DE69132629T2

DE69132629T2 - Oberflächenkomplexbildung von lymphotoxin

Info

Publication number: DE69132629T2
Application number: DE69132629T
Authority: DE
Inventors: Jeffrey Browning; F. Ware
Original assignee: University of California; Biogen Inc
Current assignee: University of California; Biogen MA Inc
Priority date: 1990-06-27
Filing date: 1991-06-27
Publication date: 2002-04-18
Anticipated expiration: 2011-06-28
Also published as: GR3036551T3; CA2086264A1; AU2716795A; AU688056B2; ES2157889T3; EP0536299A1; AU8228891A; CA2086264C; JPH06501456A; JP2004002461A; ATE201879T1; US5661004A; JP4099119B2; DE69132629D1; EP0536299B1; DK0536299T3; WO1992000329A1

Description

Diese Erfindung betrifft ein Protein, das von Lymphocyten und anderen Zelltypen produziert wird, und den Komplex, den es mit Lymphotoxin (LT) bildet. Insbesondere betrifft sie ein Membran-assoziiertes Protein, p33, das auf der Oberfläche von T-Lymphocyten, T- Zelllinien und Lymphokin-aktivierten Killerzellen identifiziert wird, und den Komplex, der gebildet wird, wenn p33 an LT bindet. Es ist zu erwarten, daß das p33-Protein dieser Erfindung von Nutzen ist beim Halten des in der Zelle gebildeten LT auf der Zelloberfläche, wo der p33/LT-Komplex als ein Mittel der Regulierung einer Entzündung wirken kann, als ein Mittel zur Inhibierung des Tumorwachstums, als ein Mittel zur Inhibierung von T-Zellen, als ein Mittel zur Aktivierung von T-Zellen oder als ein Mittel zur Regulierung von HIV. Darüber hinaus kann die Antitumor-Aktivität des p33/LT-Komplexes durch Tumor infiltrierende Lymphocyten (TILs), die mit dem Gen für p33 transfiziert sind, auf Tumorzellen übertragen werden.
Die hier beschriebene Erfindung wurde zum Teil im Verlauf der Arbeiten unter dem Antrag Nr. CA 35638-07-10 vom National Institutes of Health gemacht. Die U.S.-Regierung hat gewisse Rechte an dieser Erfindung.
Der Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) und Lymphotoxin (LT) sind lösliche Proteine, die ursprünglich wegen ihrer Fähigkeit auffielen, das Wachstum von Tumoren zu inhibieren [L. Old, "Tumor Nercrosis Factor", Science, 230, 630 (1985)]. Weitere Forschung zeigte, daß beide Proteine einen großen Bereich an Aktivitäten zeigen. TNF zum Beispiel scheint eine wichtige Rolle bei spezifischen Aspekten der metabolischen Kontrolle, bei der Antwort auf den Endotoxin-Schock und bei der Regulation der hämotopoetischen Zellentwicklung zu spielen. [B. Beutler et al., "The History, Properties, and Biological Effects of Cachectin", Biochemistry, 27, (1988); M. Akashi et al., "Lymphotoxin: Stimulation And Regulation of Colony Stimulating Factors in Fibroblasts", Blood, 74, 2383 (1989); G. Roodman et ah, "Tumor Necrosis Factor-alpha and Hematopoetic Progenitors: Effects Of Tumor Necrosis Factor On The Growth Of Erythroid Progenitors CFU-E And BFU-E And The Hematopoietic Cell Lines k562, HL60, And HEL Cells", Exp. Hematol., 15, 928 (1987)]. Zusammen mit IL-1 und IL-6 ist TNF auch ein wichtiger Mediator der entzündlichen Antwort. [D. Cavender et al., "Endothelial Cell Activation Induced By Tumor Necrosis Factor And Lymphotoxin", Amer. Jour. Path., 134, 551 (1989); R. Cotran et al., "Endothelial Activation Its Role In Inflammatory And Immune Reactions", in Endothelial Cell Biology, (Plenum Press, Simonescu & Simonescu, Hrsg., (1988) 335]. TNF scheint unter gewissen Bedingungen auch an der T-Zell- Aktivierung beteiligt zu sein. [M. Shalaby et al., "The Involvement Of Human Tumor Necrosis Factor-α And -β In The Mixed Lymphocyte Reaction", J. Immun., 141, 499 (1988); N. Damle et al., "Distinct Regulatory Effects of IL-4 and TNF-α During CD3-Dependent And CD3-Independent Initiation Of Human T-Cell Activation", Lymph. Res., 8, 85 (1989); G. Ranges et al., "Tumor Necrosis. Factor-α As A Proliferative Signal For An IL-2-Dependent T Cell Line: Strict Species Specificity of Action", Amer. Assoc. Immun.; 142, 1203 (1989); G. Ranges et al., "Tumor Necrosis Factor α/Cachectin Is A Growth Factor For Thymocytes", J. Exp. Med., 167, 1472 (1988); P. Scheurich et al., "Immunoregulatory Activity Of Recombinant Human Tumor Necrosis Factor (TNF)-α: Induction Of TNF Receptors On Human T Cells And TNF-α-Mediated Enhancement Of T Cell Responses", J. Immun., 138, 1786 (1987)].
LT hat ebenfalls viele Aktivitäten, im allgemeinen ähnlich, aber nicht identisch zu denen von TNF, einschließlich Tumor-Nekrose, Induktion eines Zustands der antiviralen Aktivität von polymorphonucleären Leukocyten, Induktion von Klasse I Haupthistokompatibilitätskomplex-Antigenen auf Endothelzellen, Induktion von Adhäsionsmolekülen auf dem Endothel und Stimulierung von Wachstumshormonen. [N. Ruddle and R. Homer, "The Role of Lymphotoxin in Inflammation", Prog. Allergy, 40, S. 162-182 (1988)].
In den letzten Jahren sind Gene sowohl für TNF als auch für LT isoliert und cloniert worden, was zu ihrer vollständigen Charakterisierung und zur Verfügbarkeit von rekombinanten Formen von beiden Proteinen führte. [P. Gray et al., "Cloning and Expression of cDNA For Human Lymphotoxin, A Lymphokine With Tumor Necrosis Activity", Nature, 312, S. 121-124 (1984); D. Pennica et al., "Human Tumor Necrosis Factor: Precursor Structure, Expression And Homology To Lymphotoxin", Nature, 312, 724 (1984)].
TNF wird von verschiedenen Arten von Zellen produziert, einschließlich Monocyten, Fibroblasten, T-Zellen und natürlichen Killer (NK)-Zellen. [D. Goeddel et al., "Tumor Necrosis Factors: Gene Structur And Biological Activities", Cold Spring Harbor Symposium Quant. Biol., 51, 597 (1986); D. Spriggs et al., Tumor Necrosis Factor Expression In Human Epithelial Tumor Cell Lines", J. Clin. Invest., 81, 455 (1988); M. Turner et al., "Human T Cells From Autoimmune And Normal Individuals Can Produce Tumor Necrosis Factor", Eur. J. Immun., 17, 1807 (1987)]. Die Sekretion von Lymphotoxin scheint eine spezifische Eigenschaft nur von aktivierten T-Zellen und gewissen B-lymphoblastoiden Tumoren zu sein. [N. Paul et al., "Lymphotoxin", Ann. Rev. Immun., 6, 407 (1988)].
Forscher haben ebenfalls murine und menschliche Formen von TNF gefunden, die mit der Oberfläche verschiedener Zellen assoziiert sind, entweder als ein Transmembran-Protein oder ein Rezeptor gebundenes Molekül [B. Luettig et al., "Evidence For the Existence of Two Forms of Membrane Tumor Necrosis Factor: An Integral Protein and a Molecule Attached To Its Receptor", J. Immun., 143, 4034 (1989); M. Kriegler et al., "A Novel Form of TNF/Cachectin Is a Cell Surface Cytotoxic Transmembrane Protein: Ramifications For the Complex Physiology of TNF", Cell, 53, S. 45-53 (1988); und M. Kinkhabwala et al., "A Novel Addition To the T Cell Repertory", J. Exp. Med., 171, S. 941-946 (1990)]. Einige Forscher haben auch angedeutet, daß eine Membran-assoziierte Form von Lymphotoxin unter gewissen Umständen auf der Oberfläche von Lymphocyten exprimiert werden kann [J. Hiserodt et al., "Identifleation of Membrane-Associated Lymphotoxin (LT) On Mitogen- Activated Human Lymphocytes Using Heterologous Anti-LT Antisera In Vitro", Cell. Immun., 34, S. 326-339 (1977); C. Ware et al., "Mechanisms of Lymphocyte-Mediated Cytotoxocity ", J. Immun., 126, S. 1927-1933 (1981); U. Anderson et al., J. Immunol. Methods. 123, 233 (1989); Y. Abe et al., Jpn. J. Canc. Res., 82, 23 (1991)].
Wir haben nun ein neues Oberflächenprotein identifiziert, p33, das in der Zelle produziertes LT zur Zellmembran dirigiert, wo p33 und LT als ein Komplex erscheinen (innerhalb dieser Offenbarung als "p33/LT" bezeichnet). Der p33/LT-Komplex kann ähnliche cytolytische und Zell-regulierende Aktivitäten gegenüber dem löslichen LT und TNF zeigen. Das p33-Protein kann einen neuen, für LT spezifischen Rezeptor darstellen (p33 bindet nicht TNF). Das Membran-assoziierte p33, komplexiert mit LT, kann als ein Komplex einen neuen Liganden für die Wechselwirkung von T-Zellen mit anderen Zellen darstellen und kann auch von Nutzen bei der zielgerichteten Zell-Lyse sein.
Das neue Protein der vorliegenden Erfindung wurde p33 genannt. Dieses Protein wird auf der Oberfläche von mehreren Arten von Lymphocyten-Zellen gefunden, einschließlich OKT3-stimulierte primäre T-Zellen, Antigen-spezifische, IL-2 abhängige CTL-Clone und ein PMA-stimuliertes menschliches T-Zell-Hybridom, II-23.D7. Es bildet einen neuen Komplex mit LT.
p33 hat ein Molekulargewicht von 31-35 kD, wie mittels Immunpräzipitation und SDS-PAGE bestimmt, und zeigt N-verknüpfte Glycosylierung. Zusätzlich enthält das Protein sowohl Methionin- als auch Cysteinreste, und die CNBr-Spaltung zeigt an, daß der Methioninrest (die Methioninreste) innerhalb von 1-2 kD vom N-Terminus oder C-Terminus liegt (liegen).
p33 auf der Zellmembran bindet mit in der Zelle produziertem LT und "dirigiert" so LT zur Zellmembran. In der Abwesenheit von p33 wird LT in das perizelluläre Medium sezerniert. Der p33/LT-Komplex und die anderen Polypeptid-Komplexe dieser Erfindung (sowohl nicht zellassoziiert als auch auf der Oberfläche von Zellen) werden von polyclonalen Antiseren, die gegen rekombinantes-Lymphotoxin (rLT) gebildet werden, das in CHO-Zellen exprimiert wird, oder von monoclonalen Antikörpern (mAbs), die gegen natürliches LT gebildet werden, erkannt. Darüber hinaus blockieren Antiseren, die den p33/LT-Komplex und die anderen Polypeptid-Komplexe dieser Erfindung erkennen, die gemischte Lymphocyten- Reaktion (MLR), einen immunologischen Standardtest der erwarteten proliferativen Antwort von T-Lymphocyten auf die allogene Stimulierung, d.h. die Einführung von T-Lymphocyten von einem anderen Individuum, die von den "Responder"-Lymphocyten als fremd (nichtselbst) erkannt werden. [vgl. z.B. M. Shalaby et al., "The Involvement of Human Tumor Necrosis Factors-α And-β In the Mixed Lymphocyte Reaction", J. Immun., 141, 499 (1988)].
Wenn sequenziert, ergibt das LT-Protein von dem von Zellen isolierten p33/LT- Komplex eine Sequenz, die genau übereinstimmt mit der für das sezernierte Lymphotoxin beschriebenen, d.h. (SEQ ID NR: 1) Leu Pro Gly Val Gly Leu Thr Pro Ser [P. Gray et al., "Cloning and Expression of cDNA For Human Lymphotoxin, A Lymphokine With Tumor Necrosis Activity", Nature, 312, S. 121-124 (1984)]. Der p33/LT-Komplex und die anderen Polypeptid-Komplexe dieser Erfindung jedoch können menschliches oder tierisches Lymphotoxin, rekombinantes Lymphotoxin, lösliches Lymphotoxin, sezerniertes Lymphotoxin und aktive Fragmente davon umfassen.
Wir glauben, daß die Polypeptide-Komplexe dieser Erfindung bei Ereignissen der T- Zell-Aktivierung wichtig sind und bei Zusammensetzungen und Verfahren zur T-Zell- Aktivierung oder T-Zell-Unterdrückung und als therapeutische Mittel bei der Behandlung der Entzündung oder für Anwendungen, die cytolytische Aktivitäten erfordern, wie die Inhibierung des Wachstums von Tumorzellen oder der Neoplasie von Nutzen sind. Wir glauben auch, daß die Polypeptide-Komplexe wichtig bei zellulären Immuntherapien sein können, einschließlich der Erhöhung der tumorociden Eigenschaften von tumorinfiltrierenden Lymphocyten bei der Therapie mit Tumorinfiltrierenden Lymphocyten ("TIL"). Antikörper gegen p33, seine verwandten Polypeptide, gegen den p33/LT-Komplex oder die anderen Polypeptid-Komplexe dieser Erfindung können auch die gefährlichen Wechselwirkungen von LT mit speziellen Rezeptoren unterbinden und so spezifisch andere LT-vermittelte Ereignisse beeinflussen als die, die durch die bekannten TNF-Rezeptor-Formen vermittelt werden. Rezeptoren für TNF, LT oder p33/LT oder ihre Derivate (d.h. lösliche Rezeptor- Immunoadhäsine) können ebenfalls verwendet werden, um die Polypeptide und Komplexe dieser Erfindung zu inhibieren.
Fig. 1 zeigt die Durchfluß-cytofluorometrische Analyse von OKT3-stimulierten, IL-2 expandierten peripheren Blutlymphocyten (PBL), die eine Reaktion mit drei verschiedenen Kaninchen-anti-rLT-Antiseren zeigen und im wesentlichen keine Rektion mit Kaninchen-anti- rTNF-Antiseren zeigen.
Fig. 2 zeigt die Durchfluß-cytofluorometrische Analyse eines menschlichen T-Zell- Hybridoms, II-23.D7, die die Anwesenheit (nach PMA-Behandlung) von LT-verwandten Epitopen auf der Zelloberfläche zeigt.
Fig. 3 zeigt die die Fähigkeit von, PMA-aktivierten II-23.D7-Zellen, anti-rLT- Antikörper zu binden. Proben von anti-rLT-Antiseren wurden mit PMA-behandelten U937- (nicht-LT-produzierenden) Zellen, (-O-), mit PMA-aktivierten II-23.D7-Hybridomzellen (10&sup8;, - -; 10&sup7;, - -) und ohne Zellen (Kontrolle - -) inkubiert. Serielle Verdünnungen der zeufreien Antiseren nach Inkubation wurden zu rLT zugegeben und in einem Cytotoxizitätstest gegen L929- (LT-sensitive) Zellen verwendet. Die Kurven zeigen, daß die rLT neutralisierenden Antikörper durch die aktivierten II-23.D7-Zellen aus den Antiseren entfernt worden waren.
Fig. 4 zeigt zwei Autoradiogramme (A und B), die die Immunpräzipitation von ¹²&sup5;I- markierten Oberflächenproteinen von PMA-aktivierten II-23.D7-Zellen zeigen. Fig. 4A zeigt die Immunpräzipitation eines ungefähr 24 kD-Oberflächenproteins (LT) und eines ungefähr 33 kD-Oberflächenproteins (p33) durch Kaninchen-anti-rLT-Antiserum nach der Immunisierung, aber nicht durch Kaninchenserum vor der Immunisierung. Fig. 4B zeigt zeigt eine 1- dimensionale CNBr-Spaltungskarte der 25 kD- und 33kD-Banden von Fig. 4A, verglichen mit rekombinantem TNF (rTNF), der in E.coli produziert worden war, und rekombinantem Lymphotoxin (rLT), der in CHO-Zellen produziert worden war [J. Browning et al., "Studies Of The Differing Effects Of Tumor Necrosis Factor and Lymphotoxin On The Growth Of Several Human Tumor Lines", J. Immun., 143, 1859 (1989)], beide mit (+) und ohne (-) CNBr-Spaltung.
Fig. 5 zeigt Autoradiogramme, die die Immunpräzipitation von TNF- und LTverwandten Proteinen von PMA-stimulierten II-23.D7-Zellen zeigen, die metabolisch mit ³&sup5;S- Methionin oder ³&sup5;S-Cystein markiert sind. Die Figur zeigt Erkennung eines Methionin- enthaltenden Oberflächenproteins von ungefähr 25 kD (LT) und eines Methionin- und Cystein-enthaltenden Oberflächenproteins von ungefähr 33 kD (p33) durch anti-rLT-Antiseren (L), aber nicht durch Antiseren vor der Immunisierung (P) oder anti-rTNF-Antiseren (T). Die Autoradiogramme zeigen auch, daß aktivierte II-23.D7-Zellen eine 26 kD-Form von TNF produzieren und lösliches Lymphotoxin sezernieren.
Fig. 6 zeigt die affinitätsgereinigte 1-D-CNBr-Peptidkartierung der Proteine von PMA-aktivierten II-23.D7-Zellen, die durch anti-rLT-Serum erkannt werden. Fig. 6A zeigt eine SDS-PAGE-Analyse der Proteine, die von einer anti-LT-Affinitätssäule eluiert wurden, die entweder mit prä-Immunisierungs (PRE)- oder post-Immunisierungs (POST)- Kaninchenseren hergestellt war. Fig. 6A zeigt, daß die ~33kD- und das 20kD- Proteinbanden nicht an eine Affinitätssäule banden, die unter Verwendung des prä- Immunisierungs (PRE) hergestellt worden war, aber an eine Affinitätssäule banden, die unter Verwendung des anti-rLT-Antiserums (POST) hergestellt worden war. Fig. 6B zeigt partielle CNBr-Spaltung der ~33kD- und der ~20kD-Proteine, die von der POST-Säule eluiert worden waren, verglichen mit parallel gelaufenem rTNF und rLT. Die Gele wurden durch Silberfärbung sichtbar gemacht.
Fig. 7 zeigt Autoradiogramme der ¹²&sup5;I-markierten ~25 kD- und ~33kD-Proteine (als "sLT" bzw. p33 bezeichnet), die durch aktivierte II-23.D7-Zellen immunpräzipitiert worden waren, behandelt mit N-Glycanase (N-gly), mit einem Gemisch von Neuraminidase und O- Glycanase (O-gly) oder mit allen drei Enzymen.
Fig. 8 zeigt die Ergebnisse einer erneuten Immunpräzipitation der gemeinsam präzipitierten p33- und LT-Proteine, um weiterhin zu untersuchen, ob sie in immunogener Hinsicht verwandt sind.
Fig. 9 (umfassend die Teile 9A und 9B) zeigt die Ergebnisse der isoelektrischen Fokussierung der immunpräzipitierten p33- und p25 (LT)-Proteine unter denaturierenden Bedingungen.
Fig. 10(umfassend die Teile 10A und 1QB) zeigt die Ergebnisse der isoelektrischen Fokussierung der immunpräzipitierten p33- und p25 (LT)-Proteine unter nativen Bedingungen. Zusammen zeigen die Fig. 9 und 10, daß p33 und LT einen denaturierbaren Komplex bilden.
Fig. 11 zeigt die Durchfluß-cytofluorometrische Analyse der differentiell exprimierten Oberflächenproteine auf T-Zellen und Monocyten nach Stimulierung mit einem Gemisch von LPS, IFN-γ und OKT3. Es wurde beobachtet, daß von einem Pool an stimulierten PBL abgetrennte T-Zellen ein Oberflächenprotein exprimierten, das von anti-rLT- Antiseren (LT) erkannt wurde, wohingegen abgetrennte Monocyten ein Oberflächenprotein exprimierten, das von anti-rTNF-Antiseren (TNF) erkannt wurde.
Fig. 12 zeigt die Durchfluß-cytofluorometrische Analyse von Oberflächen-LT- Formen auf leu-19&supmin;-und leu-19&spplus;- (d.h. natürlichen Killer) Zellen, die mit IL-2 behandelt waren. Die Analyse von mit IL-2 behandelten PBL mit sowohl markiertem leu-19 als auch anti-rLT bestätigt, daß Lymphokin-aktivierte Killer (LAK)-Zellen eine Oberflächenform von LT exprimieren.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung die Ausführungsformen, die in den Ansprüchen charakterisiert sind. Damit die hierin beschriebene Erfindung vollständig verstanden werden kann, wird die folgende ausführliche Beschreibung dargelegt.
Diese. Erfindung betrifft ein Membrantyp-Lymphocyten-Polypeptid, das ein Molekulargewicht von 31 bis 35 kD und sowohl Methionin- als auch Cysteinreste hat. Es ist in der Lage, mit Lymphotoxin (LT) eine Bindung einzugehen und ist auf der Oberfläche von OKT3-stimulierten primären T-Zellen und Antigen-spezifischen IL-2-abhängigen CTL- Clonen lokalisierbar.
Dieses Polypeptid kann nach der Expression von LT-verwandten Epitopen auf der Oberfläche besagter T-Zellen durch Oberflächen-Jodierung, gekoppelt mit Immunpräzipitation isoliert werden. Am meisten bevorzugt ist es p33. Das Polypeptid dieser Erfindung kann mit einer Zelloberfläche assoziiert sein oder es kann nicht mit einer solchen Oberfläche assoziiert sein.
Die Polypeptidkomplexe dieser Erfindung umfassen besagtes Polypeptid und ein Lymphotoxin. Mehr bevorzugt ist der Komplex p33/LT. Diese Komplexe können mit einer Zelle assoziiert sein oder nicht mit einer Zelle assoziiert sein.
Die Polypeptidkomplexe dieser Erfindung werden von polyspezifischen Antiseren, die gegen rekombinantes, in transfizierten Eierstockzellen des chinesischen Hamsters (CHO) exprimiertes Lymphotoxin (rLT) gebildet werden, von einem im Handel erhältlichen anti-LT monoclonalen Antikörper (Boehringer Mannheim) erkannt, was anzeigt, daß der Komplex LT- Epitope zeigt. Da zusätzlich das selbe moroclonale Antiserum, das den Komplex erkennt, auch die Lymphocyten-Mischkultur-Reaktion (MLR) blockiert, die monoclonalen anti-rLT- Antikörper die MLR aber nicht blockieren, scheinen die Komplexe der vorliegenden Erfindung eine wichtige Rohe bei der T-Zell-Aktivierung zu spielen. Wir erwarten auch, daß diese Komplexe T-Zell-regulierende Aktivitäten und cytotoxische Aktivitäten ähnlich denen von löslichem LT oder TNF haben.
Diese Erfindung betrifft auch DNA, die im wesentlichen aus einer DNA-Sequenz besteht, die besagtes, vorstehend beschriebenes Polypeptid codiert, rekombinante DNA- Moleküle, die durch besagte DNA charakterisiert sind, Wirte, ausgewählt aus der Gruppe von einzelligen Wirten oder tierischen und menschlichen Zellen in Kultur, die mit dieser DNA transfiziert sind, und rekombinante Verfahren der Verwendung dieser DNA und dieser rekombinanten DNA-Moleküle und Wirte, um das davon codierte Polypeptid zu produzieren.

