JP2007535297A5

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Filing date: 2004-06-28
Publication date: 2010-09-24
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Description

連結ペプチドを含む改変された結合分子

（関連出願）
本出願は、２００３年６月２７日提出の発明の名称が「ポリペプチドの精製および優先的合成」であるＵＳＳＮ６０／４８３８７７号および２００３年１０月３日提出の発明の名称が「抗原結合ポリペプチドの精製および優先的合成」であるＵＳＳＮ６０／５０８，８１０号の優先権を主張する。本出願はまた、２００３年１０月２８日提出の発明の名称が「連結ペプチドを含む修飾抗体分子」であるＵＳＳＮ６０／５１５，３５１号および２００３年１０月３０日提出の発明の名称が「連結ペプチドを含む修飾抗体分子」であるＵＳＳＮ６０／５１６，０３０号の優先権を主張する。本出願はまた、２００４年６月２８日提出の発明の名称が「結合ポリペプチドの精製および優先的合成」であるＵＳＳＮＸＸ／ＸＸＸＸＸＸ号に関連する。これらの出願の内容は、その全体が本明細書中で参考として援用される。

（発明の背景）
抗体は二量体分子であり、二量体を構成する各単量体は１つの軽鎖および１つの重鎖を含む。抗体分子溶液は、ヒンジ不均一性に関連する２つの形態で存在する。精製Ｍａｂ（ＭＡｂ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を使用して、典型的には、２つの形態は、２つのタンパク質バンド（主要なバンド（分子量約１５０〜１６０ｋＤａ）および主要でないバンド（分子量約７５〜８０ｋＤａ））として認められる。この後者の形態は、典型的には、精製ＩｇＧ４調製物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析後に認められるが、全てのＩｇＧアイソタイプ（精製組換えＭＡｂが含まれる）においてはるかに低頻度で同定することができる（非特許文献１；非特許文献２）。Ａ型と呼ばれるより高い分子量のアイソタイプは、２３９位および２４２位（Ｋａｂａｔナンバリングシステム）（ＥＵナンバリングシステムでは２２６位および２２９位）に対応する位置に共有結合性鎖間ジスルフィド結合を含む（非特許文献３）。非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動で認められた７５〜８０ｋＤａによって証明されるように、第２のアイソフォームであるＢ型は、２つの重鎖間に共有結合を含まず、かつ２つの隣接システイン残基間に鎖間ジスルフィド結合を含まないと考えられる。Ｂ型の２つの重鎖は、おそらく分子のＣＨ３ドメインと会合した強固な非共有（例えば、イオン）相互作用によって連結している。これらのＡ型とＢ型との混合物は、インタクトなヒンジを含むがＣＨ３ドメインを欠くＭＡｂフラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ）_２フラグメントなど）の溶液中に存在しない。典型的には、遺伝子操作されたか酵素消化されたＦ（ａｂ）_２ＭＡｂ調製物は、分子が非共有相互作用（例えば、水素結合）の維持に必要なドメインを欠くため、Ｂ型を欠く。しかし、これらはＣＨ３ドメインを含むＭＡｂ調製物（例えば、ＩｇＧ４）、ＣＨ２ドメイン欠失ＭＡｂフラグメント（特許文献１などに記載）、およびミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）（非特許文献４など）中に存在する。

タンパク質工学技術の治療抗体デザインへの適用によっても変化（いくつかの場合、薬力学的作用、生体分布、および活性プロフィールの改善）が示された多数の抗体形式が産生された。ヒンジ領域中のシステイン残基数が、１つのジスルフィド結合を形成することのみが必要である抗体分子のアセンブリを促進するために１つに減少させられた、いくつかの変化した抗体分子が作製されている。これはまた、ヒンジ領域の別のヒンジ領域またはエフェクター分子もしくはレポーター分子のいずれかへの結合のための特異的標的を提供する（特許文献２）。抗体ヒンジ中のシステイン残基数も増加している（特許文献２）。ＩｇＧ１ヒンジ領域およびＣＨ２ドメインがヒトＩｇＧ３ヒンジ領域に置換された他の変異抗体を構築した（特許文献３）。これらの分子は、チオール基を介した複数のハプテンの置換のための１１個のスルフヒドリル基を含む。

ＣＨ２ドメイン欠失抗体の分子量は約１２０ｋＤａであり、全長ＩｇＧよりも有意に良好に腫瘍に浸透することが示されている。ＣＨ２ドメインも欠失しているミニボディは、類似の特徴を有する。これらのドメイン欠失分子は、Ｆ（ａｂ）’_２などの他のＭＡｂフラグメントよりも有効に腫瘍部位に蓄積するが、インタクトなＩｇＧ抗体を使用して認められる好ましくない薬力学プロフィールがない。ＣＨ２ドメイン欠失抗体は、ＶＬＣＬ軽鎖ドメインおよびＶＨ１重鎖ドメインならびにＣＨ３ドメインと（直接または修飾ペプチドスペーサーを介して）遺伝子上融合したヒンジ領域（例えば、上部または中央のヒンジ）の一部からなる。例として、組換えＣＨ２ドメイン欠失ｄｄＣＣ４９（種々のヒト癌腫上で発現する腫瘍関連ＴＡＧ７２抗原を認識するドメイン欠失抗体）の生合成により、細胞培養物中で約５０：５０の分布比でＡアイソフォームおよびＢアイソフォームが産生される。ＣＨ２ドメイン欠失抗体（例えば、四価ＣＨ２ドメイン欠失抗体、ミニボディ、または四価ミニボディ）の別の形態を発現するように操作された細胞もＡおよびＢアイソフォームおよび／または単量体性半量体（ｍｏｎｏｍｅｒｉｃｈａｌｆ−ｍｅｒ）分子からなる混合物も発現する。

Ａ型およびＢ型は、同一アミノ酸から構成され、それにより同一の分子量ならびに類似の物理的および化学的性質を有するため、ＭＡｂ精製後でさえも分離が極めて困難である。これらは、組換えＭＡｂタンパク質を含む抗体分子を精製するために典型的に使用される標準的なゲル濾過、アフィニティクロマトグラフィ、またはイオン交換クロマトグラフィによって分離することができない。現在の製造プロセスでは、産生された全抗体の少なくとも５０％が破棄され、総収率に悪影響を与えている。さらに、２つのアイソフォームの存在により、後処理プロセスに必要な労力が増大する。したがって、Ａ型とＢ型の分離方法または抗体の一方または他方の形態の生合成の増大が非常に有益である。
０２／０６０９５５Ａ２米国特許第５，６７７，４２５号明細書国際公開第９７／１１３７０号パンフレットＡｎｇａｌら、「Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」、１９９３、３０：１０５Ｎｏｒｄｅｒｈａｕｇら、「Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」、１９９０、２１：２３７０Ｋａｂａｔ，Ｅ，Ｗｕ，ＴＴ，Ｐｅｒｒｙ，ＨＭ，Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，ＫＳ，Ｆｏｅｌｌｅｒ，Ｃ、「ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ．Ｂｅｔｈｅｓｄａ」、ＵＳＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＨｅａｌｔｈａｎｄＨｕｍａｎＳｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ、１９９１Ｈｕら、「ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ」、１９９６、５６：３０５５

（発明の要旨）
本発明は、少なくとも一部が、異なるアイソフォーム（分子画分が少なくとも１つの鎖間ジスルフィド結合を介して結合した２つの重鎖部分（Ａ型）を含み、分子の一部が少なくとも１つの鎖間ジスルフィド結合を介して結合しない２つの重鎖部分（Ｂ型）を含む、２つの重鎖部分を含む分子）を含む二量体ポリペプチド分子の混合物を含む組成物において、例えば、疎水性相互作用クロマトグラフィを使用した分離またはＡ型もしくはＢ型が優先的に生合成される合成連結ペプチドの封入によって一方の形態または他方の形態を優先的に得ることができるという所見に基づく。

１つの実施形態では、本発明の結合分子は四価である。本発明の連結ペプチドを、Ａ型およびＢ型の両方を形成する傾向がある任意の二量体分子（例えば、抗体分子、ドメイン欠失抗体分子（例えば、ＣＨ２ドメインの全部または一部を欠く）、ミニボディ、二重特異性抗体、融合タンパク質など）に含めることができる。好ましい実施形態では、Ａ型の形成が増強される。

別の実施形態では、本発明は、少なくとも４つの結合部位および少なくとも２つのポリペプチド鎖を含むポリペプチド二量体を含む組成物において、前記少なくとも２つのポリペプチド鎖が少なくとも１つの重鎖部分および合成連結ペプチドを含み、約５０％を超える前記二量体が少なくとも１つの鎖間ジスルフィド結合を介して結合する組成物に関する。

別の実施形態では、約９０％を超える二量体が少なくとも１つの鎖間ジスルフィド結合を介して結合している。

別の実施形態では、少なくとも１つのポリペプチド鎖は、連結ポリペプチドを介してＶＬドメイン、ＶＨドメイン、またはＣＨ１ドメインに結合したＣＨ３ドメインを含む。

別の実施形態では、ポリペプチド鎖は、ＣＨ２ドメインの全てまたは一部を欠く。

別の実施形態では、二量体は、２つまたはそれ以上の鎖間ジスルフィド結合を介して結合している。

別の実施形態では、重鎖部分は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４からなる群から選択されるアイソタイプの抗体に由来する。

別の実施形態では、重鎖部分は、γ１ヒンジ、γ２ヒンジ、γ３ヒンジ、およびγ４ヒンジからなる群から選択されるヒンジ領域に由来するアミノ酸配列を含む。

別の実施形態では、分子は二重特異性である。

別の実施形態では、分子は、可溶性リガンドに特異的な少なくとも１つの結合部位を含む。

別の実施形態では、分子は、細胞表面分子に特異的な少なくとも１つの結合部位を含む。

別の実施形態では、分子は、腫瘍細胞抗原に特異的な２つの結合部位およびプロドラッグに特異的な２つの結合部位を含む。

別の実施形態では、プロドラッグに特異的な結合部位は触媒性を示す。

別の実施形態では、合成連結ペプチドが、２４３位（Ｋａｂａｔナンバリングシステム）にプロリン残基を含む。

別の実施形態では、合成連結ペプチドは、２４４位（Ｋａｂａｔナンバリングシステム）にアラニン残基および２４５位（Ｋａｂａｔナンバリングシステム）にプロリン残基をさらに含む。

別の実施形態では、重鎖部分はキメラヒンジを含む。

別の実施形態では、合成連結ペプチドは、ＩｇＧ１ヒンジドメインの少なくとも一部、ＩｇＧ３ヒンジドメインの少なくとも一部を含む。

別の実施形態では、連結ペプチドは、配列番号８〜１５および４８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

第２の態様では、本発明は、異なるアイソフォームを含む二量体ポリペプチド分子の混合物を含む組成物を治療されるように被験体に投与する工程であって、ここで、一方のアイソフォームまたは他方のアイソフォームが優先的に得られる工程を含む、抗原結合分子を使用した治療の恩恵を受ける被験体の治療方法を提供する。

１つの実施形態では、被験体は癌を罹患している。

別の実施形態では、被験体はリンパ腫を罹患している。

別の実施形態では、被験体は自己免疫疾患または障害を罹患している。

別の実施形態では、被験体は炎症性疾患または障害を罹患している。

第３の態様では、本発明は、一方の形態または他方の形態を優先的に得ることができるように、異なるアイソフォームを含むポリペプチド分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子（分子の画分が少なくとも１つの鎖間ジスルフィド結合を介して結合した２つの重鎖部分を含み（Ａ型）、分子の一部が少なくとも１つの鎖間ジスルフィド結合を介して結合しない２つの重鎖部分を含む（Ｂ型）２つの重鎖部分を含む分子）を提供する。

１つの実施形態では、ポリペプチド二量体が４つのポリペプチド鎖を含み、そのポリペプチド鎖のうちの２つが少なくとも１つの重鎖部分および合成連結ペプチドを含む。

別の実施形態では、核酸分子は、図８Ｂに示すヌクレオチド配列（配列番号１７）を含む。

別の実施形態では、核酸分子は、図８Ｃに示すヌクレオチド配列（配列番号１８）を含む。

別の実施形態では、核酸分子は、図１０Ｂに示すヌクレオチド配列（配列番号２３）を含む。
別の実施形態では、核酸分子は、図１２Ａに示すヌクレオチド配列（配列番号２６）を含む。

別の実施形態では、核酸分子は、図１２Ｂに示すヌクレオチド配列（配列番号２７）を含む。

別の実施形態では、核酸分子は、図１４に示すヌクレオチド配列（配列番号３０）を含む。
別の実施形態では、核酸分子は、図１５に示すヌクレオチド配列（配列番号３１）を含む。

別の実施形態では、核酸分子はベクター中に存在する。さらに別の実施形態では、そのベクターは宿主細胞中に存在する。

第４の態様では、本発明は、一方の形態または他方の形態を優先的に得ることができるように、異なるアイソタイプを含むポリペプチド分子をコードするアミノ酸配列を含む結合分子（分子の画分が少なくとも１つの鎖間ジスルフィド結合を介して結合した２つの重鎖部分を含み（Ａ型）、分子の一部が少なくとも１つの鎖間ジスルフィド結合を介して結合しない２つの重鎖部分を含む（Ｂ型）２つの重鎖部分を含む分子）を提供する。

１つの実施形態では、結合分子は、図９Ｂのアミノ酸配列（配列番号２０）を含む。
別の実施形態では、結合分子は、配列番号２１のアミノ酸配列を含む。
別の実施形態では、結合分子は、図１１Ｂのアミノ酸配列（配列番号２５）を含む。

別の実施形態では、結合分子は、図１３Ａのアミノ酸配列（配列番号２８）を含む。
別の実施形態では、結合分子は、図１３Ｂのアミノ酸配列（配列番号２９）を含む。

別の実施形態では、結合分子は、図１６のアミノ酸配列（配列番号３２）を含む。

別の実施形態では、結合分子は、図１７のアミノ酸配列（配列番号３３）を含む。

第５の態様では、本発明は、一方の形態または他方の形態を優先的に得ることができ、前記結合部位が、抗原結合部位、受容体のリガンド結合部分、およびリガンドの受容体結合部分からなる群から個別に選択される、異なるアイソフォームを含む二量体ポリペプチド分子（分子の画分が少なくとも１つの鎖間ジスルフィド結合を介して結合した２つの重鎖部分を含み（Ａ型）、分子の一部が少なくとも１つの鎖間ジスルフィド結合を介して結合しない２つの重鎖部分を含む（Ｂ型）２つの重鎖部分を含む分子）の混合物を含む組成物を提供する。

１つの実施形態では、ポリペプチド鎖は、２Ｂ８、Ｌｙｍ１、Ｌｙｍ２、ＬＬ２、Ｈｅｒ２、Ｂ１、ＭＢ１、ＢＨ３、Ｂ４、Ｂ７２．３、ＣＣ４９、５Ｅ８、Ｂ３Ｆ６、および５Ｅ１０からなる群から選択される抗体に由来する少なくとも１つの結合部位を有する。

別の実施形態では、ポリペプチド二量体は四価のミニボディ分子である。
別の実施形態では、ポリペプチド二量体は四価ドメイン欠失抗体分子である。

別の実施形態では、ポリペプチド二量体は二重特異性抗体である。

第６の態様では、本発明は、２つのポリペプチド鎖を含むミニボディ分子を含む組成物において、前記ポリペプチド鎖が重鎖部分および合成連結ペプチドを含み、前記ポリペプチド鎖がＣＨ２ドメインの全てまたは一部を欠き、約５０％を超える前記分子が、ポリペプチド鎖の１つが少なくとも１つの鎖間ジスルフィド結合を介して結合する形態で存在する組成物を提供する。

１つの実施形態では、約９０％を超える二量体が少なくとも１つの鎖間ジスルフィド結合を介して結合している。

別の実施形態では、少なくとも１つのポリペプチド鎖は、連結ペプチドを介してＶＬドメイン、ＶＨドメイン、またはＣＨ１ドメインに遺伝子上融合したＣＨ３ドメインを含む。

別の実施形態では、ポリペプチド鎖は全ＣＨ２ドメインを欠く。

別の実施形態では、二量体は２つまたはそれ以上の鎖間ジスルフィド結合を介して結合している。

別の実施形態では、結合部位は、抗原結合部位、受容体のリガンド結合部分、およびリガンドの受容体結合部分からなる群から個別に選択される。

別の実施形態では、分子は二重特異性である。

別の実施形態では、連結ペプチドは、２４３位（Ｋａｂａｔナンバリングシステム）にプロリン残基を含む。

別の実施形態では、合成連結ペプチドはキメラヒンジを含む。

第７の態様では、本発明は、２つのポリペプチド鎖を含むミニボディ分子を含む組成物を治療されるように被験体に投与する工程を含む、抗原結合分子を使用した治療の恩恵を受ける被験体の治療方法において、前記ポリペプチド鎖が重鎖部分および合成連結ペプチドを含み、前記ポリペプチド鎖がＣＨ２ドメインの全てまたは一部を欠き、約５０％を超える分子が、１つのポリペプチド鎖が少なくとも１つの鎖間ジスルフィド結合を介して結合する形態で存在する方法を提供する。

別の態様では、本発明は、重鎖部分および合成連結ペプチドを含むポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子において、前記ポリペプチド鎖がＣＨ２ドメインの全てまたは一部を欠き、約５０％を超える前記分子が、１つのポリペプチド鎖が少なくとも１つの鎖間ジスルフィド結合を介して結合する形態で存在する核酸分子を提供する。

さらに別の態様では、本発明は、少なくとも４つの結合部位および少なくとも２つのポリペプチド鎖を有するポリペプチド二量体を含む組成物において、前記少なくとも２つのポリペプチド鎖が少なくとも１つの重鎖部分を含み、かつＣＨ２ドメインの全てまたは一部を欠き、５０％を超える前記ポリペプチド二量体が少なくとも１つの鎖間ジスルフィド結合を介して結合する組成物を提供する。

（発明の詳細な説明）
ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）（モノクローナル抗体（ＭＡｂ）が含まれる）は、ヒンジの異種性に関連する２つの形態で存在し得る。天然の溶液では、これらの両形態は二量体タンパク質（各単量体は１つの重鎖および１つの軽鎖を含む）として存在する。一方の免疫グロブリン分子は、二量体が鎖間重鎖ジスルフィド結合によってつなぎ合わされた約１５０〜１６０ｋＤａの安定な四鎖構築物を含み（Ａ型）、他方は二量体が鎖間ジスルフィド結合を介して結合していない形態を含む（Ｂ型）。Ｂ型はまた天然条件下で安定な二量体を形成するが、変性非還元条件下で同定することができ、重鎖の解離によって７５〜８０ｋＤａの分子が得られる。これらの形態は、ＭＡｂアフィニティ精製後でさえも分離が極めて困難である。

種々のインタクトなＩｇＧアイソタイプ中のＢ型の出現頻度は、ＭＡｂ分子のヒンジ領域のアイソタイプに関連する構造の相違に起因するが、これに限定されない。実際、ヒトＩｇＧ４ヒンジのヒンジ領域中の１アミノ酸置換によって、Ｂ型の出現をヒトＩｇＧ１ヒンジを使用して典型的に認められるレベルに有意に減少させ得る（Ａｎｇａｌｅｔａｌ．１９９３．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ３０：１０５）。しかし、ＣＨ３ドメインが保持されるＭＡｂフラグメントへのこの同一のアミノ酸置換の適用によって、調製物からＢ型は消失しなかった。典型的には、細胞培養物中で産生された全ての組換えＣＨ２ドメイン欠失抗体により、ヒンジ中の類似の分子変異を介して修正されないヒンジの不均一性がしばしば得られる。

本発明は、例えば、第１および第２のポリペプチドが少なくとも２つのポリペプチド鎖を含み、少なくとも２つのポリペプチド鎖が少なくとも１つの重鎖部分を含む、第２の二量体ポリペプチドからの第１の二量体ポリペプチドの分離方法の提供によって最先端技術に発展させる。１つの実施形態では、本発明のポリペプチドはＣＨ２ドメインの全てまたは一部を欠く。単量体は少なくとも１つの鎖間ジスルフィド結合を介して結合しており（本明細書中で「Ａ型」という）、第２のポリペプチドの単量体は少なくとも１つの鎖間ジスルフィド結合を介して結合していない（本明細書中で「Ｂ型」という）。これらの形態を、疎水性相互作用クロマトグラフィを使用して互いに分離することができる。さらに、本発明は、連結ペプチドを含むポリペプチドに関する。一定の連結ペプチドを含めることにより、少なくとも１つの鎖間ジスルフィド結合を介して結合するか少なくとも１つの鎖間ジスルフィド結合を介して結合しないポリペプチド鎖を含むポリペプチド二量体が優先的に生合成される。

本発明のさらなる説明の前に、便宜上、一定の用語を以下で説明する。

（定義）
本発明のポリペプチドは、標的分子（抗原または結合パートナー）と特異的に結合する結合部位を含む少なくとも１つの結合ドメインを含む結合分子（すなわち、ポリペプチド分子またはこれらをコードする核酸分子）である。例えば、１つの実施形態では、本発明の結合分子は、免疫グロブリン抗原結合部位またはリガンド結合を担う受容体分子の一部、または受容体結合を担うリガンド分子の一部を含む。本発明の結合分子は、ポリペプチドまたはこれらをコードする核酸分子である。

１つの実施形態では、結合分子は、少なくとも２つの結合部位を含む。１つの実施形態では、結合分子は、２つの結合部位を含む。１つの実施形態では、結合分子は３つの結合部位を含む。別の実施形態では、結合分子は４つの結合部位を含む。

本発明のポリペプチドは多量体である。例えば、１つの実施形態では、本発明のポリペプチドは二量体である。１つの実施形態では、本発明の二量体は、２つの同一の単量体サブユニットを含むホモ二量体である。別の実施形態では、本発明の二量体は、２つの同一でない単量体サブユニットを含むヘテロ二量体である。二量体のサブユニットは、１つまたは複数のポリペプチド鎖を含み得る。例えば、１つの実施形態では、二量体は少なくとも２つのポリペプチド鎖を含む。１つの実施形態では、二量体は２つのポリペプチド鎖を含む。別の実施形態では、二量体は、４つのポリペプチド鎖を含む（例えば、抗体分子の場合）。

本発明のポリペプチドは、免疫グロブリンドメイン由来の少なくとも１つのアミノ酸配列を含む。指定されたタンパク質「に由来する」ポリペプチドまたはアミノ酸配列は、ポリペプチドの起源をいう。好ましくは、特定の出発ポリペプチドまたはアミノ酸配列由来のポリペプチドまたはアミノ酸配列は、出発配列または少なくとも１０〜２０個のアミノ酸、好ましくは少なくとも２０〜３０個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも３０〜５０個のアミノ酸からなるか当業者によって出発配列中にその起源を有することが同定可能なその一部と本質的に同一のアミノ酸配列を有する。

好ましい結合ポリペプチドは、ヒトアミノ酸配列由来のアミノ酸配列を含む。しかし、結合ポリペプチドは、別の哺乳動物種由来の１つまたは複数のアミノ酸を含み得る。例えば、霊長類の重鎖部分、ヒンジ部分、または結合部位を、被験体中の結合ポリペプチドおよび／または連結ポリペプチドに含めることができる。あるいは、１つまたは複数のマウスアミノ酸は、結合ポリペプチド（例えば、結合分子の抗原結合部位）中に存在することができる。本発明の好ましい結合分子は、免疫原性ではない。

本発明の結合分子（例えば、被験者のポリペプチドの重鎖部分もしくは軽鎖部分または結合部分）をこれらが由来する天然に存在する免疫グロブリン分子とアミノ酸配列が異なるように修飾することができることも当業者に理解される。例えば、保存的置換または「非必須」アミノ酸残基の変化を行うヌクレオチドまたはアミノ酸の置換を行うことができる。

免疫グロブリン由来のポリペプチド（例えば、免疫グロブリンの重鎖部分または軽鎖部分）の非天然変異型をコードする単離核酸分子を、１つまたは複数のアミノ酸の置換、付加、または欠失がコードされたタンパク質に導入されるような免疫グロブリンのヌクレオチド配列への１つまたは複数のヌクレオチドの置換、付加、または欠失によって作製することができる。変異は、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発などの標準的な技術によって導入することができる。好ましくは、１つまたは複数の非必須アミノ酸残基において保存的アミノ酸置換を行う。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基と置換されることである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基ファミリーは当該分野で定義されており、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。したがって、免疫グロブリンポリペプチド中の非必須アミノ酸残基を、同一の側鎖ファミリー由来の別のアミノ酸残基と置換することが好ましい。別の実施形態では、アミノ酸の鎖を、側鎖ファミリーメンバーの順序および／または組成が異なる類似の構造の鎖と置換することができる。

あるいは、別の実施形態では、飽和変異誘発などによって免疫グロブリンコード配列の全部または一部に無作為に変異を導入することができ、得られた変異体を本発明のポリペプチドに組み込み、所望の抗原に結合する能力についてスクリーニングすることができる。

本明細書中で使用される、用語「重鎖部分」は、免疫グロブリン重鎖由来のアミノ酸配列を含む。重鎖部分を含むポリペプチドは、少なくとも１つのＣＨ１ドメイン、ヒンジ（例えば、上部、中央、および／または下部のヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはその変異型もしくはフラグメントを含む。１つの実施形態では、本発明のポリペプチドは、ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、およびＣＨ２ドメインを含むポリペプチド鎖を含む。別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、ＣＨ１ドメインおよびＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖を含む。別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、およびＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖を含む。別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、ＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖を含む。１つの実施形態では、本発明のポリペプチドは、ＣＨ２ドメインの少なくとも一部（例えば、ＣＨ２ドメインの全てまたは一部）を欠く。別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、完全なＩｇ重鎖を含む。上記のように、これらのドメイン（例えば、重鎖部分）を天然に存在する免疫グロブリン分子とアミノ酸配列が異なるように修飾することができることが当業者に理解される。

１つの実施形態では、本発明の結合分子の少なくとも２つのポリペプチド鎖は、抗体または免疫グロブリン分子由来の少なくとも１つの重鎖部分を含む。１つの実施形態では、本発明のポリペプチドの少なくとも２つの重鎖部分は、異なるポリペプチド鎖上に存在し、例えば、少なくとも１つのジスルフィド結合（Ａ型）または非共有結合性相互作用（Ｂ型）を介して相互作用して二量体ポリペプチド（二量体の各単量体は少なくとも１つの重鎖部分を含む）を形成する。

１つの実施形態では、二量体の一つのポリペプチド鎖の重鎖部分は、二量体の第２のポリペプチド鎖の重鎖部分と同一である。１つの実施形態では、本発明の二量体の単量体（または半量体）は、互いに同一である。別の実施形態では、これらは同一ではない。例えば、各単量体は異なる標的結合部位を含み得る。

１つの実施形態では、本発明の二量体は、共有結合性相互作用（例えば、ジスルフィド結合）によってつなぎ合わされている。１つの実施形態では、本発明の二量体は１つまたは複数のジスルフィド結合によってつなぎ合わされている。別の実施形態では、本発明の二量体は１つまたは複数、好ましくは２つのジスルフィド結合によってつなぎ合わされている。別の実施形態では、本発明の二量体は１つまたは複数、好ましくは３つのジスルフィド結合によってつなぎ合わされている。別の実施形態では、本発明の二量体は１つまたは複数、好ましくは４つのジスルフィド結合によってつなぎ合わされている。別の実施形態では、本発明の二量体は１つまたは複数、好ましくは５つのジスルフィド結合によってつなぎ合わされている。別の実施形態では、本発明の二量体は１つまたは複数、好ましくは６つのジスルフィド結合によってつなぎ合わされている。別の実施形態では、本発明の二量体は１つまたは複数、好ましくは７つのジスルフィド結合によってつなぎ合わされている。別の実施形態では、本発明の二量体は１つまたは複数、好ましくは８つのジスルフィド結合によってつなぎ合わされている。別の実施形態では、本発明の二量体は１つまたは複数、好ましくは９つのジスルフィド結合によってつなぎ合わされている。別の実施形態では、本発明の二量体は１つまたは複数、好ましくは１０個のジスルフィド結合によってつなぎ合わされている。さらなる実施形態では、本発明の二量体はジスルフィド結合によってつなぎ合わされていないが、例えば、非共有結合性相互作用によってつなぎ合わされている。

本発明のポリペプチドの重鎖部分は、異なる免疫グロブリン分子に由来し得る。例えば、ポリペプチドの重鎖部分は、ＩｇＧ１分子由来のＣＨ１ドメインおよびＩｇＧ３分子由来のヒンジ領域を含み得る。別の例では、重鎖部分は、一部がＩｇＧ１分子に由来し、一部がＩｇＧ３分子に由来するヒンジ領域を含み得る。別の例では、重鎖部分は、一部がＩｇＧ１分子に由来し、一部がＩｇＧ４分子に由来するキメラヒンジを含み得る。本明細書中で使用される、用語「軽鎖部分」は、免疫グロブリン軽鎖由来のアミノ酸配列を含む。好ましくは、軽鎖部分は、少なくとも１つのＶＬドメインまたはＣＬドメインを含む。

１つの実施形態では、本発明のポリペプチドは、Ｉｇ分子に由来しないアミノ酸配列または１つまたは複数の部分を含む。例示的修飾を、以下により詳細に記載する。例えば、１つの実施形態では、本発明のポリペプチドは、可撓性リンカー配列を含み得る。別の実施形態では、機能的部分（例えば、ＰＥＧ、薬物、または標識）を付加するためにポリペプチドを修飾することができる。

１つの実施形態では、本発明の結合ポリペプチドは融合タンパク質である。融合タンパク質は、少なくとも１つの標的結合部位および少なくとも１つの重鎖部分を含む結合ドメインを含むキメラ分子である。１つの実施形態では、融合タンパク質は、合成連結ペプチドをさらに含む。

「キメラ」タンパク質は、事実上天然に結合していない第２のアミノ酸配列に結合した第１のアミノ酸配列を含む。そのアミノ酸配列は、通常、融合ポリペプチド中に集まった個別のタンパク質中に存在し得るか、通常、同一タンパク質中に存在するが融合ポリペプチド中で新規の配置で存在する。例えば、化学合成またはペプチド領域が所望の関係でコードされるポリヌクレオチドの作製および翻訳によってキメラタンパク質を作製することができる。例示的キメラポリペプチドには、本発明の融合タンパク質およびキメラヒンジ連結ペプチドが含まれる。

ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに適用される、用語「異種」は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが比較される残りの物質と遺伝的に異なる部分に由来することを意味する。例えば、異種ポリヌクレオチドまたは抗原は、異なる種の起源、異なる細胞型、または異なる個体の同一の細胞型に由来し得る。

本明細書中で使用される、用語「リガンド結合ドメイン」または「受容体のリガンド結合部分」は、任意の天然の受容体（例えば、細胞表面受容体）または少なくとも質的リガンド結合能力、好ましくは対応する天然の受容体の生物活性を保持するその任意の領域もしくは誘導体をいう。

本明細書中で使用される、用語「受容体結合ドメイン」または「リガンドの受容体結合部分」は、任意の天然のリガンドまたは少なくとも質的受容体結合能力、好ましくは対応する天然のリガンドの生物活性を保持するその任意の領域もしくは誘導体をいう。

１つの実施形態では、本発明の結合分子は融合タンパク質である。本発明の融合タンパク質は、結合ドメイン（少なくとも１つの結合部位を含む）および二量体化ドメイン（少なくとも１つの重鎖部分を含む）を含むキメラ分子である。重鎖部分は、任意の免疫グロブリン（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４サブタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはＩｇＭなど）に由来し得る。

本発明の別の実施形態では、結合分子は、「抗体−融合タンパク質キメラ」である。このような分子は、抗体の少なくとも１つの結合ドメインと少なくとも１つの融合タンパク質とを組み合わせた分子を含む。好ましくは、２ポリペプチド間の界面は、免疫グロブリン分子のＣＨ３ドメインである。

１つの実施形態では、本発明の結合分子は、「抗体」または「免疫グロブリン」分子（例えば、天然に存在する抗体もしくは免疫グロブリン分子または抗体分子と類似の様式で抗原に結合する遺伝子操作抗体分子）である。本明細書中で使用される、用語「免疫グロブリン」は、任意の関連する特異的免疫反応性の有無を問わず２つの重鎖と２つの軽鎖との組み合わせを有するポリペプチドを含む。「抗体」は、目的の抗原（例えば、腫瘍関連抗原）に対して有意な公知の特異的免疫反応活性を有するこのようなアセンブリをいう。抗体および免疫グロブリンは、その間に鎖間共有結合を有するか有さない軽鎖および重鎖を含む。脊椎動物系における基本的な免疫グロブリン構造は比較的十分に理解されている。

以下でより詳細に考察されているように、一般的用語「免疫グロブリン」は、生化学的に区別することができる５つの異なる抗体クラスを含む。５つ全ての抗体クラスは明確に本発明の範囲内であり、以下の考察は、一般に、免疫グロブリン分子のＩｇＧクラスに関する。ＩｇＧに関して、免疫グロブリンは、分子量が約２３，０００ダルトンの２つの同一の軽鎖ポリペプチド鎖および分子量が５３，０００〜７０，０００の２つの同一の重鎖を含む。４つの鎖はジスルフィド結合によって「Ｙ」配置に結合し、軽鎖と重鎖がひとくくりになっており、「Ｙ」の入り口部から始まって可変領域まで続いている。

軽鎖および重鎖は共に構造的および機能的な相同性領域に分割されている。用語「定常」および「可変」を機能的に使用する。これに関して、軽鎖部分（ＶＬ）および重鎖部分（ＶＨ）の両方の可変ドメインが抗原認識および特異性を決定することが認識される。逆に、軽鎖（ＣＬ）および重鎖（ＣＨ１、ＣＨ２、またはＣＨ３）の定常ドメインは、分泌、経胎盤移動性、Ｆｃ受容体結合、および補体結合などの重要な生物学的性質を付与する。慣例により、定常領域ドメインのナンバリングは、抗体の抗原結合部位またはアミノ末端から遠くなるほど増加する。Ｎ末端は可変領域であり、Ｃ末端は定常領域であり、ＣＨ３およびＣＬドメインは実際はそれぞれ重鎖および軽鎖のカルボキシ末端を含む。

軽鎖はカッパまたはガンマ（κ、λ）に分類される。各重鎖クラスを、κまたはλ軽鎖のいずれかと結合することができる。一般に、軽鎖および重鎖は互いに共有結合し、２つの重鎖の「テール」部分は、免疫グロブリンがハイブリドーマ、Ｂ細胞、または遺伝子操作宿主細胞のいずれかによって生成された場合、共有結合性ジスルフィド結合および非共有結合性によって互いに結合している。重鎖では、アミノ酸配列は、Ｙ形状のフォーク形の末端のＮ末端から各鎖の下のＣ末端まで伸びている。当業者は、重鎖はガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロン（γ、μ、α、δ、ε）として分類され、これらにはいくつかのサブクラス（例えば、γ１〜γ４）が存在することを認識している。この鎖の性質によって抗体の「クラス」がそれぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ、またはＩｇＥに決定される。免疫グロブリンサブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１など）は十分に特徴づけられており、機能的特異性を付与することが公知である。当業者は本開示を考慮してこれらの各クラスおよびアイソタイプの修飾異形（ｖｅｒｓｉｏｎ）を容易に識別可能であるため、これらは本発明の範囲内である。

上記のように、可変領域により、抗体は抗原上のエピトープを選択的に認識して特異的に結合することが可能である。すなわち、抗体のＶ_ＬドメインとＶ_Ｈドメインとを組み合わせて三次元抗原結合部位を定義する可変領域を形成する。この四要素抗体構造は、Ｙの各アームの末端に存在する抗原結合部位を形成する。より詳細には、抗原結合部位は、各Ｖ_Ｈ鎖およびＶ_Ｌ鎖上の３つの補体決定領域（ＣＤＲ）によって定義される。

本明細書中で使用される、用語「結合部位」または「結合ドメイン」は、目的の標的分子（例えば、抗原、リガンド、受容体、基質、またはインヒビター）への選択的結合を担うポリペプチド領域を含む。例示的結合ドメインには、抗体可変ドメイン、リガンドの受容体結合ドメイン、受容体のリガンド結合ドメイン、または酵素ドメインが含まれる。

１つの実施形態では、結合分子は、減少または消失のために標的化される分子（例えば、細胞表面抗原または可溶性抗原）に特異的な少なくとも１つの結合部位を有する。

好ましい実施形態では、結合ドメインは抗原結合部位である。抗原結合部位は、あるポリペプチドが別のポリペプチドへ変化する可変領域によって形成される。本発明のポリペプチドは、少なくとも２つの抗原結合部位を含む。本明細書中で使用される、用語「抗原結合部位」には、抗原（例えば、細胞表面または可溶性抗原）と特異的に結合する（免疫反応する）部位が含まれる。抗原結合部位には、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変領域が含まれ、これらの可変領域によって形成された結合部位が抗体の特異性を決定する。１つの実施形態では、本発明の抗原結合分子は、抗体分子の少なくとも１つの重鎖または軽鎖ＣＤＲ（例えば、その配列は当該分野で公知であるか本明細書中に記載されている）を含む。別の実施形態では、本発明の抗原結合分子は、１つまたは複数の抗体分子由来の少なくとも２つのＣＤＲを含む。別の実施形態では、本発明の抗原結合分子は、１つまたは複数の抗体分子由来の少なくとも３つのＣＤＲを含む。別の実施形態では、本発明の抗原結合分子は、１つまたは複数の抗体分子由来の少なくとも４つのＣＤＲを含む。別の実施形態では、本発明の抗原結合分子は、１つまたは複数の抗体分子由来の少なくとも５つのＣＤＲを含む。別の実施形態では、本発明の抗原結合分子は、１つまたは複数の抗体分子由来の少なくとも６つのＣＤＲを含む。本発明の抗原結合分子に含めることができる少なくとも１つのＣＤＲを含む例示的抗体分子は当該分野で公知であり、例示的分子を本明細書中に記載する。

本明細書中に開示の２つの重鎖部分を含むポリペプチドを結合させて２つの会合したＹを形成し、それによって「四価」分子を形成する４つの結合部位が存在する（例えば、ＷＯ０２／０９６９４８Ａ２を参照のこと）。別の実施形態では、四価ミニボディまたはドメイン欠失抗体を作製することができる。

用語「特異性」は、所与の標的と特異的に結合する（例えば、免疫反応する）潜在的な結合部位数を含む。ポリペプチドは単一特異的であって標的と特異的に結合する１つまたは複数の結合部位を含み得るか、ポリペプチドは多特異的であって同一または異なる標的と特異的に結合する２つまたはそれ以上の結合部位を含み得る。

１つの実施形態では、本発明の結合分子は、二重特異性分子（例えば、１つを超える分子（例えば、１つを超える抗原または同じ抗原上の１つを超えるエピトープ）に結合特異性を有する抗体、ミニボディ、ドメイン欠失抗体、または融合タンパク質）である。１つの実施形態では、二重特異性分子は、減少または消失のためにターゲティングされた分子に特異的な少なくとも１つの標的結合部位および細胞上のターゲティング分子を有する。別の実施形態では、二重特異性分子は、減少または消失のためにターゲティングされた分子に特異的な少なくとも１つの標的結合部位および薬物に特異的な少なくとも１つ標的結合部位を有する。さらに別の実施形態では、二重特異性分子は、減少または消失のためにターゲティングされた分子に特異的な少なくとも１つの標的結合部位およびプロドラッグに特異的な少なくとも１つの標的結合部位を有する。好ましい実施形態では、二重特異性分子は１つの標的に特異的な２つの標的結合部位および第２の標的に特異的な２つの標的結合部位を有する四価抗体である。四価二重特異性分子は、各特異性について二価であり得る。二重特異性分子を以下でさらに説明する。

本明細書中で使用される、用語「価数」は、ポリペプチド中の潜在的標的結合部位数をいう。各標的結合部位は、標的分子上の１つの標的分子または特異的部位と特異的に結合する。ポリペプチドが１つを超える標的結合部位を含む場合、各標的結合部位は、同一または異なる分子と特異的に結合し得る（例えば、異なるリガンドもしくは異なる抗原または同一抗原上の異なるエピトープに結合することができる）。

天然に存在する抗体では、抗体は水性環境でその三次元形状を呈するように、各単量体抗体上に存在する６つのＣＤＲは、抗原結合部位を形成するように特異的に配置された短い不連続なアミノ酸配列である。残りの重鎖および軽鎖可変ドメインは、アミノ酸配列中での分子内可変性が低く、フレームワーク領域と呼ばれる。フレームワーク領域は、大部分がβシート配座を取り、ＣＤＲはβシート構造に連結し、いくつかの場合、その一部を形成するループを形成する。したがって、これらのフレームワーク領域は、鎖間非供給結合性相互作用によって正確な方向で６つのＣＤＲを配置する足場を形成するように作用する。配置されたＣＤＲによって形成された抗原結合部位は、免疫反応性抗原上のエピトープに相補的な表面を定義する。この相補性表面は、免疫反応性抗原エピトープへの抗体の非共有結合を促進する。当業者は、ＣＤＲの位置を容易に同定することができる。

前述のように、種々の免疫グロブリンクラスの定常領域のサブユニット構造および三次元形状は周知である。本明細書中で使用される、用語「ＶＨドメイン」には、免疫グロブリン重鎖のアミノ末端可変ドメインが含まれ、用語「ＣＨ１ドメイン」には、免疫グロブリン重鎖の第１の（ほとんどのアミノ末端）定常領域ドメインが含まれる。ＣＨ１ドメインはＶＨドメインに隣接し、免疫グロブリン重鎖分子のヒンジ領域に対してアミノ末端側に存在する。

本明細書中で使用される、用語「ＣＨ２ドメイン」には、例えば、従来のナンバリングスキームを使用して抗体の残基約２４４〜残基３６０（Ｋａｂａｔナンバリングシステムでは残基２４４〜３６０、ＥＵナンバリングシステムでは残基２３１〜３４０（ＫａｂａｔＥＡｅｔａｌ．ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ．Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＵＳＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＨｅａｌｔｈａｎｄＨｕｍａｎＳｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ．１９９１））に及ぶ重鎖分子の一部が含まれる。別のドメインと密接に対合しないという点でＣＨ２ドメインは独特である。むしろ、２つのＮ結合分岐炭水化物鎖は、インタクトな天然のＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメインの間に介入する。また、ＣＨ３ドメインはＣＨ２ドメインからＩｇＧ分子のＣ末端までに及び、約１０８個の残基を含むことが十分に報告されている。

