分子の形
Ａ．抗体またはその部分
１つの実施形態において、本発明の結合分子は抗体分子である。たとえば１つの実施形態において、本発明の結合分子はＣｒｉｐｔｏに結合するヒト化抗体またはその部分である。別の実施形態において、本発明の結合分子はＣｒｉｐｔｏに結合するヒト化抗体の抗原結合断片および抗体の第２の抗原結合断片を含む。
当分野の認識されたプロトコルを使用すると、たとえば抗体は好ましくは、哺乳類において関連抗原（たとえば精製腫瘍関連抗原あるいはそのような抗原を含む細胞または細胞抽出物）およびアジュバントの複数回の皮下または腹腔内注射によって産生される。この免疫化は通例、活性化された脾細胞またはリンパ球からの抗原反応性抗体の産生を含む免疫反応を誘発する。得られた抗体ポリクローナル調製物を提供するために動物の血清から収集できるが、モノクローナル抗体（ＭＡｂ）の同種調製物を提供するために脾臓、リンパ節または末梢血から個々のリンパ球を単離することがしばしば望ましい。好ましくはリンパ球は、脾臓から得られる。
この公知のプロセス（Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５（１９７５））において、抗原を注射された哺乳類からの比較的短寿命の、または致死のリンパ球は不死腫瘍細胞系（たとえば骨髄腫細胞系）と融合され、それゆえ不死であり、かつＢ細胞の遺伝子コードされた抗体を産生できるハイブリッド細胞、すなわち「ハイブリドーマ」を生成する。得られたハイブリッドは、単一抗体の形成のための特異的遺伝子を含む各個々の株を用いた選択、希釈、および再増殖によって、単一の遺伝子株に分離される。それらは所望の抗原に対して同種であり、その純粋な遺伝的系統に関連して「モノクローナル」と呼ばれる抗体を産生する。
そのように調製されたハイブリドーマ細胞を、好ましくは融合してない親骨髄腫細胞の増殖または生存を阻害する１つ以上の物質を含有する適切な培地に播種して、増殖させる。当業者は、ハイブリドーマの形成、選択および成長のための試薬、細胞系および培地は多数の供給源から市販されており、標準化プロトコルが十分に確立されていることを認識するであろう。概して、ハイブリドーマ細胞が成長している培地は、所望の抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降によって、または試験管内アッセイ、たとえばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって決定される。所望の特異性、親和性および／または結合の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンは希釈手順を制限することによりサブクローニングされ、標準方法によって増殖される（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体培地、腹水または血清から、従来の精製手順、たとえばタンパク質−Ａ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析または親和性クロマトグラフィーによって分離できることがさらに認識されるであろう。
別の実施形態において、所望のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、ただちに単離され、従来の手順を使用して（たとえばマウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）配列決定できる。単離およびサブクローニングしたハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい供給源として作用する。いったん単離されると、ＤＮＡは発現ベクター内に配置でき、次にそうでなければ免疫グロブリンを産生しない原核または真核宿主細胞、たとえばＥ．ｃｏｌｉ細胞，サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または骨髄腫細胞に移入される。さらに詳細には、単離したＤＮＡ（本明細書で述べるように合成できる）を使用して、参照により本明細書に組み入れられている、１９９５年１月２５日に出願されたＮｅｗｍａｎ ｅｔ ａｌ，Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，６５８，５７０で述べられているように、抗体製造のために定常および可変領域配列クローニングできる。本質的に、これは選択した細胞からのＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡへの変換、およびＩｇ特異性プライマーを使用するＰＣＲによる増幅を含む。この目的のために適切なプライマーは、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，６５８，５７０にも述べられている。以下でさらに詳細に述べるように、所望の抗体を発現する変換された細胞を比較的大量に増殖させて、免疫グロブリンの臨床用および商用供給物を提供できる。
当業者は、抗体または抗体断片（たとえば抗原結合部位）をコードするＤＮＡも抗体ファージライブラリから、たとえばｐｄファージまたはＦｄファージミド技術を使用して得られることも認識するであろう。例示的な方法はたとえばＥＰ ３６８ ６８４ Ｂ１；Ｕ．Ｓ．ｐａｔｅｎｔ．５，９６９，１０８，Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．およびＣｈａｍｅｓ．２０００．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ２１：３７１；Ｎａｇｙ ｅｔ ａｌ．２００２．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：８０１；Ｈｕｉｅ ｅｔ ａｌ．２００１．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：２６８２；Ｌｕｉ ｅｔ ａｌ．２００２．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１５：１０６３に述べられており、そのぞれぞれが参照により本明細書に組み入れられている。複数の刊行物（たとえばＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７７９−７８３（１９９２））が、鎖シャッフリングによる高親和性ヒト抗体の産生はもちろんのこと、大型ファージライブラリを構築するための方法としてのコンビナトリアル感染および生体内組換えについても述べている。別の実施形態において、リボソーム提示を使用して、バクテリオファージを提示プラットフォームとして使用することができる（たとえばＨａｎｅｓ ｅｔ ａｌ．２０００．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：１２８７；Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．２００１．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：３７５０；またはＩｒｖｉｎｇ ｅｔ ａｌ．２００１ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８：３１を参照。なお別の実施形態において、細胞表面ライブラリを抗体についてスクリーニングできる（Ｂｏｄｅｒ ｅｔ ａｌ．２０００．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：１０７０１；Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．２０００ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４３：２１１。そのような手順は、モノクローナル抗体の単離および続いてのクローニングのための在来のハイブリドーマ技法の代替方法を提供する。
本発明の別の実施形態において、本発明の結合分子の結合部位は、ヒトまたは実質的にヒト抗体によって提供できる。ヒトまたは実質的にヒト抗体は、内因性免疫グロブリン産生のできないトランスジェニック動物内で作製できる（たとえばマウス）（たとえばＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．６，０７５，１８１、５，９３９，５９８、５，５９１，６６９および５，５８９，３６９を参照、そのそれぞれが参照により本明細書に組み入れられている）。たとえばキメラおよび生殖系列ミュータントマウスにおける抗体重鎖連結領域のホモ接合型欠失は、内因性抗体産生の完全な阻害を引き起こすことが述べられている。ヒト免疫グロブリン遺伝子アレイのそのような生殖系列ミュータントマウスへの移入は、抗原チャレンジ時のヒト抗体の産生を引き起こすであろう。ＳＣＩＤマウスを使用してヒト抗体を産生する別の好ましい手段は、参照により本明細書に組み入れられている、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，８１１，５２４に開示されている。これらのヒト抗体に関連する遺伝物質も本明細書で述べるように単離および操作できることが認識されるであろう。
組換え抗体を産生するためのなお別の非常に効率的な手段は、Ｎｅｗｍａｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：１４５５−１４６０（１９９２）によって開示されている。特にこの技法は、サル可変ドメインおよびヒト定常配列を含有する霊長類化抗体の産生を引き起こす。この参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられている。その上、この技法は同一譲受人に譲渡されたＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．５，６５８，５７０、５，６９３，７８０および５，７５６，０９６に述べられており、そのそれぞれが参照により本明細書に組み入れられている。
別の実施形態において、リンパ球はマイクロ操作によって選択され、可変遺伝子が単離される。たとえば末梢血単核細胞は、免疫化哺乳類から単離でき、試験管内で約７日間培養できる。培養物は基準を満足する特異性ＩｇＧについてスクリーニングできる。陽性ウェルからの細胞を単離できる。個々のＩｇ産生Ｂ細胞は、ＦＡＣＳによって、または補体仲介溶血プラークアッセイでそれらを同定することによって単離できる。Ｉｇ産生Ｂ細胞は、チューブ内にマイクロ操作することができ、ＶＨおよびＶＬ遺伝子はたとえばＲＴ−ＰＣＲを用いて増幅できる。ＶＨおよびＶＬ遺伝子は、抗体発現ベクター内にクローニングして、発現のために細胞（たとえば真核または原核細胞）内に移入できる。
その上、本発明の結合分子を産生するのに有用な遺伝子配列は、多数の供給源から入手できる。たとえば上で広範に述べたように、各種のヒト抗体遺伝子は、公的にアクセス可能な寄託株の形で利用できる。抗体および抗体コード遺伝子の多くの配列が公開されており、適切な抗体遺伝子は当分野で認識された技法を使用して、これらの配列から化学合成できる。本発明のこの態様に適合するオリゴヌクレオチド合成技法は当業者に公知であり、複数の市販の自動合成機のいずれかを使用して実施できる。加えて本明細書で述べる複数の種類の重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡ配列は、市販のＤＮＡ合成販売者のサービスを通じて入手できる。上述の方法のいずれかを使用して得た遺伝物質は次に改変または合成されて、本発明のポリペプチドを提供する。
あるいは抗体産生細胞系は、当業者に公知の技法を使用して選択および培養できる。そのような技法は各種の実験マニュアルおよび主要刊行物に述べられている。この点で、以下で述べるような本発明での使用に適切な技法は、付録を含めてその全体が参照により本明細書に組み入れられている、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｅｄｓ．，Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９１）に述べられている。
本発明の範囲がさらに抗原結合ＤＮＡ配列のすべての対立遺伝子、改変体および変異を含むことが、さらに認識されるであろう。
公知であるように、ＲＮＡは元のハイブリドーマ細胞から、または他の変換された細胞から標準技法、たとえばグアニジニウムイソチオシアナート抽出および沈降と、それに続く遠心分離またはクロマトグラフィーによって単離できる。望ましい場合、ｍＲＮＡは全ＲＮＡから標準技法、たとえばオリゴｄＴセルロースでのクロマトグラフィーによって単離できる。適切な技法は当分野でよく知られている。
１つの実施形態において、抗体の軽鎖および重鎖をコードするｃＤＮＡは、公知の方法に従って逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼを使用して同時にまたは個別にのどちらかで作製できる。ＰＣＲは、コンセンサス定常領域プライマーによって、または公開された重鎖および軽鎖ＤＮＡならびにアミノ酸配列に基づいてより特異的なプライマーによって開始できる。上述したように、ＰＣＲは抗体軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡクローンを単離するためにも使用できる。この場合、ライブラリは、コンセンサスプライマーまたはより大きい相同性プローブ、たとえばマウス定常領域プローブによってスクリーニングできる。
ＤＮＡ、通例プラスミドＤＮＡは、当分野で公知の技法を使用して細胞から単離し、制限酵素マッピングをして、たとえば組換えＤＮＡ技法に関連する上述の参考文献で詳細に述べられている、標準の公知の技法に従って配列決定できる。もちろんＤＮＡは、単離プロセスまたは次の解析中のいずれの時点にでも合成できる。本発明の結合分子で使用するための例示的な抗体またはその断片は、本明細書で述べる標的を認識する抗体を含む。
ある実施形態において、抗体の抗原結合断片は、当分野で公知の技法を使用して産生できる。
Ｂ．修飾抗体
１つの実施形態において、本発明の結合分子は、修飾抗体、すなわちおよび抗体に由来するが、野生型抗体ではない分子、たとえばミニボディ（ミニボディは当分野で述べられている方法を使用して作製できる（たとえばＵＳ ｐａｔｅｎｔ ５，８３７，８２１またはＷＯ ９４／０９８１７Ａ１を参照））などを含むか、またはそれより成る。
１．ドメイン欠失抗体
１つの実施形態において、本発明の結合分子は、１個以上のドメインが部分的にまたは完全に欠失している合成定常領域を含む（「ドメイン欠失抗体」）。特に好ましい実施形態において、適合性修飾抗体は、ＣＨ２ドメイン全体が除去されたドメイン欠失構築物または改変体を含むであろう（ΔＣＨ２構築物）。他の好ましい実施形態では、短い結合ペプチドを欠失したドメインと置換して、可変領域の柔軟性および移動の自由を与えることができる。当業者は、抗体の異化率に対するＣＨ２ドメインの調節特性のために、そのような構築物が特に好ましいことを認識するであろう。
別の実施形態において、本発明の修飾抗体はＣＨ２ドメイン欠失抗体である。ドメイン欠失構築物は、ＩｇＧ１ヒト定常ドメインをコードするベクター（たとえばＩＤＥＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、サンディエゴから）を使用して得ることができる（たとえばＷＯ ０２／０６０９５５Ａ２およびＷＯ０２／０９６９４８Ａ２を参照）。この例示的なベクターは、ＣＨ２ドメインを欠失して、ドメイン欠失ＩｇＧ１定常領域を発現する合成ベクターを提供するように組換えられる。次にＣ２Ｂ８抗体、５Ｅ８抗体、Ｂ３Ｆ６抗体のマウス可変領域、またはヒト化ＣＣ４９抗体の可変領域をコードする遺伝子が、合成ベクターに挿入され、クローニングされた。変換された細胞内で発現されたとき、これらのベクターはＣ２Ｂ８．ΔＣＨ２、５Ｅ８．ΔＣＨ２、Ｂ３Ｆ６．ΔＣＨ２またはｈｕＣＣ４９．ΔＣＨ２またはそれぞれを提供した。これらの構築物は、それらをモノマーサブユニットの特に魅力的な候補とする多くの特性を示す。ヒト化ドメイン欠失Ｂ３Ｆ６抗体も産生され、本実施例でより詳細に述べられている。
これらの例示的な構築物が、ＣＨ３ドメインをそれぞれの本発明のポリペプチドのヒンジ領域に直接融合するように組換えられたことが注目されるであろう。他の構築物では、ヒンジ領域と合成ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインとの間にペプチドスペーサを提供することが望ましい。たとえばＣＨ２ドメインが欠失し、残りのＣＨ３ドメイン（合成または非合成）が５〜２０アミノ酸スペーサを備えたヒンジ領域に連結される適合性構築物を発現させることができる。たとえば定常ドメインの調節要素が遊離したままでアクセスできるように、またはヒンジ領域が柔軟なままであるように、そのようなスペーサを添加できる。たとえばＣＨ２ドメインおよび下部ヒンジ領域と置換された短いアミノ酸スペーサＧＧＳＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号８）を有するドメイン欠失Ｂ３Ｆ６構築物（Ｂ３Ｆ６．ΔＣＨ２［ｇｌｙ／ｓｅｒ］）を使用できる。他の例示的な結合ペプチドを表２に示す。これらの結合ペプチドは、本発明のポリペプチドにいずれかと共に使用できる。好ましくは、結合ペプチドは、ＣＨ２重鎖ドメインを欠失したポリペプチドと共に使用される。好ましくは本発明と適合するいずれのリンカーも、比較的非免疫原性であり、本発明のポリペプチドの非共有結合を阻害しない。
１つの実施形態において、本発明のポリペプチドは、それがモノマーサブユニット間の所望の共有または非共有結合を許容する限り、２、３個の、またはわずか１個のアミノ酸の欠失または置換を有する免疫グロブリン重鎖を含む。たとえばＣＨ２ドメインの選択した範囲における１個のアミノ酸の変異は、Ｆｃ結合を実質的に減少させ、それにより腫瘍局在化を増加させるのに十分である。同様に、調節されるエフェクタ機能（たとえば補体結合）を制御する１個以上の定常領域ドメインのその一部を単に欠失させることが望ましい。定常領域のそのような部分欠失は、抗体（血清半減期）の選択された特徴を改善でき、同時に対象定常領域ドメインに関連する他の望ましい機能を損なわれないままにする。その上、上で言及したように、開示した抗体の定常領域は、得られた構築物のプロフィールを向上させる１個以上のアミノ酸の変異または置換によって合成できる。この点で、実質的に修飾抗体の配置および免疫原性プロフィールを維持しながら、保存結合部位（たとえばＦｃ結合）によって提供された結合を妨害することが可能である。なお他の好ましい実施形態は、エフェクタ機能などの望ましい特徴を向上させるための、あるいはさらなる細胞毒または炭化水素付着を与えるための、１個以上のアミノ酸の定常領域への付加を含みうる。そのような実施形態では、選択した定常領域ドメインに由来する特異性配列を挿入または複製することが望ましい。
定常領域が複数のエフェクタ機能を仲介することが当分野で公知である。たとえば補体のＣ１成分の抗体への結合は、補体系を活性化する。補体の活性化は、細胞病原体のオプソニン化および溶解において重要である。補体の活性化は炎症反応も刺激して、自己免疫過敏症にも関与しうる。さらに抗体はＦｃ領域を介して細胞に結合し、抗体Ｆｃ領域のＦｃレセプタ部位は細胞のＦｃレセプタ（ＦｃＲ）に結合する。ＩｇＧ（ガンマレセプタ）、ＩｇＥ（イプシロンレセプタ）、ＩｇＡ（アルファレセプタ）およびＩｇＭ（ミューレセプタ）を含む、異なるクラスの抗体に対して特異性である多くのＦｃレセプタである。抗体の細胞表面上のＦｃレセプタへの結合は、抗体被覆粒子の貧食および破壊、免疫複合体の排除、キラー細胞による抗体被覆標的細胞の溶解（抗体依存性細胞仲介細胞毒性、またはＡＤＣＣと呼ばれる）、炎症メディエータの放出、免疫グロブリン産生の胎盤通過および制御を含む、多くの重要で多様な生体反応を誘発する。
１つの実施形態において、エフェクタ機能は、標的細胞を枯渇させることができない、またはＦｃ改変体を作製すると考えられるＩｇＧ４抗体の定常領域を使用することによって除去または低下させることができ、エフェクタ機能にとって重要なＦｃ領域の残基は当分野で公知の技法、たとえばＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，５８５，０９７を使用して変異される。たとえば定常領域ドメインの欠失または不活性化（点変異または他の手段によって）は、循環する修飾抗体のＦｃレセプタ結合を減少させ、それにより腫瘍局在化を増加させる。他の場合では、本発明と一致する定常領域修飾は、補体（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔ）結合を抑制して、それゆえ接合細胞毒の血清半減期および非特異的結合を低減させることがありうる。定常領域のなお他の修飾を使用して、抗原特異性または抗体柔軟性の上昇による局在化の向上を可能にするジスルフィド結合またはオリゴサッカライド部分を修飾できる。より一般には当業者は、本明細書で述べたように修飾した抗体がただちに認識できる、またはできない多くの微妙な効果を発揮しうることを理解するであろう。しかしながら得られた修飾の生理学的プロフィール、生物学的利用能および他の生化学効果、たとえば腫瘍局在化、体内分布および血清半減期は、過度の実験をせずに公知の免疫技法を使用して、容易に測定および定量できる。
１つの実施形態において、抗体の修飾形は、前駆体全体または親抗体から当分野で公知の技法を使用して作製できる。例示的な技法は以下でさらに詳細に述べる。
重鎖部分を含むポリペプチドは、免疫グロブリン分子に由来しない他のアミノ酸配列または部分を含んでいても、いなくてもよい。そのような修飾は以下でさらに詳細に述べる。たとえば１つの実施形態において、本発明のポリペプチドは、柔軟性リンカー配列を含むことができる。別の実施形態において、ポリペプチドは薬物またはＰＥＧなどの機能性部分を付加するために修飾できる。
２．二重特異性結合分子
１つの実施形態において、本発明の結合分子は二重特異性である。たとえば１つの実施形態において、結合分子はＣｒｉｐｔｏおよび別の分子に結合する。１つの実施形態において、本発明の二重特異性結合分子は、１個以上の腫瘍分子または腫瘍細胞増殖に関連する分子に結合する追加の結合部位を含むことができる。１つの実施形態において、腫瘍性障害では、開示したポリペプチドの抗原結合部位（すなわち可変領域あるいはその免疫反応性断片または組換え）は、悪性疾患の部位にて選択された腫瘍関連分子と結合する。新形成腫瘍細胞増殖に関連する報告された分子の数、そして関連抗体の数を考えると、当業者は、請求された結合分子の結合部位がしたがって多数の抗体全体のいずれか１つに由来することを認識するであろう。さらに一般的には、本発明で使用する結合部位は、選択した条件に関連する標的またはマーカーと反応するいずれかの抗体（文献で以前に報告された抗体も含む）から入手または由来しうる。さらに開示したポリペプチドを産生するために使用する親または前駆体抗体、あるいはその断片は、マウス、ヒト、キメラ、ヒト化、非ヒト霊長類または霊長類化でありうる。他の好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドは、本明細書で述べるような改変された定常ドメインを有する単一の鎖抗体構築物（参照により本明細書に組み入れられているＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，８９２，０１９に開示されているような）を含むことができる。結果として、抗体のこれらの種類のいずれを使用しても、本発明の二重特異性分子内に包含できる結合部位を得ることができる。
本明細書で使用するように、「腫瘍関連分子」は、概して腫瘍細胞と関連している、すなわち正常細胞と比較して同じまたは高い程度で発現される、いずれの抗原または標的分子も意味する。さらに一般的には、腫瘍関連分子は、非悪性細胞でのその発現の無関係に、新生細胞における免疫反応性抗体の局在化を提供するいずれの分子も含む。そのような分子は比較的、腫瘍特異性であり、その発現は悪性細胞の表面に制限される。あるいはそのような分子は悪性および非悪性細胞の両方で見出すことができる。たとえばＣＤ２０は、悪性および非悪性Ｂ細胞の両方の表面に見出されるｐａｎ Ｂ抗原であり、非ホジキンリンパ腫の処置のための免疫治療抗体にきわめて有効な標的であることが判明している。
この点で、ｐａｎ Ｔ細胞抗原、たとえばＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ６およびＣＤ７も本発明の意味の中での腫瘍関連分子を含む。なお他の例示的な腫瘍関連分子は、これに限定されるわけではないが、Ｌｅｗｉｓ Ｙ、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＭＵＣ−１、ＨＰＶ １６、ＨＰＶ Ｅ６ ＆ Ｅ７、ＴＡＧ−７２、ＣＥＡ、Ｌ６−抗原、ＣＤ １９、ＣＤ２２、ＣＤ３７、ＣＤ５２、ＨＬＡ−ＤＲ、ＥＧＦレセプタおよびＨＥＲ２レセプタを含む。多くの場合、これらの抗原の各免疫反応性抗体は、文献で報告されている。当業者は、これらの抗体のそれぞれが本発明による本発明のポリペプチドの前駆体として作用できることを認識するであろう。
したがって本発明の結合部位は、腫瘍関連分子と反応する多くの抗体のいずれか１つから由来、産生または製造しうる。１つの実施形態において、結合部位は、血清半減期の短縮などの所望の生化学特徴を与えるために１個以上の定常領域ドメインの少なくとも部分が欠失または改変される、一般的な遺伝子組換え技法を使用して得られる合成またはドメイン欠失抗体である。さらに詳細には、下で例示されるように、当業者は、本発明によるモノマーサブユニットとして使用される本発明のポリペプチドを提供するために、対象抗体の可変および／または定常領域に相当する遺伝子配列をただちに単離でき、適切なヌクレオチドを欠失および改変することができる。適合する本発明のポリペプチドが、十分に確立されたプロトコルを使用して臨床または商業規模で発現および産生できることがさらに認識されるであろう。
腫瘍関連分子と反応する以前に報告された抗体を本明細書で述べるように改変して、本発明のポリペプチドに１個以上の結合部位を提供できる。対象ポリペプチドに結合部位を提供するために使用できる（または結合部位が由来しうる）例示的な抗体は、これに限定されるわけではないが、２Ｂ８およびＣ２Ｂ８（Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標）およびＲｉｔｕｘａｎ（登録商標）、ＩＤＥＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｃｏｒｐ．、サンディエゴ）、Ｌｙｍ １およびＬｙｍ ２（Ｔｅｃｈｎｉｃｌｏｎｅ）、ＬＬ２（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ Ｃｏｒｐ．、ニュージャージー）、ＨＥＲ２（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ Ｉｎｃ．、サウスサンフランシスコ）、Ｂ１（Ｂｅｘｘａｒ（登録商標）、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｐｈａｒｍ．、サンフランシスコ）、Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標）（Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、ケンブリッジ）、ＭＢ１、ＢＨ３、Ｂ４、Ｂ７２．３（Ｃｙｔｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）、ＣＣ４９（国立癌研究所）および５Ｅ１０（アイオワ大学）を含む。好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドは、すぐ上で列挙した抗体と同じ腫瘍関連抗原に結合するであろう。特に好ましい実施形態において、ポリペプチドは、２Ｂ８、Ｃ２Ｂ８、ＣＣ４９およびＣ５Ｅ１０と同じ抗原に由来するか、それらに結合し、なおさらに好ましくはドメイン欠失抗体（すなわちΔＣＨ２抗体）を含むであろう。
第１の好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドはＲｉｔｕｘａｎ（登録商標）と同じ腫瘍関連抗原に結合するであろう。Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）（リツキシマブ、ＩＤＥＣ−Ｃ２Ｂ８およびＣ２Ｂ８としても公知）は、ヒトＢ細胞リンパ腫の処置のための第１のＦＤＡ認可モノクローナル抗体であった（そのそれぞれが参照により本明細書に組み入れられている、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ．５，８４３，４３９；５，７７６，４５６および５，７３６，１３７を参照）。Ｙ２Ｂ８（９０Ｙ標識２Ｂ８；Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標）；イブリツモマブチウキセタン）は、Ｃ２Ｂ８のマウス親である。Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）は、増殖阻害性であり、伝えられるところによれば、試験管内あるリンパ腫細胞系を化学治療剤によるアポトーシスに対して感作させるキメラ抗ＣＤ２０モノクローナル抗体である。該抗体はヒト補体に効率的に結合し、強力なＦｃＲ結合を有し、補体依存性（ＣＤＣ）および抗体依存性（ＡＤＣＣ）機構の両方を介して、試験管内でヒトリンパ球を有効に死滅させる（Ｒｅｆｆ ｅｔ ａｌ，Ｂｌｏｏｄ ８３：４３５−４４５（１９９４））。当業者は、本開示によるＣｒｉｐｔｏおよびＣＤ２０＋に結合する二重特異性結合分子が、ＣＤ２０＋悪性疾患を示す患者を有効に処置するために結合形または非結合形で使用できることを認識するであろう。さらに一般的には、本明細書で開示するポリペプチドを「裸の」すなわち非結合状態で、または多くの障害のいずれか１つを有効に処置する細胞傷害性薬に結合させた状態のどちらかで使用できることを繰り返し言う必要がある。
本発明の他の好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドの二重特異性は、ＣＣ４９抗体からの（またはＣＣ４９抗体に由来する）結合部位を含むことができる。以前に暗示したように、ＣＣ４９は、ヒト起源、特にＬＳ１７４Ｔ腫瘍細胞系のある腫瘍細胞の表面に結合されたヒト腫瘍関連抗原ＴＡＧ−７２に結合する。ＬＳ１７４Ｔ［Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（本明細書ではＡＴＣＣ）Ｎｏ．ＣＬ １８８］は、ＬＳ１８０（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＬ １８７）結腸線癌系の改変体である。
ＴＡＧ−７２に対する結合特異性を有する多くのマウスモノクローナル抗体が開発されていることがさらに認識されるであろう。Ｂ７２．３と呼ばれるこれらのモノクローナル抗体の１つは、ハイブリドーマＢ７２．３（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＢ−８１０８）によって産生されたマウスＩｇＧ１である。Ｂ７２．３は、ヒト乳癌抽出物を免疫原として使用して開発された第１世代モノクローナル抗体である（たとえばそのそれぞれが参照により本明細書に組み入れられている、Ｃｏｌｃｈｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），７８：３１９９−３２０３（１９８１）；ならびにＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．４，５２２，９１８および４，６１２，２８２を参照）。ＴＡＧ−７２に対して作られた他のモノクローナル抗体は、「ＣＣ」（結腸癌用）と呼ばれる。Ｓｃｈｌｏｍ ｅｔ ａｌ．（参照により本明細書に組み入れられている、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，５１２，４４３）によって述べられたように、ＣＣモノクローナル抗体は、Ｂ７２．３で精製されたＴＡＧ−７２を使用して調製された第２の世代マウスモノクローナル抗体のファミリである。ＴＡＧ−７２へのその比較的良好な結合親和性のために、次のＣＣ抗体がＡＴＣＣに寄託されており、アクセス制限が要求されている：ＣＣ４９（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＢ ９４５９）；ＣＣ８３（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＢ ９４５３）；ＣＣ４６（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＢ ９４５８）；ＣＣ９２（ＡＴＴＣＣ Ｎｏ．ＨＢ ９４５４）；ＣＣ３０（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＢ ９４５７）；ＣＣ１１（ＡＴＣＣ Ｎｏ．９４５５）；およびＣＣ１５（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＢ ９４６０）。Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，５１２，４４３は、当分野で公知の組換えＤＮＡ技法によって、たとえばヒト定常領域（Ｆｃ）ドメインでマウス定常領域を置換することにより、開示した抗体をそのキメラ形に改変できることをさらに教示している。マウスおよびキメラ抗ＴＡＧ−７２抗体を開示する以外に、Ｓｃｈｌｏｍ ｅｔ ａｌ．ＰＣＴ／ＵＳ９９／２５５５２で開示されたヒト化ＣＣ４９抗体の改変体およびＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，８９２，０１９で開示された単鎖構築物も産生しており、そのそれぞれが参照により本明細書に組み入れられている。当業者は、上述の抗体、構築物または組換え、およびその変形それぞれが本発明の二重特異性分子を作製するのに合成および使用できることを認識するであろう。
上述した抗ＴＡＧ−７２抗体に加えて、様々なグループがドメイン欠失ＣＣ４９およびＢ７２．３抗体の構成および部分キャラクタリゼーションについても報告している（たとえばＣａｌｖｏ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ、８（ｌ）：９５−１０９（１９９３）、Ｓｌａｖｉｎ−Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ５３：９７−１０３（１９９３）およびＳｌａｖｉｎ−Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｒｅｓ．５５：５９５７−５９６７（１９９５）。そのような構築物も本発明の二重特異性結合分子に含めることができる。
１つの実施形態において、本発明の二重特異性結合分子は、ＣＤ２３に結合する（Ｕ．Ｓ．ｐａｔｅｎｔ ６，０１１，１３８）。好ましい実施形態において、本発明の二重特異性結合分子は、５Ｅ８抗体と同じエピトープに結合する結合部位を含む。別の実施形態において、本発明の結合分子は抗ＣＤ２３抗体、たとえば５Ｅ８抗体からの少なくとも１個のＣＤＲを含む。
別の実施形態において、本発明の二重特異性分子は、Ｃ５Ｅ１０抗体（またはＣ５Ｅ１０抗体と同じ腫瘍関連抗原に結合する結合部位）に由来する結合部位を含む。同時係属出願０９／１０４，７１７で述べたように、Ｃ５Ｅ１０は、前立腺腫瘍細胞系（たとえばＤＵ１４５、ＰＣ３、またはＮＤ１）に対して特異性であると思われる１１５ｋＤａの糖タンパク質決定基を認識する抗体である。それゆえ本発明と併せて、Ｃ５Ｅ１０抗体によって認識された同じ腫瘍関連抗原に特異的に結合する二重特異性ポリペプチド（たとえばＣＨ２ドメイン欠失抗体）は、腫瘍性障害の処置のためで接合または非接合形で産生および使用できる。特に好ましい実施形態において、結合分子は、ＡＴＣＣアクセションＮｏ．ＰＴＡ−８６５を有するハイブリドーマ細胞系から分泌されたＣ５Ｅ１０抗体の抗原結合領域の全部または一部に由来するか、あるいはそれらを含むであろう。得られた結合分子は次に、以下で述べるように放射性核種に接合させて、本発明に従って前立腺癌に罹患した患者に投与することができる。
別の実施形態において、リガンドは、たとえば特定のレセプタへの結合を付与するために本発明の結合分子に含まれうるか、またはレセプタは循環からリガンドを除去するために結合分子に包含させることができる。対象二重特異性結合分子に含まれうる例示的なリガンドおよびそのレセプタは以下を含む：
ａ．サイトカインまたはサイトカインレセプタ
サイトカインはリンパ球の増殖、分化、および機能活性化に対する多面発現効果を有する。各種のサイトカイン、またはそのレセプタ連結部分は本発明の融合タンパク質で利用できる。例示的なサイトカインは、インターロイキン（たとえばＩＬ−Ｉ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−Ｉｌ、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、およびＩＬ−１８）、結腸刺激因子（ＣＳＦ）（たとえば顆粒球ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）、および単球マクロファージＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ））、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）アルファおよびベータおよびインターフェロン、たとえばインターフェロン−α、β、またはγ（ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ．４，９２５，７９３および４，９２９，５５４）を含む。
サイトカインレセプタは通例、リガンド特異性アルファ鎖および共通ベータ鎖より成る。例示的なサイトカインレセプタは、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３（ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，６３９，６０５）、ＩＬ−４（ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，５９９，９０５）、ＩＬ−５（ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，４５３，４９１）、ＩＦＮγ（ＥＰ０２４０９７５）のレセプタ、そしてレセプタのＴＮＦファミリ（たとえばＴＮＦα（たとえばＴＮＦＲ−１（ＥＰ ４１７，５６３）、ＴＮＦＲ−２（ＥＰ ４１７，０１４）リンホトキシンベータレセプタ）を含む。
ｂ．接着タンパク質またはそのレセプタ
接着分子は、細胞を互いに相互作用させる膜結合タンパク質である。ホーミングレセプタおよび細胞接着分子を含む、そのレセプタ連結部分の各種の接着タンパク質は、本発明の結合分子に包含させることができる。白血球ホーミングレセプタは炎症の間に白血球細胞表面で発現され、細胞外マトリクス成分への結合を仲介するβ−１インテグリン（たとえばＶＬＡ−１、２、３、４、５、および６）、および血管内皮上の細胞接着分子（ＣＡＭ）を結合するβ２−インテグリン（たとえばＬＦＡ−１、ＬＰＡＭ−１、ＣＲ３、およびＣＲ４）を含む。例示的なＣＡＭは、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＶＣＡＭ−１、およびＭＡｄＣＡＭ−１を含む。他のＣＡＭは、Ｅ−セレクチン、Ｌ−セレクチン、およびＰ−セレクチンを含むセレクチンファミリのＣＡＭも含む。
ｃ．ケモカインまたはそのレセプタ
ケモカイン、すなわち感染部位へ向けた白血球の移動を刺激する走化性タンパク質は、本発明の結合分子に包含させることができる。例示的なケモカインは、マクロファージ炎症タンパク質（ＭＩＰ−１−αおよびＭＩＰ−１−β），好中球走化性因子、およびＲＡＮＴＥＳ（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｎｏｒｍａｌｌｙ Ｔ−ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｅｄ）を含む。
ｄ．増殖因子または増殖因子レセプタ
増殖因子またはそのレセプタ（あるいはレセプタ結合またはそのリガンド連結部分）あるいはそれらに結合する分子は、本発明の結合分子に包含させることができる。例示的な増殖因子は、アンギオポエチン、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）およびそのアイソフォーム（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，１９４，５９６）；表皮増殖因子（ＥＧＦ）；ａＦＧＦおよびｂＦＧＦを含む繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）；心房性ナトリウム利尿因子（ＡＮＦ）；肝臓増殖因子（ＨＧＦ；ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ．５，２２７，１５８および６，０９９，８４１）、神経栄養因子、たとえば骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、−４、−５、または−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、またはＮＴ−６）、あるいは神経増殖因子、たとえばＮＧＦ−β血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．４，８８９，９１９、４，８４５，０７５、５，９１０，５７４，および５，８７７，０１６）；形質転換増殖因子（ＴＧＦ）、たとえばＴＧＦ−アルファおよびＴＧＦ−ベータ（ＷＯ ９０／１４３５９）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）を含む骨誘導因子；インスリン様増殖因子−Ｉおよび−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ；ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ．６，４０３，７６４および６，５０６，８７４）；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ｃ−Ｍｐｌリガンド）、およびＷｎｔポリペプチド（ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．６，１５９，４６２）を含む。
使用できる例示的な増殖因子レセプタは、ＥＧＦレセプタ（ＥＧＦＲ）；ＶＥＧＦレセプタ（たとえばＦｌｔ１またはＦｌｋ１／ＫＤＲ）、ＰＤＧＦレセプタ（ＷＯ ９０／１４４２５）；ＨＧＦレセプタ（ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ．５，６４８，２７３および５，６８６，２９２）；ＩＧＦレセプタ（たとえばＩＧＦＲ１およびＩＧＦＲ２）ならびにＮＧＦ、ＢＤＮＦ、およびＮＴ−３に結合する、ｐ７５ＮＴＲまたはｐ７５とも呼ばれる低親和性レセプタ（ＬＮＧＦＲ）と、レセプタチロシンキナーゼのｔｒｋファミリのメンバーである高親和性レセプタ（たとえばｔｒｋＡ、ｔｒｋＢ（ＥＰ ４５５，４６０）、ｔｒｋＣ（ＥＰ ５２２，５３０））を含む神経栄養性レセプタを含む。別の実施形態において、ＩＧＦＲ１およびＶＥＧＦの両方が標的化される。なお別の実施形態、ＶＬＡ４およびＶＥＧＦが標的化される。
他の細胞表面レセプタおよび／またはそのリガンドも標的化できる（たとえばＴＮＦファミリレセプタまたはそのリガンド（本明細書でさらに詳細に述べられるように）。
ｅ．ホルモン
本発明の結合分子で標的化剤として使用するためにそれらに結合する例示的な成長ホルモンまたは分子は、レニン、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ；ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，８３４，５９８）、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン；ウシ成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）；甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）；チロキシン；プロインスリンおよびインスリン（ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ．５，１５７，０２１および６，５７６，６０８）；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、カルシトニン、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、レプチン、グルカゴン；ボンベシン；ソマトロピン；ミュラー管阻害物質；リラキシンおよびプロリラキシン；ゴナドトロピン関連ペプチド；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；ＯＢタンパク質；またはミュラー管阻害物質を含む。
ｆ．凝固因子
本発明の結合分子で標的化剤として使用するための例示的な血液凝固因子は、凝固因子（たとえば因子Ｖ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、Ｘ、ＬＸ、ＸＩ、ＸＩＩおよびＸＩＩＩ、フォンウィルブランド因子）；組織因子（Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ．Ｎｏｓ．５，３４６，９９１、５，３４９，９９１、５，７２６，１４７、および６，５９６，８４）；トロンビンおよびプロトロンビン；フィブリンおよびフィブリノゲン；プラスミンおよびプラスミノーゲン；プラスミノーゲンアクチベータ、たとえばウロキナーゼまたはヒト尿素または組織型プラスミノーゲンアクチベータ（ｔ−ＰＡ）を含む。
Ｃ．融合タンパク質
本発明は、１個以上の免疫グロブリンドメインを含む結合分子にも関する。１つの実施形態において、本発明の融合タンパク質は、結合ドメイン（少なくとも１個の結合部位を含む）およびダイマー化ドメイン（少なくとも１個の重鎖部分を含む）を含む。たとえば１つの実施形態において、本発明の結合分子は少なくとも１個のヒト化Ｂ３Ｆ６結合部位およびダイマー化ドメインを含みうる。対象融合タンパク質は二重特異性である（第１の標的のための１個の結合部位と、第２の標的のための第２の結合部位の）。１つの実施形態において、対象融合タンパク質は多価である（同じ標的に対する２個の結合部位を備えた）。
１つの実施形態において、融合タンパク質はＢ３Ｆ６結合部位、少なくとも１個の重鎖ドメインおよび合成結合ペプチドを含む。
文献で報告された例示的な融合タンパク質は、Ｔ細胞レセプタ（Ｇａｓｃｏｉｇｎｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：２９３６−２９４０（１９８７））；ＣＤ４（Ｃａｐｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３３７：５２５−５３１（１９８９）；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３３９：６８−７０（１９８９）；Ｚｅｔｔｍｅｉｓｓｌら、ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．ＵＳＡ ９：３４７−３５３（１９９０）；およびＢｙｒｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３４４：６６７−６７０（１９９０））；Ｌ−セレクチン（ホーミングレセプタ）（Ｗａｔｓｏｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１０：２２２１−２２２９（１９９０）；およびＷａｔｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３４９：１６４−１６７（１９９１））；ＣＤ４４（Ａｒｕｆｆｏら、Ｃｅｌｌ ６１：１３０３−１３１３（１９９０））；ＣＤ２８およびＢ７（Ｌｉｎｓｌｅｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：７２１−７３０（１９９１））；ＣＴＬＡ−４（Ｌｉｓｌｅｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：５６１−５６９（１９９１））；ＣＤ２２（Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃら、Ｃｅｌｌ ６６：１１３３−１１４４（１９９１））；ＴＮＦレセプタ（Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１０５３５−１０５３９（１９９１）；Ｌｅｓｓｌａｕｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：２８８３−２８８６（１９９１）；およびＰｅｐｐｅｌら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：１４８３−１４８９（１９９１））；およびＩｇＥレセプタａ（Ｒｉｄｇｗａｙ ａｎｄ Ｇｏｒｍａｎ，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．Ｖｏｌ．１１５，Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｎｏ．１４４８（１９９１））の融合を含む。