Durchfluß-cytofluorometrische Analyse

Wir zeigten zuerst die Expression von LT-verwandten Epitopen auf der Oberfläche von T-Zellen unter Verwendung der Durchfluß-cytofluorometrischen Analyse. Wir beobachteten durch Reaktion mit anti-rLT-Antiserum, daß menschliche, periphere mononucleäre Blutzellen, die mit monoclonalem Antikörper gegen OKT3 aktiviert waren, die Expression von LT- verwandten Epitopen zeigten. Nur anti-rLT-Antiserum, nicht anti-rTNF-Antiserum, band an OKT3-stimulierte primäre T-Zellen.
Wir beobachteten auch, daß ein menschliches T-Zell-Hybridom, II-23.D7 [C. Ware et al., "Human T Cell Hybridomas Producing Cytotoxic Lymphokines: Induction of Lymphotoxin Release And Killer Cell Activity By Anti-CD3 Monoclonal Antibody Or Lectins And Phorbol Ester", Lymph. Res., 5, 313 (1986)], nach PMA-Stimulierung LT sezernierte und nach PMA- Stimulierung auch LT-verwandte Oberflächenepitope exprimierte. Wir zeigten auch, daß PMA-aktivierte II-23.D7-Zellen in der Lage waren, LT-neutralisierende Antikörper aus Kaninchen-anti-rLT-Antiserum zu entfernen, während U937-Kontrollzellen, denen alle Oberflächen-LT-Formen fehlen, nicht in der Läge waren. Wir schlossen weiterhin die Möglichkeit, daß das Kaninchen-anti-rLT-Antiserum mit Kaninchen-LT eine Bindung eingegangen war (komplexiert hatte) (mit anschließender Bindung der resultierenden Komplexe an zelluläre LT/TNF-Rezeptoren auf II-23.D7-Zellen) durch Sättigung der zellulären Rezeptoren mit einem Überschuß an löslichem TNF oder LT und die Beobachtung aus, daß dies keinen Einfluß auf das Anfärben hatte. Diese Tests zeigen, daß die LT- verwandten Epitope auf diesem Hybridom in der Tat mit LT verwandt sind.
Wir beobachteten auch, daß eine Vorbehandlung der Antiseren mit einem Überschuß an rLT die Fähigkeit der Antiseren blockierte, II-23.D7-Zellen anzufärben, während die Vorbehandlung mit rTNF keinen Effekt hatte. Dieser Test zeigte die Spezifität der Antiseren für Lymphotoxin-verwandte Epitope.
Trypsinspaltung der stimulierten II-23.D7-Zellen vor dem Anfärben führte zu einem Verlust des Signals, was zeigt, daß die von den Antiseren erkannten Epitope Proteine waren.
Wir zeigten auch, daß von CHO-Zellen stammende Verunreinigungen nicht zu der Erkennung von induzierten Proteinen durch die Antiseren auf der Oberfläche von aktivierten II-23.D7-Zellen beitrugen, dadurch, daß CHO-Zellen, die stabil mit dem LT-Gen transfiziert waren und nur lösliches LT produzierten, nicht durch die anti-LT-Antiseren angefärbt wurden.

Immunpräzipitation

Wir charakterisierten diese LT-verwandten Oberflächenproteine weiterhin entweder durch Oberflächenjodierung (¹²&sup5;I-Markierung) oder metabolische Markierung (³&sup5;S-Met, oder ³&sup5;S-Cys) von PMA-aktivierten II-23.D7-Zellen, gefolgt von Solubilisierung der Plasmamembran mit Detergens und Immunpräzipitation der markierten LT-verwandten Proteine.
Die Oberflächenjodierung, gekoppelt mit Immunpräzipitation, ergab zwei Proteine, die durch anti-LT-Antiseren erkannt wurden: eine 25-26 kD-Form, die nachstehend als LT bezeichnet wird, und eine 31-35 kD-Form, die nachstehend als p33 bezeichnet wird. Wir beobachteten, daß weder das prä-Immunisierungsserum von dem selben Kaninchen noch anti- TNF-Kaninchenserum diese Banden aus den jodierten, PMA-aktivierten II-23.D7-Zellen immunpräzipitierten. Eindimensionale, partielle CNBr-Peptidkartierung der jodierten, immunpräzipitierten Banden zeigte, daß die 25-26 kD-Form (LT) in einem Muster aufspaltet, das identisch ist zu dem des jodierten rekombinanten LT, was den engen Zusammenhang zwischen LT und löslichem LT bestätigt. Die jodierte 31-35 kD-Form (p33) wurde durch CNBr nicht gespalten, was anzeigt, daß sie unterschiedlich ist vom bekannten LT-Genprodukt.
Wir charakterisierten die LT- und p33-Proteine weiterhin durch metabolische Markierung von PMA-aktivierten II-23.D7-Zellen mit ³&sup5;S-Methionin oder ³&sup5;S-Cystein, gefolgt von Immunpräzipitation. Die Verteilung von Cystein und Methionin stellt ein Mittel zur Unterscheidung zwischen TNF und LT und zwischen ihren jeweiligen Formen mit und ohne ihre Signalsequenzen zur Verfügung [M. Kriegler et al., "A Novel Form Of TNF/Cachectin Is A Cell Surface Cytotoxin Transmembrane Protein: Ramifications For the Complex Physiology Of TNF", Cell, 53, 45 (1988)]. Sezerniertes TNF enthält Cystein, aber kein Methionin, während sezerniertes LT nur Methionin-, aber keine Cysteinreste enthält. LT jedoch enthält einen Cysteinrest in seiner Signalsequenz, während TNF zwei Methioninreste in seiner Signalsequenz enthält.
Wir markierten getrennte Kulturen von PMA-behandelten II-23.D7-Zellen entweder mit ³&sup5;S-Methionin oder ³&sup5;S-Cystein und präzipitierten immunreaktive Proteine aus den Kulturmedien und den Zellen. Anschließende SDS-PAGE-Analyse der Immunpräzipitate aus den Kulturmedien von Zellen, die mit ³&sup5;S-Methionin markiert waren, ergaben eine 25 kD- Form von LT, während die Immunpräzipitate aus den Kulturmedien von Zellen, die mit ³&sup5;S- Cystein markiert waren, dies nicht taten, ein Muster, das für sezerniertes LT zu erwarten ist. Die Analyse der gewaschenen Zellen zeigte sowohl die 25-26 kD-LT-Form als auch die 33 kD-p33-Form. Diese Ergebnisse stimmen überein mit den Membran-assoziierten Formen, die bei Verwendung der Oberflächenjodierung beobachtet wurden.
Dem 25-26 kD-LT fehlte Cystein, was die Prozessierung der Leadersequenz anzeigt. Wir beobachteten auch, daß das 33 kD-p33 sowohl ³&sup5;S-Methionin als auch ³&sup5;S-Cystein einbaute, womit es sich selbst als unterschiedlich von der 25 kD-LT-Foi-m darstellte. Typischerweise kann an seinen Rezeptor gebundenes LT mit dem Rezeptor verknüpft werden unter Verwendung eines chemischen Linkers wie BOSCOES (d.h. (bis [2-[Succinimidooxy- carbonyloxy]ethyl]sulfon; Pierce, Rockford, IL). [J. S. Andrews et al., "Characterisation of the Receptor for Tumor-Necrosis Factor (TNF) and Lymphotoxin (LT) on Human T Lymphocytes", J. Immun., 144, 2582 (1990)]. Wir beobachteten, daß, wenn Oberflächenjodierte II-23.D7-Zellen mit einem verknüpfenden Mittel behandelt wurden, es keine Assoziation mit einem zusätzlichen Membranprotein gab, weder von der 25-26 kD-LT- noch von der 33 kD-p33-verwandten Form. Dieser Test zeigte, daß die Rezeptorbindung nicht der Mechanismus ist, durch den LT und p33 mit der Zellmembran assoziiert bleiben. Darüber hinaus zeigte die partielle Sequenzanalyse von p33 zu keiner der zwei TNF-Rezeptorformen eine Verwandtschaft [C. Smith et al., Science, 248, 1019 (1990); T. J. Schall et al., Cell, 61, 361 (1990)].