本明細書中で使用される、用語「ヒンジ領域」には、ＣＨ１ドメインをＣＨ２ドメインに連結する重鎖分子の一部が含まれる。このヒンジ領域は、約２５残基を含みかつ可撓性を示すため、２つのＮ末端抗原結合領域は独立して動くことが可能である。ヒンジ領域を以下の３つの異なるドメインにさらに分割することができる：上部、中央、および下部のヒンジドメイン（Ｒｏｕｘｅｔａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８１６１：４０８３）。

１つの実施形態では、本発明の結合分子は連結ペプチドを含む。本発明の連結ペプチドは合成である。本明細書中で使用される、ポリペプチドに関する用語「合成」には、天然に存在しないアミノ酸配列を含むポリペプチドが含まれる。例えば、天然に存在するポリペプチドの修飾形態（例えば、付加、置換、または欠失などの変異を含む）であるか、アミノ酸の線状配列中で事実上天然に結合しない第２のアミノ酸配列（天然であってもなくても良い）に結合する第１のアミノ酸配列（天然であってもなくても良い）を含む天然に存在しないポリペプチド。

本発明の連結ペプチドは、本発明の結合分子の２つのドメイン（例えば、結合ドメインおよび二量体化ドメイン）を連結する。例えば、連結ペプチドは、重鎖部分を結合部位を含む結合ドメインに連結させる。１つの実施形態では、連結ペプチドは、ポリペプチド鎖の線状アミノ酸配列中の２つの重鎖定量領域ドメイン（ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメイン；ＣＨ１ドメインとＣＨ３ドメイン；ヒンジとＣＨ１ドメイン；ヒンジとＣＨ３ドメイン；ＶＨとヒンジドメイン；またはＣＨ３ドメインと非免疫グロブリンポリペプチドなど）を連結する。好ましくは、このような連結ペプチドは、ポリペプチド分子に可撓性を与え、ジスルフィド結合を介した二量体化を容易にする。１つの実施形態では、本発明の連結ペプチドを使用して、１つまたは複数の重鎖ドメイン（例えば、ドメイン欠失構築物中の定常領域ドメインの少なくとも一部（例えば、ＣＨ２ドメインの少なくとも一部）および／またはヒンジ領域の少なくとも一部（例えば、下部のヒンジ領域ドメインの少なくとも一部））を置換する。例えば、１つの実施形態では、連結ペプチドを介してＶＨドメインをＣＨ３ドメインに融合する（連結ペプチドのＣ末端をＣＨ３ドメインのＮ末端に結合し、連結ペプチドのＮ末端をＶＨドメインのＣ末端に結合する）。別の実施形態では、連結ペプチドを介してＶＬドメインをＣＨ３ドメインに融合する（連結ペプチドのＣ末端をＣＨ３ドメインのＮ末端に結合し、連結ペプチドのＮ末端をＶＬドメインのＣ末端に結合する）。別の実施形態では、連結ペプチドを介してＣＨ１ドメインをＣＨ３ドメインに融合する（連結ペプチドのＣ末端をＣＨ３ドメインのＮ末端に結合し、連結ペプチドのＮ末端をＣＨ１ドメインのＣ末端に結合する）。

１つの実施形態では、合成連結ペプチドは、定常領域ドメインの一部を含む。例えば、１つの実施形態では、ＣＨ２ドメインを置換する連結ペプチドは、ＣＨ２ドメインの一部を含み得る。

１つの実施形態では、連結ペプチドは、ｇｌｙ−ｓｅｒリンカーを含むかこれからなる。本明細書中で使用される、用語「ｇｌｙ−ｓｅｒリンカー」は、グリシンおよびセリン残基からなるペプチドをいう。例示的なｇｌｙ／ｓｅｒリンカーは、アミノ酸配列ＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧ（配列番号１）を含む。１つの実施形態では、本発明の連結ペプチドは、上部ヒンジ領域の少なくとも一部（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４分子由来）、中央のヒンジ領域の少なくとも一部（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４分子由来）、および一連のｇｌｙ／ｓｅｒアミノ酸残基（例えば、ＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧ（配列番号１）などのｇｌｙ／ｓｅｒリンカー）を含む。１つの実施形態では、連結ペプチドは、天然に存在するＩｇＧ１またはＩｇＧ３ヒンジ領域と比較して１つまたは複数のアミノ酸が置換されている。別の実施形態では、連結ペプチドは、ＷＯ０２／０６０９５５などに記載のアミノ酸配列を含む。連結ペプチドを、以下により詳細に記載する。

本明細書中で使用される、用語「ジスルフィド結合」には、２つの硫黄原子間に形成された共有結合が含まれる。アミノ酸システインは、ジスルフィド結合を形成するか第２のチオール基と架橋することができるチオール基を含む。ほとんどの天然に存在するＩｇＧ分子では、ＣＨ１およびＣＬ領域はジスルフィド結合によって結合し、２つの重鎖はＫａｂａｔナンバリングシステムを使用して２３９および２４２（ＥＵナンバリングシステムでは２２６位および２２９位）に対応する位置で２つのジスルフィド結合によって結合する。

定常領域がいくつかのエフェクター機能を媒介することが当該分野で公知である。例えば、補体のＣ１成分の抗体への結合によって補体系が活性化する。補体の活性化は、細胞病原体のオプソニン作用および溶解で重要である。補体の活性化は炎症反応を刺激することもでき、自己免疫性過敏症にも関与し得る。さらに、抗体は、Ｆｃ領域を介して細胞に結合し、抗体Ｆｃ領域上のＦｃ受容体部位が細胞上のＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合する。異なる抗体クラスに特異的な多数のＦｃ受容体が存在し、ＩｇＧ（γ受容体）、ＩｇＥ（ε受容体）、ＩｇＡ（α受容体）、およびＩｇＭ（μ受容体）が含まれる。細胞表面上のＦｃ受容体への抗体の結合により、多数の重要かつ多様な生物反応（抗体被覆粒子の飲み込みおよび破壊、免疫複合体のクリアランス、キラー細胞による抗体被覆標的細胞の溶解（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（または、ＡＤＣＣ）と呼ばれる）、炎症メディエーターの放出、胎盤通過、ならびに免疫グロブリン産生の制御が含まれる）を誘発する。

１つの実施形態では、Ｆｃ部分を、当該分野で公知の技術を使用して、エフェクター機能を減少させるように変異することができる。例えば、定常領域ドメインの（点変異または他の手段による）欠失または不活化によって、循環修飾抗体のＦｃ受容体結合が減少し、それによって腫瘍局在化が増加し得る。他の場合、本発明と一致する定常領域の修飾によって補体結合を抑制し、それによって血清半減期および抱合した細胞毒素の非特異的会合を減少させるかもしれない。定常領域のさらに別の修飾を使用してジスルフィド結合またはオリゴサッカリド部分を修飾し、抗原特異性または抗体可撓性の増加によって局在化が増加させられ得る。より一般的には、当業者は、本明細書中に記載のように修飾された抗体は、容易に認識することができてもできなくてもよい多数のわずかな効果を発揮し得ることを認識する。しかし、得られた生理学的プロフィール、生物学的利用能、および修飾の他の生化学的効果（腫瘍局在化、生体分布、および血清半減期など）を、実験をやり直すことなく周知の免疫学的技術を使用して容易に測定および定量することができる。

１つの実施形態では、抗体の修飾形態を、当該分野で公知の技術を使用して全前駆体または親抗体から作製することができる。例示的技術は、以下により詳細に記載する。特に好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドの可変領域および定常領域は共にヒトである。１つの実施形態では、当該分野で公知の技術を使用して、完全なヒト抗体を作製することができる。例えば、特定の抗原に対する完全なヒト抗体を、抗原の攻撃に反応してこのような抗体を産生するように改変されているが、その内因性遺伝子座が無効にされたトランスジェニック動物への抗原の投与によって調製することができる。抗体を作製するために使用することができる例示的技術は、米国特許第６，１５０，５８４号、同第６，４５８，５９２号、同第６，４２０，１４０号に記載されている。他の技術が当該分野で公知である。

重鎖部分を含むポリペプチドは、免疫グロブリン分子に由来しない他のアミノ酸配列または部分を含んでいても含んでいなくても良い。このような修飾を、以下により詳細に記載する。例えば、１つの実施形態では、本発明のポリペプチドは、可撓性リンカー配列を含み得る。別の実施形態では、ＰＥＧなどの機能的部分を付加するようにポリペプチドを修飾することができる。

本発明のポリペプチドは、ポリペプチドを選択された標的分子と会合する少なくとも２つの結合部位を含む。

１つの実施形態では、本発明の結合分子は、抗体分子（例えば、インタクトな抗体分子）または抗体分子のフラグメントを含む。別の実施形態では、本発明の結合分子は修飾されているか合成抗体分子である。１つの実施形態では、本発明の結合分子は、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、または組換え産生された抗体の全部または一部（例えば、これら由来の少なくとも１つの抗原結合部位、少なくとも１つのＣＤＲ、少なくとも１つの重鎖部分）を含む。

結合分子が抗体または修飾抗体である実施形態では、抗原結合部位および重鎖部分は、同一の免疫グロブリン分子に由来する必要はない。これに関して、可変領域は、液性応答が増加するように誘導して所望の抗原に対する免疫グロブリンを生成することができる任意の動物型に由来し得る。したがって、ポリペプチドの可変領域は、例えば、哺乳動物起源（例えば、ヒト、マウス、非ヒト霊長類（カニクイザル、マカクザルなど）、オオカミ、ラクダ科動物（ラクダ、ラマ、および関連種））であり得る。別の実施形態では、可変領域は、軟骨魚類（ｃｏｎｄｒｉｃｔｈｏｉｄ）（例えば、サメ）起源であり得る。

本発明のポリペプチドを、当該分野で公知の技術を使用して作製することができる。１つの実施形態では、本発明のポリペプチドは、「組換え産生された」（すなわち、組換えＤＮＡテクノロジーを使用して産生した）抗体分子である。例示的な抗体分子の作製技術を、以下でより詳細に考察する。

１つの実施形態では、本発明のポリペプチドは、修飾抗体である。本明細書中で使用される、用語「修飾抗体」には、天然に存在しないように変化した合成形態の抗体（例えば、少なくとも２つの重鎖部分を含むが、２つの完全な重鎖を含まない抗体（ドメイン欠失抗体またはミニボディなど））；２つまたはそれ以上の異なる抗原または単一抗原上の異なるエピトープに結合するように変化した多特異性形態の抗体（例えば、二重特異性、三重特異性など）；ｓｃＦｖ分子に連結した重鎖分子などが含まれる。ｓｃＦｖ分子は当該分野で公知であり、例えば、米国特許第５，８９２，０１９号に記載されている。さらに、用語「修飾抗体」には、多価形態の抗体（例えば、３つまたはそれ以上の同一抗原のコピーに結合する三価、四価などの抗体）が含まれる。別の実施形態では、本発明の結合分子は、ＣＨ２ドメインを欠く少なくとも１つの重鎖部分を含み、かつリガンドおよびその受容体の１つのメンバーの結合部分を含むポリペプチドの結合ドメインを含む融合タンパク質である。

１つの実施形態では、本発明の用語、「修飾抗体」には、完全な変化していないほぼ同一の免疫原性を示す抗体と比較した場合に１つまたは複数の定常領域ドメインの少なくとも一部分が欠失しているか、非共有結合によって二量体化する能力、腫瘍部位に局在化する能力の増加、または血清半減期の減少などの所望の生化学的特徴が得られるように変化した免疫グロブリン、抗体、またはその免疫反応性フラグメントもしくは組換え体が含まれる。好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖に類似のポリペプチド鎖を含むが、１つまたは複数の重鎖ドメインの少なくとも一部を欠くドメイン欠失抗体である。より好ましくは、修飾抗体の定常領域の１つの全ドメインが欠失しており、さらにより好ましくは、ＣＨ２ドメインの全てまたは一部が欠失している。

好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドは、ヒトにおいて有害な免疫応答を誘発しない。本発明に適合する定常領域の修飾は、１つまたは複数のドメイン中の１つまたは複数のアミノ酸の付加、欠失、または置換を含む。すなわち、本明細書中に開示の本発明のポリペプチドは、３つの重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２、またはＣＨ３）および／または軽鎖定常領域ドメイン（ＣＬ）のうちの１つまたは複数を変化または修飾することができる。

１つの実施形態では、本発明は、少なくとも１つのＣＣ４９結合部位（Ｔａｇ７２に特異的）を含む修飾抗体分子に関する。例えば、図８Ａ（配列番号１６）は、ｓｃ（Ｆｖ）２重鎖四価ＣＨ_２ドメイン欠失ｈｕＣＣ４９遺伝子の一本鎖ＤＮＡ配列を示す。図８Ｂ（配列番号１７）は、合成Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］ヒンジ連結ペプチドを含むｓｃ（Ｆｖ）２重鎖四価ＣＨ_２ドメイン欠失ｈｕＣＣ４９遺伝子の一本鎖ＤＮＡ配列を示す。図８Ｃ（配列番号１８）は、ｓｃ（Ｆｖ）２軽鎖ＣＨ_２ドメイン欠失ｈｕＣＣ４９の一本鎖ＤＮＡ配列を示す。図９Ａ（配列番号１９）は、重鎖ｓｃ（Ｆｖ）２四価ＣＨ_２ドメイン欠失ｈｕＣＣ４９のアミノ酸配列を示す。図９Ｂ（配列番号２０）は、合成Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］ヒンジ連結ペプチドを含む重鎖四価ＣＨ_２ドメイン欠失ｓｃ（Ｆｖ）２ｈｕＣＣ４９のアミノ酸配列を示す。配列番号２１は、軽鎖ＣＨ_２ドメイン欠失ｓｃ（Ｆｖ）２ｈｕＣＣ４９のアミノ酸配列を示す。図１０Ａ（配列番号２２）は、四価ＣＨ_２ドメイン欠失２ｓｃ（Ｆｖ）２ｈｕＣＣ４９ミニボディ遺伝子の一本鎖ＤＮＡ配列を示す。図１０Ｂ（配列番号２３）は、合成Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］ヒンジ連結ペプチドを含む四価ＣＨ_２ドメイン欠失ｓｃ（Ｆｖ）２ｈｕＣＣ４９ミニボディ遺伝子の一本鎖ＤＮＡ配列を示す。図１１Ａ（配列番号２４）は、四価ＣＨ_２ドメイン欠失ｓｃ（Ｆｖ）２ｈｕＣＣ４９ミニボディのアミノ酸配列を示す。図１１Ｂ（配列番号２５）は、合成Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］ヒンジ連結ペプチドを含む四価ＣＨ_２ドメイン欠失ｓｃ（Ｆｖ）２ｈｕＣＣ４９ミニボディのアミノ酸配列を示す。別の実施形態では、本発明は、少なくとも１つのｐ５Ｅ８結合部位（ＣＤ２３に特異的）を含む修飾抗体分子に関する。図１２Ａ（配列番号２６）は、Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］ヒンジ連結ペプチドを含む重鎖四価ＣＨ２ドメイン欠失ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）ｐ５Ｅ８ｓｃ（Ｆｖ）２抗体遺伝子の一本鎖ＤＮＡ配列を示す。図１２Ｂ（配列番号２７）は、軽鎖四価ＣＨ２ドメイン欠失ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）ｐ５Ｅ８ｓｃ（Ｆｖ）２遺伝子の一本鎖ＤＮＡ配列を示す。図１３Ａ（配列番号２８）は、Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］ヒンジ連結ペプチドを含む重鎖四価ＣＨ２ドメイン欠失ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）ｐ５Ｅ８ｓｃ（Ｆｖ）２抗体のアミノ酸配列を示す。図１３Ｂ（配列番号２９）は、軽鎖四価ＣＨ２ドメイン欠失ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）ｐ５Ｅ８ｓｃ（Ｆｖ）２抗体のアミノ酸配列を示す。図１４（配列番号３０）は、Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］ヒンジ連結ペプチドを含むＣＨ２ドメイン欠失ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）ｐ５Ｅ８ＶＬ／ＶＨミニボディ遺伝子の一本鎖ＤＮＡ配列を示す。図１５（配列番号３１）は、Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］ヒンジ連結ペプチドを含むＣＨ２ドメイン欠失ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）ｐ５Ｅ８ＶＨ／ＶＬミニボディ遺伝子の一本鎖ＤＮＡ配列を示す。図１６（配列番号３２）は、Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］ヒンジ連結ペプチドを含むＣＨ２ドメイン欠失ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）ｐ５Ｅ８ＶＬ／ＶＨミニボディのアミノ酸配列を示す。図１７（配列番号３３）は、Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］ヒンジ連結ペプチドを含むＣＨ２ドメイン欠失ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）ｐ５Ｅ８ＶＨ／ＶＬミニボディのアミノ酸配列を示す。

１つの実施形態では、本発明のポリペプチドを、当該分野で認識されている技術を使用して、その免疫原性を減少させるように修飾することができる。例えば、本発明の抗体またはポリペプチドを、ヒト化、脱免疫化（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）するか、キメラ抗体を作製することができる。これらの抗体型は、親抗体の抗原結合特性を保持するか実質的に保持しているが、ヒトにおける免疫原性が低い非ヒト抗体（典型的には、マウス抗体）に由来する。種々の方法（（ａ）キメラ抗体を作製するためのヒト定常領域への全非ヒト可変ドメインのグラフティング、（ｂ）重要なフレームワーク残基を保持しているか保持していないヒトフレームワークおよび定常領域への１つまたは複数の非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）の少なくとも一部のグラフティング、または（ｃ）全非ヒト可変ドメインが移植されているが、表面残基の置換によってヒト様部分で「覆う」ことが含まれる）によって、これを行うことができる。このような方法は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：６８５１−５（１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎｅｔａｌ．，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４４：６５−９２（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９：１５３４−１５３６（１９８８），Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．２８：４８９−４９８（１９９１）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．３１：１６９−２１７（１９９４）、および米国特許第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号、および同第５，６９３，７６２号（その全体が本明細書中で参考として援用される）に開示されている。

脱免疫化（ｄｅ−ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）を使用して、抗体の免疫原性を減少させることもできる。本明細書中で使用される、用語「脱免疫化」には、Ｔ細胞エピトープを修飾するための抗体の変化が含まれる（例えば、ＷＯ９８５２９７６Ａ１、ＷＯ００３４３１７Ａ２を参照のこと）。例えば、出発抗体由来のＶＨおよびＶＬ配列を分析し、ヒトＴ細胞エピトープを、各Ｖ領域から「マッピング」し、これは相補性決定領域（ＣＤＲ）および配列内の他の重要な残基に対するエピトープの位置を示す。最終抗体の活性を変化させるリスクの低い別のアミノ酸置換を同定するために、Ｔ細胞エピトープ地図由来の各Ｔ細胞エピトープを分析する。アミノ酸置換の組み合わせを含むＶＨおよびＶＬ配列の別の範囲をデザインし、その後これらの配列を一定範囲の本発明のポリペプチドに組み込み、機能について試験する。典型的には、１２〜２４個の変異抗体を作製し、試験する。次いで、修飾Ｖ領域およびヒトＣ領域を含む完全な重鎖および軽鎖の遺伝子を発現ベクターにクローン化し、全抗体の産生のためにプラスミドを細胞株に導入する。次いで、抗体を適切な生化学アッセイおよび生物学的アッセイで比較し、最適な変異型を同定する。１つの実施形態では、結合分子はキメラ抗体を含む。本出願の文脈では、用語「キメラ抗体」は、免疫反応性領域または部位が第１の種から得るかこれに由来し、定常領域（インタクトであるか、一部であるか、本発明によって修飾することができる）を第２の種から得た任意の抗体を意味する。好ましい実施形態では、標的結合領域または部位は、非ヒト供給源（例えば、マウス）に由来し、定常領域はヒトである。好ましくは、重鎖および軽鎖中の両可変ドメインを、１つまたは複数のＣＤＲの少なくとも部分的置換、必要に応じて部分的フレームワーク領域の置換および配列の変更によって変化させる。ＣＤＲはフレームワーク領域が由来する抗体と同一のクラスまたはさらにサブクラスの抗体に由来し得るにも関わらず、ＣＤＲは、異なるクラスの抗体、好ましくは異なる種由来の抗体に由来すると予想される。ある可変ドメインの抗原結合能力を別の可変ドメインに移動させるために全てのＣＤＲをドナー可変領域由来の完全なＣＤＲに置換する必要はない。むしろ、標的結合部位の活性を維持するために必要な残基を移動することのみが必要であり得る。米国特許第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号、および同第５，６９３，７６２号に記載の説明を考えると、免疫原性が減少した機能的抗体を得るための日常的実験または試験および誤差試験は、当業者の能力の範囲内である。

本明細書中で使用される、用語「適切に折り畳まれたポリペプチド」には、ポリペプチドを含む全ての機能的ドメインが明らかに活性であるポリペプチド（例えば、抗体などの抗原結合分子）が含まれる。本明細書中で使用される、用語「不適切に折り畳まれたポリペプチド」には、ポリペプチドの少なくとも１つの機能的ドメインが不活性であるポリペプチドが含まれる。１つの実施形態では、適切に折り畳まれたポリペプチドは少なくとも１つのジスルフィド結合によって結合したポリペプチド鎖を含み、逆に不適切に折り畳まれたポリペプチドは少なくとも１つのジスルフィド結合によって結合していないポリペプチド鎖を含む。

本明細書中で使用される、用語「悪性腫瘍」は、非良性腫瘍または癌をいう。本明細書中で使用される、用語「癌」には、無秩序または無制御の細胞増殖によって特徴づけられる悪性腫瘍が含まれる。例示的な癌には、癌腫、肉腫、白血病、およびリンパ腫が含まれる。用語「癌」には、原発性悪性腫瘍（例えば、その細胞が元の腫瘍部位以外の被験体の体内の部位に移動しないもの）および続発性悪性腫瘍（例えば、転移（元の腫瘍部位と異なる第２の部位への腫瘍細胞の移動）によるもの）が含まれる。

１つの実施形態では、本発明の結合分子は、腫瘍細胞に結合する。腫瘍細胞上に発現した抗原に結合する抗原結合部位を含む例示的抗体は当該分野で公知であり、このような抗体由来の１つまたは複数のＣＤＲを、本発明の結合分子中に含めることができる。例示的抗体には、２Ｂ８、Ｌｙｍ１、Ｌｙｍ２、ＬＬ２、Ｈｅｒ２、Ｂ１、ＭＢ１、ＢＨ３、Ｂ４、Ｂ７２．３、５Ｅ８、Ｂ３Ｆ６、および５Ｅ１０が含まれる。好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドは、ＣＤ２０に結合するＣ２Ｂ８抗体である。別の好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドは、ＴＡＧ７２を認識するＣＣ４９抗体である。

１つの実施形態では、本発明の結合分子は、自己免疫性または炎症性疾患または障害の治療で有用な分子に結合する。

本明細書中で使用される、用語「自己免疫疾患または障害」は、免疫系が身体の細胞を攻撃して組織が破壊される被験体の障害または病態をいう。自己免疫疾患には、全身性自己免疫疾患（すなわち、自己免疫反応が多数の組織で同時に起こる）または器官特異的自己免疫疾患（すなわち、自己免疫反応が単一の器官を標的する）が含まれる。本発明の方法および組成物によって診断、防止、または治療することができる自己免疫疾患の例には、クローン病；炎症性腸疾患（ＩＢＤ）；全身性紅斑性狼瘡；潰瘍性大腸炎；関節リウマチ；グッドパツチャー症候群；グレーブス病；橋本甲状腺炎；尋常性天疱瘡；重症筋無力症；強皮症；自己免疫性溶血性貧血；自己免疫性血小板減少性紫斑；多発性筋炎および皮膚筋炎；悪性貧血；シェーグレン症候群；強直性脊椎炎；血管炎；Ｉ型真性糖尿病；神経障害、多発性硬化症、および自己免疫疾患の結果として発症する続発疾患が含まれるが、これらに限定されない。

本明細書中で使用される、用語「炎症性疾患または障害」には、炎症（例えば、血流の増加、浮腫、免疫細胞の活性化（例えば、増殖、サイトカイン産生、または食作用の増加））によって発症するか少なくとも一部が悪化する疾患または障害が含まれる。例示的な障害には、炎症または炎症因子（例えば、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、一酸化窒素（ＮＯ）、ＴＮＦ、インターロイキン、血漿タンパク質、細胞防御系、サイトカイン、脂質代謝産物、プロテアーゼ、有毒ラジカル、ミトコンドリア、アポトーシス、接着分子など）が異常量（例えば、変化する（例えば、被験体を有利にする）のに有利であり得る量）で領域内に含まれるか存在する障害が含まれる。炎症過程は、生体組織の損傷への応答である。炎症の原因は、物理的損傷、化学物質、微生物、組織の壊死、癌、または他の作用因子に起因し得る。急性炎症は持続時間が短く、数日しか持続しない。しかし、より長く持続する場合、慢性炎症ということができる。

炎症性障害には、急性炎症性障害、慢性炎症性障害、および再発性炎症性障害が含まれる。急性炎症性障害は、一般に、持続時間が比較的短く、約数分から約１〜２日間であるが、数週間持続することもあり得る。急性炎症性障害の主な特徴には、血流の増加、流動物および血漿タンパク質の滲出（浮腫）、および白血球（好中球など）の移動が含まれる。慢性炎症性障害は、一般に、持続時間がより長く、例えば、数週間、数ヵ月から数年またはさらにそれ以上持続し、組織学的にリンパ球およびマクロファージの存在ならびに血管および結合組織の増殖に関連する。再発性炎症性障害には、一定期間後に再発するかまたは周期的な障害が含まれる。再発性炎症性障害の例には、喘息および多発性硬化症が含まれる。いくつかの障害は、１つまたは複数のカテゴリーに分類され得る。

炎症性障害は、一般に、高熱、潮紅、腫脹、痛み、および機能喪失によって特徴づけられる。炎症性障害の原因の例には、微生物感染（例えば、細菌、ウイルス、および真菌の感染）、物理的因子（例えば、火傷、放射線、および外傷）、化学的因子（例えば、毒素および腐食性物質）、組織の壊死、および種々の免疫反応型が含まれるが、これらに限定されない。炎症性障害の例には、変形性関節症、関節リウマチ、急性および慢性感染症（細菌、ウイルス、および真菌）；急性および慢性気管支炎、副鼻腔炎、および他の呼吸器感染（感冒が含まれる）；急性および慢性胃腸炎および大腸炎；急性および慢性膀胱炎および尿道炎；急性呼吸窮迫症候群；嚢胞性線維症；急性および慢性皮膚炎；急性および慢性結膜炎；急性および慢性漿膜炎（心膜炎、腹膜炎、滑膜炎、胸膜炎、および腱炎）；尿毒症性心膜炎；急性および慢性胆嚢炎；急性および慢性膣炎；急性および慢性ブドウ膜炎；薬物反応；および火傷（熱、化学物質、および電気）が含まれるが、これらに限定されない。

本明細書中で使用される、用語「疎水性相互作用に基づいてポリペプチドを分離する媒体」には、マトリクスに共有結合した疎水性リガンド（例えば、アルキル基またはアリール基）を含む媒体が含まれる。このような媒体を使用して、溶媒およびポリペプチド表面上のアクセスしやすい非極性基と媒体の疎水性リガンドとの間の相互作用に基づいてポリペプチドを分離することができる。例示的媒体は、ＴｏｓｏｈＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅのＰｈｅｎｙｌ５ＰＷ−ＨＲである。

本明細書中で使用される、用語「伝導率」には、μシーメンス／ｃｍ（正式にはマイクロモー／ｃｍ）で測定した溶液の電気伝導率が含まれる。溶液のイオン含有率が高いほど、溶液の伝導率が高くなる。伝導率を、当該分野で周知の技術（例えば、２電極間を流れる電流の測定）を使用して容易に測定することができる。

本発明の分離方法を、酸性から中性のｐＨ範囲（例えば、約ｐＨ３．５からほぼ中性）の溶液を使用して使用することができる。本明細書中で使用される、用語「ほぼ中性ｐＨ」には、約ｐＨ７が含まれる。例えば、１つの実施形態では、本発明の分離方法を、ｐＨが約３、約４、約５、約６、約７、または約８の溶液（例えば、緩衝液）を使用して行うことができる。好ましくは、溶液のｐＨは約６または約７である。１つの実施形態では、溶液のｐＨは、約４．０、約４．１、約４．２、約４．３、約４．４、約４．５、約４．６、約４．７、約４．８、約４．９、約５．０、約５．１、約５．２、約５．３、約５．４、約５．５、約５．６、約５．７、約５．８、約５．９、約６．０、約６．１、約６．２、約６．３、約６．４、約６．５、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９、約７．０、約７．１、約７．２、約７．３、約７．４、約７．５、約７．６、約７．７、約７．８、約７．９、または約８．０である。

本明細書中で使用される、用語「アフィニティマトリクス」には、アフィニティリガンドが結合するアガロース、空隙制御ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄｐｏｒｅｇｌａｓｓ）、またはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどのマトリクスが含まれる。アフィニティリガンドは、所望のポリペプチドに結合し、夾雑ポリペプチドはアフィニティリガンドに結合しない。公知のプロトコールを使用して、所望のポリペプチドをアフィニティマトリクスから溶離することができる。

本明細書中で使用される、用語「操作された」には、合成手段（例えば、組換え技術、ｉｎｖｉｔｒｏペプチド合成、ペプチドの酵素的もしくは化学的カップリング、またはこれらの技術のいくつかの組み合わせ）による核酸またはポリペプチド分子の操作が含まれる。好ましくは、本発明の結合分子を、例えば、本発明の連結ペプチドを発現するように操作する。

本明細書中で使用される、用語「結合した」、「融合した」、または「融合」を、交換可能に使用する。これらの用語は、任意の手段（化学的抱合または組換え手段が含まれる）による２つを超える要素または成分の結合をいう。「インフレーム融合」は、元のＯＲＦの正確な読み枠を維持する様式で連続的なより長いＯＲＦを形成するための２つまたはそれ以上の読み取り枠（ＯＲＦ）の結合をいう。したがって、得られた組換え融合タンパク質は、元のＯＲＦによってコードされるポリペプチドに対応する２つまたはそれ以上のセグメント（セグメントは通常天然ではこのように結合していない）を含む単一のタンパク質である。このようにして読み枠が融合セグメントを通して連続になるにもかかわらず、セグメントを、例えば、インフレームリンカー配列によって物理的または空間的に分離することができる。

ポリペプチドの文脈では、「直線の配列」または「配列」は、配列中の隣接残基がポリペプチドの一次構造において連続するポリペプチド中のアミノ酸のアミノ末端からカルボキシル末端への順序である。

本明細書中で使用される、句「結合分子の投与から恩恵を受ける被験体」には、例えば、結合分子によって認識される抗原の検出（例えば、診断手順）のために使用される結合分子の投与および／または結合分子によって認識される標的を減少または消失するための結合分子を使用した治療から恩恵を受ける哺乳動物被験体などの被験体が含まれる。例えば、１つの実施形態では、被験体は、循環もしくは血清由来の可溶性もしくは特定の分子（例えば、毒素または病原体）の減少もしくは消失または標的を発現する細胞集団（例えば、腫瘍細胞）の減少もしくは消失から恩恵を受けることができる。本明細書中にさらに詳細に記載するように、結合分子を非抱合形態で使用することができるか、例えば、薬物、プロドラッグ、または同位体に抱合することができる。

（ＩＩ．合成連結ペプチド）
本発明の二量体の少なくとも１つのポリペプチド鎖は、本発明の合成連結ペプチドを含み得る。１つの実施形態では、本発明の二量体の少なくとも２つの鎖は連結ペプチドを含む。好ましい実施形態では、本発明の二量体の２つの鎖は連結ペプチドを含む。

１つの実施形態では、連結ペプチドを使用して、単一のポリペプチド鎖中にインフレームで２つの重鎖部分を結合することができる。例えば、１つの実施形態では、本発明の連結ペプチドを使用して、ヒンジ領域（または合成ヒンジ領域）にＣＨ３ドメイン（または合成ＣＨ３ドメイン）を融合することができる。別の実施形態では、本発明の連結ペプチドを使用して、ＣＨ１ドメイン（または合成ＣＨ１ドメイン）にＣＨ３ドメイン（または合成ＣＨ３ドメイン）を融合することができる。さらに別の実施形態では、連結ペプチドは、ヒンジ領域（または合成ヒンジ領域）とＣＨ２ドメイン（または合成ＣＨ２ドメイン）との間のペプチドスペーサーとして作用することができる。

別の実施形態では、ＣＨ３ドメインを、細胞外タンパク質ドメイン（例えば、ＶＬドメイン（または合成ドメイン）、ＶＨドメイン（または合成ドメイン）、ＣＨ１ドメイン（または合成ドメイン）、ヒンジドメイン（または合成ドメイン）、受容体のリガンド結合部分、またはリガンドの受容体結合部分）に融合することができる。例えば、１つの実施形態では、ＶＨまたはＶＬドメインを、連結ペプチドを介してＣＨ３ドメインに融合する（連結ペプチドのＣ末端をＣＨ３ドメインのＮ末端に結合し、連結ペプチドのＮ末端をＶＨまたはＶＬドメインのＣ末端に結合する）。別の実施形態では、ＣＨ１ドメインを、連結ペプチドを介してＣＨ３ドメインに融合する（連結ペプチドのＣ末端をＣＨ３ドメインのＮ末端に結合し、連結ペプチドのＮ末端をＣＨ１ドメインのＣ末端に結合する）。別の実施形態では、本発明の連結ペプチドを使用して、ヒンジ領域（または合成ヒンジ領域）またはその一部にＣＨ３ドメイン（または合成ＣＨ３ドメイン）を融合することができる。さらに別の実施形態では、連結ペプチドは、ヒンジ領域（または合成ヒンジ領域）とＣＨ２ドメイン（または合成ＣＨ２ドメイン）との間のペプチドスペーサーとして作用することができる。

１つの実施形態では、連結ペプチドは、ｇｌｙ／ｓｅｒスペーサーを含むかそれからなることができる。例えば、ＣＨ２ドメインおよび下部ヒンジ領域を短いアミノ酸スペーサーＧＧＳＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号１）で置換したドメイン欠失ＣＣ４９構築物（ＣＣ４９．ΔＣＨ２［ｇｌｙ／ｓｅｒ］）を使用することができる。別の実施形態では、連結ペプチドは、アミノ酸配列ＩＧＫＴＩＳＫＫＡＫ（配列番号３６）を含む。

別の実施形態では、連結ペプチドは、免疫グロブリンヒンジ領域の少なくとも一部を含み得る。例えば、異なる抗体アイソタイプ由来のヒンジエレメントを組み合わせたキメラヒンジドメインを構築することができる。１つの実施形態では、連結ペプチドは、ＩｇＧ１ヒンジ領域の少なくとも一部を含む。別の実施形態では、連結ペプチドは、ＩｇＧ３ヒンジ領域の少なくとも一部を含み得る。別の実施形態では、連結ペプチドは、ＩｇＧ１ヒンジ領域の少なくとも一部およびＩｇＧ３ヒンジ領域の少なくとも一部を含み得る。１つの実施形態では、連結ペプチドは、ＩｇＧ１の上部および中央のヒンジならびに単一のＩｇＧ３の中央のヒンジ反復モチーフを含み得る。

免疫グロブリンヒンジ領域由来のアミノ酸配列を含むこのような連結ペプチド中の各アミノ酸のナンバリングが連結ペプチドの長さによって変化し得るため、これらの分子中のアミノ酸の位置のナンバリングを、Ｋａｂａｔナンバリングを使用して示す（例えば、表２を参照のこと）。表１は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４分子の天然に存在するヒンジ配列を示す。表２は、これらのヒンジ分子の一部についてのＫａｂａｔナンバリングを示し、この表に示す連結ペプチドのアミノ酸残基についてのＫａｂａｔナンバリングも示す。

１つの実施形態では、本発明の連結ペプチドは、天然に存在しない免疫グロブリンヒンジ領域ドメイン（例えば、ヒンジ領域ドメインを含むポリペプチド中に天然に見出されないヒンジ領域ドメインおよび／または天然に存在する免疫グロブリンヒンジ領域ドメインとアミノ酸配列が異なるように変化したヒンジ領域ドメイン）を含む。１つの実施形態では、本発明の連結ペプチドを作製するようにヒンジ領域ドメインを変異させることができる。１つの実施形態では、本発明の連結ペプチドは、天然に存在するシステイン数を含まないヒンジドメインを含む（すなわち、連結ペプチドは天然に存在するヒンジ分子よりもシステイン数が少ないか多い）。好ましい実施形態では、（例えば、天然に存在しないシステイン数を含む）連結ペプチドのポリペプチドへの組み込みによって、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％を超える二量体分子が少なくとも１つの鎖間ジスルフィド結合を介して２つの重鎖部分が結合した形態で存在する組成物が得られる。

本発明の１つの実施形態では、連結ペプチドは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムでアミノ酸２４３位（ＥＵナンバリングシステムでは２３０位）に対応するアミノ酸位にプロリン残基を含むヒンジ領域ドメインを含む。１つの実施形態では、連結ペプチドは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムで２４４位（ＥＵナンバリングシステムでは２４６位）に対応するアミノ酸位にアラニン残基を含む。別の実施形態では、本発明の連結ペプチドは、２４５位（Ｋａｂａｔナンバリングシステム；ＥＵナンバリングシステムでは２４７位）に対応するアミノ酸位にプロリン残基を含む。１つの実施形態では、連結ペプチドは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムで２３９位（ＥＵナンバリングシステムでは２２６位）に対応するアミノ酸位にシステイン残基を含む。１つの実施形態では、連結ペプチドは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムで２３９位（ＥＵナンバリングシステムでは２２６位）に対応するアミノ酸位にセリン残基を含む。１つの実施形態では、連結ペプチドは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムで２４２位（ＥＵナンバリングシステムでは２２９位）に対応するアミノ酸位にシステイン残基を含む。１つの実施形態では、連結ペプチドは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムで２４２位（ＥＵナンバリングシステムでは２２９位）に対応するアミノ酸位にセリン残基を含む。

１つの実施形態では、ポリペプチドの特定のアイソフォームが優先的に合成されるように連結ペプチドを選択することができる（例えば、２つの重鎖部分がジスルフィド結合を介して結合しているか、ジスルフィド結合を介して結合していない）。例えば、例に記載するように、Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３＋［ｇｌｙ／ｓｅｒ］リンカー（配列番号８）、Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［ｇｌｙ／ｓｅｒ］リンカー（配列番号９）、Ｐｒｏ２４３＋［ｇｌｙ／ｓｅｒ］リンカー（配列番号１５）、およびＰｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［ｇｌｙ／ｓｅｒ］リンカー（配列番号１４）、Ｂ型を検出不可能なＡ型ＣＨ２ドメイン欠失抗体のみが産生される連結ペプチド。対照的にＣＨ２ドメイン欠失Ｃｙｓ２４２Ｓｅｒ：Ｐｒｏ２４３（配列番号１２）およびＣＨ２ドメイン欠失Ｃｙｓ２４２Ｓｅｒ：Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５（配列番号１３）の両方によってＢ型アイソフォームが優先的に得られた。したがって、これらの合成ヒンジ領域連結ペプチドは、Ａ型またはＢ型のアイソフォーム優先的合成に有用である。これは、４つ全てのヒトアイソタイプのＣＨ３ドメイン間の高い相同性に基づいて任意の抗体のアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）について真である。（同一および保存されたアミノ酸残基が含まれ、ＩｇＧ１のＣＨ３ドメインはＩｇＧ２のＣＨ３と９８．１３％相同であり、ＩｇＧ３のＣＨ３と９７．２０％相同であり、ＩｇＧ４のＣＨ３と９６．２６％相同である）。本発明の連結ペプチドおよび種々の結合分子をいう括弧は、他で示さない限り、等価な専門用語を示す。

１つの実施形態では、本発明の連結ペプチドは、ヒンジ領域ドメインの後に可撓性ｇｌｙ／ｓｅｒリンカーを含む。例示的な連結ペプチドを、表２ならびに配列番号８〜１５、４８、および４９に示す。これらの例示的な連結ペプチドの変異形態を、１つまたは複数のアミノ酸の置換、付加、または欠失が連結ペプチドに移入されるように連結ペプチドをコードするヌクレオチド配列に１つまたは複数のヌクレオチドを置換、付加、または欠失することによって作製することができると理解される。例えば、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介性変異誘発などの標準的な技術によって変異を移入することができる。好ましくは、Ａ型またはＢ型の合成を優先的に増強する連結ペプチドの能力を変化させないように、１つまたは複数の非必須アミノ酸残基に保存的アミノ酸置換を行う。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ残残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換されたものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当該分野で定義されており、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。したがって、免疫グロブリンポリペプチド中の非必須アミノ酸残基を、同一の側鎖ファミリー由来の別のアミノ酸残基と置換することが好ましい。別の実施形態では、アミノ酸の鎖を、側鎖ファミリーメンバーの順序および／または組成が異なる類似の構造の鎖と置換することができる。

本発明の連結ペプチドは種々の長さであり得る。１つの実施形態では、本発明の連結ペプチドは、約１５〜約５０アミノ酸長である。１つの実施形態では、本発明の連結ペプチドは、約２０〜約４５アミノ酸長である。別の実施形態では、本発明の連結ペプチドは、約２５〜約４０アミノ酸長である。別の実施形態では、本発明の連結ペプチドは、約３０〜約３５アミノ酸長である。別の実施形態では、本発明の連結ペプチドは、約２４〜約２７アミノ酸長である。別の実施形態では、本発明の連結ペプチドは、約４０〜約４２アミノ酸長である。

当該分野で公知の技術を使用して、連結ペプチドをポリペプチド配列に導入することができる。例えば、１つの実施形態では、重複伸長スプライシング（ＳｐｌｉｃｉｎｇｂｙＯｖｅｒｌａｐＥｘｔｅｎｓｉｏｎ）（ＳＯＥ）法（Ｈｏｒｔｏｎ，Ｒ．Ｍ．１９９３ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ１５：ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ：ＣｕｒｒｅｎｔＭｅｔｈｏｄｓａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｅｄ．Ｂ．Ａ．Ｗｈｉｔｅ）を使用することができる。ＤＮＡ配列分析によって修飾を確認することができる。ポリペプチド産生の安定な産生のために、プラスミドＤＮＡを使用して宿主細胞を形質転換することができる。