１つの実施形態において、本発明の融合タンパク質を調製するときに、結合ドメイン（たとえばヒト化Ｂ３Ｆ６結合ドメイン）をコードする核酸は、免疫グロブリン定常ドメイン配列のＮ末端をコードする核酸にＣ末端側へ融合されるであろう。Ｎ末端融合も可能である。１つの実施形態において、融合タンパク質はＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む。融合は、定常ドメインのＦｃ部分のＣ末端に、あるいは重鎖のＣＨ１または軽鎖の相当する領域のすぐＮ末端側に行うこともできる。
１つの実施形態において、リガンドまたはレセプタドメインの配列は、免疫グロブリン分子のＦｃドメインのＮ末端に融合される。重鎖定常領域全体をリガンドまたはレセプタドメインの配列に融合させることも可能である。１つの実施形態において、ＩｇＧ Ｆｃを化学的に定義するパパイン開裂部位（すなわち重鎖定常領域の第１の残基を１１４と考えると、残基２１６）の、または他の免疫グロブリンの類似部位のすぐ上流のヒンジ領域で開始する配列が融合で使用される。融合が作製される正確な部位は重要ではない；特定の部位が公知であり、分子の生物結合、分泌、または結合特徴を最適化するために選択できる。融合タンパク質を作製する方法は当分野で公知である。
二重特異性融合タンパク質では、融合タンパク質はマルチマーとして、特にヘテロダイマーまたはヘテロテトラマーとして構築される。概して、これらの構築された免疫グロブリンは公知のユニット構造を有するであろう。基本４鎖構造ユニットは、ＩｇＧ、ＩｇＤ、およびＩｇＥが存在する形である。４鎖ユニットは、高分子量免疫グロブリンにて反復される；ＩｇＭは概して、ジスルフィド結合によって結合された４個の基本ユニットのペンチマーとして存在する。ＩｇＡグロブリン、および場合によりＩｇＧグロブリンも血清中にマルチマー形で存在できる。マルチマーの場合、４個のユニットはそれぞれ同じでも、異なっていてもよい。
融合タンパク質は、たとえばＷＯ００６９９１３Ａ１およびＷＯ００４０６１５Ａ２で教示される。融合タンパク質は、当分野で公知である方法を使用して調製できる（たとえばＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ．５，１１６，９６４および５，２２５，５３８を参照）。普通、リガンドまたはレセプタドメインは、重鎖（または重鎖部分）の定常領域のＮ末端へＣ末端側に、可変領域の代わりに融合される。リガンド結合レセプタのいずれの膜貫通領域あるいは脂質またはリン脂質アンカー認識配列も好ましくは融合の前に不活性化または欠失させる。リガンドまたはレセプタドメインをコードするＤＮＡは、所望のＯＲＦセグメントをコードするＤＮＡの５’および３’末端における、またはそれに近接した制限酵素によって開裂される。得られたＤＮＡ断片は次に重鎖定常領域をコードするＤＮＡ内へただちに挿入される。融合が作製される正確な部位は、溶解性融合タンパク質の分泌または結合特徴を最適化するために経験的に選択できる。融合タンパク質をコードするＤＮＡは次に、発現のために宿主細胞内に形質移入される。
ＩＩＩ．合成結合ペプチド
１つの実施形態において、本発明のダイマーの少なくとも１個のポリペプチド鎖は、合成結合ペプチドを含む。１つの実施形態において、本発明のダイマーの少なくとも２個の鎖は結合ペプチドを含む。好ましい実施形態において、本発明のダイマーの２個の鎖は結合ペプチドを含む。
１つの実施形態において、結合ペプチドを使用して、単一のポリペプチド鎖内のフレーム内の２個の重鎖部分を結合することができる。たとえば１つの実施形態において、本発明の結合ペプチドを使用して、ＣＨ３ドメイン（または合成ＣＨ３ドメイン）をヒンジ領域（または合成ヒンジ領域）に融合させることができる。別の実施形態において、本発明の結合ペプチドを使用して、ＣＨ３ドメイン（または合成ＣＨ３ドメイン）をＣＨ１ドメイン（または合成ＣＨ１ドメイン）に融合させることができる。なお別の実施形態において、結合ペプチドはヒンジ領域（または合成ヒンジ領域）とＣＨ２ドメイン（または合成ＣＨ２ドメイン）との間でペプチドスペーサとして作用できる。
別の実施形態において、ＣＨ３ドメインは細胞外タンパク質ドメイン（たとえばＶＬドメイン（または合成ドメイン）、ＶＨドメイン（または合成ドメイン）、ＣＨ１ドメイン（または合成ドメイン）、ヒンジドメイン（または合成ヒンジ）に、あるいはレセプタのリガンド連結部分またはリガンドのレセプタ結合）に融合できる。たとえば１つの実施形態において、ＶＨまたはＶＬドメインはＣＨ３ドメインに結合ペプチドを介して融合できる（結合ペプチドのＣ末端はＣＨ３ドメインのＮ末端に結合され、結合ペプチドのＮ末端はＶＨまたはＶＬドメインのＣ末端に結合される）。別の実施形態において、ＣＨ１ドメインは、ＣＨ３ドメインに結合ペプチドを介して結合される（結合ペプチドのＣ末端はＣＨ３ドメインのＮ末端に結合され、結合ペプチドのＮ末端はＣＨ１ドメインのＣ末端に結合される）。別の実施形態において、本発明の結合ペプチドを使用して、ＣＨ３ドメイン（または合成ＣＨ３ドメイン）をヒンジ領域（または合成ヒンジ領域）またはその部分に融合することができる。なお別の実施形態において、結合ペプチドはヒンジ領域（または合成ヒンジ領域）とＣＨ２ドメイン（または合成ＣＨ２ドメイン）との間のペプチドスペーサとして作用できる。
１つの実施形態において、結合ペプチドはｇｌｙ／ｓｅｒスペーサを含むか、それから成ることができる。たとえばＣＨ２ドメインおよび下部ヒンジ領域（ＣＨ２［ｇｌｙ／ｓｅｒ］）を置換した、短いアミノ酸スペーサＧＧＳＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号：８）を有するドメイン欠失構築物を使用できる。別の実施形態において、結合ペプチドはアミノ酸配列ＩＧＫＴＩＳＫＫＡＫ（配列番号：１５）を含む。
別の実施形態において、結合ペプチドは免疫グロブリンヒンジ領域の少なくとも部分を含むことができる。たとえば異なる抗体アイソタイプに由来するヒンジ要素を組合せるキメラヒンジドメインを構築できる。１つの実施形態において、結合ペプチドはＩｇＧ１ヒンジ領域の少なくとも部分を含む。別の実施形態において、結合ペプチドはＩｇＧ３ヒンジ領域の少なくとも部分を含むことができる。別の実施形態において、結合ペプチドはＩｇＧ１ヒンジ領域の少なくとも部分およびＩｇＧ３ヒンジ領域の少なくとも部分を含むことができる。１つの実施形態において、結合ペプチドはＩｇＧ１上部および中間ヒンジならびに単一のＩｇＧ３中間ヒンジ反復モチーフを含むことができる。
免疫グロブリンヒンジ領域に由来するアミノ酸配列を含むそのような結合ペプチドにおける個々のアミノ酸の番号付けは、結合ペプチドの長さによって変わることがあり、これらの分子のアミノ酸位置の番号付けは、Ｋａｂａｔ番号付けを使用して与えられる、たとえば表２）、表３はＩｇＧ１、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４分子の天然発生型ヒンジ配列を示す。表２はこれらのヒンジ分子の部分のＫａｂａｔ番号付けを示し、その表に示す結合ペプチドアミノ酸残基のＫａｂａｔ番号付けも示す。
１つの実施形態において、本発明の結合ペプチドは非天然発生型免疫グロブリンヒンジ領域ドメイン、たとえばヒンジ領域ドメインを含むポリペプチドには天然には見出されないヒンジ領域ドメインおよび／または天然発生型免疫グロブリンヒンジ領域ドメインとアミノ酸配列が異なるように改変されたヒンジ領域ドメインを含む。１つの実施形態において、ヒンジ領域ドメインに対して変異を行って、本発明の結合ペプチドを作製することができる。１つの実施形態において、本発明の結合ペプチドはシステインの天然発生数を含まないヒンジドメインを含み、すなわち結合ペプチドは天然発生型ヒンジ分子よりも少ないシステインか、またはより多い数のシステインを含む。好ましい実施形態において、結合ペプチドのポリペプチドへの包含は、２個の重鎖部分が少なくとも１個の鎖間ジスルフィド結合を介して結合された形に存在する二量体分子の５０％、６０％、７０％、８０％または９０％を超える組成物を生じさせる。
本発明の１つの実施形態において、結合ペプチドは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムのアミノ酸位置２４３（位置２３０、ＥＵ番号付け体系）に相当するアミノ酸位置にプロリン残基を含むヒンジ領域ドメインを含む。１つの実施形態において、結合ペプチドはＫａｂａｔ番号付けシステムの位置２４４（位置２４６、ＥＵ番号付け体系）に相当するアミノ酸位置にアラニン残基を含む。別の実施形態において、本発明の結合ペプチドは、位置２４５（Ｋａｂａｔ番号付けシステム；位置２４７、ＥＵ番号付け体系））に相当するアミノ酸位置にプロリン残基を含む。１つの実施形態において、結合ペプチドは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムの位置２３９（位置２２６、ＥＵ番号付け体系）に相当するアミノ酸位置にシステイン残基を含む。１つの実施形態において、結合ペプチドは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムの位置２３９（位置２２６、ＥＵ番号付け体系）に相当するアミノ酸位置にセリン残基を含む。１つの実施形態において、結合ペプチドは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムの位置２４２（位置２２９、ＥＵ番号付け体系）に相当するアミノ酸位置にシステイン残基を含む。１つの実施形態において、結合ペプチドは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムの位置２４２（位置２２９、ＥＵ番号付け体系）に相当するアミノ酸位置にセリン残基を含む。
１つの実施形態において、結合ペプチドは、たとえば２個の重鎖部分がジスルフィド結合を介して結合される、またはジスルフィド結合を介して結合されない、ポリペプチドの特定のアイソフォームの優先的合成を引き起こすように選択できる。たとえば本実施例、Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３＋［ｇｌｙ／ｓｅｒ］リンカー（配列番号：２６）、Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［ｇｌｙ／ｓｅｒ］リンカー（配列番号：５）、Ｐｒｏ２４３＋［ｇｌｙ／ｓｅｒ］リンカー（配列番号：３３）、およびＰｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［ｇｌｙ／ｓｅｒ］リンカ（配列番号：３２）で述べるように、結合ペプチドが検出可能なフォームＢを含まないフォームＡ ＣＨ２ドメイン欠失抗体のみの産生を引き起こした。これに対して、ＣＨ２ドメイン欠失Ｃｙｓ２４２Ｓｅｒ：Ｐｒｏ２４３（配列番号：３１）、およびＣＨ２ドメイン欠失Ｃｙｓ２４２Ｓｅｒ：Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５（配列番号：３２）はどちらもフォームＢアイソフォームへの優先を引き起こした。これらの合成ヒンジ領域結合ペプチドはそれゆえ、フォームＡまたはＢアイソフォームの有利な合成に有用である。このことは４つすべてのヒトアイソタイプのＣＨ３ドメインに対する高度の相同性に基づく抗体のいずれのアイソタイプ（たとえばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）にも当てはまる（同一および保存アミノ酸残基を含めて、ＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインはＩｇＧ２ ＣＨ３に対して９８．１３％相同であり、ＩｇＧ３ ＣＨ３に対して９７．２０％相同であり、ＩｇＧ４ ＣＨ３に対して９６．２６％相同である）。本発明の結合ペプチドおよび各種の結合分子を指す挿入句は、別途指摘しない限り同等の用語を表す。
１つの実施形態において、本発明の結合ペプチドは、柔軟性ｇｌｙ／ｓｅｒリンカーが続くヒンジ領域ドメインを含む。例示的な結合ペプチドを表２および配列番号：５、２５〜３４に示す。１個以上のアミノ酸置換、付加または欠失が結合ペプチド内に導入されるように、これらの例示的な結合ペプチドの改変体形が、結合ペプチドをコードするヌクレオチド配列内に１個以上のヌクレオチド置換、付加または欠失を導入することによって作製できることが理解されるであろう。たとえば変異は標準技法、たとえば部位特異的変異誘発およびＰＣＲ仲介変異誘発によって導入できる。好ましくは保存的アミノ酸置換は、結合ペプチドのフォームＡまたはフォームＢの合成を優先的に向上させる能力が改変されないように、１個以上の非必須アミノ酸残基にて作製される。それゆえ免疫グロブリンポリペプチドの非必須アミノ酸残基は、好ましくは同じ側鎖ファミリからの別のアミノ酸残基によって置換される。別の実施形態において、アミノ酸の列は、側鎖ファミリメンバの順序および／組成が異なる構造的に同様な列と置換できる。
本発明の結合ペプチドは、可変長でありうる。１つの実施形態において、本発明の結合ペプチドは、長さが約１５〜約５０アミノ酸である。別の実施形態において、本発明の結合ペプチドは、長さが約２０〜約４５アミノ酸である。別の実施形態において、本発明の結合ペプチドは、長さが約２５〜約４０アミノ酸である。別の実施形態において、本発明の結合ペプチドは、長さが約３０〜約３５アミノ酸である。別の実施形態において、本発明の結合ペプチドは、長さが約２４〜約２７アミノ酸である。別の実施形態において、本発明の結合ペプチドは、長さが約４０〜約４２アミノ酸である。
結合ペプチドは、当分野で公知の技法を使用してポリペプチド配列に導入できる。たとえば１つの実施形態において、Ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ Ｏｖｅｒｌａｐ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ（重複伸長によるスプライシング、ＳＯＥ）法（Ｈｏｒｔｏｎ，Ｒ．Ｍ．１９９３ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ １５：ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｅｄ．Ｂ．Ａ．Ｗｈｉｔｅ）を使用できる。修飾はＤＮＡ配列解析によって確認できる。プラスミドＤＮＡを使用して、産生されたポリペプチドの安定産生のために宿主細胞を形質転換することができる。
１つの実施形態において、対象結合ペプチドの１つのポリペプチドへの包含は、少なくとも２個の結合部位および少なくとも２個のポリペプチド鎖を有する結合分子を含む組成物を生じ、ポリペプチド鎖の少なくとも２個が合成結合ペプチドを含み、分子の５０％超は、２個の重鎖部分が少なくとも１個の鎖間ジスルフィド結合を介して結合する形で存在する。別の実施形態において、分子の６０％超は、２個の重鎖部分が少なくとも１個の鎖間ジスルフィド結合を介して結合する形で存在する。別の実施形態において、分子の７０％超は、２個の重鎖部分が少なくとも１個の鎖間ジスルフィド結合を介して結合する形で存在する。別の実施形態において、分子の８０％超は、２個の重鎖部分が少なくとも１個の鎖間ジスルフィド結合を介して結合する形で存在する。別の実施形態において、分子の９０％超は、２個の重鎖部分が少なくとも１個の鎖間ジスルフィド結合を介して結合する形で存在する。
ＩＶ．結合分子の発現
上述のような本発明のポリペプチドを提供するための単離された遺伝物質の操作後に、遺伝子は、請求された結合分子を次に提供するポリペプチドの所望の量を産生するために使用できる宿主細胞内への導入のために、通例、発現ベクターに挿入される。
「ベクター」または「発現ベクター」という用語は、本明細書では明細書および請求項の解釈上、細胞内の所望の遺伝子内に導入して、遺伝子を発現させるためのビヒクルとして、本発明に従って使用されるベクターを意味するために使用される。当業者に公知であるように、そのようなベクターはプラスミド、ファージ、ウィルスおよびレトロウィルスから成る群より容易に選択できる。一般に、本発明に適合するベクターは、選択マーカー、所望の遺伝子のクローニングを促進するための適切な制限部位ならびに真核または原核細胞に入る、および／または真核または原核細胞で複製する能力を含むであろう。
本発明の解釈上、多数の発現ベクター系を利用できる。たとえばベクターの１つのクラスは、ウシパピローマウィルス、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ワクシーナウィルス、バキュロウィルス、レトロウィルス（ＲＳＶ、ＭＭＴＶまたはＭＯＭＬＶ）またはＳＶ４０ウィルスなどの動物ウィルスに由来するＤＮＡ要素を利用する。他のベクターは、内部リボソーム結合部位を備えたポリシストロニック系の使用を含む。加えて、ＤＮＡをその染色体内に組み込んだ細胞は、形質移入された宿主細胞の選択を可能にする１個以上のマーカーを導入することによって選択できる。マーカーは栄養要求性宿主に対する原栄養性、耐殺生物剤性（たとえば抗生物質）または銅などの重金属への耐性を供給できる。選択可能なマーカー遺伝子は、発現されるＤＮＡ配列に直接結合できるか、または同時形質転換によって同じ細胞内に導入できるかのどちらかである。ｍＲＮＡの最適な合成には追加の要素が必要なことがある。これらの要素は、シグナル配列、スプライスシグナルはもちろんのこと、転写プロモータ、エンハンサ、および終止シグナルを含みうる。特に好ましい実施形態において、クローニングされた可変領域遺伝子は発現ベクター内に、上述のような重鎖および軽鎖定常領域遺伝子（好ましくはヒト）合成物と共に挿入される。好ましくはこれは、ＮＥＯＳＰＬＡと呼ばれるＩＤＥＣ，Ｉｎｃ．の専売発現ベクターを使用して実施される（Ｕ．Ｓ．ｐａｔｅｎｔ ６，１５９，７３０）。このベクターは、サイトメガロウィルスプロモータ／エンハンサ、マウスベータグロビン主要プロモータ、ＳＶ４０複製開始点、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼエクソン１およびエクソン２、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子およびリーダー配列を含有する。下の実施例で見られるように、このベクターは、可変および定常領域遺伝子の包含時の抗体の非常に高レベルの発現、ＣＨＯ細胞への形質移入と、それに続くＧ４１８含有培地での選択およびメトトレキサート増幅を引き起こすことが見出されている。ベクター系はＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．５，７３６，１３７および５，６５８，５７０でも教示され、そのそれぞれはその全体が参照により本明細書に組み入れられている。この系は高い発現レベル、たとえば＞３０ｐｇ／細胞／日を提供する。他の例示的なベクター系はたとえばＵ．Ｓ．ｐａｔｅｎｔ ６，４１３，７７７に開示されている。
他の好ましい実施形態において、本発明の本発明のポリペプチドは、２００１年１１月１６日に出願され、その全体が本明細書に組み入れられている同時係属Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．６０／３３１，４８１で開示されたようなポリシストロニック構築物を使用して発現させることができる。これらの新規な発現系において、抗体の重鎖および軽鎖などの興味のある複数の遺伝子生成物は、単一のポリシストロニック構築物から産生できる。これらの系は、真核宿主細胞内に比較的高レベルの本発明のポリペプチドを提供するために配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を好都合に使用することができる。適合するＩＲＥＳ配列は、本明細書にまた組み入れられているＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，１９３，９８０に開示されている。当業者は、そのような発現系を使用して本出願に開示された全範囲のポリペプチドを有効に産生できることを認識するであろう。
さらに一般的には、ポリペプチドのモノマーサブユニット（たとえば修飾抗体）をコードするベクターまたはＤＮＡ配列が調製されると、発現ベクターは適切な宿主細胞内に導入できる。すなわち宿主細胞は形質転換できる。プラスミドの宿主細胞への導入は、当業者に公知の各種の技法によって達成できる。これらは、これに限定されるわけではないが、形質移入（電気泳動および電気穿孔を含む）、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈殿、エンブロープＤＮＡとの細胞融合、微量注入、および無傷のウィルスによる感染を含む。Ｒｉｄｇｗａｙ，Ａ．Ａ．Ｇ．”Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ”Ｃｈａｐｔｅｒ ２４．２，ｐｐ．４７０−４７２ Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ａｎｄ Ｄｅｎｈａｒｄｔ，Ｅｄｓ．（Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ、Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．１９８８）を参照。最も好ましくは、宿主へのプラスミド導入は電気穿孔による。形質転換させた細胞は、軽鎖および重鎖の産生に適切な条件化で増殖させて、重鎖および／または軽鎖タンパク質合成に関してアッセイする。例示的なアッセイ技法は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、または蛍光活性化セルソーター解析（ＦＡＣＳ）、免疫組織化学的検査などを含む。
本明細書で使用するように「形質転換」は、広い意味で遺伝子型を変化させ、結果としてレシピエント細胞の変化を引き起こすレシピエント宿主細胞へのＤＮＡの導入を指すために使用するものとする。
これらの同じ系統ともに「宿主細胞」は、組換えＤＮＡ技法を使用して構築され、少なくとも１個の非相同遺伝子をコードするベクターをによって変換された細胞を指す。組換え宿主からの抗体の単離のためのプロセスの説明では、「細胞」および「細胞培養物」という用語は、それが明確に別途規定されない限り、抗体源を示すために互換的に使用される。言い換えれば、「細胞」からのポリペプチドの回収は、全細胞の遠心沈殿から、あるいは培地および懸濁細胞の両方を含有する細胞培養物からのどちらかを意味しうる。
タンパク質発現に使用される宿主細胞系は、好ましくは哺乳類起源のものである；当業者は、所望の遺伝子生成物をその中で発現させるのに最も適した特定の宿主細胞系を優先的に決定する能力を備えていると見なされる。例示的な宿主細胞系は、これに限定されるわけではないが、ＤＧ４４およびＤＵＸＢ１１（チャイニーズハムスター卵巣系、ＤＨＦＲマイナス）、ＨＥＬＡ（ヒト子宮頸癌）、ＣＶＩ（サル腎臓系）、ＣＯＳ（ＣＶＩのＳＶ４０ Ｔ抗原による誘導体）、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスター線維芽細胞）ＢＡＬＢＣ／３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、ＨＡＫ（ハムスター腎臓系）、ＳＰ２／Ｏ（マウス骨髄腫）、Ｐ３．ｔｉｍｅｓ．６３−Ａｇ３．６５３（マウス骨髄腫）、ＢＦＡ−１ｃ１ＢＰＴ（ウシ内皮細胞）、ＲＡＪＩ（ヒトリンパ球）および２９３（ヒト腎臓）を含む。ＣＨＯ細胞は特に好ましい。宿主細胞系は通例、商用サービス、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから、または公開された文献から入手できる。
試験管内産生は、大量の所望のポリペプチドを与えるためにスケールアップを可能にする。組織培養条件下での哺乳類細胞培養の技法は当分野で公知であり、たとえばエアリフトリアクタ内または連続スターラーリアクタ内の均質懸濁培養物、あるいはたとえば中空ファイバ、マイクロカプセル内の、アガロースマイクロビーズまたはセラミックカートリッジ上の固定化または捕捉細胞培養物を含む。必要ならばおよび／または所望ならば、ポリペプチドの溶液を慣習的なクロマトグラフィー法、たとえばゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ−セルロースによるクロマトグラフィーまたは（免疫）親和性クロマトグラフィーによって、たとえば合成ヒンジ領域ポリペプチドの優先的な生合成の後に、あるいは本明細書で述べたＨＩＣクロマトグラフィーステップの前に、またはそれに続いて精製できる。
本発明のポリペプチドをコードする遺伝子は、細菌または酵母または植物細胞などの、発現された非哺乳類細胞でもありうる。この点で、細菌などの各種の単細胞非哺乳類微生物；すなわち培養物または発酵中で増殖させることができる微生物も形質転換できることが認識されるであろう。形質転換を受けやすい細菌は、腸内細菌科のメンバー、たとえば大腸菌またはサルモネラの菌株；バチルス科、たとえば枯草菌；肺炎球菌；ストレプトコッカス、およびインフルエンザ菌を含む。細菌中で発現されるとき、ポリペプチドは通例、封入体の一部となることがさらに認識されるであろう。ポリペプチドは単離、精製、そして次に機能分子内へ構築する必要がある。抗体の４価形が所望である場合、サブユニットは次に４価抗体内へ自己構築されるであろう（ＷＯ０２／０９６９４８Ａ２）。
ｐｒｏｋａｒｙａｔｅｓに加えて、真核微生物も使用できる。出芽酵母、または普通のパン酵母は真核微生物の中で最も普通に使用されているが、多くの他の菌株も普通に入手できる。酵母での発現では、たとえばプラスミドＹＲｐ７（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら、Ｎａｔｕｒｅ，２８２：３９（１９７９）；Ｋｉｎｇｓｍａｎら、Ｇｅｎｅ，７：１４１（１９７９）；Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒら、Ｇｅｎｅ，１０：１５７（１９８０））が普通に使用される。このプラスミドは、トリプトファン中で増殖する能力の欠如した酵母のミュータント菌株、たとえばＡＴＣＣ Ｎｏ．４４０７６またはＰＥＰ４−１への選択マーカーを提供するＴＲＰ１遺伝子をすでに含有している（Ｊｏｎｅｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８５：１２（１９７７））。酵母宿主細胞ゲノムの特徴としてのｔｒｐ１損傷の存在はトリプトファンの非存在下での増殖による形質転換を検出するために有効な環境を提供する。
Ｖ．鎖間ジスルフィド結合の欠如した結合分子からの、少なくとも１個の鎖間ジスルフィド結合を含む結合分子の分離
１つの態様において、本発明は２個の重鎖部分を有する分子の混合物からの、疎水性相互作用クロマトグラフィーによる分離に関し、そこでは分子の一部が、少なくとも１個の鎖間ジスルフィド結合を介して２個の重鎖部分が結合される形で存在し、分子の一部が少なくとも１個のジスルフィド結合を介して結合されていない重鎖部分を含む。
疎水性相互作用クロマトグラフィーは、炭化水素スペーサアームを含むが、親和性リガンドが欠如した親和性ゲルにタンパク質を保持できるという観察の後に最初に開発された。ＨＩＣ支持体からの溶離は、溶媒、ｐＨ、イオン強度の変更によって、またはカオトロピック剤または有機改質剤、たとえばエチレンまたはプロピレングリコールの添加によって実施できる。疎水性相互作用クロマトグラフィーの一般原理の説明は、たとえばＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ ３，９１７，５２７およびＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ ４，０００，０９８に見出される。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の文脈でのＨＩＣは、重鎖部分が欠如した抗体断片（たとえばＦ（ａｂ’）２）を無傷の抗体分子から１ステッププロトコルで分離するために使用されてきた（Ｍｏｒｉｍｏｔｏ，Ｋ．ｅｔ ａｌ，Ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｖｓ．Ｍｅｔｈ．２４：１０７（１９９２））。
本発明の分離方法は、ポリペプチドの未精製個体群（たとえば培養物上澄みまたは調製物または原核封入体から単離したポリペプチドの調製物）に対して実施できる。あるいは本分離方法は、１つ以上の初期精製ステップの後に、たとえばフォームＡおよびＢを含む調製物が親和性マトリクスから溶離された後に、ポリペプチド混合物に対して使用できる。
１つの実施形態において、ＨＩＣクロマトグラフィーを受ける結合分子は本発明の結合ペプチドを含む。
好ましい実施形態において、ＨＩＣは、他のタンパク質精製手順によって部分的に精製された混合物に利用できる。「部分的に精製された」という用語は、本明細書で使用するように、興味のあるタンパク質が少なくとも５重量％、さらに好ましくは少なくとも１０％、最も好ましくは少なくとも４５％で存在するタンパク質調製物を含む。初期または続いての精製ステップを使用して、たとえば免疫グロブリン凝集体、ミスフォールド種、宿主細胞タンパク質、前のクロマトグラフィーステップからの残留物質（利用したときにはタンパク質Ａなど）を除去することができる。１つの実施形態において、ＨＩＣは本発明の結合ペプチドを含むポリペプチドに対して実施できる。したがってＨＩＣの利用は、全体的な精製プロトコルの文脈においても認識される。ＨＩＣの前後に使用できる例示的な精製ステップは：親和性クロマトグラフィー（たとえば制御孔ガラスに共有結合されたタンパク質Ａより成るＰＲＯＳＥＰ−Ａ（登録商標）（ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｌｔｄ．，英国）またはタンパク質Ａ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標） Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）またはＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ６５０Ｍタンパク質Ａ（ＴｏｓｏＨａａｓ））を含む。タンパク質Ａはヒトγ１、γ２、またはγ４重鎖にとって、タンパク質Ｇはアイソタイプにとって好ましい。分子がＣＨ３ドメインを含む場合は、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸｔｍ樹脂を使用できる。加えて、または代わりにイオン交換クロマトグラフィーを利用できる。この点で、クロマトグラフィー用のアニオン性またはカチオン性支持体を形成するために、各種のアニオン性またはカチオン性置換基をマトリクスに結合できる。アニオン性交換置換基は、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、四級アミノエチル（ＱＡＥ）および四級アミン（Ｑ）基を含む。カチオン性交換置換基は、カルボキシメチル（ＣＭ）、スルホエチル（ＳＥ）、スルホプロピル（ＳＰ）、ホスフェート（Ｐ）およびスルホナート（Ｓ）を含む。ＤＥ２３、ＤＥ３２、ＤＥ５２、ＣＭ−２３、ＣＭ−３２およびＣＭ−５２などのセルロースイオン交換樹脂はＷｈａｔｍａｎ Ｌｔｄ．メイドストーン、ケント、英国から入手できる。ＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）ベースおよびｌｏｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄイオン交換機も公知である。たとえばＤＥＡＥ−、ＱＡＥ−、ＣＭ−、およびＳＰ−ＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）ならびにＤＥＡＥ−、Ｑ−、ＣＭ−およびＳ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）ならびＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標） Ｆａｓｔ ＦｌｏｗはすべてＰｈａｒｍａｃｉａ ＡＢから入手できる。さらに両方のＤＥＡＥおよびＣＭ誘導体化エチレングリコール−メタクリレートコポリマー、たとえばＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＤＥＡＥ−６５０ＳまたはＭおよびＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＣＭ−６５０ＳまたはＭは、Ｔｏｓｏ Ｈａａｓ Ｃｏ．，フィラデルフィア、ペンシルベニア州から入手できる。イオン交換支持体からの溶離は、通常は塩の添加を含むため、そしてＨＩＣは上昇した塩濃度の下で向上するため、イオン交換クロマトグラフィーステップまたは他の塩媒介精製ステップ後のＨＩＣステップの導入が好ましい。必ずしもこれに限定されるわけではないが：さらなるイオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ウィルス不活性化、濃縮および凍結乾燥、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカゲルによるクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＱＨＡＲＯＳＥＴＭによるクロマトグラフィー、等電点電気泳動、または硫酸アンモニウム沈殿を含む、追加の精製プロトコルを加えることができる。
本方法を使用する精製の前に、分離されるポリペプチドの混合物を含む組成物は、好ましくは酸性またはほぼ中性ｐＨの緩衝液中に置かれる。これはたとえば、濃縮緩衝液に添加して、緩衝液にサンプルを再懸濁させて、緩衝液を交換する（たとえば透析または限界濾過を使用して）ことによって行うことができる。あるいはサンプル緩衝液のｐＨは、所望の範囲内で簡単に調節することができる。
疎水性相互作用は高いイオン強度にて最強であり、したがって分離のこの形式は、塩沈殿またはイオン交換手順の後に好都合に実施される。タンパク質のＨＩＣカラムへの吸収は高塩濃度によって好都合であるが、実際の濃度は、選択したタンパク質および特定のＨＩＣリガンドの性質に応じて広い範囲に渡って変化できる。各種のイオンは、疎水性相互作用（塩析効果）を促進するか、または水の構造を妨害して（カオトロピック効果）、疎水性相互作用の減弱をもたらすかどうかに応じて、いわゆる疎溶媒性系列に配置することができる。カチオンは上昇する塩析効果によって、Ｂａ＋＋＜；Ｃａ＋＋＜；Ｍｇ＋＋＜；Ｌｉ＋＜；Ｃｓ＋＜；Ｎａ＋＜；Ｋ＋＜；Ｒｂ＋＜；ＮＨ４ ＋として格付けされるのに対して、アニオンは上昇するカオトロピック効果によって、ＰＯ−＜；ＳＯ４ −＜；ＣＨ３ＣＯＯＯ−＜；Ｃｌ−＜；Ｂｒ−＜；ＮＯ３ −＜；ＣｌＯ４ −＜；Ｉ−＜；ＳＣＮ−として格付けすることができる。
一般にＮａ、ＫまたはＮＨ４サルフェートは、ＨＩＣにおけるリガンド−タンパク質相互作用を効果的に促進する。次の関係によって与えられる、相互作用の強度に影響を及ぼす塩を調合できる：（ＮＨ４）２ＳＯ４＞；Ｎａ２ＳＯ４＞；ＮａＣｌ＞；ＮＨ４Ｃｌ＞；ＮａＢｒ＞；ＮａＳＣＮ。一般に約０．７５〜約２Ｍ硫酸アンモニウムまたは約１〜４Ｍ ＮａＣｌの塩濃度が有用である。
ＨＩＣカラムの調製には多くのクロマトグラフ支持体を利用でき、最も広範に使用されるのは、アガロース、シリカおよび有機ポリマーまたはコポリマー樹脂である。疎水性相互作用材料は概して、疎水性リガンド（たとえばアルキルまたはアリール基）が結合されるベースマトリクス（たとえば親水性炭水化物（たとえば架橋アガロース）または合成コポリマー材料）である。好ましいＨＩＣ材料は、フェニル基によって置換されたアガロース樹脂を含む。例示的なＨＩＣ材料は：フェニルＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭ、低または高置換のＦＡＳＴ ＦＬＯＷ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＡＢ、スウェーデン）；フェニルＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭ高性能カラム；フェニルまたはブチル−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）ＣＬ−４Ｂ、ブチル−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）ＦＦ、オクチル−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）ＦＦおよびフェニル−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＡＢ、スウェーデン）；ＦｒａｃｔｏｇｅｌＴＭ ＥＭＤプロピルまたはＦＲＡＣＴＯＧＥＬＴＭＥＭＣフェニルカラム（Ｅ．Ｍｅｒｃｋ，ドイツ）；ＭＡＣＲＯＰＲＥＰＴＭメチルまたはＭＡＣＲＯ−ＰＲＥＰＴＭｔ−ブチル支持体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，カリフォルニア）；ＷＰ ＨＩ−Ｐｒｏｐｙｌ（Ｃ３）ＴＭカラム（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，ニュージャージー）を含む。例示的なＨＩＣ材料は、Ｔｏｓｏｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，東京、日本から製品名ＴＯＹＯＰＥＡＲＬエーテル６５０、フェニル６５０、ブチル６５０（Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ）、エーテル−５ＰＷ−ＨＲ、またはフェニル−５ＰＷ−ＨＲで；Ｍｉｌｅｓ−Ｙｅｄａ，レホヴォト、イスラエルから、アルキル基が２〜１０個の炭素原子を含有する製品名アルキル−アガロースで、Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，フィリップバーグ、ニュージャージー州から製品名Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＷＰ−ＨＩ−プロピルで入手できる。従来の化学作用を使用して所望のＨＩＣカラムを調製することも可能である（Ｓａ：たとえばＥｒ−ｅｌ．Ｚ．ｇｌ ａｌｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．４９：３８３（１９７２）またはＵｌｂｒｉｃｈ，Ｖ．ｒｄ ｇＬ Ｃｏｌｌ．Ｃｚｅｃｈ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｍ．９：１４６６（１９６４））。
特定のゲルの選択は、当業者によって決定できる。概して、タンパク質およびＨＩＣリガンドの相互作用の強度は、アルキルリガンドの鎖長を増大させるが、約４〜約８個の炭素原子を有するリガンドが大半の調製物に有用である。フェニル基は、ペンチル基とほぼ同じ疎水性を有するが、選択性はタンパク質の芳香族基とのπ−π軌道相互作用の可能性によって異なることがある。選択性（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ）は、支持樹脂の化学作用によっても影響されることがある。
リガンド密度は、相互作用の強度だけでなく、カラムの容量のにも影響するという点で重要である。市販のフェニルまたはオクチルフェニルゲルのリガンド密度は、約４０ｐｍｏｌｅｓ／ｍｌゲル床である。ゲル容量は、ｐＨ、温度および塩の種類ならびに濃度と同様に、問題の特定のタンパク質の関数であるが、概して３〜２０ｍｇ／ｍｌゲルの範囲に含まれることが予想できる。
一般に温度の低下は、ＨＩＣ材料との相互作用を低下させる。しかしながら温度を上昇させることによって発生するいずれの恩恵も、そのような上昇がタンパク質の安定性に対して有する悪影響に対して重み付けをする必要がある。
１つの実施形態において、本発明のポリペプチドは定組成で溶離させることができる。定組成溶離では、すべての化合物が開始時にカラムを通じて移動を開始する。しかしながらそれぞれが異なる速度で移動して、より速いまたはより遅い溶離速度を引き起こす。たとえば本実施例で述べるように、フォームＡはカラムの貫流によって溶離させることができる。
別の実施形態において、本発明のポリペプチドの１つ以上をカラムに結合させて、段階的溶離または勾配溶離を使用して溶離させることができる。溶離は段階的または勾配の形のどちらでも各種の方法：（ａ）塩濃度を変更することによって、（ｂ）溶媒の極性を変更することによって、または（ｃ）洗剤を添加することによって達成できる。塩濃度を低下させることによって、吸収されたタンパク質は疎水性の高い順に溶離される。極性の変化は、エチレンまたはプロピレングリコールあるいは（イソ）プロパノールなどの溶媒の添加によって影響を受け、それにより疎水性相互作用の強度を低下させる。洗剤はタンパク質の置換剤として機能して、主に膜タンパク質の精製と関連して使用されてきた。
分離を実施する際に、ポリペプチド混合物はたとえばバッチ精製技法を使用して、またはカラムを使用して、ＨＩＣ材料と接触させることができる。ＨＩＣ精製の前に、たとえば混合物をプレカラムに通過させることによって、いずれのカオトロピック剤または非常に疎水性物質も除去することが望ましい。
たとえばバッチ精製では、ＨＩＣ材料は所望の開始緩衝液中で作製または所望の開始緩衝液まで平衡にさせる。ＨＩＣ材料のスラリが得られる。ポリペプチド溶液をスラリに接触させて、分離されるポリペプチドの少なくとも１つをＨＩＣ材料に吸収させる。たとえばスラリを沈降させて、上澄みを除去することによって、ＨＩＣ材料に結合しないポリペプチドを含有する溶液がスラリから分離される。スラリに１つ以上の洗浄ステップを受けさせることができる。所望ならばスラリを低い伝導率の溶液に接触させて、ＨＩＣ材料に結合したポリペプチドを脱着させることができる。結合したポリペプチドを溶離させるために、塩濃度を低下させることができる。
１つの実施形態において、ＨＩＣ材料をカラムに充填することができる。分離されるポリペプチドを含む混合物は、分離されるポリペプチドの少なくとも１つをカラムに吸着させるために施用することができる。カラムに吸着しないポリペプチドは通過して、収集することができる。結合したポリペプチドを溶離させるために、たとえば段階的方式で、または塩勾配を使用して塩濃度を低下させることができる。
フォームＢはフォームＡよりも疎水性であるため、それは約０．７Ｍ（たとえば０．７３Ｍ）硫酸アンモニウム／２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ４．０〜ｐＨ８．０を移動相として使用して、固定相に不可逆的に吸着する。フォームＡはこれらの条件下ではより低い程度で固定相に結合し、したがって定組成で溶離して、すなわちそれはカラムに貫流画分を残す。フォームＡの定組成溶離に続いて、移動相から硫酸アンモニウムを除去すると、フォームＢが脱着される。
例示的な精製スキームでは、ＨＩＣ材料を約１６０〜約１１０ｍＳ／ｃｍの、好ましくは約１４０〜約１１５ｍＳ／ｃｍの、さらになお好ましくは約１３０または約１２０〜約１１７ｍＳ／ｃｍの伝導率を生じる塩濃度を含む緩衝液中で平衡にする。たとえばａｎ例示的な開始溶液は、約１Ｍ〜０．７Ｍの塩濃度、たとえば１Ｍ〜０．７Ｍ硫酸アンモニウムを含む。好ましい実施形態において、分離されるポリペプチドの混合物を含む溶液も同じまたはほぼ同じ伝導率にされる（たとえば塩の濃縮原液を使用して）。これらの条件下ではフォームＡはカラムから約１２０ｍＳ／ｃｍの伝導率にて溶離される。フォームＢを溶離させるために、硫酸アンモニウム含有率を低下させる段階的または線形勾配をカラムに適用できる。フォームＢは約１１５〜約１００ｍＳ／ｃｍの伝導率にて溶離する。
１つの実施形態において、本精製方法は、少なくとも２個の結合部位および２個の重鎖部分を有する結合分子を含む組成物を生じ、重鎖部分はＣＨ２ドメインが欠如しており、分子の５０％超が、２個の重鎖部分が少なくとも１個の鎖間ジスルフィド結合を介して結合する形で存在する。別の実施形態において、分子の６０％超は、２個の重鎖部分が少なくとも１個の鎖間ジスルフィド結合を介して結合する形で存在する。別の実施形態において、分子の７０％超は、２個の重鎖部分が少なくとも１個の鎖間ジスルフィド結合を介して結合する形で存在する。別の実施形態において、分子の８０％超は、２個の重鎖部分が少なくとも１個の鎖間ジスルフィド結合を介して結合する形で存在する。別の実施形態において、分子の９０％超は、２個の重鎖部分が少なくとも１個の鎖間ジスルフィド結合を介して結合する形で存在する。
１つの実施形態において、本精製方法は、少なくとも２個の結合部位および２個の重鎖部分を有する組換え結合分子を含む組成物を生じ、分子の９９％超が、２個の重鎖部分が少なくとも１個の鎖間ジスルフィド結合を介して結合する形で存在する。
１つの実施形態において、本精製方法は、少なくとも２個の結合部位および２個の重鎖部分を有する結合分子を含む組成物を生じ、分子の９５％超が、２個の重鎖部分が少なくとも１個の鎖間ジスルフィド結合を介して結合される形で存在し、ポリペプチドの重鎖部分がＩｇＧ４アイソタイプの抗体に由来する。
１つの実施形態において、本精製方法は、２個の軽鎖部分および２個の重鎖部分を有する結合分子を含む組成物を生じ、重鎖部分はＣＨ２ドメインが欠如しており、分子の８０％超が、２個の重鎖部分が少なくとも１個の鎖間ジスルフィド結合を介して結合しない形で存在する。
別の態様において、本発明は、組成物中のフォームＡおよびフォームＢの相対量を測定することを含む、精製および／または優先的生合成の結果を監視する方法も提供する。フォームＡおよびフォームＢはたとえば本明細書で述べるように、非還元ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動または質量分析法を使用して測定できる。
ＶＩ．結合分子の標識および接合
本発明の結合分子は、たとえば標的検出を促進するために、あるいは患者の撮像または治療のために非接合形で使用できるか、または各種のエフェクタ、すなわち官能性部分の少なくとも１つに接合できる。本発明のポリペプチドは、精製が好ましいときに精製の前後のどちらかに標識付けまたは接合できる。特に本発明のポリペプチドは、細胞毒（たとえば放射性同位体、細胞毒性薬、または毒素）治療剤、細胞分裂阻害剤、生物毒素、プロドラッグ、ペプチド、ペプチド、タンパク質、酵素、ウィルス、脂質、生物反応修飾物質、医薬品、免疫活性リガンド（たとえばリンホカインまたは生じた分子が新生細胞およびエフェクタ細胞、たとえばＴ細胞の両方に結合する他の抗体）、ＰＥＧ、または撮像に有用である検出可能な部分に接合させることができる。別の実施形態において、本発明のポリペプチドは、腫瘍の血管新生を減少させる分子に接合させることができる。他の実施形態において、開示した組成物は、薬物またはプロドラッグに結合した本発明のポリペプチドを含みうる。本発明のなお他の実施形態は、特異的生物毒素またはその細胞毒性断片、たとえばリシン、ゲロニン、緑膿菌外毒素またはジフテリア毒素に接合した本発明のポリペプチドの使用を含む。使用する接合または非接合ポリペプチドの選択は、癌の種類および段階、補助処置の使用（たとえば化学療法または外部放射線）および患者の状態によって変化するであろう。当業者が本明細書の教示を考慮してそのような選択をただちにできることが認識される。
以前の研究では、同位体によって標識された抗腫瘍抗体を使用して、動物モデル、そしてヒトの一部の症例で、固形腫瘍はもちろんのこと、リンパ腫／白血病の細胞をうまく破壊したことが認識されるであろう。例示的な放射性同位体は：９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１２３Ｉ、１１１Ｉｎ、１０５Ｒｈ、１５３Ｓｍ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、１６６Ｈｏ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅおよび１８８Ｒｅを含む。放射性核種は、核ＤＮＡでの複数の鎖切断を引き起こす電離放射線を生成することによって作用して、細胞死をもたらす。治療接合体を産生するのに使用される同位体は通例、短いパス長を有するαまたはβ粒子を産生する。そのような放射性核種は、それらが近接している細胞、たとえば接合体が付着または進入した新生物細胞を死滅させる。それらは非局在化細胞にはほとんど、または全く効果を持たない。放射性核種は本質的に非免疫原性である。
本発明と併せた放射性標識接合の使用に関して、本発明のポリペプチドは直接標識できる（ヨウ素化によってなど）か、またはキレート剤の使用によって間接的に標識できる。本明細書で使用するように「間接標識」および「間接標識手法」という句はどちらも、キレート剤が結合分子に共有結合して、少なくとも１個の放射性核種がキレート剤に結合していることを意味する。そのようなキレート剤は、ポリペプチドおよび放射性同位体の両方に結合するため、通例、２官能性キレート剤と呼ばれる。特に好ましいキレート剤は、１−イソチオシクマトベンジル−３−メチルジオテレン（ｍｅｔｈｙｌｄｉｏｔｈｅｌｅｎｅ）トリアミンペンタ酢酸（「ＭＸ−ＤＴＰＡ」）およびシクロヘキシルジエチレントリアミンペンタ酢酸（「ＣＨＸ−ＤＴＰＡ」）誘導体を含む。他のキレート剤は、Ｐ−ＤＯＴＡおよびＥＤＴＡ誘導体を含む。間接標識に特に好ましい放射性核種は、１１１Ｉｎおよび９０Ｙを含む。