Affinitätschromatographie

Eine weitere Charakterisierung der p33- und LT-Proteine auf der Oberfläche von II- 23.D7-Zellen wurde mittels Affinitätschromatographie erreicht. Wir beobachteten, daß p33 und LT auf der Oberfläche von PMA-behandelten II-23.D7-Zellen an Linsenlektin banden, was eine Glycoproteinstruktur für jede Form nahelegt. Daher wurde ein Linsenlektin- Chromatographieschritt als Reinigungsschritt vor der Antiserum-Affinitätschromatographie benutzt. Wir banden Detergens-solubilisierte PMA-behandelte II-23.D7-Proteine an Linsenlektin-Sepharose und eluierten mit α-Methylmannosid. Wir stellten sowohl Kontroll- IgG- als auch anti-LT-IgG-Affinitätssäulen her, um die Proteine genau nachzuweisen, die spezifisch vom anti-LT-Antiserum erkannt wurden. Wir trugen dann die Proteine auf diese Säulen auf, die an Linsenlektin banden. Wir beobachteten, daß die Elution der Säulentei niederem pH-Wert zu einer Freisetzung der p33- und LT-Proteine von der anti-LT- Affinitätssäule führte. SDS-PAGE-Analyse des Eluats ähnelte stark der SDS-PAGE-Analyse der immunpräzipitierten Proteine von Oberflächen-jodierten, PMA-behandelten II-23.D7- Zellen. Dieser Vergleich zeigte, daß mittels dieser beiden Verfahren ähnliche Proteine gereinigt wurden.
Wir beobachteten, daß während der Affinitätsreinigung die ~25 kD-LT-Form anscheinend zu einer 19-20 kD-Form oder einer "des 20"-Form gespalten wurde. Die ursprüngliche Isolierung von natürlichem LT von der RPMI 1788 Tumorzelllinie [B. Aggarwal et al., "Primary Structure of Human Lymphotoxin Derived From 1788 Lymphoblastoid Cell Line", J. Biol. Chem., 260, S. 2334-2344 (1985)] ergab ebenfalls eine N- terminal gespaltene 20 kD-LT-Form. Eines der Methionine geht bei dieser natürlichen "des 20"-LT-Form verloren, was ein von dem intakten Molekül unterschiedliches CNBr- Spaltungsmuster ergibt. Eindimensionale CNBr-Verdaus des. Affinitäts-gereinigten LT- Proteins zeigten ein Spaltungsmuster, das konsistent ist mit der verkürzten, natürlichen LT- Form, und wir schlossen, daß die Affinitäts-gereinigte "des 20"-LT-Form wahrscheinlich von einer ähnlichen Spaltung resultiert, wie sie bei der natürlichen "des 20"-LT-Form beobachtet wird.
Weiterhin beobachteten wir, daß p33 bei partieller CNBr-Spaltung ein Duplett erzeugt. Das mit dem p33-Protein erzeugte Spaltungsmuster zeigte, daß ein Methioninrest anwesend war und daß das betreffende Methionin innerhalb von 5-20 Resten entweder vom C-Terminus oder N-Terminus war. Dieses Muster legte nahe, daß p33 nicht die gesamte, bekannte LT- Sequenz enthält.
Wir beobachteten, daß das p33-Protein ebenfalls von Antigen-aktivierten, primären cytotoxischen T-Lymphocyten-Clonen exprimiert wurde. Metabolische Markierung dieser Zellen, gefolgt von Immunpräzipitation mit anti-rLT, zeigte p33 zusammen mit kleinen Mengen an LT. Diese Ergebnisse zeigten, daß p33 von primären T-Zellen ebenso wie von dem II-23.D7-Hybridom gebildet wird.

Anfängliche Reinigung der p33- und LT-Proteine

Wir reinigten diese LT- und p33-Proteine unter Verwendung der folgenden allgemeinen Schritte. Wir fügten zunächst Phorbolmyristinacetat (PMA) zu II-23.D7-Zellen hinzu. Nach 24 Stunden ernteten Wir die Zellen und wuschen sie mit kaltem, serumfreiem RPMI-Medium. Zu dem gekühlten Zellniederschlag fügten wir eiskalten Lysierungspuffer (HEPES, NP-40, EDTA, NaCl und Natriumazid) hinzu, zu dem Benzamidin, Phenylmethylsulfonylchlorid (PMSF) und N-Ethylmaleimüd (NEM), Sojabohnen- Trypsininhibitor, Pepstatin und Aprotinin frisch zugegeben worden waren. Wir homogenisierten die Zellen vorsichtig in einem Dounce Homogenisator und zentrifugierten das Lysat. Wir zentrifugierten und sammelten den Überstand. Wir luden den Überstand auf eine Linsenlektin-Sepharose -Säule, die mit Lysierungspuffer im Gleichgewicht war, zudem wir CaCl&sub2; und MnCl&sub2; zugegeben hatten. Wir wuschen die Säule mit Lysierungspuffer mit CaCl&sub2; und MnCl&sub2; und eluierten dann mit Lysierungspuffer, der α-Methylmannosid enthielt. Wir vereinten die Eluatfraktionen und luden sie direkt auf eine unspezifische Kaninchen-IgG- Sepharose -Affinitätssäule, die direkt verbunden war mit einer Kaninchen-anti-rLT- Sepharose -Affinitätssäule. Wir wuschen beide Säulen mit dem selben Lysierungspuffer mit EDTA, gefolgt von Lysierungspuffer, bei dem das NP-40 durch MEGA-8 (Octanoyl-N- methylglucamid, Boehringer Mannheim) ersetzt worden war. Wir eluierten die gewaschenen Säulen einzeln mit einer Lösung von MEGA-8, Glycin, NaCl, Benzamidin und EDTA. Die ersten Fraktionen nach dem Wechsel des pH-Werts wurden gesammelt, lyophilisiert und in Wasser mit SDS resuspendiert und gegen eine Lösung von HEPES und SDS dialysiert. Wir trockneten die dialysierten Fraktionen auf einer Speed-vac und resuspendierten in Wasser. Wir mischten Teilmengen mit Laemmli-Ladepuffer und führten eine auf SDS-PAGE durch. Wir machten die Proteine mit Silberfärbung sichtbar.
Wir beobachteten, daß ein LT-Epitop oder LT-Epitope auf der Oberfläche des II- 23.D7-Hybridoms nur nach Zellaktivierung anwesend ist oder sind, wie sie durch PMA- Behandlung geschieht. Wenn sie im Gegensatz dazu auf primären T-Zellen anwesend sind, führt die PMA-Behandlung zu einem Verlust des Oberflächenantigens. Zusätzlich fanden wir, daß polyclonale Antiseren gegen rekombinantes LT (in CHO-Zellen hergestellt) und natürliches LT (z.B. Genzyme, Boston, Mass.) Kaninchen-anti-menschliches-Lymphotoxin- Antiserum das LT-Epitop (die LT-Epitope) erkannten.
Wir haben auch beobachtet, daß unsere Antiseren, die p33 und LT erkennen, die MLR blockieren, wohingegen ein spezieller monoclonaler Antikörper, der ein lösliches LT erkennt, dies nicht tut [M. Shalaby et al., "The Involvement Of Human Tumor Necrosis Factors-α And -ß In The Mixed Lymphocyte Reaction", J. Immun., 141, 499 (1988)]. Der p33/LT-Komplex der Erfindung kann daher ein Mediator der T-Zell-Aktivierung sein.
Die Anwesenheit von p33 mit LT in den Immunpräzipitaten aus Zelllysaten legte nahe, daß entweder p33 mit LT-Antigen verwandt ist oder daß p33 an LT gebunden ist oder beides. Um diese Frage zu klären wurden die 25 kD- und 33 kD-Banden von ³&sup5;S-markierten Zellen mit polyclonalem Kaninchen-anti-rLT-Serum immunpräzipitiert, aus den ausgeschnittenen Gelscheiben eluiert und mit entweder polyclonalem anti-rLT-Serumoder mAb einer erneuten Immunpräzipitation unterworfen. LT, aber nicht p33, konnte mit beiden anti-rLT-Antikörpern immunpräzipitiert werden, was nahe legt, daß p33 nicht mit LT antigen verwandt ist. Diese Beobachtungen zeigten, daß p33 physikalisch mit LT assoziiert ist.
Um die Hypothese weiter zu untersuchen, daß Oberflächen-LT und -p33 einen Komplex bilden, führten wir isoelektrische Fokussierungsexperimente (IEF) unter sowohl denaturierenden als auch nativen Bedingungen mit der Überlegung durch, daß, wenn LT und p33 physikalisch assoziiert sind, sie dann unter nativen Bedingungen als ein Komplex, aber unter denaturierenden Bedingungen als getrennte Einheiten fokussieren sollten. Die einzelnen isoelektrischen Punkte (pI's) für LT und p33 wurden mittels zweidimensionaler Gelanalyse (denaturierende Bedingungen) bestimmt (Fig. 9A). LT (p25) besitzt fünf geladene Isomere, die sich im PI von 6,5 bis 7,3 bewegen, wohingegen p33 vier geladene Isomere besitzt, die sich im PI von 5, 5 bis 6,0 bewegen. Wenn die Fokussierung jedoch unter nativen Bedingungen durchgeführt wurde, fokussierten LT und p33 zusammen als eine breite Bande, die sich im pI von 6,3 bis 7,2 bewegt (Fig. 10A, Spuren 6-8). Deshalb war die Wanderung von p33 unter nativen Bedingungen beträchtlich verzögert.

Weitere Reinigung und Identifizierung von LT und p33

Wir reinigten diese LT- und p33-Proteine später unter Verwendung der folgenden allgemeinen Schritte. Wir züchteten II-23.D7-Zellen in RPMI-Medium mit fötalem Kälberserum, und wir ernteten die Zellen aus 501 RPMI und resuspendierten sie in Medium, und wir fügten Phorbolmyristoylacetat (PMA) hinzu. Nach 6 Stunden Aktivierung ernteten wir die Zellen mittels Zentrifugation und wuschen sie mit Dulbecco's Phosphat-gepufferter Salzlösung. Wir suspendierten das endgültige Zellpellet in kaltem Lysierungspuffer und schickten das Pellet einmal durch einen Stickstoff-Kavitationsapparat. Wir zentrifugierten die lysierten Zellen und verwarfen den Überstand. Wir extrahierten das Pellet über Nacht mit Lysierungspuffer mit Detergens und zentrifugierten dann erneut.
Wir trugen den Überstand, der die Detergens-solubilisierten Membranen enthielt, auf ein Affinitätsharz auf, das aus monoclonalem anti-Lymphotoxin, gekoppelt an Affi-gel (10), bestand und schüttelten die Suspension über Nacht. Wir sammelten das Harz in einem kleinen Volumen und wuschen es mit HEPES mit Nonidet P40, und dann mit dem selben Puffer mit 1% Gew./Vol. MEGA-8, wir eluierten die gebundenen Proteine mit MEGA-8 in Glycinpuffer und neutralisierten die Fraktionen sofort mit Tris-Base. Wir bestimmten die Anwesenheit von p33 und LT in den Fraktionen mittels SDS-PAGE-Analyse und Silberfärbung. Wir vereinten die Fraktionen, die diese Proteine enthielten, und fügten SDS hinzu, und wir dialysierten den Pool gegen 0,1x Laemmli-Probenpuffer (unter Verwendung mehrfacher Wechsel, um das MEGA-8-Detergens zu entfernen). Wir lyophilisierten die dialysierte Lösung bis zur Trockenheit und resuspendierten sie in 1/10 des ursprünglichen Volumens an Wasser. Wir ließen die Probe auf einem SDS-PAGE-Gel laufen, übertrugen sie auf eine Problot-Membran und färbten sie mit Coomassie -Blau-Farbstoff. Wir schnitten die p33 und 25 kD-LT-Banden aus und luden sie auf einen Proteinsequenzierapparat. Wir erhielten die N-terminale Sequenz durch Edman-Abbau mit dem Applied Biosystems-Sequenzieräpparat Modell 470 A, gekoppelt mit einem 120 PTH Aminosäure-Analysator. Wir fanden, daß die Sequenz der Membran-assoziierten Lymphotoxin-Bande genau übereinstimmte mit derjenigen, die für sezerniertes Lymphotoxin beschrieben wurde, d.h. (SEQ ID NR: 1) Leu Pro Gly Val Gly Leu Thr Pro Ser [P. Gray et al., "Cloning and Expression of cDNA For Human Lymphotoxin, A Lymphokine With Tumor Necrosis Activity", Nature, 312, S. 121-124 (1984)].
In jedem Fall, in dem eine Oberflächen-LT-Form nachgewiesen wurde, waren wir auch in der Lage, p33 nachzuweisen (d.h. bei PMA-aktivierten II-23.D7, aktivierten CTL-Clonen und Hut-78-Zellen, die konstitutiv eine Oberflächen-LT-Form exprimieren). Weil LT von transfizierten CHO-Zellen und von B-lymphoblastöiden Zelllinien in der Abwesenheit einer Oberflächen-LT-Form sezerniert wird und weil die Anwesenheit von p33 mit Oberflächengebundenem LT assoziiert ist, schlossen wir, daß p33 mit LT einen Komplex eingeht, um es zur Zelloberfläche zu leiten. Biochemisch wandern p33 und LT zusammen auf einem nicht denautierenden, isoelektrischen Fokussierungsgel, wenn aber der Komplex mit Harnstoff dissoziiert ist, laufen die beiden Proteine getrennt. [Vgl. Figs. 9A, 10A]. Diese Beobachtungen haben uns zu der Annahme gebracht, daß LT und p33 auf der Zelloberfläche als Komplex existieren.