１つの実施形態では、ポリペプチドへの１つの本発明の連結ペプチドの取り込みによって、少なくとも２つのポリペプチド鎖が合成連結ペプチドを含み、５０％を超える分子は２つの重鎖部分が少なくとも１つの鎖間ジスルフィド結合を介して結合している形態で存在する、少なくとも２つの結合部位および少なくとも２つのポリペプチド鎖を有するポリペプチド分子を含む組成物が得られる。別の実施形態では、６０％を超える分子は２つの重鎖部分が少なくとも１つの鎖間ジスルフィド結合を介して結合している形態で存在する。別の実施形態では、７０％を超える分子は２つの重鎖部分が少なくとも１つの鎖間ジスルフィド結合を介して結合している形態で存在する。別の実施形態では、８０％を超える分子は２つの重鎖部分が少なくとも１つの鎖間ジスルフィド結合を介して結合している形態で存在する。別の実施形態では、９０％を超える分子は２つの重鎖部分が少なくとも１つの鎖間ジスルフィド結合を介して結合している形態で存在する。

１つの実施形態では、ＩｇＧ４分子への１つの本発明の連結ペプチドの取り込みによって、９５％を超える分子は２つの重鎖部分が少なくとも１つの鎖間ジスルフィド結合を介して結合している形態で存在する組成物が得られる。

（ＩＩＩ．結合分子）
本発明のポリペプチドは、目的の標的分子に結合する少なくとも２つの結合部位を含む。例示的結合部位には、例えば、抗原に結合する部位（抗原結合部位）、受容体に結合する部位（受容体結合部位）、またはリガンドに結合する部位（リガンド結合部位）が含まれる。１つの実施形態では、結合分子は少なくとも２つの結合部位を含む。１つの実施形態では、結合分子は２つの結合部位を含む。１つの実施形態では、結合分子は３つの結合部位を含む。別の実施形態では、結合分子は４つの結合部位を含む。

１つの実施形態では、結合分子は、生物学的作用を媒介する（例えば、細胞の活性化を調整し（例えば、細胞表面受容体への結合およびそれによる活性化シグナルまたは阻害シグナルの伝達または阻害による）、それによって細胞が死滅するか（例えば、補体結合または結合分子上に存在する負荷量への曝露による）、被験体の疾患または障害を調整する（例えば、フィブリン塊の溶解の促進もしくは血塊形成の促進または生物学的に利用可能な物質量の調整（例えば、被験体中のＴＮＦαなどのリガンドの量の増減による）による））分子に特異的な少なくとも１つの標的結合部位を有する。

１つの実施形態では、結合分子は、減少または消失のためにターゲティングされた分子（例えば、細胞表面抗原または可溶性抗原）に特異的な少なくとも１つの標的結合部位を有する。１つの実施形態では、標的への結合分子の結合によって、例えば、組織または循環由来の標的が減少または消失する。別の実施形態では、結合分子は、標的分子の存在を検出する（例えば、夾雑物を検出するか病態または障害を診断する）ために使用することができる分子に特異的な少なくとも１つの結合部位を有する。さらに別の実施形態では、本発明の結合分子は、結合分子を被験体中の特定の部位にターゲティングする少なくとも１つの結合部位を含む（例えば、腫瘍細胞または血塊）。

本発明の結合分子の結合ドメイン中に含むことができる例示的結合部位には、リガンドの受容体結合部分、受容体のリガンド結合部分、酵素の基質結合部分、基質の酵素結合部分、または抗体の１つまたは複数の抗原結合部分が含まれる。

１つの実施形態では、結合分子（例えば、抗体分子、二重特異性抗体、または修飾抗体）の少なくとも１つの標的結合部位は触媒性を示す（ＳｈｏｋａｔａｎｄＳｃｈｕｌｔｚ．１９９０．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：３３５）。

１つの実施形態では、結合分子の重鎖可変部分および軽鎖可変部分は、例えば、単鎖抗体またはミニボディと同一のポリペプチド中に存在する（例えば、米国特許第５，８３７，８２１号またはＷＯ９４／０９８１７Ａ１を参照のこと）。別の実施形態では、ポリペプチドの重鎖部分および軽鎖部分は、例えば、抗体分子と異なるポリペプチド鎖中に存在する。

本発明の標的結合ポリペプチドは、多量体分子である。１つの実施形態では、標的結合ポリペプチドは二量体である。１つの実施形態では、本発明の二量体は、２つの同一の単量体サブユニットを含むホモ二量体である。別の実施形態では、本発明の二量体は、２つの同一でない単量体サブユニットを含むヘテロ二量体である。二量体は、少なくとも２つのポリペプチド鎖を含む。１つの実施形態では、結合分子は２つのポリペプチド鎖を含む。別の実施形態では、結合分子は３つのポリペプチド鎖を含む。別の実施形態では、結合分子は４つのポリペプチド鎖を含む。

好ましい実施形態では、本発明の結合分子は、抗体（例えば、目的の標的に結合することが当該分野で公知の抗体）の少なくとも１つのＣＤＲを含む。別の実施形態では、本発明の結合分子は、少なくとも２つのＣＤＲを含む。別の実施形態では、本発明の結合分子は、少なくとも３つのＣＤＲを含む。別の実施形態では、本発明の結合分子は、少なくとも４つのＣＤＲを含む。別の実施形態では、本発明の結合分子は、少なくとも５つのＣＤＲを含む。別の実施形態では、本発明の結合分子は、少なくとも６つのＣＤＲを含む。好ましい実施形態では、本発明の結合分子は、抗体（例えば、目的の標的に結合することが当該分野で公知の抗体）の少なくとも１つのＶＨドメインを含む。好ましい実施形態では、本発明の結合分子は、少なくとも１つのＶＬドメインを含む。別の好ましい実施形態では、本発明の結合分子は、抗体の少なくとも１つのＶＨドメインおよび１つのＶＬドメインを含む。

１つの実施形態では、抗原結合部位は、例えば、ＶＬ鎖の非存在下で安定なラクダ科動物由来のＶＨドメインからなる（Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎｅｔａｌ．１９９３．Ｎａｔｕｒｅ３６３：４４６；Ｄｅｓｍｙｔｅｒｅｔａｌ．１９９６．Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３：８０３；Ｄｅｓｍｙｔｅｒ，Ａ．，１９９６．Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３：８０３；Ｄｅｃａｎｎｉｅｒｅ，Ｋ．，ｅｔａｌ．１９９９．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ７：３６１；Ｄａｖｉｅｓｅｔａｌ．１９９６．ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ．９：５３１；Ｋｏｒｔｔｅｔａｌ．１９９５．Ｊ．ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｅｍ．１４：１６７）。

（Ａ．融合タンパク質）
本発明はまた、１つまたは複数の免疫グロブリンドメインを含む結合分子に関する。本発明の融合タンパク質は、結合ドメイン（少なくとも１つの結合部位を含む）および二量体化ドメイン（少なくとも１つの重鎖部分を含む）を含む。本発明の融合タンパク質は二重特異性（第１の標的に対する１つの結合部位および第２の標的に対する第２の結合部位を含む）であり得るか、多特異性（同一標的に対する２つの結合部位を含む）であり得る。

文献で報告されている例示的な融合タンパク質には、Ｔ細胞受容体（Ｇａｓｃｏｉｇｎｅｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：２９３６−２９４０（１９８７））；ＣＤ４（Ｃａｐｏｎｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３３７：５２５−５３１（１９８９）；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３３９：６８−７０（１９８９）；Ｚｅｔｔｍｅｉｓｓｌｅｔａｌ．，ＤＮＡＣｅｌｌＢｉｏｌ．ＵＳＡ９：３４７−３５３（１９９０）；ａｎｄＢｙｒｎｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３４４：６６７−６７０（１９９０））；Ｌ−セレクチン（ホーミング受容体）（Ｗａｔｓｏｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１０：２２２１−２２２９（１９９０）；ａｎｄＷａｔｓｏｎｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３４９：１６４−１６７（１９９１））；ＣＤ４４（Ａｒｕｆｆｏｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ６１：１３０３−１３１３（１９９０））；ＣＤ２８およびＢ７（Ｌｉｎｓｌｅｙｅｔａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：７２１−７３０（１９９１））；ＣＴＬＡ−４（Ｌｉｓｌｅｙｅｔａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：５６１−５６９（１９９１））；ＣＤ２２（Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ６６：１１３３−１１４４（１９９１））；ＴＮＦ受容体（Ａｓｈｋｅｎａｚｉｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：１０５３５−１０５３９（１９９１）；Ｌｅｓｓｌａｕｅｒｅｔａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：２８８３−２８８６（１９９１）；ａｎｄＰｅｐｐｅｌｅｔａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：１４８３−１４８９（１９９１））；およびＩｇＥ受容体（ＲｉｄｇｗａｙａｎｄＧｏｒｍａｎ，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．Ｖｏｌ．１１５，ＡｂｓｔｒａｃｔＮｏ．１４４８（１９９１））の融合物が含まれる。

１つの実施形態では、融合タンパク質は、リガンドまたは受容体の結合ドメイン（例えば、受容体の細胞外ドメイン（ＥＣＤ））を少なくとも１つの重鎖ドメインおよび合成連結ペプチドと組み合わせる。１つの実施形態では、本発明の融合タンパク質を調製した場合、リガンドまたは受容体の結合ドメインをコードする核酸はＣ末端で免疫グロブリン定常ドメイン配列のＮ末端をコードする核酸と融合する。Ｎ末端融合物も可能である。１つの実施形態では、融合タンパク質には、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインが含まれる。定常ドメインのＦｃ部分のＣ末端または重鎖のＣＨ１または軽鎖の対応領域のＮ末端に直接融合することができる。

１つの実施形態では、リガンドまたは受容体ドメインの配列を、免疫グロブリン分子のＦｃドメインのＮ末端に融合する。全重鎖定常領域をリガンドまたは受容体ドメインの配列に融合することも可能である。１つの実施形態では、化学的にＩｇＧのＦｃと定義するパパイン切断部位（すなわち、重鎖定常領域の最初の残基を１１４とした場合の残基２１６）または他の免疫グロブリンの類似の部位の直ぐ上流のヒンジ領域から始まる配列を融合で使用する。融合される正確な部位は重要ではなく、特定の部位が周知であり、分子の生物活性、分泌、または結合特性を至適化するために選択することができる。融合タンパク質の作製方法は当該分野で公知である。

二重特異性融合タンパク質のために、融合タンパク質を多量体、特にヘテロ二量体またはヘテロ四量体としてアセンブリする。一般に、これらのアセンブリされた免疫グロブリンは公知の単位構造を有する。基本的な四鎖構造単位は、ＩｇＧ、ＩｇＤ、およびＩｇＥが存在する形態である。四鎖単位は、より高い分子量の免疫グロブリンで反復され、ＩｇＭは、一般に、４つの基本単位がジスルフィド結合によってつなぎ合わされた五量体として存在する。ＩｇＡグロブリン（時折ＩｇＧグロブリン）は、血清中で多量体形態でも存在し得る。多量体の場合、４つの各単位は同一であっても異なっていても良い。

本発明の融合タンパク質中に含めることができるさらなる例示的リガンドおよびその受容体には、以下が含まれる。

サイトカインおよびサイトカイン受容体。サイトカインは、リンパ球の増殖、分化、および機能的活性化に多面的効果を有する。種々のサイトカインまたはその受容体結合部分を、本発明の融合タンパク質で使用することができる。例示的サイトカインには、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、およびＩＬ−１８）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）（例えば、顆粒球ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）、および単球−マクロファージＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ））、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）αおよびβ、ならびにインターフェロンα、β、またはγなどのインターフェロン（米国特許第４，９２５，７９３号および同第４，９２９，５５４号）が含まれる。

サイトカイン受容体は、典型的には、リガンド特異的α鎖および共通のβ鎖からなる。例示的サイトカイン受容体には、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３（米国特許第５，６３９，６０５号）、ＩＬ−４（米国特許第５，５９９，９０５号）、ＩＬ−５（米国特許第５，４５３，４９１号）、ＩＦＮγ（ＥＰ０２４０９７５）、および受容体のＴＮＦファミリー（例えば、ＴＮＦα（例えば、ＴＮＦＲ−１（ＥＰ４１７，５６３）、ＴＮＦＲ−２（ＥＰ４１７，０１４）リンホトキシンβ受容体）の受容体が含まれる。

接着タンパク質。接着分子は、細胞を互いに相互作用させる膜結合タンパク質である。その受容体結合部分の種々の接着タンパク質（白血球ホーミング受容体および細胞接着分子が含まれる）を、本発明の融合タンパク質に組み込むことができる。白血球ホーミング受容体は、炎症時に白血球細胞表面で発現し、細胞外マトリクス成分への結合を媒介するβ−１インテグリン（例えば、ＶＬＡ−１、２、３、４、５、および６）および血管内皮上の細胞接着分子（ＣＡＭ）に結合するβ２−インテグリン（例えば、ＬＦＡ−１、ＬＰＡＭ−１、ＣＲ３、およびＣＲ４）が含まれる。例示的ＣＡＭには、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＶＣＡＭ−１、およびＭＡｄＣＡＭ−１が含まれる。他のＣＡＭには、セレクチンファミリー（Ｅ−セレクチン、Ｌ−セレクチン、およびＰ−セレクチンが含まれる）のセレクチンが含まれる。

ケモカイン。ケモカイン（感染部位への白血球の移動を刺激する走化性タンパク質）を、本発明の融合タンパク質に組み込むこともできる。例示的ケモカインには、マクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ−１−αおよびＭＩＰ−１−β）、好中球走化性因子、およびＲＡＮＴＥＳ（通常はＴ細胞を発現および分泌する活性化に対して調節される）が含まれる。

成長因子および成長因子受容体。成長因子またはその受容体（またはその受容体結合部分もしくはリガンド結合部分）を、本発明の融合タンパク質に組み込むことができる。例示的成長因子には、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）およびそのアイソタイプ（米国特許第５，１９４，５９６号；線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）（ａＦＧＦおよびｂＦＧＦが含まれる）；心房性ナトリウム利尿因子（ＡＮＦ）；肝臓成長因子（ＨＧＦ；米国特許第５，２２７，１５８号および同第６，０９９，８４１号）、神経栄養因子（骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、−４、−５、または−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、またはＮＴ−６）など）または神経成長因子（ＮＧＦ−β血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）（米国特許第４，８８９，９１９号、同第４，８４５，０７５号、同第５，９１０，５７４号、および同第５，８７７，０１６号）など）；形質転換成長因子（ＴＧＦ）（ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β（ＷＯ９０／１４３５９）、骨誘導因子（ｏｓｔｅｏｉｎｄｕｃｔｉｖｅｆａｃｔｏｒ）（形態形成タンパク質（ＢＭＰ）などが含まれる）；インスリン様成長因子ＩおよびＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ；米国特許第６，４０３，７６４号および同第６，５０６，８７４号）；エリスロポイエチン（ＥＰＯ）；幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポイエチン（ｃ−Ｍｐｌリガンド）、およびＷｎｔポリペプチド（米国特許第６，１５９，４６２）が含まれる。本発明のターゲティング受容体ドメインとして使用することができる例示的な成長因子受容体には、ＥＧＦ受容体；ＶＥＧＦ受容体（例えば、Ｆｌｔ１またはＦｌｋ１／ＫＤＲ）、ＰＤＧＦ受容体（ＷＯ９０／１４４２５）；ＨＧＦ受容体（米国特許第５，６４８，２７３号および同第５，６８６，２９２号）、およびＮＧＦ、ＢＤＮＦ、およびＮＴ−３に結合する神経栄養受容体（ｐ７５^ＮＴＲまたはｐ７５とも呼ばれる低親和性受容体（ＬＮＧＦＲ））、受容体チロシンキナーゼのｔｒｋファミリーのメンバーである高親和性受容体（例えば、ｔｒｋＡ、ｔｒｋＢ（欧州特許第４５５，４６０号）、ｔｒｋＣ（欧州特許第５２２，５３０号））が含まれる。

ホルモン。本発明の融合タンパク質におけるターゲティング因子として使用するための例示的成長ホルモンには、レニン、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ；米国特許第５，８３４，５９８号）、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン；ウシ成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）；甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）；チロキシン；プロインスリンおよびインスリン（米国特許第５，１５７，０２１号および同第６，５７６，６０８号）；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、カルシトニン、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、レプチン、グルカゴン；ボンベシン；ソマトロピン；ミューラー阻害物質；レラキシンおよびプロレラキシン；ゴナドトロピン関連ペプチド；プロラクチン；胎盤性ラクトゲン；ＯＢタンパク質；またはミューラー阻害物質が含まれる。

凝固因子。本発明の融合タンパク質におけるターゲティング因子として使用するための例示的血液凝固因子には、凝固因子（例えば、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第Ｘ因子、第ＩＸ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、および第ＸＩＩＩ因子、フォンウィルブランド因子）；組織因子（米国特許第５，３４６，９９１号、同第５，３４９，９９１号、同第５，７２６，１４７号、および同第６，５９６，８４号）；トロンビンおよびプロトロンビン；フィブリンおよびフィブリノゲン；プラスミンおよびプラスミノゲン；プラスミノゲンアクチベーター（ウロキナーゼまたはヒト尿または組織特異的プラスミノゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）など）が含まれる。

他の例示的融合タンパク質は、例えば、ＷＯ００６９９１３Ａ１およびＷＯ００４０６１５Ａ２に教示されている。本発明の融合タンパク質中に含めることができる別の例示的分子は、ＩＧＳＦ９である。

当該分野で周知の方法（例えば、米国特許第５，１１６，９６４号および同第５，２２５，５３８号を参照のこと）を使用して、融合タンパク質を調製することができる。通常、リガンドまたは受容体ドメインのＣ末端と可変領域の代わりの重鎖の定常領域（または重鎖の一部）のＮ末端とを融合する。リガンド結合受容体の任意の膜貫通領域または脂質もしくはリン脂質のアンカー認識配列を、融合前に不活化するか欠失することが好ましい。リガンドまたは受容体ドメインをコードするＤＮＡを、制限酵素によって所望のＯＲＦセグメントをコードするＤＮＡの５’末端および３’末端またはその近位で切断する。次いで、得られたＤＮＡフラグメントを、重鎖定常領域をコードするＤＮＡに容易に挿入する。可溶性融合タンパク質の分泌または結合特性を最適にするために、正確な融合部位を経験的に選択することができる。次いで、融合タンパク質をコードするＤＮＡを、発現用の宿主細胞にトランスフェクトする。

（Ｂ．抗体またはその一部）
１つの実施形態では、本発明の結合分子（例えば、抗原結合分子）は抗体分子である。認識されたプロトコールを使用して、例えば、関連抗原（例えば、精製腫瘍関連抗原またはこのような抗原を含む細胞もしくは細胞抽出物）およびアジュバントの複数回の皮下注射または腹腔内注射によって哺乳動物中に抗体を惹起することが好ましい。この免疫化により、典型的には、活性化脾臓細胞またはリンパ球由来の抗原反応性抗体の産生を含む免疫応答が誘発される。ポリクローナル調製物を得るために得られた抗体を動物の血清から回収することができる一方で、モノクローナル抗体（ＭＡｂ）の均一な調製物を得るために脾臓、リンパ節、または末梢血から個々のリンパ球を単離することがしばしば望ましい。好ましくは、脾臓からリンパ球を得る。

この周知のプロセス（Ｋｏｈｌｅｒｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５））では、抗原を注射した哺乳動物由来の比較的短命または死ぬべき運命のリンパ球を、不死の腫瘍細胞株（例えば、骨髄腫細胞株）と融合することによって、不死でありかつＢ細胞の遺伝的にコードされた抗体を産生することができるハイブリッド細胞または「ハイブリドーマ」が産生される。得られたハイブリッドを、選択、希釈、および単一の抗体の形成に特異的な遺伝子を含む各個別の株との再成長によって単一遺伝子株に分離する。これらは所望の抗原に対して均一な抗体を産生し、その純粋な遺伝的起源に関連して、「モノクローナル」と呼ばれる。

したがって、このようにして調製したハイブリドーマ細胞を、好ましくは融合していない親骨髄腫細胞の成長または生存を阻害する１つまたは複数の物質を含む適切な培養培地に播種して成長させる。当業者は、ハイブリドーマの形成、選択、および成長のための試薬、細胞株、および培地は多数の供給元から市販されており、標準化されたプロトコールが十分に確立されていることを認識する。一般に、ハイブリドーマ細胞が成長する培養培地を、所望の抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナル抗体の結合特異性を、免疫沈降またはｉｎｖｉｔｒｏアッセイ（放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）など）によって決定する。所望の特異性、親和性、および／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定した後、限界希釈手順によってクローンをサブクローン化し、標準的方法で成長させることができる（Ｇｏｄｉｎｇ，ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ５９−１０３（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，１９８６））。サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体を、従来の精製手順（例えば、プロテインＡ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティクロマトグラフィなど）によって培養培地、腹水、または血清から分離することができることがさらに認識される。

別の実施形態では、所望のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡを、従来の手順（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブの使用）を使用して容易に単離し、配列決定することができる。単離およびサブクローン化したハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。一旦単離されると、ＤＮＡを発現ベクターに配置し、その後他に免疫グロブリンを産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞などの原核または真核宿主細胞にトランスフェクトすることができる。より詳細には、単離ＤＮＡ（本明細書中に記載のように修飾することができる）を使用して、１９９５年１月２５日提出のＮｅｗｍａｎｅｔａｌ．の米国特許第５，６５８，５７０号（本明細書中で参考として援用される）に記載のように抗体製造のために定常領域配列および可変領域配列をクローン化することができる。本質的に、これは、選択された細胞からのＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡへの変換、およびＩｇ特異的プライマーを使用したＰＣＲによる増幅が必要である。この目的に適切なプライマーも米国特許第５，６５８，５７０号に記載されている。以下により詳細に考察するように、所望の抗体を発現する形質転換細胞を、免疫グロブリンを臨床的および商業的に供給するために比較的大量に成長させることができる。

当業者は、例えば、ｐｄファージまたはＦｄファージミドテクノロジーを使用して、抗体または抗体フラグメントをコードするＤＮＡも抗体ファージライブラリーに由来し得ることも認識する。例示的方法は、例えば、欧州特許第３６８６８４Ｂ１号；米国特許第５，９６９，１０８号、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．ａｎｄＣｈａｍｅｓ．２０００．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ２１：３７１；Ｎａｇｙｅｔａｌ．２００２．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：８０１；Ｈｕｉｅｅｔａｌ．２００１．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９８：２６８２；Ｌｕｉｅｔａｌ．２００２．Ｊ：Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１５：１０６３（それぞれ本明細書中で参考として援用される）に記載されている。いくつかの刊行物（例えば、Ｍａｒｋｓｅｔａｌ．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０：７７９−７８３（１９９２））は、鎖シャフリングならびに巨大ファージライブラリーの構築のためのストラテジーとしての組み合わせ感染およびｉｎｖｉｖｏ組換えによる高親和性ヒト抗体の産生を記載している。別の実施形態では、ディスプレプラットフォームとしてリボゾームディスプレイを使用して、バクテリオファージを置換することができる（例えば、Ｈａｎｅｓｅｔａｌ．２０００．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：１２８７；Ｗｉｌｓｏｎｅｔａｌ．２００１．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９８：３７５０；またはＩｒｖｉｎｇｅｔａｌ．２００１Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２４８：３１を参照のこと）。さらに別の実施形態では、抗体について細胞表面ライブラリーをスクリーニングすることができる（Ｂｏｄｅｒｅｔａｌ．２０００．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９７：１０７０１；Ｄａｕｇｈｅｒｔｙｅｔａｌ．２０００Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２４３：２１１）。このような手順は、モノクローナル抗体の単離およびその後のクローニングのための従来のハイブリドーマ技術の代替法を提供する。

本発明のさらに他の実施形態は、内因性免疫グロブリンを産生することができないトランスジェニック動物（例えば、マウス）中でのヒト抗体または実質的なヒト抗体の産生を含む（例えば、米国特許第６，０７５，１８１号、同第５，９３９，５９８号、同第５，５９１，６６９号、および同第５，５８９，３６９号（それぞれ本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。例えば、キメラおよび生殖系列変異マウス中の抗体重鎖結合領域のホモ接合性欠失によって内因性抗体産生が完全に阻害されることが記載されている。このような生殖系列変異マウスへのヒト免疫グロブリン遺伝子アレイの導入により、抗原の抗原誘発時にヒト抗体が産生される。ＳＣＩＤマウスを使用した別の好ましいヒト抗体の作製手段は、米国特許第５，８１１，５２４号（本明細書中で参考として援用される）に開示されている。これらのヒト抗体に関連する遺伝物質を本明細書中に記載のように単離および操作することもできることが認識される。

組換え抗体のさらに別の極めて有効な産生手段は、Ｎｅｗｍａｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：１４５５−１４６０（１９９２）に開示されている。詳細には、この技術により、サル可変ドメインおよびヒト定常配列を含む霊長類化抗体が作製される。この参考文献は、その全体が本明細書中で参考として援用される。さらに、この技術は、同一出願人による米国特許第５，６５８，５７０号、同第５，６９３，７８０号、および同第５，７５６，０９６号（本明細書中で参考として援用される）にも記載されている。

別の実施形態では、顕微操作によってリンパ球を選択し、種々の遺伝子を単離することができる。例えば、免役化哺乳動物から末梢血単核細胞を単離し、ｉｎｖｉｔｒｏで約７日間培養することができる。培養物を、スクリーニング基準を満たす特異的ＩｇＧについてスクリーニングすることができる。正のウェル由来の細胞を単離することができる。個々のＩｇ産生Ｂ細胞をＦＡＣＳまたは補体媒介性溶血プラークアッセイにおけるこれらの同定によって単離することができる。Ｉｇ産生Ｂ細胞を試験管中で顕微操作し、例えば、ＲＴ−ＰＣＲを使用してＶｈおよびＶｌ遺伝子を増幅することができる。ＶＨおよびＶＬ遺伝子を抗体発現ベクターにクローン化し、発現用の細胞（例えば、真核細胞または原核細胞）にトランスフェクトすることができる。

さらに、本発明のポリペプチドの産生に有用な遺伝子配列を、多数の異なる供給源から得ることができる。例えば、上記で詳細に考察しているように、種々のヒト抗体遺伝子を公的に利用可能な寄託物の形態で利用可能である。抗体および抗体コード遺伝子の多数の配列は公開されており、適切な抗体遺伝子を、当該分野で認識されている技術を使用してこれらの配列から化学合成することができる。本発明のこの態様に適合するオリゴヌクレオチド合成技術が当業者に周知であり、任意のいくつかの市販されている自動化合成機を使用して行うことができる。さらに、本明細書中に記載のいくつかの重鎖および軽鎖型をコードするＤＮＡ配列を、ＤＮＡ合成ベンダーによる市販のサービスを介して得ることができる。次いで、任意の上記方法を使用して得た遺伝物質を、本発明のポリペプチドが得られるように変化または修飾することができる。

あるいは、当業者に周知の技術を使用して抗体産生細胞株を選択し、培養することができる。このような技術は、種々の実験マニュアルおよび主な刊行物に記載されている。これに関して、下記の本発明での使用に適切な技術は、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｉｇａｎｅｔａｌ．，Ｅｄｓ．，ＧｒｅｅｎＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＡｓｓｏｃｉａｔｅｓａｎｄＷｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９１）（補遺を含む）（その全体が本明細書中で参考として援用される）に記載されている。

本発明の範囲には抗原結合ＤＮＡ配列の全ての対立遺伝子、変異型、および変異をさらに含むことがさらに認識される。

周知のように、グアニジニウムイソチオシアネート抽出および沈殿ならびにその後の遠心分離またはクロマトグラフィなどの標準的技術によって、元のハイブリドーマ細胞または他の形質転換細胞からＲＮＡを単離することができる。望ましい場合、オリゴｄＴセルロースによるクロマトグラフィなどの標準的技術によって総ＲＮＡからｍＲＮＡを単離することができる。適切な技術は当該分野で周知である。

可変領域ドメインおよび定常領域ドメインを任意の供給源から得ることができ、本発明の修飾抗体に組み込むことができる。抗体をクローン化するために、ハイブリドーマ、脾臓細胞、またはリンパ球からｍＲＮＡを単離し、ＤＮＡに逆転写し、抗体遺伝子をＰＣＲによって増幅することができる。公開された重鎖および軽鎖のＤＮＡおよびアミノ酸配列に基づいたコンセンサス定常領域プライマーまたはより特異的なプライマーによってＰＣＲを開始することができる。上記で考察されるように、ＰＣＲを使用して、抗体の軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡクローンを単離することもできる。この場合、コンセンサスプライマーまたはマウス定常領域プローブなどのより大きな相同プローブによってライブラリーをスクリーニングすることができる。抗体遺伝子の増幅に適切な多数のプライマー組が当該分野で公知である（例えば、精製抗体のＮ末端配列（ＢｅｎｈａｒａｎｄＰａｓｔａｎ．１９９４．ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ７：１５０９）；ｃＤＮＡ末端の迅速な増幅（Ｒｕｂｅｒｔｉ，Ｆ．ｅｔａｌ．１９９４．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ１７３：３３）；抗体リーダー配列（Ｌａｒｒｉｃｋｅｔａｌ．１９８９Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１６０：１２５０）に基づくか、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔｅｔａｌ．１９９１．ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ．Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ：ＪＳＤｅｐ．ＨｅａｌｔｈＨｕｍ．Ｓｅｒｖ．５ｔｈｅｄ．）またはＶ−ｂａｓｅデータベース（例えば、Ｏｒｌａｎｄｉｅｔａｌ．１９８９．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：３８３３；Ｓｂｌａｔｔｅｒｏｅｔａｌ．１９９８．Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ３：２７１；またはＫｒｅｂｂｅｒｅｔａｌ．１９９７．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２０１：３５）由来の公知の可変領域フレームワークアミノ酸配列に基づいた５’プライマー）。特定のエフェクター機能を有するか（または特定のエフェクター機能を欠く）、免疫原性を減少するための特定の修飾を有する定常領域ドメインを選択することができる。可変ドメインおよび定常ドメインを、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応および目的のドメインを増幅するために選択したプライマーを使用してクローン化することができる。ＰＣＲ増幅法は、米国特許第４，６８３，１９５号；同第４，６８３，２０２号；同第４，８００，１５９号；同第４，９６５，１８８号；および、例えば、"ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ：ＡＧｕｉｄｅｔｏＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ"Ｉｎｎｉｓｅｔａｌ．ｅｄｓ．，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）；Ｈｏｅｔａｌ．１９８９．Ｇｅｎｅ７７：５１；Ｈｏｒｔｏｎｅｔａｌ．１９９３．ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．２１７：２７０）に記載されている。

あるいは、最適な動物由来のＶ遺伝子配列のライブラリーからＶドメインを得ることができる。所望の結合特性を有するエレメントを同定するために、ドメイン（例えば、ＶＨドメインおよびＶＬドメイン）のランダムな組み合わせを発現するライブラリーを、所望の抗原を使用してスクリーニングすることができる。このようなスクリーニング方法は当該分野で周知である。例えば、抗体遺伝子レパートリーを、λバクテリオファージ発現ベクターにクローン化することができる（Ｈｕｓｅ，ＷＤｅｔａｌ．１９８９．Ｓｃｉｅｎｃｅ２４７６：１２７５）。さらに、その表面上で抗体を発現する細胞（ＢｏｄｅｒａｎｄＷｉｔｔｒｕｐ．１９９７．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：５５３；Ｄａｕｇｔｈｅｒｔｙ，Ｐ．ｅｔａｌ．２０００．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．２４３：２１１；Ｆｒａｎｃｉｓｃｏｅｔａｌ．１９９４．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：１０４４４；Ｇｅｏｒｇｉｏｕｅｔａｌ．１９９７．ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１５：２９）またはウイルス（例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，ＨＲ．１９９８Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ４：１Ｗｉｎｔｅｒｅｔａｌ．１９９４．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ＡＤ．１９９８．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９：１０２）をスクリーニングすることができる。リボゾームディスプレイを使用して、抗体ライブラリーをスクリーニングすることもできる（ＨａｎｅｓＪ．，ｅｔａｌ．１９９８．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：１４１３０；Ｈａｎｅｓ，Ｊ．ａｎｄＰｌｕｃｋｔｈｕｎ．１９９９．Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４３：１０７；Ｈｅ，Ｍ．ａｎｄＴａｕｓｓｉｇ．１９９７．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ２５：５１３２）。

好ましいスクリーニング用ライブラリーは、ヒトＶ遺伝子ライブラリーである。非ヒト供給源由来のＶＬドメインおよびＶＨドメインも使用することができる。１つの実施形態では、このような非ヒトＶドメインを、認識された技術を使用して、その免疫原性を減少するように変更することができる。

ライブラリーは、ナイーブであっても免疫化被験体由来であっても半合成であってもよい（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．ａｎｄＷｉｎｔｅｒ．１９９２．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ＡＤ，ｅｔａｌ．ＥＭＢＯＪ．１３：３２４５；ｄｅＫｒｕｉｆ，Ｊ．ｅｔａｌ．１９９５．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４８：９７；Ｂａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．，ｅｔａｌ．１９９２．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：４４５７）。

さらに、多数の抗体ＶドメインおよびＣドメインの配列が公知であり、当該分野で周知の方法を使用してこのようなドメインを合成することができる。

１つの実施形態では、より高い異質性を有する核酸分子のライブラリーを作製するために、免疫グロブリンドメインを変異させることができる（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．，ｅｔａｌ．１９９６．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５６：７７；Ｌａｍｍｉｎｍａｋｉ，Ｕ．ｅｔａｌ．１９９９．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９１：５８９；Ｃａｌｄｗｅｌｌ，Ｒ．Ｃ．ａｎｄＪｏｙｃｅＧＦ．１９９２．ＰＣＲＭｅｔｈｏｄｓＡｐｐｌ．２：２８；ＣａｌｄｗｅｌｌＲＣａｎｄＪｏｙｃｅＧＦ．１９９４．ＰＣＲＭｅｔｈｏｄｓＡｐｐｌ．３：Ｓ１３６）。標準的なスクリーニング手順を使用して、高親和性変異型を選択することができる。別の実施形態では、抗体結合活性を増大するために、例えば当該分野で公知の技術を使用して結晶構造から得た情報を使用して、ＶＨ配列およびＶＬ配列を変化させることができる。

（Ｃ．修飾抗体）
例示的構築物には、例えば、ミニボディ、二重特異性抗体、ＣＨ３分子と融合した二重特異性抗体、四価抗体、イントラ二重特異性抗体（ｉｎｔｒａｄｉａｂｏｄｙ）（Ｊｅｎｄｒｅｙｋｏｅｔａｌ．２００３．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：４７８１３）、二重特異性抗体、融合タンパク質（例えば、抗体サイトカイン融合タンパク質、Ｆｃ受容体の少なくとも一部と融合したタンパク質）、二重特異性抗体が含まれる。他の免疫グロブリン（Ｉｇ）およびその一定の変異型は、例えば、米国特許第４，７４５，０５５号；欧州特許第２５６，６５４号；Ｆａｕｌｋｎｅｒｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ２９８：２８６（１９８２）；欧州特許第１２０，６９４号；欧州特許第１２５，０２３号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１２３：７９３（１９７９）；Ｋｏｈｌｅｒｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：２１９７（１９８０）；Ｒａｓｏｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．４１：２０７３（１９８１）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎｅｔａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：２３９（１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２２９：１２０２（１９８５）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：６８５１（１９８４）；欧州特許第２５５，６９４；欧州特許第２６６，６６３；およびＷＯ８８／０３５５９に記載されている。再集合免疫グロブリン鎖も公知である。例えば、米国特許第４，４４４，８７８号；ＷＯ８８／０３５６５；ならびに欧州特許第６８，７６３号およびその引用文献を参照のこと。

１つの実施形態では、本発明のポリペプチドは、少なくとも１つのアミノ酸が欠失または置換された免疫グロブリン重鎖を含む。例えば、ＣＨ２ドメインの選択領域中の１つまたは複数の１アミノ酸の変異でＦｃ結合を実質的に減少させ、それによって腫瘍局在化を増加させるのに十分であり得る。同様に、調整されるべきエフェクター機能（例えば、補体結合）を調節する１つまたは複数の定常領域ドメインの一部を単純に欠失することが望ましい。定常領域のこのような部分的欠失は、抗体の選択された特徴（血清半減期）を改良することができる一方で、本発明の定常領域ドメインに関連する他の望ましい機能はインタクトなままである。したがって、１つの実施形態では、本発明の結合分子は、全てまたは一部のＣＨ２ドメインを欠く。さらに、上記で暗示しているように、開示の抗体の定常領域を、１つまたは複数のアミノ酸の変異または置換によって修飾して得られた構築物のプロフィールを増強することができる。これに関して、保存結合部位（例えば、Ｆｃ結合）によって得られた活性を破壊する一方で、修飾抗体の形状および免疫原性プロフィールを実質的に保持することが可能であり得る。さらに他の好ましい実施形態は、エフェクター機能などの所望の特徴を増強するか、よりさらなる細胞毒素または炭水化物を結合するための定常領域への１つまたは複数のアミノ酸の付加を含み得る。このような実施形態では、選択された定常領域ドメイン由来の特定の配列を挿入または複製することが望ましい。

別の実施形態では、天然に存在するヒンジ領域を変異することができる。本発明による定常領域のこのような修飾を、十分に当業者の範囲内である周知の生化学的または分子の操作技術を使用して容易に行うことができる。

１つの実施形態では、本発明のポリペプチドは、１つまたは複数のドメインの一部または全部が欠失した修飾定常領域（「ドメイン欠失抗体」）を含む。特に好ましい実施形態では、適合可能な修飾抗体は、全ＣＨ２ドメインが除去されたドメイン除去構築物または変異型を含む。種々の修飾抗体構築物を、以下により詳細に記載する。

（ｉ．ミニボディ）
１つの実施形態では、本発明の修飾抗体はミニボディである。ミニボディは、それぞれがＳｃＦｖ分子を含む２つのポリペプチド鎖（１つまたは複数の抗原結合部位を含む単一ポリペプチド（例えば、可撓性リンカーによってＶＨドメイン（これは、連結ペプチドを介してＣＨ３ドメインと融合している）に結合したＶＬドメイン））から構成された二量体分子である。例示的ミニボディ構築物を、図２に示す。図２では、ＣＨ３ドメインがそのＮ末端で連結ペプチドと融合し、連結ペプチドがそのＮ末端でＶＨドメインと融合し、ＶＨドメインがそのＮ末端を介して可撓性リンカーと融合し、可撓性リンカーがそのＮ末端でＶＬドメインと融合している。

ＶＨ−リンカー−ＶＬ方向またはＶＬ−リンカー−ＶＨ方向でＳｃＦｖ分子を構築することができる。

抗原結合部位を構成するＶＬドメインおよびＶＨドメインが結合した可撓性ヒンジは、約１０〜約５０個のアミノ酸残基を含むことが好ましい。この目的のための例示的連結ペプチドは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号３５）（Ｈｕｓｔｏｎｅｔａｌ．．１９８８．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５８７９）である。他の連結ペプチドが当該分野で公知である。

単鎖抗体の作製方法は当該分野で周知である（例えば、Ｈｏｅｔａｌ．１９８９．Ｇｅｎｅ７７：５１；Ｂｉｒｄｅｔａｌ．１９８８Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３；Ｐａｎｔｏｌｉａｎｏｅｔａｌ．１９９１．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３０：１０１１７；Ｍｉｌｅｎｉｃｅｔａｌ．１９９１．ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ５１：６３６３；Ｔａｋｋｉｎｅｎｅｔａｌ．１９９１．ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ４：８３７）。

当該分野で公知の方法を使用したＳｃＦｖ成分および連結ペプチド−ＣＨ３成分の構築によってミニボディを作製することができる（例えば、米国特許第５，８３７，８２１号またはＷＯ９４／０９８１７Ａ１号を参照のこと）。これらの成分を制限フラグメントとして個別のプラスミドから単離し、ライゲーションし、適切なベクターに再クローン化することができる。制限消化およびＤＮＡ配列分析によって、適切なアセンブリを検証することができる。

１つの実施形態では、本発明のミニボディは、連結ペプチドを含む。１つの実施形態では、連結ペプチドは、ｇｌｙ／ｓｅｒリンカー（例えば、ＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧＧ（配列番号１））を含む。

別の実施形態では、四価ミニボディを構築することができる。例えば、アミノ酸配列（Ｇ４Ｓ）_４Ｇ３ＡＳ（配列番号３６）を有する可撓性リンカーを使用して２つのＳｃＦｖ分子を結合すること以外はミニボディと類似の様式で四価ミニボディを構築することができる。例示的四価ミニボディを、図２に例示する。

（ｉｉ．ドメイン欠失抗体）
別の実施形態では、本発明の修飾抗体は、ＣＨ２ドメイン欠失抗体である。ドメイン欠失構築物は、ＩｇＧ_１ヒト定常ドメインをコードするベクター（例えば、ＩＤＥＣＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ）に由来し得る（例えば、ＷＯ０２／０６０９５５Ａ２号およびＷＯ０２／０９６９４８Ａ２号を参照のこと）。本質的に、ＣＨ２ドメインを欠失してドメイン欠失ＩｇＧ_１定常領域を発現する修飾ベクターが得られるようにベクターを操作した。次に、Ｃ２Ｂ８抗体、５Ｅ８抗体、Ｂ３Ｆ６抗体のマウス可変領域またはヒト化ＣＣ４９抗体の可変領域をコードする遺伝子を、修飾ベクターに挿入し、クローン化した。形質転換細胞中で発現する場合、これらのベクターにより、それぞれＣ２Ｂ８．ΔＣＨ２、５Ｅ８．ΔＣＨ２、Ｂ３Ｆ６．ΔＣＨ２、またはｈｕＣＣ４９．ΔＣＨ２が得られた。これらの構築物は、特に単量体サブユニットに魅力的な候補にする多数の特性を示す。