本明細書で使用するように、「直接標識」および「直接標識手法」という句はどちらも、ポリペプチドに直接共有結合する（通例、アミノ酸残基を介して）放射性核種を意味する。さらに詳細には、これらの接合技術は、ランダム標識および部位特異的標識を含む。後者の場合では、標識はポリペプチドの特異的部位、たとえば接合体のＦｃ部分のみに存在するＮ結合糖残基に向けられる。さらに各種の直接標識技法およびプロトコルは、本発明に適合する。たとえばテクネチウム−９９ｍ標識ポリペプチドは、ｐｅｒｔｅｃｈｎａｔｅ（ＴｃＯ４ −）をスズイオン溶液で還元して、還元テクネチウムをセファデックスカラム上にキレート化し、ポリペプチドをこのカラムに施用することによるリガンド交換プロセスによって、またはたとえばＳｎＣｌ２などの還元剤、ナトリウム−カリウムフタレート溶液などの緩衝溶液、および抗体をインキュベートすることによるバッチ標識技法によって調製できる。いずれにしても、抗体を直接標識するために好ましい放射性核種は当分野で公知であり、直接結合に特に好ましい放射性核種は、チロシン残基を介して共有付着された１３１Ｉである。本発明によるポリペプチドは、たとえば放射性ヨウ化ナトリウムまたはカリウムおよび化学酸化剤、たとえば次亜塩素酸ナトリウム、クロラミンＴなど、あるいは酵素酸化剤、たとえばラクトペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼおよびグルコースを用いて得ることができる。しかしながら本発明の解釈上、直接標識手法が特に好ましい。キレート剤およびキレート剤接合体に関する特許は、当分野で公知である。たとえばＧａｎｓｏｗのＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．４，８３１，１７５は、多置換ジエチレントリアミンペンタ酢酸キレートおよびそれを含有するタンパク質接合体、ならびにその調製の方法に関する。ＧａｎｓｏｗのＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ．５，０９９，０６９、５，２４６，６９２、５，２８６，８５０、５，４３４，２８７および５，１２４，４７１も、多置換ＤＴＰＡキレートに関する。これらの特許は、本明細書にその全体が組み入れられている。適合する金属キレート剤の他の例は、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、１，４，８，１１−テトラアザテトラデカン、１，４，８，１１−テトラアザテトラデカン−１，４，８，１１−テトラ酢酸、１−オキサ−４，７，１２，１５−テトラアザヘプタデカン−４，７，１２，１５−テトラ酢酸などである。シクロヘキシル−ＤＴＰＡまたはＣＨＸ−ＤＴＰＡは特に好ましく、下に広範に例示される。なお他の適合するキレート剤は、なお発見されていないものを含めて、当業者が容易に認識でき、明らかに本発明の範囲内である。
適合するキレート剤は、同時継続出願Ｓｅｒｉａｌ Ｎｏｓ．０８／４７５，８１３、０８／４７５，８１５および０８／４７８，９６７においてキレート化を促進するために使用される特異性２官能性キレート剤を含めて、好ましくは３価金属に高い親和性を提供するように選択され、腫瘍対非腫瘍比の向上および骨吸収の低下はもちろんのこと、標的部位、すなわちＢ細胞リンパ腫腫瘍部位における放射性核種の生体内保持の向上も示す。しかしながら、これらの特徴のすべてを持つ、または持たない他の２官能性キレート剤は当分野で公知であり、腫瘍治療にも有益である。本明細書の教示に従って、ポリペプチドは診断および治療目的で各種の放射性標識に接合できることも認識されるであろう。このために、参照により本明細書に組み入れられている上述の同時継続出願は、治療用抗体投与前の腫瘍の診断「撮像」のための放射性標識治療接合体を開示している。「Ｉｎ２Ｂ８」接合体は、ヒトＣＤ２０抗原に特異性であるマウスモノクローナル抗体、２Ｂ８を含み、これは１１１Ｉｎに、１−イソチオシアナートベンジル−３−メチル−ＤＴＰＡおよび１−メチル−３−イソチオシアナートベンジル−ＤＴＰＡの１：１混合物を含む２官能性キレート剤、すなわちＭＸ−ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミンペンタ酢酸）を介して結合される。１１１Ｉｎは、検出可能な毒性を伴わずに安全に投与できるため、診断用放射性核種として特に好ましい；そして撮像データは概して、次の９０Ｙ標識抗体分布を予測する。大半の撮像試験が５ｍＣｉ１１１Ｉｎ標識抗体を利用するのは、この用量が安全であり、同時により低い用量と比較して向上した撮像効率を有するからであり、抗体投与の３〜６日後に最適な撮像が行われる。たとえばＭｕｒｒａｙ，Ｊ．Ｎｕｃ．Ｍｅｄ．２６：３３２８（１９８５）およびＣａｒｒａｇｕｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｎｕｃ．Ｍｅｄ．２６：６７（１９８５）を参照。
上で示したように、各種の放射性核種が本発明に利用でき、当業者は、各種の条件下でどの放射性核種が最も適切であるかを容易に決定できる。たとえば１３１Ｉは、標的免疫療法に使用される公知の放射性核種である。しかしながら１３１Ｉの臨床有用性は：８日間の物理的半減期；血液および腫瘍部位の両方におけるヨウ化抗体の脱ハロゲン化；および腫瘍での局在化用量沈積にとって次善でありうる放出特徴（たとえば大型ガンマ成分）を含む複数の因子によって制限されうる。優れたキレート剤の出現により、金属キレート基をタンパク質に付着する機会は、他の放射性核種、たとえば１１１Ｉｎおよび９０Ｙを利用する機会を増加させた。９０Ｙは放射免疫療法用途での利用に関して複数の利点を提供する；９０Ｙの６４時間の半減期は抗体の腫瘍に蓄積を可能にするために十分長く、たとえば１３１Ｉとは異なり、９０Ｙは、１００〜１，０００細胞直径の組織における範囲で、その崩壊時にγ照射を伴わない高エネルギーの純粋なβ放射体である。さらに透過性放射線の最少量は、９０Ｙ標識抗体の外来患者への投与を可能にする。加えて標識抗体の内部移行は細胞死滅に必要なく、イオン化放射線の局所放出は、標的分子が欠如した隣接腫瘍細胞にとって致死性であるはずである。
当業者は、接合される選択された薬剤に応じて各種の技法を使用して、これらの非放射性接合体を構築できることも認識するであろう。たとえばビオチンとの接合体は、たとえばポリペプチドをビオチンの活性化エステル、たとえばビオチンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと反応させることによって調製される。同様に蛍光マーカーとの接合体は、たとえば上に挙げたようなカップリング剤の存在下で、またはイソチオシアナート、好ましくはフルオレセイン−イソチオシアナートとの反応によって調製できる。本発明のポリペプチドの細胞分裂停止／細胞毒性物質および金属キレートとの接合体は、類似の方式で調製される。
多くのエフェクタ部分は、抗体が結合できる適切な官能基が欠如している。１つの実施形態において、エフェクタ部分、たとえば薬物またはプロドラッグは、連結部分を通じて抗体に結合される。１つの実施形態において、連結部分は特定の部位における細胞毒性の活性化を可能にする化学結合を含有する。適切な化学結合は当分野で公知であり、ジスルフィド結合、酸不安定結合、光不安定結合、ペプチダーゼ不安定結合、スルフヒドリルおよびマレイミド基との間に形成されたチオエーテル結合、エステラーゼ不安定結合を含む。最も好ましくは、連結部分は、ジスルフィド結合またはチオエーテル結合を含む。本発明により、連結部分好ましくは反応性化学基を含む。特に好ましい反応性化学基は、Ｎ−スクシンイミジルエステルおよびＮ−スルホスクシンイミジルエステルである。好ましい実施形態において、反応性化学基は、チオール基間のジスルフィド結合を介して、エフェクタに共有結合できる。１つの実施形態において、エフェクタ分子はチオール基を含むように修飾される。当業者は、チオール基が水素原子に結合された硫黄原子を含有して、通例当分野で、「−ＳＨ」または「ＲＳＨ」として示されるスルフヒドリル基と呼ばれることを認識するであろう。
１つの実施形態において、連結部分は、エフェクタ部分を結合分子と結合するために使用できる。本発明の連結部分は開裂性でも、非開裂性でもよい。１つの実施形態において、開裂可能な連結部分は、遊離スルフヒドリル基を持つ分子がより高濃度の細胞質および他の領域などの、連結部分がより低い酸化還元電位の環境で開裂できるように、酸化還元開裂性連結部分である。酸化還元電位の変化のために開裂できる連結部分の例は、ジスルフィを含有する連結部分を含む。本発明の結合タンパク質の細胞内摂取時に開裂刺激を与えることができ、そこでは細胞質のより低い酸化還元電位が連結部分の開裂を促進する。別の実施形態において、ｐＨの低下がメイタンシノイドカーゴの標的細胞内への放出を誘発する。ｐＨの低下は、多くの生理学的および病理学的プロセス、たとえばエンドソーム輸送、腫瘍成長、炎症、および心筋虚血に結び付けられる。ｐＨは、生理学的な７．４からエンドソームで５〜６またはリソソームで４〜５へ降下する。癌細胞のリソソームまたはエンドソームを標的化するのに使用できる酸感受性連結部分の例は、アセタール、ケタール、オルトエステル、ヒドラゾン、トリチル、シスアコニチル、またはチオカルバモイルで見られるような酸開裂性結合を含む（たとえばＷｉｌｌｎｅｒ ｅｔ ａｌ，（１９９３），Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．，４：５２１−７；ＵＳ Ｐａｔ．Ｎｏｓ．４，５６９，７８９，４，６３１，１９０，５，３０６，８０９，および５，６６５，３５８を参照）。他の例示的な酸感受性連結部分は、ジペプチド配列Ｐｈｅ−ＬｙｓおよびＶａｌ−Ｌｙｓを含む（Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ，（２００２），Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４５：４３３６−４３）。開裂刺激は、低ｐＨエンドソームコンパートメント（たとえばリソソーム）への細胞内摂取輸送時に与えることができる。他の例示的な酸開裂性連結部分は、２個以上のメイタンシノイドの付着のために２個以上の酸開裂性結合を含有する部分である（Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ，（１９９９），Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．，１０：２７９−８８；ＷＯ ９８／１９７０５）。
開裂性連結部分は、特定の標的細胞、たとえばリソソームまたは腫瘍関連酵素と結合する生物供給の開裂剤に対して感受性でありうる。酵素によって開裂できる連結部分の例は、これに限定されるわけではないが、ペプチドおよびエステルを含む。例示的な酵素開裂性連結部分は、腫瘍関連プロテアーゼに対して感受性である連結部分、たとえばカテプシンＢまたはプラスミンを含む（Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ ｅｔ ａｌ，（１９９９），Ｐｈａｒｍ．Ｔｈｅｒ．，８３：６７−１２３；Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ ｅｔ ａｌ，（１９９８），Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ，８：３３４１−５２；ｄｅ Ｇｒｏｏｔ ｅｔ ａｌ，（２０００），Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４３：３０９３−１０２；ｄｅ Ｇｒｏｏｔ ｅｔ ａｌ，（１９９９）ｍ ４２：５２７７−８３）。カテプシンＢ開裂性部位は、ジペプチド配列バリン−シトルリンおよびフェニルアラニン−リジンを含む（Ｄｏｒｏｎｉｎａ ｅｔ ａｌ，（２００３），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２１（７）：７７８−８４）；Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ ｅｔ ａｌ，（２００２），Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．，１３：８５５−６９）。他の例示的な酵素開裂性部位は、ｔｒｏｕｓｅプロテアーゼ、たとえばＴｈｉｍｅｔオリゴペプチダーゼ（ＴＯＰ）、好中球、マクロファージ、および他の顆粒球によって優先的に放出される酵素によって認識される、４〜１６アミノ酸のオリゴペプチド配列によって形成された部位を含む（たとえばＳｕｃ−β−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ）。
さらなる実施形態において、連結部分は本発明の連結分子を式：
Ｘ−Ｙ−Ｚ
の分子と反応させることによって形成され、
式中：
Ｘは、付着部分であり；
Ｙは、スペーサ部分であり；
Ｚは、エフェクタ付着部分である。
「結合分子付着部分」という用語は、リンカーの本発明の結合分子への共有付着を可能にする部分を含む。
付着部分は、水素原子および結合分子にその所期の機能を実施させる他の置換基と場合により置換された、たとえば１〜６０個の炭素、酸素、窒素、硫黄原子の共有鎖を含むことができる。付着部分はペプチド、エステル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、エーテル、チオエーテルなど、官能基を含みうる。好ましくは付着部分は、本発明の結合分子を形成するために、少なくとも１個の抗原結合部位を含むポリペプチドの反応性官能基と反応できるように選択される。付着部分の例は、たとえばアミノ、カルボキシラート、およびチオール付着部分を含む。
アミノ付着部分は、本発明の結合分子が形成されるように、ポリペプチドのアミノ基と反応する部分を含む。アミノ付着部分は当分野で公知である。アミノ付着部分の例は、活性化カルバミド（たとえば結合分子のアミノ基と反応して、尿素基を含む連結部分を形成できる）、アルデヒド（たとえば結合分子のアミノ基と反応できる）、および活性化イソシアナート（結合分子のアミノ基と反応して、尿素基を含む連結部分を形成できる）を含む。アミノ付着部分の例は、これに限定されるわけではないが、Ｎ−スクシンイミジル、Ｎ−スルホスクシンイミジル、Ｎ−フタルイミジル、Ｎ−スルホフタリミジル、２−ニトロフェニル、４−ニトロフェニル、２，４−ジニトロフェニル、３−スルホニル−４−ニトロフェニル、または３−カルボキシ−４−ニトロフェニル部分を含む。
カルボキシラート付着部分は、本発明の結合分子が形成されるようにはポリペプチドのカルボキシラート基と反応する部分を含む。カルボキシラート付着部分は当分野で公知である。カルボキシラート付着部分の例は、これに限定されるわけではないが、結合分子のＣＯＯＨ基と反応して、エステル、チオエステル、またはアミド基を含む連結部分を形成しできる活性化エステル中間体および活性化カルボニル中間体を含む。
チオール付着部分は、本発明の結合分子が形成されるようにポリペプチドに存在するチオール基と反応する部分を含む。チオール付着部分は当分野で公知である。チオール付着部分の例は、活性化アシル基（結合分子のスルフヒドリルと反応して、チオエステルを含む連結部分を形成できる）、活性化アルキル基（結合分子のスルフヒドリルと反応して、チオエステルを含む連結部分を形成できる）、マレイミドまたはアクリル基などのＭｉｃｈａｅｌアクセプタ（結合分子のスルフヒドリルと反応して、Ｍｉｃｈａｅｌ型添加生成物を形成できる）、酸化還元反応を介してスルフヒドリル基と反応する基、活性化ジスルフィド基（結合分子のスルフヒドリル基と反応して、たとえばジスルフィド部分を含む連結部分を形成できる）を含む。他のチオール付着部分は、アクリルアミド、アルファ−ヨードアセトアミド、およびシクロプロパン−１，１−ジカルボニル化合物を含む。加えて、チオール付着部分は、結合分子のチオールを修飾して、連結分子が結合して本発明の結合分子を形成できる別の反応性種を形成する部分を含みうる。
スペーサ部分Ｙは、１個以上のアミノ酸残基を含有できる原子の共有結合または共有鎖である。それは水素原子および結合分子にその所期の機能を実施させる他の置換基と場合により置換された、たとえば０〜６０個の炭素、酸素、窒素、硫黄原子の共有鎖を含むこともできる。１つの実施形態において、Ｙはアルキル、アルケニル、アルキニル、エステル、エーテル、カルボニル、またはアミド部分を含む。
別の実施形態において、結合分子のチオール基は、反応性基、たとえば反応性カルボニル基、たとえばケトンまたはアルデヒドに変換される。付着部分は次にケトンまたはアルデヒドと反応させて、本発明の所望の化合物を形成する。カルボニル反応性付着部分の例は、これに限定されるわけではないが、ヒドラジン、ヒドラジド、Ｏ−置換ヒドロキシルアミン、アルファ−ベータ−不飽和ケトン、およびＨ２Ｃ＝ＣＨ−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ２を含む。付着部分の他の例および本発明の結合分子を形成するために使用できるチオール部分を修飾するための方法は、Ｐｒａｔｔ，Ｍ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．２００３ Ｍａｙ ２１；１２５（２０）：６１４９−５９；およびＳａｘｏｎ，Ｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０００ Ｍａｒ １７；２８７（５４６０）：２００７−１０に述べられている。
連結分子は、エフェクタ部分またはその誘導体と反応して、本発明の結合分子を形成できるいずれの分子でもよい。たとえばエフェクタ部分は、分子の残りの部分にジスルフィド結合を通じて連結できる。そのような場合、連結部分は、適切なエフェクタ部分誘導体と結合して、エフェクタ部分が本発明の結合分子と結合するように選択される。上述したように、連結部分および／またはリンカーは全体として、リンカーが適切な環境で開裂するように選択できる。
特に好ましいリンカー分子は、たとえばＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）（たとえばＣａｒｌｓｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１７３，７２３−７３７（１９７８）を参照）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブタノアート（ＳＰＤＢ）（たとえばＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，５６３，３０４を参照）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノアート（ＳＰＰ）（たとえばＣＡＳ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ ｎｕｍｂｅｒ ３４１４９８−０８−６を参照）、Ｎ−スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート（ＳＭＣＣ）（たとえばＹｏｓｈｉｔａｋｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，３９５−３９９（１９７９）を参照）、およびＮ−スクシンイミジル４−メチル−４−［２−（５−ニトロ−ピリジル）−ジチオ］ペンタノアート（ＳＭＮＰ）を含む（たとえばＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，５６３，３０４を参照）。本発明の組成物で使用するために最も好ましいリンカー分子は、ＳＰＰ、ＳＭＣＣ、およびＳＰＤＢである。好ましい実施形態において、ＳＰＤＢは、エフェクタ部分を本発明の結合分子に連結するために使用される。
本発明で使用するための好ましい細胞毒性エフェクタ部分は、癌治療に使用される細胞毒性薬である。本明細書で使用するように、「細胞毒または細胞傷害性薬」は、細胞の成長および増殖に有害であり、細胞または悪性疾患を減少、阻害または破壊するように作用できるいずれかの薬剤を意味する。例示的な細胞毒は、これに限定されるわけではないが、放射性核種、生物毒素、酵素活性毒素、細胞分裂停止または細胞毒性治療剤、プロドラッグ、免疫活性リガンドおよび生物反応修飾物質、たとえばサイトカインを含む。免疫反応性細胞または悪性細胞の成長を遅延または低速化するように作用するいずれの細胞毒も、本発明の範囲内である。
例示的な細胞毒は、一般に細胞分裂阻害剤、アルキル化剤、代謝拮抗物質、抗増殖剤、チューブリン結合剤、ホルモンおよびホルモンアンタゴニストなどを含む。本発明と適合する例示的な細胞分裂停止剤は、アルキル化物質、たとえばメクロレタミン、トリエチレンホスホラミン、シクロホスファミド、イフォスファミド、クロランブシル、ブスルファン、メルファランまたはｔｒｉａｚｉｑｕｏｎｅ、またはニトロソ尿素化合物、たとえばカルムスチン、ロムスチン、またはセムスチンを含む。
接合に特に好ましい部分は、メイタンシノイドである。メイタンシノイドは、ハリツルマサキ属に属する東アフリカシュラブから最初に単離されたが、土壌細菌、たとえばＡｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａ ｐｒｅｔｉｏｓｕｍの代謝産物であることも見出された（たとえばＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．３，８９６，１１１を参照）。メイタンシノイドは、メイタンシン、メイタンシノール、メイタンシノールのＣ−３エステル、および他のメイタンシノール類似体および誘導体を含むことが当分野で公知である（たとえばＵ．Ｓ． Ｐａｔ．Ｎｏｓ．５，２０８，０２０および６，４４１，１６３を参照）。メイタンシノールのＣ−３エステルは天然発生型であるか、または合成により得られる。その上、天然発生型および合成Ｃ−３メイタンシノールエステルのどちらも、単純カルボン酸とのＣ−３エステル、またはＮ−メチル−Ｌ−アラニンの誘導体とのＣ−３エステルとして分類でき、後者は前者よりも細胞毒性である。合成メイタンシノイド類似体も当分野で公知であり、たとえばＫｕｐｃｈａｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２１，３１−３７（１９７８）に述べられている。メイタンシノールならびにその類似体および誘導体を産生する方法は、たとえばＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，１５１，０４２に述べられている。
抗体接合体として使用するために適切なメイタンシノイドは、当分野で公知の方法を使用して、天然源から単離、合成的に産生、または半合成により産生できる。その上、メイタンシノイドは、十分な細胞毒性が最終的な接合分子中に保存される限り、いずれかの適切な方法で修飾できる。
反応性化学基を含有する連結部分を含む特に好ましいメイタンシノイドは、連結部分がジスルフィド結合を含有し、付着部分がＮ−スクシンイミジルまたはＮ−スルホスクシンイミジルエステルを含有する、メイタンシノールのＣ−３エステルおよびその類似体である。メイタンシノイドの多くの位置は、たとえばエフェクタ付着部分を通じて連結部分を化学的に連結する位置として作用する。たとえばヒドロキシル基を有するＣ−３位置、ヒドロキシメチルによって修飾されたＣ−１４位置、ヒドロキシによって修飾されたＣ−１５位置およびヒドロキシ基を有するＣ−２０位置は、すべて有用である。連結部分は最も好ましくはメイタンシノールのＣ−３位置に連結される。最も好ましくは、本発明の組成物と関連して使用されるメイタンシノイドは、Ｎ．ｓｕｐ．２’−ｄｅａｃｅｔｙｌ−Ｎ．ｓｕｐ．２’−（−３−メルカプト−１−オキソプロピル）−メイタンシン（ＤＭ１）またはＮ．ｓｕｐ．２’−デアセチル−Ｎ．ｓｕｐ．２’−（４−メルカプト−４−メチル−１−オキソペンチル）−メイタンシン（ＤＭ４）である。
他の化学結合との連結部分も、他のメイタンシノイドが可能なように、本発明の文脈で使用することが可能である。連結部分に包含できる他の化学結合の具体的な例は、たとえば酸不安定結合、チオエーテル結合、光不安定結合、ペプチダーゼ不安定結合およびエステラーゼ不安定結合などの上述の結合を含む。連結部分および／またはエフェクタ付着部分を備えたメイタンシノイドを産生する方法は、たとえばＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．５，２０８，０２０、５，４１６，０６４、および６，３３３，４１０に述べられている。
メイタンシノイドの連結部分（および／またはエフェクタ付着部分）は通例、そして好ましくは、抗体をメイタンシノイドに結合するために使用されるより大型のリンカー分子の一部である。いずれの適切なリンカー分子も、メイタンシノイドおよび抗体の細胞毒性および標的化特徴それぞれの保持を提供する限り、本発明に関連して使用できる。連結分子は、メイタンシノイドおよび抗体が相互に化学的にカップリングされる（たとえば共有結合）ように、化学結合を通じて（上述したように）メイタンシノイドを抗体に結合する。望ましくは、連結分子はジスルフィド結合またはチオエーテル結合を通じて、メイタンシノイドを抗体に化学的にカップリングする。最も好ましくは、抗体はメイタンシノイドにジスルフィド結合を介して化学的にカップリングされる。
細胞傷害性薬の他の好ましいクラスはたとえば薬物のアントラサイクリンファミリ、ビンカ薬、マイトマイシン、ブレオマイシン、細胞毒性ヌクレオシド、薬物のプテリジンファミリ、ジイネン、およびポドフィロトキシンを含む。これらのクラスの特に有用なメンバーは、たとえばアドリアマイシン、カルミノマイシン、ダウノルビシン（ダウノマイシン）、ドキソルビシン、アミノプテリン、メトトレキサート、メトプテリン、ミトラマイシン、ストレプトニグリン、ジクロロメトトレキサート、マイトマイシンＣ、アクチノマイシン−Ｄ、ポルフィロマイシン、５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、フトラフール、６−メルカプトプリン、シタラビン、シトシンアラビノシド、ポドフィロトキシン、またはポドフィロトキシン誘導体、たとえばエトポシドまたはエトポシドホスフェート、メルファラン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ロイロシジン、ビンデシン、ロイロシンなどを含む。本明細書の教示と適合するなお他の細胞毒は、タキソール、タキサン、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロミド、エメチン、テノポシド、コルヒチン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ならびにピューロマイシンおよびその類似体またはホモログを含む。ホルモンおよびホルモンアンタゴニスト、たとえばコルチコステロイド、たとえばプレドニゾン、プロゲスチン、たとえばヒドロキシプロゲステロンまたはメドロプロゲステロン、エストロゲン、たとえばジエチルスチルベストロール、アンチエストロゲン、たとえばタモキシフェン、アンドロゲン、たとえばテストステロン、およびアロマターゼインヒビタ、たとえばアミノグルテチミドも本明細書の教示と適合する。上述したように、当業者は、所望の化合物への化学修飾を行って、本発明の接合体を調製する目的のためにその化合物の反応をより好都合にすることができる。
特に好ましい細胞毒の１つの例は、カリケアマイシン、エスペラマイシンまたはネマイシンを含む、抗腫瘍抗生物質のエネジインファミリのメンバーまたは誘導体を含む。これらの毒素はきわめて強力であり、核ＤＮＡを開裂させることによって作用して、細胞死をもたらす。生体内で開裂して多くの不活性であるが、免疫原性のポリペプチド断片を与えることができるタンパク質とは異なり、カリケアマイシン、エスペラマイシンおよび他のエネジインなどの毒素は、本質的に非免疫原性である小型分子である。これらの非ペプチド毒素はダイマーまたはテトラマーに、モノクローナル抗体および他の分子を標識するために以前に使用されていた技法によって化学的に連結される。これらの連結技術は、構成物のＦｃ部分のみに存在するＮ−連結糖残基を介して部位特異性連結を含む。そのような部位特異的連結方法は、構成物の結合特性に対する連結の考えられる効果を低下させる利点を有する。
他の細胞毒の中で、ポリペプチドがリシンサブユニットＡ、アブリン、ジフテリア毒素、ボツリヌス、シアンジノシン、サキシトキシン、志賀毒素、破傷風、テトロドトキシン、トリコテシン、ｖｅｒｒｕｃｏｌｏｇｅｎまたは毒性酵素などの生体毒素とも結合できることが認識されるであろう。好ましくはそのような構築物は、抗体−毒性構築物の直接発現を可能にする遺伝子組換え技法を使用して作製されるであろう。本発明の本発明のポリペプチドに結合できる他の生物反応修飾物質は、リンホカインおよびインターフェロンなどのサイトカインを含む。本開示を考慮すると、当業者が通常の技法を使用してそのような構築物をただちに形成できることが提起される。
開示したポリペプチドと併せて使用できる適合する細胞毒の別のクラスは、腫瘍または免疫反応性細胞へ有効に向けることができる放射線増感薬である。そのような薬物は、電離放射線への感受性を向上させ、それにより放射線療法の有効性を上昇させる。腫瘍細胞によって内部移行された抗体接合体は、放射線増感剤を核により近づけて、そこでは放射線増感が最大となる。本発明の未結合放射線増感剤が連結されたポリペプチドは、血液から迅速に排除されて、残りの放射性増感剤を標的腫瘍に局在化させて、正常組織には最小限の摂取を与える。血液からの迅速な排除の後、補助の放射線療法が３つの方法：１．）腫瘍に特異的に向けられた外部ビーム放射、２．）腫瘍に直接インプラントされた放射能、または３．）同じ標的化抗体を用いた全身放射免疫療法の１つで投与される。この手法の潜在的に魅力的な変形は、治療用放射性同位体の放射線感作免疫接合体への付着であり、それにより患者に単一の薬物を投与するという便利さがもたらされる。
１つの実施形態において、ポリペプチドの安定性または有効性を向上させる部分は接合でありうる。たとえば１つの実施形態において、ＰＥＧは本発明のポリペプチドに接合して、その半減期を生体内で延長させることができる。Ｌｅｏｎｇ，Ｓ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．２００１．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ １６：１０６；２００２；Ａｄｖ．ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５４：５３１；またはＷｅｉｒ ｅｔ ａｌ．２００２．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ ３０：５１２。
以前に暗示したように、適合する細胞毒はプロドラッグを含みうる。本明細書で使用するように「プロドラッグ」という用語は、親薬物と比較して腫瘍細胞に対する細胞毒性が低く、酵素によって活性化またはより活性な親形に変換できる製薬活性物質の前駆体または誘導体形を指す。本発明に適合するプロドラッグは、これに限定されるわけではないが、より活性の細胞毒性を含まない薬物に変換することができる、ホスフェート含有プロドラッグ、チオホスフェート含有プロドラッグ、サルフェート含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、β−ラクタム含有プロドラッグ、場合により置換されたフェノキシアセトアミド含有プロドラッグまたは場合により置換されたフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、５−フルオロシトシンおよび他の５−フルオロウリジンプロドラッグを含む。１つの実施形態において、細胞傷害性薬、たとえばメイタンシノイドは、ジスルフィド結合の加水分解によって放出されるプロドラッグとして投与される。本発明で使用するためのプロドラッグ形に誘導体化できる細胞毒性薬のさらなる例は、上述したこれらの化学治療剤を含む。
Ｖ．ポリペプチドの投与
本発明のポリペプチドを調製して、被験体に投与する方法は、当業者に公知であり、当業者によってただちに決定される。本発明のポリペプチドの投与経路は、経口、非経口、吸入または局所的でありうる。非経口という用語は、本明細書で使用するように静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、経直腸または経膣投与を含む。非経口投与の静脈内、動脈内、皮下および筋肉内形が概して好ましい。これらすべての投与形は、本発明の範囲内であることが明らかに考えられるが、投与形は、注射用、特に静脈内または動脈内注射あるいは点滴用の溶液でありうる。通例、注射に適切な製薬組成物は、緩衝液（たとえば酢酸、リン酸、クエン酸緩衝液）、界面活性剤（たとえばポリソルベート）、場合により安定剤（たとえばヒトアルブミン）などを含む。しかしながら本明細書の教示と適合する他の方法において、ポリペプチドは有害細胞個体群の部位へ直接送達されて、それにより罹患組織の治療剤への露出を増大させることができる。
非経口投与のための調製物は、滅菌水溶液または非水溶液、懸濁剤、および乳剤を含む。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルを含む。水性担体は、食塩水および緩衝溶媒を含む、水、アルコール性／水性溶液、乳剤または懸濁剤を含む。本発明において、製薬的に許容される担体はこれに限定されるわけではないが、０．０１〜０．１Ｍおよび好ましくは０．０５Ｍリン酸緩衝液または０．８％食塩水を含む。他の一般的な非経口ビヒクルは、リン酸ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル、または固定油を含む。静脈内ビヒクルは、流体および栄養補充剤、電解質補充剤、たとえばリンゲルデキストロースをベースとするようなものなどを含む。保存料および他の添加剤、たとえば抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなども存在しうる。さらに詳細には、注射用途に適した製薬組成物は、滅菌水溶液（水溶性の場合）あるいは滅菌注射用液剤または分散剤の即席調製物用の分散剤および滅菌粉剤を含む。そのような場合には、組成物を滅菌する必要があり、容易な注射性が存在する程度まで流体であるべきである。それは製造および貯蔵条件下で安定であるべきであり、好ましくは微生物、たとえば細菌および真菌の汚染作用から保護されるであろう。担体は、たとえば水、エタノール、ポリオール（たとえばグリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびその適切な混合物を含む溶媒または分散溶媒でありうる。適正な流動性は、たとえばレシチンなどのコーティングの使用によって、分散剤の場合には要求された粒径の維持によって、そして界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防止は、各種の抗菌剤および抗真菌剤、たとえばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成できる。多くの場合、組成物に等張剤、たとえば糖、ポリアルコール、たとえばマンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射用組成物の長期吸収は、組成物に吸収を遅延させる薬剤、たとえばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含めることによって引き起こすことができる。
いずれの場合にも、滅菌注射用液剤は、活性化合物（たとえばポリペプチド単独、または他の活性剤と組合せて）の必要量を、本明細書で列挙した成分の１つまたは組合せを含む適切な溶媒に包含させることによって調製でき、必要ならば濾過滅菌を続ける。概して、分散剤は活性化合物を、塩基性分散媒および上に列挙した必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに包含させることによって調製できる。滅菌注射用液剤の調製のための滅菌粉剤の場合、調製の好ましい方法は真空乾燥および凍結乾燥であり、それにより活性成分およびその以前に滅菌濾過した溶液からのいずれかの追加の所望の成分の粉末を生じる。注射用調製物は当分野で公知の方法に従って、処理され、アンプル、袋、ボトル、注射器またはバイアルなどの容器に充填されて、無菌条件下で密封される。さらに調製物は包装され、そのそれぞれが参照により本明細書に組み入れられている同時係属Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０９／２５９，３３７およびＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０９／２５９，３３８で述べられているようなキットの形で販売される。そのような製造品は好ましくは、関連組成物が自己免疫または腫瘍性障害に罹患している、またはかかりやすい被験体を処置するために有用であることを示すラベルまたはパッケージ挿入物を有する。
上述の状態の処置のための、本発明の組成物の有効用量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトまたは動物であるか、投与される他の薬物、そして処置が予防的か治療的かを含む、多くの各種因子に応じて変化する。通例、患者はヒトであるが、トランスジェニック哺乳類を含む非ヒト哺乳類も処置できる。処置投薬量は、安全性および有効性を最適化するために、当業者に公知の通常の方法を使用して滴定できる。
抗体による受動免疫のために、投薬量はたとえば宿主体重の約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、さらに通常は０．０１〜５ｍｇ／ｋｇ（たとえば０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．７５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇなど）の範囲で変化しうる。たとえば投薬量は、１ｍｇ／ｋｇ体重または１０ｍｇ／ｋｇ体重、あるいは１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内、好ましくは少なくとも１ｍｇ／ｋｇである。上の範囲の中間の用量も、本発明の範囲内にあるものである。
被験体にはそのような用量を毎日、または１日おきに、毎週または実証的分析によって決定された他のいずれかのスケジュールに従って投与することができる。例示的な処置はたとえば少なくとも６ヶ月の長期間に亘って、複数回の用量量での投与を必要とする。追加の例示的な処置計画は、隔週に１回または毎月１回または３〜６ヶ月ごとに１回の投与を必要とする。例示的な投薬スケジュールは、毎日１〜１０ｍｇ／ｋｇまたは１５ｍｇ／ｋｇ、隔日３０ｍｇ／ｋｇまたは毎週６０ｍｇ／ｋｇを含む。一部の方法では、異なる結合特異性を備えた２つ以上のモノクローナル抗体が同時に投与され、その場合、投与された各抗体の投薬量は、示した範囲内に含まれる。
本発明の結合分子は、複数の機会に投与できる。１回の用量の間隔はたとえば毎日、毎週、毎月、または毎年でありうる。間隔は、患者のポリペプチドまたは標的分子の血液レベルを測定することによって示されるように、不規則でもよい。一部の方法では、投薬量はある血漿結合分子または毒素濃度、たとえば１〜１０００μｇ／ｍｌまたは２５〜３００μｇ／ｍｌを達成するために調整できる。あるいは結合分子は持続放出製剤として投与でき、その場合、より頻繁でない投与が必要とされる。投薬量および頻度は、患者内での抗体の半減期に応じて変化する。一般にヒト化抗体は最長半減期を示し、キメラ抗体および非ヒト抗体がそれに続く。１つの実施形態において、本発明の結合分子は非接合形で投与できる。別の実施形態において、本発明のポリペプチドは接合形で複数回投与できる。なお別の実施形態において、本発明の結合分子は非接合形で、次に接合形で、あるいはその逆で投与することができる。
投与の投薬量および頻度は、処置が予防的または治療的であるかに応じて変化しうる。予防用途において、本抗体またはそのカクテルを含有する組成物は、患者の抵抗力を向上させるためにすでに疾患状態にない患者に投与される。そのような量は、「予防的有効用量」と定義される。この用途では、正確な量は再度、患者の健康および全身免疫の状態に応じて代わるが、概して０．１〜２５ｍｇ／用量、特に０．５〜２．５ｍｇ／用量の範囲で変化する。比較的少ない投薬量が比較的まれな間隔で長期間に亘って投与される。一部の患者は、その生涯の残りに亘って処置を受け続ける。
治療用途では、疾患の進行が減速または終止するまで、好ましくは患者が疾患症状の部分的または完全な回復を示すまで、比較的多い投薬量（たとえば用量当り約１〜４００ｍｇ／ｋｇの結合分子、たとえば抗体、放射性免疫接合体では５〜２５ｍｇの投薬量がより普通に使用され、細胞毒−薬物接合分子ではより多い用量である）が比較的短い間隔に時折要求される。その後、患者には予防計画を投与できる。
１つの実施形態において、被験体は、（たとえばベクター内で）本発明のポリペプチドをコードする核酸分子によって処置できる。ポリペプチドをコードする核酸の用量は、患者当りＤＮＡ約１０ｎｇ〜１ｇ、１００ｎｇ〜１００ｍｇ、１μｇ〜１０ｍｇ、または３０〜３００μｇの範囲で変化する。感染ウィルス性ベクターの用量は、用量当り１０〜１００ビリオン、またはそれ以上で変化する。
治療剤は、非経口、局所的、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、腹腔内、鼻腔内または筋肉内手段で、予防および／または治療処置のために投与できる。抗体の投与には、筋肉内注射または静脈内輸液が好ましい。一部の方法では、特定の治療用抗体を頭蓋に直接注射する。一部の方法では、抗体は持続放出組成物またはデバイス、たとえばＭｅｄｉｐａｄＴＭデバイスとして投与される。
本発明の薬剤は場合により、処置の必要がある障害または状態を処置するのに有効である（たとえば予防的または治療的）他の薬剤と組合せて投与することができる。好ましい追加の薬剤は、当分野で認識され、特定の疾患に標準的に投与される薬剤である。
本発明の９０Ｙ標識ポリペプチドの有効な１回処置投薬量（すなわち治療的有効量）は、約５〜約７５ｍＣｉの、さらに好ましくは約１０〜約４０ｍＣｉの範囲で変化する。１３１Ｉ標識抗体の有効な１回処置非骨髄除去投薬量は、約５〜約７０ｍＣｉの、さらに好ましくは約５〜約４０ｍＣｉの範囲で変化する。１３１Ｉ標識抗体の有効１回処置除去投薬量（すなわち自家骨髄移植を必要とする）は、約３０〜約６００ｍＣｉの、さらに好ましくは約５０〜約５００ｍＣｉ未満の範囲で変化する。キメラ抗体と併せて、マウス抗体に対してより長い循環半減期のために、ヨウ素１３１標識キメラ抗体の有効な１回処置非骨髄除去投薬量は、約５〜約４０ｍＣｉ、さらに好ましくは約３０ｍＣｉの範囲で変化する。たとえば１１１Ｉｎ標識の撮像基準は通例、約５ｍＣｉ未満である。
１３１Ｉおよび９０Ｙでは多くの臨床経験が得られているが、他の放射性標識が当分野で公知であり、同様の目的に使用されている。なお他の放射性同位体が撮像に使用される。たとえば本発明の範囲に適合する追加の放射性同位体は、これに限定されるわけではないが、１２３Ｉ、１２５Ｉ、３２Ｐ、５７Ｃｏ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、７７Ｂｒ、８１Ｒｂ、８１Ｋｒ、８７Ｓｒ、１１３Ｉｎ、１２７Ｃｓ、１２９Ｃｓ、１３２Ｉ、１９７Ｈｇ、２０３Ｐｂ、２０６Ｂｉ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉ、４７Ｓｃ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１５３Ｓｍ、１８８Ｒｅ、１９９Ａｕ、２２５Ａｃ、２１１Ａｔ、および２１３Ｂｉを含む。この点でアルファ、ガンマおよびベータ放射体は本発明にすべて適合する。さらに本開示を考慮して、当業者が過度の実験をせずに選択した処置コースと適合する放射性核種をただちに決定できることが提示される。このために、すでに臨床診断に使用されている追加の放射性核種は、１２５Ｉ、１２３Ｉ、９９Ｔｃ、４３Ｋ、５２Ｆｅ、６７Ｇａ、６８Ｇａはもちろんのこと、１１１Ｉｎも含む。抗体は標的化免疫療法での潜在的使用のために各種の放射性核種によって標識もされている（Ｐｅｉｒｅｒｓｚ ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．６５：１１１−１２５（１９８７））。これらの放射性核種は、１８８Ｒｅおよび１８６Ｒｅはもちろんのこと、１９９Ａｕおよび６７Ｃｕもより少ない程度で含む。Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，４６０，７８５は、そのような放射性同位体に関する追加のデータを提供し、参照により本明細書に組み入れられている。
本発明のポリペプチドが接合形または非接合形で使用されるかどうかにかかわらず、本発明の主な利点は、骨髄抑制患者、特に放射線療法または化学療法などの補助療法を受けている、または受けた患者でこれらのポリペプチドを使用する能力であることが認識されるであろう。他の好ましい実施形態において、ポリペプチド（再度、接合または非接合形）は、化学治療剤を用いた複合治療計画で使用できる。当業者は、そのような治療計画が開示した抗体および１つ以上の化学治療剤の連続、同時、並行または同一空間投与を含むことを認識するであろう。本発明の本態様の特に好ましい実施形態は、たとえばＤ４メイタンシノイドなどのメイタンシノイドに接合した毒素接合結合分子の投与を含むであろう。
ポリペプチドはすぐ上で述べたように投与できるが、他の実施形態において、接合および非接合ポリペプチドは、そうでなければ健康な患者に第１選択治療剤として投与できることを強調する必要がある。そのような実施形態において、ポリペプチドは正常または平均赤色骨髄予備を有する患者に、および／または外部ビーム照射または化学療法などの補助療法を受けなかった、受けていない患者に投与することができる。
しかしながら上述したように、本発明の選択した実施形態は、骨髄抑制患者への、あるいは放射線療法または化学療法などの１つ以上の補助療法と組合せたまたは併用した、ポリペプチドの投与を含む（すなわち複合治療計画）。本明細書で使用するように、補助療法と併用したまたは組合せたポリペプチドの投与は、治療および開示したポリペプチドの連続、同時、同一空間、並行、付随または同時発生投与または利用を意味する。当業者は、複合治療計画の各種の成分の投与または利用は、処置の全体的な有効性を向上させるために時間調節できることを認識するであろう。たとえば化学治療剤は、本発明の放射性免疫接合体に続いて２〜３週間以内に、標準の公知の処置コースで投与できる。反対に、細胞毒結合ポリペプチドは、腫瘍局在化外部ビーム照射に続いて静脈内投与できる。なお他の実施形態において、ポリペプチドは、１つ以上の選択された化学治療剤を１回の外来診療で並行投与できる。当業者（たとえば熟練腫瘍医）は、選択した補助療法および本明細書の教示に基づいて、過度の実験をせずに有効な複合治療計画をただちに識別できるであろう。
この点で、ポリペプチド（接合または非接合のどちらか）および化学療法剤の組合せをいずれかの順序で、患者に治療上の恩恵をもたらすいずれかの時間枠で投与できることが認識されるであろう。すなわち化学療法剤およびポリペプチドはいずれかの順序で、または並行に投与できる。選択した実施形態において、本発明のポリペプチドは、前に化学療法を受けた患者に投与されるであろう。なお他の実施形態において、ポリペプチドおよび化学療法処置は、実質的に同時または並行に投与されるであろう。たとえば患者には、一連の化学療法を受けながら結合分子を与えることができる。好ましい実施形態において、結合分子はいずれかの化学療法剤または処置の１年以内で投与されるであろう。他の好ましい実施形態において、ポリペプチドはいずれかの化学療法剤または処置の１０、８、６、４、または２ヶ月間以内で投与されるであろう。なお他の好ましい実施形態において、ポリペプチドはいずれかの化学療法剤または処置の４、３、２または１週間以内で投与されるであろう。なお他の実施形態において、ポリペプチドは選択した化学療法剤または処置の５、４、３、２または１日以内で投与されるであろう。２つの薬剤または処置が患者にほんの数時間または数分以内に（すなわち実質的に同時に）投与できることがさらに認識されるであろう。
その上、本発明により、骨髄抑制患者は、血球数の低下を示すいずれの患者も意味すると見なされるものとする。当業者は、骨髄抑制の臨床指標として慣習的に使用される複数の血球数パラメータがあり、患者において骨髄抑制が発生している程度を容易に測定できることを認識するであろう。当分野で受け入れられている骨髄抑制測定の例は、絶対好中球数（ＡＮＣ）または血小板数である。そのような骨髄抑制または部分骨髄除去は、おそらく各種の生化学障害または疾患の結果、あるいはどちらかと言えば従来の化学療法または放射線療法である。この点で当業者は、在来の化学療法を受けた患者が通例、赤色骨髄予備の低下を示すことを認識するであろう。上述したように、そのような被験体は、死亡率または罹患率の上昇を引き起こす貧血または免疫抑制などの許容できない副作用のために、細胞毒（すなわち放射性核種）の最適レベルを使用して処置できないことが多い。