Potentielle Anwendungen von p33 und LT und dem p33/LT-Komplex

Unter der Voraussetzung der offensichtlichen Äquivalenz zwischen löslichem LT und dem LT des bevorzugten p33/LT-Komplexes dieser Erfindung, kann man erwarten, daß die Komplexe dieser Erfindung eine Reihe von potentiellen Anwendungen haben, einschließlich anti-Tumor-, T-Zellaktivierende oder T-Zell-unterdrückende Anwendungen ebenso wie Anwendungen in anti-Entzündungsmitteln und -verfahren. Hochgereinigtes p33 wird auch bei der Synthese von Sonden von Nutzen sein, welche wiederum von Nutzen für die Isolierung von DNA sind, die p33 und die anderen Proteine der Erfindung codiert. Solche DNA- Sequenzen, rekombinanten DNA-Moleküle, die sie umfassen, und einzelligen Wirte und tierische oder menschliche Zellen in Kultur, die mit ihnen transfiziert sind, können dann verwendet werden, um große Mengen der Polypeptide dieser Erfindung, die im wesentlichen frei von anderen menschlichen Proteinen sind, zur Verwendung in den vorstehend erwähnten Zusammensetzungen und Therapien zu produzieren.
Insbesondere können wir unser gereinigtes p33-Protein zur Bestimmung der Aminosäuresequenz verschiedener Teile und Fragmente verwenden. Wir verwenden dann diese Sequenzen und die degenerierten DNA-Sequenzen, die sie codieren, um eine Reihe von DNA-Sonden zu planen, die von potentiellem Nutzen bei der Durchmusterung verschiedener DNA-Banken nach DNA-Sequenzen sind, die p33 und andere Proteine dieser Erfindung codieren. Solche Banken umfassen chromosomale Genbanken und cDNA- oder DNA-Banken, die aus Gewebe oder Zelllinien hergestellt wurden, von denen gezeigt wurde, daß sie das p33- Protein dieser Erfindung produzieren. Solche Zelllinien umfassen Zelllinien, die im Stand der Technik gut bekannt sind.
Lymphocyten, die auf ihrer Oberfläche die Polypeptidkomplexe dieser Erfindung und vorzugsweise den p33/LT-Komplex exprimieren, repräsentieren eine Unterklasse, die erhöhte Fähigkeiten haben kann, Tumorzellen abzutöten. Als solche wäre diese Unterklasse für Medikamente in den LAK (Lymphokin-aktivierte Killer)- oder TIL (Tumor infiltrierende Lymphocyten)-Zelltherapien von Nutzen. [H. Thomas, K. Sikora, "Biological Approaches to Cancer Therapy", Jour. Int. Med. Res., 17, 191 (1989)].
Antikörper oder Antikörperderivate gegen die Polypeptide und Polypeptidkomplexe dieser Erfindung sind auch von Nutzen bei konventionellen immunologischen Verfahren, z.B. dem Panning oder Durchfluß-cytofluorometrischen Sortieren, um diese Zellpopulation anzureichern. [L. J. Wysocki und U. L. Sato, "Panning for Lymphocytes: A method for Cell Selection", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 2844 (1978)].
Die Anmelder glauben, daß die Polypeptide und Komplexe dieser Erfindung oder Fragmente oder Derivate davon von Nutzen sein werden bei Anwendungen - der Zeliregulierung oder bei therapeutischen Anwendungen ähnlich denen, bei denen Lymphotoxin oder Tumornekrosefaktor verwendet werden.
Die Anmelder glauben auch, daß die Komplexe und Polypeptide dieser Erfindung, oder möglicherweise davon abgeleitete Peptide oder Peptide, die davon oder unter Verwendung ihrer Aminosäuresequenz synthetisiert wurden, oder ihre Sülze oder pharmazeutisch verträgliche Derivate davon in Medikamenten von Nutzen sein können, die mittels irgendeiner der herkömmlich akzeptierten Verabreichungsarten für Mittel, die anti-Tumor-, T-Zell- aktivierende, T-Zell-unterdrückende oder anti-Entzündungsaktivität haben, zur Verabreichung vorgesehen sind. Diese umfaßt orale, parenterale, subkutane, intravenöse, intraläsionale oder topische Verabreichung. Weiterhin wird die hier bereitgestellte Sequenzinformation die Isolierung und Sequenzierung von cDNA ermöglichen, die p33 codiert, und rekombinante Gene für p33 und verwandte Polypeptide, die darauf basieren, werden therapeutisch von Nutzen sein, zum Beispiel in Medikamenten für die TIL-Therapie, bei der ein p33-Gen, entweder mit oder ohne einem LT-Gen, in T-Zellen eingebracht wird, die aus einem Tumor isoliert werden und in den Patienten eingebracht werden. Stärker bevorzugt werden die Zellen dem Patienten entnommen, mit einer DNA-Sequenz, die die Expression eines Polypeptids der Erfindung codiert, transfiziert, vor oder nach der Transfektion mit einem Lymphokin inkubiert, vorzugsweise IL-2, und in den Patienten zurückgebracht. Die transfizierten T-Zellen (die jetzt p33 exprimieren und folglich LT komplexieren) kehren zu den Tumoren zurück, von denen sie entfernt wurden, wo die tumoricide Wirkung von LT direkt an die Tumore verabreicht wird. In ähnlicher Weise wird in Betracht gezogen, daß ein p33-Gen in LAK- Zellen eingebracht wird und diese transfiziert, um ein Medikament herzustellen, das die Anzahl von Oberflächenkomplexen auf den Zellen und ihre Aktivität erhöhen würde.
Im allgemeinen zeigen LT und TNF qualitativ das selbe Spektrum an Aktivitäten, und man glaubt, daß LT und TNF mit dem selben Satz an Rezeptoren wechselwirken (als 55 und 80 kD-TNF-Rezeptoren bezeichnet): C. Smith et al, Science, 248, 1019 (1990); T. Schall et al., Cell, 61, 361 (1990). Dennoch sind die quantitativen Muster der biologischen Wirksamkeit, das von LT und TNF gezeigt wird, in hohem Maße unterschiedlich, wobei LT oft viel weniger wirksam ist als TNF (vgl. z.B. Browning und Ribolini, J. Immun., a.a.o.). Diese Beobachtungen sind schwer in Übereinstimmung zu bringen mit den existierenden Daten der Rezeptorbindung. Es ist möglich, daß der p33/LT-Komplex LT einzigartige Eigenschaften verleiht, so daß es mit anderen, bislang nicht definierten Rezeptoren wechselwirkt. In diesem Fall hätte ein p33/LT-Komplex und die anderen Komplexe dieser Erfindung einzigartige biologische Eigenschaften, die sie von sowohl LT als auch TNF unterscheiden. Der p33/LT-Komplex kann verwendet werden, um solche p33/LT- oder p33- spezifischen Rezeptoren zu identifizieren und zu clonieren. Darüber hinaus kann die weitere Verwendung des Komplexes neue biologische Aktivitäten ergeben.
Während eine Anzahl von T-Zelllinien und Makrophagenzelllinien dafür bekannt sind, daß sie mit dem HIV-Virus infizierbar sind, war aber in der Praxis nur eine kleine Zahl an Zelllinien bei der Propagation des Virus in Gewebekultur von Nutzen. Zum Beispiel waren die H9-Linie, ein Abkömmling von Hut-78, die ursprünglich von Gallo et al. genutzt wurde [M. Popovic et al., Science, 224, 497-500 (1984)], und eine andere menschliche, lymphocytäre Linie; C8166, von Wert für die HIV-Propagation [M. Somasundaran und H. Robinson, Science, 242, 1554-1557 (1988)]. Es ist möglich, daß Oberflächen-LT-Expression oder die Fähigkeit zur Expression von Oberflächen-LT eine gegebene Zelle zu einem guten Ziel für die HIV-Proliferation macht.
Als eine Rolle von TNF ist die Steigerung der HIV-Proliferation vorgeschlagen worden [L. Osborn et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 2336 (1989); Z. Rosenberg und A. Fauci, Immunol. Today, 11, 176 (1990); C. Locardi et al., J. Viroloay, 64, 5874 (1990); G. Oli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 782 (1990)]. Wir haben gefunden, daß die II-23.D7- Linie mit dem HIV-Stamm IIIB infizierbar ist, daß aber bei Behandlung mit PMA die Infektion mit dem Virus dramatisch erhöht wird. Bei der Hut-78-Zelllinie wurde gefunden, daß sie eine Oberflächen-LT-Form konstitutiv exprimiert, und die C8166-Linie ähnelt II- 23.D7, indem Oberflächen-LT nach PMA-Behandlung erscheint. Unter Berücksichtigung dieser Ergebnisse über die Infizierbarkeit von II-23.D7 durch HIV und der Beziehung zwischen infizierbaren Zelllinien und der Oberflächen-LT-Expression schlagen wir vor, daß diese Linien gute Wirte für. HIV-Infektion und -Replikation sein können, weil der p33/LT- Komplex und die anderen Polypeptide und Komplexe dieser Erfindung eine regulatorische Rolle erfüllen. Es ist gezeigt worden, daß das LT-Gen durch die Expression des HIV- Transkriptionsaktivators TAT induziert wird [K. Sastry et al., J. Biol. Chem., 265, 20091 (1990], und darüber hinaus ist auch gezeigt worden, daß die HTLV-1-Infektion die LT- Expression induziert [N. Paul et al., J. Virol., 64, 5412 (1990); E, Tschachler et al., in Human Retrovirology (Raven Press 1990), Hrsg. W. Blattner, S 105]. Somit können die Induktion von LT durch HIV-Infektion und die anschließende Expression des p33-LT-Komplexes oder eines anderen Komplexes oder die Induktion der Expression des p33/LT- oder eines anderen Komplexes durch PMA-Behandlung bei Zelllinien, die in der Lage sind, diese Proteine herzustellen, dazu dienen, die virale Replikation zu erhöhen. Aus diesem Grund können Antikörper oder spezifische Bindungsproteine (z.B. lösliche Rezeptoren) zu dem p33/LT- Komplex oder den anderen Polypeptid-Komplexen dieser Erfindung oder zu den löslichen Formen dieser Komplexe oder zu p33 und den anderen Polypeptiden dieser Erfindung zumindest zum Teil die HIV-Proliferation inhibieren oder blockieren.
Die Zusammensetzungen, die zu Herstellung eines Medikaments für diese Therapien verwendet werden, können auch in einer Vielzahl von Formen sein. Diese umfassen zum Beispiel feste, halbfeste und flüssige Dosierungsformen, wie Tabletten, Pillen, Puder, flüssige Lösungen oder Suspensionen, Zäpfchen, injizierbare Lösungen und Lösungen für die Infusion, Gentherapie. Die bevorzugte Form hängt von dem geplanten Verabreichungsweg und der therapeutischen Anwendung ab. Die Zusammensetzungen enthalten vorzugsweise auch herkömmliche, pharmazeutisch verträgliche Träger und können andere medizinische Mittel, genetische Träger, z.B. Tumor-infiltrierende Lymphocytentherapie, Adjuvantien, Träger usw., z.B. menschliches Serumalbumin oder Plasmaherstellungen umfassen. Vorzugsweise sind die Zusammensetzungen in der Form einer Einheitsdosis und werden üblicherweise einmal oder mehrfach am Tag verabreicht.
Die Zusammensetzungen dieser Erfindung sind von Nutzen bei der Herstellung eines Medikaments, das in einer wirksamen Dosis verabreicht wird, um die besonderen, beabsichtigten, klinischen Bedingungen zu behandeln. Die Bestimmung der besonderen Dosis für eine vorgegebene Anwendung ist im Stand der Technik bekannt, wobei zum Beispiel der Zustand und das Gewicht des Patienten, das Ausmaß der erwünschten Behandlung und die Verträglichkeit der Behandlung bei dem Patienten zu berücksichtigen sind.
Das folgende sind Beispiele, die den p33/LT-Komplex dieser Erfindung und die Verfahren beschreiben, die verwendet wurden, um ihn zu charakterisieren. Diese Beispiele sollten nicht als einschränkend gesehen werden.

BEISPIELE

Wir verwendeten die folgenden experimentellen Verfahren in den Beispielen:

Antiseren

Rekombinantes menschliches LT (rLT) wurde mittels einer stabil transfizierten Zelllinie vom Eierstock des chinesischen Hamsters (CHO) in Serum-freie konditionierte Medien exprimiert und sezerniert. Wir reinigten das sezernierte rLT aus den Serumfreien konditionierten Medien durch eine Reihe von Sepharose S-, Linsenlektin-Sepharose - und FPLC Mono Q Säulenchromatographie-Schritte. Die Eigenschaften der von CHO-Zellen abgeleiteten rLT-Herstellungen sind beschrieben worden. [J. Browning et al., "Studies On The Differing Effects Of Tumor Necrosis Factor And Lymphotoxin On The Growth Of Several Human Tumor Lines", J. Immun., 143, 1859 (1989)]. Wir immunisierten zwei Kaninchen (4 und 5) mittels eines Lymphknoten-Verfahrens [M. Sigel et al., "Production Of Antibodies By Inoculation Into Lymph Nodes", Met. Enz., 93, 3 (1983)] mit 25 ug nativem rLT in vollständigem Freundschem Adjuvans. Ein drittes Kaninchen (6) wurde nach dem selben Verfahren mit 25 ug an denaturiertem rLT in vollständigem Freundschem Adjuvans immunisiert. Denaturiertes rLT wurde mittels SDS-PAGE hergestellt, gefolgt von Elektroelution in 0,1% SDS-Carbonat-Puffer.
Unter Verwendung der vorstehenden Verfahren wurden drei anti-rLT-Antiseren erzeugt, zwei gerichtet gegen natives rLT und ein drittes gegen SDS-denaturiertes rLT. Die Antiseren, die durch Immunisierung mit nativem Protein erzeugt wurden (Kaninchen 4 und 5), konnten eine Lösung von 50 Einheiten/ml bei einer Verdünnung von 1 : 2000-5000 neutralisieren. Das Serum, das gegen denaturiertes rLT erzeugt wurde (Kaninchen 6), hatte keinen neutralisierenden Titer, war jedoch bei einem Western-Blot schwach reaktiv mit rLT. Keines der Antiseren konnte menschliches r-TNF neutralisieren, noch konnten sie menschliches r-TNF erkennen, das an eine ELISA-Platte gebunden war, außer einem sehr schwachen Titer im Antiserum von Kaninchen 6. Nur Antiserum von Kaninchen 6 war in der Lage, rLT bei der Western-Analyse zu erkennen.
Wir immunisierten ein viertes Kaninchen mit rekombinantem menschlichem TNF. Wir stellten das polyclonale anti-rTNF-Kaninchenserum mittels eines klassischen Immunisierungsschemas unter Verwendung von rekombinantem menschlichem TNF (von E.coli abgeleitet [D. Weir et al., Handbook Of Experimental Immunology In Four Volumes, Chapter 8 "Immunization Of Experimental Animals"]) in vollständigem Freundschen Adjuvans, gefolgt von einer Auffrischung in unvollständigem Freundschen Adjuvans, her. Das gegen rTNF durch Immunisierung erzeugte Serum hatte einen guten neutralisierenden Titer. Ein neutralisierender monoclonaler Antikörper gegen TNF ist beschrieben worden [Liang et al., "Production And Characterization Of Monoclonal Antibodies Against Recombinant Human Tumor Necrosis Factor/Cachectin", Biochem. Biophys. Res. Comm., 137, 847 (1986)]. Prä- Immunisierungsserum wurde von allen Tieren zur Verwendung als Kontrolle entnommen.

Zellwachstum und T-Zellaktivierung

Alle Zellen wurden von der American Type Culture Collection (ATCC) erhalten, außer der LT-transfizierten Eierstocklinie des chinesischen Hamsters (CHO), die zuvor beschrieben wurden [Browning und Ribolini, "Studies on the Differing Effects Of Tumor Necrosis Factor And Lymphotoxin On The Growth Of Several Human Tumor Lines", J. Immun., 143, S. 1859-1867 (1989)].
Zellen wurden in RPMI 1640 gezüchtet, das mit 1% Glutamin, 10 mM HEPES-Puffer, pH 7,5, Penicillin/Streptomycin und 10%o fötalem Kälberserum (Hyclone-deiniert) ergänzt war (als "vollständiges RPMI" bezeichnet), außer die transfizierten CHO-Zellen, die in Dulbecco's modifiziertem Eagle's Medium gezüchtet wurden, das wie vorstehend ergänzt war. Das menschliche T-Zell-Hybridom II-23 war ein Ergebnis einer Fusion der menschlichen CIEM-Tumorlinie mit aktivierten peripheren T-Lymphocyten und wurde weiter subcloniert (II- 23.D7) [C. Ware et al., "Human T Cell Hybridomas Producing Cytotoxic Lymphokines: Induction of Lymphotoxin Release And Killer Cell Activity By Anti-CD3 Monoclonal Antibody Or Lectins And Phorbol Ester", Lymph. Res., 5, 313 (1986)]. Menschliche periphere Blutlymphocyten (PBL) wurden in heparinisierten Glasröhrchen gesammelt, mittels Ficoll- Hypaque -Zentrifugation isoliert, gewaschen und in vollständigem RPMI-Medium resuspendiert. Wir behandelten PBL zu 2 · 106 Zellen/ml mit einer 1 : 500-Verdünnung von OKT3-konditioniertem Medium (~2 ng/ml Endkonzentration) in der Anwesenheit von 1 ug/ml Indomethacin und in einigen Experimenten mit 10 ng/ml rIL-2 (Biogen, Inc., Cambridge, MA). Menschliche CTL-Clone wurden wie beschrieben hergestellt [L. Green et al., "Cytotoxic Lymphokines Produced By Cloned Human Cytotoxic T Lymphocytes", Jour. of Immun., 135, 4034 (1985)] und entweder mit bestrahlten Stimulatorzellen (Antigen) oder einer Kombination von monoclonalen anti-CD2-Antikörpern (T11&sub2; + T11&sub3;), die von E. Reinherz zur Verfügung gestellt wurden, aktiviert.