全定常領域ドメインの欠失に加えて、本発明の抗体を部分的に欠失するか数個のアミノ酸または１つのアミノ酸を置換するように操作することができることが認識される。例えば、Ｃ_Ｈ２ドメインの選択された領域中での１アミノ酸の変異で、Ｆｃ結合を実質的に減少させ、それによって腫瘍局在化を増加させるのに十分であり得る。同様に、エフェクター機能（例えば、補体Ｃ１Ｑ結合）を調節する１つまたは複数の定常領域ドメインの一部を単純に欠失することが望ましい。定常領域のこのような部分的欠失は、抗体の選択された特徴（血清半減期）を改良することができる一方で、本発明の定常領域ドメインに関連する他の望ましい機能はインタクトなままである。重複ＰＣＲ変異誘発によって、Ｃ_Ｈ２ドメイン欠失異形（ｖｅｒｓｉｏｎ）を作製することができる。γ１定常ドメインは、免疫グロブリン配列を含む翻訳読み枠中のプラスミドにコードされたＮｈｅＩ部位から始まる。ＮｈｅＩ部位および直ぐ下流の配列をコードする５’ＰＣＲプライマーを構築した。３’末端で免疫グロブリンヒンジ領域とアニーリングし、γ１ＣＨ３ドメインの最初の数個のアミノ酸をインフレームでコードする対の３’ＰＣＲプライマーを構築した。第２のＰＣＲプライマー対は、５’プライマーとしての第１の対（上記）由来の３’ＰＣＲプライマーの逆方向相補物およびＣ_Ｈ３ドメイン内のＢｓｒＧＩ制限部位に及ぶ遺伝子座でアニーリングする３’プライマーからなる。各ＰＣＲ増幅後、得られた産物を、それぞれＮｈｅＩおよびＢｓｒＧＩの５’および３’プライマーと共にテンプレートとして使用した。次いで、増幅産物をＮ５ＫＧ１に逆クローニングしてプラスミドＮ５ＫＧ１ΔＣ_Ｈ２を作製した。この構築は、インタクトなヒンジ領域のすぐ下流かつインフレームでインタクトなＣＨ３ドメインを配置する。類似の手順を使用して、ＣＨ３ドメインが連結ペプチドの直ぐ下流に存在するドメイン欠失構築物を作製することができる。例えば、米国特許第５，６４８，２６７号および同第５，７３６，１３７号（それぞれ本明細書中で参考として援用される）に記載のように、Ｃ２Ｂ８抗体のドメイン欠失異形をこの様式で作製した。

１つの実施形態では、四価ドメイン欠失抗体を、ドメイン欠失抗体をコードするＤＮＡ配列とＳｃＦｖ分子との組み合わせによって産生することができる。例えば、１つの実施形態では、ＳｃＦｖ分子をそのＮ末端で可撓性リンカー（例えば、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）_３（配列番号３５）などのｇｌｙ／ｓｅｒリンカー）を介してドメイン欠失抗体のＣＨ３ドメインと結合するようにこれらの配列を組み合わせる。

別の実施形態では、ＳｃＦｖ−Ｆａｂ四価分子を構築するためのＳｃＦｖ分子とＣＨ１ドメインと融合した連結ペプチドとの融合によって四価抗体を作製することができる（ＣｏｌｏｍａａｎｄＭｏｒｒｉｓｏｎ．１９９７．ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１５：１５９；ＷＯ９５／０９９１７）。

（ｉｉｉ．二重特異性抗体）
二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）は、ｓｃＦｖ分子と類似しているが、通常、両Ｖドメインと連結した短い（１０個未満、好ましくは１〜５個）アミノ酸残基リンカーを有しており、その結果、同一ポリペプチド鎖上のＶＬドメインとＶＨドメインとが相互作用することができない。その代わりに、１つのポリペプチド鎖のＶＬドメインおよびＶＨドメインは、第２のポリペプチド鎖上のＶＨドメインおよびＶＬドメインと（それぞれ）相互作用する（ＷＯ０２／０２７８１号）。１つの実施形態では、本発明の結合分子は、少なくとも１つの重鎖部分と融合した二重特異性抗体である。好ましい実施形態では、本発明の結合分子は、ＣＨ３ドメインと融合した二重特異性抗体である。

１つの実施形態では、本発明の修飾抗体（結合分子）は、軽鎖のＮ末端に付加されたｓｃＦｖを有する四価または二重特異性四価ＣＨ２ドメイン欠失抗体を含む。本発明の別の実施形態では、結合分子は、重鎖のＮ末端に付加されたｓｃＦｖを有する四価または二重特異性四価ＣＨ２ドメイン欠失抗体を含む。１つの実施形態では、Ｎ末端へのｓｃＦｖの結合により、カルボキシ末端にｓｃＦｖが結合した分子と比較して分子の凝集が減少する。１つの実施形態では、Ｎ末端融合構築物を発現する細胞によって産生された結合分子の組成物中に約３０％未満の凝集体が存在する。１つの実施形態では、Ｎ末端融合構築物を発現する細胞によって産生された結合分子の組成物中に約２０％未満の凝集体が存在する。１つの実施形態では、Ｎ末端融合構築物を発現する細胞によって産生された結合分子の組成物中に約１０％未満の凝集体が存在する。１つの実施形態では、Ｎ末端融合構築物を発現する細胞によって産生された結合分子の組成物中に約５％未満の凝集体が存在する。

修飾抗体の別の形態も本発明の範囲内である（例えば、ＷＯ０２／０２７８１Ａ１；５，９５９，０８３；６，４７６，１９８Ｂ１；ＵＳ２００２／０１０３３４５Ａ１；ＷＯ００／０６６０５；Ｂｙｒｎｅｔａｌ．１９９０．Ｎａｔｕｒｅ．３４４：６６７−７０；ＣｈａｍｏｗａｎｄＡｓｈｋｅｎａｚｉ．１９９６．ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：５２）。

（Ｄ．触媒抗体）
１つの実施形態では、本発明の修飾抗体分子の少なくとも１つの結合特異性は触媒性である。当該分野で認識された技術を使用して、触媒結合特異性を得ることができる（例えば、米国特許第６，５９０，０８０号および同第５，６５８，７５３号を参照のこと）。触媒結合特異性は、遷移状態を安定化し、それによって活性化の自由エネルギーを減少させるための酵素で同定された機構と類似の多数の基本機構によって作用することができる。例えば、触媒活性部位内の触媒作用に関連する一般的な酸性および塩基性残基を任意選択的に配置することができ；共有結合性酵素−基質中間体を形成することができ；触媒抗体をまた反応に適切な方向に配置して反応物質の有効濃度を少なくとも７オーダーの規模で増加させ（Ｆｅｒｓｈｔ，Ａ．Ｒ．，ｅｔａｌ．，Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９０（１９６８）：５８３３）、それによって化学反応のエントロピーを大幅に減少させることができる。最後に、触媒抗体は、基質結合時に得られるエネルギーを変換して、遷移状態に類似する構造へと反応を変化させることができる。

１つの実施形態では、免疫原として相補的荷電分子を使用することによって酸性または塩基性の残基を結合部位に配置することができる。この技術は、正電荷のアンモニウムイオンを含むハプテンを使用して首尾よく抗体を誘発することが証明されている（Ｓｈｏｋａｔ，ｅｔａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．２７（１９８８）：２６９−２７１）。

別のアプローチでは、所望の反応物のサイズ、形状、および遷移状態の電荷に類似する安定な化合物（すなわち、遷移状態アナログ）に対して抗体を誘発することができる。例えば、動物を免疫化するための遷移状態アナログの使用および触媒抗体の産生を記載した米国特許第４，７９２，４４６号および同第４，９６３，３５５号を参照のこと。これらの両特許は、本明細書中で参考として援用される。１つの実施形態では、このような分子を、（例えば、ＫＬＨなどの免疫原性キャリア分子を含む）免疫結合体（ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）の一部として投与することができる。

例示的な触媒結合特異性は、例えば、エステラーゼ活性（その静電気的特性および形状の特性をホスホネートの構造によって模倣することができる荷電遷移状態を含む；Ｊａｃｏｂｓ，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０９（１９８７）：２１７４−２１７６；Ｄｕｒｆｏｒ，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０（１９８８）：８７１３−８７１４；Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０（１９８８）：２２８２；Ｐｏｌｌａｃｋ，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１（１９８９）：５９６１−５９６２）；ペプチダーゼ活性またはアミダーゼ活性（Ｊａｎｄａ，ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４１（１９８８）：１１８８−１１９１；Ｉｖｅｒｓｏｎ，ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４３（１９８９）：１１８４−１１８８；Ｐａｕｌ，ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４４（１９８９）：１１５８−１１６２）；クライゼン転位（Ｊａｃｋｓｏｎ，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０（１９８８）：４８４１−４８４２；Ｈｉｌｖｅｒｔ，ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５（１９８８）：４９５３−４９５５；Ｈｉｌｖｅｒｔ，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０（１９８８）：５５９３−５５９４）；酸化還元反応（Ｓｈｏｋａｔ，ｅｔａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．２７（１９８９）：２６９−２７１）；チミン二量体の光化学的切断（Ｃｏｃｈｒａｎ，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０（１９８８）：７８８８−７８９０）；立体特異的エステル交換反応転位（ｓｔｅｒｅｏｓｐｅｃｉｆｉｃｔｒａｎｓｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔｓ）（Ｎａｐｐｅｒ，ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３７（１９８７）：１０４１−１０４３）；または二分子アミド合成（Ｂｅｎｋｏｖｉｃ，ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５（１９８８）：５３５５−５３５８；Ｊａｎｄａ，ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４１（１９８８）：１１８８−１１９１）を有し得る。

別のアプローチでは、従来の結合特異性を、触媒性にするように変異させることができる。

触媒抗体活性のスクリーニング方法は、当該分野で周知である（例えば、Ｒｅｙｍｏｎｄ，Ｊ．Ｌ．２００２．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ２６９：１２５；Ｍｏｕｒａｔｏｕｅｔａｌ．２００２．Ｊ．ｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ．２６９：１４７）。さらに別の実施形態では、例えば、米国特許第６，５９０，０８０号に記載のように、触媒性Ｂ細胞の選択を容易にするように構築され得る分子を使用して触媒性Ｂ細胞を選択することができる。

別の実施形態では、２工程プロセスの一部として触媒結合特異性を開発することができる。以下の結合特性を示した場合に限り、触媒抗体を選択することができる：２つの基が相互の反応位置に存在するような方法での基質と反応基の両方の結合。第２に、選択された抗体を、抗体の結合ポケットへの反応基の共有結合によって化学的に操作することができる。ＪＩｍｍｕｎｏｌＭｅｔｈｏｄｓ．２００２．２６９：８１−９８。

１つの実施形態では、触媒性結合特異性はプロドラッグに特異的である。このような結合特異性を使用して、プロドラッグのｉｎｖｉｖｏで有効な薬物への変換を触媒することができる。好ましくは、触媒された反応は、ｉｎｖｉｖｏで天然の酵素によって達成することができない反応である。抗体によるプロドラッグ活性化の例は、当該分野で公知である（例えば、Ｍｉｙａｓｈｉｔａｅｔａｌ．１９９３．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：５３３７を参照のこと）。

１つの実施形態では、本発明の修飾抗体分子は、標的細胞のための少なくとも１つの結合特異性およびプロドラッグのための少なくとも１つの結合特異性を含む。例えば、好ましい実施形態では、本発明の修飾抗体分子は、腫瘍細胞のための少なくとも１つの結合特異性および細胞毒性薬に変換することができるプロドラッグのための少なくとも１つの結合特異性を含む。１つの例では、本発明の修飾抗体は、カルバメートプロドラッグである４−［Ｎ，Ｎ−ビス（２−クロロエチル）］アミノフェニル−Ｎ−［（１Ｓ−（１，３−ジカルボキシ）プロピル］カルバメートのための結合特異性を含み、対応する細胞毒性ナイトロジェンマスタードを作製する（Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈｅｔａｌ．１９９６．ＰｒｏｃＮａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９３：７９９）。

１つの実施形態では、標的細胞部位で蓄積させるために、修飾抗体をプロドラッグの投与前に投与する。例示的なプロドラッグは当該分野で公知である。触媒作用（例えば、アルドラーゼ活性を有する抗体によって触媒された連続的レトロ−アルドール／レトロ−ミハエル反応）によって放出されるようにデザインした部分の組み込みによってプロドラッグを合成することもできる（Ｓｈａｂａｔｅｔａｌ．２００１．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９８：７４２８）。このような薬物のマスキング部分を、例えば、薬物の水酸基またはチオール基の修飾によって作製することができる。

（Ｅ．多特異性結合分子）
１つの実施形態では、本発明の結合分子は、多特異性である（すなわち、第１の分子または分子のエピトープに結合する少なくとも１つの結合部位および第２の分子または分子のエピトープに結合する少なくとも１つの第２の結合部位を有する）。

１つの実施形態では、本発明の結合分子は二重特異性である。二重特異性分子は、例えば、同一標的分子または異なる標的分子上の２つの異なる標的部位に結合することができる。例えば、抗体の場合、二重特異性分子は、例えば、同一抗原または２つの異なる抗原上の２つの異なるエピトープに結合することができる。二重特異性分子を、例えば、診断および治療への適用で使用することができる。例えば、これらを使用して、免疫アッセイ用の酵素を固定することができる。これらを、例えば、腫瘍関連分子および検出可能マーカー（例えば、放射性核種に強固に結合するキレート剤）の両方への結合による癌の診断および治療で使用することもできる。例えば、特定の標的に対して細胞毒性を向けること（例えば、病原体または腫瘍細胞への結合およびＴ細胞受容体またはＦｃγ受容体などの細胞毒性誘発分子への結合による）によってヒト治療のために二重特異性分子を使用することもできる。二重特異性抗体を、例えば、線維素溶解薬またはワクチンアジュバントとして使用することもできる。

二重特異性結合分子の例には、腫瘍細胞抗原に指向する少なくとも２つのアームを有するもの；腫瘍細胞抗原に指向する少なくとも１つのアームおよび細胞毒性誘発分子に指向する少なくとも１つのアームを有する二重特異性結合分子（抗ＦｃγＲＩ／抗ＣＤ１５、抗ｐ１８５．ｓｕｐ．ＨＥＲ２／ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、抗ＣＤ３／抗悪性Ｂ細胞（１Ｄ１０）、抗ＣＤ３／抗ｐ１８５．ｓｕｐ．ＨＥＲ２、抗ＣＤ３／抗ｐ９７、抗ＣＤ３／抗腎細胞癌、抗ＣＤ３／抗ＯＶＣＡＲ−３、抗ＣＤ３／Ｌ−Ｄ１（抗結腸癌）、抗ＣＤ３／抗メラノサイト刺激ホルモンアナログ、抗ＥＧＦ受容体／抗ＣＤ３、抗ＣＤ３／抗ＣＡＭＡ１、抗ＣＤ３／抗ＣＤ１９、抗ＣＤ３／ＭｏＶ１８、抗神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）／抗ＣＤ３、抗葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）／抗ＣＤ３、抗汎癌関連抗原（ａｎｔｉ−ｐａｎｃａｒｃｉｎｏｍａａｓｓｏｃｉａｔｅｄａｎｔｉｇｅｎ）（ＡＭＯＣ−３１）／抗ＣＤ３など）；腫瘍抗原と特異的に結合する少なくとも１つおよび毒素に結合する少なくとも１つを含む二重特異性結合分子（抗サポリン／抗Ｉｄ−１、抗ＣＤ２２／抗サポリン、抗ＣＤ７／抗サポリン、抗ＣＤ３８／抗サポリン、抗ＣＥＡ／抗リシンＡ鎖、抗インターフェロンα（ＩＦＮ−α）／抗ハイブリドーマイディオタイプ、抗ＣＥＡ／抗ビンカアルカロイドなど）；酵素活性化プロドラッグの変換のための二重特異性結合分子（抗ＣＤ３０／抗アルカリホスファターゼ（リン酸マイトマイシンプロドラッグのマイトマイシンアルコールへの変換を触媒する）など）；線維素溶解薬として使用することができる二重特異性結合分子（抗フィブリン／抗組織プラスミノゲンアクチベーター（ｔＰＡ）、抗フィブリン／抗ウロキナーゼ型プラスミノゲンアクチベーター（ｕＰＡ）など）；細胞表面受容体へ免疫複合体をターゲティングするための二重特異性結合分子（抗低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）／抗Ｆｃ受容体（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、またはＦｃγＲＩＩＩ）など）；感染症治療で使用するための二重特異性結合分子（抗ＣＤ３／抗単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、抗Ｔ細胞受容体：ＣＤ３複合体／抗インフルエンザ、抗ＦｃγＲ／抗ＨＩＶなど）；ｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎｖｉｖｏでの腫瘍検出のための二重特異性結合分子（抗ＣＥＡ／抗ＥＯＴＵＢＥ、抗ＣＥＡ／抗ＤＰＴＡ、抗ｐ１８５ＨＥＲ２／抗ハプテンなど）；ワクチンアジュバントとしての二重特異性結合分子（Ｆａｎｇｅｒｅｔａｌ．、ｓｕｐｒａを参照のこと）；および診断ツールとしての二重特異性結合分子（抗ウサギＩｇＧ／抗フィリチン、抗西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）／抗ホルモン、抗ソマトスタチン／抗サブスタンスＰ、抗ＨＲＰ／抗ＦＩＴＣ、抗ＣＥＡ／抗β−ガラクトシダーゼ（Ｎｏｌａｎｅｔａｌ．、ｓｕｐｒａを参照のこと）など）が含まれる。三重特異性抗体の例には、抗ＣＤ３／抗ＣＤ４／抗ＣＤ３７、抗ＣＤ３／抗ＣＤ５／抗ＣＤ３７、および抗ＣＤ３／抗ＣＤ８／抗ＣＤ３７が含まれる。

好ましい実施形態では、本発明の二重特異性分子はＣＲＩＰＴＯ−Ｉに結合する。

二重特異性分子は各特異性について一価であり得るか、各特異性について多価であり得る。例えば、抗体分子または融合タンパク質は第１の標的分子と反応する１つの結合部位および第２の標的分子と反応する１つの結合部位を含み得るか、第１の標的分子と反応する２つの結合部位および第２の標的分子と反応する２つの結合部位を含み得る。二重特異性分子の産生方法は当該分野で周知である。例えば、組換えテクノロジーを使用して、二重特異性分子（例えば、二重特異性抗体、単鎖二重特異性抗体、タンデムｓｃＦｖなど）を産生することができる。二重特異性分子の例示的産生技術は当該分野で公知である（例えば、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎｅｔａｌ．ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＶｏｌ．２４８：ＡｎｔｉｂｏｄｙＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：ＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＰｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｐｐ２２７−２４２ＵＳ２００３／０２０７３４６Ａ１およびその参考文献）。１つの実施形態では、例えば、ＵＳ２００３／０２０７３４６Ａ１号、または米国特許第５，８２１，３３３号、またはＵＳ２００４／００５８４００号などに記載の方法を使用して、多量体二重特異性分子を調製する。

本明細書中で使用される、句「多重特異性融合タンパク質」は、少なくとも２つの結合特異性（すなわち、リガンドまたは受容体の２つまたはそれより多くの結合ドメインの組み合わせ）を有する（上記定義のとおりの）融合タンパク質を示す。本質的にＷＯ８９／０２９２２号（１９８９年４月６日公開）、欧州特許第ＥＰ３１４，３１７号（１９８９年５月３日公開）、１９９２年５月２日発行の米国特許第５，１１６，９６４号に開示のように、多重特異性融合タンパク質を、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、またはヘテロ四量体としてアセンブリすることができる。好ましい多重特異性融合タンパク質は二重特異性である。二重特異性融合タンパク質の例には、ＣＤ４−ＩｇＧ／ＴＮＦ受容体−ＩｇＧおよびＣＤ４−ＩｇＧ／Ｌ−セレクチン−ＩｇＧが含まれる。最後に言及した分子は、リンパ球ホーミング受容体（ＬＨＲ、Ｌ−セレクチン）のリンパ節結合機能とＣＤ４のＨＩＶ結合機能とを組み合わせたものであり、ＨＩＶ感染、関連病態の防止もしくは治療または診断薬としての潜在的用途がある。

当業者は、本発明の多重特異性結合分子の標的結合部位を容易に選択することができる。いかなる方法にも制限されないが、例示的結合部位には、腫瘍抗原の１つまたは複数のエピトープが含まれる。他の例示的標的分子には、例えば、硫酸ヘパリン、成長因子またはその受容体（例えば、上皮成長因子受容体、インスリン様成長因子受容体、肝細胞成長因子（ＨＧＦ／ＳＦ）受容体、ＭＯＲＥ）の１つまたは複数のエピトープが含まれる（例えば、Ｃａｏｅｔａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ２００１．９８：７４４３；Ｌｕｅｔａｌ．２００４．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：２８５６を参照のこと）。

別の実施形態では、本発明は、既知の標的に結合する少なくとも１つの結合部位および未知の標的を認識する少なくとも１つの結合部位が組み込まれた二重特異性分子（例えば、抗体）に関する（例えば、１つの実施形態では、二重特異性分子は、半合成抗体ファージディスプレイライブラリーから選択された結合部位が組み込まれている）。

本発明の１つの実施形態では、当業者は、当該分野で公知の技術を使用して既知の特異性を有する単鎖抗体から出発し、Ｆａｂライブラリーを構築することができるか、あるいは、当業者は、当該分野で公知の技術を使用して既知の特異性を有するＦａｂフラグメントから出発し、一本鎖ライブラリーを構築することができる。非免疫化供給源に由来し、Ｖ遺伝子配列の合成組換え（好ましくは、ＤＨ配列およびＪＨ配列でのＶＨ配列の組換えならびにＪＬ配列でのＶＬ配列の組換え）によって調製されたライブラリーを使用して任意の抗原に対する抗体を単離することができることが当該分野で公知である。例えば、特許出願ＷＯ９２／０１０４７号は、抗体フラグメントをバクテリオファージの表面上にディスプレイすることができ、これらが抗原に結合することを教示する。この特徴を使用して、抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、およびＶＨ）を直接選択することができる。当該分野で公知の他の方法には、例えば、米国特許第５，６９８，４２６号、同第６，２９１，１５９号、同第５，６５８，７２７号、同第５，６６７，９８８号、および同第５，９６９，１０８号に教示の方法が含まれる。

別の実施形態では、既知の標的を認識するｓｃＦｖを、半合成ヒトファージ抗体ディスプレイライブラリーから単離したｓｃＦｖと二量体化することができる（例えば、ＫｒｕｉｆａｎｄＬｏｇｔｅｎｂｅｒｇ１９９６．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：７６３０を参照のこと）。

１つの実施形態では、本発明の二重特異性分子を、抗体分子を発現するために使用される任意の発現系（例えば、哺乳動物細胞、ピキア（Ｐｉｃｃｈｉａ）などの酵母、大腸菌、バキュロウイルスなど）で発現する。１つの実施形態では、本発明の二重特異性分子を、ＮＥＯＳＰＬＡベクター系で発現する（例えば、米国特許第６，１５９，７３０号を参照のこと）。このベクターは、サイトメガロウイルスプロモーター／エンハンサー、マウスβグロビン主要プロモーター、ＳＶ４０複製起点、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼエクソン１およびエクソン２、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、およびリーダー配列を含む。

１つの実施形態では、本発明の二重特異性分子は、合成連結ペプチドを含む。

これらの二重特性分子は、既知の標的への１つまたは複数の結合部位を有し、１つまたは複数の結合部位でライブラリーを発現する。このような二重特異性分子を使用して、例えば、既知の標的に極めて近接しているか会合している分子を同定することができる。例えば、当業者は、当該分野で周知のスクリーニング法を使用して、特定の応答（例えば、アポトーシスまたは細胞活性化）を誘導する二重特異性分子を選択するためのアッセイで本発明の二重特異性分子を使用することができる。スクリーニングした応答を生じると同定された二重特異性分子を同定し、その特異性を決定することができる。このような方法を使用して、目的の特定の標的と密接に関連する分子（例えば、Ｔ細胞マーカーまたは他のシグナル伝達分子（ＣＲＩＰＴＯ−Ｉ、死ドメイン分子、またはアポトーシスに関与する分子など））を同定することが可能である。既知の標的と「最も近接する」と新規に同定された分子の近接性を、免疫沈降または当業者に公知の他の技術を使用して確認することができる。これらの方法を使用して、特定の細胞応答の調整のための標的として分子を同定することが可能である。

１つの実施形態では、本発明のポリペプチド分子は、図８Ａ（配列番号１６）、図８Ｂ（配列番号１７）、図８Ｃ（配列番号１８）、図１０Ａ（配列番号２２）、図１０Ｂ（配列番号２３）に示す核酸配列を含む核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含む。
別の実施形態では、本発明の核酸分子は、図８Ａ（配列番号１６）、図８Ｂ（配列番号１７）、図８Ｃ（配列番号１８）、図１０Ａ（配列番号２２）、図１０Ｂ（配列番号２３）に示すヌクレオチド配列を含む。

別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、図９Ａ（配列番号１９）、図９Ｂ（配列番号２０）、配列番号２１、図１１Ａ（配列番号２４）、または図１１Ｂ（配列番号２５）に示すアミノ酸配列を含む。

別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、図１２Ａ（配列番号２６）、図１２Ｂ（配列番号２７）、図１４（配列番号３０）、または図１５（配列番号３１）に示すヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされる。別の実施形態では、本発明の核酸分子は、図１２Ａ（配列番号２６）、図１２Ｂ（配列番号２７）、図１４（配列番号３０）、または図１５（配列番号３１）に示すヌクレオチド配列を含む。１つの実施形態では、本発明のポリペプチドは、図１３Ａ（配列番号２８）、図１３Ｂ（配列番号２９）、図１６（配列番号３２）、または図１７（配列番号３３）に示すアミノ酸配列を含む。

配列表および図中の本明細書中に開示の他の核酸配列およびアミノ酸配列も本発明に含まれる。

（Ｂ．ポリペプチドの発現）
上記の本発明のポリペプチドを得るための単離遺伝物質の操作後、典型的には、所望の量の修飾抗体を産生するために使用することができる宿主細胞に導入するために、遺伝子を発現ベクターに挿入し、特許請求の範囲に記載のポリペプチドを得ることができる。

用語「ベクター」または「発現ベクター」は、細胞への所望の遺伝子の導入および細胞中での発現のための媒体として本発明で使用されるベクターを意味するために、明細書および特許請求の範囲のために本明細書中で使用される。当業者に公知のように、このようなベクターを、プラスミド、ファージ、ウイルス、およびレトロウイルスからなる群から容易に選択することができる。一般に、本発明に適合するベクターは、選択マーカー、所望の遺伝子のクローニングを容易にするための適切な制限部位、ならびに真核細胞または原核細胞に侵入し、そして／または複製する能力を有する。

本発明の目的のために、多数の発現ベクター系を使用することができる。例えば、あるベクタークラスは、ウシ乳頭腫ウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＭＭＴＶ、またはＭＯＭＬＶ）、またはＳＶ４０ウイルスなどの動物ウイルス由来のＤＮＡエレメントを使用する。他のクラスは、内部リボソーム結合部位を含む多シストロン系の使用を含む。例示的なベクターには、米国特許第６，１５９，７３０号、同第６，４１３，７７７号、またはＵＳ２００３０１５７６４１Ａ１号に教示のベクターが含まれる。さらに、ＤＮＡがその染色体に組み込まれた細胞を、トランスフェクトした宿主細胞の選択を許容する１つまたは複数のマーカーの導入によって選択することができる。マーカーは、独立栄養性宿主に原栄養性を提供するか、殺生物剤耐性（例えば、抗生物質）または銅などの重金属への耐性を付与することができる。選択可能マーカー遺伝子を、発現すべきＤＮＡ配列に直接結合するか、または同時形質転換によって同一細胞に導入することができる。

１つの実施形態では、誘導性発現系を使用することができる。

最適なｍＲＮＡ合成のためにさらなるエレメントも必要であり得る。これらのエレメントには、シグナル配列、スプライスシグナル、ならびに転写プロモーター、エンハンサー、および終結シグナルが含まれ得る。

１つの実施形態では、ポリペプチドを最適に分泌させるために、分泌シグナル（例えば、いくつかの十分に特徴づけられた細菌リーダーペプチド（例えば、ｐｅｌＢ、ｐｈｏＡ、またはｏｍｐＡ）のうちの１つ）を、インフレームで本発明のポリペプチドのＮ末端に融合することができる（Ｌｅｉｅｔａｌ．１９８８Ｎａｔｕｒｅ３３１：５４３；Ｂｅｔｔｅｒｅｔａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ１９８８．２４０：１０４１；Ｍｕｌｌｉｎａｘｅｔａｌ．，１９９０．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：８０９５）。

１つの実施形態では、ペプチドリンカーをコードする核酸配列を含むベクターを使用することができる。別の実施形態では、例えば、重複プライマーを使用したＰＣＲ増幅によって最初に所望のコード配列（例えば、分泌シグナル、ＶＬ、リンカーペプチド、ＶＨなど）を１つの配列にアセンブリし、その後、プラスミドまたは他のベクターへライゲーションすることが所望され得る。

特に好ましい実施形態では、クローン化した可変領域遺伝子を、上記で議論したように修飾した重鎖および軽鎖の定常領域遺伝子（好ましくはヒト）と共に発現ベクターに挿入する。好ましくは、ＮＥＯＳＰＬＡと呼ばれるＩＤＥＣ，Ｉｎｃ．の独占商品である発現ベクターを使用してこれを行う。米国特許第６，１５９，７３０号を参照のこと。このベクターは、サイトメガロウイルスプロモーター／エンハンサー、マウスβグロビン主要プロモーター、ＳＶ４０複製起点、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼのエクソン１およびエクソン２、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、およびリーダー配列を含む。以下の実施例で認められるように、このベクターは、可変領域および定常領域の遺伝子を組み込み、ＣＨＯ細胞でトランスフェクションし、その後、Ｇ４１８含有培地で選択し、メトトレキセート増幅すると抗体を非常に高レベルで発現することが見出されている。ベクター系は、米国特許第５，７３６，１３７号および同第５，６５８，５７０号（それぞれその全体が本明細書中で参考として援用される）にも教示されている。この系の発現レベルは高い（例えば、＞３０ｐｇ／細胞／日）。他の例示的ベクター系は、例えば、米国特許第６，４１３，７７７号に開示されている。

他の好ましい実施形態では、２００１年１１月１６日提出の米国特許仮出願番号６０／３３１，４８１号（その全体が本明細書中で援用される）に開示される多シストロン性構築物などの多シストロン性構築物を使用して、本発明のポリペプチドを発現することができる。これらの新規の発現系では、抗体の重鎖および軽鎖などの目的の複数の遺伝子産物を、１つの多シストロン性構築物から産生することができる。これらの系は、真核宿主細胞中での本発明のポリペプチドを比較的高レベルで得るために、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を使用することが有利である。適合性ＩＲＥＳ配列は、米国特許第６，１９３，９８０号（本明細書中でも援用される）に開示されている。当業者は、このような発現系を使用して本出願で開示の全範囲のポリペプチドを有効に産生することができることを認識する。

より一般的には、一旦ポリペプチド（例えば、修飾抗体）の単量体サブユニットをコードするベクターまたはＤＮＡ配列が調製されれば、発現ベクターを適切な宿主細胞に導入することができる。すなわち、宿主細胞を形質転換することができる。当業者に周知の種々の技術によって、宿主細胞にプラスミドを導入することができる。これらには、トランスフェクション（電気泳動およびエレクトロポレーションが含まれる）、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈殿、包膜ＤＮＡとの細胞融合、微量注入、およびインタクトなウイルスでの感染が含まれるが、これらに限定されない。Ｒｉｄｇｗａｙ，Ａ．Ａ．Ｇ．”ＭａｍｍａｌｉａｎＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＶｅｃｔｏｒｓ” Ｃｈａｐｔｅｒ２４．２，ｐｐ．４７０−４７２Ｖｅｃｔｏｒｓ，ＲｏｄｒｉｇｕｅｚａｎｄＤｅｎｈａｒｄｔ，Ｅｄｓ．（Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．１９８８）を参照のこと。最も好ましくは、宿主へのプラスミドの導入は、エレクトロポレーションによる。形質転換細胞を軽鎖および重鎖の産生に適切な条件下で増殖させ、重鎖および／または軽鎖タンパク質合成のためにアッセイする。例示的なアッセイ技術には、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、または蛍光標示式細胞分取分析（ＦＡＣＳ）、および免疫組織化学などが含まれる。

本明細書中で使用される、用語「形質転換」を、遺伝子型を変化させてその結果としてレシピエント細胞が変化する、レシピエント宿主細胞へのＤＮＡの任意の導入をいうために広義で使用するものとする。

同一系統のもののうち、「宿主細胞」は、組換えＤＮＡ技術を使用して構築し、かつ少なくとも１つの異種遺伝子をコードするベクターで形質転換した細胞をいう。組換え宿主からの抗体の単離プロセスの説明では、用語「細胞」および「細胞培養物」を、他で明確に特定しない限り、抗体の供給源を示すために交換可能に使用する。言い換えると、「細胞」からのポリペプチドの回収は、沈降全細胞または培地および懸濁細胞の両方を含む細胞培養物のいずれかからの回収を意味し得る。

タンパク質発現に使用される宿主細胞株は、哺乳動物起源が最も好ましい；当業者は、所望の遺伝子産物が特定の細胞株中で発現されるのに最も適切な特定の宿主細胞株を優先的に決定する能力を有すると考える。例示的な宿主細胞株には、ＤＧ４４およびＤＵＸＢ１１（チャイニーズハムスター卵巣株、ＤＨＦＲ−）、ＨＥＬＡ（ヒト頸部癌）、ＣＶＩ（サル腎臓株）、ＣＯＳ（ＳＶ４０Ｔ抗原を有するＣＶＩ誘導体）、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスター線維芽細胞）、ＢＡＬＢＣ／３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、ＨＡＫ（ハムスター腎臓株）、ＳＰ２／Ｏ（マウス骨髄腫）、Ｐ３．ｔｉｍｅｓ．６３−Ａｇ３．６５３（マウス骨髄腫）、ＢＦＡ−１ｃ１ＢＰＴ（ウシ内皮細胞）、ＲＡＪＩ（ヒトリンパ球）、および２９３（ヒト腎臓）が含まれるが、これらに限定されない。ＣＨＯ細胞が特に好ましい。宿主細胞株は、典型的には、商業サービス、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｉｓｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎまたは既刊文献から利用可能である。

別の実施形態では、宿主細胞は、原核細胞（例えば、ジスルフィド結合の形成を許容する株）である（Ｄｅｒｍａｎ，ＡＩ，ｅｔａｌ．１９９３．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２６２：１７４４；Ｂｅｓｓｅｔｔｅ，ＰＨ．Ｅｔａｌ．１９９９．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９６：１３７０３）。

ｉｎｖｉｔｒｏ産生によってスケールアップして大量の所望のポリペプチドを得ることが可能である。組織培養条件下での哺乳動物細胞培養技術は当該分野で公知であり、例えば、エアリフトリアクターまたは連続撹拌リアクターでの均一浮遊培養、例えば、中空繊維、マイクロカプセル、アガロースマイクロビーズもしくはセラミックカートリッジでの固定もしくは捕捉細胞培養が含まれる。必要および／または所望ならば、ポリペプチド溶液を、例えば、修飾ヒンジ領域ポリペプチドの優先的生合成後または本明細書中に記載のＨＩＣクロマトグラフィ工程の前もしくは後の習慣的クロマトグラフィ法（例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィ、ＤＥＡＥ−セルロースクロマトグラフィ、または（イムノ）アフィニティクロマトグラフィ）によって精製することができる。

本発明のポリペプチドをコードする遺伝子は、細菌もしくは酵母または植物細胞などの非哺乳動物細胞を発現することもできる。これに関して、細菌などの種々の単細胞非哺乳動物微生物（すなわち、培養または発酵で増殖することができるもの）を形質転換することもできることが認識される。形質転換に感受性を示す細菌には、大腸菌またはサルモネラの株などの腸内細菌科；バチルス科（枯草菌など）；肺炎球菌；連鎖球菌；インフルエンザ菌が含まれる。細菌中で発現される場合、典型的には、ポリペプチドは封入体の一部となることがさらに認識される。ポリペプチドを単離し、精製し、アセンブリして機能的分子にしなければならない。抗体の四価形態が望ましく、サブユニットは次いで自己アセンブリして四価抗体になる（ＷＯ０２／０９６９４８Ａ２）。

原核生物に加えて、真核微生物も使用することができる。出芽酵母（すなわち、一般的なパン酵母）は、真核微生物のうちで最も一般的に使用されているが、多数の他の株を一般的に利用可能である。酵母類での発現のために、一般に、プラスミドＹＲｐ７（例えば、Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２８２：３９（１９７９）；Ｋｉｎｇｓｍａｎｅｔａｌ．，Ｇｅｎｅ，７：１４１（１９７９）；Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒｅｔａｌ．，Ｇｅｎｅ，１０：１５７（１９８０））を使用する。このプラスミドは、トリプトファン中での増殖能力を欠く酵母の変異株のための選択マーカーを提供するＴＲＰ１遺伝子（例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６またはＰＥＰ４−１（Ｊｏｎｅｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８５：１２（１９７７）））を既に含む。次いで、酵母宿主ゲノムに特徴的なｔｒｐ１損傷の存在によって、トリプトファンの非存在下での増殖による形質転換の検出のための有効な環境が提供される。

（ＩＶ．鎖間ジスルフィド結合を欠くポリペプチドからの少なくとも１つの鎖間ジスルフィド結合を含むポリペプチドの分離）
１つの態様では、本発明は、ある分子画分は２つの重鎖部分が少なくとも１つの鎖間ジスルフィド結合を介して結合している形態で存在し、ある分子画分は少なくとも１つのジスルフィド結合を介して結合していない重鎖部分を含む混合物からの、疎水性相互作用クロマトグラフィによる、２つの重鎖部分を有する分子の分離に関する。

炭化水素スペーサーアームを含むがアフィニティリガンドを欠くアフィニティゲル上にタンパク質を保持することができるという知見の後に、疎水性相互作用クロマトグラフィは最初に開発された。溶媒、ｐＨ、イオン強度の変化またはカオトロピック剤または有機修飾剤（ｍｏｄｉｆｉｅｒ）（エチレングリコールまたはプロピレングリコールなど）の添加によってＨＩＣ支持体から溶離することができる。疎水性相互作用クロマトグラフィの一般的原理の説明を、例えば、米国特許第３，９１７，５２７号および同第４，０００，０９８号で見出すことができる。高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）の文脈でＨＩＣを使用して、１工程プロトコールでインタクトな抗体分子から重鎖部分を欠く抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）_２）を分離した（Ｍｏｒｉｍｏｔｏ，Ｋ．ｅｔａｌ．，ＬＢｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｖｓ．Ｍｅｔｈ．２４：１０７（１９９２））。

本発明の分離方法を、ポリペプチドの非精製集団（例えば、培養上清もしくは調製物または原核生物封入体から単離したポリペプチドの調製物）に対して実施することができる。あるいは、本発明の分離方法を、１つまたは複数の最初の精製工程後（例えば、Ａ型およびＢ型を含む調製物をアフィニティマトリクスから溶離した後）に得たポリペプチド混合物に対して使用することができる。

１つの実施形態では、ＨＩＣクロマトグラフィに供した結合分子は、本発明の連結ペプチドを含む。

好ましい実施形態では、ＨＩＣを、他のタンパク質精製手順によって部分精製した混合物に適用することができる。本明細書中で使用される、用語「部分精製された」には、目的のタンパク質が少なくとも５重量％、より好ましくは少なくとも１０重量％、最も好ましくは少なくとも４５重量％存在するタンパク質調製物が含まれる。最初またはその後の精製工程を使用して、例えば、先のクロマトグラフィ工程（使用する場合、プロテインＡなど）から免疫グロブリン凝集体、誤折りたたみ種、宿主細胞タンパク質、残存物質を除去することができる。１つの実施形態では、本発明の連結ペプチドを含むポリペプチドに対してＨＩＣを行うことができる。したがって、全精製プロトコールの文脈でＨＩＣの適用も認識することができる。ＨＩＣの前または後で使用することができる例示的精製工程には、アフィニティクロマトグラフィ（例えば、制御された細孔性ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄｐｏｒｅｇｌａｓｓ）に共有結合したプロテインＡからなるＰＲＯＳＥＰ−Ａ（登録商標）（ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓｉｎｇＬｔｄ．，Ｕ．Ｋ．）、プロテインＡＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）ＦａｓｔＦｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、またはＴＯＹＯＰＥＡＲＬ６５０ＭプロテインＡ（ＴｏｓｏＨａａｓ））が含まれる。プロテインＡはヒトγ１、γ２、またはγ４重鎖に好ましく、プロテインＧはマウスアイソタイプに好ましい。分子がＣＨ３ドメインを含む場合、ＢａｋｅｒｂｏｎｄＡＢＸｔｍ樹脂を使用することができる。さらにまたはあるいは、イオン交換クロマトグラフィを使用することができる。これに関して、クロマトグラフィ用の陰イオン性または陽イオン性の支持体を形成するために、種々の陰イオンまたは陽イオン置換基をマトリクスに結合することができる。陰イオン交換置換基には、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基、第四級アミノエチル（ＱＡＥ）、および第四級アミン（Ｑ）基が含まれる。陽イオン交換置換基には、カルボキシメチル（ＣＭ）基、スルホエチル（ＳＥ）基、スルホプロピル（ＳＰ）基、リン酸基（Ｐ）、およびスルホン酸基（Ｓ）が含まれる。ＤＥ２３、ＤＥ３２、ＤＥ５２、ＣＭ−２３、ＣＭ−３２、およびＣＭ−５２などのセルロースイオン交換樹脂は、ＷｈａｔｍａｎＬｔｄ．Ｍａｉｄｓｔｏｎｅ，Ｋｅｎｔ，Ｕ．Ｋから市販されている。ＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）ベースおよび架橋イオン交換体も公知である。例えば、ＤＥＡＥ−、ＱＡＥ−、ＣＭ−、およびＳＰ−ＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）ならびにＤＥＡＥ−、Ｑ−、ＣＭ−、およびＳ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）およびＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）ＦａｓｔＦｌｏｗはすべて、ＰｈａｒｍａｃｉａＡＢから市販されている。さらに、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬＤＥＡＥ−６５０ＳまたはＭおよびＴＯＹＯＰＥＡＲＬＣＭ−６５０ＳまたはＭなどのＤＥＡＥおよびＣＭ誘導体化エチレングリコール−メタクリレートコポリマーはＴｏｓｏＨａａｓＣｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａから市販されている。イオン交換支持体からの溶離が通常は塩の添加を含み、かつ増加塩濃度下でＨＩＣが増強されるため、イオン交換クロマトグラフィ工程または他の塩媒介精製工程後のＨＩＣ工程の導入が好ましい。さらなる精製プロトコール（さらなるイオン交換クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、ウイルス不活化、濃縮および凍結乾燥、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカゲルクロマトグラフィ、ヘパリンＳＥＱＨＡＲＯＳＥ^ＴＭでのクロマトグラフィ、クロマトフォーカシング、または硫酸アンモニウム沈殿が含まれるが、これらに必ず制限されるわけではない）を加えることができる。