さらに詳細には、本発明の接合または非接合ポリペプチドを使用すると、約２０００／ｍｍ３より低いＡＮＣおよび約１５０，０００／ｍｍ３より低い血小板数を有する患者を有効に処置できる。さらに好ましくは、本発明のポリペプチドを使用して、約１５００／ｍｍ３未満の、約１０００／ｍｍ３未満の、なおさらに好ましくは約５００／ｍｍ３未満のＡＮＣを有する患者を処置できる。同様に本発明のポリペプチドを使用して、約７５，０００／ｍｍ３未満の、約５０，０００／ｍｍ３未満の、なお約１０，０００／ｍｍ３未満の血小板数を有する患者を処置することができる。さらに一般的な意味で当業者は、患者に政府実施指針および手順を使用して骨髄抑制するときを容易に決定できるであろう。
上で示したように、多くの骨髄抑制患者が化学療法、インプラント放射線療法または外部ビーム放射線療法を含む処置コースを受けている。後者の場合、外部放射線源は悪性疾患の局所照射用である。放射線療法インプランテーション方法は、放射性試薬を悪性疾患内に外科的に配置して、それにより疾患部位に選択的に照射する。いずれの場合にも、開示したポリペプチドを使用して、原因とは無関係に、骨髄抑制を示す患者の障害を処置することができる。
この点で本発明のポリペプチドは、生体内での新生物細胞の増殖を消滅、減少、阻害または制御するいずれかの化学療法剤または薬剤と併用して、または組合せて（たとえば複合治療計画を提供するために）使用できることがさらに認識されるであろう。上述したように、そのような薬剤は赤色骨髄予備の減少を引き起こすことが多い。この減少は全部または一部を、そのような患者における新形成の積極的な処置を好都合に可能にする本発明の化合物の骨髄毒性の低下によって停止させることができる。他の好ましい実施形態において、本明細書で開示する放射性標識免疫接合体は、新生物細胞の放射性核種に対する感受性を向上させる放射線増感剤と共に有効に使用できる。たとえば放射線増感化合物は、放射性標識化結合分子が血流から大部分排除されたが、１つまたは複数の腫瘍の部位に治療的に有効なレベルでなお残存している後に、投与できる。
本発明のこれらの態様に関して、本発明に適合する例示的な化学治療剤は、アルキル化剤、ビンカアルカロイド（たとえばビンクリスチンおよびビンブラスチン）、プロカルバジン、メトトレキサートおよびプレドニゾンを含む。４薬物の組合せであるＭＯＰＰ（ｍｅｃｈｌｅｔｈａｍｉｎｅ（ナイトロジェンマスタード）、ビンクリスチン（オンコビン）、プロカルバジンおよびプレドニゾン）は、各種のリンパ腫を処置するに非常に有効であり、本発明の好ましい実施形態を構成する。ＭＯＰＰ耐性患者では、ＡＢＶＤ（たとえばアドリアマイシン、ブレオマイシン、ビンブラスチンおよびダカルバジン）、Ｃｈ１ＶＰＰ（クロランブシル、ビンブラスチン、プロカルバジンおよびプレドニゾン）、ＣＡＢＳ（ロムスチン、ドキソルビシン、ブレオマイシンおよびストレプトゾシン）、ＭＯＰＰおよびＡＢＶＤ、ＭＯＰＰおよびＡＢＶ（ドキソルビシン、ブレオマイシンおよびビンブラスチン）またはＢＣＶＰＰ（カルムスチン、シクロホスファミド、ビンブラスチン、プロカルバジンおよびプレドニゾン）組合せを使用することができる。Ａｒｎｏｌｄ Ｓ．Ｆｒｅｅｄｍａｎ ａｎｄ Ｌｅｅ Ｍ．Ｎａｄｌｅｒ，Ｍａｌｉｇｎａｎｔ Ｌｙｍｐｈｏｍａｓ，ｉｎ ＨＡＲＲＩＳＯＮ’Ｓ ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＯＦ ＩＮＴＥＲＮＡＬ ＭＥＤＩＣＩＮＥ １７７４−１７８８（Ｋｕｒｔ Ｊ．Ｉｓｓｅｌｂａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ，ｅｄｓ．，１３ｔｈ ｅｄ．１９９４）およびＶ．Ｔ．ＤｅＶｉｔａ ｅｔ ａｌ，（１９９７）ならびに標準投薬およびスケジューリングのためにそこで引用された参考文献。これらの治療は変更せずに使用できるか、または特定の患者のために必要に応じて、本明細書で述べるような１つ以上の本発明のポリペプチドと組合せて改変できる。
本発明の文脈で有用である追加の計画は、単一のアルキル化剤、たとえばシクロホスファミドまたはクロランブシル、あるいは組合せ、たとえばＣＶＰ（シクロホスファミド、ビンクリスチンおよびプレドニゾン）、ＣＨＯＰ（ＣＶＰおよびドキソルビシン）、Ｃ−ＭＯＰＰ（シクロホスファミド、ビンクリスチン、プレドニゾンおよびプロカルバジン）、ＣＡＰ−ＢＯＰ（ＣＨＯＰおよびプロカルバジンならびにブレオマイシン）、ｍ−ＢＡＣＯＤ（ＣＨＯＰおよびメトトレキサート、ならびにブレオマイシンならびにロイコボリン）、ＰｒｏＭＡＣＥ−ＭＯＰＰ（プレドニゾン、メトトレキサート、ドキソルビシン、シクロホスファミド、エトポシドならびにロイコボリンおよび標準ＭＯＰＰ）、ＰｒｏＭＡＣＥ−ＣｙｔａＢＯＭ（プレドニゾン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、エトポシド、シタラビン、ブレオマイシン、ビンクリスチン、メトトレキサートおよびロイコボリン）ならびにＭＡＣＯＰ−Ｂ（メトトレキサート、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、固定用量プレドニゾン、ブレオマイシンおよびロイコボリン）の使用を含む。当業者は、これらの計画それぞれの標準投薬量およびスケジューリングをただちに決定することができるであろう。ＣＨＯＰは、ブレオマイシン、メトトレキサート、プロカルバジン、ナイトロジェンマスタード、シトシンアラビノシドおよびエトポシドとも組合されている。他の適合する化学治療剤は、これに限定されるわけではないが、２−クロロデオキシアデノシン（２−ＣＤＡ）、２’−デオキシコフォルマイシンおよびフルダラビンを含む。
寛解または再発を達成できなかった中間および高悪性度ＮＨＬを有する患者は、救済療法が使用される。救済療法は、単独または組合せで投与されるシトシンアラビノシド、シスプラチン、エトポシドおよびイフォスファミドなどの薬物を利用する。ある腫瘍性障害の再発または高悪性度形において、次のプロトコル：ＩＭＶＰ−１６（イフォスファミド、メトトレキサートおよびエトポシド）、ＭＩＭＥ（メチル−ｇａｇ、イフォスファミド、メトトレキサートおよびエトポシド）、ＤＨＡＰ（デキサメタゾン、高用量シタラビンおよびシスプラチン）、ＥＳＨＡＰ（エトポシド、メチルプレジソロン、ＨＤシタラビン、シスプラチン）、ＣＥＰＰ（Ｂ）（シクロホスファミド，エトポシド、プロカルバジン、プレドニゾンおよびブレオマイシン）およびＣＡＭＰ（ロムスチン、ミトキサントロン、シタラビンおよびプレドニゾン）が、それぞれ周知の投与速度およびスケジュールを用いてしばしば使用される。
本発明のポリペプチドと併せて使用される化学療法剤の量は、被験体によって変化するか、または当分野で公知のことに従って投与される。たとえばＢｒｕｃｅ Ａ Ｃｈａｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ，Ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ Ａｇｅｎｔｓ，ｉｎ ＧＯＯＤＭＡＮ ＆ ＧｌＬＭＡＮ’Ｓ ＴＨＥ ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＩＣＡＬ ＢＡＳＩＳ ＯＦ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ １２３３−１２８７（（Ｊｏｅｌ Ｇ．Ｈａｒｄｍａｎ ｅｔ ａｌ，ｅｄｓ．，９ｔｈ ｅｄ．１９９６）を参照。
１つの実施形態において、本発明の結合分子は、たとえば予防治療として原発性腫瘍、転移あるいは前癌増殖または組織を除去するために、外科処置を受けた、受けている、または受けるであろう被験体に投与できる。
別の実施形態において、本発明の結合分子は生物薬と併せて投与できる。癌の処置に有用な生物薬は当分野で公知であり、本発明の結合分子はたとえばそのような既知の生物薬と併せて用途できる。
たとえばＦＤＡは、乳癌の処置のために次の生物薬を認可している：Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（トラスツズマブ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ Ｉｎｃ．，サウスカリフォルニア，カリフォルニア州；ＨＥＲ２陽性乳癌で抗腫瘍結合を有するヒト化モノクローナル抗体）；Ｆａｓｌｏｄｅｘ（登録商標）（フルベストラント、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＬＰ，ウィルミントン、デラウェア州；乳癌を処置するために使用されるエストロゲンレセプタアンタゴニスト）；Ａｒｉｍｉｄｅｘ（登録商標）（アナストロゾール、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＬＰ；アロマターゼを遮断する非ステロイド性アロマターゼインヒビタ、エストロゲンを作製するために必要な酵素）；Ａｒｏｍａｓｉｎ（登録商標）（エキセメスタン、，Ｐｆｉｚｅｒ Ｉｎｃ．，ニューヨーク、ニューヨーク州；乳癌の処置で使用される不可逆性ステロイド性アロマターゼインアクチベータ）；Ｆｅｍａｒａ（登録商標）（レトロゾール、Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，イーストハノーバー，ニュージャージー州；ＦＤＡにより認可された乳癌を処置するための非ステロイド性アロマターゼインヒビタ）；およびＮｏｌｖａｄｅｘ（登録商標）（タモキシフェン、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＬＰ；ＦＤＡにより認可された乳癌を処置するための非ステロイド性抗エストロゲン）。本発明の結合分子が組合される他の生物薬は：ＡｖａｓｔｉｎＴＭ（ベバシズマブ，Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ Ｉｎｃ．；血管新生を阻害するように設計された最初のＦＤＡ認可治療）；およびＺｅｖａｌｉｎ（登録商標）（イブリツモマブチウキセタン、Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｅ，ケンブリッジ、マサチューセッツ州；Ｂ細胞リンパ腫の処置のために現在認可されている放射性標識化モノクローナル抗体）を含む。
加えてＦＤＡは、結腸直腸癌の処置のために次の生物薬を認可している：ＡｖａｓｔｉｎＴＭ；ＥｒｂｉｔｕｘＴＭ（セツキシマブ、ＩｍＣｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．，ニューヨーク、ニューヨーク州、およびＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ，ニューヨーク、ニューヨーク州；は、表皮増殖因子レセプタ（ＥＧＦＲ）に対して作られたモノクローナル抗体である）；Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標）（メシル酸イマチニブ；タンパク質キナーゼインヒビタ）；およびＥｒｇａｍｉｓｏｌ（登録商標）（塩酸レバミゾール，Ｊａｎｓｓｅｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＬＰ，ティテュスビル、ニュージャージー州；Ｄｕｋｅｓ’ＳｔａｇｅＣ結腸癌の患者での外科切除後に、５−フルオロウラシルと組合されたアジュバント処置としての１９９０年にＦＤＡによって認可された免疫調節物質）。
非ホジキンリンパ腫の処置で使用するための、現在認可されている療法は：Ｂｅｘｘａｒ（登録商標）（トシツモマブおよびヨウ素Ｉ−１３１トシツモマブ、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ，ＮＣ；放射性分子（ヨウ素Ｉ−１３１）に連結されたマウスモノクローナル抗体（トシツモマブ）を含む多段階処置）；Ｉｎｔｒｏｎ（登録商標）Ａ（インターフェロンアルファ−２ｂ、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ケニルワース，ニュージャージー州；アントラサイクリン含有複合化学療法と併せた、濾胞性非ホジキンリンパ腫の処置のために認可されたインターフェロンの種類（たとえばシクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾン［ＣＨＯＰ］））；Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）（リツキシマブ，Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ Ｉｎｃ．，サウスカリフォルニア，カリフォルニア州、およびＢｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｅ，ケンブリッジ、マサチューセッツ州；非ホジキンリンパ腫の処置のために認可されたモノクローナル抗体；Ｏｎｔａｋ（登録商標）（デニロイキンディフチトクス、Ｌｉｇａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．，サンディエゴ、カリフォルニア州；インターロイキン−２に遺伝子融合されたジフテリア毒素の断片より成る融合タンパク質）；およびＺｅｖａｌｉｎ（登録商標）（イブリツモマブチウキセタン、Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｅ；Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫の処置のためにＦＤＡによって認可された放射性標識モノクローナル抗体）を含む。
白血病の処置では、本発明の結合分子と併せて使用できる例示的な生物薬は、Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標）；Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標）−１Ｈ（アレムツズマブ、Ｂｅｒｌｅｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，リッチモンド、カリフォルニア州；慢性リンパ球性白血病の処置で使用されるモノクローナル抗体の種類）を含む。加えてＧｅｎａｓｅｎｓｅ（オブリマーセン、Ｇｅｎｔａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，バークレーハイツ、ニュージャージー州；白血病を処置するために開発中のＢＣＬ−２アンチセンス療法を使用できる（たとえば単独で、または１つ以上の化学療法薬、たとえばフルダラビンおよびシクロホスファミドと組合せて）は、請求される結合分子と共に投与できる。
肺癌の処置では、例示的な生物薬は、ＴａｒｃｅｖａＴＭ（エルロチニブＨＣＬ、ＯＳＩ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．，メルビル、ニューヨーク州；ヒト表皮増殖因子レセプタ１（ＨＥＲ１）経路を標的化するように設計された小型分子）を含む。
多発性骨髄腫の処置では、例示的な生物薬は、Ｖｅｌｃａｄｅ（登録商標）Ｖｅｌｃａｄｅ（ボルテゾミブ、Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ケンブリッジ、マサチューセッツ州；プロテアソームインヒビタ）を含む。追加の生物薬は、Ｔｈａｌｉｄｏｍｉｄ（登録商標）（サリドマイド、Ｃｌｅｇｅｎｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ウォレン、ニュージャージー州；免疫調節剤で、骨髄腫細胞の増殖および生存ならびに抗血管新生を阻害する能力を含む、複数の作用を有すると考えられる）。
他の例示的な生物薬は、ＩｍＣｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，ニューヨーク、ニューヨーク州によって開発されたＭＯＡＢ ＩＭＣ−Ｃ２２５を含む。
加えて請求された結合分子は、抗癌免疫反応を調節するために、ワクチンまたは他の薬剤（たとえばサイトカイン）と併せて投与できる。たとえばＭｅｌａｃｉｎｅ（登録商標）（Ｃｏｒｉｘａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，シアトル、ワシントン州）は、Ｔ３Ｎ０Ｍ０切除メラノーマの処置に有望な結果を有することが報告されている同種腫瘍ワクチンである。ＧＭＫ（登録商標）（Ｐｒｏｇｅｎｉｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，Ｉｎｃ．，タリータウン、ニューヨーク州）は、アジュバント第ＩＩＩ相薬剤としてメラノーマ再発のリスクが高い患者に投与されるガングリオシド抗原である。抗ガストリン治療ワクチン（登録商標）（Ａｐｈｔｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，マイアミ、フロリダ州）は、ホルモンＧ１７およびＧｌｙ伸長を中和して、結腸直腸、膵臓、および胃癌の患者への第ＩＩＩ相臨床試験中である。ＣｅａＶａｃ（登録商標）（Ｔｉｔａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，サウスカリフォルニア、カリフォルニア州）は、結腸直腸癌で研究されている抗イディオタイプ抗体ワクチンである。最後にＴｈｅｒａｔｏｐｅ（登録商標）（Ｂｉｏｍｉｒａ Ｉｎｃ．，エドモントン、アルバータ州、カナダ）は、転移性乳癌患者で第ＩＩＩ相薬剤として調査されている合成炭化水素治療ワクチンである（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｒｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，２０００）。
別の実施形態において、本発明の結合分子は、抗血管新生剤、たとえばエンドスタチン（微小血管内皮細胞産生を停止させる内因性腫瘍由来内皮特異性インヒビタ）；抗ＶＥＧＦ抗体；サリドマイドと併せて投与できる；またはマトリクスメタロプロテイナーゼインヒビタは、血管の基底膜の合成および分解を阻害する）。
上述したように、本発明のポリペプチド、その免疫反応性断片または組換えは哺乳類障害の生体内処置に対して製薬的有効量で投与できる。この点で、開示した抗体は活性剤の投与を容易にして、安定性を促進するために調合されることが認識されるであろう。好ましくは本発明による製薬組成物は製薬的に許容される非毒性滅菌担体、たとえば生理的食塩水、非毒性緩衝液、保存料などを含む。本出願の解釈上、治療剤へ接合された、または非接合のポリペプチド、その免疫反応性断片または組換えの製薬的有効量は、標的への有効な結合を達成するのに、そしてたとえば疾患または障害の症状を回復させるために、あるいは物質または細胞を検出するために恩恵を達成するのに十分な量を意味すると見なされる。腫瘍細胞の場合、ポリペプチドは好ましくは腫瘍性または免疫反応性細胞の選択した免疫反応性抗原と相互作用可能であり、これらの細胞死の増加をもたらすであろう。もちろん本発明の製薬組成物は、ポリペプチドの製薬的有効量を供給するために１回用量または複数回用量で投与できる。
本開示の範囲を維持しながら、本発明のポリペプチドは、上述の処置方法に従ってヒトまたは他の動物に治療または予防効果を生じるのに十分な量で投与できる。本発明のポリペプチドはそのようなヒトまたは他の動物に、公知の方法に従って本発明の抗体を従来の製薬的に許容される担体または希釈剤と組合せることによって調製された従来の投薬形で投与できる。当業者によって、製薬的に許容される担体または希釈剤の形および特徴はそれが組合される活性成分の量、投与経路および他の公知の変形によって指示されることが認識されるであろう。当業者は、本発明によるポリペプチドの１つ以上の種を含むカクテルが特に有効であると判明することをさらに認識するであろう。
ＶＩ．使用方法
本発明の分子は、診断または治療目的で使用できる。本発明の好ましい実施形態は、そのような処置が必要な哺乳類被験体に障害、たとえば腫瘍性障害の診断および／または処置のための化合物、組成物、キットおよび方法を提供することである。好ましくは、被験体はヒトである。
本発明のポリペプチドは、多くの異なる用途で有用であろう。たとえば１つの実施形態において、対象結合分子は、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して試験管内でＣｒｉｐｔｏを検出するためのアッセイで使用できる。例示的なアッセイは当分野で公知であり、たとえばＵｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ２００４００７７０２５を参照。
別の実施形態において、対象結合分子は撮像技術を使用してＣｒｉｐｔｏ保持細胞の存在を検出するために有用である。そのような用途では、結合分子を検出可能な部分、たとえば放射性標識に下でさらに述べるように接合させることが望ましい。
別の実施形態において、対象結合分子は、本発明の結合分子に認識された細胞保持標的（たとえばＣｒｉｐｔｏのエピトープ）を減少または除去するために有用である。別の実施形態において、対象結合分子は、循環中の溶解性標的分子の濃度低下、またはその除去に有効である。
１つの実施形態において、本発明の結合分子は腫瘍サイズを縮小して、腫瘍成長を阻害し、および／または腫瘍保持被験体の生存時間を延長する。したがって本発明は、ヒトまたは他の動物の腫瘍を、そのようなヒトまたは動物にポリペプチドの有効な非毒性量を投与することによって処置する方法にも関する。当業者は、通常の実験によって、悪性疾患を処置する目的のためのポリペプチドの有効な非毒性量を決定することができる。たとえばポリペプチドの治療活性量は、被験体の疾患ステージ（たとえばステージＩ対ステージＩＶ）、年齢、性別、内科的合併症（たとえば免疫抑制状態または疾患）および体重、ならびに被験体において所望の反応を誘発する抗体の能力などの因子に従って変化しうる。投薬計画は、最適治療反応を提供するために調整できる。たとえば複数の分割用量を毎日投与することができ、または用量を治療状況の緊急性によって示されるように比例的に減少させることができる。概してしかしながら、有効な投薬量は、約０．０５〜１００ミリグラム／キログラム体重／日およびさらに好ましくは約０．５〜１０ミリグラム／キログラム体重／日の範囲にあると予想される。
解明する目的で「哺乳類」は、ヒト、家畜（ｄｏｍｅｓｔｉｃ ａｎｄ ｆａｒｍ ａｎｉｍａｌ）、および動物園の動物、競技用動物、ペット動物、たとえばイヌ、ウマ、ネコ、メウシなどを含む、哺乳類として分類されるいずれの動物も指す。好ましくは哺乳類はヒトである。「処置」は、治療処置および予防または防止措置の療法を指す。処置が必要な哺乳類は、すでに疾患または障害を持つ哺乳類はもちろんのこと、疾患または障害が防止される哺乳類も含む。それゆえ該哺乳類は、疾患または障害を有すると診断されているか、または疾患の素因がある、または疾患にかかりやすいことがある。
概して開示した発明を使用して、癌性細胞の結合分子による標的化を可能にするマーカーを含むいずれの新生物も予防的にまたは治療的に処置できる。好ましい実施形態において、本発明の結合分子は固形腫瘍を処置するために使用される。処置できる例示的な癌は、これに限定されるわけではないが、前立腺癌、胃癌、たとえば結腸癌、皮膚癌、乳癌、卵巣癌、肺癌および膵臓癌を含む。別の実施形態において、本発明の抗体を使用して、カポジ肉腫、ＣＮＳ新形成（毛細血管細胞芽腫、髄膜腫および脳転移）、メラノーマ、胃腸および腎肉腫、横紋筋肉腫、神経膠芽腫（好ましくは多形神経膠芽腫）、平滑筋肉腫、網膜芽細胞腫、卵巣の乳頭状嚢胞腺癌、ウィルムス腫瘍または小細胞肺癌を処置できる。本開示を考慮すると、過度の実験なしに、上述の新形成それぞれに関連した腫瘍関連分子のために適切なポリペプチドを得られることが認識されるであろう。
開示した発明による処置に従う例示的な血液悪性疾患は、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫はもちろんのこと、ＡＬＬ−Ｌ３（バーキット型白血病）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）および単球細胞白血病を含む白血病も含む。本発明の化合物および方法は、低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、細胞リンパ腫（ＦＣＣ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、びまん性大細胞リンパ腫（ＤＬＣＬ）、小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ、中悪性度／濾胞性ＮＨＬ、中悪性度びまん性ＮＨＬ、高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ、高悪性度小非切れ込み細胞ＮＨＬ、巨大病変ＮＨＬおよびワルデンストロームマクログロブリン血症を含む、各種のＢ細胞リンパ腫を処置するのに特に有効であることが認識されるであろう。これらのリンパ腫が分類系の変更のために異なる名称をしばしば有する多いことと、異なる名称で分類されたリンパ腫を有する患者も本発明の複合治療計画から恩恵を得ることが、当業者に明らかになるはずである。上述の腫瘍性障害に加えて、開示した発明を好都合に使用して、適合性の腫瘍関連分子を持つ追加の悪性疾患を処置できることが認識されるであろう。
本発明の１つの実施形態において、Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合することができ、腫瘍成長がアクチビンＢシグナリングの消失または低下によって仲介される場合に患者の腫瘍細胞の成長を阻害する分子が提供される。ある実施形態において、腫瘍細胞は、脳、頭部、頸部、前立腺、乳房、精巣、結腸、肺、卵巣、膀胱、子宮、子宮頸部、膵臓および胃の腫瘍細胞である。他の実施形態において、本発明の結合分子はＣｒｉｐｔｏに特異的に結合して、Ｃｒｉｐｔｏを過剰発現する腫瘍細胞の成長を阻害する。１つの実施形態において、腫瘍細胞はＣｒｉｐｔｏを過剰発現する細胞系、たとえば脳、乳房、精巣、結腸、肺、卵巣、膀胱、子宮、子宮頸部、膵臓および胃の癌に由来する細胞系である。
本発明は、制限するものとして解釈すべきでない次の実施例によってさらに説明される。本出願を通じて引用されたすべての参考文献、特許および公開特許出願の内容は、参照により本明細書に組み入れられている。
（実施例１）
ＡおよびＢアイソフォームの識別
抗体分子の溶液は、２つの異なるアイソフォームを含む。一方の形のフォームＡは、少なくとも１個のジスルフィド結合を介して連結される重鎖分子を含む。他方の形のフォームＢは、少なくとも１個のジスルフィド結合を介して連結されない重鎖分子を含む。フォームＢは出現しないか、または無傷のガンマ１ＭＡｂ、たとえばＲｉｔｕｘａｎ（登録商標）と共に非常に低い頻度で出現する。しかしながら、同様のヒンジを有するドメイン欠失（ｄｄ）構築物を用いると、フォームＢの頻度ははるかに高くなる。これらの形は、変性非還元ＳＤＳ ｐａｇｅを使用して区別することができる。ドメイン欠失抗体調製物では、フォームＡは１２０ｋＤａダイマーとして出現するのに対して、フォームＢは６０ｋＤａモノマーとして出現する。
（実施例２）
ＣＨ２ドメイン欠失ＭＡｂ断片におけるヒンジ領域異種性の識別
ヒンジドメインは、３つの識別可能な領域：上部、中間、および下部ヒンジ領域に再分割できる（Ｒｏｕｘ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８ １６１：４０８３）。ＩｇＧ１およびＩｇＧ３ヒンジのこれらの領域を含むポリペプチド配列を表３に示す。ＩｇＧ３ヒンジ中間領域は、２つの保存システイン残基に加えて、３回反復する１５アミノ酸モチーフを含有する。これらの領域からのアミノ酸配列は、合成ＩｇＧ１／ＩｇＧ３結合ペプチドを設計するために使用される。これらは位置２２６〜２３８に相当するＩｇＧ１上部ヒンジ残基、位置２３９〜２４１に相当するＩｇＧ１中間ヒンジおよび位置２４３の付加プロリンまたは位置２４３、２４４、および２４５それぞれの付加プロリン、アラニン、プロリンのどちらかと組合された位置２４１ＥＥ〜２４２に相当する単一のＩｇＧ３中間ヒンジ反復モチーフ（Ｋａｂａｔ番号付けシステム）より構成され、柔軟性Ｇｌｙ／Ｓｅｒスペーサが続いた（表２）。加えて、位置２４３の付加プロリンまたは位置２４３、２４４、および２４５それぞれの付加プロリン、アラニン、プロリンのどちらかと組合された、位置２３９または２４２のシステインを置換したセリンアミノ酸残基より成る、新規な結合ペプチドが設計された（Ｋａｂａｔ番号付けシステム）。Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５およびＰｒｏ２４３結合ペプチドも作製された。ＩｇＧ１ヒンジの第１の残基（位置２２６、Ｋａｂａｔ番号付けシステム）から開始し、ヒンジ／ＧｌｙＳｅｒ結合ペプチドの最後の残基までの親ＣＨ２ドメイン欠失ヒト化ＣＣ４９結合ペプチドのアミノ酸配列を表２に示す。Ｋａｂａｔ番号付けシステムで示したシステイン残基の位置を用いたＣＣ４９への配列比較による、各種の結合ペプチド設計も示す。
表２：ヒンジ領域結合ペプチド配列
Figure 2008526234
 表３：ＩｇＧ１、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４ヒンジ領域
Figure 2008526234
 （実施例３）
結合ポリペプチドの構築およびアイソフォームの優先的合成
表２に示すヒンジ領域結合ペプチドをコードする核酸配列は、ＣＨ２ドメイン欠失ｈｕＣＣ４９遺伝子配列内にＳｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ Ｏｖｅｒｌａｐ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ（ＳＯＥ）法を使用して導入した（Ｈｏｒｔｏｎ，Ｒ．Ｍ．１９９３ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ １５：ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｅｄ．Ｂ．Ａ．Ｗｈｉｔｅ）。ヒンジ領域への正確な修飾はＤＮＡ配列解析によって確認した。プラスミドＤＮＡを使用して、抗体タンパク質の安定産生のためにＣＨＯ ＤＧ４４細胞を形質転換した。
表２に示した８つの設計された合成結合ペプチドを含有するＣＨ２ドメイン欠失ｈｕＣＣ４９抗体を構築して、ＣＨＯ ＤＧ４４細胞内で抗体を産生した。上澄みを単離細胞系から回収して、培養物上澄み中の抗体濃度はイムノアッセイによって決定した。各細胞系からの全抗体タンパク質０〜３０ｎｇの範囲の抗体を含有する上澄みは、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動と、それに続く抗ヒトカッパＨＲＰ接合抗体を用いたウェスタンブロットによって解析して、ＣＨ２ドメイン欠失ｈｕＣＣ４９フォームＡおよびフォームＢアイソフォームを検出した。これらの条件下では、フォームＡは単一の１２０ｋＤａホモダイマーとして、フォームＢは６０ｋＤａ二重項として移動する。カッパ鎖モノマーおよびダイマーも見られる。配列番号：５、２６、３２、および３３で示す結合ペプチドは、産生されたフォームＡの割合を上昇させることがすべて見出された。これらの結果は、フォームＡ ＣＨ２ドメイン欠失ｈｕＣＣ４９抗体の産生において、フォームＢがわずかに検出されるか、検出されずに、Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］（配列番号：５）およびＧ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］（配列番号：２６）ヒンジの両方が、完全でないにしても、主として生じたことを示した。対照的に、ＣＨ２ドメイン欠失ｈｕＣＣ４９Ｃｙｓ２４２Ｓｅｒ：Ｐｒｏ２４３（配列番号：３０）およびＣＨ２ドメイン欠失ｈｕＣＣ４９Ｃｙｓ２４２Ｓｅｒ：Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５（配列番号：３２）はそれぞれ、フォームＢアイソフォームの中程度からかなりの優先度をもたらした。
ｈｕＣＣ４９抗体配列に導入されたＰｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］（配列番号：３２）およびＧ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］（配列番号：５）結合ペプチドを含有する細胞系を抗体産生に使用した。Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］およびＧ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］結合ペプチドは、ｈｕＣＣ４９ Ｖ２抗体配列にも導入され、細胞系が産生された（ヒト化ＣＣ４９バージョン２配列は当分野で公知である）。抗体はＣＨＯ ＤＧ４４細胞から産生して、下の実施例４で述べる方法を使用して精製した。タンパク質ＧおよびＨＩＣステップ後のフォームＡアイソフォームの収率を表４で報告する。これらの結果から、ＣＨ２ドメイン欠失抗体内のヒンジ領域に導入された修飾は、Ａアイソフォームの優先的合成をもたらすことが明らかである。実施例４で述べたＨＩＣ精製技法の後に、精製ｈｕＣＣ４９ Ｐｒｏ２３０Ａｌａ２３１Ｐｒｏ２３２およびｈｕＣＣ４９ Ｖ２ Ｐｒｏ２３０Ａｌａ２３１Ｐｒｏ２３２フォームＡ物質は、９８％を超える値で達成された。ｈｕＣＣ４９ Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５およびｈｕＣＣ４９ Ｖ２ Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５フォームＡ物質は、タンパク質Ｇカラムのみを使用して精製され、どちらもさらなるＨＩＣ精製をせずに純度＞９６％にて本質的に単一ピークとして溶離した。すべての抗体をサイズ排除クロマトグラフィーによって検査すると、単一ピークとして溶離することが見出され、抗体生成物の著しい凝集または分解がないことが示された。
ペプチドマッピングを使用して、ＣＨ２ドメイン欠失ｈｕＣＣ４９、ｈｕＣＣ４９ ＰＡＰ、およびｈｕＣＣ４９ Ｇ１／Ｇ３／ ＰＡＰ抗体の重鎖ヒンジ領域におけるジスルフィド結合形成の完全性を判定した。ＣＨ２ドメイン欠失ＣＣ４９抗体のサンプルは、次のように変性、還元およびトリプシンによって消化した：１５０ｕｇの分割量をＨＰＬＣ水で１００ｍｌまで希釈して、６Ｍ塩酸グアニジン、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０中で変性させた。２０ｍＭ ＤＴＴの添加によってサンプルを還元して、３７℃にて３０分間インキュベートした。還元したサンプルを５０ｍＭヨード酢酸によって３７℃にて３０分間アルキル化した。アルキル化反応は、過剰なＤＴＴの添加によって停止させた。還元およびアルキル化されたサンプルは、２５ｍＭ ＴＲＩＳ、２０ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ７．５中へ、ＰＤ−１０カラムを使用して緩衝液交換した。トリプシンを各サンプルに１：１５（ｗ／ｗ）の比で添加して、３７℃にて４時間インキュベートした。０．１％の最終濃度までのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の添加によって、消化を停止させた。トリプシン消化サンプル（１５ｕｇ）を次に、下で述べるクロマトグラフィー条件に従って解析した。
ＣＨ２ドメイン欠失ＣＣ４９抗体のサンプルは、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ消化によって解析した。変性および還元されたサンプルは、４ＭグアニジンＨＣｌおよび２５ｍＭ ＤＴＴの最終濃度をサンプルの１．５ｍｇ／ｍＬまで添加することによって調製した。非還元サンプルは、４ＭグアジニンＨＣｌの最終濃度をサンプルの１．５ｍｇ／ｍＬまで添加することによって調製した。サンプルは３７℃にて２時間インキュベートした。消化緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０および０．０６２ＡＵ／ｍｌエンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ）を次にサンプルに１：１（ｖ／ｖ）で添加して、サンプルを３７℃にて１５時間インキュベートした。１５時間後、酵素の第２の分割量（０．２９ｍＡＵ：ｕｇ抗体）を添加して、サンプルを３７℃にてさらに６時間インキュベートした。ＴＦＡを０．１％最終濃度で添加した。非還元および還元エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ消化サンプル（１２ｕｇ）は次に、下で述べる手順に従って解析した。
ＨＰＬＣ／質量分析法解析。サンプルはＡｇｉｌｅｎｔ ＭＳＤシングル四重極質量分析計に接続されたＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣシステムで解析した。逆相Ｃ１８カラム（Ｖｙｄａｃ ｃａｔａｌｏｇ ｎｕｍｂｅｒ ２１８ＴＰ５２）を水／０．１％ ＴＦＡ（ｖ／ｖ）（緩衝液Ａ）およびアセトニトリル／０．１％ ＴＦＡ（ｖ／ｖ）（緩衝液Ｂ）の溶離液系によって０．２ｍＬ／分の流速にて使用した。イオン化を向上させるために、アセトニトリルおよび酢酸（１：１ ｖ／ｖ）のポストカラム「ＴＦＡ ｆｉｘａｔｉｖｅ」溶液を０．１ｍＬ／分にて添加した。カラム温度を４５℃に制御して、溶離プロフィールを２１５および２８０ｎｍにて監視した。全イオンクロマトグラムを陽イオンモードで監視した。サンプルをカラムに注入して、勾配を０％緩衝液Ｂにて５分間維持した。溶離は０〜５０％緩衝液Ｂの線形勾配を用いて１２５分間に亘って達成され、１０分間に亘る７５％緩衝液Ｂの洗浄および３０分間に亘る０％緩衝液Ｂの再平衡が続いた。
ｅｎｄｏ Ｌｙｓ−Ｃ還元解析において、断片（Ｌ５２〜１０９）はすべてのサンプルで検出されなかった。この断片は非常に疎水性であり、強力な相互作用のためにカラムマトリクスから溶離されなかったのだろう。相当するトリプシン断片（Ｌ６８〜１０９）もすべてのサンプルで検出されなかった。これらの断片は多数のアミノ酸を含有するため、アミノ酸同一性のパーセントは〜８９％同一性まで低下した。加えた断片（Ｌ６８〜１１１９）はＧ１／Ｇ３／ＰＡＰのｅｎｄｏ Ｌｙｓ−Ｃ解析で検出されず、同一性を〜７９％に下げた。
ｅｎｄｏ Ｌｙｓ−Ｃ非還元解析はより優れた結果を与えた。断片（Ｌ５２〜１０９）はすべてのサンプルで断片（Ｌ１〜２４）を備えたジスルフィド結合として検出された。他のすべてのジスルフィド結合が検出され、全アミノ酸同一性％はすべてのサンプルで〜９９％であった。Ｇ１／Ｇ３／ＰＡＰサンプルは、元の（Ｈ２２４〜２２７）ＣＰＰＣヒンジ領域の下の、断片（Ｈ２３２〜２７５）内に追加の重鎖−重鎖ジスルフィド結合を示した。組換えヒンジ領域ペプチドの理論質量値および実測質量値を測定した。ｈｕＣＣ４９ΔＣＨ２ヒンジｅｎｄｏ Ｌｙｓ−Ｃ非還元ペプチド（残基Ｈ２２１〜２５７）は、７４１９．４の実測ＭＷを有し、２個の鎖内ジスルフィドブリッジを含有する連結ヒンジの７４１９．４ｇ／ｍｏｌの計算質量とうまく一致した。ｈｕＣＣ４９ΔＣＨ２ ＰＡＰヒンジｅｎｄｏ Ｌｙｓ−Ｃ非還元ペプチド（残基Ｈ２２１〜２６０）は７９４９．７の実測ＭＷを有し、２個の鎖内ジスルフィドブリッジを含有する連結ヒンジの７９４９．８ｇ／ｍｏｌの計算質量と良好に一致した。２個のヒンジ非還元ペプチド断片は、１５アミノ酸γ３モチーフ内のＫａｂａｔ位置２４１ＩＩにおけるリジン残基の存在のために、ｅｎｄｏ Ｌｙｓ−ＣによるｈｕＣＣ４９ΔＣＨ２ Ｇ１／Ｇ３／ＰＡＰの消化から生じた。残基Ｈ２２１〜２３１およびＨ２３２〜２７５のペプチド断片は２４１４．３および８７８２．６実測ＭＷを有し、２４１３．０および８７８２．０ｇ／ｍｏｌの計算質量にそれぞれ非常に良好に一致した。質量データは、ｈｕＣＣ４９ΔＣＨ２ Ｇ１／Ｇ３／ＰＡＰに由来するＴＨＴＣＰＰＣＰＥＰＫペプチド（残基Ｈ２２１〜２３１）が２個の鎖内ジスルフィドブリッジを含有するという主張を裏付けている。重要なことに、残基Ｈ２３２〜２７５を含むペプチドが少なくとも１個の鎖内ジスルフィドブリッジを含有しており、キメラＧ１／Ｇ３／ＰＡＰヒンジが２個を超えるジスルフィドブリッジの形成に関与しているという考えと一致している。これらの解析は、ｈｕＣＣ４９ΔＣＨ２ ＰＡＰ ヒンジが２個の重鎖鎖間ジスルフィド結合を形成することを示す。ｈｕＣＣ４９ΔＣＨ２ Ｇ１／Ｇ３／ＰＡＰヒンジが少なくとも３個の重鎖鎖間ジスルフィド結合を形成するが、おそらく５個を形成する。断片ｈｕＣＣ４９ΔＣＨ２ Ｇ１／Ｇ３／ＰＡＰ残基のＨ２３２〜２７５が最小限で１個の鎖間ジスルフィド結合を含有することは確実であるが、しかしながら３個の鎖間ジスルフィド結合を含有するヒンジ領域の、１個の鎖内および２個の鎖間ジスルフィド結合を含有するヒンジ領域からの質量差を区別することは不可能である。
表４．親和性クロマトグラフィー（タンパク質Ｇ）後およびＨＩＣ精製後のフォームＡ抗体のパーセンテージ
Figure 2008526234
 これらのデータは、新規な組換え合成ヒンジ領域結合ペプチドが、ＡまたはＢアイソフォームの形成を優先的に支持するために使用できることを示す。これらの試験は、ＣＨ２ドメイン欠失抗体フォームＡアイソフォームを合成するときの、位置２４２（Ｋａｂａｔ番号付けシステム）のシステイン残基の重要性も明らかにする。したがって１つの実施形態において、本発明の結合ペプチドは、位置２３９または２４２の少なくとも１つにシステインを含む。位置２３９または２４２のどちらかでシステインをセリンで置換すると（たとえば配列番号：２８、２９、３０、または３１で示す結合ペプチドを使用して）、ＣＨ２ドメイン欠失抗体生合成をフォームＢアイソフォームに変化させる。産生されたフォームＡの割合を上昇させる結合ペプチドの使用は、プロセスに有益な改善、収率および／または安定性をもたらすであろう。これらの合成ヒンジ領域結合ペプチドは、４つすべてのヒトアイソタイプのＣＨ３ドメイン間でのきわめて高い相同性度に基づく、いずれかの抗体アイソタイプ、たとえばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のＣＨ２ドメイン欠失抗体フォームＡアイソフォームの好都合な合成に有用である。同一および保存アミノ酸残基を含めて、ＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ２ ＣＨ３に対して９８．１３％相同であり、ＩｇＧ３ ＣＨ３に対して９７．２０％相同であり、ＩｇＧ４ ＣＨ３に対して９６．２６％相同である。
（実施例４）
両方のアイソフォームを含有するモノクローナル抗体混合物からフォームＡおよびフォームＢの精製
ｄｄＣＣ４９上澄み１０ｍＬを１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ９．０によって最終ｐＨ７．５まで滴定した。この物質を一連のＳｏｌ−Ｖａｃ ０．８μおよび０．４μ膜で濾過した。１００ｍＬ ＸＫ５０タンパク質Ｇカラムを流速８０ｍｌ／分にて１ｘＰＢＳによって予備平衡させた。滴定して、濾過した上澄みをカラムに８０ｍｌ／分にて添加した。結合タンパク質を２カラム体積分の平衡緩衝液によって洗浄して、次にｐＨ３．０の１００ｍＭグリシンによって溶離させた。ｄｄＣＣ４９ピークを含有する画分を収集して、１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ９．０で最終ｐＨ７．０までただちに滴定した。
Ｔｏｓｏ Ｂｉｏｓｅｐ Ｐｈｅｎｙｌ ５ＰＷ−ＨＲカラムを２０ｍＭホスフェートｐＨ７．２；１Ｍ硫酸アンモニウムによって予備平衡させた。タンパク質Ｇ溶離物は３．５Ｍ硫酸アンモニウムｐＨ７．２ストックを使用して１Ｍ硫酸アンモニウムまで滴定し、ゲル床２ｍｇ／ｍｌの濃度まで添加した。結合タンパク質を２０ｍＭホスフェートｐＨ４または７．２硫酸アンモニウムによって洗浄して、伝導率を１１６．４ｍＳ／ｃｍに調整した。この条件から溶離した物質は、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで見かけの分子量約１２０ｋＤ（フォームＡ）を有していた。残りの結合抗体は、ホスフェート緩衝液中の減少する硫酸アンモニウム含有率の線形勾配によってさらに溶離させた。後者の溶離抗体は重鎖のジスルフィド結合を明らかに欠いており、その分子量は約６０ｋＤａである（フォームＢ）。
上の精製物質はどちらも硫酸アンモニウム濃度を１Ｍにして、それを清掃したＰｈｅｎｙｌ ５ＰＷ−ＨＲカラムに再添加することによって再捕捉できる。結合タンパク質は、２０ｍＭホスフェートｐＨ７．２で溶離させて、１ｘＰＢＳ中へ透析させる。
（実施例５）
フォームＡおよびフォームＢの安定性の比較
フォームＡおよびＢの生物活性（たとえば直接結合または競合試験を使用して、予備実験で測定されたような）は、フォームＡおよびＢが同様の生物活性を有することを明らかにした。
フォームＡおよびＢの安定性も比較した。精製したｄｄＣＣ４９分子をＹＭ３０膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を装着したＡｍｉｃｏｎ濃縮器によって約５ｍｇ／ｍｌに濃縮した。濃縮物質は各アイソフォームについて４つの部分に等しく分割され、各画分を次の緩衝液：１）１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ３；２）１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５；３）１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７；および４）１０ｍＭホウ酸ナトリウム、ｐＨ９中の、１６時間透析用の１ＯＫ透析カセット（Ｐｉｅｒｃｅ，ｃａｔ＃６６４１０）に入れた。透析後、各溶液のタンパク質濃度を３ｍｇ／ｍｌに調整した。純粋なＡおよびＢアイソフォーム溶液に加えて、各ｐＨからのＡおよびＢ溶液の一部を混合して、５０％各のアイソフォームを含有する混合物を作製する。合計１２個の調合物を作製した（４つのｐＨレベルｘ３つの抗体溶液）。溶液を濾過して、灰色ブチルストッパの付いた３ｍｌタイプ１ガラス血清バイアルに充填した（Ｗｅｓｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）。
３つの温度２〜８℃、２０〜２５℃、および３８〜４２℃を選択して、タンパク質溶液を安定性試験のために貯蔵した。貯蔵の前に、サンプル５００μｌを物理および化学分析のために各調合物から採取して、これらのゼロ時点データを対照と呼んだ。いったん貯蔵したら、サンプルを次のスケジュール、２週間、１ヶ月、２ヶ月および３ヶ月で採取して、試験のためにただちに提出した。
２つのアイソフォームの物理および化学安定性を評価するために、次の方法を使用した：ＯＤ３２０にて測定した濁度、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、およびサイズ排除クロマトグラフィー。
非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、２〜８℃、２０〜２５℃および３８〜４２℃にて貯蔵したサンプルに各種の時点で実施した。ＡおよびＢフォームは２〜８℃で貯蔵したときにはｐＨ５にてどちらも比較的安定であった。しかしながらｐＨ７および９で調合したとき、ＡおよびＢフォームはどちらも元の主要バンド（フォームＡは１２０ｋＤａ、フォームＢは６０ｋＤａ）よりも少ないバンドの数を増加させることによって示されるように、分解を示した。特に低温および中間温度で貯蔵されたｐＨ７および９サンプルでは、５５ｋＤａ未満であったバンドの強度および数は、ＡよりもＢアイソフォームで高いことが認められた。このことは、これらの条件下でＡアイソフォームがＢアイソフォームよりも安定であることを示した。しかしながらこれはｐＨ５で２０〜２５℃にて貯蔵されたＡアイソフォームの場合ではないと思われる。このサンプルは、Ｂアイソフォームよりも多くの断片を有すると思われる。微生物汚染による人為現象であったと思われる（以下でさらに詳細に述べる）。高い貯蔵温度ではｐＨ９にてどちらのフォームも著しく分解され、サンプル間のゲルパターンにはほとんど相違がない。この条件下で、微量のスメアバンドがゲルの上部に現れ、これは凝集体の形成を示していた。凝集体はＳＤＳによって溶解できるため、次の節で述べる方法を使用して凝集を調査できる。
表５Ａ〜表５Ｃは、３つの異なる温度で貯蔵されたｄｄＣＣ４９の濁度データを示す。濁度は溶解性および不溶性凝集体の両方を測定し、それはこれらの粒子によって散乱された光の量に基づいている。存在する場合、凝集体は光を散乱して、Ａ３２０の増加を生じさせる。表５Ａ〜Ｃに示すように、２〜８℃で貯蔵されたｄｄＣＣ４９分子の濁度は、ＡおよびＢアイソフォームの両方でｐＨが上昇すると上昇し、前者が後者よりも濁度が低い。この傾向はより高温（２０〜２５℃および３８〜４０℃）にて１ヶ月未満貯蔵されたサンプルに当てはまった。貯蔵時間が３ヶ月に達すると、ｐＨおよび温度のサンプルでは濁度が著しく上昇して、ＡおよびＢフォーム間の相違は縮小する。これらの結果はＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果と一致しており、両方のアイソフォームはｐＨ３〜５にて比較的安定である（凝集体を形成しないという点で）ことと、ＡアイソフォームがＢアイソフォームよりも凝集を受けにくいことを示している。