Durchflußcytometrie

Wir resuspendierten Zellen in RPMI 1640-Medium mit 10% fötalem Kälberserum (FBS), 0,1% Natriumazid und 0,1 mg/ml menschlichem IgG bei 0ºC. Nach Präinkubation mit dem menschlichen IgG fügten wir zusätzliches Medium hinzu, das die gewünschten Antiseren emthielt. Typischerweise wurden die Zellen mit einer Endverdünnung der anti-rLT- und anti- rTNE-Seren von 1 : 200 für 60-90 min. inkubiert. Wir wuschen die Zellen zweimal mit Dulbecco's phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und inkubierten sie dann mit einer 1 : 500- Verdünnung von Fluorescein-markiertem Ziege-anti-Kaninchen-IgG (Cappel Durham, N.C.) in vorstehendem Medium für mindestens 60 min. Die Zellen wurden dann einmal gewaschen und entweder direkt analysiert oder in einigen Fällen nach 10 minütiger Fixierung bei 0ºC mit 0,5% Paraformaldehyd. Wir führten wie vorstehend zwei Farbanalysen durch, außer daß wir Phycoerythrin-markierte leu-4, leu-2, leu-M3 oder leu-16 oder leu-19 (Becton-Dickinson, Mountain View, CA) beim zweiten Antikörperstadium zugaben. Der Vergleich von Oberflächengebundenem LT mit IL-2-Rezeptor-Mengen wurde in einer getrennten Analyse mit einer einzigen Farbe mit Fluorescein-markiertem anti-IL-2-Rezeptor (CD25)-Antikörper (Becton-Dickinson, Mountain View, Ca.) durchgeführt. Die Analysen wurden mit einem FACStar-Gerät (Becton-Dickinson) durchgeführt.
Absorption von neutralisierenden anti-rLT-Antikörpern durch aktivierte II-23.D7-Zellen Wir stimulierten II-23.D7- und U937 prämonocytäre Zellen zu 1 · 10&sup6; Zellen/ml 8 Stunden mit 10 ng/ml PMA in komplettem RPMI-Medium. Wir wuschen die Zellen (1 · 10&sup8;) dreimal in Medium und saugten den Überstand ab, um ein trockenes Pellet zu erhalten. Die Zellen wurden dann in 1 ml Medium resuspendiert, das eine 1 : 1000-Verdünnung von anti- rLT-Serum (von Kaninchen 4) enthielt, und inkubierten sie unter Mischen 1,5 Stunden auf Eis. Die Zellen wurden durch Zentrifugation von dem Antiserum befreit. Wir mischten das absorbierte Antiserum (sowohl vor als auch nach der Immunisierung) mit einem gleichen Volumen (50 ul) an Medium, das 15 U/ml rLT enthielt, und inkubierten 20 Minuten bei Raumtemperatur. Die Gemische wurden seriell in Medium verdünnt und zu L929-Zellen (in 0,1 ml) zugegeben und weiterer 24 Stunden inkubiert. Wir überprüften die Lebensfähigkeit der Zellen mittels des MTT-Tests, wie beschrieben [L. Green et al., "Rapid Colorimetric Assay For Cell Viability: Application To The Quantitation of Cytotoxic And Growth Inhibitory Lymphokines", Jour. Immun. Meth., 70, 257-268 (1984)].

Metabolische Markierung von T-Zellen mit ³&sup5;S-Methionin oder ³&sup5;S-Cystein

Wir transferierten Zellen in entweder Cystein-freies oder Methionin-freies RPMI 1640, das mit Penicillin/Streptomycin, Glutamin, 10 mM HEPES pH-Wert 7,5, 10% Vol./Vol. dialysiertem FBS und 2% Vol./Vol. herkömmlichem RPMI (Zusatz von kaltem Träger) ergänzt war. Wir stellten die Zellkonzentration auf 2-3 · 10&sup5; Zellen/ml ein und fügten ³&sup5;S- Methionin oder ³&sup5;S-Cystein zu dem jeweiligen Medium in einer Konzentration von 100-200 uCl/ml zu. Im Falle von frisch aktivierten PBL wurden die Überstände vorsichtig entfernt, und die Zellen wurden zentrifugiert, resuspendiert in Markierungsmedium und zu der ursprünglichen, adhärenten Population zurückgegeben. Nach einer Markierungsperiode von 12-18 Stunden wuschen und lysierten wir die Zellen wie nachstehend beschrieben. Bei den PBL wurden die Zellen durch Pipettieren entfernt und die adhärente Population durch Behandlung mit 5 mM EDTA in PBS teilweise entfernt.

Immunpräzipitationen

Zu 0,2-0,5 ml markiertem Zelllysat gaben wir 2-4 ul Kaninchenserum zu. Die Probe wurde bei 4ºC 1-2 Stunden stehengelassen. Wir fügten dann eine 60 ul-Teilmenge einer 60-70 %igen Suspension von gewaschener Protein-A-Sepharose (Pharmacia, Piscataway, N.J.) hinzu und schüttelten die Probe 6-18 Stunden bei 4ºC. Wir wuschen die Protein A Sepharose -Pellets 3 mal mit 1% NP-40 in Calcium/Magnesium-freiem PBS und resuspendierten sie in 50 ul Laemmli SDS-Ladepuffer. Typischerweise durchlief eine einzige Lysatprobe zyklisch aufeinanderfolgende Immunpräzipitätionen mit anti-rLT-Serum vor der Immunisierung, anti-TNF-Antiserum und letztlich anti-rLT-Serum nach der Immunisierung. In einem Satz an Experimenten fügten wir 5 mM CaCl&sub2; und MnCl&sub2; zu dem Lysat hinzu, und das Lysat wurde über Nacht mit 75 ul einer 75%igen Suspension von gewaschener Linsenlektin-Sepharose geschüttelt. Die Sepharose wurde zweimal mit NP-40/PBS gewaschen und dann mit drei aufeinanderfolgenden Zugaben von 75 ul von 1% NP-40/PBS mit 0,25 M α-Methylmannosid eluiert. Wir unterwarfen die vereinten Waschungen dem Immunpräzipitationsprotokoll.

Kaninchen-anti-rLT-Affinitätssäule

Wir reinigten die Immunglobulinfraktion von anti-rLT-Serum (vom Kaninchen 4) unter Verwendung von Protein A Sepharose mit Eluierung bei saurem pH-Wert. Die eluierten, IgG enthaltenden Fraktionen wurden gegen PBS dialysiert und mittels Amicon- Filtrierung konzentriert. Die anti-rLT-IgG-Lösung (15 ml mit 6 mg/ml) wurde an 8 ml Affigel 10-Harz (Biorad, Richmond, Ca.) nach Vorschrift gekoppelt. Wir stellten eine identische Affinitätssäule unter Verwendung von unspezifischem Kaninchen-IgG (Cappel, Durham, N.C.) her. Beide Säulen wurden mit PBS, 1 M Acetat, pH-Wert 3,0 mit 1% NP-40 und letztlich mit Lysierungspuffer ohne Proteaseinhibitoren gewaschen.

Reinigung von p33 und LT

Wir züchteten II-23.D7-Zellen (15 l) bis zu einer Dichte von 5 · 10&sup5; Zellen/ml und gaben Phorbolmyristoylacetat (PMA) mit einer Endkonzentration von 25 ng/ml zu. Nach 24 Stunden ernteten wir die Zellen und wuschen sie in kaltem, serumfreiem RPMI-Medium. Zu dem gekühlten Zellniederschlag, der 7 · 10&sup9; Zellen enthielt, fügten wir 100 inl eiskalten Lysierungspuffer (50 mM HEPES, pH-Wert 7,5, 1 % Vol./Vol. NP-40, 2 mM EDTA, 0,15 M NaCl und 0,1% Natriumazid) hinzu, zu dem 5 mM Benzamidin, 1 mM Phenylmethylsulfonylchlorid (PMSF) und 0,25 mM N-Ethylmaleimid (NEM), 10 ug/ml Sojabohnen-Trypsininhibitor, 0,7 ug/ml Pepstatin und 10 ug/ml Aprotinin frisch zugegeben worden waren. Wir homogenisierten die Zellen vorsichtig in einem Dounce-Homogenisator und zentrifugierten das Lysat 10 Minuten bei 10 000 · g. Wir zentrifugierten den Überstand 90 Minuten bei 60 000 · g und sammelten den Überstand.
Zum Überstand der Hochgeschwindigkeitszentrifugation fügten wir 5 mM CaCl&sub2; und 5 mM MnCl&sub2; hinzu. Der Überstand wurde dann auf eine 20 ml-Linsenlektin-Sepharose - Säule geladen (Pharmacia, Piscataway, N.J.), die mit Lysierungspuffer plus CaCl&sub2; und MnCl&sub2; im Gleichgewicht war. Wir wuschen die Säule mit Lysierungspuffer (mit CaCl&sub2; und MnCl2) und eluierten die Säule mit Lysierungspuffer, der 0,25 M α-Methylmannosid enthielt.
Wir vereinten die Linsenlektin-Eluatfraktionen, so daß sie ein Volumen von 50 ml ergaben, und luden sie direkt auf eine unspezifische Kaninchen-IgG-Sepharos Affinitätssäule von 2 ml. Wir verbanden diese Säule direkt mit einer 2 ml Kaninchen-anti- rLT-Sepharose -Affinitätssäule. Wir wuschen beide Säulen mit dem selben Lysierungspuffer mit EDTA, gefolgt von Lysierungspuffer, in dem 1% NP-40 durch 1% Gew./Vol. MEGA-8 (Octanoyl-Nmethylglucamid, Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN.) ersetzt worden war.
Wir eluierten die gewaschenen Säulen einzeln mit 1% MEGA-8,50 mM Glycin, pH- Wert 2,5, 0,05 M NaCl, 5 mM Benzamidin und 2 mM EDTA. Wir vereinten die ersten 20 ml nach dem pH-Wechsel, lyophilisierten den Pool und resuspendierten ihn in 1 ml Wasser mit 0,05% SDS und dialysierten gegen 10 mM HEPES, pH-Wert 7,5, 0,05% SDS und 0,1% MEGA-8. Wir trockneten die dialysierten Fraktionen in einer Speed-vac und resuspendierten sie in 0,15 ml Wasser. Wir mischten Teilmengen mit Laemmli-Ladepuffer und führten eine SDS-PAGE durch. Die p33- und LT-Proteine wurden mittels Silberfärbung sichtbar gemacht.

Jodierung der II-23.D7-Zelloberfläche

Entweder Kontroll- oder PMA-induzierte II-23.D7-Zellen wurden ausgiebig mit Calcium/Magnesium-freiem PBS gewaschen, mit 1 mM PMSF und 0,25 mM NEM behandelt und dann zweimal gewaschen. Zu einem 12 · 75 mm-Glasröhrchen, das mit 50 ug Iodogen (Pierce) beschichtet worden war, wurden 0,3 ml Zellen (1 · 10&sup7; insgesamt) und 1-2 mCi ¹²&sup5;Natriumjodid zugegeben. Die Zellen wurden unter regelmäßigem Schütteln 25 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen, dreimal in PBS mit 10% FBS gewaschen und in Lysierungspuffer resuspendiert, wie vorstehend beschrieben. Wir entfernten dann die Kerne durch eine 2-minütige Zentrifugation in einer Eppendorf-Zentrifuge. Wir zentrifugierten dann den Überstand zusätzliche 15 Minuten. Der geklärte Überstand wurde dem Immunpräzipitationsprotokoll unterworfen.

1-dimensionale CNBr-Peptidkartierung

Wir führten mit Proben auf einem 12% Acrylamid-SDS-PAGE-Laemmli-System-Gel für eine kurze Strecke eine Elektrophorese durch und schnitten die entsprechenden Gelabschnitte aus. Wir weichten die Gelscheiben eine Stunde in 1,0 ml 1 N HCl, 0,2% 2- Mercaptoethanol mit 15 ul von 700 mg/ml frischem CNBr in 90% Ameisensäure ein. Die Scheiben wurden dann entfernt und 5 Minuten mit 0,1 M Tris-HCl, pH-Wert 8,0, 5 min mit 25 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0 und letztlich 10 min mit 1x Laemmli-SDS-PAGE-Ladepuffer gewaschen. Wir luden die Scheiben auf ein 15% SDS-PAGE-Laemmli-Gel mit einem 12% Acrylamid-Sammelgel. Wir machten die Peptidbanden durch Anfärben mit Silber oder durch Autoradiographie des getrockneten Gels sichtbar.

Erneute Immunpräzipitation

Eine erneute Immunpräzipitation von SDS-PAGE-getrennten Antigenen wurde durch Ausschneiden der markierten Banden aus den Gelen, erneute Hydratation für 10 Minuten in TBS, 0,2% SDS und dann Zerkleinern der Gelscheiben in kleine Stücke durchgeführt. Die Proteine wurden durch 8 Stunden Inkubation in 1 ml TBS, 0,2% SDS bei Raumtemperatur unter Drehen eluiert. Nach der Elution wurden die Gelstücke durch Zentrifugation entfernt, und zu dem Überstand wurde NP-40 mit einer Endkonzentration von 2% zugegeben. Die eluierten Proteine wurden dann wie vorstehend immunpräzipitiert und mittels SDS-PAGE erneut analysiert.

Isoelektrische Fokussierung (IEF)

Zweidimensionale IEF wurde im wesentlichen durchgeführt, wie von P. H. O'Farrell [1 Biol. Chem., 250, 4007-4021 (1975)] beschrieben. ¹²&sup5;I-markierte Antigene wurden aus II- 23.D7-Zellextrakten immunpräzipitiert, und die immunpräzipitierten Proteine wurden durch 5 Minuten Erhitzen auf 100ºC in 100 ul O'Farrell-Probenpuffer, der 9,5 M Harnstoff enthielt, eluiert. Die eluierten Proteine wurden dann 16 Stunden bei Raumtemperatur bei konstanter Spannung (400 V) auf 14 cm · 3 mm-Röhrchengelen, die ein Endkonzentration von 2% an Ampholinen (Bereich pH-Wert 3-10, Sigma) hatten, fokussiert (erste Dimension). Die zweite Dimension war 12% SDS-PAGE.
Für die IEF unter nativen (nicht denautierenden) Bedingungen wurden ¹²&sup5;I-markierte Zellextrakte direkt in Röhrchengelen fokussiert, die außer der Anwesenheit von Harnstoff identisch wären zu den vorstehenden. Die markierten Extrakte (200 ul Volumen) wurden 10 Minuten mit 100 000 · g (30 psi, Airfuge) zentrifugiert, bevor sie auf das Röhrchengel geladen wurden. Die Fokussierung wurde bei 4ºC unter den selben Bedingungen, wie vorstehend beschrieben, durchgeführt. Das Röhrchengel wurde dann entfernt und in 1 cm- Abschnitte zerschnitten, und die Proteine wurden durch 8 Stunden Inkubation bei Raumtemperatur unter Drehen von jeder Scheibe in 1 ml TBS, 2% NP-40, 2 mM PMSF eluiert. Die Überstände, die die eluierten Proteine enthielten, wurden dann immunpräzipitiert und mittels SDS-PAGE analysiert. Die pH-Gradienten für sowohl die denaturierten als auch die nativen Röhrchengele wurden durch Messen der pH-Werte von einzelnen Scheiben von Gelen, die parallel liefen, bestimmt.

T-Zell-Proliferationstests

Wir isolierten und resuspendierten PBL in vollständigem RPMI, wie vorstehend beschrieben, außer dem Ersatz von fötalem Kälberserum durch 10% menschliches, autologes Serum, 1 ug/ml Indomethacin und 50 U/ml Polymyxin B. In den MLR-Experimenten war das autologe Serum das Serum des Responders: Wir bestrahlten Stimulatorzellen von einem unterschiedlichen Donor mit 3000 Rad. Wir heizten Kaninchenseren eine Stunde bei 56ºC vor und verdünnten und sterilfilterten die Seren vor Verwendung in den Proliferationstests. Die Zellen (1 · 10&sup5; insgesamt) in 0,2 ml in einer 96-Mulden-Platte mit rundem Boden wurden entweder mit 5 ug/ml Phytohämagglutinin, 1-2 ng/ml OKT3 oder 1,5-2 · 10&sup5; bestrahlten Stimulatorzellen in der Anwesenheit oder Abwesenheit verschiedener Antiseren oder Cytokine behandelt. Nach drei Tagen (PHA oder OKT3-Aktivierung) oder 5 Tagen (MLR) wurden die Zellen mit ³H-Thymidin pulsmarkiert, geerntet und gezählt.