本発明の方法を使用した精製前に、分離すべきポリペプチドの混合物を含む組成物を、酸性もしくはほぼ中性のｐＨの緩衝液に入れることが好ましい。例えば、濃縮緩衝液の添加、緩衝液へのサンプルの再懸濁、緩衝液の交換（例えば、透析または限外濾過を使用する）によってこれを行うことができる。あるいは、サンプル緩衝液のｐＨを、所望の範囲内となるように簡単に調整することができる。

疎水性相互作用は高イオン強度で最も強くなるため、塩沈殿またはイオン交換手順後にこの分離形態が便利に実施される。高塩濃度はＨＩＣカラムへのタンパク質の吸着に有利に働くが、実際の濃度は、タンパク質の性質および選択した特定のＨＩＣリガンドに依存して広範に変化し得る。疎水性相互作用（塩析作用）を促進するかどうかまたは水の構造を破壊して（カオトロピック効果）、疎水性相互作用を弱めるかどうかに依存して、いわゆるｓｏｌｕｐｈｏｂｉｃシリーズ中に種々のイオンを配置することができる。陽イオンは、塩析作用の増加に関してＢａ^＋＋＜；Ｃａ^＋＋＜；Ｍｇ^＋＋＜；Ｌｉ^＋＜；Ｃｓ^＋＜；Ｎａ^＋＜；Ｋ^＋＜；Ｒｂ^＋＜；ＮＨ_４ ^＋として順位づけされ、陰イオンをカオトロピック効果の増加に関してＰＯ⁻⁻＜；Ｓ０_４ ⁻⁻＜；ＣＨ_３ＣＯＯＯ⁻＜；Ｃｌ⁻＜；Ｂｒ⁻＜；ＮＯ_３ ⁻＜；ＣｌＯ_４ ⁻＜；Ｉ⁻＜；ＳＣＮ⁻に順位づけることができる。

一般に、Ｎａ、Ｋ、またはＮＨ_４の硫酸塩は、ＨＩＣにおけるリガンド−タンパク質相互作用を効果的に促進する。以下の関係によって与えられたように相互作用の強度に影響を与える塩を配合することができる：（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４＞；Ｎａ_２ＳＯ_４＞；ＮａＣｌ＞；ＮＨ_４Ｃ１＞；ＮａＢｒ＞；ＮａＳＣＮ。一般に、約０．７５と約２Ｍとの間の硫酸アンモニウムの塩濃度または約１Ｍと４Ｍとの間のＮａＣｌの塩濃度が有用である。

ＨＩＣカラムの調製において多数のクロマトグラフィ支持体を使用することができ、アガロース、シリカ、および有機ポリマー、またはコポリマー樹脂が最も広範に使用されている。疎水性相互作用材料は、一般に、疎水性リガンド（例えば、アルキル基またはアリール基）をカップリングしたベースマトリクス（例えば、親水性炭水化物（架橋アガロースなど）または合成コポリマー材料）である。好ましいＨＩＣ材料は、フェニル基で置換されたアガロース樹脂を含む。例示的ＨＩＣ材料には、フェニルＳＥＰＨＡＲＯＳＥ^ＴＭ、低または高置換ＦＡＳＴＦＬＯＷ（ＰｈａｒｍａｃｉａＬＫＢＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＡＢ，Ｓｗｅｄｅｎ）；フェニルＳＥＰＨＡＲＯＳＥ^ＴＭＨｉｇｈＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラム；フェニルまたはブチル−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）ＣＬ−４Ｂ、ブチル−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）ＦＦ、オクチル−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）ＦＦ、およびフェニル−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）ＦＦ（ＰｈａｒｍａｃｉａＬＫＢＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＡＢ，Ｓｗｅｄｅｎ）；Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ^ＴＭＥＭＤプロピルまたはＦＲＡＣＴＯＧＥＬ^ＴＭＥＭＣフェニルカラム（Ｅ．Ｍｅｒｃｋ，Ｇｅｒｍａｎｙ）；ＭＡＣＲＯＰＲＥＰ^ＴＭメチルまたはＭＡＣＲＯ−ＰＲＥＰ^ＴＭｔ−ブチル支持体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）；ＷＰＨＩ−プロピル（Ｃ３）^ＴＭカラム（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ）が含まれる。例示的ＨＩＣ材料はまた、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬエーテル６５０、フェニル６５０、ブチル６５０（Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ）、エーテル−５ＰＷ−ＨＲ、またはフェニル−５ＰＷ−ＨＲの製品名でＴｏｓｏｈＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎから市販されており、アルキル基が２〜１０個の炭素原子を含むアルキル−アガロースの製品名でＭｉｌｅｓ−Ｙｅｄａ，Ｒｅｈｏｖｏｔ，Ｉｓｒａｅｌから市販されており、ＢａｋｅｒｂｏｎｄＷＰ−ＨＩ−プロピルの製品名でＪ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，Ｎ．Ｊ．から市販されている。従来の化学を使用して、所望のＨＩＣカラムを調製することも可能である（Ｓａ：例えば、Ｅｒ−ｅｌ．Ｚ．ｇｌａｌｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．４９：３８３（１９７２）またはＵｌｂｒｉｃｈ，Ｖ．ｒｄｇＬＣｏｌｌ．Ｃｚｅｃｈ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｍ．９：１４６６（１９６４））。

当業者は、特定のゲルを選択することができる。一般に、タンパク質とＨＩＣリガンドとの相互作用強度は、アルキルリガンドの鎖強度とともに増加するが、約４〜約８個の炭素原子範囲のリガンドはほとんどの分離に適切である。フェニル基はペンチル基と疎水性がほぼ同一であるが、タンパク質上の芳香基とのπ−πオービタル相互作用の可能性によって選択性が異なり得る。選択性は、支持樹脂の化学的性質にも影響を受け得る。

相互作用の強度だけでなくカラムの能力にも影響を与えるという点で、リガンド密度は重要なパラメータである。市販のフェニルまたはオクチルフェニルゲルのリガンド密度は、４０ｐｍｏｌ／ｍＬゲルベッドのオーダーである。ゲルの能力は、目的の特定のタンパク質、ならびにｐＨ、温度、ならびに塩の型および塩濃度の関数であるが、一般に、３〜２０ｍｇ／ｍＬゲルの範囲内であると予想することができる。

一般に、温度の低下によりＨＩＣ材料との相互作用が減少する。しかし、温度上昇によって得られる任意の利益を、このような上昇がタンパク質の安定性に与え得る悪影響と比較検討しなければならない。

１つの実施形態では、本発明のポリペプチドを定組成で溶離することができる。定組成溶離では、全化合物が開始時にカラムから移動し始める。しかし、それぞれ異なる速度で移動し、高速または低速の溶離速度が得られる。例えば、本発明の実施例に記載のように、Ａ型をカラムを通過させて溶離することができる。

別の実施形態では、本発明の１つまたは複数のポリペプチドを、カラムに結合させ、例えば、段階的溶離または勾配溶離を使用して溶離することができる。段階的または勾配形態での溶離を、以下の種々の方法で行うことができる：（ａ）塩濃度の変化、（ｂ）溶媒の極性の変化、または（ｃ）界面活性剤の添加。塩濃度の減少によって、吸着されたタンパク質が疎水性の低い順に溶離する。極性の変化は、エチレングリコール、プロピレングリコール、または（イソ）プロパノールなどの溶媒の添加によって影響を受けることができ、それによって疎水性相互作用の強度を減少させることができる。界面活性剤はタンパク質の置換剤（ｄｉｓｐｌａｃｅｒ）として機能し、主に膜タンパク質の精製と組み合わせて使用されている。

分離の実施では、ポリペプチド混合物を、例えば、バッチ精製技術またはカラムを使用してＨＩＣ材料と接触させることができる。ＨＩＣ精製前に、例えば、プレカラムへの混合物の通過によってあらゆるカオトロピック剤または非常に疎水性の高い物質を除去することが所望され得る。

例えば、バッチ精製のために、所望の出発緩衝液中にＨＩＣ材料を調製するかまたは平衡化する。ＨＩＣ材料のスラリーを得る。ポリペプチド溶液を、スラリーと接触させて分離すべき少なくとも１つのポリペプチドをＨＩＣ材料に吸着させる。ＨＩＣ材料に結合しないポリペプチドを含む溶液を、例えば、スラリーを静置するかまたは上清の除去することによってスラリーから分離する。スラリーを、１つまたは複数の洗浄工程に供することができる。所望ならば、スラリーを伝導率のより低い溶液と接触させて、ＨＩＣ物質に結合したポリペプチドを脱着させることができる。結合ポリペプチドを溶離するために、塩濃度を減少させることができる。

１つの実施形態では、ＨＩＣ材料をカラムにパッケージングすることができる。分離すべきポリペプチドを含む混合物をカラムにアプライして、少なくとも１つの分離すべきポリペプチドをカラムに吸着させることができる。カラムに吸着しないポリペプチドは通過し、回収することができる。結合したポリペプチドを溶離するために、例えば、段階的様式で、または塩勾配を使用して塩濃度を減少させることができる。

Ｂ型はＡ型よりも疎水性が高いため、移動相として約０．７Ｍ（例えば、０．７３Ｍ）の硫酸アンモニウム／２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ４．０〜ｐＨ８．０）を使用した固定相に不可逆的に吸着する。Ａ型は、これらの条件下で固定相により低い範囲で結合するため定組成で溶離する（すなわち、通過画分と共にカラムから遊離する）。Ａ型の定組成溶離後、移動相からの硫酸アンモニウムの除去によりＢ型が脱着する。

例示的精製スキームでは、ＨＩＣ材料を、約１６０ｍＳ／ｃｍ〜約１１０ｍＳ／ｃｍ、好ましくは約１４０ｍＳ／ｃｍ〜約１１５ｍＳ／ｃｍ、さらにより好ましくは約１３０ｍＳ／ｃｍ〜約１１７ｍＳ／ｃｍ、または約１２０ｍＳ／ｃｍ〜約１１７ｍＳ／ｃｍの伝導率が得られる塩濃度を含む緩衝液中で平衡化する。例えば、例示的出発溶液は、約１Ｍ〜０．７Ｍの塩濃度（例えば、１Ｍ〜０．７Ｍの硫酸アンモニウム）を含む。好ましい実施形態では、分離すべきポリペプチドの混合物を含む溶液も、同一またはほぼ同一の伝導率にする（例えば、濃縮した塩ストック溶液を使用）。これらの条件下で、Ａ型を、約１２０ｍＳ／ｃｍの伝導率でカラムから溶離する。Ｂ型を溶離するために、カラムの硫酸アンモニウム含有量を段階的または直線勾配で減少させることができる。Ｂ型は、約１１５ｍＳ／ｃｍ〜約１００ｍＳ／ｃｍの伝導率で溶離する。

１つの実施形態では、本発明の精製方法により、重鎖部分がＣＨ２ドメインを欠き、かつ約５０％を超える分子は、２つの重鎖部分が少なくとも１つの鎖間ジスルフィド結合を介して結合している形態で存在する、少なくとも２つの標的結合部位および２つの重鎖部分を有するポリペプチド分子を含む組成物が得られる。別の実施形態では、約６０％を超える分子は２つの重鎖部分が少なくとも１つの鎖間ジスルフィド結合を介して結合している形態で存在する。別の実施形態では、約７０％を超える分子は２つの重鎖部分が少なくとも１つの鎖間ジスルフィド結合を介して結合している形態で存在する。別の実施形態では、約８０％を超える分子は２つの重鎖部分が少なくとも１つの鎖間ジスルフィド結合を介して結合している形態で存在する。別の実施形態では、約９０％を超える分子は２つの重鎖部分が少なくとも１つの鎖間ジスルフィド結合を介して結合している形態で存在する。

１つの実施形態では、本発明の精製方法によって、約９９％を超える分子は２つの重鎖部分が少なくとも１つの鎖間ジスルフィド結合を介して結合している形態で存在する、少なくとも２つの標的結合部位および２つの重鎖部分を有する組換えポリペプチド分子を含む組成物が得られる。

１つの実施形態では、本発明の精製方法によって、約９５％を超える分子は２つの重鎖部分が少なくとも１つの鎖間ジスルフィド結合を介して結合している形態で存在し、ポリペプチドの重鎖部分がＩｇＧ４アイソタイプの抗体に由来する、少なくとも２つの標的結合部位および２つの重鎖部分を有するポリペプチド分子を含む組成物が得られる。

１つの実施形態では、本発明の精製方法によって、重鎖部分がＣＨ２ドメインを欠き、約８０％を超える分子は２つの重鎖部分が少なくとも１つの鎖間ジスルフィド結合を介して結合していない形態で存在する、２つの軽鎖部分および２つの重鎖部分を有するポリペプチド分子を含む組成物が得られる。

別の態様では、本発明はまた、組成物中のＡ型およびＢ型の相対量を測定する工程を含む、精製および／または優先的生合成の結果をモニタリングする方法を提供する。例えば、本明細書中に記載のように非還元ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動または質量分析を使用してＡ型およびＢ型を測定することができる。

（Ｖ．ポリペプチドの標識または結合体化）
本発明のポリペプチド分子を、非結合体化形態で使用することができるか、例えば、抗原の検出を容易にするためか患者の画像化もしくは治療のために種々の分子のうちの少なくとも１つに結合体化（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）することができる。本発明のポリペプチドを、精製を行う場合、精製前または精製後のいずれかで標識または結合体化することができる。特に、本発明のポリペプチドを、細胞毒素（放射性同位体、細胞毒性薬、または毒素など）、治療薬、細胞増殖抑制薬、生物毒素、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生物反応修飾物質、薬物、免疫学的に活性なリガンド（例えば、得られた分子が新生物細胞とＴ細胞などのエフェクター細胞との両方に結合する、リンホカインまたは抗体）、またはＰＥＧに結合体化することができる。別の実施形態では、本発明のポリペプチドを、腫瘍の血管新生を減少させる分子に結合体化することができる。他の実施形態では、開示の組成物は、薬物またはプロドラッグに結合した本発明のポリペプチドを含み得る。本発明のさらに他の実施形態は、リシン、ゲロニン、緑膿菌外毒素、またはジフテリア毒素などの特定の生物毒素またはその細胞毒性フラグメントに結合体化した本発明のポリペプチドの使用を含む。使用する結合体化または非結合体化ポリペプチドの選択は、癌の型および進行度、補助療法（例えば、化学療法または外部照射）の使用、および患者の健康状態に依存する。当業者は、本明細書中の教示を考慮して、このような選択を容易に行うことができると認識する。

以前の研究では、同位体で標識した抗腫瘍抗体が充実性腫瘍中の細胞ならびに動物モデル（いくつかの場合、ヒト）におけるリンパ腫／白血病を破壊するために首尾よく使用されていることが認識される。例示的放射性同位体には、^９０Ｙ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^１２３Ｉ、^１１１Ｉｎ、^１０５Ｒｈ、^１５３Ｓｍ、^６７Ｃｕ、^６７Ｇａ、^１６６Ｈｏ、^１７７Ｌｕ、^１８６Ｒｅ、および^１８８Ｒｅが含まれる。放射性核種は、核ＤＮＡ中の複数の鎖を破壊して細胞死に至らしめる電離放射線を発生することによって作用する。治療結合体の産生のために使用される同位体は、典型的には、路長の短い高エネルギーのαまたはβ粒子を生成する。このような放射性核種は、極めて近接した細胞（例えば、結合体が結合するか侵入した新生物細胞）を死滅させる。これらは、非局在化細胞にほとんどまたは全く効果がない。放射性核種は、本質的に非免疫原性である。

本発明と組み合わせた放射性標識結合体の使用に関して、（ヨード化などによって）本発明のポリペプチドを直接標識するか、キレート剤の使用によって間接的に標識することができる。本明細書中で使用される、句「間接的標識」および「間接的標識アプローチ」は共に、キレート剤が分子に共有結合し、少なくとも１つの放射性核種がキレート剤に会合していることを意味する。ポリペプチドおよび放射性同位体の両方に結合するため、このようなキレート剤を、典型的には、二官能性キレート剤という。特に好ましいキレート剤は、１−イソチオシクマトベンジル（ｉｓｏｔｉｏｃｙｃｍａｔｏｂｅｎｚｙｌ）−３−メチルジオセレン（ｍｅｔｈｙｌｄｉｏｔｈｅｌｅｎｅ）トリアミン五酢酸（「ＭＸ−ＤＴＰＡ」）誘導体およびシクロヘキシルジエチレントリアミン五酢酸（「ＣＨＸ−ＤＴＰＡ」）誘導体を含む。他のキレート剤は、Ｐ−ＤＯＴＡ誘導体およびＥＤＴＡ誘導体を含む。間接的標識に特に好ましい放射性核種には、^１１１Ｉｎおよび^９０Ｙが含まれる。

本明細書中で使用される、句「直接標識」および「直接標識アプローチ」は共に、（典型的にはアミノ酸残基を介して）放射性核種がポリペプチドに直接的に共有結合することを意味する。より詳細には、これらの結合テクノロジーには、ランダム標識および部位特異的標識が含まれる。後者の場合、標識は、結合体のＦｃ部分上のみに存在するＮ結合糖残基などのポリペプチド上の特定の部位に指向する。さらに、種々の直接標識技術およびプロトコールは、本発明に適合する。例えば、テクネチウム−９９ｍ標識ポリペプチドを、リガンド交換プロセス、スズイオン溶液での過テクネート（ＴｃＯ_４ ⁻）の還元、Ｓｅｐｈａｄｅｘカラム上への還元テクネチウムのキレート化およびこのカラムへのポリペプチドのアプライ、またはバッチ標識技術（例えば、過テクネート、ＳｎＣｌ_２などの還元剤、フタル酸ナトリウム−カリウム溶液などの緩衝液、および分子のインキュベーション）によって調製することができる。任意の事象では、ポリペプチドの直接標識のための好ましい放射性核種は当該分野で周知であり、直接標識に特に好ましい放射性標識は、チロシン残基を介して共有結合した^１３１Ｉである。本発明のポリペプチドを、例えば、放射性のヨウ化ナトリウムもしくはヨウ化カリウムおよび化学的酸化剤（次亜塩素酸ナトリウムまたはクロラミンＴなど）もしくは酵素酸化剤（ラクトペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、およびグルコースなど）を使用して誘導することができる。しかし、本発明の目的のために、間接的標識アプローチが特に好ましい。キレート剤およびキレート剤結合体に関する特許は当該分野で公知である。例えば、Ｇａｎｓｏｗに付与された米国特許第４，８３１，１７５号は、多置換ジエチレントリアミン五酢酸キレートおよびこれを含むタンパク質結合体、およびその調製方法に関する。Ｇａｎｓｏｗに付与された米国特許第５，０９９，０６９号、同第５，２４６，６９２号、同第５，２８６，８５０号、同第５，４３４，２８７号、および同第５，１２４，４７１号も多置換ＤＴＰＡキレートに関する。これらの特許は、その全体が本明細書中で参考として援用される。適合可能な金属キレート剤の他の例は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＰＴＡ）、１，４，８，１１−テトラアザテトラデカン、１，４，８，１１−テトラアザテトラデカン−１，４，８，１１−四酢酸、または１−オキサ−４，７，１２，１５−テトラアザヘプタデカン−４，７，１２，１５−四酢酸などである。シクロヘキシル−ＤＴＰＡまたはＣＨＸ−ＤＴＰＡが特に好ましい。当業者は、さらに他の適合するキレート剤（依然として発見されていないものも含まれる）を容易に識別することができ、これらは明らかに本発明の範囲内である。

三価金属と高親和性を示し、腫瘍−非腫瘍比の増加および骨取り込みの減少を示し、標的部位（すなわち、Ｂ細胞リンパ腫の腫瘍部位）での放射性核種のｉｎｖｉｖｏ保持をより高くするために、適合可能なキレート剤（同時係属出願番号０８／４７５，８１３号、０８／４７５，８１５号、および０８／４７８，９６７号においてキレート化を容易にするために使用した特定の二官能性キレート剤が含まれる）を選択することが好ましい。しかし、他の二官能性キレート剤（これらの全ての特徴を含んでいても含んでいなくてもよい）は当該分野で公知であり、腫瘍治療でも有利であり得る。本明細書中の教示にしたがって、診断および治療の目的のためにポリペプチドを異なる放射性標識に結合体化することができることも認識される。この目的を達成するために、上記同時係属出願（その全体が本明細書中で参考として援用される）は、治療分子の投与前の腫瘍の診断用「画像化」のための放射性標識治療結合体を開示する。「Ｉｎ２Ｂ８」結合体は、１−イソチオシアナトベンジル−３−メチル−ＤＴＰＡと１−メチル−３−イソチオシアナトベンジル−ＤＴＰＡとの１：１混合物を含む二官能性キレート剤（すなわち、ＭＸ−ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸））を介して^１１１Ｉｎに結合したヒトＣＤ２０抗原に特異的なマウスモノクローナル抗体（２Ｂ８）を含む。^１１１Ｉｎは、約１ｍＣｉと約１０ｍＣｉとの間で検出可能な毒性もなく安全に投与することができるため、診断用放射性核種として特に好ましく、画像化データにより、一般に、その後の^９０Ｙ標識抗体分布を予想する。ほとんどの画像化研究は、安全かつより低い用量と比較して画像化効率が高く、抗体投与から３〜６日後に至適に画像化される用量であるため、５ｍＣｉの^１１１Ｉｎ標識抗体を使用する。例えば、Ｍｕｒｒａｙ，Ｊ．Ｎｕｃ．Ｍｅｄ．２６：３３２８（１９８５）およびＣａｒｒａｇｕｉｌｌｏｅｔａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃ．Ｍｅｄ．２６：６７（１９８５）を参照のこと。

上記のように、種々の放射性核種を本発明に適用可能であり、当業者はどの放射性核種が種々の環境下で最も適切であるかを容易に決定することができる。例えば、^１３１Ｉは、ターゲティング免疫療法で使用される周知の放射性核種である。しかし、いくつかの要因（８日間の物理的半減期；血液および腫瘍部位の両方におけるヨウ化抗体の脱ハロゲン化；および腫瘍における局在化用量の蓄積が最適以下であり得る放射特性（例えば、大量のγ成分）が含まれる）によって^１３１Ｉの臨床有用性は制限され得る。より優れたキレート剤の出現で、金属キレート基がタンパク質に結合する機会により、^１１１Ｉｎおよび^９０Ｙなどの他の放射性核種を利用する機会が増加した。^９０Ｙにより、放射性免疫療法への適用において以下の利用上のいくつかの利点が得られる：^９０Ｙの６４時間の半減期は^１３１Ｉと異なり腫瘍による蓄積を可能とするに充分な長さであり、^９０Ｙはその崩壊においてγ線照射を伴わず、組織の直径が１００〜１，０００細胞の範囲の、高エネルギーの純粋なβ線放射体である。さらに、透過性放射線量が最小であるため、外来患者への^９０Ｙ標識分子の投与が可能である。さらに、細胞の死滅に標識ポリペプチドの内在化は必要なく、電離放射線の局所放射は、標的抗原を欠く隣接腫瘍細胞も死滅させるはずである。

当業者は、これらの非放射性結合体を結合体化されるべき選択された薬剤に依存して種々の技術を使用してアセンブリすることもできることを認識する。例えば、ポリペプチドとビオチンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルなどのビオチンの活性化エステルとの反応によってビオチンとの結合体を調製する。同様に、カップリング剤（例えば、上記列挙のもの）の存在下またはイソチオシアネート、好ましくはフルオレセイン−イソチオシアネートとの反応によって蛍光マーカーとの結合体を調製することができる。本発明のポリペプチドと細胞増殖抑制物質／細胞毒性物質および金属キレートとの結合体を、類似の様式で調製する。

本発明での使用に好ましい薬剤は、細胞毒性薬、特に、癌治療で使用される細胞毒性薬である。本明細書中で使用される、「細胞毒素または細胞毒性薬」は、細胞の成長および増殖に有害であり、細胞または悪性腫瘍を減少、阻害、または破壊するように作用することができる任意の薬剤を意味する。例示的細胞毒素には、放射性核種、生物毒素、酵素活性毒素、細胞増殖抑制性または細胞毒性治療薬、プロドラッグ、免疫学的に活性なリガンド、およびサイトカインなどの生物反応修飾物質が含まれるが、これらに限定されない。免疫反応細胞または悪性腫瘍細胞の増殖を遅延させるかまたは減速させるように作用する任意の細胞毒素は、本発明の範囲内である。

例示的細胞毒素には、一般に、細胞増殖抑制薬、アルキル化剤、代謝拮抗物質、抗増殖薬、チューブリン結合剤、ホルモン、およびホルモンアンタゴニストなどが含まれる。本発明と適合可能な例示的細胞増殖抑制薬には、メクロレタミン、トリエチレンホスホラミド、シクロホスファミド、イフォスファミド、クロラムブシル、ブスルファン、メルファラン、またはトリアジクオン（ｔｒｉａｚｉｑｕｏｎｅ）などのアルキル化物質が含まれ、カルムスチン、ロムスチン、またはセムスチンなどのニトロソ尿素化合物も含まれる。他の好ましい細胞毒性薬のクラスには、例えば、薬物のメイタンシノイドファミリーが含まれる。他の好ましい細胞毒性薬クラスには、例えば、薬物のアントラサイクリンファミリー、ビンカ薬、マイトマイシン、ブレオマイシン、細胞毒性ヌクレオシド、薬物のプテリジンファミリー、ジイネン（ｄｉｙｎｅｎｅ）、およびポドフィロトキシンが含まれる。これらのクラスの特に有用なメンバーには、例えば、アドリアマイシン、カルミノマイシン、ダウノルビシン（ダウノマイシン）、ドキソルビシン、アミノプテリン、メトトレキサート、メトプテリン、ミトラマイシン、ストレプトニグリン、ジクロロメトトレキセート、マイトマイシンＣ、アクチノマイシンＤ、ポルフィロマイシン、５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、フトラフール、６−メルカプトプリン、シタラビン、シトシンアラビノサイド、ポドフィロトキシン、あるいはエトポシドまたはリン酸エトポシドなどのポドフィロトキシン誘導体、メルファラン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ロイロシジン、ビンデシン、およびロイロシンなどが含まれる。本明細書中の技術に適合可能なさらに他の細胞毒素には、タキソール、タキサン、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロミド、エメチン、テノポシド、コルヒチン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、ならびにそれらのアナログまたはホモログが含まれる。ホルモンおよびホルモンアンタゴニスト（コルチコステロイド（例えば、プレドニゾン）、プロゲスチン（例えば、ヒドロキシプロゲステロンまたはメドロプロゲステロン）、エストロゲン（例えば、ジエチルスチルベストロール）、抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン）、アンドロゲン（例えば、テストステロン）、およびアロマターゼインヒビター（例えば、アミノグルテチミド）など）も本明細書中の教示に適合可能である。前に記載のように、当業者は、所望の化合物の反応を本発明の結合体の調製により都合よくするために、所望の化合物を化学修飾することができる。

特に好ましい細胞毒素の１つの例は、抗腫瘍抗生物質のエネジインファミリーのメンバーまたは誘導体（カリケアミシン、エスペラミシン、またはダイネミシンが含まれる）を含む。これらの毒素は非常に強力であり、核ＤＮＡの切断によって作用し、細胞を死滅させる。ｉｎｖｉｖｏで切断して多数の不活性であるが免疫原性を示すポリペプチドフラグメントが得られ得るタンパク質毒素と異なり、カリケアミシン、エスペラミシン、および他のエネジインなどの毒素は本質的に非免疫原性の小分子である。これらの非ペプチド毒素を、モノクローナル抗体および他の分子を標識するために以前より使用されている技術によって二量体または四量体に化学結合する。これらの連結技術には、構築物のＦｃ部分上のみに存在するＮ結合糖残基を介した部位特異的結合が含まれる。このような部位特異的結合方法は、構築物の結合特性に対して結合が及ぼす可能性のある影響を減少させるという利点がある。

前に暗示するように、適合可能な細胞毒素は、プロドラッグを含み得る。本明細書中で得使用される、用語「プロドラッグ」は、親薬物と比較して腫瘍細胞に対する細胞毒性が低く、より活性な親形態に酵素的に活性化するかまたは変換することができる薬学的に活性な物質の前駆体形態または誘導体形態をいう。本発明に適合可能なプロドラッグには、より活性な細胞傷害遊離薬物に変換することができる、ホスフェート含有プロドラッグ、チオホスフェート含有プロドラッグ、スルフェート含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、β−ラクタム含有プロドラッグ、任意選択的に置換されたフェノキシアセトアミド含有プロドラッグ、または任意選択的に置換されたフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、５−フルオロシトシンプロドラッグおよび他の５−フルオロウリジンプロドラッグが含まれるが、これらに限定されない。本発明で使用するためのプロドラッグ形態に誘導体化することができる細胞毒性薬のさらなる例は、上記の化学療法薬を含む。

他の細胞毒素のうち、ポリペプチドを、リシンサブユニットＡ、アブリン、ジフテリア毒素、ボツリヌス菌、シアンギノシン（ｃｙａｎｇｉｎｏｓｉｎｓ）、サキシトキシン、シガトキシン、破傷風、テトロドトキシン、トリコテセン、ベルコロゲン（ｖｅｒｒｕｃｏｌｏｇｅｎ）、または有毒酵素などの生物毒素に会合することもできることが認識される。好ましくは、結合分子−毒素構築物を直接発現させる遺伝子操作技術を使用して、このような構築物を作製する。本発明のポリペプチドに会合することができる他の生物反応修飾物質は、リンホカインおよびインターロイキンなどのサイトカインを含む。本開示を考慮して、当業者が従来技術を使用してこのような構築物を容易に形成することができることを提示する。

開示のポリペプチドと組み合わせて使用することができる適合可能な別のクラスの細胞毒素は、腫瘍または免疫反応細胞に有効に指向することができる放射線増感剤である。このような薬物は、電離放射線に対する感受性を増強し、それによって放射線治療の有効性を増大させる。腫瘍細胞によって内在化された結合体は、放射線増感が最大になる核のより近くに放射線増感剤を送達させる。本発明の非結合放射線増感剤結合ポリペプチドは、血液から迅速にクリアランスされ、標的腫瘍中の残存する放射線増感剤が局在し、正常組織への取り込みを最小にする。血液からの迅速なクリアランス後、補助的放射線療法を以下の３つの方法のうちの１つで投与する：１）腫瘍に特異的に指向する外部ビーム照射、２）腫瘍への放射能の直接埋め込み、または３）同一のターゲティング分子を使用した全身放射線免疫療法。このアプローチの潜在的に魅力的なバリエーションは、放射線増感免疫結合体への治療放射性同位体の結合およびそれによる単一の薬物の患者への都合の良い投与の提供である。

１つの実施形態では、ポリペプチドの安定性または有効性を増強する部分を結合体化することができる。例えば、１つの実施形態では、ｉｎｖｉｖｏでの半減期を増加させるためにＰＥＧを本発明のポリペプチドに結合体化することができる。Ｌｅｏｎｇ，Ｓ．Ｒ．，ｅｔａｌ．２００１．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ１６：１０６；２００２；Ａｄｖ．ｉｎＤｒｕｇＤｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５４：５３１；またはＷｅｉｒｅｔａｌ．２００２．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ３０：５１２。

（ＶＩ．ポリペプチドの投与）
本発明のポリペプチドの調製方法および被験体への投与方法は周知であるか、または当業者によって容易に決定される。本発明のポリペプチドの投与経路は、経口、非経口、吸入、または局所であり得る。本明細書中で使用される、用語「非経口」には、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、直腸、または膣への投与が含まれる。非経口投与の静脈内、動脈内、皮下、および筋肉内形態が一般に好ましい。これらの全投与形態は、本発明の範囲内であることが明らかに意図される一方で、投与形態は、注射、特に、静脈内もしくは動脈内の注射または滴注のための溶液である。通常、注射に適切な薬学的組成物は、緩衝液（例えば、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、またはクエン酸緩衝液）、界面活性剤（例えば、ポリソルベート）、任意選択的に、安定剤（例えば、ヒトアルブミン）などを含み得る。しかし、本明細書中の教示に適合可能な他の方法では、ポリペプチドを直接有害な細胞集団部位に送達させ、それによって治療薬への罹患組織の曝露を増加させることができる。

非経口投与用の調製物には、滅菌の水性または非水性の溶液、懸濁液、および乳濁液が含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルである。水性キャリアには、水、アルコール／水性の溶液、乳濁液、または懸濁液（生理食塩水および緩衝化溶剤が含まれる）が含まれる。本発明では、薬学的に許容可能なキャリアには、０．０１〜０．１Ｍ、好ましくは０．０５Ｍのリン酸緩衝液または０．８％生理食塩水が含まれるが、これらに限定されない。他の一般的非経口賦形剤には、リン酸ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース、および塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル液、または不揮発性油が含まれる。静脈内賦形剤には、流動物および栄養補給物、および電解質補給物（リンゲルデキストロースに基づくものなど）などが含まれる。例えば、抗菌薬（ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ）、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなどの防腐剤および他の添加物も存在し得る。より詳細には、注射用途に適切な薬学的組成物には、滅菌されていて水性の溶液（水溶性の場合）または分散液および滅菌されていて注射可能な溶液または分散液の即時調製のための滅菌粉末が含まれる。このような場合、組成物は滅菌されていなければならず、シリンジでの使用が容易な範囲の流動物であるべきである。それは製造および保存の条件下で安定であるべきであり、好ましくは、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保存される。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびその適切な混合物を含む溶媒または分散媒であり得る。例えば、レシチンなどのコーティングの使用、必要な粒子サイズの維持（分散液の場合）、および界面活性剤の使用によって適切な流動性を維持することができる。種々の抗菌薬（ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ）および抗真菌薬（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、およびチメロサールなど）によって、微生物作用を防止することができる。多くの場合、組成物中に等張化剤（例えば、糖、ポリアルコール（マンニトール、ソルビトールなど）、または塩化ナトリウム）を含むことが好ましい。組成物中に吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）を含めることによって、注射用組成物の長期吸収を達成することができる。

任意の場合、本明細書中に列挙した成分の１つまたは組み合わせを必要に応じて含む適切な溶媒中に必要量の活性化合物（例えば、ポリペプチド単独または他の活性剤との組み合わせ）を組み込み、濾過滅菌することによって、滅菌注射溶液を調製することができる。一般に、基剤となる分散媒および上記列挙の必要な他の成分を含む滅菌賦形剤への活性化合物の組み込みによって分散液を調製する。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、既に濾過滅菌したその溶液由来の有効成分および任意のさらなる所望の成分の粉末が得られる真空乾燥および凍結乾燥である。当該分野で公知の方法にしたがって、注射用調製物を処理し、アンプル、バッグ、ボトル、シリンジ、またはバイアルなどの容器に充填し、無菌条件下で密封する。さらに、調製物をパッケージングし、同時係属米国特許出願番号０９／２５９，３３７号および米国特許出願番号０９／２５９，３３８号（それぞれ本明細書中で参考として援用される）に記載されるキットなどのキットの形態で販売することができる。このような製品は、付随の組成物が自己免疫障害または新生物障害を罹患しているかまたは罹患しやすい被験体の治療に有用であることを示すラベルまたは添付文書を有することが好ましい。

上記病態の治療のための本発明の組成物の有効用量は、多数の異なる要因（投与手段、標的部位、患者の身体の状態、患者がヒトであるかまたは動物であるか、他の投与される薬物、および治療が予防であるかまたは治療であるのかが含まれる）に依存して変化する。通常、患者はヒトであるが、トランスジェニック哺乳動物を含む非ヒト哺乳動物も治療することができる。安全性および有効性を至適化するために当業者に公知の日常的方法を使用して、治療用量を漸増（ｔｉｔｒａｔｅ）することができる。抗体を使用した受動免疫法のために、投薬量は、例えば、約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ宿主体重、より通常には約０．０１〜５ｍｇ／ｋｇ宿主体重（例えば、０．０２ｍｇ／ｋｇ宿主体重、０．２５ｍｇ／ｋｇ宿主体重、０．５ｍｇ／ｋｇ宿主体重、０．７５ｍｇ／ｋｇ宿主体重、１ｍｇ／ｋｇ宿主体重、２ｍｇ／ｋｇ宿主体重など）の範囲であり得る。例えば、投薬量は、１ｍｇ／ｋｇ体重または１０ｍｇ／ｋｇ体重または１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内、好ましくは少なくとも１ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。上記範囲の中間値も本発明の範囲内に含まれることが意図される。被験体にこのような用量を毎日、隔日、毎週、または経験的分析によって決定した任意の他のスケジュールにしたがって投与することができる。例示的治療は、（例えば、少なくとも６ヶ月の）長期間にわたる複数回投薬量での投与を必要とする。さらなる例示的治療投与計画は、２週間毎に１回または１ヶ月毎に１回または３ヶ月〜６ヶ月毎に１回の投与を必要とする。例示的投薬計画には、１〜１０ｍｇ／ｋｇまたは１５ｍｇ／ｋｇを毎日、３０ｍｇ／ｋｇを隔日、または６０ｍｇ／ｋｇを毎週が含まれる。いくつかの方法では、異なる結合特異性を有する２つまたはそれより多くのモノクローナル抗体を同時に投与し、その場合、投与される各抗体の投薬量は表示される範囲内に入る。

本発明のポリペプチドを複数の時間に投与することができる。単回投与の間の間隔は、週、月、または年であり得る。患者の血中ポリペプチドレベルまたは抗原レベルの測定によって示されるように、間隔は不規則でもあり得る。いくつかの方法では、１〜１０００μｇ／ｍＬ、いくつかの方法では２５〜３００μｇ／ｍＬの血漿ポリペプチド濃度を達成するように投薬量を調整する。あるいは、結合分子を徐放性処方物として投与することができ、この場合、必要な投与頻度は低くなる。投薬量および投与頻度は、患者中の分子の半減期に依存して変化する。一般に、ヒト化抗体は、最も長い半減期を示し、キメラ抗体および非ヒト抗体がこれに続く。１つの実施形態では、本発明の結合分子を、非結合体化形態で投与することができる。別の実施形態では、本発明のポリペプチドを結合体化形態で複数回投与することができる。さらに別の実施形態では、本発明の結合分子を非結合体化形態で投与し、その後結合体化形態で投与するか、その逆で投与することができる。

投薬量および投与頻度は、治療が予防または治療のいずれであるかに依存して変化し得る。予防適用では、本発明のポリペプチドまたはそのカクテルを含む組成物を患者の抵抗力を強化するために依然として病状を示していない患者に投与する。このような量を、「予防的有効用量」と定義する。この用途では、正確な量は、患者の健康状態および全身免疫（ｇｅｎｅｒａｌｉｍｍｕｎｉｔｙ）にも依存するが、一般に、０．１〜２５ｍｇ／用量、詳細には、０．５〜２．５ｍｇ／用量の範囲である。比較的低い投薬量を比較的遠く離れた間隔で長期間投与する。いくつかの患者は、その余命にわたり治療を受け続ける。

治療適用では、疾患の進行が減速または終結するまで、好ましくは患者が疾患の症状の部分的または完全な緩和を示すまで、しばしば比較的短い間隔での比較的高い投薬量（例えば、約１〜４００ｍｇ／ｋｇ抗体／用量、５〜２５ｍｇの投薬量が放射性免疫結合体ではより一般的に使用され、より高い用量が細胞毒素−薬物結合体化分子で使用される）を必要とする。その後、患者に予防的投与計画を実施することができる。

１つの実施形態では、被験体を、（例えば、ベクター中の）本発明のポリペプチドをコードする核酸分子で治療することができる。ポリペプチドをコードする核酸の投与量は、約１０ｎｇ〜１ｇ、１００ｎｇ〜１００ｍｇ、１μｇ〜１０ｍｇ、または３０〜３００μｇＤＮＡ／患者の範囲である。感染性ウイルスベクターの用量は、用量あたり１０〜１００個またはそれより多くのビリオンで変化する。

予防および／または治療上の処置のために非経口、局所、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、腹腔内、鼻腔内、または筋肉内の手段で治療薬を投与することができる。免疫原性薬剤の最も典型的な投与経路は皮下であるが、他の経路も同等に有効であり得る。次に最も一般的な経路は、筋肉内注射である。この注射型は、腕または脚の筋肉で最も一般的に実施される。いくつかの方法では、薬剤を沈着物が蓄積する特定の組織に直接注射する（例えば、頭蓋内注射）。分子の投与には筋肉内注射または静脈内注入が好ましい。いくつかの方法では、特定の治療分子を、頭蓋内に直接注射する。いくつかの方法では、分子を徐放性組成物またはデバイス（Ｍｅｄｉｐａｄ^ＴＭデバイスなど）として投与する。

本発明の薬剤を、任意選択的に、治療を必要とする障害または病態の治療（例えば、予防的または治療的）に有効な他の薬剤と組み合わせて投与することができる。

本発明の^９０Ｙ標識ポリペプチドの有効な単回治療投薬量（すなわち、治療有効量）は、約５ｍＣｉと約７５ｍＣｉとの間、より好ましくは約１０ｍＣｉと約４０ｍＣｉとの間の範囲である。^１３１Ｉ標識抗体の有効単回治療非骨髄切除投薬量は、約５ｍＣｉと約７０ｍＣｉとの間、より好ましくは約５ｍＣｉと約４０ｍＣｉとの間の範囲である。^１３１Ｉ標識抗体の有効単回治療切除投薬量（すなわち、自家骨髄移植が必要であり得る）は、約３０ｍＣｉと約６００ｍＣｉとの間、より好ましくは約５０ｍＣｉと約５００ｍＣｉ未満との間の範囲である。キメラ抗体（マウス抗体と比較して循環半減期がより長いため）と組み合わせて、ヨウ素^１３１標識キメラ抗体の有効単回治療非骨髄切除投薬量は、約５ｍＣｉと約４０ｍＣｉとの間、より好ましくは約３０ｍＣｉ未満の範囲である。例えば、^１１１Ｉｎ標識の画像化基準は、典型的には約５ｍＣｉ未満である。