表５Ａ．２〜８℃で貯蔵したｄｄＣＣ４９サンプルのＡ３２０にて測定した濁度
Figure 2008526234
 表５Ｂ．２０〜２５℃で貯蔵したｄｄＣＣ４９サンプルのＡ３２０にて測定した濁度濁度
Figure 2008526234
 表５Ｃ．３８〜４２℃で貯蔵したｄｄＣＣ４９サンプルのＡ３２０にて測定した濁度濁度
Figure 2008526234
 サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、無傷の分子および分解生成物（断片および溶解性凝集体の両方）のパーセントを明らかにする強力な方法であり、非常に再現性である。表５Ａ〜Ｃには、異なる温度で貯蔵したＡアイソフォーム、Ｂアイソフォームおよび混合物の無傷のモノマーのパーセントを挙げる。２〜８℃で貯蔵したサンプルでは、フォームＡはフォームＢと比較してモノマーのより高いパーセンテージを有することが明らかであり、フォームＡおよびフォームＢの混合物はおおよそその間である。この貯蔵温度では、どちらのフォームもｐＨ３、５および７（ｐＨ５が最も安定な条件であった）において、約３ヶ月間に亘って比較的安定であった。しかしながらｐＨ９では、フォームＢのモノマーのパーセンテージには著しい低下があったが、フォームＡではわずかな低下のみであった。高温において、貯蔵時間が長くなるにつれて、すべてのサンプルがモノマーのパーセントの著しい低下を示した；ＡアイソフォームはＢアイソフォームより性能が優れていた。しかしながら例外があり、室温にて貯蔵したｐＨ５のＡアイソフォームのサンプルは、同様の貯蔵条件下のＢアイソフォームまたは混合物よりもはるかに多くの分解を示した。この特定のＡアイソフォームバイアルを綿密に調査すると、サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ、およびＳＥＣによるデータは、微生物汚染がこの予想外の結果を引き起こしたかもしれないことを示唆した。第１にＳＥＣおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果がどちらも、このサンプルの分解が主として、おそらく微生物消化から生じる断片化の増加によって説明される、そうでなければある程度の凝集の増加が予想されることを示した。第２に、ＡおよびＢアイソフォームそれぞれを５０％含有した混合物サンプルが、Ｂアイソフォームよりも良好な安定性プロフィールを示したという事実は、より安定なＡアイソフォームがモノマーのより高いパーセントに寄与したに違いないことを示している。最後に、２〜８℃および３８〜４２℃の両方で貯蔵されたｐＨ５のＡアイソフォームは、同様の条件下でＢアイソフォームよりもモノマーの高いパーセントを示した。したがって中間貯蔵温度は、同様の結果を生じたはずである。サンプル量の制限のために、微生物汚染に関するアッセイは実施できなかった。
高いｐＨ（９）および４０℃で貯蔵されたＩＤＥＣ−１５９のアイソフォームの両方について、モノマーのパーセントが約３０％に低下したことにも注目した。このような厳しい条件下で、２つのアイソフォーム間の安定性の相違は消滅した。このＳＥＣ結果は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して見出された結果を反映している。どちらの結果も、一部の化学的および物理的特徴が２つのアイソフォーム間で異なっているが、両方のアイソフォームの分解機構および副生成物は同一でないにしても同様であることを示した。
要約すれば、ＳＥＣ結果は、ＡおよびＢアイソフォームの両方が約５の最適ｐＨを有することと、Ａアイソフォームが、同様の貯蔵条件下で無傷のモノマーをより高いパーセントで維持するという点でＢアイソフォームよりも安定であることを示す。
表６Ａ．２〜８℃で貯蔵されたｄｄＣＣ４９サンプルのモノマーのパーセンテージ
Figure 2008526234
 表６Ｂ．２０〜２５℃で貯蔵されたｄｄＣＣ４９サンプルのモノマーのパーセンテージ
Figure 2008526234
 表６Ｃ．３８〜４２℃で貯蔵されたｄｄＣＣ４９サンプルのモノマーのパーセンテージ
Figure 2008526234
 （実施例６）
フォームＡおよびＢの分取精製
ＩＤＥＣ−１５９（ｄｄＣＣ４９）は、腫瘍表面に発現されるＴＡＧ−７２抗原に対して作られたＣＨ２ドメイン欠失モノクローナル抗体である。ＩＤＥＣ−１５９は、フォームＡおよびフォームＢと呼ばれる抗体の２つのアイソフォームを含有する。ＩＤＥＣ−１５９の現在の細胞培養プロセスは、フォームＡのフォームＢに対する約５０：５０の比を生じる。フォームＡアイソフォームは、重鎖のＦｃ部分における欠失ＣＨ２領域のある抗体である。欠失ＣＨ２領域を有することに加えて、フォームＢはＦｃ領域でのジスルフィド結合リンケージも欠いており、疎水性相互作用および塩ブリッジによってのみ結合される。
ＩＤＥＣ−１５９精製プロセスにおける第３および最後のクロマトグラフィープロセスは、ＩＤＥＣ−１５９の２つのアイソフォームを分離するために開発された。分離は疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によって、Ｐｈｅｎｙｌ ＴＳＫｇｅｌ ５ＰＷ−ＨＲ吸着剤を使用して達成する。フォームＢはフォームＡよりも疎水性であるため、それは約０．７３Ｍ硫酸アンモニウム／２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ４．０〜ｐＨ７．０を移動相として使用して、固定相に不可逆的に吸着する。フォームＡはこれらの条件下ではより低い程度で固定相に結合し、したがって定組成で溶離して、すなわちそれはカラムに貫流画分を残す。フォームＡの定組成溶離に続いて、移動相から硫酸アンモニウムを除去すると、フォームＢが脱着される。次の方法はＩＤＥＣ−１５９の２つのアイソフォームを分離するために使用した：
・カラムは、≦１５０ｃｍ／時にて、≧３ＣＶの０．５Ｎ ＮａＯＨを使用して消毒した。
・カラムは、≦１５０ｃｍ／時にて、≧５ＣＶの０．７３Ｍ硫酸アンモニウム／２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ４．０を使用して平衡にした。
・カラムに、０．４３体積の２．５Ｍ硫酸アンモニウム／２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ４．０の液体原液を含むように調整された室温ＴＭＡＥ貫流を、５ｍｇ／樹脂ｍｌで添加した。抗体は、≦１００ｃｍ／時でｐＨ４．０にてカラムに添加した。２８０ｎｍの出口Ｏ．Ｄ．が１０ｍＡＵに達するときに抗体の収集を開始した。
・カラムは、１５ＣＶの０．７３Ｍ硫酸アンモニウム／２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ４．０を≦１００ｃｍ／時で使用して洗浄した。１５ＣＶ洗浄の間、抗体収集を継続して、次に出口を再度廃棄に方向転換した。
・カラムは、５ＣＶの２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ４．０を≦１００ｃｍ／時で使用してストリッピングした。６．カラムを≧３ＣＶの０．５Ｎ ＮａＯＨによって≦１５０ｃｍ／時にて洗浄した。
・カラムを≧３ＣＶの０．７３Ｍ硫酸アンモニウム／２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ４．０で≦１５０ｃｍ／時で平衡にした。
・カラムは、＞３ＣＶの２０％エタノール中に≧１５０ｃｍ／時で貯蔵した。
分取スケール（５Ｌカラム体積、全ＩＤＥＣ−１５９添加量約２０ｇ）での２つのフォームの分離を実施した。第１の２つのピークはフォームＡの定組成溶離を含み、第２のピークは溶離したフォームＢを示すのに対して、第３のピークは不純物を含有しており、不純物は洗浄の間に固定相から除去される。
この方法がフォームＡおよびＢを分取スケールで分離する能力も、ＳＤＳ ＰＡＧＥによって証明された。０．７３Ｍ硫酸アンモニウム／２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ４．０を使用して定組成で溶離された画分（レーン６〜８）は、フォームＡを優先的に含有していた（純度＞９０％）。
（実施例７）
モノクローナル抗体ＣＣ４９のヒト化
ヒト化ＣＣ４９バージョン２（ｈｕＣＣ４９ Ｖ２）を作製するために、ＣＣ４９抗体に複数の変更を行った。ヒト化ＣＣ４９ＭＡｂの潜在的な免疫原性をさらに低下させるために、抗体内に存在するマウス残基を、軽鎖置換用のヒトアクセプタ配列ＬＥＮおよび重鎖置換用の２１／２８’ＣＬに由来するヒトフレームワーク残基との置換えについて調査および検討した（Ｓｉｎｇｅｒ ＩＩら、１９９３．Ｏｐｔｉｍａｌ Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ １Ｂ４，ａｎ Ａｎｔｉ−ＣＤ１８ Ｍｕｒｉｎｅ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ，ｉｓ Ａｃｈｉｅｖｅｄ ｂｙ Ｃｏｒｒｅｃｔ Ｃｈｏｉｃｅ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｖ−Ｒｅｇｉｏｎ Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：２８４４−２８５７．Ｐａｄｌａｎ Ｅ Ａ，１９９１．Ｐｏｓｓｉｂｌｅ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ Ｆｏｒ Ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｄｏｍａｉｎｓ Ｗｈｉｌｅ Ｐｒｅｓｅｒｖｉｎｇ Ｔｈｅｉｒ Ｌｉｇａｎｄ−Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９−４９８）。
組合せ部位の特異性および親和性を保存するために重要であると見なされるフレームワーク残基は、わずかな相違を明らかにしただけであった。重鎖配列では、位置６９（ロイシン）および９３（トレオニン）における予測された埋没残基はどちらも、ヒト残基イソロイシンおよびアラニンによってそれぞれ置換された。軽鎖配列では、位置４３（セリン）にほぼ埋没されることが予測される１個の残基がヒト残基プロリンによって置換される。
Ｖ２ ＣＣ４９抗体のドメイン欠失形が作製され、結合ペプチドはｈｕＣＣ４９ Ｖ２配列に挿入される。Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］ヒンジ結合ペプチドを含有するＣＨ２ドメイン欠失ｈｕＣＣ４９ Ｖ２は、ＣＨ２ドメイン欠失ｈｕＣＣ４９ Ｖ２と同様に作製された。
（実施例８）
新規な結合ペプチドを含む抗体の向上した体内分布プロフィール
ドメイン欠失抗体の各種の形（結合ペプチドを含む、そして含まない）を、時間分解蛍光分光イムノアッセイによって、Ｗａｌｌａｃ １４２０ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ Ｖｉｃｔｏｒ Ｖ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して、ＴＡＧ−７２抗原の供給源であるウシ顎下ムチンに結合するその能力に関する競合的結合アッセイで試験した。ｈｕＣＣ４９ ＰＡＰ（配列番号：３２で示す結合ペプチドを含有）、ｈｕＣＣ４９ Ｖ２ ＰＡＰ（配列番号：３２で示す結合ペプチドを含有）、ｈｕＣＣ４９ Ｇ１／Ｇ３：ＰＡＰ（配列番号：５で示す結合ペプチドを含有）、ｈｕＣＣ４９ Ｖ２ Ｇ１／Ｇ３／ＰＡＰ（配列番号：５で示す結合ペプチドを含有）、および対照親ＨｕＣＣ４９抗体を評価した。３つすべてのヒンジ組換え抗体の相対結合活性は区別ができないか、または対照親ＣＣ４９抗体の２〜３倍以内であった。
９０Ｙ−２−（ｐ−イソチオシアナートベンジル）（ｐ−ＳＣＮ−Ｂｚ）−シクロヘキシルジエチレントリアミンペンタ酢酸リガンド（ＣＨｘ−ＤＴＰＡ）接合ｈｕＣＣ４９ Ｖ２ ＰＡＰ（配列番号：３２で示す結合ペプチドを含有）および対照親ＨｕＣＣ４９抗体の体内分布をＬＳ−１７４Ｔヒト腫瘍異種移植片を持つ胸腺欠損マウスで評価および比較した。腫瘍または正常組織１グラム当たりの９０Ｙ放射性標識化抗体の注射用量のパーセンテージ（％ＩＤ）を３および２４時間後に決定し、表７に示す。
表７．
Figure 2008526234
 データは平均値＋／−標準偏差を表す。
＊腫瘍中の２４時間時点ｈｕＣＣ４９と比較した、ｐ＜０．０５対応のないｔ検定
＊＊腎臓中の２４時間時点ｈｕＣＣ４９と比較した、ｐ＜０．００１対応のないｔ検定
驚くべきことに、２４時間時点ｈｕＣＣ４９ Ｖ２ ＰＡＰ摂取量は腫瘍において著しく高く（ｐ＜０．０５対応のないｔ検定）、反対に腎臓では（ｐ＜０．０１）対照ｈｕＣＣ４９抗体よりも低かった。これらの抗体の腫瘍対臓器比を比較したときに、ｈｕＣＣ４９ Ｖ２ ＰＡＰは、血液を除くすべての臓器でより高い腫瘍対臓器比を生じた。
これらの結果は、これらの新規なヒンジが腫瘍局在化にプラスに影響して、腎臓などの正常臓器による摂取量を減少させる、固体に対する構造的変化を付与することを示唆している。それゆえこれらの新規なヒンジは、治療用抗体に組み込まれたときに特に有用である。
（実施例９）
新規な結合ペプチドを含む抗体の向上した体内分布プロフィール：詳細な時間経過
本実施例は、実施例８に示した結果を確認および拡張する。抗体ヒトＣＣ４９ Ｖ２ Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］（配列番号：５）およびｈｕＣＣ４９（ｇｌｙ／ｓｅｒ）をダイアフィルトレーションし、低金属５ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５（ＬＭＢ）中に予備すすぎ済みのＡｍｉｃｏｎ Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ ３０を使用して濃縮した。Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎの遠心分離は、２〜８℃の温度で保持した固定角ロータで５０００ｘｇにて実施した。ＬＭＢ ５０μｌをサンプルリザーバに添加して、短時間ボルテックスにかけ、１０００ｘｇで１０分間バックスピンすることによって、各抗体を回収した。タンパク質濃度はＵＶ Ｓｐｅｃ解析を２８０ｎｍにて、１．４８の吸光係数を使用して決定した。次にＬＭＢを使用して、各抗体を１０．５ｍｇ／ｍｌに調整した。
１．０Ｍホウ酸（ｐＨ８．６、Ｃｈｅｌｅｘ処理および０．２μｍ濾過）を使用して、抗体をｐＨ８．６に調整した。ＣＨｘ−ＤＴＰＡ（１．０Ｍホウ酸に溶解）を次に３キレート対抗体１モルのモル比で添加した。添加したホウ酸の量は、抗体体積の１０分の１であった。この混合物を次にボルテックスにかけて、室温にて１６〜１８時間インキュベートした。混合物を新しい予備すすぎ済みＣｅｎｔｒｉｃｏｎ ３０に添加して反応を停止させ、前のダイアフィルトレーションに従って低金属５ｍＭ酢酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ５中でダイアフィルトレーションした。各抗体の濃度を３μｇ／ｍＬに調整した。
メスヌードマウスにＨＢＳＳ（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｃａｔ＃ １０−５４７Ｆ）に懸濁させたＬＳ１７４Ｔ細胞を右大腿部内側に皮下接種した。試験開始の１日前に腫瘍サイズを測定した。腫瘍体積は長さに幅の２乗をかけることによって計算した［Ｌｘ（（Ｗ２）／２）］。平均腫瘍体積〜２００ｍｍ３を与えるようにマウスをグループ分けした。
ヌードマウス４２匹に１１１Ｉｎ標識ＣＨ２ドメイン欠失抗体を時間０にて注射した。試験は、７つの時点の経過での抗体の分布を追跡し、各時点はマウス６匹で構成された。尿は各マウスから、風袋を差し引いた紙の上でマウスを保持して、膀胱を圧搾して収集した。血液は「目出血」によって採取した（マウス当り約２００ｕｌ）。個々のマウスで、血液および尿サンプリング中に排泄された便は収集した。血液収集の後、マウスを頸椎脱臼により殺処分した。マウス６匹それぞれが殺処分されたら、他のサンプルを解剖によって収集した。各サンプル（皮膚を除く）を３％ホルマリンですすぎ、ペーパータオルで吸い取って、次に秤量した。すべてのサンプルは風袋を差し引いた紙を使用して秤量した。
サンプル収集の後、サンプルをホウケイ酸塩試験管に入れて、標識抗体の１：１０希釈より成る減衰対照と共にガンマカウンタでカウントした。各臓器または組織に関連する放射能の減衰対照に対するパーセント（％注射した用量／組織または臓器ｇ）を計算した。該実施例は、この新規の結合ペプチドを含む抗体分子が腎臓で蓄積の低下を、血液では著しい蓄積の上昇を、腫瘍では著しい蓄積の上昇を示すことを明らかにしている。このプロフィールは、生体内での安定性の上昇ならびに有効性および安全性を有するこれらの分子と一致している。
（実施例１０）
結合ペプチドを含む抗体が、還元剤に対する感受性を低下させた
該実施例は、ドメイン欠失ＣＣ４９ Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］（配列番号：５）が親ＣＣ４９と同様に、Ｇｌｙ−Ｓｅｒヒンジリンカを持つドメイン欠失ＣＣ４９よりも、グルタチオン（ＧＳＨ）還元に対してより安定であると思われることを証明する。
簡潔には、ｄｄＣＣ４９（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）、ｄｄＣＣ４９ Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］（配列番号：５）または親ＣＣ４９ ５０ｕｇを０、１、５または１０ｍＭ ＧＳＨと共に室温にて１時間インキュベートした。使用した反応緩衝液は、１００ｍＭ ＰＢＳ、ｐＨ７．２または１００ｍＭ酢酸ナトリウム、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ４．５を含む。ＧＳＨ処理抗体をＳＤＳと共に加熱して、４〜２０％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、非還元ゲルに添加した。添加されたサンプルは、定圧１２０ボルトで９０分間、室温にてゲル内を移動させた。タンパク質をクマシー染色して、ゲルを乾燥させた。
ドメイン欠失ＣＣ４９ Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］（配列番号：５）は親ＣＣ４９と同様に、Ｇｌｙ−Ｓｅｒヒンジリンカを持つドメイン欠失ＣＣ４９よりも、グルタチオン（ＧＳＨ）還元に対してより安定であると思われる。加えてｐＨ４．５の１００ｍＭ酢酸ナトリウムがドメイン欠失ＣＣ４９ Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］（配列番号：５）をＧＳＨ還元から、ｐＨ７．２の１００ｍＭ ＰＢＳと比較してさらに保護する。還元剤に対する感受性低下のこの予測外の観察は、Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］（配列番号：５）ヒンジ設計が、抗体の物理的完全性を維持しながら、薬物接合体を調製するために使用されるもの（たとえばＳＰＤＰリンカー）のような還元剤または放射性同位体を抗体に結合するための技法（たとえば９９ＭＴｃ）を使用する化学作用の使用を可能にすることを示唆する。Ｔ還元剤感受性に関するこの利点は、ＣＨ２ドメイン欠失構築物の薬物動態学的利点を変化させないように思われる（実施例９のマウス体内分布データを参照）。還元剤に対する感受性の低下も生体内安定性の向上を予測しうる。
（実施例１１）
結合ペプチドを含む抗ＣＤ２０抗体
ヒンジ領域結合ペプチドＧ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］（配列番号：５）をＣＨ２ドメイン欠失Ｃ２Ｂ８抗体内に実施例３で述べたように導入した。Ｃ２Ｂ８は、ヒト重鎖および軽鎖定常ドメインにそれぞれ融合されたマウス重鎖および軽鎖可変ドメインより成るキメラ抗ＣＤ２０モノクローナル抗体である。ヒンジ領域への正確な修飾は、ＤＮＡ配列解析によって確認した。プラスミドＤＮＡを使用して、抗体タンパク質の一過性産生のためにＣＨＯ ＤＧ４４細胞を形質転換した。
Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］結合ペプチドを含有するＣＨ２ドメイン欠失Ｃ２Ｂ８抗体を産生する細胞から上澄みを収集して、培養物上澄み中の抗体の濃度をイムノアッセイによって決定した。一過性細胞培養物からの全抗体タンパク質約３ｎｇを非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって、続いて抗ヒトＩｇＧ ＨＲＰ接合抗体を用いたウェスタンブロットによってＣＨ２ドメイン欠失ｈｕＣＣ４９ ＭＡｂと比較して、ＣＨ２ドメイン欠失ｈｕＣＣ４９フォームＡおよびフォームＢアイソフォームを検出した。これらの条件下では、フォームＡは単一の１２０ｋＤａホモダイマーとして、フォームＢは６０ｋＤａ二重項として移動する。配列番号：５で示す結合ペプチドの包含は、産生されたフォームＡの割合を実質的に上昇させることが見出された。結果は、Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］ヒンジ（配列番号：５）が、フォームＢがわずかに検出されるか、検出されずに、本質的にすべてのフォームＡＣＨ２ドメイン欠失Ｃ２Ｂ８抗体の産生を引き起こしたことを証明し、フォームＡアイソフォームを産生するためのこのヒンジの有用性が概して各種の特異性の抗体に利用できることを証明した。
（実施例１２）
結合ペプチドを含む抗ＣＤ２３抗体
ヒンジ領域結合ペプチドＧ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］（配列番号：５）を使用して、本質的に実施例３で述べたように、ＣＨ２ドメイン欠失５Ｅ８（５Ｅ８ΔＣＨ２）抗体を構築した。５Ｅ８は、ヒト重鎖および軽鎖定常ドメインにそれぞれ融合された霊長類重鎖および軽鎖可変ドメインより成るキメラ抗ＣＤ２３モノクローナル抗体である。ヒンジ領域への正確な修飾は、ＤＮＡ配列解析によって確認した。５Ｅ８軽鎖および重鎖の核酸およびアミノ酸配列は、当分野で公知である。プラスミドＤＮＡを使用して、抗体タンパク質の産生のためにＣＨＯ ＤＧ４４細胞を形質転換した。
５Ｅ８ΔＣＨ２抗体配列内に導入されたＧ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］（配列番号：５）結合ペプチドを含有する細胞系（ＩＡ７）を抗体産生に使用した。抗体は上の実施例４で述べた方法を使用して産生および精製した。５Ｅ８ΔＣＨ２ Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５抗体はタンパク質Ｇカラムのみを使用して精製し、≧９７％純度で本質的に単一ピークとしてさらなるＨＩＣ精製なしで溶離した。還元および非還元精製タンパク質サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって解析した。非還元条件下で、フォームＡは単一の１２０ｋＤａホモダイマーとして、フォームＢは６０ｋＤａ二重項として移動すると予測される。配列番号：５で示す結合ペプチドは、産生されたフォームＡの割合を実質的に上昇させることが見出された。この結果は、Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］ヒンジ（配列番号：５）が、フォームＢがわずかに検出されるか、検出されずに、本質的にすべてのフォームＡ ５Ｅ８ΔＣＨ２抗体の産生を引き起こしたことを示し（レーン２を参照）、フォームＡアイソフォームを産生するためのこのヒンジの有用性が概して各種の特異性の抗体に利用できることを証明する。５Ｅ８ΔＣＨ２ Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５抗体をサイズ排除クロマトグラフィーによって検査して、抗体生成物の著しい凝集または分解がないことを示す単一ピークとして溶離することが見出された。５Ｅ８ΔＣＨ２ Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５抗体をＥｕ標識５Ｅ８ ＩｇＧへのＣｙ５標識溶解性ＣＤ２３結合に関するＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）競合的結合アッセイで、Ｄｅｌｐｈｉａ蛍光光度計（Ｗａｌｌａｃ １４２０ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ Ｖｉｃｔｏｒ Ｖ，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用してさらに試験した。５Ｅ８ΔＣＨ２ Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５（配列番号：５で示した結合ペプチドを含有）、および対照親５Ｅ８ ＩｇＧ抗体を競合的結合アッセイで評価した。ヒンジ組換え抗体の相対結合結合は、対照親５Ｅ８ ＩｇＧ抗体から区別できなかった。これらの結果から、５Ｅ８ΔＣＨ２抗体へのヒンジ領域（配列番号：５で示した結合ペプチドを含有）の導入が完全な結合活性を保持しながらＡアイソフォームの優先的合成をもたらし、組換えヒンジの全体的な有用性を支持することが明らかである。
（実施例１３）
結合ペプチドを含むｃｈＢ３Ｆ６抗体
ヒンジ領域結合ペプチドＧ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］（配列番号：５）を使用して、本質的に実施例３で述べたようにＣＨ２ドメイン欠失キメラＢ３Ｆ６（ｃｈＢ３Ｆ６ΔＣＨ２）抗体を構築した。「ｃｈＢ３Ｆ６」は、ヒト重鎖および軽鎖定常ドメインにそれぞれ融合されたマウス重鎖および軽鎖可変ドメインより成るキメラ抗ＣＲＩＰＴＯモノクローナル抗体である。ヒンジ領域への正確な修飾は、ＤＮＡ配列解析によって確認した。ｃｈＢ３Ｆ６軽鎖および重鎖の核酸およびアミノ酸配列は、図１および２にそれぞれ示す。プラスミドＤＮＡを使用して、抗体タンパク質の産生のためにＣＨＯ ＤＧ４４細胞を形質転換した。
ｃｈＢ３Ｆ６ΔＣＨ２抗体配列に導入されたＧ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］（配列番号：５）結合ペプチドを含有する細胞系（３Ｃ７）を抗体産生に使用した。抗体は上の実施例４で述べた方法を使用して産生および精製した。ＣｈＢ３Ｆ６ΔＣＨ２ Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５抗体はタンパク質Ｇカラムのみを使用して精製し、≧９７％純度で本質的に単一ピークとしてさらなるＨＩＣ精製なしで溶離した。還元および非還元精製タンパク質サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって解析した。これらの条件下で、フォームＡは単一の１２０ｋＤａホモダイマーとして、フォームＢは６０ｋＤａ二重項として移動すると予測される。配列番号：５で示す結合ペプチドは、産生されたフォームＡの割合を実質的に上昇させることが見出された。この結果は、Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］ヒンジ（配列番号：５）が、フォームＢがわずかに検出されるか、検出されずに、本質的にすべてのフォームＡ ｃｈＢ３Ｆ６ΔＣＨ２抗体の産生を引き起こしたことを示し、フォームＡアイソフォームを産生するためのこのヒンジの有用性が概して各種の特異性の抗体に利用できることを証明する。ＣｈＢ３Ｆ６ΔＣＨ２ Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５抗体をサイズ排除クロマトグラフィーによって検査して、抗体生成物のわずかなまたは顕著ではない凝集または分解を示す、本質的に９３〜９８％モノマーの範囲の単一ピークとして溶離することが見出された。ＣｈＢ３Ｆ６ΔＣＨ２ Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５抗体をフローサイトメトリー競合的結合アッセイで、ＣＲＩＰＴＯ抗原の供給源であるＧＥＯ腫瘍細胞へのＦＩＴＣ標識Ｂ３Ｆ６ＩｇＧ結合を用いてさらに試験した。ＣｈＢ３Ｆ６ΔＣＨ２ Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５（配列番号：５で示した結合ペプチドを含有）競合的結合、およびｃｈＢ３Ｆ６ＩｇＧ抗体の２個の対照サンプルを評価した。ヒンジ組換え抗体の相対結合結合は、対照親ｃｈＢ３Ｆ６ＩｇＧ抗体から区別できなかった。これらの結果から、ｃｈＢ３Ｆ６ΔＣＨ２抗体へのヒンジ領域（配列番号：５で示した結合ペプチドを含有）の導入が完全な結合活性を保持しながらＡアイソフォームの優先的合成をもたらし、組換えヒンジの全体的な有用性をさらに支持することが明らかである。
（実施例１４）
Ｂ３Ｆ６抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体のヒト化形の調製
Ｂ３Ｆ６抗体の可変領域を配列決定した。マウスＢ３Ｆ６抗体の軽鎖可変領域の配列を下に与える：
Figure 2008526234
 マウスＢ３Ｆ６抗体の重鎖可変領域の配列を下に与える：
Figure 2008526234
 これらの配列のそれぞれについて、ＣＤＲ残基に下線を付け、標準残基を小文字で示し、異常な標準残基を小文字、イタリック体および太字で示す。
相補性決定領域（ＣＤＲ）を標準クラスに分類した。ＣＤＲは抗原に最も結合しやすい残基を含有し、再形成された抗体内に保持されねばならない。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，Ｗｕ，Ｔ．Ｔ．，Ｐｅｒｒｙ，Ｈ．Ｍ．，Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｋ．Ｓ．ａｎｄ Ｆｏｅｌｌｅｒ，Ｃ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ．Ｕ．Ｓ．Ｇｏｖｔ．Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｏｆｆｉｃｅ）による配列によって定義される。ＣＤＲは、主要な残基がＣＤＲループの構造配座を大幅に決定する場合、標準クラスに分類される（Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ，Ａ．，Ｌｅｖｉｔｔ，Ｍ．，Ｓｍｉｔｈ−Ｇｉｌｌ，ＳＪ．，Ａｉｒ，Ｇ．，Ｓｈｅｒｉｆｆ，Ｓ．，Ｐａｄｌａｎ，Ｅ．Ａ．，Ｄａｖｉｅｓ，Ｄ．，Ｔｕｌｉｐ，Ｗ．Ｒ．，Ｃｏｌｍａｎ，Ｐ．Ｍ．，Ｓｐｉｎｅｌｌｉ，Ｓ．，Ａｌｚａｒｉ，Ｐ．Ｍ．ａｎｄ Ｐｏｌｊａｋ，ＲＪ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７−８８３）。これらの残基は、再形成された抗体内にほとんどの場合保持される。重鎖および軽鎖のＣＤＲは、次のように標準クラスに分類される：
Figure 2008526234
 これらのクラスに重要な標準残基を表８に示す。ループＬ１は位置２にＦを有するのに対して、標準残基はＶ／Ｉである。ループＨ２は位置７１にＶを有するのに対して、標準残基はＡ／Ｔ／Ｌである（ＶはＨ２クラス１で標準であるが）。
表８
Figure 2008526234
 可変軽鎖および重鎖をプログラムＦＡＳＴＡおよびコンセンサス配列のデータベースを使用してマウスおよびヒトサブグループのコンセンサス配列（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．１９９１）と比較した。可変軽鎖は１１３ ａａ重複に９２．９％同一性を持つマウスサブグループＫａｐｐａ ２のメンバーであることが見出された。配列比較を下に示す：
マウスサブグループＫａｐｐａ ２コンセンサスに対するＢ３Ｆ６軽鎖の配列比較
＞＞ｍｏｕｋｖ２ 長さ：１１３ ８月６日、１９９２ １５：０４ タイプ： Ｐ Ｃ（１１３ ａａ）ｉｎｉｔｎ：６５４ ｉｎｉｔｌ：６５４ ｏｐｔ：７００ ｚ−ｓｃｏｒｅ：８３．４ Ｅ（ ）：０．２４ スミス−ウォーターマンスコア：７００；１１３ ａａ重複に９２．９２０％同一性
Figure 2008526234
 可変重鎖は、１２８ ａａ重複に８０．５％同一性を持つマウスサブグループ２Ｂのメンバーであることが見出された。配列比較を下に示す：
マウスサブグループ２Ｂコンセンサスに対するＢ３Ｆ６重鎖の配列比較
＞＞ｍｏｕｈｖ２ｂ 長さ：１２７ ８月６日、１９９２ １５：０４ タイプ：Ｐ（１２７ ａａ）ｉｎｉｔｎ：６６４ ｉｎｉｔｌ：５９２ ｏｐｔ：６５３ ｚ−ｓｃｏｒｅ：９６．８ Ｅ（ ）：０．０４３ スミス−ウォーターマンスコア：６５３；１２８ ａａ重複に８０．４６９％同一性
Figure 2008526234
 可変軽鎖は、１１４ ａａ重複に７６．３％同一性を持つヒトサブグループＫａｐｐａ ２に相当する。配列比較を下に示す：
ヒトサブグループＫａｐｐａ ２コンセンサスに対するＢ３Ｆ６軽鎖の配列比較
＞＞ｈｕｍｋｖ２ 長さ：１１４ ８月６日、１９９２ １５：０４ タイプ：Ｐ Ｃ（１１４ ａａ）ｉｎｉｔｎ：５６６ ｉｎｉｔｌ：３８３ ｏｐｔ：５７１ ｚ−ｓｃｏｒｅ：７３．２ Ｅ（ ）：０．８８ スミス−ウォーターマンスコア：５７１；１１４ ａａ重複に７６．３１６％同一性
Figure 2008526234
 可変重鎖は、１２９ ａａ重複に６５．１％同一性を持つヒトサブグループ１に相当する。配列比較を下に示す：
ヒトサブグループ１コンセンサスに対するＢ３Ｆ６重鎖の配列比較
＞＞ｈｕｍｈｖ１ 長さ：１２９ ８月６日、１９９２ １５：０４ タイプ：Ｐ Ｃ（１２９ ａａ）ｉｎｔｉｎ：３４８ ｉｎｉｔｌ： ２７４ ｏｐｔ：５３２ Ｚ−ｓｃｏｒｅ：８５．５ Ｅ（ ）：０．１８ スミス−ウォーターマンスコア：５３２；１２９ ａａ重複に６５．１１６％同一性
Figure 2008526234
 １つのヒト化設計において、抗原からの結合ペプチドと複合体形成させたＢ３Ｆ６ Ｆａｂのｘｒａｙ構造を使用した。最も類似したヒト発現抗体配列を抗体フレームワークとして使用するために選択した。最も近い発現配列を見出すために、最も相同的に発現したヒトフレームワークをＮＣＢＩ ＮＲデータベースおよびＫａｂａｔデータベースで検索した。重鎖および軽鎖配列について、２回の検索（ＣＤＲマスクおよびアンマスクによって）を実施した。最も適切な発現配列の選択は、標準およびインタフェース残基の配列同一性について点検することはもちろん、ＣＤＲループ長の類似性について点検することを含む。抗体の供給源も決定因子である。以前にヒト化された抗体は除外する。ＮＣＢＩ ＮＲデータベースでは我々はＢＬＡＳＴを使用し、Ｋａｂａｔデータベース検索にはＦＡＳＴＡを使用した。
最も適切な発現軽鎖は、組織、扁桃腺、臍帯、末梢血および骨髄の混合物から単離された抗体から生じたｎｒデータベースに見出された（ｇｉ−２１６６９４１７（ＢＡＣ０１７３３）；Ａｋａｈｏｒｉ ｅｔ ａｌ．（未発表、ＮＣＢＩウェブサイトを参照））。配列比較を下に示す：
Ｂ３Ｆ６軽鎖とヒトｇｉ−２１６６９４１７（ＢＡＣ０１７３３）との配列比較
＞＞ＢＡＣ０１７３３
（１１２ ａａ）ｉｎｉｔｎ ：４４７ ｉｎｉｔｌ：４４７ ｏｐｔ：４４７
スミス−ウォーターマンスコア：４４７；１１２ ａａ重複に６１．６０７％同一性
Figure 2008526234
 最も適切な重鎖は、良性リンパ球増殖のＢリンパ球のポリクローナルセットから生じたｎｒデータベースに見出された（ｇｉ−１４２８９１０６（ＡＡＫ５７７９２）；Ｓａｌｃｅｄｏ ｅｔ ａｌ．（２００２））。配列比較を下に示す：
Ｂ３Ｆ６重鎖とヒトｇｉ−１４２８９１０６との配列比較
Figure 2008526234
 免疫グロブリン重鎖（１２０ ａａ）ｉｎｉｔｎ：３９５ ｉｎｉｔｌ：３９５ ｏｐｔ：３９７
スミス−ウォーターマンスコア：３９７；１１９ ａａ重複に５３．７８２％同一性
Figure 2008526234
 両方のヒト発現配列をＮＣＢＩの生殖系列配列データベースで検索して、これは次の選択された生殖系列：軽鎖のＡ３＊／Ａ１９＊（ＢＡＣ０１７３３）、および重鎖ＶＨ１−２＊（ＡＡＫ５７７９２）を生じさせた。
選択したヒトフレームワーク残基を相当するマウス残基への復帰突然変異のために選択した。結合部位に近い、標準残基、インタフェースパッキング残基、および異常なマウス残基を保持することが優先された。加えてＣＤＲ残基のいずれかの６Å以内の残基をＣＤＲの配座に対する潜在的な効果に関して詳細に解析した。
ヒト化Ｂ３Ｆ６軽鎖の１つのバージョンでは、位置２のＶがＦに変更された。この位置のアミノ酸は、Ｌ９３（ＣＤＲ−Ｌ３）と相互作用するために重要であると見なされた。このＣＤＲは、抗原に由来するペプチドを結合することに関与する。
この方法を使用して、軽鎖の１つのバージョンを作製した：
軽鎖バージョンＬ１（１復帰突然変異）
Figure 2008526234
 次のアミノ酸残基をヒトＢ３Ｆ６重鎖における潜在的な復帰突然変異のために選択した：位置４８のＭ、位置６７のＶ、位置７１のＲ、位置７３のＴ、位置９３のＡおよび位置１１２のＣ。
位置４８のＭは、ＣＤＲ−Ｈ２に近接しているが、ペプチド抗原には近接していないことが決定された。それはヒト化重鎖の１つのバージョン内に保持され、別のバージョンのＩへ復帰突然変異される。
位置６７のＶは、ＣＤＲ−Ｈ２に近接しているが、ペプチド抗原には近接していないことが決定された。それはヒト化重鎖の１つのバージョン内に保持され、別のバージョンのＡへ復帰突然変異される。
位置７１のＲは、標準であることが決定された。それは両方のバージョンでＶに復帰突然変異される。
位置７３のＴは、ＣＤＲ−Ｈ２に近接しているが、ペプチド抗原には近接していないことが決定された。それはヒト化重鎖の１つのバージョン内に保持され、別のバージョンのＫへ復帰突然変異される。
位置９３のＡは、明らかな側基接触のないインタフェース残基であることが決定された。それはヒト化重鎖の１つのバージョン内に保持され、別のバージョンのＳへ復帰突然変異される。
位置１１２のＣは、異常なヒト残基であることが決定された。それは両方のバージョンでＳに復帰突然変異される。
この方法を使用して、重鎖の２つのバージョンを作製した：
重鎖バージョンＨ１（６復帰突然変異）
Figure 2008526234
 バージョンＨ２（２復帰突然変異）
Figure 2008526234
 （実施例１５）
Ｂ３Ｆ６抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体の追加のヒト化形の調製
知識ベース方法（許容される配列変化を決定するための、他のヒト化抗体のデータベースの検索）を使用して、復帰突然変異を位置２および位置１００に含む軽鎖の別のバージョンを作製した。
ヒト化方法は、Ｒｏｓｏｋ ｅｔ ａｌ（Ｒｏｓｏｋ ＭＪ，ｅｔ ａｌ．，１９９６．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２２６１１−２２６１８）に述べた方法によるＶ領域配列の目視検査および解析に基づいていた。標準決定基、表面残基、および潜在的接触残基を同定した。潜在的接触残基が認められ、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．によって定義されたＣＤＲループの構造定義（Ｃｈｏｔｈｉａ Ｃ ａｎｄ Ｌｅｓｋ ＡＭ．１９８７．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７）、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．によって定義された配列超可変性（Ｋａｂａｔ ＥＡ，Ｗｕ ＴＴ，Ｒｅｉｄ−Ｍｉｌｌｅｒ Ｍ，Ｐａｒｒｙ ＨＭ，ａｎｄ Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ ＫＳ．１９８７．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ．ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ、ベセズダ、メリーランド州）、ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．によって定義された潜在的抗原接触残基（ＭａｃＣａｌｌｕｍ ＲＭ，Ｍａｒｔｉｎ ＡＣＲ，ａｎｄ Ｔｈｏｒｔｏｎ ＪＭ．１９９６．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２−７４５）に従って広範に分類される。Ｋａｂａｔ番号付けおよび定義によるマウスＣＤＲループはその全体をアクセプタヒトフレームワーク上にグラフトした。Ｐａｄｌａｎによって定義されたパッキング残基（Ｐａｄｌａｎ ＥＡ．１９９１．Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９−４９８）を同定して、パッキング残基をＳｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｓｉｎｇｅｒ ＩＩ ｅｔ ａｌ．１９９３．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：２８４４−２８５７）に述べられた方法に従って保存する試みを行う。フレームワーク配列内の各残基に、ＨａｒｒｉｓおよびＢａｊｏｒａｔｈ（Ｈａｒｒｉｓ Ｌ ａｎｄ Ｂａｊｏｒａｔｈ Ｊ． １９９５． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ４：３０６−３１０）で述べられたように抗体ヒト化について低、中、または高「リスク位置」を割り当てた。
一般に低リスク位置はヒトに維持された。同一でない中および高リスクアミノ酸位置の多くでは、ヒト化抗体のコレクションへの参照が行われ、ヒトまたはマウス（復帰突然変異）アミノ酸残基の包含が機能結合活性をもたらすかどうかが考慮された。置換が検討されるこのような場合では、残基の機能互換性を確認するためのアミノ酸置換マップ（Ｄ．Ｂｏｒｄｏ ａｎｄ Ｐ．Ａｒｇｏｓ．１９９１．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１７：７２１−７２９）、
この方法を使用して、軽鎖の１つのバージョンを作製した。軽鎖の配列を下に示す：
軽鎖バージョンＬ２：
Figure 2008526234
 復帰突然変異を位置１、４８、７１、８１、８２ｂ、および１１２に含む重鎖の別のバージョンも作製した：
この方法を使用して、重鎖の１つのバージョンを作製した。重鎖の配列を下に示す：
重鎖バージョンＨ３：
Figure 2008526234
 ＣＤＲグラフトヒト化Ｂ３Ｆ６配列および復帰突然変異を含む配列の注釈付きバージョンを軽鎖については図５に、重鎖については図６に示す。復帰突然変異が作製された位置のＫａｂａｔ番号付けも示す。
（実施例１６）
全長ヒト化Ｂ３Ｆ６抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体の調製
次のヒト化重鎖および軽鎖の組合せを有する、６つのヒト化全長Ｂ３Ｆ６抗体および６つのヒト化ドメイン欠失Ｂ３Ｆ６抗体を作製した：
全長バージョン１−ヒト化（ｈｕ）Ｂ３Ｆ６軽鎖バージョンＬ１／重鎖バージョンＨ１（Ｌ１／Ｈ１）
全長バージョン２−ｈｕＢ３Ｆ６ Ｌ１／Ｈ２
全長バージョン３−ｈｕＢ３Ｆ６ Ｌ１／Ｈ３
全長バージョン４−ｈｕＢ３Ｆ６ Ｌ２／Ｈ１
全長バージョン５−ｈｕＢ３Ｆ６ Ｌ２／Ｈ２
全長バージョン６−ｈｕＢ３Ｆ６ Ｌ２／Ｈ３
全長抗体分子を作製するのに使用したＩｇＧ１重鎖定常領域のアミノ酸配列を図７に示す。
ＣＤＲグラフトＢ３Ｆ６軽鎖ならびにバージョンＬ１およびＬ２の完全なアミノ酸配列を下に示す：
ＣＤＲグラフトＢ３Ｆ６軽鎖
Figure 2008526234
Figure 2008526234
 作製された全長抗体のＣＤＲグラフトＢ３Ｆ６重鎖ならびにバージョンＨ１、Ｈ２、およびＨ３の完全なアミノ酸配列を下に示す：
ＣＤＲグラフト全長Ｂ３Ｆ６重鎖
Figure 2008526234
Figure 2008526234
 安定なバルク培養物から、全長バージョン２ヒト化抗体（バージョン１軽鎖およびバージョン２重鎖を含む）は、最大量の抗体を産生し、親マウス抗体に匹敵する対する結合親和性を有していた。
（実施例１７）
ドメイン欠失ヒト化Ｂ３Ｆ６抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体の調製
次のヒト化重鎖および軽鎖の組合せを有する６つのヒト化ＣＨ２ドメイン欠失Ｂ３Ｆ６抗体を作製した：
ドメイン欠失（ｄｄ）バージョン１−ヒト化ドメイン欠失Ｂ３Ｆ６軽鎖バージョン１／重鎖バージョン１（Ｌ１／Ｈ１）
ｄｄバージョン２−ｈｕｄｄＢ３Ｆ６Ｌ１／Ｈ２
ｄｄバージョン３−ｈｕｄｄＢ３Ｆ６Ｌ１／Ｈ３
ｄｄバージョン４−ｈｕｄｄＢ３Ｆ６Ｌ２／Ｈ１
ｄｄバージョン５−ｈｕｄｄＢ３Ｆ６Ｌ２／Ｈ２
ｄｄバージョン６−ｈｕｄｄＢ３Ｆ６Ｌ２／Ｈ３
ドメイン欠失抗体分子を作製するために使用した重鎖定常領域のアミノ酸配列を図７に示す。
ドメイン欠失抗体を作製するために使用したＣＤＲグラフトＢ３Ｆ６軽鎖ならびに軽鎖バージョンＬ１およびＬ２の完全なアミノ酸配列を下に示す：
ＣＤＲグラフトＢ３Ｆ６軽鎖
Figure 2008526234
 ドメイン欠失抗体を作製するために使用したＣＤＲグラフトＢ３Ｆ６重鎖ならびにバージョンＨ１、Ｈ２、およびＨ３の完全なアミノ酸配列を下に示す：
ＣＤＲグラフトＣＨ２ドメイン欠失Ｂ３Ｆ６重鎖
Figure 2008526234
Figure 2008526234
 ドメイン欠失抗体の６つのバージョンの結合活性（ＣＤＲグラフト抗体は含まない）を試験した。簡潔にはＧＥＯヒト結腸腺癌細胞を２ｍＭグルタミン、０．５ｍＭピルビン酸ナトリウム、ペニシリン／ストレプトマイシン、および非必須アミノ酸を含むＤＭＥＭ、１０％ ＦＢＳ中で培養した。ＰＢＳ、２０ｍＭ ＥＤＴＡを用いて細胞をフラスコから取り出して、１２００ｒｐｍで３分間遠心分離し、ＰＢＳ、０．０２％アジド、０．１％ ＢＳＡに懸濁させた。各種の濃度のヒト化またはキメラ抗体を最終濃度５ｎＭマウスＢ３Ｆ６とポリプロピレンＶ底プレート内で混合した。１００万個のＧＥＯ細胞を各プレートに添加して、細胞を抗体と共に４℃にて２時間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄して、抗マウスＩｇＧフィコエリトリン接合体の１：５００希釈物で４℃にて１時間インキュベートした。細胞をもう１回洗浄して、３％ホルムアルデヒド中で固定し、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ装置にかけた。平均蛍光強度（ＭＦＩ）をヒト化またはキメラ抗体濃度に対してプロットした。ＩＣ５０を４パラメータ適合によって決定した。各実験では、各ヒト化抗体のＩＣ５０をその実験のキメラ抗体と比較した。結果を下の表９に示す。
表９
Figure 2008526234
 （実施例１８）
毒素へのヒト化Ｂ３Ｆ６抗体接合は、生体内モデルでヒト乳癌細胞の増殖を阻害するのに有効である
本実施例では次の物質および方法を使用した：
マウス
１０週齢のメス胸腺欠損ヌードマウス１４０匹（Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ，マジソン、ウィスコンシン州）で試験を開始した。腫瘍移植前の少なくとも５日間に亘って、動物を実験室に順化させた。通風ケージラックに収容して、食餌および水は自由に与えた。
腫瘍モデル
ＢＴ−４７４腫瘍は、Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｅで樹立された連続継代生体内ドナー系による凍結保存固形腫瘍断片から得た（ｃｒｙｏ ｒｅｇ ＃０１４１、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｙｐｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（マナッサス、バージニア州）から得た細胞から最初に樹立）。本試験の移植前に、腫瘍断片を凍結保存から取り出して、メス胸腺欠損ヌードマウスで３世代に亘って生体内で皮下連続継代した。マウスに移植される腫瘍組織のサンプルで細菌培養を実施した。細菌培養は移植後２４時間および４８時間後の両方で、細菌汚染について陰性であった。
第１日に、ＢｉｏＭｅｄｉｃｓ ａｎｉｍａｌ ＩＤ ｃｈｉｐｓ（Ｍｏｄｅｌ ＩＭＩ−１０００；シーフォード、デラウェア州）をマウスの左側腹部に皮下移植した。第０日に、８匹のドナー動物からの腫瘍を収穫して、壊死組織を除去して、刻み、ＢＴ−４７４腫瘍の３ｍｍ３断片を各マウスの右側腹部に皮下移植した。腫瘍サイズおよび体重測定値は第５日から開始して週に２回記録した。最低１００ｍｇの腫瘍が測定されたときに（第１５日）、腫瘍サイズに基づき、非進行性成長の腫瘍を除いて、マウスを処置および対照グループにランダムに分けた（表１０を参照）。
表１０： 対照および試験処置グループ
Figure 2008526234
 ａ静脈内
ｂ腹腔内。
試験品および正の化学治療剤
メイタンシンＤＭ４接合（２０００−６７ ３．５ Ｄ／Ａ、６ｍｇ／ｍｌおよび２０００−７９、３．３ Ｄ／Ａ、５．５ｍｇ／ｍｌ）は、ＩｍｍｕｎｏＧｅｎ，Ｉｎｃ（ケンブリッジ、マサチューセッツ州）でＩｍｍｕｎｏＧｅｎ腫瘍活性化プロドラッグ（ＴＡＰ）技術によって調製した。すべての実験において、Ｂ３Ｆ６抗体を抗体当り平均３〜４個のＤＭ４分子を接合させた。送達されたＤＭ４の量の一例として、平均３ＤＭ４／ｍＡｂを持つＢ３Ｆ６−ＤＭ４接合抗体の用量２３ｍｇ／ｋｇがＤＭ４約３５０ｕｇ／ｋｇに相当する。臨床グレードのタキソールＴＭ（パクリタキセル注射、ＮＤＣ ００１５−３４７６−３０）はＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ（Ｌｏｔ Ｎｏ ４Ｌ８３４６０、使用期限２００７年１１月）から入手した。