Beispiel 1

T-Zellen exprimieren LT-verwandte Epitope auf ihren Oberflächen

Unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen aktivierten wir menschliche, periphere, mononukleäre Zellen (PMN) mit dem monoclonalen Antikörper OKT3, und nach zwei Tagen in Kultur analysierten wir sie auf die Expression von p33/LT-Komplex- verwandten Formen unter Verwendung der Durchfluß-cytofluorometrischen Analyse. In einem Experiment, dessen Resultate in Fig. 1 gezeigt werden, züchteten wir frische PBL drei Tage mit OKT3 und IL-2 und färbten sie mit einer 1 : 200-Verdünnung von Antiseren gegen natives rLT ("LT-4"- und "LT-5"-Bilder in Fig. 1 von Kaninchen 4 bzw 5), denaturiertem rLT ("LT-6"-Bild in Fig. 1 von Kaninchen 6) und nativem rTNF ("TNF"-Bild in Fig. 1 von Kaninchen 7). Wir färbten die Zellen mit Serum nach der Immunisierung (durchgehende Linie in den Bildern der Fig. 1) oder mit Serum vor der Immunisierung von jedem Tier (gepunktete Linie in den Bildern der Fig. 1). Die Fig. 1 zeigt, daß nur anti-rLT-Seren von den Kaninchen 4 und 5 Epitope auf den aktivierten peripheren T-Zellen erkannten.
Bei den in Fig. 2 gezeigten Experimenten behandelten wir II-23.D7-Zellen 15 Stunden mit oder ohne 10 ng/ml PMA und färbten sie wie in dem in Fig. 1 beschriebenen Experiment mit anti-rLT-Serum nach der Immunisierung von Kaninchen 4 (durchgehende Linie in den Bildern der Fig. 2) oder mit Serum vor der Immunisierung von Kaninchen 4 (gepunktete Linie in den Bildern der Fig. 2). Wie in Fig. 2 gezeigt, fanden wir, daß das T- Zell-Hybridom II-23.D7, das nach Stimulierung mit Phorbolester (PMA) LT synthetisierte, nach Aktivierung mit PMA Oberflächen-LT-verwandte Epitope exprimierte.
Um festzustellen, daß die LT-verwandten Epitope auf T-Zellen mit LT verwandt waren und nicht mit irgendeiner Verunreinigung in den von CHO-Zellen abgeleiteten, rekombinanten LT-Präparationen, behandelten wir eine 1 : 1000 Verdünnung von Antiserum von Kaninchen 4 mit PMA-aktivierten, gewaschenen II-23.D7-oder U937-Zellen. In dem in Fig. 3 gezeigten Experiment behandelten wir eine 1 ml-Probe von anti-rLT-Seren (1 : 1000 anti-LT-4) entweder nicht mit Zellen (- -) oder mit 1 · 10&sup8; U937-Zellen (-o-), 1 · 10&sup8; (- -) PMA-aktivierten II- 23.D7-Zellen oder 1 · 10&sup7; (- -) PMA-aktivierten II-23.D7-Zellen. Wir fügten Verdünnungen von absorbierten Antiseren zu einer begrenzenden Menge von rLT in einem L929- Cytotoxizitätstest hinzu, so daß in der ersten Mulde eine 1 : 4000 Endverdünnung anwesend war. Dieser Test mißt die Fähigkeit von LT, eine Mausfibroblasten-Zelllinie, L929 innerhalb eines 24 Stunden-Zeitraums abzutöten [L. Green, J. L. Reade, C. F. Ware, "Rapid Colorimetric Assay For Cell Viability: Application To The Quantitation of Cytotoxic And Growth Inhibitory Lymphokines", J. Immun. Meth., 70, 257 (1984)]. Nach 24 Stunden testeten wir die Lebensfähigkeit der Zellen unter Verwendung eines MTT-Ausdrucks. In Fig. 3 ist die optische Dichte (die proportional ist zur Lebensfähigkeit der Zellen) vs. die Verdünnung an absorbierten Antiseren aufgetragen. Die Daten bilden den Durchschnitt von zweifachen Mulden, und die zwei Proben lagen im allgemeinen innerhalb des Bereichs, der durch das Symbol angegeben ist. Wie in Fig. 3 gezeigt, zeigte die Analyse der neutralisierenden Titer der absorbierten Antiseren in dem Standard-L929-Cytotoxizitätstest, daß die aktivierten II-23.D7-Zellen die LT-neutralisierenden Antikörper entfernten, wohingegen U937-Zellen unwirksam waren. Diese Daten zeigen an, daß die antigenen Strukturen auf der Membranoberfläche in der Tat mit LT verwandt sind.
Wir unterwarfen das II-23.D7-Hybridom einer Anzahl von weiteren Behandlungen, um eine Reihe von trivialen Erklärungen für die offensichtliche Existenz, von LT-verwandten Epitopen auf der Oberfläche von T-Zellen zu untersuchen. Zuerst schlossen wir die Möglichkeit aus, daß LT: Antikörper-Komplexe in den Antiseren an TNF/LT-Rezeptoren auf den Hybridomen binden könnten. Sowohl TNF als auch LT haben trimere Strukturen, die die Anwesenheit von Antikörper-bindenden Epitopen innerhalb des Komplexes ermöglichen könnten. Die vorherige Sättigung der zellulären TNF-Rezeptoren mit löslichem TNF oder LT hatte jedoch keinen Einfluß auf die Oberflächenfärbung. Eine solche Sättigung sollte einen solche Immunkomplex an der Bindung an einen solchen Rezeptor gehindert haben.
Die Behandlung mit Milchsäure bei pH 3, die gebundenes TNF von seinem Rezeptor freisetzen kann, hatte keinen Einfluß auf das Signal, was nahe legt, daß LT nicht Rezeptorgebunden ist. Experimente unter Verwendung von ¹²&sup5;I-LT-Bindung an II-23.D7-Zellen zeigten an, daß Rezeptor gebundenes LT bei sauren pH-Werten schwieriger von seinem Rezeptor zu entfernen war als TNF.
Eine milde Trypsinsgaltung der Zellen vor der Färbung führte zu einem Verlust des Signals, was anzeigt, daß das Epitop ein Protein ist. Um zu bestimmen, ob das Oberflächenassoziierte LT über Phosphatidylinosit verknüpft war, wurden die Zellen mit einer Phosphatidylinosit-spezifischen Phospholipase C behandelt. Unter Bedingungen, bei denen ein PI-verknüpftes Antigen, LFA-3, freigesetzt werden konnte [A. Peterson et al., "Monoclonal Antibody And Ligand Binding Sites Of The T Cell Erythrocyte Receptor (CD&sub2;)", Nature, 329, 842 (1987)], wurde auf dem LT-Epitop kein Effekt gesehen.
Wir konnten CHO-Zellen, die mit dem LT-Gen stabil transfiziert waren, nicht färben, weder mit noch ohne vorheriger PMA-Aktivierung, was anzeigt, daß Antikörper gegen CHO- abgeleitete Verunreinigungen im ursprünglichen rLT, das verwendet wurde, um die Kaninchen zu immunisieren, nicht in ausreichenden vorhanden waren, um zur Färbung der II- 23.D7-Zellen beizutragen. In ähnlicher Weise wären Antikörper, die gegen irgendwelche Proteine des fötalen Kälberserums, die die LT-Präparationen verunreinigen, nicht wirksam bei der Färbung der T-Zellen, da die Färbung in 10% fötalem Kälberserum durchgeführt wird.
Eine Vorbehandlung des anti-rLT-Serums mit rLT blockierte die Färbung der LT- Formen auf II-23.D7-Zellen, wohingegen Vorbehandlung mit rTNF dies nicht tat.

Beispiel 2

Immunpräzipitation von LT-verwandten Proteinen auf dem T-Zell-Hybridom II-23.D7

Wir jodierten die Oberfläche von PMA-aktivierten II-23.D7-Zellen und lysierten und solubilisierten die Zellen in Detergens. Immunpräzipitation und SDS-PAGE-Analyse der markierten Membranproteine zeigten, daß zwei Proteine durch anti-rLT-Antiseren erkannt wurden. Fig. 4A zeigt die Ergebnisse der SDS-PAGE-Analyse der jodierten Oberflächenproteine, die mit anti-rLT-Serum entweder vor der Immunisierung (PRE) oder nach der Immunisierung (POST) (von Kaninchen 4) präzipitiert wurden.
Wie in Fig. 4A gezeigt, beobachteten wir eine 25-26 kD Molekulargewichtsform ("LT"), die mit der erwarteten Größe von LT übereinstimmte, und wir sahen auch eine zusätzliche Form von ungefähr 33 kD ("p33"). Weder das Serum vor der Immunisierung von dem selben Kaninchen (Fig. 4A, Spalte PRE), noch das anti-rTNF-Kaninchenserum waren in der Lage, irgendwelche Banden von den jodierten, PMA-aktivierten II-23.D7-Zellen einer Immunpräzipitation zu unterwerfen.
Partielle 1-D-CNBr-Peptidkartierung der jodierten Banden zeigte, daß die 25-26 kD Form in einem Muster gespalten wurde, das identisch ist zu dem von jodiertem rLT, was diese Bande als LT identifizierte. Bei dem in Fig. 4B gezeigten Experiment würden die 25-26 kD- und die 33 kD-Banden von Bild A ausgeschnitten, einer beschränkten CNBr-Spaltung unterworfen und auf einem SDS-PAGE-System einer Elektrophorese unterzogen. Zum Vergleich sind parallel durchgeführte Spaltungen von sowohl rTNF als auch rLT in Fig. 4B gezeigt. Die Gele wurden mittels Autoradiographie sichtbar gemacht. Spur 1 repräsentiert rTNF, Spur 2 repräsentiert rLT, Spur 3 repräsentiert LT, und Spur 4 repräsentiert p33. Die erhöhten Größen der CNBr-Fragmente reflektieren die erhöhten Mengen von Kohlenhydrat auf natürlichem LT. Die jodierte 33 kD Form wurde durch CNBr nicht gespalten (Spur 4), was andeutet, daß sie unterschiedlich ist von dem bekannten LT-Genprodukt. rTNF wurde durch CNBr wegen der Abwesenheit von Methionin in diesem Protein nicht gespalten (Spur 1).
Wir führten die metabolische Markierung mit ³&sup5;S-Methionin und ³&sup5;S-Cystein, gekoppelt mit einer Immunpräzipitation, durch, um diese LT-verwandten Oberflächenformen weiter zu charakterisieren. Im Falle des TNF/LT-Paares erlaubt einem die Verteilung von Cystein und Methionin sowohl zwischen TNF und LT als auch zwischen den Formen mit und ohne ihre Signalsequenzen zu unterscheiden, wie in Untersuchungen über die TNF-Membran- Form herausgefunden wurde [M. Kriegler et al., "A Novel Form of TNF/Cachectin Is a Cell Surface Cytotoxic Transmembrane Protein: Ramifications For the Complex Physiology of TNF", Cell, 53, S. 45-53 (1988)]. Im Falle der vollständig prozessierten Cytokine, d.h. der sezernierten Formen, enthält TNF Cystein und kein Methionin, während Lymphotoxin nur Methionin enthält und kein Cystein. LT jedoch hat zwei Cysteinreste in der Signalsequenzdomäne, und TNF enthält einen Methioninrest in diesem N-terminalen Bereich. Separate Kulturen von II-23.D7-Hybridomzellen wurden entweder mit ³&sup5;S-Methionin oder ³&sup5;S-Cystein markiert, und immunreaktive Proteine wurden präzipitiert. In einem Experiment, dessen Resultate in Fig. 5 gezeigt werden, wurden die II-23.D7-Zellen mit 10 ng/ml PMA aktiviert und simultan 8 Stunden mit entweder ³&sup5;S-Methionin oder ³&sup5;S-Cystein markiert.
Sowohl das Medium als auch die lysierten Zellen wurden aufeinanderfolgenden Immunpräzipitationen mit Serum vor der Immunisierung (Kaninchen 4) (P), anti-rTNF (T)- und anti-rLT (Kaninchen 4) (L)-Serum in dieser Reihenfolge unterworfen. Fig. 5 zeigt eine autoradiographische SDS-PAGE-Analyse der Immunpräzipitate von entweder den Überständen, die sezernierte Protein enthielten, oder den gewaschenen Zellen. "s-TNF" bedeutet die ³&sup5;S-Methionin-markierte anti-rTNF immunpräzipitierte Bande von den Zellen, die vermutlich als unprozessierte 26 kD-Form von TNF bezeichnet wurde. "Met" und "Cys" beziehen sich auf die verwendeten ³&sup5;S-markierten Aminosäuren. Diejenigen Spüren, die ³&sup5;S- Cystein enthielten, wurden für längere Zeiträume belichtet als die Spuren, die ³&sup5;S-Methionin enthielten. In den Überständen von diesen Zellen (Spuren mit "sezerniert" bezeichnet) wurde ein 25 kD-Form von LT ("LT") nach Behandlung der Zellen mit PMA, die mit ³&sup5;S-Methionin markiert waren, freigesetzt, aber nicht von denen, die mit ³&sup5;S-Cystein markiert waren. Dieses Muster ist für vollständig prozessiertes, sezeniertes LT zu erwarten. Längere Expositionszeiten zeigten Spurenmengen von TNF im Überstand und der Einbau der Markierung war, wie für vollständig prozessiertes, sezeniertes TNF zu erwarten war. Wir beobachteten eine Expression von überwiegend LT mit geringen Mengen von TNF auch auf der mRNA-Ebene (Shamansky und Ware, nicht publizierte Beobachtung). Die Analyse der gewaschenen Zellen (Spuren mit "zellulär" bezeichnet) zeigte, daß sowohl 25-26 kD-LT als auch 33 kD-p33 anwesend waren. Die relativen Mengen an den 25-26 kD- und 33 kD-Formen liefen parallel mit den bei Verwendung der Oberflächenjodierung beobachteten. Die 25-26 kD-Oberflächen-LT-Form hat kein Cystein, was die Prozessierung der Leader-Sequenz anzeigt. Die 33 kD-Form baute sowohl ³&sup5;S-Methionin als auch ³&sup5;S-Cystein ein. Längere Expositionszeiten (nicht gezeigt) des in Fig. 5 gezeigten Films offenbarte die Anwesenheit einer anti-TNF immunpräzipitierten Bande von diesen Zellen bei etwa 26-27 kD. Die Bande zeigte den Einbau von sowohl markiertem Cystein als auch markiertem Methionin. Die Markierung war mit Cystein stärker. Da das cys : met-Verhältnis in der 26 kD-TNF-Form 4 : 1 ist, bestätigt dieses Markierungsmuster die Identität dieser Bande.
Die Anwesenheit von p33 zusammen mit LT in Immunpräzipitaten von Zelllysaten legte nahe, daß entweder p33 antigen verwandt ist mit LT oder, daß p33 an LT gebunden ist oder beides. Um diese Frage zu klären, wurden die 25 kD- und 33 kD-Banden von mit ³&sup5;S- Methionin markierten Zellen mit polyclonalem Kaninchen-anti-rLT-Serum immunpräzipitiert, aus den ausgeschnittenen Gelscheiben eluiert und einer erneuten Immunpräzipitation mit entweder polyclonalem anti-rLT-Serum oder mAb unterworfen. LT, aber nicht p33, konnte mit jedem der beiden anti-rLT-Antikörper immunpräzipitiert werden, was nahe legt, daß p33 nicht antigen verwandt ist mit LT. Diese Beobachtungen zeigten an, daß p33 physikalisch mit LT assoziiert ist. Wir glauben, daß das 33 kD-Protein antigen nicht mit LT verwandt ist und einfach mit LT copräzipitierte.
Wir waren weder mit Oberflächenjodierung noch mit metabolischer Markierung in der Lage, irgendeine der bekannten 55 oder 80 kD-TNF/LT-Rezeptorformen zu entdecken, die mit LT oder TNF assoziiert sind. Wir glauben, daß dies so ist, weil die Rezeptoren während der Aktivierung der T-Zellen rasch verloren gehen. [C. Ware et al., "Regulation Of The CTL Lytic Pathway By Tumor Necrosis Factor", Cellular Immunity And The Immunotherapy Of Cancer, UCLA Symposia on Molecular and Cell Biology M. T. Lotze and O. J. Finn, Hrsg. Vol. 135, 5. 121-128 (Wiley-Liss, Inc. New York) 1990].