非常に多数の臨床経験が^１３１Ｉおよび^９０Ｙで得られている一方で、他の放射性標識が当該分野で公知であり、類似の目的で使用されている。さらに他の放射性同位体を画像化に使用する。例えば、本発明の範囲に適合するさらなる放射性同位体には、^１２３Ｉ、^１２５Ｉ、^３２Ｐ、^５７Ｃｏ、^６４Ｃｕ、^６７Ｃｕ、^７７Ｂｒ、^８１Ｒｂ、^８１Ｋｒ、^８７Ｓｒ、^１１３Ｉｎ、^１２７Ｃｓ、^１２９Ｃｓ、^１３２Ｉ、^１９７Ｈｇ、^２０３Ｐｂ、^２０６Ｂｉ、^１７７Ｌｕ、^１８６Ｒｅ、^２１２Ｐｂ、^２１２Ｂｉ、^４７Ｓｃ、^１０５Ｒｈ、^１０９Ｐｄ、^１５３Ｓｍ、^１８８Ｒｅ、^１９９Ａｕ、^２２５Ａｃ、^２１１Ａｔ、および^２１３Ｂｉが含まれるが、これらに限定されない。これに関して、α、γ、およびβ放射体は全て本発明に適合する。さらに、本開示を考慮して、当業者は過度の実験を行うことなくどの放射性核種が選択された治療方針（ｃｏｕｒｓｅ）に適合するかを容易に決定することができることを提示する。この目的を達成するために、臨床診断で既に使用されているさらなる放射性核種には、^１２５Ｉ、^１２３Ｉ、^９９Ｔｃ、^４３Ｋ、^５２Ｆｅ、^６７Ｇａ、^６８Ｇａ、および^１１１Ｉｎが含まれる。抗体はまた、ターゲティング免疫治療での潜在的使用のために、種々の放射性核種で標識されている（Ｐｅｉｒｅｒｓｚｅｔａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．６５：１１１−１２５（１９８７））。これらの放射性核種には、^１８８Ｒｅおよび^１８６Ｒｅならびにより小さな範囲では^１９９Ａｕおよび^６７Ｃｕが含まれる。米国特許第５，４６０，７８５号は、このような放射性同位体に関するさらなるデータを提供し、本明細書中で参考として援用される。

本発明のポリペプチドが結合体化形態または非結合体化形態で使用されているかまたは使用されていないかにかかわらず、本発明の主な利点は、骨髄抑制患者、特に放射線療法または化学療法などの補助的治療を受けているかまたは受けた患者におけるこれらのポリペプチドを使用する能力であることが認識される。すなわち、ポリペプチドの有利な送達プロフィール（すなわち、比較的短い血清存在時間、高結合親和性、および局在化の増強）により、赤色骨髄の貯蔵が減少して骨髄毒性に感受性である患者の治療に特に有用となる。これに関して、ポリペプチドの固有の送達プロフィールにより、これらは骨髄抑制癌患者に対する放射性標識結合体の投与を非常に有効にする。したがって、結合体化形態または非結合体化形態の本発明のポリペプチドは、外部ビーム照射または化学療法などの補助的療法を以前に受けた患者において有用である。他の好ましい実施形態では、ポリペプチド（この場合も結合体化形態または非結合体化形態）を、化学療法薬を使用した併用療法投与計画で使用することができる。当業者は、このような治療計画は、開示の分子および１つまたは複数の化学療法薬の連続的、同時、並行（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ）、または同延（ｃｏｅｘｔｅｎｓｉｖｅ）投与を含み得ることを認識する。本発明のこの態様の特に好ましい実施形態は、放射性標識ポリペプチドの投与を含む。

ポリペプチドを直前に記載のように投与することができる一方で、他の実施形態では、結合体化ポリペプチドおよび非結合体化ポリペプチドを第一治療薬（ｆｉｒｓｔｌｉｎｅｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｇｅｎｔ）として他の点では健常な患者に投与することができることを強調しなければならない。このような実施形態では、正常もしくは平均的な赤色骨髄貯蔵を有する患者および／または外部ビーム照射もしくは化学療法などの補助的療法を現在または過去に受けていない患者にポリペプチドを投与することができる。

しかし、上記で考察するように、本発明の選択された実施形態は、骨髄抑制患者へのポリペプチドの投与または放射線療法または化学療法などの１つまたは複数の補助的療法との組み合わせもしくは併用（すなわち、併用療法投与計画）でのポリペプチドの投与を含む。本明細書中で使用される、「補助的療法と併用または組み合わせたポリペプチドの投与」は、治療および開示された分子の連続的、同時、同延、並行、付随的、または同時期（ｃｏｎｔｅｍｐｏｒａｎｅｏｕｓ）の投与または適用を意味する。当業者は、併用療法の投与計画の種々の成分の投与または適用を治療の全有効性が増強するように時間設定することができることを認識する。例えば、標準的な周知の治療方針で化学療法薬を投与し、その後数週間以内に本発明の放射免疫結合体を投与することができる。逆に、細胞毒素会合ポリペプチドを静脈内投与し、その後腫瘍局在化外部ビーム照射を行うことができる。さらに他の実施形態では、１回の外来診療で１つまたは複数の選択した化学療法薬と同時にポリペプチドを投与することができる。当業者（例えば、経験豊かな癌専門医）は、選択された補助的療法および本明細書の教示に基づいて過度に実験することなく有効な併用療法の投与計画を容易に識別することができる。

これに関して、ポリペプチド（細胞毒素を含むか含まない）と化学療法薬との組み合わせを患者に治療による利点が得られる任意の順序および任意の時間枠で投与することができることが認識される。すなわち、化学療法薬およびポリペプチドを任意の順序または同時に投与することができる。選択された実施形態では、本発明のポリペプチドを、以前に化学療法を受けた患者に投与する。さらに他の実施形態では、ポリペプチドおよび化学療法薬での治療を、実質的に同時にまたは並行して投与する。例えば、患者に結合分子を投与しながら一連の化学療法を受けさせることができる。好ましい実施形態では、任意の化学療法薬または治療の１年以内に結合分子を投与する。他の好ましい実施形態では、任意の化学療法薬または治療の１０ヶ月、８ヶ月、６ヶ月、４ヶ月、または２ヶ月以内にポリペプチドを投与する。さらに他の好ましい実施形態では、任意の化学療法薬または治療の４週間、３週間、２週間、または１週間以内にポリペプチドを投与する。さらに他の好ましい実施形態では、選択された化学療法薬または治療の５日間、４日間、３日間、２日間、または１日以内にポリペプチドを投与する。２つの薬剤または治療を約数時間または数分以内に患者に投与することができる（すなわち、実質的に同時に）ことがさらに認識される。

さらに、本発明によれば、骨髄抑制患者は、血球数が減少した任意の患者を意味するものとする。当業者は、骨髄抑制の臨床的指標として従来から使用されているいくつかの血球数パラメータが存在し、患者で起こった骨髄抑制の範囲を容易に測定することができることを認識する。認められている骨髄抑制測定の例は、絶対好中球数（ＡＮＣ）または血小板数である。このような免疫抑制または部分的骨髄切除は、種々の生化学的障害または疾患の結果であり得るか、またはむしろ以前の化学療法または放射線療法の結果であり得る。これに関して、当業者は、伝統的化学療法を受けた患者は典型的には赤色骨髄貯蔵が減少することを認識する。上記で考察するように、死亡率または罹患率が増加することになる、貧血または免疫抑制などの受け入れられない副作用によって最適レベルの細胞毒素（すなわち、放射性核種）を使用してこのような被験体を治療することはしばしばできない。

より詳細には、本発明の結合体化ポリペプチドまたは非結合体化ポリペプチドを使用して、約２０００／ｍｍ^３未満のＡＮＣまたは約１５０，０００／ｍｍ^３未満の血小板数の患者を有効に治療することができる。より好ましくは、本発明のポリペプチドを使用して、約１５００／ｍｍ^３未満、約１０００／ｍｍ^３未満、さらにより好ましくは約５００／ｍｍ^３未満のＡＮＣの患者を治療することができる。同様に、本発明のポリペプチドを使用して、約７５，０００／ｍｍ^３未満、約５０，０００／ｍｍ^３未満、またはさらに約１０，０００／ｍｍ^３未満の血小板数の患者を治療することができる。より一般的な意味では、当業者は、政府が実施しているガイドラインおよび手順を使用して、患者が骨髄抑制されているかどうかを容易に決定することができる。

上記のように、多数の骨髄抑制患者は、化学療法、インプラント放射線療法、または外部ビーム放射線療法を含む一連の治療を受けている。後者の場合、外部放射線源は、悪性腫瘍の局所照射用である。放射線移植法のために、放射性試薬を外科的に悪性腫瘍内に配置し、それによって疾患部位を選択的に照射する。任意の事象では、開示したポリペプチドを使用して、原因と無関係に骨髄抑制を示す患者の障害を治療することができる。

これに関して、本発明のポリペプチドを、（例えば、併用療法の投与計画を得るために）ｉｎｖｉｖｏで新生物細胞の増殖を消失、減少、阻害、または調節する任意の化学療法薬と併用するかまたは組み合わせて使用することができることがさらに認識される。考察されるように、このような薬剤により、しばしば赤色骨髄貯蔵が減少する。この減少の全部または一部を、本発明の化合物の骨髄毒性の減少によって相殺することができ、これにより、このような患者の新形成を有利に積極的に治療することが許容される。他の好ましい実施形態では、本明細書中に開示の放射性標識免疫結合体を、新生物細胞の放射性核種に対する感受性を増加させる放射線増感剤と共に有効に使用することができる。例えば、腫瘍部位には依然として治療有効レベルで放射性標識結合物質が保持されているが、血流からその大部分をクリアランスした後に放射線増感化合物を投与することができる。

本発明のこれらの態様に関して、本発明に適合可能な例示的化学療法薬には、アルキル化剤、ビンカアルカロイド（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）、プロカルバジン、メトトレキセート、およびプレドニゾンが含まれる。４つの薬物組み合わせであるＭＯＰＰ（メクレタミン（ナイトロジェンマスタード）、ビンクリスチン（オンコビン）、プロカルバジン、およびプレドニゾン）は種々のリンパ腫型の治療で非常に有効であり、本発明の好ましい実施形態を構成する。ＭＯＰＰ耐性患者では、ＡＢＶＤ（例えば、アドリアマイシン、ブレオマイシン、ビンブラスチン、およびダカルバジン）、ＣｈｌＶＰＰ（クロラムブシル、ビンブラスチン、プロカルバジン、およびプレドニゾン）、ＣＡＢＳ（ロムスチン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、およびストレプトゾトシン）、ＭＯＰＰ＋ＡＢＶＤ、ＭＯＰＰ＋ＡＢＶ（ドキソルビシン、ブレオマイシン、およびビンブラスチン）、またはＢＣＶＰＰ（カルムスチン、シクロホスファミド、ビンブラスチン、プロカルバジン、およびプレドニゾン）の組み合わせを使用することができる。標準的な投与およびスケジューリングについては、ＡｒｎｏｌｄＳ．ＦｒｅｅｄｍａｎａｎｄＬｅｅＭ．Ｎａｄｌｅｒ，ＭａｌｉｇｎａｎｔＬｙｍｐｈｏｍａｓ，ｉｎＨＡＲＲＩＳＯＮ’ＳＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳＯＦＩＮＴＥＲＮＡＬＭＥＤＩＣＩＮＥ１７７４−１７８８（ＫｕｒｔＪ．Ｉｓｓｅｌｂａｃｈｅｒｅｔａｌ．，ｅｄｓ．，１３ｔｈｅｄ．１９９４）およびＶ．Ｔ．ＤｅＶｉｔａｅｔａｌ．，（１９９７）およびその参考文献。これらの療法を、変化させないか、または特定の患者の必要に応じて変化させて、本明細書中に記載の１つまたは複数の本発明のポリペプチドと組み合わせて使用することができる。

本発明の文脈で有用なさらなる投与計画には、シクロホスファミドまたはクロラムブシルなどの１つのアルキル化剤またはＣＶＰ（シクロホスファミド、ビンクリスチン、およびプレドニゾン）、ＣＨＯＰ（ＣＶＰおよびドキソルビシン）、Ｃ−ＭＯＰＰ（シクロホスファミド、ビンクリスチン、プレドニゾン、およびプロカルバジン）、ＣＡＰ−ＢＯＰ（ＣＨＯＰ＋プロカルバジンおよびブレオマイシン）、ｍ−ＢＡＣＯＤ（ＣＨＯＰ＋メトトレキセート、ブレオマイシン、およびロイコボリン）、ＰｒｏＭＡＣＥ−ＭＯＰＰ（プレドニゾン、メトトレキセート、ドキソルビシン、シクロホスファミド、エトポシド、およびロイコボリン＋標準的ＭＯＰＰ）、ＰｒｏＭＡＣＥ−ＣｙｔａＢＯＭ（プレドニゾン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、エトポシド、シタラビン、ブレオマイシン、ビンクリスチン、メトトレキセート、およびロイコボリン）、およびＭＡＣＯＰ−Ｂ（メトトレキセート、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、固定用量のプレドニゾン、ブレオマイシン、およびロイコボリン）などの組み合わせの使用が含まれる。当業者は、これらの各投与計画のための標準的な投薬量およびスケジューリングを容易に決定することができる。ＣＨＯＰを、ブレオマイシン、メトトレキセート、プロカルバジン、ナイトロジェンマスタード、シトシンアラビノシド、およびエトポシドとも組み合わせた。他の適合可能な化学療法薬には、２−クロロデオキシアデノシン（２−ＣＤＡ）、２’−デオキシコホルマイシン、およびフルダラビンが含まれるが、これらに限定されない。

寛解を達成できないか、または再発する中等度および高悪性度のＮＨＬを罹患した患者のために、救助療法を使用する。救助療法は、シトシンアラビノシド、シスプラチン、エトポシド、およびイフォスファミドなどの薬物を単独または組み合わせて使用する。再発または進行性形態の一定の新生物障害では、以下のプロトコールをしばしば使用する：ＩＭＶＰ−１６（イフォスファミド、メトトレキセート、およびエトポシド）、ＭＩＭＥ（メチル−ｇａｇ、イフォスファミド、メトトレキセート、およびエトポシド）、ＤＨＡＰ（デキサメタゾン、高用量シタラビン、およびシスプラチン）、ＥＳＨＡＰ（エトポシド、メチルプレドニゾン、ＨＤシタラビン、シスプラチン）、ＣＥＰＰ（Ｂ）（シクロホスファミド、エトポシド、プロカルバジン、プレドニゾン、およびブレオマイシン）、およびＣＡＭＰ（ロムスチン、ミトキサントロン、シタラビン、およびプレドニゾン）（それぞれ周知の投与速度およびスケジュールを使用する）。

本発明のポリペプチドと組み合わせて使用すべき化学療法薬の量を被験体によって変化させることができるか、当該分野で公知のように投与することができる。例えば、ＢｒｕｃｅＡＣｈａｂｎｅｒｅｔａｌ．，ＡｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃＡｇｅｎｔｓ，ｉｎＧＯＯＤＭＡＮ＆ＧＩＬＭＡＮ’ＳＴＨＥＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＩＣＡＬＢＡＳＩＳＯＦＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ１２３３−１２８７（（ＪｏｅｌＧ．Ｈａｒｄｍａｎｅｔａｌ．，ｅｄｓ．，９ｔｈｅｄ．１９９６）を参照のこと。前に考察するように、本発明のポリペプチド、その免疫反応性フラグメント、またはその組換え体を、哺乳動物障害のｉｎｖｉｖｏ治療のための薬学的有効量で投与することができる。これに関して、開示の結合分子を、投与を容易にして活性成分の安定性を促進するように処方することが認識される。好ましくは、本発明に関する薬学的組成物は、生理食塩水、非毒性緩衝液、および防腐剤などの薬学的に許容可能な非毒性滅菌キャリアを含む。本発明の目的のために、治療薬と結合体化しているか結合体化していない薬学的有効量のポリペプチド、免疫反応性フラグメント、またはその組換え体は、抗原への有効な結合を達成して利益を得る（例えば、疾患もしくは障害の症状の改善または物質もしくは細胞の検出）のに十分な量を意味するものとする。腫瘍細胞の場合、ポリペプチドは、好ましくは、新生物細胞または免疫反応性細胞上の選択された免疫反応性抗原と相互作用してこれらの細胞の死を増大させることができる。勿論、薬学的有効量のポリペプチドを得るために、本発明の薬学的組成物を単回または複数回投与することができる。

本開示の範囲と一致して、本発明のポリペプチドを、上記治療方法にしたがって治療または予防効果を得るのに十分な量でヒトまたは他の動物に投与することができる。本発明の結合分子を、公知の技術にしたがって本発明の結合分子と従来の薬学的に許容可能なキャリアまたは希釈剤とを組み合わせることによって調製された従来の投薬形態でこのようなヒトまたは他の動物に投与することができる。当業者は、薬学的に許容可能なキャリアまたは希釈剤の形態および特徴は、組み合わされる有効成分の量、投与経路、および他の周知の変数によって決定されることを認識する。当業者は、本発明のポリペプチドの１つまたは複数の種を含むカクテルが特に有効であると証明することができることをさらに認識する。

（ＶＩＩ．使用方法）
本発明のポリペプチドを、診断または治療目的で使用することができる。本発明の好ましい実施形態は、このような治療を必要とする哺乳動物被験体の障害（例えば、新生物障害）の診断および／または治療のための化合物、組成物、キット、および方法を提供する。被験体はヒトであるのが好ましい。

本発明のポリペプチドは、多数の異なる適用で有用である。例えば、１つの実施形態では、本発明の結合分子は、本発明の結合分子によって認識されるエピトープを保有する細胞の減少または消失に有用なはずである。別の実施形態では、本発明の結合分子は、循環中の可溶性抗原の濃度の減少または消失に有効である。

１つの実施形態では、腫瘍サイズ、腫瘍成長の阻害、および／または腫瘍保有動物の生存期間の延長。したがって、本発明はまた、有効な非毒性量のポリペプチドのヒトまたは動物への投与による、ヒトまたは他の動物における腫瘍の治療方法に関する。当業者は、日常的な実験によって、ポリペプチドの悪性腫瘍の治療目的に有効な非毒性の量を決定することができる。例えば、ポリペプチドの治療活性量は、疾患の病期（例えば、病期ＩＶに対して病期Ｉ）、年齢、性別、合併症（例えば、免疫抑制病態または疾患）、および被験体の体重、分子が被験体中で所望の応答を誘発する能力などの要因によって変化し得る。至適な治療応答が得られるように投薬計画を調整することができる。例えば、いくつかの分割用量を毎日投与するか、緊急な治療状況で示された用量を比例的に減少させることができる。しかし、一般に、有効投薬量は、約０．０５〜１００ｍｇ／ｋｇ体重／日、より好ましくは約０．５〜１０ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲と予想される。

明確にする目的で、「哺乳動物」は、ヒト、家畜、および動物園、競技用、またはペット動物（イヌ、ウマ、ネコ、ウシなど）を含む哺乳動物として分類される任意の動物をいう。好ましくは、哺乳動物はヒトである。

「治療」は、治療上の処置および予防的または防止手段の両方をいう。治療を必要とする者には、既に疾患または障害を有する者および疾患または障害を防止すべき者が含まれる。したがって、哺乳動物を、疾患または障害を有するか、疾患にかかりやすいか感受性を示し得ると診断することができる。

上記で考察するように、本発明のポリペプチドは、１つまたは複数の腫瘍抗原または免疫障害に関連する抗原に免疫反応性を示し得る。例えば、新生物障害では、開示のポリペプチドの抗原結合部位（すなわち、可変領域またはその免疫反応性フラグメントもしくは組換え体）は、悪性腫瘍部位で選択された腫瘍関連抗原に結合する。同様に、免疫障害（自己免疫障害が含まれる）では、開示のポリペプチドは、原因細胞（ｏｆｆｅｎｄｉｎｇｃｅｌｌ）上の選択されたマーカーに結合する。報告された新形成障害および免疫障害に関連する抗原数および関連抗体数を考慮して、当業者は、現在開示されているポリペプチドは多数の全抗体の任意の１つに由来し得ることを認識する。より一般には、本発明で有用なポリペプチドは、選択された病態に関連する分子またはマーカーと反応する任意の抗体（以前に文献で報告された抗体が含まれる）から得ることができるかこれに由来し得る。さらに、開示のポリペプチドの作製に使用した親抗体もしくは前駆抗体またはそのフラグメントは、マウス抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、非ヒト霊長類抗体、または霊長類化抗体であり得る。他の好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドは、本明細書中に記載の変化した定常ドメインを有する単鎖抗体構築物（米国特許第５，８９２，０１９号（本明細書中で参考として援用される）に開示されるものなど）を含み得る。したがって、本明細書中の教示にしたがって修飾したこれらの任意の抗体型は、本発明に適合する。

本明細書中で使用される、「腫瘍関連抗原」は、一般に腫瘍細胞に関連する（すなわち、正常細胞と比較して同一またはより高い程度に生じる）任意の抗原を意味する。より一般には、腫瘍関連抗原は、免疫反応性抗体を非悪性細胞上でのその発現と無関係に新生物細胞に局在化する任意の抗原を含む。このような抗原は比較的腫瘍特異的であり、悪性細胞の表面にその発現が制限され得る。あるいは、このような抗原を、悪性細胞および非悪性細胞の両方の上に見出すことができる。例えば、ＣＤ２０は、非ホジキンリンパ腫の治療のための免疫治療抗体の非常に有効な標的であることが証明されている悪性および非悪性の両方のＢ細胞の表面上で見出されるｐａｎＢ抗原である。これに関して、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ６、およびＣＤ７などのｐａｎＴ細胞抗原はまた、本発明の意味の範囲内で腫瘍関連抗原を含む。さらに他の例示的腫瘍関連抗原には、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＭＵＣ−１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶＥ６およびＥ７、ＴＡＧ−７２、ＣＥＡ、Ｌ６−抗原、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３７、ＣＤ５２、ＨＬＡ−ＤＲ、ＥＧＦ受容体、およびＨＥＲ２受容体が含まれるが、これらに限定されない。多くの場合、これらの各抗原の免疫反応性抗体は、文献で報告されている。当業者は、これらの各抗体は、本発明にしたがって本発明のポリペプチドの前駆体として作用することができることを認識する。

本発明のポリペプチドは、好ましくは、上記の腫瘍または免疫関連抗原に会合および結合する。したがって、以下にいくらか詳細に考察するように、本発明のポリペプチドは、腫瘍関連抗原と反応する多数の抗体の任意の１つから誘導されるか、これらから作製されるか、調製することができる。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、血清半減期の減少などの所望の生化学的特徴を得るために１つまたは複数の定常領域ドメインの少なくとも一部が欠失または変化する一般的な遺伝子操作技術を使用して誘導される修飾されているかドメインが欠失した抗体である。より詳細には、当業者は、本発明の抗体の可変領域および／または定常領域に対応する遺伝子配列を容易に単離し、本発明にしたがい、単量体サブユニットとして使用するための本発明のポリペプチドを得るために適切なヌクレオチドを欠失または変化させることができる。本発明の適合性ポリペプチドを、十分に確立されたプロトコールを使用して臨床または商業的規模で発現および産生することができることがさらに認識される。

腫瘍関連抗原と反応する、以前に報告された抗体を、本発明のポリペプチドを得るために本明細書中に記載のように変化させることができる。抗原結合領域を得るか開示のポリペプチドを作製または誘導するために使用することができる例示的抗体には、２Ｂ８およびＣ２Ｂ８（Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標）およびＲｉｔｕｘａｎ（登録商標）、ＩＤＥＣＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓＣｏｒｐ．，ＳａｎＤｉｅｇｏ）、Ｌｙｍ１およびＬｙｍ２（Ｔｅｃｈｎｉｃｌｏｎｅ）、ＬＬ２（ＩｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓＣｏｒｐ．，ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ）、ＨＥＲ２（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標），ＧｅｎｅｎｔｅｃｈＩｎｃ．，ＳｏｕｔｈＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ）、Ｂ１（Ｂｅｘｘａｒ（登録商標），ＣｏｕｌｔｅｒＰｈａｒｍ．，ＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ）、Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標）（ＭｉｌｌｅｎｎｉｕｍＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）、ＭＢ１、ＢＨ３、Ｂ４、Ｂ７２．３（ＣｙｔｏｇｅｎＣｏｒｐ．）、ＣＣ４９（ＮａｔｉｏｎａｌＣａｎｃｅｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅ）、および５Ｅ１０（ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＩｏｗａ）が含まれるが、これらに限定されない。本発明の結合部位に組み込むことができる他の抗体結合部位には、ＯｒｔｈｏｃｌｏｎｅＯＫＴ３（ＣＤ３）、ＲｅｏＰｒｏ（ＧｐＩＩｂ／ｇＩＩａ）、Ｚｅｎａｐａｘ（Ｃ２５）、Ｒｅｍｉｃａｄｅ（ＴＮＦ−ａ）、Ｓｉｍｕｌｅｃｔ（ＣＤ２５）、Ｓｙｎａｇｉｓ（ＲＳＶ）、Ｍｙｌｏｔａｒｇ（ＣＤ３３）、およびＣａｍｐａｔｈ（ＣＤ５２）が含まれる。好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドは、直ぐ上で列挙した抗体と同一の腫瘍関連抗原に結合する。特に好ましい実施形態では、ポリペプチドは、２Ｂ８，Ｃ２Ｂ８，ＣＣ４９およびＣ５Ｅ１０と同一の抗原に由来するかこれに結合し、さらにより好ましくは、ＣＨ２ドメインの全部または一部を欠く。

１つの実施形態では、本発明の結合分子は、ＣＤ２３に結合する（米国特許第６，０１１，１３８号）。好ましい実施形態では、本発明の結合分子は、５Ｅ８抗体と同一のエピトープに結合する。別の実施形態では、本発明の結合分子は、抗ＣＤ２３抗体（例えば、５Ｅ８抗体）由来の少なくとも１つのＣＤＲを含む。

１つの実施形態では、本発明の結合分子は、ＣＲＩＰＴＯ−Ｉ抗原に結合する（ＷＯ０２／０８８１７０Ａ２またはＷＯ０３／０８３０４１Ａ２）。好ましい実施形態では、本発明の結合分子は、Ｂ３Ｆ６抗体と同一のエピトープに結合する。別の実施形態では、本発明の結合分子は、抗ＣＲＩＰＴＯ−Ｉ抗体（例えば、Ｂ３Ｆ６抗体）由来の少なくとも１つのＣＤＲを含む。

第１の好ましい実施形態では、ポリペプチドは、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）と同一の腫瘍関連抗原に結合する。Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）（リツキシマブ、ＩＤＥＣ−Ｃ２Ｂ８、およびＣ２Ｂ８としても公知）は、最初にＦＤＡで承認されたヒトＢ細胞リンパ腫治療用のモノクローナル抗体であった（米国特許第５，８４３，４３９号、同第５，７７６，４５６号、および同第５，７３６，１３７号（それぞれ本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。Ｙ２Ｂ８（９０Ｙ標識２Ｂ８；Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標）；イブリツモマブチウキセタン（ｔｉｕｘｅｔａｎ））は、Ｃ２Ｂ８のマウス親（ｍｕｒｉｎｅｐａｒｅｎｔ）である。Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）は、成長阻害性を示し、ｉｎｖｉｔｒｏで化学療法薬によってアポトーシスについて一定のリンパ腫細胞株を感作することが報告されているキメラ抗ＣＤ２０モノクローナル抗体である。この抗体は、ヒト補体と有効に結合し、強力なＦｃＲ結合を有し、ｉｎｖｉｔｒｏで補体依存性（ＣＤＣ）および抗体依存性（ＡＤＣＣ）の両方の機構を介してヒトリンパ球を有効に死滅することができる（Ｒｅｆｆｅｔａｌ．，Ｂｌｏｏｄ８３：４３５−４４５（１９９４））。当業者は、本開示にしたがって修飾されたＣ２Ｂ８または２Ｂ８の二量体変異型（ホモ二量体またはヘテロ二量体）を、ＣＤ２０＋悪性腫瘍を罹患した患者を有効に治療するために結合体形態または非結合体形態で使用することができることを認識する。より一般には、本明細書中に開示のポリペプチドを、多数の障害の任意の１つを有効に治療するために、「裸」または細胞毒性薬との非結合体状態または結合体状態のいずれかで使用することができることを繰り返し示さなくてはならない。本発明の他の好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドは、ＣＣ４９と同一の腫瘍関連抗原に由来するか、これに結合する。前に暗示のように、ＣＣ４９は、ヒト起源の一定の腫瘍細胞（詳細には、ＬＳ１７４Ｔ腫瘍細胞株）の表面に会合するヒト腫瘍関連抗原ＴＡＧ−７２に結合する。ＬＳ１７４Ｔ（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（本明細書中でＡＴＣＣ）番号ＣＬ１８８）は、ＬＳ１８０（ＡＴＣＣ番号ＣＬ１８７）結腸腺癌株の変形である。ＴＡＧ−７２に対する結合特異性を有する多数のマウスモノクローナル抗体が開発されていることがさらに認識される。Ｂ７２．３と呼ばれるこれらのモノクローナル抗体の１つは、ハイブリドーマＢ７２．３（ＡＴＣＣ番号ＨＢ−８１０８）によって産生されるマウスＩｇＧ１である。Ｂ７２．３は、免疫原としてヒト乳癌抽出物を使用して開発した第１世代のモノクローナル抗体である（Ｃｏｌｃｈｅｒｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），７８：３１９９−３２０３（１９８１）；ならびに米国特許第４，５２２，９１８号および同第４，６１２，２８２号（それぞれ本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。ＴＡＧ−７２に指向する他のモノクローナル抗体を、「ＣＣ」（結腸癌に由来）と命名する。Ｓｃｈｌｏｍｅｔａｌ．（米国特許第５，５１２，４４３号（本明細書中で参考として援用される））に記載のように、ＣＣモノクローナル抗体は、Ｂ７２．３を使用して精製したＴＡＧ−７２を使用して調製した第２世代のマウスモノクローナル抗体のファミリーである。ＴＡＧ−７２に対するその比較的良好な結合親和性のために、以下のＣＣ抗体をＡＴＣＣに寄託した（アクセスは制限されている）：ＣＣ４９（ＡＴＣＣ番号ＨＢ９４５９）；ＣＣ８３（ＡＴＣＣ番号ＨＢ９４５３）；ＣＣ４６（ＡＴＣＣ番号ＨＢ９４５８）；ＣＣ９２（ＡＴＴＣＣ番号ＨＢ９４５４）；ＣＣ３０（ＡＴＣＣ番号ＨＢ９４５７）；ＣＣ１１（ＡＴＣＣ番号９４５５）；およびＣＣ１５（ＡＴＣＣ番号ＨＢ９４６０）。米国特許第５，５１２，４４３号は、例えば、当該分野で公知の組換えＤＮＡ技術によるマウス定常領域のヒト定常領域（Ｆｃ）ドメインへの置換によって開示の抗体をそのキメラ形態に変化させることができることをさらに教示している。マウスおよびキメラ抗ＴＡＧ−７２抗体の開示に加えて、Ｓｃｈｌｏｍｅｔａｌ．は、ＰＣＴ／ＵＳ９９／２５５５２号に開示のヒト化ＣＣ４９抗体の変異型および米国特許第５，８９２，０１９号（それぞれ本明細書中で参考として援用される）に開示の単鎖抗体も産生した。当業者は、上記の各抗体、構築物または組換え体、およびその変異型を修飾し、これを使用して本発明のポリペプチドを提供することができることを認識する。

上記に考察の抗ＴＡＧ−７２抗体に加えて、種々のグループもドメイン欠失ＣＣ４９およびＢ７２．３抗体の構築および部分的特徴づけを報告されている（例えば、Ｃａｌｖｏｅｔａｌ．ＣａｎｃｅｒＢｉｏｔｈｅｒａｐｙ，８（１）：９５−１０９（１９９３），Ｓｌａｖｉｎ−Ｃｈｉｏｒｉｎｉｅｔａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ５３：９７−１０３（１９９３）およびＳｌａｖｉｎ−Ｃｈｉｏｒｉｎｉｅｔａｌ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｒｅｓ．５５：５９５７−５９６７（１９９５））。

本発明のさらに他の好ましい実施形態は、Ｃ５Ｅ１０と同一の腫瘍関連抗原に由来するかこれに結合する修飾抗体を含む。同時係属出願０９／１０４，７１７号に記載するように、Ｃ５Ｅ１０は、前立腺細胞株（例えば、ＤＵ１４５、ＰＣ３、またはＮＤ１）に特異的と思われる約１１５ｋＤａの糖タンパク質決定基を認識する抗体である。したがって、本発明と併せて、Ｃ５Ｅ１０抗体によって認識される同一の腫瘍関連抗原に特異的に結合するポリペプチド（例えば、ＣＨ２ドメイン欠失抗体）を産生し、新生物障害の治療のために結合体形態または非結合体形態で使用することができる。特に好ましい実施形態では、修飾抗体は、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−８６５のハイブリドーマ細胞株から分泌されたＣ５Ｅ１０抗体の抗原結合部位の全部または一部に由来するかこれを含む。次いで、得られた修飾抗体を、以下に記載のように放射性核種に結合体化し、本明細書中の方法にしたがって前立腺癌を罹患した患者に投与することができる。

一般に、開示の発明を使用して、結合分子によって癌細胞がターゲティングされる抗原マーカーを含む任意の新生物を予防的または治療的に治療することができる。治療することができる例示的癌には、前立腺癌、結腸癌などの胃癌、皮膚癌、乳癌、卵巣癌、肺癌、および膵臓癌が含まれるが、これらに限定されない。より詳細には、本発明の結合分子を使用して、カポジ肉腫、ＣＮＳ新形成（毛細血管芽細胞腫、髄膜腫、および脳転移）、黒色腫、胃腸肉腫および腎肉腫、横紋筋肉腫、膠芽細胞腫（好ましくは多形グリア芽細胞腫）、平滑筋肉腫、網膜芽細胞腫、卵巣の乳頭状嚢腺腫、ウィルムス腫瘍、または小細胞肺癌を治療することができる。適切なポリペプチドが本開示を考慮して過度に実験することなく上記各新形成に関連する腫瘍関連抗原について誘導され得ることが認識される。開示の発明の治療の影響を受けやすい例示的血液悪性腫瘍には、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫ならびに白血病（ＡＬＬ−Ｌ３（バーキット型白血病）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、および単球性白血病が含まれる）が含まれる。本発明の化合物および方法は、種々のＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、細胞リンパ腫（ＦＣＣ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、びまん性大細胞リンパ腫（ＤＬＣＬ）、小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ、中悪性度／濾胞性ＮＨＬ、中悪性度びまん性ＮＨＬ、高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ、高悪性度リン芽球性ＮＨＬ、高悪性度非切断小細胞（ｓｍａｌｌｎｏｎ−ｃｌｅａｖｅｄ）ＮＨＬ、巨大疾患（ｂｕｌｋｙｄｉｓｅａｓｅ）ＮＨＬ、およびワルデンストローム型マクログロブリン血症が含まれる）の治療で特に有効であることが認識される。これらのリンパ腫はしばしば分類システムの変更によって異なる病名を有し、異なる病名に分類されたリンパ腫を有する患者も本発明の併用療法の投与計画から利益を得ることもできることが当業者に明らかである。上記新生物障害に加えて、開示の発明を有利に使用して、適合する腫瘍関連抗原を保有するさらなる悪性腫瘍を治療することができることが認識される。

新生物障害に加えて、本発明のポリペプチドは、自己免疫障害または異常な免疫応答の治療で特に有効である。これに関して、本発明のポリペプチドを使用して、外部抗原および自己抗原の両方に対する望ましくない免疫応答を制御、抑制、調整、または消失することができることが認識される。例えば、１つの実施形態では、抗原は自己抗原である。別の実施形態では、抗原はアレルゲンである。さらに他の実施形態では、抗原は、同種抗原または異種抗原である。同種抗原および異種抗原に対する免疫応答を減少するための開示のポリペプチドの使用は、例えば、移植においてドナーの移植片（例えば、組織または臓器移植片または骨髄移植）の移植レシピエントによる拒絶を阻害するために特に有用である。さらに、骨髄移植片中のドナーＴ細胞の抑制または消失は、移植片対宿主疾患の阻害に有用である。

さらに他の実施形態では、本発明のポリペプチドを使用して、免疫障害（アレルギー性気管支肺アスペルギルス症；アレルギー性鼻炎；自己免疫性溶血性貧血；黒色表皮症；アレルギー性接触皮膚炎；アジソン病；アトピー性皮膚炎；円形脱毛症；全身性脱毛症；アミロイドーシス；アナフィラキシー性紫斑病；過敏症反応；再生不良性貧血；遺伝性血管性水腫；特発性血管性水腫；強直性脊椎炎；頭部動脈炎；巨細胞性動脈炎；高安動脈炎；側頭動脈炎；喘息；毛細血管拡張性運動失調症；自己免疫性卵巣炎；自己免疫性精巣炎；自己免疫性多内分泌腺不全；ベーチェット病；バーガー病；バージャー病；気管支炎；水胞性天然痘；慢性粘膜皮膚カンジダ症；カプラン症候群；心筋梗塞後症候群；心膜切開後症候群；心臓炎；セリアック病；シャーガス病；チェジアック−東症候群；チャーグストラウス病；コーガン症候群；寒冷凝集素症；ＣＲＥＳＴ症候群；クローン病；クリオグロブリン血症；特発性間質性肺炎；疱疹状皮膚炎；皮膚筋炎；真性糖尿病；ダイヤモンド−ブラックファン症候群；ディジョージ症候群；円板状紅斑性狼瘡；好酸球性筋膜炎；上強膜炎；持久性隆起性紅斑；輪郭状紅斑；多形性紅斑；結節性紅斑；家族性地中海熱；フェルティー症候群；肺線維症；アナフィラキシー様糸球体腎炎；自己免疫性糸球体腎炎；連鎖球菌感染後糸球体腎炎；移植後糸球体腎炎；膜性糸球体症；グッドパスチュア症候群；免疫性媒介性顆粒球減少症；環状肉芽腫；アレルギー性肉芽腫症；肉芽腫性筋肉炎；グレーブス病；橋本甲状腺炎；新生児溶血性疾患；特発性ヘモクロマトーシス；ヘノッホ・シェーンライン紫斑病；慢性能動性および慢性進行性肝炎；組織球症Ｘ；好酸球増加症候群；特発性栓球減少性紫斑病；ジョブ症候群；若年性皮膚筋炎；若年性関節リウマチ（若年性慢性関節炎）；川崎病；角膜炎；乾性角結膜炎；ランドリー−ギラン−バー−ストロール症候群；結節性癩；レフレル症候群；狼瘡；ライエルの症候群；ライム病；リンパ腫様肉芽腫症；全身性肥満細胞症；混合性結合組織病；多発性単神経炎；マックル−ウェルズ症候群；皮膚粘膜リンパ節症候群；皮膚粘膜リンパ節症候群；多中心性網内系組織球症；多発性硬化症；重症筋無力症；菌状息肉症；全身性壊死性血管炎；ネフローゼ症候群；オーバーラップ症候群；皮下脂肪組織炎；発作性寒冷血色素尿症；発作性夜間血色素尿症；類天疱瘡；天疱瘡；紅斑性天疱瘡；落葉状天疱瘡；尋常性天疱瘡；鳩飼病；過敏性肺臓炎；結節性動脈周囲炎；リューマチ性多発性筋痛；多発性筋炎；特発性多発神経炎；ポルトガル家族性多発性神経炎；子癇前症／子癇；原発性胆汁性肝硬変；全身性進行性硬化症（強皮症）；乾癬；乾癬性関節炎；肺胞タンパク症；肺線維症，レーノー現象／症候群；ライデル甲状腺炎；ライター症候群、再発性多発性軟骨炎；リューマチ熱；関節リウマチ；類肉腫症；強膜炎；硬化性胆管炎；血清病；セザリー症候群；シェーグレン症候群；スティーブンス−ジョンソン症候群；スティル病；亜急性硬化性全脳炎；交感性眼炎；全身性エリトマトーデス；移植片拒絶；潰瘍性大腸炎；分類不能結合組織病；慢性蕁麻疹；寒冷蕁麻疹；ブドウ膜炎；白斑；ウェーバー−クリスチャン病；ウェゲナー肉芽腫症、およびウィスコット−オールドリッチ症候群が含まれるが、これらに限定されない）を治療することができる。

別の実施形態では、本発明の結合分子をプレターゲティング適用のために使用することができる。例えば、化学療法薬物送達のためのプレターゲティング適用と同一の利点が明らかである。

例えば、プレターゲティングでは、腫瘍を、一方で腫瘍関連抗原に親和性を示し、他方で放射性標識ハプテンに親和性を示す結合構築物でプレターゲティングする。放射性標識ハプテンを、好ましくは、結合分子がクリアランスされた後に投与する（例えば、Ｂｏｅｒｍａｎｅｔａｌ．２００３．Ｊ．ＮｕｃｌｅａｒＭｅｄ．４４：４００を参照のこと）。別の例では、抗体は、非毒性であるが結合分子に結合した場合のみで有毒な薬物またはプロドラッグと反応するように誘導体化されている。本実施例中の生体分布データを考慮すると、本発明の結合分子は、プレターゲティング適用での使用に十分に適応している。１つの実施形態では、本発明の結合分子の使用によってプレターゲティング法からキレート剤を消失させることができる。

本発明を、以下の実施例によってさらに例示するが、これらは本発明を制限すると解釈されるべきではない。本出願にわたって引用された全ての参考文献、特許、および公開された特許出願は、本明細書中で参考として援用される。