試験グループおよび処置計画
試験グループおよび処置計画を表１０に示す。ビヒクル対照（１０ｍＭクエン酸緩衝液、ｐＨ５．５、１３５ｍＭ塩化ナトリウム）は週１回、３回の用量（ｑ７ｄｘ３）で静脈内投与し、タキソールＴＭは４日ごと、３回の用量（ｑ４ｄｘ３）を腹腔内投与した。１５ｍｇ／ｋｇのＢ３Ｆ６．１−ＤＭ４は、ｑ７ｄｘ３および第４３日の追加投与またはｑ７ｄｘ３および第４３日の２５ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与した。３５ｍｇ／ｋｇのＢ３Ｆ６．１−ＤＭ４はｑ７ｄｘ３または第１５、２２、３３、および３６日に静脈内投与した。すべての処置は第１５日に開始した。
抗癌活性の評価
腫瘍測定値はデジタルカリパスを使用して決定した。体重および腫瘍サイズ測定値は第０日に記録して、試験終了まで週２回継続した。長楕円の体積を計算する式を使用して、２次元腫瘍測定値から腫瘍体積（ｍｍ３）を概算した：腫瘍体積（ｍｍ３）＝（長さｘ幅２）÷２。単位密度を仮定して、体積を重量に変換した（すなわち１ｍｍ３＝１ｍｇ）。
第５８日にビヒクル対照、タキソール、および１５ｍｇ／ｋｇ／注射のＢ３Ｆ６．１−ＤＭ４で処置したグループを安楽死させた。腫瘍重量および体重は残りのグループから毎週、引き続き得た。３５ｍｇ／ｋｇ／注射、ｑ７ｄｘ３のＢ３Ｆ６．１−ＤＭ４で処置したグループは第７６日に安楽死させた。第１５、２２、３３、および３６日に３５ｍｇ／ｋｇ／注射のＢ３Ｆ６．１−ＤＭ４で処置したグループは、試験が終了する第８３日に安楽死させた。
統計解析
各処置グループおよびビヒクル対照グループ間に何らかの統計的有意差があるかどうかを判定するために、各試験終了時の平均腫瘍重量に対してＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定を実施した。
移植後には９８％の腫瘍生着率があり、厳しいサイズ範囲内のマウスを選択して処置を開始した。ビヒクル対照グループの腫瘍成長は十分に、このモデルで見られる代表的な範囲内であった。タキソールはこのモデルと一致する反応を生じて、第２６日〜第５０日に腫瘍成長の有意な（Ｐ＜０．０５）阻害を引き起こした。第５８日にビヒクル対照、タキソール、および１５ｍｇ／ｋｇ／注射のＢ３Ｆ６．１−ＤＭ４で処置したグループを安楽死させた。腫瘍重量および体重は残りのグループから毎週、引き続き得た。３５ｍｇ／ｋｇ／注射、ｑ７ｄｘ３のＢ３Ｆ６．１−ＤＭ４で処置したグループは第７６日に安楽死させた。第１５、２２、３３、および３６日に３５ｍｇ／ｋｇ／注射のＢ３Ｆ６．１−ＤＭ４で処置したグループは、試験が終了する第８３日に安楽死させた。
図１０〜１３は、各種の計画で静脈内投薬されたＢ３Ｆ６．１−ＤＭ４の２つの用量（１５および３５ｍｇ／ｋｇ／注射）の、樹立ＢＴ−４７４異種移植腫瘍を持つ胸腺欠損ヌードマウスにおける腫瘍重量、％試験／対照（％Ｔ／Ｃ）、および体重の変化に対する影響を示す。ｑ７ｄｘ３よび第４３日の追加投薬で静脈内投薬されたＢ３Ｆ６．１−ＤＭ４は、第３３日から第４７日まで腫瘍成長を有意に（ｐ＜０．０５）阻害したが、第５８日にこのグループを終了させときにはもはや有意な阻害は示さなかった。１５ｍｇ／ｋｇ／注射のＢ３Ｆ６．１−ＤＭ４によって処置して、ｑ７ｄｘ３および第４３日には２５ｍｇ／ｋｇ／注射を静脈投薬した他のコホートは、試験を通じて腫瘍成長の有意な阻害を示さなかった。３５ｍｇ／ｋｇ／注射でのＢ３Ｆ６．１−ＤＭ４の投薬計画はどちらも、第２９日からビヒクル対照グループを終了させた第５８日まで腫瘍成長の有意（Ｐ＜０．００１）な阻害を引き起こした。
３５ｍｇ／ｋｇ／注射のＢ３Ｆ６．１−ＤＭ４によって処置された両方のコホートの％Ｔ／Ｃは、第２９日までに活性のＮＣＩ基準の４２％以下に低下して、試験の間、このレベル以下で維持された。１５ｍｇ／ｋｇのＢ３Ｆ６．１−ＤＭ４で処置したコホートの％Ｔ／Ｃは、４２％以下になることはなかった。
臨床所見
Ｂ３Ｆ６．１−ＤＭ４で処置した複数のマウスが、皮膚に軽度のｃｏｒｙｎｅｏｆｏｒｍ細菌感染を経験した。この細菌は皮膚に存在して、動物がストレスを受けた場合に発生しうる日和見感染と見なされる。３５ｍｇ／ｋｇ／注射のＢ３Ｆ６．１−ＤＭ４によって処置したマウスの大半は第２９日までに感染を発症して、すべての感染は第４３日までに回復した（Ｎｏ．３３を除く）。
タキソールで処置したマウス１匹は、タキソール投与中の技術的失敗のために体重減少を経験した。タキソールはＧＩ毒性を引き起こすことが公知であり、この細胞傷害性薬を腹腔内投与するときは注意する必要がある。皮下液の投与はマウスの状態を改善しなかったが、体重減少に関するＩＡＣＵＣガイドライン（体重減少が２０％を超えたときに安楽死）によって、それがタキソールのその最終用量を投与された３日後の第２６日に安楽死させた。この動物のデータは、グラフおよび統計解析から除外した。
Ｂ３Ｆ６．１−ＤＭ４、３５ｍｇ／ｋｇ／注射、ｑ７ｄｘ３で処置したマウス１匹は、第２６日から開始する体重減少を経験した。体重減少は継続したため、マウスはＢ３Ｆ６．１−ＤＭ４のその最後の投薬を受けてから１４日後の第４３日に、ＩＡＣＵＣガイドラインによって安楽死させねばならなかった。検死は、胸内の透明な皮下液を明らかにした。このグループで他のマウス１匹のみがわずかな体重減少を経験したため、体重減少が処置に関連したかどうかは不明である。しかしながらＮｏ．３５もｃｏｒｙｎｅｏｆｏｒｍ細菌感染を経験しており、これがわずかな体重減少を引き起こしたかもしれない。
第５０日にビヒクル対照グループのマウス１匹を、その腫瘍がその体重の２０％を超える重量に達したときに、ＩＡＣＵＣガイドラインに従って安楽死させた。腫瘍の重篤な潰瘍形成および体重減少のために、ビヒクル対照グループの別のマウスを第５０日に安楽死させた。これらのマウスの腫瘍重量は、試験の残りのデータに繰り越した。
（実施例１９）
毒素へのヒト化ドメイン欠失Ｂ３Ｆ６抗体の接合は、生体内モデルで乳癌細胞の増殖を阻害するのに有効である
本実施例では次の物質および方法を使用した。
動物：
Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（マジソン、ウィスコンシン州）による、６〜７週齢の胸腺欠損メスヌードマウス１３５匹で試験を開始した。腫瘍移植前の少なくとも５日間に亘って、動物を実験室に順化させた。腫瘍の移植前に、動物には動物ＩＤチップを個別に移植した。８匹の動物を試験グループに含め、２０匹の動物をビヒクル対照グループに含めた。
腫瘍：
ＢＴ−４７４試験管内細胞系はＮＣＩ Ｔｕｍｏｒ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙから最初に入手した。連続移植生体内ドナー系（Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｅ ｃｒｙｏ ｒｅｇ ＃０１４１より（エストロゲン添加なし）をＢｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｅで樹立して、本試験の移植前に、メス胸腺欠損ヌードマウスで４世代に亘って移植した。動物には３ｍｍ３組織断片／マウスを右側腹部に皮下移植した
腫瘍が１００ｍｇｓの最低サイズに達したときに処置を開始した。動物を次の試験および対照グループにランダムに分けた。
表１１
Figure 2008526234
 注記：＊＊用量は、動物にメイタンシン３５０ｕｇ／ｋｇを与える、２３ｍｇ／ｋｇ用量＝３つの薬物／ｍＡｂに基づく（ＭＴＤ）。
試験スケジュールは：
第−１日：動物ＩＤチップを移植して、初期体重を記録した。
第０日：腫瘍を採取して、インプラントして、マウスをランダムに分けた。腫瘍での細胞培養を行った。
第４日：腫瘍をステージングするために腫瘍サイズ測定値を記録して、ステージング日まで毎日または１日おきのどちらかで継続する。
であった。
最小サイズ１００ｍｇｓが測定された腫瘍のあるマウスを選択した。マウスをランダムに分けて、体重を記録した。処置を１回静脈内投薬として投与した。正の対照薬剤をｑ４ｄｘ３スケジュールで腹腔内投与した。
体重および腫瘍測定値をステージング日に記録して、試験終了まで週２回継続した。
図１４〜１７のデータは、ドメイン欠失Ｂ３Ｆ６が、ある濃度のドメイン欠失分子で処置したマウスにおいて腫瘍重量を減少させるのに有効であったことを示している。
（実施例２０）
毒素へのヒト化Ｂ３Ｆ６抗体の接合は、生体内モデルでヒト精巣癌細胞の増殖を阻害するのに有効である
次の実施例では、抗Ｃｒｉｐｔｏヒト化ＩｇＧ１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）Ｂ３Ｆ６（Ｂ３Ｆ６．１とも呼ばれる）を、細胞傷害性薬メイタンシンの誘導体であるＤＭ４と接合させた（Ｂ３Ｆ６．１−ＤＭ４）。この接合体をＮＣＣＩＴヒト精巣癌の樹立された皮下（ＳＣ）移植異種移植片を持つオス胸腺欠損ヌードマウスで、抗癌活性の証拠について評価した。動物のコホートは、Ｂ３Ｆ６．１−ＤＭ４ ｍＡｂで、６、１０、１５および２５ｍｇ／ｋｇ／注射（それぞれ１００、１７８、２６６および４４４ｕｇ／ｋｇメイタンシンに相当）にて週１回、３回の用量（ｑ７ｄｘ３）または腫瘍の再成長に応じて第１５日および後日の２５および１０ｍｇ／ｋｇ／注射、ビヒクル対照ＩＶ ｑ７ｄｘ３、または２ｍｇ／ｋｇ／皮下注射のシスプラチナム（正の化学治療対照）、週３回、６回の用量（３ｘ／ｗｋｘ６）で、静脈内（ＩＶ）処置した。処置は、腫瘍１００ｍｇのサイズの最小変化に達する第１５日に開始した。
結果は、ビヒクル対照グループの腫瘍成長が十分にこのモデルの許容範囲内であったことを示す。シスプラチナムは、第２０日から第６６日までこのモデルと一致する腫瘍成長の有意（ｐ＜０．０５）な阻害を生じた。ｑ７ｄｘ３で投薬されたＢ３Ｆ６．１−ＤＭ４は、１０（Ｐ＜０．００１）、１５（Ｐ＜０．００１）および２５ｍｇ／ｋｇ／注射（Ｐ＜０．００１）にて第２０日に開始する腫瘍の退行を生じ、第１０７日に試験が終了するまで退行を維持した。６ｍｇ／ｋｇ／注射、ｑ７ｄｘ３のＢ３Ｆ６．１−ＤＭ４は第２０日から第４４日まで腫瘍を退行させて、第７０日に該グループが終了するまで腫瘍の増殖を有意に（ｐ＜０．００１）阻害した。第１５日に２５ｍｇ／ｋｇで投薬したＢ３Ｆ６．１−ＤＭ４は、試験を通じて腫瘍の退行を生じた（Ｐ＜０．００１）。第１５日に１回、１０ｍｇ／ｋｇで投薬されたＢ３Ｆ６．１−ＤＭ４は、腫瘍の初期退行を引き起こした（Ｐ＜０．００１）。第３７日および第４４日に与えた１０ｍｇ／ｋｇの追加の投薬は、再び成長を開始した腫瘍の退行を引き起こした（Ｐ＜０．０１）。結論として、試験投薬計画でのＢ３Ｆ６．１−ＤＭ４は、ＮＣＣＩＴ精巣癌の樹立異種移植片に対して非常に有効であった。
本実施例では次の物質および方法を使用した：
マウス
７〜８週齢のオス胸腺欠損ヌードマウス１５０匹（Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ，マジソン、ウィスコンシン州）で試験を開始した。腫瘍移植前の少なくとも５日間に亘って、動物を実験室に順化させた。通風ケージラックに収容して、食餌および水は自由に与えた。
腫瘍モデル
ＮＣＣＩＴ細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｙｐｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（マナッサス、バージニア州）から得た。移植前に、細胞系を試験管内で４回継代した。細胞は試験管内で、抗生物質を含まないＲＰＭＩ−１６４０＋１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）培地（５％ ＣＯ２）中で培養した。細菌培養は、マウスに移植される細胞ホモジネート調製物の分割量に対して実施した。細菌培養は移植後２４時間および４８時間後の両方で、細菌汚染について陰性であった。
第−１日に、ＢｉｏＭｅｄｉｃｓ ａｎｉｍａｌ ＩＤ ｃｈｉｐｓ（Ｍｏｄｅｌ ＩＭＩ−１０００；シーフォード、デラウェア州）をマウスの左側腹部に皮下移植した。第０日に、血清（２５％）を含まず、マトリゲル（７５％）を加えたＲＰＭＩ−１６４０ ２００Ｌ中のＮＣＣＩＴ細胞５ｘ１０６個の接種材料を右側腹部に皮下移植した。腫瘍サイズおよび体重測定値を第６日から開始して週に２回記録した。第１５日に非進行性成長を持つ腫瘍を除外して、腫瘍重量の最小増加１００ｍｇおよび最大増加２４４ｍｇの腫瘍を持つマウスを処置および対照グループにランダムに分けた（表１２を参照）。最初の腫瘍測定（第６日）からの腫瘍重量の変化を使用して、接種材料中のマトリゲルの体積を説明するために、実際の腫瘍重量ではなく腫瘍成長を評価した。
試験品および正の化学治療剤
ＤＭ４接合（２０００−６７、６．０ｍｇ／ｍｌ）は、ＩｍｍｕｎｏＧｅｎ，Ｉｎｃ（ケンブリッジ、マサチューセッツ州）でＩｍｍｕｎｏＧｅｎ腫瘍活性化プロドラッグ（ＴＡＰ）技術によって調製した。ビヒクル対照およびＢ３Ｆ６．１−ＤＭ４ ｍＡｂ投薬溶液（Ｌｏｔ Ｎｏ １１１５５−１０４、調合物、ノートブック：ＬＣ １１１５５−１０４）は、Ｂｉｏｇｅｎ ＩｄｅｅのＬｉｎｇ Ｌｉｎｇ Ｃｈｅｎから提供された。臨床グレードＰｌａｔｉｎｏｌ−ＡＱ（シスプラチン注射、ＮＤＣ００１５−３２２１−２２）をＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ（Ｌｏｔ Ｎｏ ２Ｃ６５５５６，使用期限２００３年３月）から入手した。
試験グループおよび処置計画
試験グループおよび処置計画を表１２に示す。Ｂ３Ｆ６．１−ＤＭ４は、胸腺欠損ヌードマウスにおいて３．９日の半減期を有する。Ｂ３Ｆ６．１−ＤＭ４ ｍＡｂは、週１回、３回の用量（ｑ７ｄｘ３）で、または腫瘍の再成長に応じて第１５日および後日に静脈投与した。ビヒクル対照（１０ｍＭクエン酸緩衝液、ｐＨ５．５、１３５ｍＭ塩化ナトリウム）はｑ７ｄｘ３で静脈内投与して、シスプラチナムは週３回、６回の用量（３ｘ／ｗｋｘ６）で皮下投与した。すべての処置は第１５日に開始した。
表１２は、対照および試験処置グループを示す。
対照および試験処置グループ
Figure 2008526234
 すべての処置は第１５日に開始した
ａ静脈内
ｂ皮下。
抗癌活性の評価
腫瘍測定値はデジタルカリパスを使用して決定した。体重および腫瘍サイズ測定値は第６日に記録して、試験終了まで週２回継続した。長楕円の体積を計算する式を使用して、２次元腫瘍測定値から腫瘍体積（ｍｍ３）を概算した：腫瘍体積（ｍｍ３）＝（長さｘ幅２）÷２。単位密度を仮定して、体積を重量に変換した（すなわち１ｍｍ３＝１ｍｇ）。最初の測定（第６日）からの腫瘍重量の変化を使用して、接種材料中のマトリゲルの体積を説明するために、実際の腫瘍重量ではなく腫瘍成長を評価した。
第７０日に、ビヒクル対照、シスプラチナム、および６ｍｇ／ｋｇ／注射のＢ３Ｆ６．１−ＤＭ４で処置したグループを安楽死させた。残りのグループは試験が終了する第１０７日まで追跡を続けた。
統計解析
各処置グループおよびビヒクル対照グループ間に何らかの統計的有意差があるかどうかを判定するために、各試験終了時の平均腫瘍重量に対してＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定を実施した。
試験の終わり近くに、ビヒクル対照群の一部のマウスを、その腫瘍がその体重の２０％を超える重量に達したときにＩＡＣＵＣガイドラインに従って安楽死させたこれらのマウスからの最終腫瘍重量は、試験終了まで繰り越した。
移植後には９５％の腫瘍生着率があり、第１５日に腫瘍重量変化の厳しい範囲内にある腫瘍を持つマウスを選択して処置を開始した。ビヒクル対照グループの腫瘍成長は十分に、このモデルで見られる代表的な範囲内であった。シスプラチナムは、第２０日から第６６日まで腫瘍成長の有意な阻害（ｐ＜０．０５）を引き起こすモデルと一致する反応を生じた。第７０日に、ビヒクル対照，シスプラチナム、および６ｍｇ／ｋｇ／注射のＢ３Ｆ６．１−ＤＭ４で処置したグループを安楽死させた。残りのグループは試験が終了する第１０７日まで追跡を続けた。
図１８〜２１は、ｑ７ｄｘ３で投薬されたＢ３Ｆ６．１−ＤＭ４の４つの用量（６、１０、１５および２５ｍｇ／ｋｇ／注射）または３ｘ／ｗｋｘ６で投薬されたシスプラチナムの、樹立ＮＣＣＩＴ異種移植腫瘍を持つ胸腺欠損ヌードマウスにおける腫瘍重量、％試験／対照、および体重の変化に対する影響を示す。ｑ７ｄｘ３で投薬されたＢ３Ｆ６．１−ＤＭ４は、１０（Ｐ＜０．０１）、１５（Ｐ＜０．００１）および２５ｍｇ／ｋｇ（Ｐ＜０．００１）にて、第２０日から第７０日（ビヒクル対照グループが終了した日）までの腫瘍の退行を生じた。これらのグループの腫瘍は、第１０７日の試験終了まで退行を維持した。ｑ７ｄｘ３で投与された６ｍｇ／ｋｇ／注射のＢ３Ｆ６．１−ＤＭ４は、第２０日から第４４日まで腫瘍を退行させた。第４４日の後、このグループの多くの腫瘍は再成長を開始したが、腫瘍成長は該グループが終了した第７０日まで有意に（ｐ＜０．０１）阻害された。
６および１０ｍｇ／ｋｇ／注射のＢ３Ｆ６．１−ＤＭ４の％Ｔ／Ｃは、第２３日に活性のＮＣＩ基準の４２％以下に低下して、試験の間、このレベル以下で維持された。２５ｍｇ／ｋｇ／注射グループの％Ｔ／Ｃは、第２０日までに４２％以下に低下して、第２３日から試験の間、１０％未満を維持した。
図２２〜２５は、第１５日に１回用量された、２５ｍｇ／ｋｇ／注射のＢ３Ｆ６．１−ＤＭ４、腫瘍再成長に応じて第１５日およびその後（第３７および４４日）に投薬された１０ｍｇ／ｋｇ／注射のＢ３Ｆ６，１、または３ｘ／ｗｋｘ６で投薬されたシスプラチナムの、樹立ＮＣＣＩＴ異種移植腫瘍を持つ胸腺欠損ヌードマウスにおける腫瘍サイズ、％試験／対照、および体重の変化に対する効果を示す。第１５日に１回用量された２５ｍｇ／ｋｇ／注射のＢ３Ｆ６．１−ＤＭ４は、第２０日から第７０日（ビヒクル対照グループが終了した日）まで腫瘍の退行（Ｐ＜０．００１）を生じた。このグループの腫瘍は、第１０７日の試験終了まで退行を維持した。１０ｍｇ／ｋｇで第１５日に１回用量されたＢ３Ｆ６．１−ＤＭ４は、腫瘍の初期退行を引き起こした（Ｐ＜０．００１）。第３７日および第４４日に与えた１０ｍｇ／ｋｇの追加の投薬は、再び成長を開始した腫瘍の退行を引き起こした（Ｐ＜０．０１）。
１０および２５ｍｇ／ｋｇ／注射のＢ３Ｆ６．１−ＤＭ４の％Ｔ／Ｃは、第２０日までに活性のＮＣＩ基準の４２％以下に低下して、試験の間、このレベル以下を維持した。
Ｂ３Ｆ６．１−ＤＭ４で処置した複数のマウスが、軽度から中程度の皮膚のｃｏｒｙｎｅｏｆｏｒｍ細菌感染を経験したが、開始から２、３日で回復した。この細菌皮膚に存在して、動物がストレスを受けた場合に発生しうる日和見感染と見なされる。２５ｍｇ／ｋｇ／注射のＢ３Ｆ６．１−ＤＭ４によってｑ７ｄｘ３で処置した２匹のマウス、２５ｍｇ／ｋｇ／注射で第１５日のみに処置した２匹のマウス、そして１５ｍｇ／ｋｇ／注射によってｑ７ｄｘ３で処置した１匹のマウスは、第２０〜２３日に感染の徴候を示した。２５ｍｇ／ｋｇ／注射によってｑ７ｄｘ３で処置した１匹のマウスは、軽度の感染の徴候を第３０日に示した。
第５２日に、２５ｍｇ／ｋｇ／注射のＢ３Ｆ６．１−Ｍ４で第１５日に１回処置した１匹のマウスが腹部膨張を示し、膀胱を圧搾できなかった。該マウスを安楽死させると、検死によって膀胱結石が明らかにされた。
（実施例２１）
ヒト化Ｂ３Ｆ６が生体内モデルでＣＬＡＵ−６ヒト肺癌細胞の増殖を阻害する
本試験の目的は、樹立された予備形成腫瘍塊に処置を開始したときに、Ｃａｌｕ−６異種移植腫瘍の成長に対するＢ３Ｆ６．１−ＤＭ４接合ｍＡｂの有効性を判定した。
本実施例では次の物質および方法を使用した：
マウス
８〜９週齢のメス胸腺欠損ヌードマウス１６０匹（Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ，マジソン、ウィスコンシン州）で試験を開始した。腫瘍移植前の少なくとも５日間に亘って、動物を実験室に順化させた。通風ケージラックに収容して、食餌および水は自由に与えた。
腫瘍モデル
Ｃａｌｕ−６細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｙｐｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（マナッサス、バージニア州）から得た。移植前に、細胞系を試験管内で１１回継代した。細胞は試験管内で、抗生物質を含まないＲＰＭＩ−１６４０＋１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）培地（５％ ＣＯ２）中で培養した。細菌培養は、マウスに移植される細胞ホモジネート調製物の分割量に対して実施した。細菌培養は移植後２４時間および４８時間後の両方で、細菌汚染について陰性であった。
第−１日に、ＢｉｏＭｅｄｉｃｓ ａｎｉｍａｌ ＩＤ ｃｈｉｐｓ（Ｍｏｄｅｌ ＩＭＩ−１０００；シーフォード、デラウェア州）をマウスの左側腹部に皮下移植した。第０日に、血清を含まない２００μＬ ＲＰＭＩ−１６４０中のＣａｌｕ−６細胞５ｘ１０６の接種材料を右側腹部に皮下移植した。腫瘍サイズおよび体重第６日から開始して週に４回記録した。最低１００ｍｇの腫瘍が測定されたときに、を処置および対照グループにランダムに分けた（表１３を参照）。
試験品および正の化学治療剤
ＤＭ４接合（２０００−７９ ３．３ Ｄ／Ａ、５．５ｍｇ／ｍｌ）は、ＩｍｍｕｎｏＧｅｎ，Ｉｎｃ（ケンブリッジ、マサチューセッツ州）でＩｍｍｕｎｏＧｅｎ腫瘍活性化プロドラッグ（ＴＡＰ）技術によって調製した。ビヒクル対照およびＢ３Ｆ６．１−ＤＭ４ ｍＡｂ投薬溶液（Ｌｏｔ＃ １０８７８−４９、調合物、ノートブック：ＡＣ １０８７８−４９）は、Ｂｉｏｇｅｎ ＩｄｅｅのＡｎｎｅ Ｃｈｅｕｎｇから提供された。臨床グレードのカンプトサールＴＭ（イリノテカン注射、ＮＤＣ ０００９−７５２９−０１）はＰｈａｒｍａｃｉａ ａｎｄ Ｕｐｊｏｈｎ（最初の７回の用量にはＬｏｔ Ｎｏ．７６ＫＤＰ、使用期限２００６年７月、最後の３回の用量にはＬｏｔ Ｎｏ．４６ＭＦＨ、使用期限２００７年８月）から入手した。
試験グループおよび処置計画
試験グループおよび処置計画を表１３に示す。Ｂ３Ｆ６．１−ＤＭ４は胸腺欠損ヌードマウスにおいて３．９日の半減期を有し、すべてのＢ３Ｆ６．１−ＤＭ４ ｍＡｂは第１３、１７、および２１日に、または週１回のどちらかに３回の用量（ｑ７ｄｘ３）を静脈内投与した。ビヒクル対照（１０ｍＭクエン酸緩衝液、ｐＨ５．５、１３５ｍＭ塩化ナトリウム）はｑ７ｄｘ３で投与して、イリノテカンは第１３〜１４日、第１７〜２１日、および第２４〜２６日に腹腔内投与した。ビヒクル対照グループの投薬計画は本報告には関連のない処置グループの投薬と類似しており、第１の処置は第１４日に与えた。Ｂ３Ｆ６．１−ＤＭ４およびイリノテカンの処置は第１３日に開始した。
表１３：対照および試験処置グループ
Figure 2008526234
 ａ静脈内
ｂ腹腔内。
抗癌活性の評価
腫瘍測定値はデジタルカリパスを使用して決定した。体重および腫瘍サイズ測定値は第４日に記録して、試験終了まで週２回継続した。長楕円の体積を計算する式を使用して、２次元腫瘍測定値から腫瘍体積（ｍｍ３）を概算した：腫瘍体積（ｍｍ３）＝（長さｘ幅２）÷２。単位密度を仮定して、体積を重量に変換した（すなわち１ｍｍ３＝１ｍｇ）。
統計解析
各処置グループおよびビヒクル対照グループ間に何らかの統計的有意差があるかどうかを判定するために、各試験終了時の平均腫瘍重量に対してＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定を実施した。
抗腫瘍活性
移植後には９０％の腫瘍生着率があり、厳しいサイズ範囲内にあるマウスを選択して処置を開始した。イリノテカンは第２０日から該グループが終了した第４５日まで、このモデルと一致する腫瘍成長の有意な（Ｐ＜０．００１）阻害を生じた。
図２６〜２９は、第１３、１７、および２１日に静脈内投薬されたＢ３Ｆ６．１−ＤＭ４の２つの用量（１０および２０ｍｇ／ｋｇ／注射）または第１３〜１４日、第１７〜２１日、および第２４〜２６日に投薬されたイリノテカンの、樹立Ｃａｌｕ−６異種移植腫瘍を持つ胸腺欠損ヌードマウスの腫瘍重量、最終腫瘍重量、％試験／対照、および体重の変化に対する影響を示す。Ｂ３Ｆ６．１−ＤＭ４は、次の期間に亘って両方の用量で腫瘍成長の有意な阻害を生じた：
・第２４〜４５日に１０ｍｇ／ｋｇ（Ｐ＜０．０１ 第２４、３５〜３８および４５日；Ｐ＜０．００１ 第２７〜３２および４１日）
・第２４〜４５日に２０ｍｇ／ｋｇ（Ｐ＜０．００１）
％Ｔ／Ｃは、第３２〜４５日に２０ｍｇ／ｋｇ／注射で活性のＮＣＩ基準の４２％以下に達した。
図３０〜３３は、ｑ７ｄｘ３で静脈内投与されたＢ３Ｆ６．１−ＤＭ４の２つの用量（１５および３０ｍｇ／ｋｇ／注射）または第１３〜１４日、第１７〜２１日、および第２４〜２６日に投薬されたイリノテカンの、樹立Ｃａｌｕ−６異種移植腫瘍を持つ胸腺欠損ヌードマウスの腫瘍重量、最終腫瘍重量、％試験／対照、および体重の変化に対する影響を示す。Ｂ３Ｆ６．１−ＤＭ４は、次の期間に亘って両方の用量で腫瘍成長の有意な阻害を生じた：
・第３２〜４５日に１５ｍｇ／ｋｇ（ｐ＜０．０１ 第３２〜３５および４５日；Ｐ＜０．００１ 第３８〜４１）
・第２４〜４５日に３０ｍｇ／ｋｇ（ｐ＜０．０１ 第２４日、Ｐ＜０．０１ 第２７〜４５日）
％Ｔ／Ｃは、第３２〜４５日に３０ｍｇ／ｋｇで活性のＮＣＩ基準の４２％以下に達した。
１０ｍｇ／ｋｇ／注射のＢ３Ｆ６．１−ＤＭ４の１匹のマウスが移植第３２日後、Ｂ３Ｆ６．１−ＤＭ４のその最終投薬を受けた１１日後に死亡して発見された。動物は投薬後の毒性の徴候を示さず、該グループの他の動物のいずれも健康障害を示さなかった。
グループＢ３Ｆ６．１−ＤＭ４、３０ｍｇ／ｋｇ／注射グループのすべてのマウスは、皮膚にｃｏｒｙｎｅｏｆｏｒｍ細菌感染を経験したが、Ｂ３Ｆ６．１−ＤＭ１の最終用量を投薬した数日後に回復した。この細菌は皮膚に存在して、動物がストレスを受けた場合に発生しうる日和見感染と見なされる。このグループの動物は投薬中のに５〜１５％の体重減少を経験したが、体重減少および感染はどちらも投薬を中止したら回復した。このグループの１匹のマウスは、右耳耳介に二次ブドウ球菌感染を経験したが、数日以内に回復した。
均等物
当業者は、日常的な実験のみを使用して、本明細書で述べた本発明の具体的な実施形態の多くの均等物を認識、または確認できるであろう。そのような均等物は、上記の請求項に含まれるものとする。
図１Ａ（配列番号：１） ヒト重鎖および軽鎖定常ドメインに融合されたマウス重鎖および軽鎖可変ドメイン、それぞれＧ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［ＧｌｙＳｅｒ］ヒンジ結合ペプチドを含有する（ｃｈＢ３Ｆ６）より成る、重鎖ＣＨ２ドメイン欠失キメラ抗Ｃｒｉｐｔｏモノクローナル抗体のＤＮＡ配列を示す。図１Ｂ（配列番号：２） 軽鎖ＣＨ２ドメイン欠失ｃｈＢ３Ｆ６のＤＮＡ配列を示す。 図２Ａ（配列番号：３） Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［ＧｌｙＳｅｒ］ヒンジ結合ペプチドを含有する重鎖ＣＨ２ドメイン欠失ｃｈＢ３Ｆ６のアミノ酸配列を示す。図２Ｂ（配列番号：４） 軽鎖ＣＨ２ドメイン欠失ｃｈＢ３Ｆ６のアミノ酸配列を示す。 Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］結合ペプチド（配列番号：５）のＣＨ２ドメイン欠失ｃｈＢ３Ｆ６抗体内への包含が、わずかなまたは検出できないフォームＢを伴う本質的にすべてのフォームＡ抗体の産生を引き起こすことを示す（レーン４を参照）。 キメラＢ３Ｆ６（ｃｈＢ３Ｆ６）および結合ペプチドを含むキメラＢ３Ｆ６ドメイン欠失抗体（Ｂ３Ｆ６ΔＣＨ２ Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５）がＧＥＯ腫瘍細胞への結合に関して同程度に競合することを示す。 ドナーマウスＢ３Ｆ６軽鎖可変領域、ヒトアクセプタ、および作製した各種のヒト化形の軽鎖の配列比較を示す。ＣＤＲ配列は影付きである。ドナーとアクセプタとの間のＦＲアミノ酸残基の相違は太字になっている。作製された復帰突然変異ｓは、太字および小文字で示す。Ｋａｂａｔ番号は配列比較の上部に沿って示す。 ドナーマウスＢ３Ｆ６重鎖領域、ヒトアクセプタ、および作製した各種のヒト化形の重鎖の配列比較を示す。ＣＤＲ配列は影付きである。ドナーとアクセプタとの間のＦＲアミノ酸残基の相違は太字になっている。作製された復帰突然変異ｓは、太字および小文字で示す。Ｋａｂａｔ番号は配列比較の上部に沿って示す。 ドメイン欠失抗体（ヒンジ結合ペプチド（ＨＣＰ）を含む）を作製するために使用した定常領域配列および全長抗体を作製するために使用した全長ＩｇＧ１定常領域配列を示す。 キメラドメイン欠失Ｂ３Ｆ６のドメイン欠失ヒト化Ｂ３Ｆ６バージョン１およびバージョン２との結合の比較を示す。 キメラドメイン欠失Ｂ３Ｆ６のドメイン欠失ヒト化Ｂ３Ｆ６バージョン３、バージョン４、バージョン５、およびバージョン６との結合の比較を示す。 腫瘍重量の変化によって測定した、ＤＭ４に接合した全長Ｂ３Ｆ６の、ヌードマウスにおける樹立ＢＴ−４７４異種移植腫瘍に対する効果を示す。Ｂ３Ｆ６．１−ＤＭ４コンジュゲートを１５ｍｇ／ｋｇ、静脈内、７日ごとに３ヶ月間（ｑ７ｄｘ３）および第４３日（ｎ＝８）に、またはｑ７ｄｘ３および第４３日に２５ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝８）で投与、Ｂ３Ｆ６．１−ＤＭ４を３５ｍｇ／ｋｇ、静脈内、ｑ７ｄｘ３（ｎ＝８）で、または第１５、２２、３３、および３６日（ｎ＝８）に投与、ビヒクル（ｎ＝１６）を静脈内にｑ７ｄｘ３にて投与、そしてタキソール（ｎ＝７）を第１５日から開始して腹腔内にｑ４ｄｘ３にて投与した。垂直棒は平均値の標準誤差を示す。 パネルＡおよびＢは、ヌードマウスのＢＴ−４７４異種移植腫瘍に対するＤＭ４に接合した全長Ｂ３Ｆ６の効果を示す。樹立ＢＴ−４７４ヒト乳癌を持つマウスを、Ｂ３Ｆ６．１−ＤＭ４により１５ｍｇ／ｋｇ、静脈内、ｑ７ｄｘ３および第４３日（ｎ＝８）またはｑ７ｄｘ３および第４３日の２５ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝８）で、Ｂ３Ｆ６．１−ＤＭ４により３５ｍｇ／ｋｇ、静脈内、ｑ７ｄｘ３（ｎ＝８）または第１５、２２、３３、および３６日（ｎ＝８）に、ビヒクルにより（ｎ＝１６）、静脈内、ｑ７ｄｘ３で、タキソールにより（ｎ＝７）、ＩＰ、第１５日から開始してｑ４ｄｘ３で処置した。パネルＡは、第５８日の個々の腫瘍重量を示す。パネルＢは、第７６日の残りの処置群の個々の腫瘍重量を示す。各点は１匹のマウスの腫瘍重量を表し、水平棒は各群の平均腫瘍重量を表す。 パネルＡおよびＢは、ヌードマウスのＢＴ−４７４異種移植腫瘍に対するＤＭ４に接合した全長Ｂ３Ｆ６の効果を示す。樹立ＢＴ−４７４ヒト乳癌を持つマウスを、Ｂ３Ｆ６．１−ＤＭ４により１５ｍｇ／ｋｇ、静脈内、ｑ７ｄｘ３および第４３日（ｎ＝８）またはｑ７ｄｘ３および第４３日の２５ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝８）で、Ｂ３Ｆ６．１−ＤＭ４により３５ｍｇ／ｋｇ、静脈内、ｑ７ｄｘ３（ｎ＝８）または第１５、２２、３３、および３６日（ｎ＝８）に、ビヒクルにより（ｎ＝１６）、静脈内、ｑ７ｄｘ３で、タキソールにより（ｎ＝７）、ＩＰ、第１５日から開始してｑ４ｄｘ３で処置した。パネルＡは、第５８日の個々の腫瘍重量を示す。パネルＢは、第７６日の残りの処置群の個々の腫瘍重量を示す。各点は１匹のマウスの腫瘍重量を表し、水平棒は各群の平均腫瘍重量を表す。 ＤＭ４に接合した全長Ｂ３Ｆ６およびタキソールの、ヌードマウスの樹立ＢＴ−４７４異種移植腫瘍に対する効果を示す。図は、試験群平均腫瘍サイズの比較を平均ビヒクル対照腫瘍サイズのパーセンテージとして示す。樹立ＢＴ−４７４ヒト乳癌を持つヌードマウスを、Ｂ３Ｆ６．１−ＤＭ４により１５ｍｇ／ｋｇ、静脈内、ｑ７ｄｘ３および第４３日（ｎ＝８）またはｑ７ｄｘ３および第４３日の２５ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝８）で、Ｂ３Ｆ６．１−ＤＭ４により３５ｍｇ／ｋｇ、静脈内、ｑ７ｄｘ３（ｎ＝８）または第１５、２２、３３、および３６日（ｎ＝８）に、ビヒクルにより（ｎ＝１６）、静脈内、ｑ７ｄｘ３で、タキソールにより（ｎ＝７）腹腔内、第１５日から開始してｑ４ｄｘ３で処置した。水平棒は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（国立癌研究所）の活性基準（４２％）を表す。 ＢＴ−４７４ヒト乳癌を移植して、ＤＭ４に接合した全長Ｂ３Ｆ６またはタキソールで処置したヌードマウスの平均体重を示す。マウスを、Ｂ３Ｆ６．１−ＤＭ４により１５ｍｇ／ｋｇ、静脈内、ｑ７ｄｘ３および第４３日（ｎ＝８）またはｑ７ｄｘ３および第４３日の２５ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝８）で、Ｂ３Ｆ６．１−ＤＭ４により３５ｍｇ／ｋｇ、静脈内、ｑ７ｄｘ３（ｎ＝８）または第１５、２２、３３、および３６日（ｎ＝８）に、ビヒクルにより（ｎ＝１６）静脈内、ｑ７ｄｘ３で、タキソールにより（ｎ＝７）、腹腔内、第１５日から開始してｑ４ｄｘ３で処置した。垂直棒は、平均値の標準誤差を表す。 腫瘍重量の変化によって測定した、ＢＴ−４７４乳癌細胞に対するドメイン欠失（ｄｄ）ｈｕＢ３Ｆ６−ＤＭ４の効果を示す。１８ｍｇ／ｋｇの、５回用量の場合は１０ｍｇ／ｋｇのＤＭ−４結合抗体、そして２５ｍｇ／ｋｇのタキソールによって、著しい効果が認められた。 腫瘍重量の変化によって測定した、ＢＴ−４７４癌細胞に対するドメイン欠失（ｄｄ）ｈｕＢ３Ｆ６−ＤＭ４の効果を示す。動物には３週間の退行／静止の後に再投薬した。１０ｍｇ／ｋｇのＤＭ−４接合抗体および２５ｍｇ／ｋｇタキソールによって、著しい効果が認められた。 ＢＴ−４７４癌細胞に対するドメイン欠失（ｄｄ）ｈｕＢ３Ｆ６−ＤＭ４の効果を示す。腫瘍重量を試験腫瘍重量／ビヒクル対照のパーセンテージとして示す。タキソールおよび１０ｍｇ／ｋｇ ｈｕＢ３Ｆ６−ＤＭ４のどちらも、腫瘍重量を５０％以上減少させた。 腫瘍重量の変化によって測定した、ＢＴ−４７４癌細胞に対するドメイン欠失（ｄｄ）ｈｕＢ３Ｆ６−ＤＭ４の効果を示す。動物には、月曜日、水曜日、金曜日、そして月曜日に投薬した。第７群には７／８の動物が残った。 腫瘍重量の変化によって測定した、ヌードマウスの樹立ＮＣＣＩＴ異種移植腫瘍に対する、ＤＭ４に接合した全長Ｂ３Ｆ６またはシスプラチナムの効果を示す。６（ｎ＝８）、１０（ｎ＝８）、１５（ｎ＝８）および２５（ｎ＝８）ｍｇ／ｋｇのＢ３Ｆ６．１−ＤＭ４を静脈内、ｑ７ｄｘ３で投与し（矢印によって示すように）、ビヒクル（ｎ＝１６）を静脈内、ｑ７ｄｘ３で投与し、シスプラチナム（ｎ＝８）を皮下、２ｍｇ／ｋｇ、第１５日から開始して３ｘ／ｗｋｘ６で投与した。垂直棒は、平均値の標準誤差を表す。 パネルＡおよびＢは、ヌードマウスの腫瘍に対する全長Ｂ３Ｆ６．１−ＤＭ４の効果を散乱スポットで示す。樹立ＮＣＣＩＴヒト精巣腫瘍を持つヌードマウスを、Ｂ３Ｆ６．１−ＤＭ４によって６（ｎ＝８）、１０（ｎ＝８）、１５（ｎ＝８）、および２５（ｎ＝８）ｍｇ／ｋｇ、静脈内、ｑ７ｄｘ３で、ビヒクルによって（ｎ＝１６）、静脈内、ｑ７ｄｘ３で、そしてシスプラチナムによって（ｎ＝８）、皮下、第１５日から開始して３ｘ／ｗｋｘ４で処置した。パネルＡは、第７０日の個々の腫瘍重量を示す。パネルＢは、第１０７日に残存する処置群の個々の腫瘍重量を示す。各点は１匹のマウスの腫瘍重量を表し、棒は各群の平均腫瘍重量を表す。 パネルＡおよびＢは、ヌードマウスの腫瘍に対する全長Ｂ３Ｆ６．１−ＤＭ４の効果を散乱スポットで示す。樹立ＮＣＣＩＴヒト精巣腫瘍を持つヌードマウスを、Ｂ３Ｆ６．１−ＤＭ４によって６（ｎ＝８）、１０（ｎ＝８）、１５（ｎ＝８）、および２５（ｎ＝８）ｍｇ／ｋｇ、静脈内、ｑ７ｄｘ３で、ビヒクルによって（ｎ＝１６）、静脈内、ｑ７ｄｘ３で、そしてシスプラチナムによって（ｎ＝８）、皮下、第１５日から開始して３ｘ／ｗｋｘ４で処置した。パネルＡは、第７０日の個々の腫瘍重量を示す。パネルＢは、第１０７日に残存する処置群の個々の腫瘍重量を示す。各点は１匹のマウスの腫瘍重量を表し、棒は各群の平均腫瘍重量を表す。 ヌードマウスの樹立ＮＣＣＩＴ異種移植腫瘍に対する、ＤＭ４に接合した全長Ｂ３Ｆ６またはシスプラチナムの効果を示す。図は、試験群平均腫瘍サイズの比較を平均ビヒクル対照腫瘍サイズのパーセンテージとして示す。樹立ＮＣＣＩＴヒト精巣腫瘍を持つヌードマウスを、Ｂ３Ｆ６．１−ＤＭ４によって６（ｎ＝８）、１０（ｎ＝８）、１５（ｎ＝８）、および２５（ｎ＝８）ｍｇ／ｋｇ、静脈内、ｑ７ｄｘ３で、ビヒクルによって（ｎ＝１６）、静脈内、ｑ７ｄｘ３で、そしてシスプラチナムによって（ｎ＝８）、皮下、第１５日から開始して３ｘ／ｗｋｘ４で処置した。棒は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの活性基準（４２％）を表す。 ＮＣＣＩＴ異種移植腫瘍を移植して、ＤＭ４に接合した全長Ｂ３Ｆ６またはシスプラチナムで処置したマウスの平均体重を示す。マウスを、Ｂ３Ｆ６．１−ＤＭ４によって６（ｎ＝８）、１０（ｎ＝８）、１５（ｎ＝８）、および２５（ｎ＝８）ｍｇ／ｋｇ、静脈内、ｑ７ｄｘ３で、ビヒクルによって（ｎ＝１６）、静脈内、ｑ７ｄｘ３で、そしてシスプラチナムによって（ｎ＝８）、皮下、第１５日から開始して３ｘ／ｗｋｘ４で処置した。垂直棒は、平均値の標準誤差を表す。 パネルＡおよびＢは、腫瘍重量の変化によって示される、ヌードマウスの樹立ＮＣＣＩＴ異種移植腫瘍に対する第１５日および再成長時に投薬したＤＭ４に接合した全長Ｂ３Ｆ６およびシスプラチナムの効果を示す。Ｂ３Ｆ６．１−ＤＭ４を２５（ｎ＝８）ｍｇ／ｋｇ、静脈内、第１５日に１回投与、Ｂ３Ｆ６．１−ＤＭ４を１０（ｎ＝８）ｍｇ／ｋｇ、静脈内で第１５、３７、および４４ａに投与、ビヒクルを（ｎ＝１６）、静脈内、ｑ７ｄｘ３で投与、シスプラチナムを（ｎ＝８）、皮下、２ｍｇ／ｋｇ、第１５日から開始して３ｘ／ｗｋｘ６で投与した。垂直棒は、平均値の標準誤差を表す。パネルＡは、１０ｍｇ／ｋｇで投薬したすべてのマウスの複合データを示す。パネルＢは、第１５、３７、および４４日に１０ｍｇ／ｋｇで投薬したマウス（ｎ＝３）のデータから分離した、第１５および３７日に１０ｍ／ｋｇで投薬したマウス（ｎ＝５）のデータを示す。ａ 第４４日に腫瘍が進行性成長を示していたマウス３匹のみに投薬した。 パネルＡおよびＢは、腫瘍重量の変化によって示される、ヌードマウスの樹立ＮＣＣＩＴ異種移植腫瘍に対する第１５日および再成長時に投薬したＤＭ４に接合した全長Ｂ３Ｆ６およびシスプラチナムの効果を示す。Ｂ３Ｆ６．１−ＤＭ４を２５（ｎ＝８）ｍｇ／ｋｇ、静脈内、第１５日に１回投与、Ｂ３Ｆ６．１−ＤＭ４を１０（ｎ＝８）ｍｇ／ｋｇ、静脈内で第１５、３７、および４４ａに投与、ビヒクルを（ｎ＝１６）、静脈内、ｑ７ｄｘ３で投与、シスプラチナムを（ｎ＝８）、皮下、２ｍｇ／ｋｇ、第１５日から開始して３ｘ／ｗｋｘ６で投与した。垂直棒は、平均値の標準誤差を表す。パネルＡは、１０ｍｇ／ｋｇで投薬したすべてのマウスの複合データを示す。パネルＢは、第１５、３７、および４４日に１０ｍｇ／ｋｇで投薬したマウス（ｎ＝３）のデータから分離した、第１５および３７日に１０ｍ／ｋｇで投薬したマウス（ｎ＝５）のデータを示す。ａ 第４４日に腫瘍が進行性成長を示していたマウス３匹のみに投薬した。 パネルＡおよびＢは、腫瘍重量の変化によって測定した、ヌードマウスの腫瘍に対する全長Ｂ３Ｆ６．１−ＤＭ４の効果を示す。樹立ＮＣＣＩＴヒト精巣腫瘍を持つマウスは、Ｂ３Ｆ６．１−ＤＭ４によって、２５（ｎ＝８）ｍｇ／ｋｇ、静脈内で第１５日に１回、Ｂ３Ｆ６．１−ＤＭ４によって１０（ｎ＝８）ｍｇ／ｋｇ、静脈内、第１５、３７、および４４日ａに、ビヒクルによって（ｎ＝１６）、静脈内、ｑ７ｄｘ３で、シスプラチナムによって（ｎ＝８）、皮下、２ｍｇ／ｋｇ、第１５日から開始して３ｘ／ｗｋｘ６で処置した。パネルＡは、第７０日の個々の腫瘍重量を示す。パネルＢは、第１０７日の残存する処置群の個々の腫瘍重量を示す。各点は１匹のマウスの腫瘍重量を表し、水平棒は各群の平均腫瘍重量を表す。 パネルＡおよびＢは、腫瘍重量の変化によって測定した、ヌードマウスの腫瘍に対する全長Ｂ３Ｆ６．１−ＤＭ４の効果を示す。樹立ＮＣＣＩＴヒト精巣腫瘍を持つマウスは、Ｂ３Ｆ６．１−ＤＭ４によって、２５（ｎ＝８）ｍｇ／ｋｇ、静脈内で第１５日に１回、Ｂ３Ｆ６．１−ＤＭ４によって１０（ｎ＝８）ｍｇ／ｋｇ、静脈内、第１５、３７、および４４日ａに、ビヒクルによって（ｎ＝１６）、静脈内、ｑ７ｄｘ３で、シスプラチナムによって（ｎ＝８）、皮下、２ｍｇ／ｋｇ、第１５日から開始して３ｘ／ｗｋｘ６で処置した。パネルＡは、第７０日の個々の腫瘍重量を示す。パネルＢは、第１０７日の残存する処置群の個々の腫瘍重量を示す。各点は１匹のマウスの腫瘍重量を表し、水平棒は各群の平均腫瘍重量を表す。 パネルＡおよびＢは、ヌードマウスの樹立ＮＣＣＩＴ異種移植腫瘍に対するＤＭ４に接合した全長Ｂ３Ｆ６およびシスプラチナムの効果を示す。図は、試験群の腫瘍サイズの平均変化の比較を、平均ビヒクル対照の腫瘍サイズの変化のパーセンテージとして示す。樹立ＮＣＣＩＴヒト精巣腫瘍を持つヌードマウスは、Ｂ３Ｆ６．１−ＤＭ４によって２５（ｎ＝８）ｍｇ／ｋｇ、静脈内で第１５日に１回、Ｂ３Ｆ６．１−ＤＭ４によって１０（ｎ＝８）ｍｇ／ｋｇ、静脈内、第１５、３７、および４４日ａに、ビヒクルによって（ｎ＝１６）、静脈内、ｑ７ｄｘ３で、シスプラチナムによって（ｎ＝８）、皮下、２ｍｇ／ｋｇ、第１５日から開始して３ｘ／ｗｋｘ６で処置した。パネルＡは、１０ｍｇ／ｋｇで投薬したすべてのマウスの複合データを示す。パネルＢは、第１５、３７、および４４日に１０ｍｇ／ｋｇ／注射を投薬したマウス（ｎ＝３）のデータから分離した、第１５および３７日に１０ｍ／ｋｇ／注射で投薬したマウス（ｎ＝５）のデータを示す。水平棒は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの活性基準（４２％）を表す。ａ 第４４日に腫瘍が進行性成長を示していたマウス３匹のみに１０ｍｇ／ｋｇで投薬した。 パネルＡおよびＢは、ヌードマウスの樹立ＮＣＣＩＴ異種移植腫瘍に対するＤＭ４に接合した全長Ｂ３Ｆ６およびシスプラチナムの効果を示す。図は、試験群の腫瘍サイズの平均変化の比較を、平均ビヒクル対照の腫瘍サイズの変化のパーセンテージとして示す。樹立ＮＣＣＩＴヒト精巣腫瘍を持つヌードマウスは、Ｂ３Ｆ６．１−ＤＭ４によって２５（ｎ＝８）ｍｇ／ｋｇ、静脈内で第１５日に１回、Ｂ３Ｆ６．１−ＤＭ４によって１０（ｎ＝８）ｍｇ／ｋｇ、静脈内、第１５、３７、および４４日ａに、ビヒクルによって（ｎ＝１６）、静脈内、ｑ７ｄｘ３で、シスプラチナムによって（ｎ＝８）、皮下、２ｍｇ／ｋｇ、第１５日から開始して３ｘ／ｗｋｘ６で処置した。パネルＡは、１０ｍｇ／ｋｇで投薬したすべてのマウスの複合データを示す。パネルＢは、第１５、３７、および４４日に１０ｍｇ／ｋｇ／注射を投薬したマウス（ｎ＝３）のデータから分離した、第１５および３７日に１０ｍ／ｋｇ／注射で投薬したマウス（ｎ＝５）のデータを示す。水平棒は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの活性基準（４２％）を表す。ａ 第４４日に腫瘍が進行性成長を示していたマウス３匹のみに１０ｍｇ／ｋｇで投薬した。 パネルＡおよびＢは、樹立ＮＣＣＩＴヒト精巣腫瘍を持ち、全長Ｂ３Ｆ６．１−ＤＭ４によって２５（ｎ＝８）ｍｇ／ｋｇ、静脈内で第１５日に１回、Ｂ３Ｆ６．１−ＤＭ４によって１０（ｎ＝８）ｍｇ／ｋｇ、静脈内、第１５、３７、および４４日ａに、ビヒクルによって（ｎ＝１６）、静脈内、ｑ７ｄｘ３で、シスプラチナムによって（ｎ＝８）、皮下、２ｍｇ／ｋｇ、第１５日から開始して３ｘ／ｗｋｘ６で処置したヌードマウスの平均体重を示す。パネルＡは、１０ｍｇ／ｋｇで投薬したすべてのマウスの複合データを示す。パネルＢは、第１５、３７、および４４日に１０ｍｇ／ｋｇ／注射を投薬したマウス（ｎ＝３）のデータから分離した、第１５および３７日に１０ｍ／ｋｇ／注射で投薬したマウス（ｎ＝５）のデータを示す。ａ 第４４日に腫瘍が進行性成長を示していたマウス３匹のみに１０ｍｇ／ｋｇで投薬した。 パネルＡおよびＢは、樹立ＮＣＣＩＴヒト精巣腫瘍を持ち、全長Ｂ３Ｆ６．１−ＤＭ４によって２５（ｎ＝８）ｍｇ／ｋｇ、静脈内で第１５日に１回、Ｂ３Ｆ６．１−ＤＭ４によって１０（ｎ＝８）ｍｇ／ｋｇ、静脈内、第１５、３７、および４４日ａに、ビヒクルによって（ｎ＝１６）、静脈内、ｑ７ｄｘ３で、シスプラチナムによって（ｎ＝８）、皮下、２ｍｇ／ｋｇ、第１５日から開始して３ｘ／ｗｋｘ６で処置したヌードマウスの平均体重を示す。パネルＡは、１０ｍｇ／ｋｇで投薬したすべてのマウスの複合データを示す。パネルＢは、第１５、３７、および４４日に１０ｍｇ／ｋｇ／注射を投薬したマウス（ｎ＝３）のデータから分離した、第１５および３７日に１０ｍ／ｋｇ／注射で投薬したマウス（ｎ＝５）のデータを示す。ａ 第４４日に腫瘍が進行性成長を示していたマウス３匹のみに１０ｍｇ／ｋｇで投薬した。 １０（ｎ＝８）および２０（ｎ＝８）ｍｇ／ｋｇ、静脈内で第１３、１７、および２１日に（矢印で示すように）投与した全長Ｂ３Ｆ６．１−ＤＭ４、静脈内、第１４日から開始して３ｘ／ｗｋｘ４で投与したビヒクル（ｎ＝１６）、および１０ｍｇ／ｋｇ、皮下で、第１３〜１４、１７〜２１、２４〜２６日に投与したカンプトサール（ｎ＝８）の、ヌードマウスの樹立Ｃａｌｕ−６異種移植腫瘍の腫瘍重量変化に対する効果を示す。垂直棒は、平均値の標準誤差を示す。 ヌードマウスの樹立Ｃａｌｕ−６異種移植腫瘍に対するＤＭ４に接合した全長Ｂ３Ｆ６の効果を示す。マウスを、Ｂ３Ｆ６．１−ＤＭ４によって１０（ｎ＝８）および２０（ｎ＝８）ｍｇ／ｋｇ、静脈内で第１３、１７、および２１日に、ビヒクルによって（ｎ＝１６）、静脈内で第１４日から開始して３ｘ／ｗｋｘ４で、カンプトサールによって（ｎ＝８）、１０ｍｇ／ｋｇ、皮下で、第１３〜１４、１７〜２１、２４〜２６日に処置した。各点は１匹のマウスの腫瘍重量を表し、水平棒は各群の平均腫瘍重量を表す。 ヌードマウスの樹立Ｃａｌｕ−６異種移植腫瘍に対するＤＭ４に接合した全長Ｂ３Ｆ６またはカンプトサールの効果を示す。図は、試験群平均腫瘍サイズの比較を、平均ビヒクル対照腫瘍サイズのパーセンテージとして示す。樹立Ｃａｌｕ−６異種移植腫瘍を持つヌードマウスを、Ｂ３Ｆ６．１−ＤＭ４によって１０（ｎ＝８）および２０（ｎ＝８）ｍｇ／ｋｇ、静脈内で第１３、１７、および２１日に、ビヒクルによって（ｎ＝１６）、静脈内で第１４日から開始して３ｘ／ｗｋｘ４で、カンプトサールによって（ｎ＝８）、１０ｍｇ／ｋｇ、皮下で第１３〜１４、１７〜２１、２４〜２６日に処置した。棒は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの活性基準（４２％）を表す 樹立Ｃａｌｕ−６異種移植腫瘍を持ち、ＤＭ４に接合した全長Ｂ３Ｆ６で処置したヌードマウスの平均体重を示す。マウスを、Ｂ３Ｆ６．１−ＤＭ４によって１０（ｎ＝８）および２０（ｎ＝８）ｍｇ／ｋｇ、静脈内で第１３、１７、および２１日に（矢印によって示すように）、ビヒクルによって（ｎ＝１６）、静脈内で第１４日から開始して３ｘ／ｗｋｘ４で、カンプトサールによって（ｎ＝８）、１０ｍｇ／ｋｇ、皮下で第１３〜１４、１７〜２１、２４〜２６日に処置した。垂直棒は、平均値の標準誤差を示す。 ヌードマウスの樹立Ｃａｌｕ−６異種移植腫瘍に対するＤＭ４に接合した全長Ｂ３Ｆ６またはカンプトサールの効果を示す。Ｂ３Ｆ６．１−ＤＭ４を１５（ｎ＝８）および３０（ｎ＝８）ｍｇ／ｋｇにて、静脈内、ｑ７ｄｘ３（矢印で示すように）で投与し、ビヒクル（ｎ＝１６）を第１４日から開始して静脈内、３ｘ／ｗｋｘ４で投与し、カンプトサール（ｎ＝８）を１０ｍｇ／ｋｇ、皮下で第１３〜１４、１７〜２１、２４〜２６日に投与した。樹立Ｃａｌｕ−６異種移植腫瘍の腫瘍重量の変化を示す。垂直棒は、平均値の標準誤差を示す。 ヌードマウスの樹立Ｃａｌｕ−６異種移植腫瘍に対する全長Ｂ３Ｆ６．１−ＤＭ４の効果を示す。樹立Ｃａｌｕ−６異種移植腫瘍を持つヌードマウスを、Ｂ３Ｆ６．１−ＤＭ４によって１５（ｎ＝８）および３０（ｎ＝８）ｍｇ／ｋｇ、静脈内、ｑ７ｄｘ３で、ビヒクルによって（ｎ＝１６）、静脈内、第１４日から開始して３ｘ／ｗｋｘ４で、カンプトサールによって（ｎ＝８）、１０ｍｇ／ｋｇ、皮下で第１３〜１４、１７〜２１、２４〜２６日に処置した。各点は１匹のマウスの腫瘍重量を表し、水平棒は各群の平均腫瘍重量を表す。 マウスの樹立Ｃａｌｕ−６異種移植腫瘍に対するＤＭ４に接合した全長Ｂ３Ｆ６またはカンプトサールの効果を示す。データは平均ビヒクル対照腫瘍サイズのパーセンテージとしての、試験群平均腫瘍サイズの比較として示す。樹立Ｃａｌｕ−６異種移植腫瘍を持つヌードマウスを、Ｂ３Ｆ６．１−ＤＭ４によって１５（ｎ＝８）および３０（ｎ＝８）ｍｇ／ｋｇ、静脈内、ｑ７ｄｘ３で、ビヒクルによって（ｎ＝１６）、静脈内、第１４日から開始して３ｘ／ｗｋｘ４で、カンプトサール（ｎ＝８）、１０ｍｇ／ｋｇ、皮下で第１３〜１４、１７〜２１、２４〜２６日に処置した。棒はＮａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの活性基準（４２％）を示す。 樹立Ｃａｌｕ−６ヒト肺未分化腫瘍を持ち、全長Ｂ３Ｆ６．１−ＤＭ４によって１５（ｎ＝８）および３０（ｎ＝８）ｍｇ／ｋｇ、静脈内、ｑ７ｄｘ３ ９矢印で示すように）、ビヒクルによって（ｎ＝１６）、静脈内、第１４日から開始して３ｘ／ｗｋｘ４で、イリノテカン（ｎ＝８）１０ｍｇ／ｋｇ、皮下で第１３〜１４、１７〜２１、２４〜２６日に処置したヌードマウスの体重を示す。垂直棒は、平均値の標準誤差を示す。