Beispiel 3

Biochemische Charakterisierung von Oberflächen-LT-Formen auf II-23.D7-Zellen

Wir reinigten die LT-verwandten Formen auf der Oberfläche von PMA-behandelten II- 23.D7-Zellen unter Verwendung der Affinitätschromatographie. Bei der Verwendung von Immunpräzipitationsverfahren hatteh wir bemerkt, daß sowohl p33 als auch LT an Linsenlektin-Sepharose banden, was eine Glycopioteinstruktur andeutete. Wir banden Detergens-solubilisierte, PMA-behandelte II-23.D7-Proteine an Linsenlektin-Sepharose und eluierten vor der Affinitätsreinigung mit α-Methylmannosid. Wir stellten sowohl Kontroll- IgG- als auch anti-IgG-Säulen her, um diese Proteine genauer zu erfassen, die vom anti-rLT- Serum spezifisch erkannt wurden. Die Eluierung der Säulen bei niedrigem pH-Wert führte zur Freisetzung von etwa 100-200 ng der zwei LT-Formen von der anti-rLT-Säule.
Fig. 6A zeigt die SDS-PAGE-Analyse der Proteine, die von anti-rLT-Affinitätssäule eluiert waren, die mit Kaninchenseren entweder vor der Immunisierung (PRE) oder nach der Immunisierung (POST) hergestellt waren. In Fig. 6B wurden die 33 kD- und 20 kD-Banden von dem Gel in Bild A ausgeschnitten und einer beschränkten CNBr-Spaltung unterworfen und auf einem SDS-PAGE-System einer Elektrophorese unterworfen. Zum Vergleich zeigte Fig. 6B CNBr-Spaltungen von rTNF und rLT (von CHO abgeleitet), die parallel durchgeführt wurden. Die Gele wurden mittels Silberfärbung sichtbar gemacht. SDS-PAGE- Gele der Eluate ähnelten sehr Gelen von immunpräzipitierten, Oberflächen jodierten, PMA- behandelten 23.D7-Zellen, was anzeigt, daß ähnliche Proteine gereinigt worden waren.
Während der Affinitätsreinigung schien die 25 kD-LT-Form zu einer 19-20 kD-Form gespalten zu werden, d.h. sie wanderte jetzt zusammen mit dem intakten, rekombinanten, von CHO-Zellen abgeleiteten LT. Die ursprüngliche Isolierung von natürlichem LT von der RPMI 1788 Tumorlinie ergab ebenfalls eine N-terminal gespaltene "des-20"-LT-Form. Der eindimensionale CNBr-Verdau der Affinitäts-gereinigten Proteine zeigte, daß die gespaltene 20 kD-LT-Form ein CNBr-Spaltungsmuster hat, das wahrscheinlich die verkürzte Natur dieser LT-Form wiederspiegelt. Eines der Methionine geht bei der "des-20"-LT-Förm verloren, und daher wäre das Spaltungsmuster unterschiedlich von dem der intakten LT-Form. Das 33 kD- Protein (p33) bildete nach Spaltung mit CNBr ein Duplett, und daraus wurde geschätzt, daß das einzige Methionin innerhalb von 5-20 Resten von entweder dem C- oder N-Ende liegen muß. Dieses Spaltungsmuster zeigt, daß das 33 kD-Protein deutlich unterschiedlich ist von den bekannten LT-Formen. Die CNBr-Spaltungsanalyse des Oberflächen jodierten 33 kD-Proteins ergibt wahrscheinlich ein ähnliches Ergebnis; die mit der Jodierung erreichbare Auflösung genügte jedoch nicht, um das Doublett sichtbar zu machen. Der Verdau von jodierten rLT, rTNF und der II-23.D7-LT-Form mit Staphylococcus V8 zeigte, daß rLT und die 25-26 kD-II- 23.D7-LT-Form resistent gegen den Verdau sind, was die Zuordnung dieses Proteins als LT bestätigt. Das 33 kD-Protein wurde in mehrere kleinere Fragmente gespalten mit einem Muster, das dem von rTNF stark ähnelt.
In Fig. 7 wurden immunpräzipitierte, Oberflächenjodierte Proteine mittels SDS- PAGE-Analyse aufgelöst, und die Oberflächen-assoziierte 25-26 kD-Protein- ("sLT") und die 33 kD-Protein- ("p33") Bande wurden ausgeschnitten. Die Scheiben wurden mit N-Glycanase (N-Gly), mit einem Gemisch aus Neuraminidase und O-Glycanase (O-Gly) oder mit allen drei Enzymen verdaut. Die verdauten Scheiben wurden noch einmal auf SDS-PAGE laufen gelassen, und ein Autoradiogramm des getrockneten Gels wird gezeigt. Wie in Fig. 7 gezeigt, zeigte die Immunpräzipitation von jodiertem Oberflächen-LT, gefolgt von dem Verdau mit entweder N- oder O-Glycanasen oder mit beiden, daß die 25-26 kD-LT-Form ein N-verknüpftes Oligosaccharid enthält. Die 25-26 kD-LT-Form enthält nur eine N-verknüpfte Stelle, die gut übereinstimmen würde mit der Größenveränderung bei N-Glycanase-Verdau. Vergleichsweise verlor die 33 kD-Form (p33) bei Behandlung mit N-Glycanase etwa 3 kD an Größe, was die Anwesenheit von einem N-verknüpften Oligosaccharid nahe legt. Im Gegensatz zur 25-26 kD-LT-Form beeinträchtigte die Behandlung mit O-Glycanase nicht das Molekulargewicht von p33. Das Fehlen der Spaltung durch eine Glycanase ist jedoch kein definitiver Beweis für das Fehlen eines Kohlenhydrats.

Beispiel 4

Erneute Immunpräzipitation von LT

Die gemeinsame Präzipitation von p33 mit LT legte nahe, daß diese Proteine entweder antigen verwandt oder physikalisch assoziiert sind. Um diese Frage zu klären, testeten wir, ob mittels SDS-PAGE getrennte LT- (p25) und p33-Proteine immunpräzipitiert werden konnten oder nicht. Mit I¹²&sup5; oder ³&sup5;S-Met markiertes LT und p33 wurden zunächst teilweise durch Immunpräzipitation gereinigt und mittels SDS-PAGE getrennt. Die markierten Banden wurden ausgeschnitten, in Puffer erneut hydratisiert und die Proteine eluiert. Die eluierten Proteine wurden einer zweiten Runde Immunpräzipitation unterworfen unter Verwendung von entweder polyclonalen oder monoclonalen anti-rLT-Antikörpern (Fig. 10). Kaninchen-anti- rLT immunpräzipitierte erneut LT ("p25", Spur 2), aber nicht p33 (Spur 3). Das anti-rLT-mAb präzipitierte LT (Spur 5) und ein 21 kD-Protein ("p21", Spur 4), welches, wie nachstehend gezeigt wird, ein Vorläufer von LT ist; er präzipitierte jedoch nicht p33 (Spur 6). Diese Ergebnisse zeigen an, daß, nachdem LT und p33 mittels SDS-PAGE getrennt sind, sowohl polyclonale als auch monoclonale anti-rLT-Antikörper in der Lage sind, mit LT zu reagieren, aber nicht mit p33. Diese Daten machen offensichtlich, daß p33 nicht mit LT-Antigen verwandt ist. Wir können jedoch nicht die Möglichkeit ausschließen, daß mögliche Kreuzreaktive Epitope von p33 nach der Denaturierung verloren gehen, während die LT-Epitope intakt bleiben.
Fig. 8 zeigt die Ergebnisse der erneuten Immunpräzipitation von ¹²&sup5;I- und ³&sup5;S-Met- markierten p25- und p33-Proteinen, die aus SDS-PAGE-Gelen eluiert wurden. LT- und p33- Arten von ¹²&sup5;I-markierten II-23.D7-Zellen (Spuren 2,3) und ³&sup5;S-markierten Zellen (Spuren 4,5,6) wurden wie vorstehend beschrieben aus den Gelscheiben eluiert. Die Eluate wurden immunpräzipitiert mit entweder dem anti-rLT-Serum (Spuren 2, 3) oder anti-rLT mAb (Spuren 4,5,6) und die erneut präzipitierten Proteine mittels SDS-PAGE und Autoradiographie analysiert. Spur 1 ist eine Kontrollspur zur Identifikation von p25 und p33.

Beispiel 5

Isoelektrische Fokussierung von LT und p33

Die Fig. 9 und 10 (jede umfassend ein Autoradiogramm (9A, 10A) und eine Kalibrierungskurve, die die Wanderungsstrecke gegen den pH-Wert darstellt (9B, 10B)) stellen die Analyse mittels isoelektrischer Fokussierung unter denaturierenden (Fig. 9) und nativen (Fig. 10) Bedingungen dar. Die zweidimensionale Gel-Analyse wurde, wie vorstehend beschrieben, mit ¹²&sup5;I-markiertem p25- und p33 durchgeführt, die von II-23.D7-Zellextrakten immunpräzipitiert waren. Die 2-D-Gelanalyse wurde unter denaturierenden Bedingungen in der Anwesenheit von Harnstoff durchgeführt (Fig. 9A). Im Gegensatz dazu wurde die native IEF in 1% NP-40 ohne Harnstoff durchgeführt. Der ¹²&sup5;I-markierte II-23.D7-Zellextrakt wurde zuerst bei 4ºC in einem Röhrchengel fokussiert. Nach der Fokussierung wurde das Röhrchengel in 1 cm-Stücke geschnitten, die fokussierten Proteine aus diesen Stücken eluiert, immunpräzipitiert und mittels SDS-PAGE analysiert (Fig. 10A). Immunpräzipitleites Material von den Gelspuren 1-12 entspricht den Röhrchengelscheiben 2-13. pH- Gradienten wurden für sowohl die denaturierten als auch die nativen Röhrchengele entsprechend einem Gelzuwachs von 1 cm erzeugt. Diese werden ebenfalls unterhalb jedes Autoradiogramms als 9B bzw. 10B gezeigt.

Beisipel 6

Regulation der LT-Expression

Nachstehend gezeigte Tabelle I faßt die Ergebnisse einer Übersicht unter Verwendung der Durchfluß-cytofluorometrischen Analyse für verschiedene Zelltypen für die Expression einer Oberflächenform von LT zusammen Tabelle 1 Expression von LT- und TNF-verwandten Epitopen auf der Oberfläche verschiedener Zellen
Die überraschendste Beobachtung von diesen Untersuchungen war die Restriktion der Expression von Oberflächen-LT nur auf T-Zellen. Leu-M3-, ein Monocyten-Marker, und Leu- 4- (CD3) Antikörper wurden bei der Zweifarben-Durchfluß-cytofluorometrischen Analyse verwendet, um jede Zellpopulation separat zu beobachten. Es gab eine ausgezeichnete Unterscheidung zwischen Oberflächen-TNF und Oberflächen-LT bei dieser Analyse, indem Monocyten nur Oberflächen-TNF exprimierten, während T-Zellen nur Oberflächen-LT zeigten. Dieses Ergebnis wird in Fig. 11 gezeigt.
Bei dem in Fig. 11 dargestellten Experiment wurden PBL 8 Stunden mit einem Gemisch aus LPS (1 ug/ml), Interferon-γ (200 U/ml) und OKT3 (1 ng/ml) behandelt und dann für LT (anti-rLT-Serum von Kaninchen 5) oder TNF (anti-rTNF-Serum von Kaninchen 7) angefärbt, gefolgt von einer FITC-anti-Kaninchen-Markierung. Die Zellen wurden gegengefärbt mit entweder Phycoerythrin-leu-4, einem Pan-T-Zell-Marker, oder Phycoerythrin-leu-M3, einem Monocyten-Marker. "T-Zell-Gruppen" wurden nach leu-4&spplus;- Zellen geordnet ("gated"), während "Monocyten"-Gruppen nach leu-M3&spplus;-Zellen geordnet wurden. Zellen wurden mit Seren vor der Immunisierung (gepunktete Linien) oder nach der Immunisierung (durchgezogene Linien) gefärbt. Die Monocyten-Tumorlinien HL-60 und U937 färbten nicht für LT. Bei Verwendung der Zweifarben-Durchfluß-cytofluorometrischen Analyse wurde gefunden, daß die T4- und T8-Unterklassen von aktivierten PBL ähnliche Mengen an Oberflächenassoziiertem LT zeigten. Im allgemeinen scheint es, daß primäre T- Zellen, die in der Lage sind, LT zu exprimieren, auch in der Lage sind, Oberflächen-LT- Formen zu zeigen.
Die Untersuchung von drei verschiedenen menschlichen Spendern zeigte, daß eine Oberflächen-LT-Form auf frisch isolierten, ruhenden peripheren T-Zellen anwesend war. Im Falle von PBL führte die Aktivierung der Zellen mit OKT3 oder einfach die Behandlung mit IL-2 zu einer erhöhten Expression. Unter Verwendung von Fluoreszenz-Kanalnummern haben wir versucht, die Expression von sowohl Oberflächen-LT als auch IL-2-Rezeptoren (CD25) während der OKT3-Aktivierung zu quantifizieren. Eine maximale Induktion von Oberflächen- LT durch OKT3 schien der Spitzenexpression von IL-2-Rezeptor (TAC-Expression) in der Massenkultur vorauszugehen, daher scheint die Öberflächen-gebundene LT-Form (p33/LT- Komplex) ein frühes Antigen der T-Zell-Aktivierung zu sein. Es wurde gefunden, daß sowohl das anti-T11- als auch das allogene Antigen in der Lage waren, das Erscheinen von LT auf der Oberfläche von clonierten cytotoxischen T-Zellen zu bewirken. Vergleichsweise war die PMA-Stimulierung erforderlich, um das Erscheinen von LT auf der Oberfläche von II-23.D7- Hybridomen zu induzieren. Es scheint, daß die Aktivierung von T-Zellen die Oberflächen-LT- Form(en) erhöht. Periphere Lymphocyten, im Gegensatz zu II-23.D7-Hybridomen, regulieren nach PMA-Behandlung Oberflächen-LT-Formen sehr schnell herunter. Vergleichsweise fehlten bei der Zweifarben-Analyse von OKT3-aktivierten PBL-Populationen Dr&spplus;-Zellen, die T-Zellen in fortgeschrittenen Stadien der Aktivierung umfassen sollten, Oberflächen-LT- Form(en).
Die Aktivierung von frischen PBL mit hohen Mengen an IL-2 erzeugte Lymphokinaktivierte Killerzellen (LAK-Zellen). Wie in Fig. 12 gezeigt, zeigte die Zweifarben- Durchfluß-cytofluorometrische Analyse unter Verwendung von anti-rLT und Leu-19, einem NK/LAK-Zellmarker, daß die Expression der Oberflächen-LT-Formen von LAK-Zellen derjenigen der T-Zell-Hybridomlinie II-23.D7 ähnelt. Bei dem in Fig. 12 gezeigten Experiment wurden PBL 5 Tage mit 20 ng/ml IL-2 gezüchtet und dann für die Zweifarben- Analyse mit Phycoerythrin-markierten Leu-19 und anti-rLT (Kaninchen 5) gefärbt, wie vorstehend beschrieben. Fig. 12 zeigt die Oberflächen-LT-Mengen auf Leu-19&spplus;-Zellen, die mit Seren vor der Immunisierung (gepunktete Linien) oder nach der Immunisierung (durchgezogene Linien) gefärbt waren. Somit schienen LAK-Zellen die höchsten Mengen an Oberflächen-LT-Formen von allen primären Zelltypen zu haben.