（実施例１：ＡおよびＢアイソフォームの同定）
抗体分子溶液は、２つの異なるアイソフォームを含む。一方の形態であるＡ型は、少なくとも１つのジスルフィド結合を介して結合した重鎖分子を含む。他方の形態であるＢ型は、少なくとも１つのジスルフィド結合を介して結合していない重鎖分子を含む。Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）などのインタクトなγ１ＭＡｂを使用した場合、Ｂ型は出現しないか非常に低い頻度で出現する。しかし、類似のヒンジを有するドメイン欠失（ｄｄ）構造を使用すると、Ｂ型の頻度ははるかに高くなる。変性非還元ＳＤＳｐａｇｅを使用して、これらの形態を区別することができる。ドメイン欠失抗体調製物では、Ａ型は１２０ｋＤａの二量体として出現し、Ｂ型は６０ｋＤａの単量体として出現する（図１）。

（実施例２：ＣＨ２ドメイン欠失ＭＡｂフラグメント中のヒンジ領域不均一性の同定）
ヒンジドメインを、上部、中央、および下部ヒンジ領域の３つの異なる領域に細分することができる（Ｒｏｕｘｅｔａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８１６１：４０８３）。ＩｇＧ１およびＩｇＧ３ヒンジについてのこれらの領域を含むポリペプチド配列を、表１に示す。ＩｇＧ３ヒンジ中央領域は、２つの保存システイン残基に加えて、３回反復した１５アミノ酸モチーフを含む。これらの領域由来のアミノ酸配列を使用して、合成ＩｇＧ１／ＩｇＧ３連結ペプチドをデザインした。これらは、２２６位〜２３８位に対応するＩｇＧ１上部ヒンジ残基、２３９位〜２４１位に対応するＩｇＧ１中央ヒンジ、および２４３位にプロリンを付加するか、２４３位、２４４位、および２４５位（Ｋａｂａｔナンバリングシステム）にそれぞれプロリン、アラニン、プロリンを付加し、その後に可動性Ｇｌｙ／Ｓｅｒスペーサーを付加した、２４１ＥＥ位〜２４２位に対応する１つのＩｇＧ３中央ヒンジ反復モチーフからなる（表２）。さらに、２４３位にプロリンを付加するか、２４３位、２４４位、および２４５位（Ｋａｂａｔナンバリングシステム）にそれぞれプロリン、アラニン、プロリンを付加した、２３９位または２４２位のシステインがセリンアミノ酸残基に置換された新規の連結ペプチドをデザインした。Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５およびＰｒｏ２４３連結ペプチドも作製した。ＩｇＧ１ヒンジの最初の残基（２２６位、Ｋａｂａｔナンバリングシステム）から始まり、ヒンジ／ＧｌｙＳｅｒ連結ペプチドの最後の残基で終わる親ＣＨ２ドメイン欠失ヒト化ＣＣ４９連結ペプチドのアミノ酸配列を表２に示す。Ｋａｂａｔナンバリングシステムで示したシステイン残基の位置を使用したＣＣ４９とのアラインメントによる種々の連結ペプチドデザインも示す。

（実施例３：連結ポリペプチドの構築およびアイソフォームの優先的合成）
重複伸長スプライシング（ＳＯＥ）法を使用して、表２に示すヒンジ領域連結ペプチドをコードする核酸配列を、ＣＨ２ドメイン欠失ｈｕＣＣ４９遺伝子配列に移入した（Ｈｏｒｔｏｎ，Ｒ．Ｍ．１９９３ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ１５：ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ：ＣｕｒｒｅｎｔＭｅｔｈｏｄｓａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｅｄ．Ｂ．Ａ．Ｗｈｉｔｅ）。ヒンジ領域の正確な修飾を、ＤＮＡ配列分析によって確認した。抗体タンパク質の安定な産生のために、プラスミドＤＮＡを使用して、ＣＨＯＤＧ４４細胞を形質転換した。

表２に示す８個のデザインした合成連結ペプチドを含むＣＨ２ドメイン欠失ｈｕＣＣ４９抗体を構築し、ＣＨＯＤＧ４４細胞中で抗体を産生した。単離細胞株から上清を回収し、免疫アッセイによって培養上清中の抗体濃度を決定した。各細胞株由来の全抗体タンパク質の０〜３０ｎｇの範囲の抗体を含む上清を、ＣＨ２ドメイン欠失ｈｕＣＣ４９のＡ型およびＢ型アイソフォームを検出するための非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動およびその後の抗ヒトκＨＲＰ結合体化抗体を使用したウェスタンブロットによって分析した。これらの条件下で、Ａ型は単一の１２０ｋＤａのホモ二量体として移動し、Ｂ型は６０ｋＤａの２対として移動する。κ鎖単量体および二量体も認められる。配列番号８、９、１４、および１５に示した連結ペプチドは全てＡ型の産生比率が増大することが見出された。

これらのデータは、新規の操作した合成ヒンジ領域の連結ペプチドを使用してＡアイソフォームまたはＢアイソフォームを優先的に形成することができることを示す。これらの研究は、ＣＨ２ドメイン欠失抗体のＡ型アイソフォームの合成における２４２位（Ｋａｂａｔナンバリングシステム）でのシステイン残基の重要性も示す。２３９位または２４２位のいずれかのシステインのセリンへの置換（例えば、配列番号１０、１１、１２、または１３に示す連結ペプチドを使用）により、ＣＨ２ドメイン欠失抗体生合成がＢ型アイソフォームにシフトされる。したがって、１つの実施形態では、本発明の連結ペプチドは、２３９位または２４２位の少なくとも１つにシステインを含む。Ａ型の産生比率が増加する連結ペプチドの使用により、プロセス、収率、および／または安定性が有利に改善される。これらの合成ヒンジ領域の連結ペプチドは、４つ全てのヒトアイソタイプのＣＨ３ドメインの間での非常に高い相同性に基づいて、任意の抗体アイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）のＣＨ２ドメイン欠失抗体Ａ型アイソフォームの優先的合成に有用である。同一および保存されたアミノ酸残基を含むことにより、ＩｇＧ１のＣＨ３ドメインはＩｇＧ２のＣＨ３と９８．１３％相同であり、ＩｇＧ３のＣＨ３と９７．２０％相同であり、ＩｇＧ４のＣＨ３と９６．２６％相同である。

（実施例４：両アイソフォームを含むモノクローナル抗体混合物からのＡ型およびＢ型の精製）
１０ｍＬのｄｄＣＣ４９上清を、１ＭＴｒｉｓ（ｐＨ９．０）で最終ｐＨ７．５まで漸増（ｔｉｔｒａｔｅ）した。この物質を、一連のＳｏｌ−Ｖａｃ０．８μおよび０．４μメンブレンで濾過した。１００ｍＬのＸＫ５０プロテインＧカラムを、流速８０ｍＬ／分にて１×ＰＢＳで予備平衡化した。漸増し、濾過した上清を、８０ｍＬ／分でカラムにロードした。結合したタンパク質を、２カラム体積の平衡緩衝液で洗浄し、その後ｐＨ３．０で１００ｍＭグリシンにて溶離した。ｄｄＣＣ４９ピークを含む画分を回収し、その直後に１ＭＴｒｉｓ（ｐＨ９．０）で最終ｐＨ７．０に漸増した。

ＴｏｓｏＢｉｏｓｅｐＰｈｅｎｙｌ５ＰＷ−ＨＲカラムを、２０ｍＭリン酸（ｐＨ７．２）；１Ｍ硫酸アンモニウムで予備平衡化した。プロテインＧ溶離物を、３．５Ｍ硫酸アンモニウム（ｐＨ７．２）ストックを使用して１Ｍ硫酸アンモニウムに漸増し、ゲルベッド１ｍＬあたり２ｍｇの濃度でロードする。伝導率を１１６．４ｍＳ／ｃｍに調整するために、結合したタンパク質を２０ｍＭリン酸（ｐＨ４または７．２）硫酸アンモニウムで洗浄した。この条件で溶離した物質の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる見かけ上の分子量は約１２０ｋＤａ（Ａ型）である。残りの結合抗体を、硫酸アンモニウム含量の減少が直線勾配のリン酸緩衝液でさらに溶離した。この方法により、Ａ型およびＢ型が２つの個別のピークで分離される。後者の溶離抗体は、見かけ上重鎖間のジスルフィド結合を欠き、その分子量は約６０ｋＤａである（Ｂ型）。

上記の両精製物質を、硫酸アンモニウム濃度を１Ｍにし、これを洗浄したＰｈｅｎｙｌ５ＰＷ−ＨＲカラムに再ロードすることによって再度捕捉することができる。結合したタンパク質を、２０ｍＭリン酸（ｐＨ７．２）で溶離し、１×ＰＢＳで透析する。

（実施例５：Ａ型およびＢ型の安定性の比較）
Ａ型およびＢ型の生物活性（例えば、直接結合または競合研究を使用した予備実験での測定）により、Ａ型およびＢ型が類似の生物活性を有することが明らかとなった。

Ａ型およびＢ型の安定性も比較した。精製ｄｄＣＣ４９分子を、ＹＭ３０メンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を取りつけたＡｍｉｃｏｎ濃縮機によって約５ｍｇ／ｍＬに濃縮した。濃縮物質を、各アイソフォームについて４つに等分し、各画分を１０Ｋ透析カセット（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号６６４１０）に入れ、以下の緩衝液で１６時間透析した：１）１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ３）；２）１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５）；３）１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７）；および４）１０ｍＭホウ酸ナトリウム（ｐＨ９）。透析後、各溶液のタンパク質濃度を３ｍｇ／ｍＬに調整した。純粋なＡアイソフォーム溶液およびＢアイソフォーム溶液に加えて、各ｐＨ由来のＡ溶液およびＢ溶液の一部を混合して、５０％の各アイソフォームを含む混合物を作製した。全１２種の処方物を作製した（４つのｐＨレベル×３つの抗体溶液）。溶液を濾過し、灰色のブチルストッパーを備えた３ｍＬのＴｙｐｅ−１ガラス血清バイアル（ＷｅｓｔＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）に充填した。

安定性試験用のタンパク質溶液を保存するために、３つの温度（２〜８℃、２０〜２５℃、および３８〜４２℃）を選択した。保存前に、物理分析および化学分析のために各処方物から５００μＬのサンプルを採取し、これらの時間起点データをコントロールとして参照した。一旦保存されると、サンプルを以下のスケジュールで採取した：２週間、１ヶ月、２ヶ月、および３ヶ月、ならびに試験直前。

２つのアイソフォームの物理的および化学的安定性を評価するために、以下の方法を使用した：ＯＤ_３２０での濁度測定、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、およびサイズ排除クロマトグラフィ。

種々の時点にて２〜８℃、２０〜２５℃、および３８〜４２℃で保存したサンプルに対して非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。２〜８℃で保存した場合、Ａ型およびＢ型は共に、ｐＨ５で比較的安定である。しかし、元の主要バンド（Ａ型は１２０ｋＤａおよびＢ型は６０ｋＤａ）よりも小さいバンド数の増加によって示されるように、ｐＨ７および９で処方した場合、Ａ型およびＢ型は共に分解された。特にｐＨ７および９の低温および中間の温度で保存したサンプルは、５５ｋＤａ未満のバンドの強度および数がＡ型よりもＢ型で高いことに留意した。これは、これらの条件下で、ＡアイソフォームがＢアイソフォームよりも安定であることを示していた。しかし、これは、ｐＨ５および２０〜２５℃で保存したＡアイソフォームには当てはまらないようである。このサンプルは、Ｂアイソフォームよりも多数のフラグメントを有するようであった。これは、微生物混入による悪影響であるようである（以下により詳細に考察している）。高保存温度では、両型はｐＨ９で有意に分解され、サンプル間でゲルパターンにほとんど相違がなかった。この条件下では、ゲルの上部に凝集体の形成を示す微量のスミアバンド（ｓｍｅａｒｂａｎｄ）が出現した。凝集体をＳＤＳに溶解することができるため、以下の節に記載の方法を使用して凝集体を調査した。

表４Ａから４Ｃは、３つの異なる温度で保存したｄｄＣＣ４９の濁度データを列挙する。濁度によって可溶性および不溶性凝集体の両方を測定し、濁度はこれらの粒子による散乱光の量に基づく。存在する場合、凝集体は光を散乱し、Ａ_３２０が増加する。表４Ａ〜Ｃに示すように、２〜８℃で保存したｄｄＣＣ４９分子の濁度は、ＡアイソフォームおよびＢアイソフォームの両方のｐＨの上昇と共に増加し、前者は後者よりも濁度が低い。この傾向は、より高い温度（２０〜２５℃および３８〜４０℃）で１ヶ月未満保存したサンプルについても当てはまった。保存期間が３ヶ月に達すると、高ｐＨおよび高温のサンプルの濁度は有意に増加し、Ａ型とＢ型の相違が減少した。これらの結果はＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果に匹敵し、（凝集体が形成されないという点で）両アイソフォームがｐＨ３および５で比較的安定であり、ＡアイソフォームがＢアイソフォームよりも凝集体に対する感受性が低いことを示す。

サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）はインタクトな分子および分解生成物（フラグメントおよび可溶性凝集体の両方）の比率の解明のための強力な方法であり、再現性が高い。表４Ａ〜４Ｃでは、異なる温度でのＡアイソフォーム、Ｂアイソフォーム、および混合物のインタクトな単量体の比率を列挙する。２〜８℃で保存したサンプルについては、Ａ型はＢ型と比較して単量体の比率が高く、Ａ型とＢ型との混合物はその間であることが明らかである。この保存温度では、両型は、ｐＨ３、５、および７で約３ヶ月間比較的安定であった（ｐＨ５が最も安定な条件である）。しかし、ｐＨ９では、Ｂ型では単量体の比率が有意に減少するが、Ａ型ではわずかしか減少しなかった。

高温では、全てのサンプルは、保存期間が増加するにつれて単量体の比率が有意に減少した；ＡアイソフォームはＢアイソフォームよりも優れていた。しかし、例外として、室温で保存したｐＨ５のＡアイソフォームのサンプルは、類似の保存条件下でのＢアイソフォームまたは混合物よりもより一層分解された。この特定のＡアイソフォームバイアル、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ由来のデータ、およびサンプルのＳＥＣの厳密な検査により、微生物混入がこの予想外の結果の原因であることが示唆された。第１に、ＳＥＣおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果は共に、このサンプルの分解がおそらく微生物消化に起因する断片化の増加によって主に説明され、そうでなければいくらかの凝集の増加が予想されることを示した。第２に、ＡアイソフォームおよびＢアイソフォームをそれぞれ５０％含む混合サンプルがＢアイソフォームよりも良好な安定性プロフィールを示したという事実は、より安定なＡアイソフォームがより高い単量体の比率に寄与したに違いないことを示す。最後に、２〜８℃および３８〜４２℃で保存したｐＨ５のＡアイソフォームは共に類似の条件下のＢアイソフォームよりも単量体の比率が高かった。したがって、中間の保存温度は類似の結果が得られるはずである。サンプル量が制限されているため、微生物混入アッセイを行うことができなかった。

高ｐＨ（９）および４０℃で保存したＩＤＥＣ−１５９の両アイソフォームについて、単量体の比率が約３０％に減少したことも留意した。これらのいくつかの条件下で、２つのアイソフォーム間の安定性の相違は消滅した。このＳＥＣの結果は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して見出された結果を反映する。両結果は、２つのアイソフォーム間で化学的および物理的特徴が幾らか異なるが、両アイソフォームの分解機構および分解副産物が全く同じではないにしても類似していることを示す。

まとめると、ＳＥＣの結果は、ＡアイソフォームおよびＢアイソフォームの両方の至適ｐＨが約５であり、類似の保存条件でのインタクトな単量体の比率がより高い点から見てＡアイソフォームがＢアイソフォームよりも安定であることを示す。

（実施例７：Ａ型およびＢ型の分取精製）
ＩＤＥＣ−１５９（ｄｄＣＣ４９）は、腫瘍表面上に発現する、ＴＡＧ−７２抗原に指向するＣＨ２ドメイン欠失モノクローナル抗体である。ＩＤＥＣ−１５９は、Ａ型およびＢ型と呼ばれる抗体の２つのアイソフォームを含む。ＩＤＥＣ−１５９のための現在の細胞培養プロセスにより、Ａ型：Ｂ型が約５０：５０の比で産生される。Ａアイソフォームは、重鎖のＦｃ部分のＣＨ２領域が欠失した抗体である。ＣＨ２領域の欠失に加えて、Ｂ型はＦｃ領域を横切るジスルフィド結合も欠き、疎水性相互作用および塩橋のみでつなぎ合わされている。

ＩＤＥＣ−１５９の２つのアイソフォームを分離するために、ＩＤＥＣ−１５９精製プロセスの第３および最後のクロマトグラフィ工程を構築した。ＰｈｅｎｙｌＴＳＫｇｅｌ５ＰＷ−ＨＲ吸着剤を使用した疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）によって分離する。Ｂ型はＡ型よりも疎水性が高いため、Ｂ型は、移動相として約０．７３Ｍ硫酸アンモニウム／２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ４．０〜ｐＨ７．０）を使用した固定相に不可逆的に吸着する。Ａ型はこれらの条件下でより弱く固定相に結合するため定組成で（ｉｓｏｃｒａｔｉｃａｌｌｙ）溶離する（すなわち、カラムから貫流画分に遊離する）。Ａ型の定組成溶離後、移動相からの硫酸アンモニウムの除去によってＢ型が脱離する。以下の方法を使用して、ＩＤＥＣ−１５９の２つのアイソフォームを分離した。
・１５０ｃｍ以下／時間で３ＣＶ以上の０．５ＮＮａＯＨを使用してカラムを浄化した。
・１５０ｃｍ以下／時間で５ＣＶ以上の０．７３Ｍ硫酸アンモニウム／２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ４．０）を使用してカラムを平衡化した。
・５ｍｇ／ｍＬ樹脂で０．４３倍体積の２．５Ｍ硫酸アンモニウム／２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ４．０）液体ストック溶液を含むように調整した室温のＴＭＡＥＦｌｏｗｔｈｒｏｕｇｈをカラムにロードした。
・ｐＨ４．０で１００ｃｍ以下／時間にて抗体をカラムにロードした。
・２８０ｎｍでの排出Ｏ．Ｄ．が１０ｍＡＵに到達した時に抗体を回収し始めた。
・１００ｃｍ以下／時間で１５ＣＶの０．７３Ｍ硫酸アンモニウム／２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ４．０）を使用してカラムを洗浄した。
・１５ＣＶ洗浄の間中抗体を回収し続け、その後排出液を廃液に戻した。
・１００ｃｍ以下／時間で５ＣＶ以上の２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ４．０）を使用してカラムから剥離した。６．１５０ｃｍ以下／時間で３ＣＶ以上の０．５ＮＮａＯＨを使用してカラムを洗浄した。
・１５０ｃｍ以下／時間で３ＣＶ以上の０．７３Ｍ硫酸アンモニウム／２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ４．０）を使用してカラムを平衡化した。
・１５０ｃｍ以下／時間で３ＣＶ以上の２０％エタノール中にカラムを保存した。

分取スケール（５Ｌカラム体積、全ＩＤＥＣ−１５９の負荷量は約２０ｇ）での２つの形態の分離を、図１３に示す（ＡおよびＢ）。第１の２つのピークはＡ型の定組成溶離物を含み、第２のピークは溶離されたＢ型を示す一方で、第３のピークは夾雑物を含み、洗浄時に固定相から除去した。

この方法による分取スケールでのＡ型およびＢ型の分離能力もＳＤＳ−ＰＡＧＥによって証明した。

（実施例８：ＣＨ２ドメイン欠失四価抗体の調製）
ｈｕＣＣ４９ＣＨ２ドメイン欠失ｓｃ（Ｆｖ）２四価抗体のデザインは、ｈｕＣＣ４９ＣＨ２ドメイン欠失抗体ＣＨ３ドメインのカルボキシル末端へのｈｕＣＣ４９単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）の付加に基づいた。ｈｕＣＣ４９ＣＨ２ドメイン欠失ｓｃ（Ｆｖ）２四価抗体の略図を図４に示す。このデザインの等価な表現は、Ｃ−ｓｃＦｖ四価ＣＨ２ドメイン欠失抗体である。Ｆｖ領域の一本鎖ポリペプチド結合分子（単鎖Ｆｖ分子）の調製は、米国特許第４，９４６，７７８号に記載されている。ＣＣ４９ｓｃＦｖ免疫グロブリン様抗体は、米国特許第５，８９２，０１９号に記載されている。ｈｕＣＣ４９ｓｃＦｖは、短い合成リンカーによって繋がれたＶＬ領域およびＶＨ領域の配列から構成され（ＶＬ→（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３リンカー→ＶＨ方向）、ＰＣＲ増幅によって合成した。５’ＶＬＰＣＲプライマーは、ＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼ部位およびその後に（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_２リンカーペプチドをコードする配列を含んでいた。３’ＶＬＰＣＲプライマーは、２つのＶＬ領域およびＶＨ領域を連結するために使用される（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３リンカーペプチドを部分的にコードする配列を含んでいた。５’ＶＨＰＣＲプライマーも、ＶＬ領域およびＶＨ領域を連結するために使用される（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３リンカーペプチドを部分的にコードする配列を含んでいた。最後に、３’ＶＨＰＣＲプライマーは、終止コドンおよびその後にＢａｍＨＩ部位を含んでいた。２つのＶ領域を、２つのＰＣＲプライマー組を使用してｈｕＣＣ４９ＣＨ２ドメイン欠失抗体を含むプラスミドＤＮＡ基質から増幅し、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３リンカーをコードする共通の重複配列を介した第２のＰＣＲ反応においてｓｃＦｖをアセンブリした。ｈｕＣＣ４９ｓｃＦｖ遺伝子フラグメントをゲルで単離し、ＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、ｈｕＣＣ４９ＣＨ２ドメイン欠失抗体多シストロン性発現ベクターに事前に移入した単一のＢａｍＨＩ部位にクローニングした（ＵＳ２００３０１５７６４１Ａ１を参照のこと）。簡単に述べれば、ＣＨ３ドメインをコードする遺伝子の３’末端に存在する終止コドンの除去および直後にＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼ部位（Ｇｌｙ−Ｓｅｒをコードする）を含むアミノ酸配列Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙをコードするヌクレオチドとの置換によってベクターを修飾した。ＢａｍＨＩ消化ｈｕＣＣ４９ｓｃＦｖフラグメントを、ベクターのＢａｍＨＩ部位にクローニングして、１６アミノ酸のＳｅｒ（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３リンカーを介したｈｕＣＣ４９ＣＨ２ドメイン欠失抗体ＣＨ３ドメインのカルボキシル末端へのｈｕＣＣ４９ｓｃＦｖの融合産物が得られた。ＤＮＡ配列分析によって正確な配列を確認した。抗体タンパク質の安定な産生のために、プラスミドＤＮＡを使用してＣＨＯＤＧ４４細胞を形質転換した。操作抗体を、ｈｕＣＣ４９ドメイン欠失ｓｃ（Ｆｖ）２四価抗体と命名した。図８Ａは、重鎖ｈｕＣＣ４９ドメイン欠失ｓｃ（Ｆｖ）２四価抗体のＤＮＡ配列を示す。図８Ｃは、軽鎖ｈｕＣＣ４９ドメイン欠失ｓｃ（Ｆｖ）２四価抗体のＤＮＡ配列を示す。図９Ａは、重鎖ｈｕＣＣ４９ドメイン欠失ｓｃ（Ｆｖ）２四価抗体のアミノ酸配列を示す。

単離細胞株から上清を回収し、免疫アッセイによって培養上清中の抗体濃度を決定した。ｈｕＣＣ４９ＣＨ２ドメイン欠失ｓｃ（Ｆｖ）２四価抗体ＡアイソフォームおよびＢアイソフォームを検出するために、上清を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動およびその後の抗ヒトκＨＲＰ結合体化抗体を使用したウェスタンブロットによって分析した。これらの条件下で、約５０：５０の比のＡアイソフォームとＢアイソフォームにおいて、Ａ型は単一の約１７０ｋＤａのホモ二量体として移動し、Ｂ型は約８５ｋＤａの２対として移動することが認められた。図１８に示すように、５つの個別に単離されたクローンは全てＡ型およびＢ型のＣＨ２ドメイン欠失ｓｃ（Ｆｖ）２四価抗体アイソフォームを産生することが見出された。抗体産生および実施例４に記載のＨＩＣクロマトグラフィを使用した精製のために１つのクローンを選択した。精製されたｈｕＣＣ４９ＣＨ２ドメイン欠失ｓｃ（Ｆｖ）２四価抗体のＡ型およびＢ型を非還元および還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、結果を図１９に示す。Ａ型ｈｕＣＣ４９ドメイン欠失ｓｃ（Ｆｖ）２四価抗体を、Ｂ型から９５％を超える純度で有効に分離した。予想されたように、両方の精製形態は、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ条件下で同様に挙動した。ｈｕＣＣ４９ＣＨ２ドメイン欠失ｓｃ（Ｆｖ）２四価抗体のＡ型を、サイズ排除クロマトグラフィによって試験したところ主に単一ピーク（９６％）として溶離され、これは、抗体産物の有意な凝集または分解が認められないことを示す（図２０）。

（実施例９：ｈｕＣＣ４９ＣＨ２ドメイン欠失四価抗体の生体分布プロフィール）
Ｄｅｌｐｈｉａ蛍光光度計（ＷａｌｌａｃＩｎｃ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用した時間分解蛍光免疫アッセイによって、ｈｕＣＣ４９ＣＨ２ドメイン欠失ｓｃ（Ｆｖ）２四価抗体のＡ型を、競合結合アッセイにおいてそのウシ顎下腺ムチン（ＴＡＧ−７２抗原の供給源）への結合能力について試験した。競合結合曲線を図２１に示す。ｈｕＣＣ４９ＣＨ２ドメイン欠失ｓｃ（Ｆｖ）２四価抗体のＡ型およびコントロール親ＣＨ２ドメイン欠失ｈｕＣＣ４９（ｈｕＣＣ４９またはＩＤＥＣ１５９という）抗体を評価した。四価抗体の相対結合活性は、コントロール親ＣＣ４９抗体よりも５倍アビディティが高いことが見出され（ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ４．０ｆｏｒＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標），ＧｒａｐｈＰａｄ，Ｓｏｆｔｗａｒｅ，ＳａｎＤｉｅｇｏＣａｌｉｆｏｒｎｉａＵＳＡ．ｗｗｗ．ｇｒａｐｈｐａｄ．ｃｏｍ）、これは予想された抗体結合部位数の増加と一致した。

ＬＳ−１７４Ｔヒト腫瘍異種移植片を保有する胸腺欠損マウス中の^９０Ｙ放射標識ｈｕＣＣ４９ＣＨ２ドメイン欠失ｓｃ（Ｆｖ）２四価抗体の生体分布を、コントロール親ｈｕＣＣ４９抗体を使用して以前に得た結果と比較した。ｈｕＣＣ４９ＣＨ２ドメイン欠失ｓｃ（Ｆｖ）２四価抗体を、清浄剤であるＣｈｘ−ＤＴＰＡと結合体化し、結合活性を評価した。結合体化したｈｕＣＣ４９ＣＨ２ドメイン欠失ｓｃ（Ｆｖ）２四価抗体は、結合体化されたコントロール親ｈｕＣ４９よりも５〜６倍アビディティが高く、有意な結合活性を失うことなく四価抗体を誘導体化することができることを示す。ｈｕＣＣ４９ＣＨ２ドメイン欠失ｓｃ（Ｆｖ）２四価抗体を^９０Ｙで標識し、単回用量の放射性標識抗体を、予め確立させた約２５０ｍｍ^３の腫瘍を有するマウスへの尾静脈への静脈内注射によって投与した。サンプルを回収し、βカウンティングのために処理した。３〜７２時間の１ｇの腫瘍または正常な組織あたりの^９０Ｙ放射性標識抗体の注射用量率（％ＩＤ）を決定し、表６に示す。

ｈｕＣＣ４９ＣＨ２ドメイン欠失ｓｃ（Ｆｖ）２四価（Ｃ−ｓｃＦｖ四価ＣＨ２ドメイン欠失）抗体は、おそらく抗体の分子量の増加によってコントロールｈｕＣＣ４９抗体よりも腎臓での蓄積が少なかった。ｈｕＣＣ４９ＣＨ２ドメイン欠失ｓｃ（Ｆｖ）２四価抗体の腫瘍蓄積は、コントロール親ｈｕＣＣ４９を用いて達成された蓄積に類似していた（表６）。しかし、記載するように、これら２つの生体分布研究を同時に行っておらず、実験にばらつきがあった。％ＩＤ／ｇｍで測定したコントロール親ｈｕＣＣ４９およびｈｕＣＣ４９ＣＨ２ドメイン欠失ｓｃ（Ｆｖ）２四価抗体の腫瘍保持を示す図を、図３５に示す。図３５は、放射能のピーク蓄積に対して標準化した同一の腫瘍保持データも示す。図３５における２つの標準化保持曲線のＡＵＣ分析を、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ４．０ｆｏｒＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標），ＧｒａｐｈＰａｄ，Ｓｏｆｔｗａｒｅ，ＳａｎＤｉｅｇｏＣａｌｉｆｏｒｎｉａＵＳＡ．ｗｗｗ．ｇｒａｐｈｐａｄ．ｃｏｍ．を使用して計算した。コントロール親ｈｕＣＣ４９の総ピーク面積は２０３７単位であり、ｈｕＣＣ４９ＣＨ２ドメイン欠失ｓｃ（Ｆｖ）２四価抗体の総ピーク面積は２５６２単位であり、四価タンパク質の面積の２５．８％増加を示す。この形式でのデータ表示により、親二価分子と比較して腫瘍区画中の四価抗体の保持が改善されることが示唆される。

四量体ｈｕＣＣ４９構築物は、プレターゲティング（例えば、放射性免疫治療（ＲＩＴ）プレターゲティング）に一定の利点をもたらす。この利点を、表６由来の３つの所見によって定義する。第１に、四量体ｈｕＣＣ４９ＣＨ２ドメイン欠失構築物は、現在のＣＨ２ドメイン欠失ｈｕＣＣ４９構築物に匹敵する血液クリアランス速度を有する。この迅速なクリアランスは、腫瘍結合抗体に局在する放射性標識リガンドの投与前の血液からの抗体の除去を促進するための「清浄剤」の必要性を回避することができる。清浄剤の消失により、臨床状況におけるこの治療方法の複雑さが有意に減少する。第２に、四量体構築物の腫瘍保持は、現在の二量体構築物に匹敵する。したがって、送達される放射線量は、２つの構築物で類似している（表６）。第３に、ＣＨ２ドメイン欠失ｈｕＣＣ４９と比較して腎臓および肝臓の取り込みが低いことにより、臓器限界毒性に達する前に放射性標識リガンドの投与量をより多くすることができる。

（実施例１０：新規の連結ペプチドを含むｈｕＣＣ４９ＣＨ２ドメイン欠失四価抗体の調製およびＡアイソフォームの優先的合成）
図４の下半分中に示したデザインに類似するが、表２に示すＧ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］合成連結ペプチドを含むｈｕＣＣ４９ＣＨ２ドメイン欠失ｓｃ（Ｆｖ）２四価抗体を構築した。簡単に述べれば、部分的Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］連結ペプチドをコードする遺伝子配列を、ＳａｌＩ制限エンドヌクレアーゼ部位をコードする５’連結ペプチドＰＣＲプライマーおよびＸｈｏＩ部位をコードする３’連結ペプチドＰＣＲプライマーを使用したＰＣＲ増幅によって合成した。Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］連結ペプチドをコードする遺伝子配列を含むプラスミドＤＮＡを基質として使用した。ＰＣＲ産物は、Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５の全ておよび［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］連結ペプチドの一部をコードする。Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５ヒンジフラグメントをゲルで単離し、ＳａｌＩおよびＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、ＳａｌＩおよびＸｈｏＩベクター部位にクローニングし、全長Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］連結ペプチドを再構築した。正確な配列を、ＤＮＡ配列分析によって確認した。抗体タンパク質の安定な産生のために、プラスミドＤＮＡを使用してＣＨＯＤＧ４４細胞を形質転換した。図８Ｂは、Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］連結ペプチドを含む重鎖ｈｕＣＣ４９ドメイン欠失ｓｃ（Ｆｖ）２四価抗体のＤＮＡ配列を示す。図８Ｃは、Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］連結ペプチドを含む軽鎖ｈｕＣＣ４９ドメイン欠失ｓｃ（Ｆｖ）２四価抗体のＤＮＡ配列を示す。図９Ｂは、Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］連結ペプチドを含む重鎖ｈｕＣＣ４９ドメイン欠失ｓｃ（Ｆｖ）２四価抗体のアミノ酸配列を示す。

単離細胞株から上清を回収し、免疫アッセイによって培養上清中の抗体濃度を決定した。ｈｕＣＣ４９ＣＨ２ドメイン欠失ｓｃ（Ｆｖ）２四価（Ｃ−ｓｃＦｖ四価ＣＨ２ドメイン欠失）抗体のＡアイソフォームおよびＢアイソフォームを検出するために、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動およびその後の抗ＩｇＧ−ＨＲＰ結合体化抗体を使用したウェスタンブロットによって上清を分析した。これらの条件下で、約５０：５０の比のＡアイソフォームとＢアイソフォームにおいて、Ａ型は単一の約１７０ｋＤａのホモ二量体として移動し、Ｂ型は約８５ｋＤａの２対として移動すると予想される。図２２に示すように、Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］連結ペプチドを含む代表的なＣＨ２ドメイン欠失ｓｃ（Ｆｖ）２四価抗体は、全てＡ型四価抗体アイソフォームを産生することが認められた。

ｈｕＣＣ４９ＣＨ２ドメイン欠失ｓｃ（Ｆｖ）２四価抗体配列に移入したＧ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］（配列番号９）連結ペプチドを含む細胞株を、抗体産生のために使用した。抗体を産生し、上記実施例４に記載の方法を使用して精製した。Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］（配列番号９）連結ペプチドを含むｈｕＣＣ４９ＣＨ２ドメイン欠失ｓｃ（Ｆｖ）２四価抗体を、プロテインＧカラムのみを使用して精製し、さらにＨＩＣ精製を行うことなく本質的に純度９６％の単一ピークとして溶離した。還元および非還元精製タンパク質サンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって分析した。非還元条件下で、Ａ型は、単一の１７０ｋＤａのホモ二量体として移動し、Ｂ型は８５ｋＤａの２対として移動すると予想される。配列番号９に示す連結ペプチドは、Ａ型の産生比率が実質的に増加することが見出された。例示的結果を、図２３に示す。この結果は、Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］ヒンジ（配列番号９）により、本質的に全てＡ型のｈｕＣＣ４９ＣＨ２ドメイン欠失ｓｃ（Ｆｖ）２四価（Ｃ−ｓｃＦｖ四価ＣＨ２ドメイン欠失）抗体が産生され、Ｂ型はほとんどまたは全く検出されないことを示し、Ａアイソフォームの産生のためのこのヒンジの有用性を一般に多価抗体などの複雑な抗体に適用可能であることが証明される。本発明をさらに二重特異性四価抗体形式にも適用可能であることが明らかである。ｈｕＣＣ４９ＣＨ２ドメイン欠失ｓｃ（Ｆｖ）２四価Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５抗体をサイズ排除クロマトグラフィによって試験し、本質的に８４％の単量体を含む単一ピークとして溶離されることが見出された。残存する凝集体を含む画分を分取サイズ排除クロマトグラフィによって除去して、本質的に９５％の単量体を含む調製物を得た（図２４）。ｈｕＣＣ４９ＣＨ２ドメイン欠失ｓｃ（Ｆｖ）２四価Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５抗体を、Ｄｅｌｐｈｉａ蛍光光度計（ＷａｌｌａｃＩｎｃ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用した時間分解蛍光免疫アッセイによって、競合結合アッセイにおいてそのウシ顎下腺ムチン（ＴＡＧ−７２抗原の供給源）への結合能力について試験した。競合結合曲線を図２５に示す。ｈｕＣＣ４９ＣＨ２ドメイン欠失ｓｃ（Ｆｖ）２四価抗体のＡ型およびコントロール親ＣＨ２ドメイン欠失ｈｕＣＣ４９（ｈｕＣＣ４９またはＩＤＥＣ１５９という）抗体を評価した。四価抗体の相対結合活性は、コントロール親ｈｕＣＣ４９抗体よりも８倍アビディティが高いことが見出され（ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ４．０ｆｏｒＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標），ＧｒａｐｈＰａｄ，Ｓｏｆｔｗａｒｅ，ＳａｎＤｉｅｇｏＣａｌｉｆｏｒｎｉａＵＳＡ．ｗｗｗ．ｇｒａｐｈｐａｄ．ｃｏｍ）、これは予想された抗体結合部位数の増加と一致した。

これらの結果は、Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］連結ペプチド（配列番号９）によって本質的に全てＡ型のｈｕＣＣ４９ＣＨ２ドメイン欠失ｓｃ（Ｆｖ）２四価抗体が産生され、Ｂ型は検出不可能であることを示す。精製抗体は、抗原に対するアビディティの増加を示した。

（実施例１１：ＣＨ２ドメイン欠失四価抗体の調製）
図２に示すように、ｈｕＣＣ４９ミニボディおよびｈｕＣＣ４９２ｓｃ（Ｆｖ）２四価抗体（Ｎ−ｓｃＦｖ四価ミニボディ）を構築した。簡単に述べれば、ｈｕＣＣ４９２ｓｃ（Ｆｖ）２四価抗体（Ｎ−ｓｃＦｖ四価ミニボディ）デザインは、ｈｕＣＣ４９ミニボディ中の第１のｓｃＦｖドメインのカルボキシル末端とヒンジ連結ペプチドのアミノ末端との間へのｈｕＣＣ４９単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）の挿入に基づいた。Ｆｖ領域の単鎖ポリペプチド結合分子（単鎖Ｆｖ分子）の調製は、米国特許第４，９４６，７７８号に記載されている。ＣＣ４９ｓｃＦｖ免疫グロブリン様抗体は米国特許第５，８９２，０１９に記載されている。ミニボディ構築物の調製は、米国特許第５，８３７，８２１号に記載されている。ｈｕＣＣ４９ｓｃＦｖは、短い合成リンカーによって繋がれたＶＬ領域配列およびＶＨ領域配列（ＶＬ→（Ｇｌｙ _４Ｓｅｒ） _３リンカー→ＶＨ方向）から構成され、ＰＣＲ増幅によって合成し、ｈｕＣＣ４９ミニボディの構築に使用した。第２に、ＰＣＲ増幅によるｈｕＣＣ４９ミニボディのアミノ末端ｓｃＦｖドメインのカルボキシ末端への修飾（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_５リンカーの付加、リンカーの最後の２つのアミノ酸残基をコードするヌクレオチドのＮｈｅＩ制限エンドヌクレアーゼ部位への置換によってミニボディベクターを修飾した。これにより、後に数個のヌクレオチドで分離されたＳａｌＩ制限エンドヌクレアーゼ部位が存在する（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_４−Ｇｌｙ_３−Ａｌａ−Ｓｅｒリンカーが得られる。ＮｈｅＩ制限エンドヌクレアーゼ部位をコードする５’ＶＬＰＣＲプライマーおよびＳａｌＩ部位をコードする３’ＶＨＰＣＲプライマーを使用したＰＣＲを使用して、第２のｈｕＣＣ４９ｓｃＦｖを、ｈｕＣＣ４９ｓｃＦｖ遺伝子を含むプラスミドＤＮＡ基質から増幅させた。ｈｕＣＣ４９ｓｃＦｖフラグメントをゲルで単離し、ＮｈｅＩおよびＳａｌＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、第１のｓｃＦｖとヒンジ連結ペプチドとの間のＮｈｅＩ部位およびＳａｌＩ部位にクローニングした。これにより、リーダーペプチド−２つの一連のｈｕＣＣ４９ｓｃＦｖ−ヒンジ連結ペプチド−ＣＨ３ドメインからなる融合産物が得られる。正確な配列を、ＤＮＡ配列分析によって確認した。抗体タンパク質の安定な産生のために、プラスミドＤＮＡを使用してＣＨＯＤＧ４４細胞を形質転換した。図１０Ａは、ｈｕＣＣ４９四価（Ｎ−ｓｃＦｖ四価）ミニボディ遺伝子のＤＮＡ配列を示す。図１１Ａは、ｈｕＣＣ４９四価（Ｎ−ｓｃＦｖ四価）ミニボディのアミノ酸配列を示す。

単離細胞株から上清を回収し、免疫アッセイによって培養上清中の抗体濃度を決定した。ＡアイソフォームおよびＢアイソフォームにおける重鎖定常配列を検出するために、上清を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動およびその後の抗ＩｇＧ−ＨＲＰ結合体化抗体を使用したウェスタンブロットによって分析した。これらの条件下で、ｈｕＣＣ４９ミニボディＡ型は単一の約８２ｋＤａのホモ二量体および半分子（ｈａｌｆｍｏｌｅｃｕｌｅ）として移動し、Ｂ型は約４１ｋＤａの２対として移動することが予想される。約５０：５０の比のＡアイソフォームとＢアイソフォームにおいて、ｈｕＣＣ４９２ｓｃ（Ｆｖ）２四価ミニボディＡ型は単一の約１３８ｋＤａのホモ二量体として移動し、Ｂ型は約６９ｋＤａの２対として移動することが予想される。比較によって、ｈｕＣＣ４９ＣＨ２ドメイン欠失抗体（約５０：５０の比のＡアイソフォームとＢアイソフォームにおいて、単一の約１２０ｋＤａのホモ二量体として移動し、Ｂ型は約６０ｋＤａの２対として移動すると予想される）をコントロールとして使用した。図２６に示すように、代表的な単離ミニボディおよび２ｓｃ（Ｆｖ）２四価ミニボディクローンは、ＡアイソフォームおよびＢアイソフォームの両方を分泌することが見出され、これは非還元および還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ条件下での推定分子量と一致した。