Claims (97)

  1. 結合分子であって：
    （ｉ）
    Figure 2008526234
     を含む群より選択される少なくとも１個のＣＤＲ配列と；
    （ｉｉ）ヒトアクセプタ免疫グロブリン配列由来の可変フレームワーク領域配列と；
    を含み、ヒトＣｒｉｐｔｏ抗原に特異的に結合する結合分子。
  2. ＣＤＲ Ｈ３配列
    Figure 2008526234
     （配列番号：１４）を含む、請求項１に記載の結合分子。
  3. ＣＤＲ Ｈ２配列
    Figure 2008526234
     （配列番号：１３）を含む、請求項１または２に記載の結合分子。
  4. ＣＤＲ Ｈ１配列
    Figure 2008526234
     （配列番号：１２）を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の結合分子。
  5. ＣＤＲ Ｌ３配列
    Figure 2008526234
     （配列番号：１１）を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の結合分子。
  6. ＣＤＲ Ｌ２配列
    Figure 2008526234
     （配列番号：１０）を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の結合分子。
  7. ＣＤＲ Ｌ１配列
    Figure 2008526234
     （配列番号：９）を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の結合分子。
  8. 前記可変フレームワーク領域配列の少なくとも１個のフレームワーク残基が相当するマウスＢ３Ｆ６可変領域配列由来の対応するアミノ酸残基によって置換される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の結合分子。
  9. 結合分子であって：
    （ａ）配列番号：３９のＣＤＲ１〜３と、ヒトアクセプタ免疫グロブリン軽鎖配列由来の可変フレームワーク領域とを含む軽鎖可変領域と；
    （ｂ）配列番号：４０のＣＤＲ１〜３と、ヒトアクセプタ免疫グロブリン重鎖由来の可変フレームワーク領域とを含む重鎖可変領域と；
    を含み、ヒトＣｒｉｐｔｏ抗原に特異的に結合する；
    結合分子。
  10. 前記ヒトアクセプタ免疫グロブリン重鎖由来の可変フレームワーク領域が、配列番号：４０のフレームワークおよびＣＤＲ領域と少なくとも約５０％は同一である、請求項９に記載の結合分子。
  11. 前記ヒトアクセプタ免疫グロブリン重鎖由来の可変フレームワーク領域がヒトサブグループ１配列、ヒトサブグループ１コンセンサス配列、またはヒト生殖系列配列に由来する、請求項９または１０に記載の結合分子。
  12. 前記ヒトアクセプタ免疫グロブリン重鎖由来の可変フレームワーク領域が配列番号：４６で示すアミノ酸配列を含む、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の結合分子。
  13. 前記ヒトアクセプタ免疫グロブリン軽鎖配列由来の可変フレームワーク領域が、配列番号：３９のフレームワークおよびＣＤＲ領域と少なくとも約６０％は同一である、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の結合分子。
  14. 前記ヒトアクセプタ免疫グロブリン軽鎖配列由来の可変フレームワーク領域がヒトサブグループＫａｐｐａ ２配列、ヒトサブグループＫａｐｐａ ２コンセンサス配列、またはヒト生殖系列配列に由来する、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の結合分子。
  15. 前記ヒトアクセプタ免疫グロブリン軽鎖配列由来の可変フレームワーク領域が配列番号：４５で示すアミノ酸配列を含む、請求項９〜１４のいずれか一項に記載の結合分子。
  16. 前記ヒトアクセプタ免疫グロブリン重鎖由来の可変フレームワーク領域の少なくとも１個のフレームワーク残基が、配列番号：４０で示すマウスアミノ酸配列由来の対応するアミノ酸残基と置換され、該少なくとも１個のアミノ酸残基が
    ａ）標準残基、
    ｂ）インタフェースパッキング残基、
    ｃ）結合部位に近い異常または希少な残基、
    ｄ）ＣＤＲ内の一部の原子の約３オングストロームユニット以内の側鎖原子を有する残基、
    である、請求項９〜１５のいずれかに記載の結合分子。
  17. 前記少なくとも１個のフレームワーク残基がＨ１、Ｈ４８、Ｈ６７、Ｈ７１、Ｈ７３、Ｈ８１、Ｈ８２ｂ、Ｈ９３、およびＨ１１２（Ｋａｂａｔ番号付け規則）から成る群より選択される、請求項１６に記載の結合分子。
  18. 前記少なくとも１個のフレームワーク残基がＨ４８、Ｈ６７、Ｈ７１、Ｈ７３、Ｈ９３、およびＨ１１２を含む請求項１６または１７に記載の結合分子。
  19. 前記少なくとも１個のフレームワーク残基がＨ７１およびＨ１１２である、請求項１６〜１８のいずれかに記載の結合分子。
  20. 前記少なくとも１個のフレームワーク残基がＨ１、Ｈ４８、Ｈ７１、Ｈ８１、Ｈ８２ｂ、およびＨ１１２を含む、請求項１６〜１９のいずれかに記載の結合分子。
  21. 前記ヒトアクセプタ免疫グロブリン軽鎖配列由来の可変フレームワーク領域の少なくとも１個のフレームワーク残基が配列番号：３９で示すマウス配列由来の対応するアミノ酸残基と置換され、該少なくとも１個のアミノ酸残基が
    ａ）標準残基、
    ｂ）インタフェースパッキング残基、
    ｃ）結合部位に近い異常または希少な残基、
    ｄ）ＣＤＲ内の一部の原子の約３オングストロームユニット以内の側鎖原子を有する残基、
    である、請求項１６〜２０のいずれかに記載の結合分子。
  22. 前記ヒトアクセプタ免疫グロブリン軽鎖配列由来の可変フレームワーク領域がＬ２またはＬ１００（Ｋａｂａｔ番号付け規則）である、請求項２１のいずれかに記載の結合分子。
  23. 前記ヒトアクセプタ免疫グロブリン軽鎖配列由来の可変フレームワーク領域がＬ２である、請求項２１または２２に記載の結合分子。
  24. 前記ヒトアクセプタ免疫グロブリン軽鎖配列由来の可変フレームワーク領域がＬ２およびＬ１００を含む、請求項２１〜２３に記載の結合分子。
  25. 結合分子であって：
    （ａ）配列番号：４７、配列番号：５０、および配列番号：５２のアミノ酸残基１〜１１２から成る群より選択されるＶＬ配列で示すＣＤＲおよびフレームワークアミノ酸配列と；場合によりシグナル配列とを含む軽鎖と；
    （ｂ）配列番号：４８、配列番号：４９、配列番号：５１、および配列番号：５５のアミノ酸残基１〜１２１から成る群より選択されるＶＨ配列で示すＣＤＲおよびフレームワークアミノ酸配列と；場合によりシグナル配列とを含む重鎖と；
    を含み、ヒトＣｒｉｐｔｏ抗原に特異的に結合する；
    結合分子。
  26. （ａ）配列番号：５２のアミノ酸１〜１１２で示すフレームワークおよびＣＤＲアミノ酸配列と、場合によりシグナル配列とを含む軽鎖と；
    （ｂ）配列番号：５５のアミノ酸１〜１２１で示すフレームワークおよびＣＤＲアミノ酸配列と、場合によりシグナル配列とを含む重鎖と；
    を含む、請求項２５に記載の結合分子。
  27. （ａ）配列番号：４７で示すフレームワークおよびＣＤＲアミノ酸配列と、場合によりシグナル配列とを含む軽鎖と；
    （ｂ）配列番号：４８で示すフレームワークおよびＣＤＲアミノ酸配列と、場合によりシグナル配列とを含む重鎖と；
    を含む、請求項２５に記載の結合分子。
  28. （ａ）配列番号：４７で示すフレームワークおよびＣＤＲアミノ酸配列と、場合によりシグナル配列とを含む軽鎖と；
    （ｂ）配列番号：４９で示すフレームワークおよびＣＤＲアミノ酸配列と、場合によりシグナル配列とを含む重鎖と；
    を含む、請求項２５に記載の結合分子。
  29. （ａ）配列番号：４７で示すフレームワークおよびＣＤＲアミノ酸配列と、場合によりシグナル配列とを含む軽鎖と；
    （ｂ）配列番号：５１で示すフレームワークおよびＣＤＲアミノ酸配列と、場合によりシグナル配列とを含む重鎖と；
    を含む、請求項２５に記載の結合分子。
  30. （ａ）配列番号：５０で示すフレームワークおよびＣＤＲアミノ酸配列と、場合によりシグナル配列とを含む軽鎖と；
    （ｂ）配列番号：４８で示すフレームワークおよびＣＤＲアミノ酸配列と、場合によりシグナル配列とを含む重鎖と；
    を含む、請求項２５に記載の結合分子。
  31. （ａ）配列番号：５０で示すフレームワークおよびＣＤＲアミノ酸配列と、場合によりシグナル配列とを含む軽鎖と；
    （ｂ）配列番号：４９で示すフレームワークおよびＣＤＲアミノ酸配列と、場合によりシグナル配列とを含む重鎖と；
    を含む、請求項２５に記載の結合分子。
  32. （ａ）配列番号：５０で示すフレームワークおよびＣＤＲアミノ酸配列と、場合によりシグナル配列とを含む軽鎖と；
    （ｂ）配列番号：５１で示すフレームワークおよびＣＤＲアミノ酸配列と、場合によりシグナル配列とを含む重鎖と；
    を含む、請求項２５に記載の結合分子。
  33. 前記結合分子重鎖が、ＶＨ、ＶＬ、またはＣＨ１ドメインに合成結合ペプチドを介して遺伝的に融合したＣＨ３ドメインを含む、請求項９〜３２のいずれかに記載の結合分子。
  34. 前記結合分子重鎖がＣＨ２ドメインの全部または一部を欠失している、請求項９〜３３のいずれかに記載の結合分子。
  35. ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４から成る群より選択されるアイソタイプの抗体に由来する定常領域を含む、請求項９〜３４のいずれかに記載の結合分子。
  36. γ１ヒンジ、γ２ヒンジ、γ３ヒンジ、およびγ４ヒンジから成る群より選択されるヒンジ領域に由来するアミノ酸配列を含む、請求項９〜３５のいずれかに記載の結合分子。
  37. キメラヒンジを含む、請求項９〜３６のいずれかに記載の結合分子。
  38. 前記結合分子がＩｇＧ１ヒンジドメインの少なくとも部分、ＩｇＧ３ヒンジドメインの少なくとも部分を含む、請求項９〜３７のいずれかに記載の結合分子。
  39. 前記結合分子が位置２３９または２４２（Ｋａｂａｔ番号付けシステム）にシステイン残基を含む重鎖定常領域を含む、請求項９〜３８のいずれかに記載の結合分子。
  40. 前記結合分子が野生型Ｆｃ領域と比較して少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む重鎖定常領域を含む、請求項９〜３９のいずれかに記載の結合分子。
  41. 前記修飾が、哺乳類細胞内で改変体が発現されたときに実質的にグリコシル化されるように、ＥＵ位置２９７〜２９９のいずれかにアミノ酸置換を含む、請求項４０に記載の結合分子。
  42. 前記結合分子が野生型Ｆｃ領域を有する結合分子と比較して低下したエフェクタ機能を有する、請求項４０または４１に記載の結合分子。
  43. 低下した抗原依存性細胞毒性を有する、請求項４２に記載の結合分子。
  44. 延長された半減期を有する、請求項４２または４３に記載の結合分子。
  45. 前記修飾Ｆｃ領域が少なくとも１個の操作されたシステイン残基を有する、請求項４０〜４５のいずれかに記載の結合分子。
  46. 前記操作されたシステイン残基が前記Ｆｃ領域のＣＨ３ドメイン内にある、請求項４５に記載の結合分子。
  47. エフェクタ部分に接合された、請求項１〜４６のいずれかに記載の結合分子。
  48. 前記エフェクタ部分が細胞毒、プロドラッグ、生体毒素、および放射性同位体から成る群より選択される、請求項４７に記載の結合分子。
  49. 前記エフェクタ部分がアミド結合を介して接合される。請求項４７に記載の結合分子。
  50. 前記エフェクタ部分がメイタンシノイドである、請求項４８に記載の結合分子。
  51. 前記軽鎖が配列番号：５３で示すフレームワークおよびＣＤＲアミノ酸配列を含み、前記重鎖が配列番号：５６で示すフレームワークおよびＣＤＲアミノ酸配列を含む、請求項２５に記載の結合分子。
  52. 前記軽鎖が配列番号：５３で示すフレームワークおよびＣＤＲアミノ酸配列を含み、前記重鎖が配列番号：５７で示すフレームワークおよびＣＤＲアミノ酸配列を含む、請求項２５に記載の結合分子。
  53. γ１アイソタイプの重鎖定常領域を含む、請求項５２に記載の結合分子。
  54. 配列番号：７１で示す重鎖定常領域配列を含む、請求項５２に記載の結合分子。
  55. アクセション番号 でＡＴＣＣに寄託された細胞系統によって産生された、ヒト化抗Ｃｒｉｐｔｏモノクローナル抗体。
  56. 前記軽鎖が配列番号：５３で示す配列を有し、前記重鎖が配列番号：５８で示す配列を有する、請求項２５に記載の結合分子。
  57. 前記軽鎖が配列番号：５４で示す配列を有し、前記重鎖が配列番号：５６で示す配列を有する、請求項２５に記載の結合分子。
  58. 前記軽鎖が配列番号：５４で示す配列を有し、前記重鎖が配列番号：５７で示す配列を有する、請求項２５に記載の結合分子。
  59. 前記軽鎖が配列番号：５４で示す配列を有し、前記重鎖が配列番号：５８で示す配列を有する、請求項２５に記載の結合分子。
  60. 前記軽鎖が配列番号：５２で示す配列を有し、前記重鎖が配列番号：５５で示す配列を有する、請求項２５に記載の結合分子。
  61. （ａ）配列番号：５２、配列番号：５３、および配列番号：５４から成る群より選択される軽鎖可変領域（ＶＬ）配列を含む軽鎖と；
    （ｂ）配列番号：５５；配列番号：５６、配列番号：５７、および配列番号：５８から成る群より選択される重鎖可変領域（ＶＨ）配列を含む重鎖と；
    を含み、ヒトＣｒｉｐｔｏ抗原に特異的に結合する；
    ＣＨ２ドメイン欠失結合分子。
  62. 前記軽鎖が配列番号：５３で示す配列を有し、前記重鎖が配列番号：６０で示す配列を有する、請求項５７に記載のドメイン欠失結合分子。
  63. 前記軽鎖が配列番号：５３で示す配列を有し、前記重鎖が配列番号：６１で示す配列を有する、請求項５７に記載のドメイン欠失結合分子。
  64. 前記軽鎖が配列番号：５３で示す配列を有し、前記重鎖が配列番号：６２で示す配列を有する、請求項５７に記載のドメイン欠失結合分子。
  65. 前記軽鎖が配列番号：５４で示す配列を有し、前記重鎖が配列番号：６０で示す配列を有する、請求項５７に記載のドメイン欠失結合分子。
  66. 前記軽鎖が配列番号：５４で示す配列を有し、前記重鎖が配列番号：６１で示す配列を有する、請求項５７に記載のドメイン欠失結合分子。
  67. 前記軽鎖が配列番号：５４で示す配列を有し、前記重鎖が配列番号：６２で示す配列を有する、請求項５７に記載のヒト化Ｂ３Ｆ６結合分子。
  68. 前記軽鎖が配列番号：５２で示す配列を有し、前記重鎖が配列番号：５９で示す配列を有する、請求項５７に記載のヒト化Ｂ３Ｆ６結合分子。
  69. 前記結合分子が、該結合分子の少なくとも１個のＣＤＲ内に少なくとも１個の保存的アミノ酸置換を含むように改変される、請求項９〜６８のいずれかに記載の結合分子。
  70. 二重特異性である、請求項９〜６９のいずれかに記載の結合分子。
  71. ４価である、請求項９〜６９のいずれかに記載の結合分子。
  72. 全長抗体である、請求項９〜６９のいずれかに記載の結合分子。
  73. 抗体断片である、請求項９〜６９のいずれかに記載の結合分子。
  74. 少なくとも２個の結合部位および少なくとも２個のポリペプチド鎖を有するポリペプチドダイマーを含む組成物であって、該少なくとも２個の結合部位のうち少なくとも一方がヒト化Ｂ３Ｆ６可変領域を含み、該少なくとも２個のポリペプチド鎖が少なくとも１個の重鎖部分および合成結合ペプチドを含み、該ポリペプチドダイマーの約７０％超が少なくとも１個の鎖間ジスルフィド結合を介して結合されるポリペプチド鎖を含み、該結合ペプチドがＫａｂａｔ番号付けシステムの位置２４３にプロリン残基を含む、組成物。
  75. 前記ポリペプチドダイマーの９０％超が少なくとも１個の鎖間ジスルフィド結合を介して連結される、請求項７３に記載の組成物。
  76. 前記合成結合ペプチドがＫａｂａｔ番号付けシステムの位置２３９または２４２にシステイン残基をさらに含む、請求項７３または７４に記載の組成物。
  77. 前記ポリペプチド鎖の少なくとも一方が、前記結合ペプチドを介してＶＬ、ＶＨまたはＣＨ１ドメインに連結されたＣＨ３ドメインを含む、請求項７３〜７５のいずれかに記載の組成物。
  78. 前記合成結合ペプチドがＫａｂａｔ番号付けシステムの位置２４４にアラニン残基を、Ｋａｂａｔ番号付けシステムの位置２４５にプロリン残基をさらに含む、請求項７３〜７６のいずれかに記載の組成物。
  79. 配列番号：５３で示す軽鎖アミノ酸配列と、配列番号：５７で示す重鎖アミノ酸配列とを含むヒト化抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体であって、メイタンソイドに接合される抗体。
  80. 請求項１〜７８のいずれか一項に記載の結合分子と、製薬的に許容される担体とを含む組成物。
  81. 請求項７８に記載の抗体の改変体であって、該改変体が少なくとも１個の保存的アミノ酸置換を含み、ヒトＣｒｉｐｔｏに特異的に結合する能力を保持する改変体。
  82. 請求項９〜５５のいずれか一項に記載の結合分子の重鎖または軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子。
  83. 高ストリンジェンシー条件下で請求項８１に記載の核酸分子の相補体にハイブリダイズする核酸分子。
  84. ベクター内にある、請求項８２に記載の核酸分子。
  85. 請求項８３に記載のベクターを含む宿主細胞。
  86. 前記結合分子を産生する方法であって、請求項９〜５５に記載のいずれか一項の宿主細胞を、該結合分子が産生される条件下で培養するステップと、該宿主細胞または培養物から該結合分子を単離するステップと、を包含する方法。
  87. 請求項１〜８０のいずれかに記載の結合分子による処置から恩恵を得る被験体を処置する方法であって、該結合分子をそのような処置が行われる被験体に投与するステップを含む方法。
  88. 悪性疾患が患者にて処置されるように、請求項１〜８０のいずれか一項に記載の結合分子をコード化する核酸分子を、該結合分子が発現されるような条件下で悪性疾患を有する患者に投与するステップを含む、悪性疾患を処置する方法。
  89. 前記被験体が癌に罹患している、請求項８６または８７に記載の方法。
  90. 追加の薬剤を投与するステップをさらに含む、請求項８６または８７に記載の方法。
  91. 前記追加の薬剤が化学療法剤である、請求項８９に記載の方法。
  92. 前記追加の薬剤がナタリズマブ、トラスツズマブ、ベバシズマブ、インフリキシマブ、リツキシマブ、イブリツモマブチウキセタン、セツキシマブ、塩酸レバミゾール、トシツモマブ、アレムツズマブ、ＩＭＣ−Ｃ２２５、メシル酸イマチニブ、フルベストラント、アナストロゾール、エキセメスタン、レトロゾール、タモキシフェン、インターフェロンアルファ、デニロイキンディフチトクス、オブリマーセン、エルロチニブＨＣｌ、ボルテゾミブ、サリドマイド、およびエンドスタチンから成る群より選択される、請求項８９に記載の方法。
  93. 前記患者に請求項７８に記載の結合分子の有効な投薬量を投与するステップを含む、患者の細胞におけるＣｒｉｐｔｏ発現の効果を阻害する方法。
  94. 前記結合分子の有効投薬量が少なくとも約５ｍｇ／ｋｇである、請求項９２に記載の方法。
  95. 前記結合分子の有効投薬量が少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇである、請求項９２に記載の方法。
  96. 前記結合分子が腹腔内に、経口的に、経鼻的に、皮下に、筋肉内に、局所的に、または静脈内に投与される、請求項９２に記載の方法。
  97. 前記患者が脳、乳房、精巣、結腸、肺、卵巣、膀胱、子宮、子宮頸部、膵臓および胃から成る群より選択される臓器の癌に罹患している、請求項９２に記載の方法。
JP2007550510A 2005-01-05 2006-01-05 Ｃｒｉｐｔｏ結合分子 Pending JP2008526234A (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US64169105P 2005-01-05 2005-01-05
PCT/US2006/000502 WO2006074397A2 (en) 2005-01-05 2006-01-05 Cripto binding molecules