（実施例１２：新規の連結ペプチドを含むｈｕＣＣ４９ＣＨ２ドメイン欠失四価抗体の調製およびＡアイソフォームの優先的合成）
図２の下半分中に示したデザインに類似するが、表２に示すＧ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］連結ペプチドを含むｈｕＣＣ４９２ｓｃ（Ｆｖ）２四価抗体（Ｎ−ｓｃＦｖ四価ミニボディ）を構築した。簡単に述べれば、部分的Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］連結ペプチドをコードする遺伝子配列を、ＳａｌＩ制限エンドヌクレアーゼ部位をコードする５’連結ペプチドＰＣＲプライマーおよびＸｈｏＩ部位をコードする３’連結ペプチドＰＣＲプライマーを使用したＰＣＲ増幅によって合成した。Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］連結ペプチドをコードする遺伝子配列を含むプラスミドＤＮＡを基質として使用した。ＰＣＲ産物は、Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５の全ておよび［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］連結ペプチドの一部をコードする。Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５ヒンジフラグメントをゲルで単離し、ＳａｌＩおよびＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、ＳａｌＩおよびＸｈｏＩベクター部位にクローニングし、全長Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］連結ペプチドを再構築した。正確な配列を、ＤＮＡ配列分析によって確認した。抗体タンパク質の安定な産生のために、プラスミドＤＮＡを使用してＣＨＯＤＧ４４細胞を形質転換した。図１０Ｂは、Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］連結ペプチドを含むｈｕＣＣ４９２ｓｃ（Ｆｖ）２四価抗体（Ｎ−ｓｃＦｖ四価ミニボディ）遺伝子のＤＮＡ配列を示す。図１１Ｂは、Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］連結ペプチドを含むｈｕＣＣ４９２ｓｃ（Ｆｖ）２四価抗体（Ｎ−ｓｃＦｖ四価ミニボディ）遺伝子のアミノ酸配列を示す。

単離細胞株から上清を回収し、免疫アッセイによって培養上清中の抗体濃度を決定した。ｈｕＣＣ４９２ｓｃ（Ｆｖ）２四価抗体（Ｎ−ｓｃＦｖ四価ミニボディ）のＡアイソフォームおよびＢアイソフォームを検出するために、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動およびその後の抗ＩｇＧ−ＨＲＰ結合体化抗体を使用したウェスタンブロットによって上清を分析した。これらの条件下で、約５０：５０の比のＡアイソフォームとＢアイソフォームにおいて、ｈｕＣＣ４９２ｓｃ（Ｆｖ）２四価ミニボディＡ型は単一の約１３８ｋＤａのホモ二量体として移動し、Ｂ型は約６９ｋＤａの２対として移動すると予想される。図２７に示すように、Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］連結ペプチドを含む代表的なｈｕＣＣ４９２ｓｃ（Ｆｖ）２四価ミニボディは、本質的に全てＡ型の四価ミニボディアイソフォームを産生することが認められた。

ｈｕＣＣ４９２ｓｃ（Ｆｖ）２四価ミニボディ配列に移入したＧ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］（配列番号９）連結ペプチドを含む細胞株を、抗体産生のために使用した。ｈｕＣＣ４９２ｓｃ（Ｆｖ）２四価ミニボディがＣＨ１ドメインを欠くため、プロテインＧクロマトグラフィを使用してタンパク質を精製することができない。その後、陰イオン交換クロマトグラフィ法、疎水性相互作用クロマトグラフィ法、およびサイズ排除クロマトグラフィ法の組み合わせを使用して抗体を精製した。Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］（配列番号９）連結ペプチドを含むｈｕＣＣ４９２ｓｃ（Ｆｖ）２四価ミニボディを、本質的に純度９７．６％の単一ピークとして精製した。還元および非還元精製タンパク質サンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって分析した。非還元条件下で、Ａ型は、単一の約１３８ｋＤａのホモ二量体として移動し、Ｂ型は約６９ｋＤａの２対として移動すると予想される。配列番号９に示す連結ペプチドは、Ａ型の産生比率が実質的に増加することが見出された。例示的結果を、図２８に示す。この結果は、Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］ヒンジ（配列番号９）により、本質的に全てＡ型のｈｕＣＣ４９２ｓｃ（Ｆｖ）２四価ミニボディ（Ｎ−ｓｃＦｖ四価ミニボディ）が産生され、Ｂ型はほとんどまたは全く検出されないことを示し、Ａアイソフォームの産生のためのこのヒンジの有用性を一般に多価抗体などの複雑な抗体に適用可能であることが証明される。本発明をさらに二重特異性四価抗体形式にも適用可能であることが明らかである。精製ｈｕＣＣ４９２ｓｃ（Ｆｖ）２四価Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５ミニボディをサイズ排除クロマトグラフィによって試験し、本質的に９７．６％の単量体を含む単一ピークとして溶離されることが見出された（図２９）。

精製ｈｕＣＣ４９２ｓｃ（Ｆｖ）２四価Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５ミニボディを、Ｄｅｌｐｈｉａ蛍光光度計（ＷａｌｌａｃＩｎｃ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用した時間分解蛍光免疫アッセイによって、競合結合アッセイにおいてそのウシ顎下腺ムチン（ＴＡＧ−７２抗原の供給源）への結合能力について試験した。競合結合曲線を図３０に示す。ｈｕＣＣ４９２ｓｃ（Ｆｖ）２四価Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５ミニボディ、ｈｕＣＣ４９ミニボディ、ｈｕＣＣ４９ＣＨ２ドメイン欠失ｓｃ（Ｆｖ）２四価Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５抗体、およびコントロール親ＣＨ２ドメイン欠失ｈｕＣＣ４９（ｈｕＣＣ４９またはＩＤＥＣ１５９という）抗体を評価した。両方の四価抗体の相対結合活性は、コントロール親ｈｕＣＣ４９抗体またはミニボディよりもアビディティが高いことが見出され（ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ４．０ｆｏｒＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標），ＧｒａｐｈＰａｄ，Ｓｏｆｔｗａｒｅ，ＳａｎＤｉｅｇｏＣａｌｉｆｏｒｎｉａＵＳＡ．ｗｗｗ．ｇｒａｐｈｐａｄ．ｃｏｍ）、これは予想された抗体結合部位数の増加と一致した。

（実施例１３：新規の連結ペプチドを含むＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）ｐ５Ｅ８ＣＨ２ドメイン欠失四価抗体の調製およびＡアイソフォームの優先的合成）
ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）ｐ５Ｅ８Ｇ１は、ヒトγ１定常領域およびκ定常領域にそれぞれ融合したマカクザル重鎖および軽鎖の可変領域を含むキメラマカクザル／ヒト（ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標））モノクローナル抗体である。ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）ｐ５Ｅ８Ｇ１は、ヒトＣＤ２３（ＩｇＥの低親和性受容体（ＦｃεＲＩＩ））に結合する（ＭａｖｒｏｍａｔｉｓａｎｄＣｈｅｓｏｎ．２００３．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２１：１８７４；米国特許出願２００３００５９４２４号）。表２に示したＧ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］合成連結ペプチド（配列番号９）を含むＣＨ２ドメイン欠失ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）ｐ５Ｅ８ｓｃ（Ｆｖ）２四価抗体を、実施例１０と類似のストラテジーを使用して構築した。ｓｃ（Ｆｖ）２四価抗体の構築で使用されるＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）ｐ５Ｅ８ｓｃＦｖは、短い合成リンカーによってＶＬ→（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３リンカー→ＶＨ方向に繋がれたｐ５Ｅ８ＶＬ領域およびＶＨ領域の配列から構成され、実施例１２により詳細に記載している。正確な配列を、ＤＮＡ配列分析によって確認した。抗体タンパク質の安定な産生のために、プラスミドＤＮＡを使用してＣＨＯＤＧ４４細胞を形質転換した。図１２Ａは、Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］連結ペプチドを含む重鎖ＣＨ２ドメイン欠失ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）ｐ５Ｅ８ｓｃ（Ｆｖ）２四価抗体のＤＮＡ配列を示す。図１２Ｂは、軽鎖ＣＨ２ドメイン欠失ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）ｐ５Ｅ８ｓｃ（Ｆｖ）２四価抗体のＤＮＡ配列を示す。図１３Ａは、Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］連結ペプチドを含む重鎖ＣＨ２ドメイン欠失ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）ｐ５Ｅ８ｓｃ（Ｆｖ）２四価抗体のアミノ酸配列を示す。図１３Ｂは、Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］連結ペプチドを含む軽鎖ＣＨ２ドメイン欠失ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）ｐ５Ｅ８ｓｃ（Ｆｖ）２四価抗体のアミノ酸配列を示す。

安定にトランスフェクトされた細胞株から上清を回収し、免疫アッセイによって培養上清中の抗体濃度を決定した。Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］連結ペプチドを含むＣＨ２ドメイン欠失ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）ｐ５Ｅ８ｓｃ（Ｆｖ）２四価抗体のＡアイソフォームおよびＢアイソフォームを検出するために、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動およびその後の抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ結合体化抗体を使用したウェスタンブロットによって上清を分析した。これらの条件下で、Ａ型は単一の約１７０ｋＤａのホモ二量体として移動し、Ｂ型は約８５ｋＤａの２対として移動すると予想される。配列番号９に示す連結ペプチドは、Ａ型四価抗体の産生比率が実質的に増加することを見出した。例示的結果を図３１に示す。これらの結果は、Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］連結ペプチド（配列番号９）によって本質的に全てＡ型のＣＨ２ドメイン欠失ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）ｐ５Ｅ８ｓｃ（Ｆｖ）２四価抗体が産生されてＢ型は検出不可能であることを示し、Ａ型アイソフォームＣＨ２ドメイン欠失ｓｃ（Ｆｖ）２四価抗体の産生のためのこのヒンジの有用性を種々の特異性を示す抗体に一般に適用可能であることが証明された。

（実施例１４：新規の連結ペプチドを含むＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）ｐ５Ｅ８ミニボディの調製およびＡアイソフォームの優先的合成）
ミニボディは、免疫グロブリンヒンジ領域およびＣＨ３ドメインに融合したｓｃＦｖからなる一本鎖ポリペプチドである。ミニボディ単鎖ポリペプチド分子の調製は、米国特許第５，８３７，８２１号に記載されている。通常、インタクトなＩｇＧ分子では、ヒンジ領域中の２３０位のシステイン残基が２１４位のカルボキシ末端軽鎖定常ドメインのシステイン残基と共有結合性ジスルフィド結合を形成し、重鎖および軽鎖のポリペプチドが結合する（Ｋａｂａｔナンバリングシステム）。ミニボディのデザインでは、軽鎖定常領域は存在せず、ジスルフィド結合の形成に関与する２つのシステインのうちの１つが消失している。しかし、２３０位のヒンジ領域中の残りの単一のシステインが、おそらくヒンジ領域構造に寄与するホモタイプの鎖間ジスルフィド結合に関与すると提案されているため、そのままにした。

ＣＨ２ドメインを欠くミニボディは細胞から分泌され、図３２に示すように、ＡアイソフォームおよびＢアイソフォームを含む混合物として培養上清中に蓄積し、おそらくアセンブリされていない半分子である。これらの形態の比率は非常に変化し、純粋な産物の再現可能に調製することは困難である。免疫グロブリンＣＨ１／ＣＬドメインが存在しないため、プロテインＧ免疫アフィニティマトリクスを使用した全ミニボディの単離が不可能にされる。多数のクロマトグラフィストラテジーを使用してホモ二量体（ＭＷ約８０〜９０ｋＤ）からアセンブリされていない半分子（ＭＷ約４０〜４５ｋＤ）を分離することができる一方で、ＣＨ１／ＣＬドメインも存在しないため残りのインタクトなＡアイソフォームおよびＢアイソフォームをＨＩＣクロマトグラフィ（本明細書中に記載）などの技術を使用して互いに有効に分離することができない。２つのアイソフォームの分子量がほぼ同一であり、この特徴に基づいた分離が妨げられるため、サイズ排除クロマトグラフィによってこれらのアイソフォームを分離することもできない。したがって、ミニボディ調製物の組成物は、実際は、ＡアイソフォームとＢアイソフォームとの混合物からなる複合物であり得る。表２に示したＧ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］連結ペプチド（配列番号９）を含むように操作されたＣＨ２ドメイン欠失ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）ｐ５Ｅ８ミニボディの産生を試験した。

ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）ｐ５Ｅ８ｓｃＦｖをＰＣＲ増幅によって構築した。ｓｃＦｖを両方向（ＶＬ→（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３リンカー→ＶＨ（ＶＬ／ＶＨ）およびＶＨ→（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３リンカー→ＶＬ（ＶＨ／ＶＬ））で構築した。構築で使用したオリゴヌクレオチドを以下の表に示す。

ＶＬ／ＶＨｓｃＦｖを２工程で構築した。５’ＶＬＰＣＲ正方向プライマーＮ−２３ＶＬ−１Ｆ（配列番号３７）は、発現ベクター中でｓｃＦｖを免疫グロブリンシグナルペプチドに結合させるためのＢｓｐＬＵ１１Ｉ制限エンドヌクレアーゼ部位を含んでいた。３’ＶＬＰＣＲ逆方向プライマー２３−ＶＬ−１Ｒ（配列番号３８）は、ＶＬ領域とＶＨ領域との結合に使用される（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３リンカーペプチドを部分的にコードする配列を含んでいた。５’正方向ＶＨＰＣＲプライマー２３−ＶＨ−２Ｆ（配列番号３０）もＶＬ領域とＶＨ領域との結合に使用される（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３リンカーペプチドを部分的にコードする配列を含み、３’ＶＨＰＣＲ逆方向プライマーＮ−２３−ＶＨ−２Ｒ（配列番号４０）はｓｃＦｖをヒンジ領域に結合させるためのＳａｌＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を含んでいた。２つのＶ領域を、２つのＰＣＲプライマー組を使用してＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）ｐ５Ｅ８Ｇ１抗体を含むプラスミドＤＮＡ基質から増幅し、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３リンカーをコードする共通の重複配列を介した第２のＰＣＲ反応においてｓｃＦｖをアセンブリした。ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）ｐ５Ｅ８ｓｃＦｖ遺伝子フラグメントをゲルで単離し、ＢｓｐＬＵ１１ＩおよびＳａｌＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］連結ペプチドを含むＢｓｐＬＵ１１ＩおよびＳａｌＩ二重消化ＣＨ２ドメイン欠失抗体多シストロン性発現ベクターにクローニングした。ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）ｐ５Ｅ８ＶＨ／ＶＬｓｃＦｖを類似の様式で表７および８に示すＰＣＲプライマー対Ｎ−２３ＶＨ−１Ｆ（配列番号４１）および２３−ＶＨ−１Ｒ（配列番号３６）ならびに２３−ＶＬ−２Ｆ（配列番号４３）およびＮ−２３−ＶＬ−２Ｒ（配列番号４４）を使用して構築した。完了した両構築物の正確な配列を、ＤＮＡ配列分析によって正確な配列を確認した。抗体タンパク質の一過性産生のために、プラスミドＤＮＡを使用してＣＨＯＤＧ４４細胞を形質転換した。図１４は、ＶＬ→ＶＨ方向（ＶＬ／ＶＨ）でＧ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］連結ペプチドを含むＣＨ２ドメイン欠失ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）ｐ５Ｅ８ＶＬ／ＶＨミニボディのＤＮＡ配列を示す。図１５は、ＶＨ→ＶＬ方向（ＶＨ／ＶＬ）でＧ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］連結ペプチドを含むＣＨ２ドメイン欠失ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）ｐ５Ｅ８ＶＨ／ＶＬミニボディのＤＮＡ配列を示す。図１６は、Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］連結ペプチドを含むＣＨ２ドメイン欠失ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）ｐ５Ｅ８ＶＬ／ＶＨミニボディのアミノ酸配列を示す。図１７は、Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］連結ペプチドを含むＣＨ２ドメイン欠失ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）ｐ５Ｅ８ＶＨ／ＶＬミニボディのアミノ酸配列を示す。

トランスフェクトされた細胞株から上清を回収し、免疫アッセイによって培養上清中の抗体濃度を決定した。培養上清中に存在するミニボディ分子を、ＥＬＩＳＡによってプラスチック製のマイクロタイタープレート上に固定した可溶性ＣＤ２３抗原への結合について分析した。図３３に示す効果は、Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］連結ペプチドを含むＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）ｐ５Ｅ８ＶＨ／ＶＬおよびＶＬ／ＶＨミニボディが共に用量応答様式で等しくＣＤ２３抗原に結合することができることを証明する。

Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］連結ペプチドを含むＣＨ２ドメイン欠失ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）ｐ５Ｅ８ミニボディのＡアイソフォームおよびＢアイソフォームを検出するために、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動およびその後の抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ結合体化抗体を使用したウェスタンブロットによって上清を分析した。これらの条件下で、Ａ型は単一の約８０〜９０ｋＤａのホモ二量体として移動し、Ｂ型は約４０〜４５ｋＤａの２対として移動すると予想される。配列番号９に示す連結ペプチドは、両ミニボディについてＡ型の産生比率が実質的に増加することを見出した。例示的結果は図３４に示されている。これらの結果は、Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］連結ペプチド（配列番号９）によって本質的に全てＡ型のＣＨ２ドメイン欠失ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）ｐ５Ｅ８ミニボディが産生されてＢ型は検出不可能であることを示す。

等価物。当業者は、日常的な実験しか使用せずに本明細書中に記載の本発明の特定の実施形態に対する多数の等価物を認識するか確認することができる。このような等価物は、以下の特許請求の範囲に含まれることが意図される。

図１は、ドメイン欠失抗体中で１２０ｋＤａの二量体として出現するＡ型および６０ｋＤａの単量体として出現するＢ型を示す。図２は、それぞれヒンジ連結ペプチド（ＨＣＰ）を含む例示的な二鎖二量体ミニボディおよび例示的な二鎖二量体四価ミニボディの略図を示す。他の形状も可能であり、例えば、二重特異性となるように連結ペプチド（ＨＣＰ）を含む二鎖二量体四価ミニボディを構築することもできる。別の実施形態では、ｓｃＦｖ中のＶＨドメインおよびＶＬドメインの方向を変更することができる。図３は、ヒンジ連結ペプチド（ＨＣＰ）を含む四鎖二量体二重特異性抗体の略図を示す。二重特異性となるようにヒンジ連結ペプチド（ＨＣＰ）を含む四鎖二量体二重特異性抗体を構築することもできる。ＶＨドメインおよびＶＬドメインの方向を変更することができる。図４は、それぞれＣＨ３のカルボキシル末端に付加されたｓｃＦｖおよびヒンジ連結ペプチドを含む四鎖二量体四価ｓｃＦｖ抗体（Ｃ−ｓｃＦｖ四価抗体）および四鎖四価ｓｃＦｖＣＨ２ドメイン欠失抗体（Ｃ−ｓｃＦｖ四価ＣＨ２ドメイン欠失抗体）の略図を示す。ｓｃＦｖ中のＶＨドメインおよびＶＬドメインの方向を変更することができる。図５は、ヒンジ連結ペプチド（ＨＣＰ）を含む四鎖二量体ＣＨ２ドメイン欠失四価（Ｎ_Ｌ−ｓｃＦｖＣＨ２ドメイン欠失四価）抗体の略図を示す。二重特異性となるように連結ペプチド（ＨＣＰ）を含む四鎖二量体ＣＨ２ドメイン欠失四価抗体を構築することもできる。軽鎖に付加したｓｃＦｖ中のＶＨドメインおよびＶＬドメインの方向を変更することができる。図６は、ヒンジ連結ペプチド（ＨＣＰ）を含む四鎖二量体ＣＨ２ドメイン欠失四価（Ｎ_Ｈ−ｓｃＦｖＣＨ２ドメイン欠失四価）抗体の略図を示す。二重特異性となるように連結ペプチド（ＨＣＰ）を含む四鎖二量体ＣＨ２ドメイン欠失四価抗体を構築することもできる。重鎖に付加したｓｃＦｖ中のＶＨドメインおよびＶＬドメインの方向を変更することができる。図７は、ヒンジ連結ペプチド（ＨＣＰ）を含む二鎖二量体四価ミニボディ（Ｃ−ｓｃＦｖ四価ミニボディ）の略図を示す。二重特異性となるように連結ペプチド（ＨＣＰ）を含む二鎖二量体四価ミニボディを構築することもできる。両方のｓｃＦｖ中のＶＨドメインおよびＶＬドメインの方向を変更することができる。図８Ａ（配列番号１６）は、重鎖ＣＨ２ドメイン欠失ｓｃ（Ｆｖ）２四価（Ｃ−ｓｃＦｖ四価ＣＨ２ドメイン欠失）ｈｕＣＣ４９遺伝子の一本鎖ＤＮＡ配列を示す。図８Ｂ（配列番号１７）は、合成Ｇ１／Ｇ３：／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］ヒンジ連結ペプチドを含む重鎖四価ＣＨ２ドメイン欠失ｓｃ（Ｆｖ）２四価（Ｃ−ｓｃＦｖ四価ＣＨ２ドメイン欠失）ｈｕＣＣ４９遺伝子の一本鎖ＤＮＡ配列を示す。図８Ｃ（配列番号１８）は、軽鎖ＣＨ２ドメイン欠失ｓｃ（Ｆｖ）２四価（Ｃ−ｓｃＦｖ四価ＣＨ２ドメイン欠失）ｈｕＣＣ４９の一本鎖ＤＮＡ配列を示す。図９Ａ（配列番号１９）は、重鎖ＣＨ２ドメイン欠失ｓｃ（Ｆｖ）２四価（Ｃ−ｓｃＦｖ四価ＣＨ２ドメイン欠失）ｈｕＣＣ４９のアミノ酸配列を示す。図９Ｂ（配列番号２０）は、合成Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］ヒンジ連結ペプチドを含む重鎖ＣＨ２ドメイン欠失ｓｃ（Ｆｖ）２四価（Ｃ−ｓｃＦｖ四価ＣＨ２ドメイン欠失）ｈｕＣＣ４９のアミノ酸配列を示す。図１０Ａ（配列番号２２）は、ＣＨ２ドメイン欠失ｈｕＣＣ４９四価（Ｎ−ｓｃＦｖ四価）ミニボディ遺伝子の一本鎖ＤＮＡ配列を示す。図１０Ｂ（配列番号２３）は、合成Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］ヒンジ連結ペプチドを含む四価ＣＨ２ドメイン欠失（Ｎ−ｓｃＦｖ四価）ｈｕＣＣ４９四価ミニボディ遺伝子の一本鎖ＤＮＡ配列を示す。図１１Ａ（配列番号２４）は、四価ＣＨ２ドメイン欠失（Ｎ−ｓｃＦｖ四価）ｈｕＣＣ４９ミニボディのアミノ酸配列を示す。図１１Ｂ（配列番号２５）は、合成Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］ヒンジ連結ペプチドを含む四価ＣＨ２ドメイン欠失（Ｎ−ｓｃＦｖ四価）ｈｕＣＣ４９ミニボディのアミノ酸配列を示す。図１２Ａ（配列番号２６）は、Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］ヒンジ連結ペプチドを含む重鎖四価ＣＨ２ドメイン欠失ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）ｐ５Ｅ８ｓｃ（Ｆｖ）２（Ｃ−ｓｃＦｖ四価ＣＨ２ドメイン欠失）抗体遺伝子の一本鎖ＤＮＡ配列を示す。図１２Ｂ（配列番号２７）は、軽鎖四価ＣＨ２ドメイン欠失（Ｃ−ｓｃＦｖ四価ＣＨ２ドメイン欠失）ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）ｐ５Ｅ８ｓｃ（Ｆｖ）２遺伝子の一本鎖ＤＮＡ配列を示す。図１３Ａ（配列番号２８）は、Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］ヒンジ連結ペプチドを含む重鎖四価ＣＨ２ドメイン欠失（Ｃ−ｓｃＦｖ四価ＣＨ２ドメイン欠失）ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）ｐ５Ｅ８ｓｃ（Ｆｖ）２抗体のアミノ酸配列を示す。図１３Ｂ（配列番号２９）は、軽鎖四価ＣＨ２ドメイン欠失（Ｃ−ｓｃＦｖ四価ＣＨ２ドメイン欠失）ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）ｐ５Ｅ８ｓｃ（Ｆｖ）２抗体のアミノ酸配列を示す。図１４（配列番号３０）は、Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］ヒンジ連結ペプチドを含むＣＨ２ドメイン欠失ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）ｐ５Ｅ８ＶＬ／ＶＨミニボディ遺伝子の一本鎖ＤＮＡ配列を示す。図１５（配列番号３１）は、Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］ヒンジ連結ペプチドを含むＣＨ２ドメイン欠失ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）ｐ５Ｅ８ＶＨ／ＶＬミニボディ遺伝子の一本鎖ＤＮＡ配列を示す。図１６（配列番号３２）は、Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］ヒンジ連結ペプチドを含むＣＨ２ドメイン欠失ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）ｐ５Ｅ８ＶＬ／ＶＨミニボディのアミノ酸配列を示す。図１７（配列番号３３）は、Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］ヒンジ連結ペプチドを含むＣＨ２ドメイン欠失ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）ｐ５Ｅ８ＶＨ／ＶＬミニボディのアミノ酸配列を示す。図１８は、ｈｕＣＣ４９ドメイン欠失ｓｃ（Ｆｖ）２四価（Ｃ−ｓｃＦｖ四価ＣＨ２ドメイン欠失）抗体を産生する５つの独立したクローン由来の上清のウェスタンブロットを示す。各上清を還元条件下および非還元条件下で電気泳動した。図１９は、精製されたＡ型およびＢ型のｈｕＣＣ４９ドメイン欠失ｓｃ（Ｆｖ）２四価（Ｃ−ｓｃＦｖ四価ＣＨ２ドメイン欠失）抗体のクーマシーブルー染色ゲルを示す。各抗体を、還元条件下および非還元条件下で電気泳動した。図２０は、精製されたＡ型ｈｕＣＣ４９ドメイン欠失ｓｃ（Ｆｖ）２四価（Ｃ−ｓｃＦｖ四価ＣＨ２ドメイン欠失）抗体がＨＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィによって主に単一ピークとして溶離することを示す。図２１は、Ｄｅｌｐｈｉａ蛍光光度計（ＷａｌｌａｃＩｎｃ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用した時間分解蛍光免疫アッセイによるＡ型ｈｕＣＣ４９ドメイン欠失ｓｃ（Ｆｖ）２四価（Ｃ−ｓｃＦｖ四価ＣＨ２ドメイン欠失）抗体とウシ顎下ムチン（ＴＡＧ−７２抗原の供給源）との競合結合アッセイの結果を示す。図２２は、Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］ヒンジ連結ペプチドを含むｈｕＣＣ４９のＣＨ２ドメイン欠失ｓｃ（Ｆｖ）２四価（Ｃ−ｓｃＦｖ四価ＣＨ２ドメイン欠失）抗体を産生する代表的なクローン由来の上清のウェスタンブロットを示す。図２３は、Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］ヒンジ連結ペプチドを含む精製されたＡ型ｈｕＣＣ４９のＣＨ２ドメイン欠失ｓｃ（Ｆｖ）２四価Ｇ１／Ｇ３／ＰＡＰ（Ｃ−ｓｃＦｖ四価ＣＨ２ドメイン欠失）抗体のクーマシーブルー染色ゲルを示す。図２４は、Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］ヒンジ連結ペプチドを含む精製されたＡ型ｈｕＣＣ４９のＣＨ２ドメイン欠失ｓｃ（Ｆｖ）２四価Ｇ１／Ｇ３／ＰＡＰ（Ｃ−ｓｃＦｖ四価ＣＨ２ドメイン欠失）抗体がＨＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィによって主に単一ピークとして溶離することを示す。図２５は、Ｄｅｌｐｈｉａ蛍光光度計（ＷａｌｌａｃＩｎｃ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用した時間分解蛍光免疫アッセイによるＧ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］ヒンジ連結ペプチドを含むＡ型ｈｕＣＣ４９ＣＨ２ドメイン欠失ｓｃ（Ｆｖ）２四価Ｇ１／Ｇ３／ＰＡＰ（Ｃ−ｓｃＦｖ四価ＣＨ２ドメイン欠失）抗体とウシ顎下ムチン（ＴＡＧ−７２抗原の供給源）との競合結合アッセイの結果を示す。図２６は、ｈｕＣＣ４９ミニボディ、ｈｕＣＣ４９の２ｓｃ（Ｆｖ）２四価抗体（Ｎ−ｓｃＦｖ四価ｈｕＣＣ４９ミニボディ）、およびｈｕＣＣ４９のＣＨ２ドメイン欠失抗体を産生する代表的なクローン由来の上清のウェスタンブロットを示す。還元条件下および非還元条件下で電気泳動した上清についてウェスタンブロットを行った。図２７は、ｈｕＣＣ４９の２ｓｃ（Ｆｖ）２四価抗体（Ｎ−ｓｃＦｖ四価ｈｕＣＣ４９ミニボディ）およびＧ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］ヒンジ連結ペプチドを含むｈｕＣＣ４９の２ｓｃ（Ｆｖ）２四価抗体（Ｎ−ｓｃＦｖ四価ｈｕＣＣ４９ミニボディ）を産生する代表的なクローン由来の上清のウェスタンブロットを示す。図２８は、Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］ヒンジ連結ペプチドを含む精製されたＡ型ｈｕＣＣ４９ドメイン欠失ｓｃ（Ｆｖ）２四価抗体（Ｎ−ｓｃＦｖ四価ミニボディ）のクーマシーブルー染色ゲルを示す。図２９は、Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］ヒンジ連結ペプチドを含む精製されたＡ型ｈｕＣＣ４９ドメイン欠失ｓｃ（Ｆｖ）２四価抗体（Ｎ−ｓｃＦｖ四価ミニボディ）がＨＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィによって主に単一ピークとして溶離することを示す。図３０は、Ｄｅｌｐｈｉａ蛍光光度計（ＷａｌｌａｃＩｎｃ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用した時間分解蛍光免疫アッセイによるＧ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］ヒンジ連結ペプチドを含むｈｕＣＣ４９ドメイン欠失ｓｃ（Ｆｖ）２四価抗体（Ｎ−ｓｃＦｖ四価ミニボディ）、ｈｕＣＣ４９ミニボディ、Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］ヒンジ連結ペプチドを含むｈｕＣＣ４９のＣＨ２ドメイン欠失ｓｃ（Ｆｖ）２四価抗体（Ｃ−ｓｃＦｖ四価抗体）、およびコントロール親ＣＨ２ドメイン欠失ｈｕＣＣ４９（ＨｕＣＣ４９またはＩＤＥＣ１５９と呼ばれる）とウシ顎下ムチン（ＴＡＧ−７２抗原の供給源）との競合結合アッセイの結果を示す。図３１は、Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］ヒンジ連結ペプチドを含む四価ＣＨ２ドメイン欠失（Ｃ−ｓｃＦｖ四価ＣＨ２ドメイン欠失）ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）ｐ５Ｅ８ｓｃ（Ｆｖ）２抗体を産生する細胞株由来の上清のウェスタンブロットを示す。図３２は、ＣＨ２ドメイン欠失ｈｕＣＣ４９ＶＬ／ＶＨミニボディを産生する５つの独立した細胞株由来の上清のウェスタンブロットを示す。ミニボディサンプルを、非還元変性条件下で分析し、ＡアイソフォームおよびＢアイソフォームの存在が明らかとなった。図３３は、Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］連結ペプチドを含むＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）ｐ５Ｅ８のＶＨ／ＶＬおよびＶＬ／ＶＨミニボディのＣＤ２３抗原への結合についてのＥＬＩＳＡ結合アッセイの結果を示す。ｐ５Ｅ８Ｇ１は、インタクトな全長ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）ＩｇＧ１である。図３４は、Ｇ１／Ｇ３／Ｐｒｏ２４３Ａｌａ２４４Ｐｒｏ２４５＋［Ｇｌｙ／Ｓｅｒ］連結ペプチドを含むＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）ｐ５Ｅ８のＶＨ／ＶＬおよびＶＬ／ＶＨミニボディを産生する細胞株由来の上清のウェスタンブロットを示す。図３５Ａは、％ＩＤ／ｇｍによって測定したコントロール親ｈｕＣＣ４９およびｈｕＣＣ４９ＣＨ２ドメイン欠失ｓｃ（Ｆｖ）２四価抗体の腫瘍保持を示す。図３５Ｂは、ピーク抗体蓄積に対して標準化した同一の保持データを示す。

Claims

少なくとも４つの結合部位および少なくとも２つのポリペプチド鎖を含むポリペプチド二量体を含む組成物であって、該少なくとも２つのポリペプチド鎖が少なくとも１つの免疫グロブリン重鎖部分、およびキメラヒンジを含む合成連結ペプチドを含み、該合成連結ペプチドは、２３９位〜２４１位（Ｋａｂａｔナンバリングシステム）に対応するＩｇＧ１ヒンジ領域の少なくとも中央ヒンジ部分と、ＩｇＧ３ヒンジ領域の少なくとも一部とを含み、
該ポリペプチド二量体の９０％超が、少なくとも１つの鎖間ジスルフィド結合を介して結合されているポリペプチド鎖を含む、組成物。
前記重鎖部分が、ＩｇＧ１アイソタイプの抗体に由来する、請求項１に記載の組成物。
少なくとも４つの結合部位および少なくとも２つのポリペプチド鎖を含むポリペプチド二量体を含む組成物であって、該少なくとも２つのポリペプチド鎖は、ＩｇＧ１抗体アイソタイプに由来する少なくとも１つの免疫グロブリン重鎖部分、およびキメラヒンジを含む合成連結ペプチドを含み、該ポリペプチド二量体の９０％超が、少なくとも１つの鎖間ジスルフィド結合を介して結合されているポリペプチド鎖を含む、組成物。
前記合成連結ペプチドは、ＩｇＧ１ヒンジドメインの少なくとも一部およびＩｇＧ３ヒンジドメインの少なくとも一部を含む、請求項２に記載の組成物。
前記１つのポリペプチド鎖の少なくとも１つが、前記連結ペプチドを介してＶＬドメイン、ＶＨドメイン、またはＣＨ１ドメインに直接結合したＣＨ３ドメインを含む、請求項１または３に記載の組成物。
前記ポリペプチド鎖がＣＨ２ドメインの全てまたは一部を欠く、請求項１または３に記載の組成物。
前記ポリペプチド二量体が、２つまたはそれ以上の鎖間ジスルフィド結合を介して結合しているポリペプチド鎖を含む、請求項１または３に記載の組成物。
前記合成連結ペプチドが、２２６位〜２３８位（Ｋａｂａｔナンバリングシステム）に対応するＩｇＧ１上部ヒンジ残基を含む、請求項１または３に記載の組成物。
前記キメラヒンジが、２４１ＥＥ位〜２４２位（Ｋａｂａｔナンバリングシステム）に対応する１つのＩｇＧ３中央ヒンジ反復モチーフを含む、請求項１、３または４に記載の組成物。
前記二量体が二重特異性である、請求項１または３に記載の組成物。
前記二量体が可溶性リガンドに特異的な少なくとも１つの結合部位を含む、請求項１または３に記載の組成物。
前記分子が細胞表面分子に特異的な少なくとも１つの結合部位を含む、請求項１または３に記載の組成物。
前記分子が腫瘍細胞抗原に特異的な２つの結合部位およびプロドラッグに特異的な２つの結合部位を含む、請求項１または３に記載の組成物。
前記プロドラッグに特異的な結合部位が触媒性である、請求項１３に記載の組成物。
前記合成連結ペプチドが、Ｋａｂａｔナンバリングシステム２４３位にプロリン残基を含む、請求項１または３に記載の組成物。
前記合成連結ペプチドが、Ｋａｂａｔナンバリングシステム２４４位にアラニン残基をさらに含み、そしてＫａｂａｔナンバリングシステム２４５位にプロリン残基をさらに含む、請求項１または３に記載の組成物。
前記連結ペプチドが、配列番号８、９、１４および１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１または３に記載の組成物。
医薬としての使用のための、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の組成物。
抗原結合分子を使用した治療の恩恵を受ける被験体の治療のための医薬の製造における、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の組成物の使用。
前記被験体が癌を罹患している、請求項１９に記載の使用。
前記被験体がリンパ腫を罹患している、請求項１９に記載の使用。
前記被験体が自己免疫疾患または自己免疫障害を罹患している、請求項１９に記載の使用。
前記被験体が炎症性疾患または炎症性障害を罹患している、請求項１９に記載の使用。
請求項１または３に記載のポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリペプチド鎖は、免疫グロブリン重鎖部分およびキメラヒンジを含む合成連結ペプチドを含む、核酸分子。
前記ポリペプチド二量体が４つのポリペプチド鎖を含み、該ポリペプチド鎖のうちの２つが少なくとも１つの免疫グロブリン重鎖部分、およびキメラヒンジを含む合成連結ペプチドを含む、請求項１または３に記載の組成物。
図８Ｂに示すヌクレオチド配列（配列番号１７）を含む核酸分子。
図８Ｃに示すヌクレオチド配列（配列番号１８）を含む核酸分子。
図１０Ｂに示すヌクレオチド配列（配列番号２３）を含む核酸分子。
図１２Ａに示すヌクレオチド配列（配列番号２６）を含む核酸分子。
図１２Ｂに示すヌクレオチド配列（配列番号２７）を含む核酸分子。
図１４に示すヌクレオチド配列（配列番号３０）を含む核酸分子。
図１５に示すヌクレオチド配列（配列番号３１）を含む核酸分子。
ベクター中に存在する、請求項２６〜３２のいずれか１項に記載の核酸分子。
請求項３３に記載のベクターを含む宿主細胞。
図９Ｂのアミノ酸配列（配列番号２０）を含む結合分子。
図９Ｃのアミノ酸配列（配列番号２１）を含む結合分子。
図１１Ｂのアミノ酸配列（配列番号２５）を含む結合分子。
図１３Ａのアミノ酸配列（配列番号２８）を含む結合分子。
図１３Ｂのアミノ酸配列（配列番号２９）を含む結合分子。
図１６のアミノ酸配列（配列番号３２）を含む結合分子。
図１７のアミノ酸配列（配列番号３３）を含む結合分子。
前記結合部位が、抗原結合部位、受容体のリガンド結合部分、およびリガンドの受容体結合部分からなる群から個別に選択される、請求項１または３に記載の組成物。
前記ポリペプチド鎖が、２Ｂ８、Ｌｙｍ１、Ｌｙｍ２、ＬＬ２、Ｈｅｒ２、Ｂ１、ＭＢ１、ＢＨ３、Ｂ４、Ｂ７２．３、ＣＣ４９、５Ｅ８、Ｂ３Ｆ６、および５Ｅ１０からなる群から選択される抗体に由来する少なくとも１つの結合部位を有する、請求項４２に記載の組成物。
前記ポリペプチド二量体が四価のミニボディ分子である、請求項１または３に記載の組成物。
前記ポリペプチド二量体が四価のドメイン欠失抗体分子である、請求項１または３に記載の組成物。
前記ポリペプチド二量体が二重特異性抗体である、請求項１または３に記載の組成物。
２つのポリペプチド鎖を含むミニボディ分子を含む組成物であって、該ポリペプチド鎖が免疫グロブリン重鎖部分、およびキメラヒンジを含む合成連結ペプチドを含み、該合成連結ペプチドは、２３９位〜２４１位（Ｋａｂａｔナンバリングシステム）に対応するＩｇＧ１ヒンジ領域の少なくとも中央ヒンジ部分と、ＩｇＧ３ヒンジ領域の少なくとも一部とを含み、該ポリペプチド鎖がＣＨ２ドメインの全てまたは一部を欠き、該ミニボディ分子の９０％超が、該ポリペプチド鎖が少なくとも１つの鎖間ジスルフィド結合を介して結合する形態で存在する、組成物。
前記重鎖部分が、ＩｇＧ１アイソタイプの抗体に由来する、請求項４７に記載の組成物。
２つのポリペプチド鎖を含むミニボディ分子を含む組成物であって、該ポリペプチド鎖がＩｇＧ１抗体アイソタイプに由来する少なくとも１つの免疫グロブリン重鎖部分、およびキメラヒンジを含む合成連結ペプチドを含み、該合成連結ペプチドは、２３９位〜２４１位（Ｋａｂａｔナンバリングシステム）に対応するＩｇＧ１ヒンジ領域の少なくとも中央ヒンジ部分と、ＩｇＧ３ヒンジ領域の少なくとも一部とを含み、該ミニボディ分子の９０％超が、該ポリペプチド鎖が少なくとも１つの鎖間ジスルフィド結合を介して結合する形態で存在する、組成物。
前記合成連結ペプチドは、ＩｇＧ１ヒンジドメインの少なくとも一部およびＩｇＧ３ヒンジドメインの少なくとも一部を含む、請求項４９に記載の組成物。
前記ポリペプチド鎖の少なくとも１つが、前記連結ペプチドを介してＶＬドメイン、ＶＨドメイン、またはＣＨ１ドメインに直接遺伝的に融合したＣＨ３ドメインを含む、請求項４７または４９に記載の組成物。
前記ポリペプチド鎖が全ＣＨ２ドメインを欠く、請求項４７または４９に記載の組成物。
前記分子が、２つまたはそれ以上の鎖間ジスルフィド結合を介して結合しているポリペプチド鎖を含む、請求項４７または４９に記載の組成物。
前記合成ペプチドが、２２６位〜２３８位（Ｋａｂａｔナンバリングシステム）に対応するＩｇＧ１上部ヒンジ残基を含む、請求項４７または４９に記載の組成物。
前記キメラヒンジが、２４１ＥＥ位〜２４２位（Ｋａｂａｔナンバリングシステム）に対応する１つのＩｇＧ３中央ヒンジ反復モチーフを含む、請求項４７、４９または５０に記載の組成物。
前記結合部位が、抗原結合部位、受容体のリガンド結合部分、およびリガンドの受容体結合部分からなる群から個別に選択される、請求項４７または４９に記載の組成物。
前記分子が二重特異性である、請求項４７または４９に記載の組成物。
前記連結ペプチドが、Ｋａｂａｔナンバリングシステム２４３位にプロリン残基を含む、請求項４７または４９に記載の組成物。
医薬としての使用のための、請求項４７〜５８のいずれか１項に記載の組成物。
抗原結合分子を使用した治療の恩恵を受ける被験体の治療のための医薬の製造における、請求項４７〜５８のいずれか１項に記載の組成物の使用。
請求項４７または４９に記載のポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
少なくとも４つの結合部位および少なくとも２つのポリペプチド鎖を有するポリペプチド二量体を含む組成物であって、該少なくとも２つのポリペプチド鎖が少なくとも１つの免疫グロブリン重鎖部分を含み、かつＣＨ２ドメインの全てまたは一部を欠き、該ポリペプチド二量体の９０％超が少なくとも１つの鎖間ジスルフィド結合を介して結合するポリペプチド鎖を含む、組成物。