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2008526234A true JP2008526234A (ja) 2008-07-24
JP2008526234A5 JP2008526234A5 (ja) 2009-01-15

Family

ID=36581648

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2007550510A Pending JP2008526234A (ja) 2005-01-05 2006-01-05 Ｃｒｉｐｔｏ結合分子

Country Status (17)

Country Link
US (1) US8021661B2 (ja)
EP (3) EP2311880A3 (ja)
JP (1) JP2008526234A (ja)
KR (1) KR20070100346A (ja)
CN (1) CN101137673B (ja)
AU (1) AU2006203889A1 (ja)
BR (1) BRPI0606398A (ja)
CA (1) CA2593212A1 (ja)
DK (1) DK1838736T3 (ja)
EA (1) EA200701448A1 (ja)
ES (1) ES2408704T3 (ja)
IL (2) IL184467A0 (ja)
NO (1) NO20073981L (ja)
NZ (1) NZ556788A (ja)
SG (1) SG173313A1 (ja)
WO (1) WO2006074397A2 (ja)
ZA (2) ZA200706348B (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013505732A (ja) * 2009-09-29 2013-02-21 ロシュ グリクアート アーゲー 二重特異性デス受容体アゴニスト抗体
JP2014515742A (ja) * 2011-04-01 2014-07-03 イミュノジェン， インコーポレイテッド Ｃｄ３７結合性分子及びその免疫複合体

Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7582299B2 (en) 2001-04-26 2009-09-01 Biogen Idec Ma Inc. Cripto-specific antibodies
CN100352501C (zh) 2001-04-26 2007-12-05 比奥根艾迪克Ma公司 Cripto阻断抗体及其用途
US20050163782A1 (en) 2003-06-27 2005-07-28 Biogen Idec Ma Inc. Modified binding molecules comprising connecting peptides
EP2311880A3 (en) 2005-01-05 2011-07-27 Biogen Idec MA Inc. Cripto binding molecules
US8455622B2 (en) * 2006-12-01 2013-06-04 Seattle Genetics, Inc. Variant target binding agents and uses thereof
US20100330081A1 (en) * 2007-06-01 2010-12-30 Biogen Idec Ma Inc. Cripto binding molecules
WO2010000714A2 (en) * 2008-07-04 2010-01-07 Oslo Universitetssykehus Hf Radioimmunoconjugate kit
EP2280022A1 (en) * 2009-07-31 2011-02-02 Consiglio Nazionale Delle Ricerche Cripto blocking molecules and therapeutic uses thereof
SG183542A1 (en) 2010-03-12 2012-10-30 Immunogen Inc Cd37-binding molecules and immunoconjugates thereof
CN103328514B (zh) * 2010-11-09 2015-12-02 阿尔蒂单抗治疗公司 用于抗原结合的蛋白复合物及其使用方法
JP6130307B2 (ja) 2011-03-17 2017-05-17 ザ ユニバーシティ オブ バーミンガム 再指向性免疫療法
US10035860B2 (en) 2013-03-15 2018-07-31 Biogen Ma Inc. Anti-alpha V beta 6 antibodies and uses thereof
US10035859B2 (en) 2013-03-15 2018-07-31 Biogen Ma Inc. Anti-alpha V beta 6 antibodies and uses thereof
UA118028C2 (uk) 2013-04-03 2018-11-12 Рош Глікарт Аг Біспецифічне антитіло, специфічне щодо fap і dr5, антитіло, специфічне щодо dr5, і спосіб їх застосування
MA40764A (fr) 2014-09-26 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agent thérapeutique induisant une cytotoxicité
JP2017531642A (ja) 2014-10-03 2017-10-26 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー エボラ糖タンパク質に結合する抗体およびその使用
WO2016087648A1 (en) * 2014-12-05 2016-06-09 Universität Für Bodenkultur Wien Immunoglobulins with incorporated heterologous ch3 domains resulting in a prolonged half-life
US20170000900A1 (en) 2015-06-08 2017-01-05 Immunogen, Inc. Anti-cd37 immunoconjugate and anti-cd20 antibody combinations
BR112018003147A2 (pt) 2015-08-28 2018-09-18 Debiopharm International S.A. anticorpos e testes para detecção de cd37
EP3535297B1 (en) 2016-11-02 2022-08-10 Debiopharm International, S.A. Methods for improving anti-cd37 immunoconjugate therapy
SG11201907288RA (en) 2017-02-28 2019-09-27 Seattle Genetics Inc Cysteine mutated antibodies for conjugation
KR20210099074A (ko) * 2018-12-03 2021-08-11 퓨전 파마슈티칼즈 인크. 방사성면역접합체와 dna 손상 및 복구 억제제의 조합 요법
EP3897851A2 (en) 2018-12-17 2021-10-27 Revitope Limited Twin immune cell engager
WO2021067628A2 (en) * 2019-10-01 2021-04-08 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Conformation-specific antibodies that bind nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated b cells
JP6761889B1 (ja) * 2019-11-11 2020-09-30 株式会社Ｇｓｐエンタープライズ 抗ヒトＣｒｉｐｔｏ−１抗体

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001506967A (ja) * 1996-08-02 2001-05-29 ブリストル―マイヤーズ・スクイブ・カンパニー 治療およびインビボ診断における免疫グロブリンの使用の結果としての免疫グロブリン誘発毒性の抑制方法
WO2002060955A2 (en) * 2001-01-29 2002-08-08 Idec Pharmaceuticals Corporation Modified antibodies and methods of use
JP2004534020A (ja) * 2001-04-26 2004-11-11 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド Ｃｒｉｐｔｏをブロックする抗体およびその使用

Family Cites Families (105)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5097A (en) 1847-05-01 N peters photo lithogr peer wasringto d o
US659684A (en) 1899-10-14 1900-10-16 John A W Lundborg Dental rubber-dam holder.
US3896111A (en) 1973-02-20 1975-07-22 Research Corp Ansa macrolides
DE2319495C2 (de) 1973-04-17 1985-01-10 Yeda Research And Development Co., Ltd., Rehovot Verfahren zum selektiven, reversiblen Binden von Biomolekülen an ein Adsorbens in einer chromatographischen Säule
US4000098A (en) 1974-08-16 1976-12-28 Palo Alto Medical Research Foundation Separation of proteins by hydrophobic adsorption
US4151042A (en) 1977-03-31 1979-04-24 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for producing maytansinol and its derivatives
US4563304A (en) 1981-02-27 1986-01-07 Pharmacia Fine Chemicals Ab Pyridine compounds modifying proteins, polypeptides or polysaccharides
US4631190A (en) 1981-06-26 1986-12-23 Shen Wei C Acidity-sensitive spacer molecule to control the release of pharmaceuticals from molecular carriers
AU561343B2 (en) 1981-10-19 1987-05-07 Genentech Inc. Human immune interferon by recombinant dna
US4612282A (en) 1981-12-15 1986-09-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Monoclonal antibodies reactive with human breast cancer
US4522918A (en) 1981-12-15 1985-06-11 Jeffery Schlom Process for producing monoclonal antibodies reactive with human breast cancer
US4542225A (en) 1984-08-29 1985-09-17 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Acid-cleavable compound
US4849407A (en) 1986-08-13 1989-07-18 Zymogenetics, Inc. Biologically active mosaic proteins
US4766073A (en) 1985-02-25 1988-08-23 Zymogenetics Inc. Expression of biologically active PDGF analogs in eucaryotic cells
US5157021A (en) 1985-03-15 1992-10-20 Novo Nordisk A/S Insulin derivatives and pharmaceutical preparations containing these derivatives
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
IL78444A (en) 1986-04-08 1992-05-25 Yeda Res & Dev Human gamma interferon-specific receptor protein,antibody against said protein,and compositions containing said protein and antibody
US4831175A (en) 1986-09-05 1989-05-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Backbone polysubstituted chelates for forming a metal chelate-protein conjugate
US5099069A (en) 1986-09-05 1992-03-24 Gansow Otto A Backbone polysubstituted chelates for forming a metal chelate-protein conjugate
US5246692A (en) 1986-09-05 1993-09-21 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Health And Human Services Backbone polysubstituted chelates for forming a metal chelate-protein conjugate
JP3095752B2 (ja) 1987-07-15 2000-10-10 アメリカ合衆国 Ｔａｇ‐７２及びヒト癌腫に対して結合特異性を有する第二世代モノクローナル抗体及びその使用方法
US5892019A (en) 1987-07-15 1999-04-06 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of a single-gene-encoded immunoglobulin
WO1990005183A1 (en) 1988-10-31 1990-05-17 Immunex Corporation Interleukin-4 receptors
EP0368684B2 (en) 1988-11-11 2004-09-29 Medical Research Council Cloning immunoglobulin variable domain sequences.
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5225538A (en) 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
DK0474744T3 (da) 1989-05-22 1994-11-21 Zymogenetics Inc PDGF-alfa-receptor
US5061786A (en) 1989-05-25 1991-10-29 Genentech, Inc. Biologically active polypeptides based on transforming growth factor-β
US5194596A (en) 1989-07-27 1993-03-16 California Biotechnology Inc. Production of vascular endothelial cell growth factor
US5460785A (en) 1989-08-09 1995-10-24 Rhomed Incorporated Direct labeling of antibodies and other protein with metal ions
JPH0396383A (ja) 1989-09-08 1991-04-22 Riso Kagaku Corp 画像形成装置
EP0939121B2 (de) 1989-09-12 2007-12-26 AHP Manufacturing B.V. TFN-bindende Proteine
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5648273A (en) 1989-12-27 1997-07-15 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Hepatic growth factor receptor is the MET proto-oncogene
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
ATE139258T1 (de) 1990-01-12 1996-06-15 Cell Genesys Inc Erzeugung xenogener antikörper
US5124471A (en) 1990-03-26 1992-06-23 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Bifunctional dtpa-type ligand
CA2040099A1 (en) 1990-05-01 1991-11-02 Mariano Barbacid Tyrosine kinase negative trkb
US5256643A (en) 1990-05-29 1993-10-26 The Government Of The United States Human cripto protein
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5453491A (en) 1990-09-11 1995-09-26 Kiyoshi Takatsu Murine interleukin-5 receptor
DK0564531T3 (da) 1990-12-03 1998-09-28 Genentech Inc Berigelsesfremgangsmåde for variantproteiner med ændrede bindingsegenskaber
FI101678B1 (fi) 1990-12-31 1998-08-14 Akzo Nv Happolabiileja kytkentämolekyylejä
WO1992018628A1 (en) 1991-04-19 1992-10-29 Schering Corporation Subunit of the human interleukin-3 receptor
US5227158A (en) 1991-06-10 1993-07-13 Genentech, Inc. Method of stimulating hepatocyte proliferation by administration of hepatocyte growth factor and gamma-interferon
US5346991A (en) 1991-06-13 1994-09-13 Genentech, Inc. Tissue factor mutants useful for the treatment of myocardial infarction and coagulopathic disorders
LU91067I2 (fr) 1991-06-14 2004-04-02 Genentech Inc Trastuzumab et ses variantes et dérivés immuno chimiques y compris les immotoxines
US5348856A (en) 1991-07-08 1994-09-20 E. R. Squibb & Sons, Inc. DNA encoding TRKC protein
US5756096A (en) 1991-07-25 1998-05-26 Idec Pharmaceuticals Corporation Recombinant antibodies for human therapy
MX9204374A (es) 1991-07-25 1993-03-01 Idec Pharma Corp Anticuerpo recombinante y metodo para su produccion.
US5264557A (en) 1991-08-23 1993-11-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Polypeptide of a human cripto-related gene, CR-3
EP0626012B1 (en) 1992-02-11 2003-07-09 Cell Genesys, Inc. Homogenotization of gene-targeting events
GB9206422D0 (en) 1992-03-24 1992-05-06 Bolt Sarah L Antibody preparation
JP2559093Y2 (ja) 1992-05-08 1998-01-14 ワイケイケイ株式会社 面ファスナー
US5837821A (en) 1992-11-04 1998-11-17 City Of Hope Antibody construct
US5736137A (en) 1992-11-13 1998-04-07 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
ATE236987T1 (de) 1992-11-13 2003-04-15 Idec Pharma Corp Konsensus-kozak-sequenzen zur säugetier- exprimierung
JP3095175B2 (ja) 1992-11-13 2000-10-03 アイデック ファーマシューティカルズ コーポレイション Ｂ細胞リンパ腫の治療のためのヒトｂリンパ球限定分化抗原に対するキメラ抗体と放射能標識抗体の療法利用
US5556623A (en) 1993-03-30 1996-09-17 Eli Lilly And Company Antibody-drug conjugates
AU7050994A (en) 1993-06-01 1994-12-20 Scripps Research Institute, The Human mutant tissue factor compositions useful as tissue factor antagonists
US5877016A (en) 1994-03-18 1999-03-02 Genentech, Inc. Human trk receptors and neurotrophic factor inhibitors
US5686292A (en) 1995-06-02 1997-11-11 Genentech, Inc. Hepatocyte growth factor receptor antagonist antibodies and uses thereof
US5981215A (en) 1995-06-06 1999-11-09 Human Genome Sciences, Inc. Human criptin growth factor
US5811524A (en) 1995-06-07 1998-09-22 Idec Pharmaceuticals Corporation Neutralizing high affinity human monoclonal antibodies specific to RSV F-protein and methods for their manufacture and therapeutic use thereof
EP1382679A3 (en) 1995-09-08 2004-11-10 Genentech, Inc. Vascular Endothelial Growth Factor Related Protein (VRP) Antagonists
GB9524973D0 (en) 1995-12-06 1996-02-07 Lynxvale Ltd Viral vectors
WO1997044461A2 (en) 1996-05-22 1997-11-27 Novopharm Biotech, Inc. Antigen binding fragments that specifically detect cancer cells, nucleotides encoding the fragments, and use thereof for the prophylaxis and detection of cancers
JP2000515735A (ja) 1996-07-03 2000-11-28 ジェネンテック インコーポレーテッド 肝細胞成長因子レセプターアゴニスト
US6159462A (en) 1996-08-16 2000-12-12 Genentech, Inc. Uses of Wnt polypeptides
AU5159798A (en) 1996-11-05 1998-05-29 Bristol-Myers Squibb Company Branched peptide linkers
US6011138A (en) 1997-02-20 2000-01-04 Idec Pharmaceuticals Corporation Gamma-1 anti-human CD23 monoclonal antibodies
PT981637E (pt) 1997-03-14 2005-09-30 Biogen Idec Inc Metodo para integrar genes em sitios especificos em celulas de mamifero atraves de recombinacao homologa e vectores para a realizacao do mesmo
GB9720054D0 (en) 1997-09-19 1997-11-19 Celltech Therapeutics Ltd Biological products
IL125608A0 (en) 1998-07-30 1999-03-12 Yeda Res & Dev Tumor associated antigen peptides and use of same as anti-tumor vaccines
PT1141014E (pt) 1999-01-06 2005-04-29 Genentech Inc Variante mutante do factor de crescimento semelhante a insulina (igf-i)
PT1141015E (pt) 1999-01-06 2009-10-13 Genentech Inc Variantes mutantes do factor de crescimento do tipo insulina (igf)i
CA2356401A1 (en) 1999-01-07 2000-07-13 Lexigen Pharmaceuticals, Corp. Expression and export of anti-obesity proteins as fc fusion proteins
WO2000052204A2 (en) * 1999-02-22 2000-09-08 Orntoft Torben F Gene expression in bladder tumors
WO2000063693A1 (en) 1999-04-20 2000-10-26 Kokolus William J Improved method of identifying and locating immunobiologically-active linear peptides
CZ20014123A3 (cs) 1999-05-19 2002-06-12 Lexigen Pharmaceuticals Corp. Exprese a export interferonů-alfa jako Fc fúzních proteinů
US6949245B1 (en) 1999-06-25 2005-09-27 Genentech, Inc. Humanized anti-ErbB2 antibodies and treatment with anti-ErbB2 antibodies
JP2001046066A (ja) 1999-08-03 2001-02-20 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 新規な相補性決定領域を有するヒトｖｅｇｆ受容体ｋｄｒに対する抗体
DE60039448D1 (de) 1999-10-29 2008-08-21 Genentech Inc Gegen das prostata-stammzellantigen (psca) gerichtete antikörper und deren verwendung
AU3607301A (en) 2000-03-03 2001-09-12 Kyowa Hakko Kogyo Kk Gene recombinant antibody and its fragment
US6333410B1 (en) 2000-08-18 2001-12-25 Immunogen, Inc. Process for the preparation and purification of thiol-containing maytansinoids
GB0020953D0 (en) 2000-08-24 2000-10-11 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
AU9272401A (en) 2000-09-18 2002-03-26 Biogen Inc Cripto mutant and uses thereof
AU2002236871B2 (en) 2001-01-26 2006-09-28 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Detection and quantification of CRIPTO-1
US7319139B2 (en) * 2001-01-29 2008-01-15 Biogen Idec, Inc. TAG-72 specific CH2 domain deleted antibodies
AUPR395801A0 (en) 2001-03-26 2001-04-26 Austin Research Institute, The Antibodies against cancer
WO2003083041A2 (en) 2002-03-22 2003-10-09 Biogen, Inc. Cripto-specific antibodies
US7582299B2 (en) 2001-04-26 2009-09-01 Biogen Idec Ma Inc. Cripto-specific antibodies
US6441163B1 (en) 2001-05-31 2002-08-27 Immunogen, Inc. Methods for preparation of cytotoxic conjugates of maytansinoids and cell binding agents
WO2004003019A2 (en) * 2002-06-28 2004-01-08 Domantis Limited Immunoglobin single variant antigen-binding domains and dual-specific constructs
NZ573831A (en) 2001-09-18 2010-07-30 Genentech Inc Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor, particularly breast tumor - TAT193
US20040014690A1 (en) * 2002-02-13 2004-01-22 Zhenkun Ma Macrolides with activity against methicillin-resistant staphylococcus aureus
MY139983A (en) * 2002-03-12 2009-11-30 Janssen Alzheimer Immunotherap Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US20050163782A1 (en) 2003-06-27 2005-07-28 Biogen Idec Ma Inc. Modified binding molecules comprising connecting peptides
AU2004274433B2 (en) * 2003-09-15 2010-08-12 Research Development Foundation Cripto antagonism of activin and TGF-beta signaling
EP2311880A3 (en) 2005-01-05 2011-07-27 Biogen Idec MA Inc. Cripto binding molecules
AU2007243181A1 (en) * 2006-04-28 2007-11-08 Biogen Idec Ma Inc. Composition and methods for the detection of Cripto-3
WO2014176371A2 (en) 2013-04-23 2014-10-30 Levant Power Corporation Active suspension with structural actuator
US9925552B2 (en) 2015-03-09 2018-03-27 Nordson Corporation Liquid dispensing applicators having backpressure control devices, and related methods

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001506967A (ja) * 1996-08-02 2001-05-29 ブリストル―マイヤーズ・スクイブ・カンパニー 治療およびインビボ診断における免疫グロブリンの使用の結果としての免疫グロブリン誘発毒性の抑制方法
WO2002060955A2 (en) * 2001-01-29 2002-08-08 Idec Pharmaceuticals Corporation Modified antibodies and methods of use
JP2004534020A (ja) * 2001-04-26 2004-11-11 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド Ｃｒｉｐｔｏをブロックする抗体およびその使用

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013505732A (ja) * 2009-09-29 2013-02-21 ロシュ グリクアート アーゲー 二重特異性デス受容体アゴニスト抗体
JP2014515742A (ja) * 2011-04-01 2014-07-03 イミュノジェン， インコーポレイテッド Ｃｄ３７結合性分子及びその免疫複合体

Also Published As

Publication number Publication date
EP1838736B1 (en) 2013-03-06
WO2006074397A2 (en) 2006-07-13
US8021661B2 (en) 2011-09-20
IL184468A0 (en) 2008-01-20
SG173313A1 (en) 2011-08-29
DK1838736T3 (da) 2013-06-03
EP2311880A2 (en) 2011-04-20
EP2311881A3 (en) 2011-07-27
KR20070100346A (ko) 2007-10-10
BRPI0606398A (pt) 2008-03-11
EP1838736A2 (en) 2007-10-03
WO2006074397A3 (en) 2006-12-28
ZA200706348B (en) 2009-05-27
ES2408704T3 (es) 2013-06-21
ZA200810117B (en) 2012-07-25
CN101137673B (zh) 2013-12-04
AU2006203889A1 (en) 2006-07-13
NZ556788A (en) 2011-03-31
CN101137673A (zh) 2008-03-05
NO20073981L (no) 2007-10-05
EA200701448A1 (ru) 2008-02-28
IL184467A0 (en) 2008-12-29
EP2311881A2 (en) 2011-04-20
CA2593212A1 (en) 2006-07-13
EP2311880A3 (en) 2011-07-27
US20100008906A1 (en) 2010-01-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8021661B2 (en) Cripto binding molecules
JP5091476B2 (ja) 均質な抗体溶液の生成のための疎水性相互作用クロマトグラフィーまたはヒンジ領域改変の使用
US20140017262A1 (en) Cripto binding molecules
JP2007535296A5 (ja)
JP2007535297A5 (ja)

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20081121

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20081121

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20110621

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20110920

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20110928

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20111020

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20111027

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20111118

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20111128

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20120305