Beispiel 7

Funktionelle Bedeutung von Gesamt-TNF oder -LT für die T-Zell-Aktivierung

Um die funktionelle Bedeutung von TNF und LT für die T-Zell-Aktivierurigsprozesse zu untersuchen, schlossen wir die Kaninchen-anti-rLT- und -anti-rTNF-Seren in Lymphocyten-Mischkultur-Reaktions- (MLR) und OKT3-Aktivierungstests ein. MLR ist ein immunologischer Standardtest, der die Fähigkeit der T-Zellen eines Individuums testet, die T- Zellen einer anderen Person als fremd zu erkennen und auf ihre Anwesenheit mit Proliferation zu antworten. Die nachstehende Tabelle II zeigt Daten von MLR-Experimenten unter Verwendung verschiedener Responder/Stimulator-Kombinationen. Tabelle II Effekte von LT- und TNF-Antikörper auf eine 5-Tage alte Lymphocyten-Mischkultur
Vgl. nachstehende Erläuterungen
aProzent Veränderung bezieht sich auf die Erhöhung oder Verminderung des Einbaus an ³H- Thymidin nach Korrektur um einen Hintergrund von Responder-Zellen allein
bStimulatorzellen wurden mit 3000 Rad bestrahlt und werden mit "*" gekennzeichnet. Proliferation auf niedrigem Niveau war bei den Stimulatorpopulationen noch vorhanden. Das Verhältnis von Responder zu Stimulator war 1/1,5.
crTNF und rLT wurden zu einer Konzentration von 10 ng/ml zugegeben.
dAntiseren wurden eine Stunde bei 56ºC Hitze-inaktiviert, gefiltert und mit einer Endverdünnung von 1 : 250 verwendet.
eDer monoclonale anti-TNF war ein gereinigter Maus-IgG2a-Antikörper, der mit 2 ug/ml verwendet wurde, und die Kontrolle war in diesem Fall reiner Maus-UPC 10 (IgG2a).
fIn diesem Fall wurde die Immunglobulin-Fraktion aus dem Serum gereinigt und mit einer Endkonzentration von 50 ug/ml verwendet.
Wie in Tabelle II gezeigt inhibierten die neutralisierenden anti-rLT-Seren (Kaninchen 4 und 5) die proliferative Antwort, wie nach 5 Tagen festgestelh wurde, wohingegen die Seren vor der Immunisierung oder die nicht neutralisierenden anti-rLT-Seren (Kaninchen 6) milde stimulatorische Effekte hatten. Wie kürzlich berichtet [M. Shalaby et al., "The Involvement Of Human Tumor Necrosis Factor-a And -β In The Mixed Lymphocyte Reaction", J. Immun., 141, 499 (1988)), sind polyclonale und monoclonale anti-TNF-Präparationen ebenfalls inhibitorisch. Diese Tests wurden unter Überschußbedingungen für Stimulatorzellen durchgeführt, und deshalb kann die Inhibierung nicht optimiert gewesen sein. Die in Tabelle II verwendeten Serummengen sind ziemlich hoch, aber in anderen Experimenten (Ergebnisse nicht gezeigt) waren Antikörperverdünnungen von bis zu 1 : 1000 noch inhibitorisch. Die PHA- oder OKT3-stimulierte T-Zell-Proliferation wurde auch zu einem kleineren Ausmaß inhibiert (Ergebnisse nicht gezeigt). Diese Ergebnisse zeigten, daß LT oder mit LT verwandte Epitope auf T-Zelloberflächen in die T-Zellaktivierung involviert sein können.
Eine kürzliche Untersuchung unter Verwendung des MLR-Tests und neutralisierender monoclonaler Antikörper bezog TNF, aber nicht LT, in die T-Zellaktivierung und anschließende Proliferation in diesem System ein. [M. Shalaby et al., a.a.o.]. Bei dieser Untersuchung hatten monoclonale anti-rLT-Antikörper keine Wirkung im MLR-Test. Unsere Untersuchungen zeigen, daß neutralisierende, polyclonale anti-CHO-Zell-abgeleitetes-rLT- Seren in der Lage waren, die MLR teilweise zu inhibieren, was eine Rolle für eine Form von LT in diesem System nahe legt. Die Gründe für diese Diskrepanz sind nicht klar, obwohl es einige Unterschiede in der Natur dieser Antikörperpräparationen geben kann. Die monoclonalen Antikörper wurden gegen Glutaraldehyd-verknüpftes natürliches LT (von RPMI 1788 sezerniert) gebildet, wohingegen die polyclonalen anti-rLT-Seren unter Verwendung von nativem rLT (abgeleitet von rekombinanten CHO-Zellen) mit Freundschem Adjuvans, direkt in die Lymphknoten injiziert, hergestellt würden. Der Depoteffekt beim Erfolg des zweiten Systems war wahrscheinlich wichtig, wenn man die Schwierigkeiten berücksichtigt, die bei der Immunisierung von Mäusen berichtet wurden [T. Bringman et al., "Monoclonal Antibodies to Human Tumor Necrosis Factor Alpha and Beta: Application For Affinity Purification, Immunoassays, And As Structural Probes", Hybridoma, 6, 489 (1987)]. Diese Ergebnisse legen nahe; daß die blockierende Wirkung unserer polyclonalen anti-rLT- Seren bei der MLR eher ein Resultat der Erkennung der Oberflächen-LT-Form(en) durch die Seren ist als der Erkennung der herkömmlichen LT-Form.

Beispiel 8

Reinigung von LT und dem assoziierten Protein p133

Wir züchteten 11-23.D7-Zellen in RPMI-Medium mit 10% fötalem Kälberserum, und wir ernteten die Zellen aus 50 1 RPMI-Medium und resuspendierten sie in Medium mit einer Konzentration von 4 · 106 Zellen/ml, und wir fügten 50 ng/ml Phorbolmyristoylacetat (PMA) hinzu. Nach 6 Stunden Aktivierung ernteten wir die Zellen durch Zentrifugation und wuschen sie mit Dulbecco's phosphatgepufferter Salzlösung. Wir suspendierten das endgültige Zellpellet von 4 · 10¹&sup0; Zellen in 200 ml kaltem Lysierungspuffer (50 mM HEPES-Puffer, pH- Wert 7,0; 0,1 M NaCl, 10 mM EDTA, 5 mM Benzamidin je 10 ug/ml Sojabohnen- Trypsininhibitor, Aprotinin, Chymostatin, Leupeptin und Antipain, 1 ug/ml Pepstatin und 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid) und schickten das Pellet einmal durch einen Stickstoffkavitationsapparat. Wir zentrifugierten die lysierten Zellen 60 Minuten bei 40 000 UpM in einem 50.2 Ti-Rotor und verwarfen den Überstand. Wir extrahierten das Pellet über Nacht in 120 ml Lysierungspuffer mit 1% Gew./Vol. Nonidet P40-Detergens und zentrifugierten dann wie vorstehend.
Wir fügten den Überstand, der die Detergens-solubilisierten Membranproteine enthielt, zu 2 ml Affinitätsharz hinzu, das aus monoclonalem anti-Lymphotoxin (anti-Tumor-Nekrose- Faktor-β von Boehringer Mannheim), gekoppelt an Affi-Gel 10 (BioRad), bestand, und schüttelten die Suspension über Nacht. Wir sammelten das Harz in einer kleinen Säule und wuschen es mit 50 mM HEPES, pH-Wert 7,0 mit 1% Nonidet P40 und dann mit dem selben Puffer mit 1% Gew./Vol. MEGA-8 (Boehringer Mannheim). Wir eluierten die gebundenen Proteine mit 1% MEGA-8 in 50 mM Glycinpuffer, pH-Wert 2,5, und neutralisierten die Fraktionen unmittelbar mit Tris-Base. Wir bestimmten die Anwesenheit von p33 und LT in den Fraktionen mittels SDS-PAGE-Analyse und Silberfärbung. Wir vereinten die Fraktionen, die diese Proteine enthielten, und fügten SDS mit einer Endkonzentration von 0,1% Gew./Vol. hinzu, und wir dialysierten den Pool gegen 0,1 · Laemmli-Probenpuffer (mit mehrfachem Wechsel, um das MEGA-8-Detergens zu entfernen). Wir lyophilisierten die dialysierte Lösung bis zur Trockenheit und resuspendierten sie in 1/10 des ursprünglichen Volumens an Wasser. Wir ließen die Probe auf einem SDS-PAGE-Gel laufen, transferierten sie auf eine ProBlot-Membran (Applied Biosystems) und färbten sie mit Coomassie Blau- Farbstoff. Wir schnitten die p33- und 25 kD-LT-Banden aus und luden sie in ein Protein- Sequenziergerät. Wir erhielten die N-terminale Sequenz durch Edman-Abbau mit einem Applied Biosystems-Sequenziergerät Modell 470A, das an einen 120A PTH- Aminosäureanalysator gekoppelt war. Wir fanden, daß die Sequenz von Membran- assoziiertem Lymphotoxin genau übereinstimmte mit der, die für sezerniertes Lymphotoxin beschrieben wurde, d.h. (SEQ ID NR: 1) Leu Pro Gly Val Gly Leu Thr Pro Ser.
Dieses Schema erlaubt einem, p33 zu einer Bande auf einem Blot zu reinigen. Es sollte für jeden Durchschnittsfachmann möglich sein, die von dem Affinitätsharz eluierten Proteine mittels Ionenaustauscherchromatographie zu trennen. Zum Beispiel kann der Komplex mit Harnstoff dissoziiert werden, und die LT- und p33-Proteine können z.B. mit MONO Q FPLC- (Pharmacia) Ionenaustauscherchromatographie in Tris-HCl-Puffer, pH-Wert 8,0 mit 1% nicht-ionischem Detergens (z.B. MEGA-8, Boehringer Mannheim) und Harnstoff unter Verwendung einer Salzgradientenelution getrennt werden. Dieses chromatographische Verfahren trennt auf der Basis von unterschiedlichen Ladungen auf den Proteinen. Die zwei Proteine sind trennbar in einem Experiment mit isoelektrischer Fokussierung (vgl. a.a.o.) auf der Basis von Ladungsunterschieden, wobei Harnstoff verwendet wird, um den p33/LT- Komplex zu dissoziieren. Solch eine Kombination von Affinitätschromatographie, Dissoziation in Harnstoff/nicht-ionischem Detergens und Ionenaustauscherchromatographie erlaubt die Reinigung von löslichem p33 oder des p33/LT-Komplexes.

Beispiel 9

Clonierungsstrategien

A: Die Proteinsequenz erlaubt einem, mögliche Nucleinsäuresequenzen vorauszusagen, die das Protein codieren würden. Um p33 zu clonieren, nehmen wir Pools einer 17mer- Oligotlucleotidsequenz, die ein 6 Aminosäure-Segment codieren. Im Prinzip kann jedes Segment verwendet werden. Radiomarkierte Oligonucleotid-Pools werden verwendet, um Northern Blots von RNA von PMA-induzierten II-23.D7 und Hut-78 (ohne PMA), die beide p33 exprimieren müssen, ebenso wie RNA von mehreren nicht-hämotopoetischen Zelllinien, z.B. HT1080, ME-180, MCF-7 und RL-95, zu sondieren. Da LT nur auf T-Zellen beobachtet wird, obwohl auch andere Zellen LT sezernieren können (es aber nicht zur Oberfläche dirigieren), postulieren wir, daß p33 nur in T-Zellen exprimiert wird. Wir werden nach mRNA's suchen, die vorzugsweise in T-Zellen exprimiert werden und die größer sind als etwa 1,0 kb (um ein 30 kD-Protein zu codieren). Wenn wir den richtigen Sonden-Pool finden, werden wir diese Sonde verwenden, um eine PMA-induzierte II-23.D7 cDNA-Bank zu durchmustern. Der korrekte Clon wird LT in einer CHO-Zelllinie, die mit rLT stabil transfiziert ist und konstitutiv LT sezerniert, zur Oberfläche dirigieren [Browning und Ribolini, J. Immunol., a.a.o.].
B: Sowohl LT als auch p33 sind erforderlich, um den p33/LT-Komplex zu erhalten, und daher werden normale Strategien der Expressionsclonierung nicht funktionieren, da die Wahrscheinlichkeit, daß beide Clone in die selbe Zelle transfiziert werden, sehr niedrig ist. Die Transfektion von Säugerzellen, wie COS-Zellen, mit einer cDNA-Bank von II-23.D7 und auch LT-cDNA in Expressionsvektoren sollte LT in den Zellen zur Oberfläche dirigieren, die sowohl mit LT- als auch p33-DNA transfiziert sind. Die Transfektion von COS-Zellen mit LT allein wird nicht zum Erscheinen einer Oberflächen-LT-Form führen. Die Zellen, die LT als auch p33 exprimieren, könnten dann mit anti-LT-Antikörper einem Panning-Verfahren unterworfen werden. [A. Aruffo und B. Seed, "Molecular Cloning of a CD28 cDNA by a High Efficiency COS Cell Expression System", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84; 8573-77 (1987).] Die PMA-induzierte II-23.D7-Zelllinie zeigt in dieser Situation ein sehr gutes Panning- Verhalten. Daher erwarten wir, daß die Durchmusterung einer PMA-induzierten II-23.D7- Bibliothek in dem pCDM8-Vektorsystem auf den LT-transfizierten CHO-Zellen zu dem Clon für p33 führen wird.

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE INFORMATION

(i) ANMELDER: Browning, Jeffrey Ware, Carl F.
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: OBERFLÄCHEN- KOMPLEXIERTES LYMPHOTOXIN
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 1
(iv) KORRESPONDENZADRESSE:
(A) ADRESSAT: c/o Fish & Neave
(B) STRASSE: 875 Third Avenue, 29th Floor
(C) STADT: New York
(D) STAAT: New York
(E) LAND: USA
(F) POSTLEITZAHL: 10022-6250
(v) COMPUTERLESBARE FORM:
(A) MEDIUMART: Floppy Disk
(B) COMPUTER: IBM PC kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1,25
(vi) DATEN DER VORLIEGENDEN ANMELDUNG
(A) ANMELDENUMMER:
(B) ANMELDEDATUM:
(C) KLASSIFIKATION:
(vii) DATEN DER FRÜHEREN ANMELDUNG:
(A) ANMELDENUMMER: US 07/544,862
(B) ANMELDEDATUM: 27. Juni 1990
(viii) ANWALTS/AGENTEN-INFORMATION:
(A) NAME: Haley Jr., James F.
(B) REGISTRIERUNGSNUMMER: 27,794
(C) REFERENZ/AKTEN-NUMMER: B 129CIP
(ix) TELEKOMMUNIKATIONSINFORMATION:
(A) TELEFON: 212-715-0600
(B) TELEFAX: 212-715-0674
(C) TELEX: 14-8367

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR: 1:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
(A) LÄNGE: 9 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) TOPOLOGIE: unbekannt
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 1:

Claims

1. Membrantyp-Lymphocyten-Polypeptid mit einem Molekulargewicht von 31- 35kD, das sowohl Methioninreste als auch Cysteinreste hat, wobei das Polypeptid die Fähigkeit besitzt, Lymphotoxin zu binden, und an der Oberfläche von OKT3-stimulierten primären T-Zellen und antigenspezifischen IL-2 abhängigen CTL-Clonen lokalisierbar ist.

2. Membrantyp-Lymphocyten-Polypeptid, erhältlich durch Expression LT- verwandter Epitope an der Oberfläche von T-Zellen, wie OKT3-stimulierten primären T-Zellen oder antigenspezifischen IL-2-abhängigen CTL-Clonen und Isolieren des an der Oberfläche dieser Zellen exprimierten 31-35kD- Polypeptids durch Oberflächen-Iodierung gekoppelt mit Immunpräzipitation.

3. Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Polypeptid ein Membrantyp- Lymphocyten-Polypeptid ist, das mit einer Zelloberfläche assoziiert ist.

4. Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Polypeptid ein Membrantyp- Lymphocyten-Polypeptid ist, das nicht mit einer Zelloberfläche assoziiert ist.

5. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, welches das Polypeptid p33 ist.

6. DNA-Sequenz, die im wesentlichen aus einer DNA-Sequenz besteht, die das Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5 codiert.

7. Rekombinantes DNA-Molekül, das eine DNA-Sequenz nach Anspruch 6 umfasst.

8. Wirt aus der Gruppe von einzelligen Wirten oder tierischen Zellen und menschlichen Zellen in Kultur, der mit einer DNA-Sequenz nach Anspruch 6 oder einem rekombinanten DNA-Molekül nach Anspruch 7 transfiziert ist.

9. Wirt nach Anspruch 8, ausgewählt aus der Gruppe von tumorinfiltrierenden Lymphocyten, Lymphokin-aktivierten Killerzellen und Killerzellen.

10. Verfahren zur Herstellung des Polypeptides nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Verfahren die Schritte der Züchtung eines transformierten Wirtes nach Anspruch 8 oder 9 und der Gewinnung des Polypeptides umfasst.

11. Polypeptid-Komplex, der ein Membrantyp-Lymphocyten-Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder hergestellt nach Anspruch 10 und ein Lymphotoxin umfasst.

12. Komplex nach Anspruch 11, wobei das Lymphotoxin aus der Gruppe von nativem menschlichem oder tierischem Lymphotoxin, rekombinantem Lymphotoxin, löslichem Lymphotoxin, sezerniertem Lymphotoxin oder Lymphotoxin-aktiven Fragmenten aus einem der oben genannten ausgewählt ist.

13. Verfahren zur Erhöhung der Anzahl von Lymphotoxin-Epitopen auf der Oberfläche einer Zelle, die diese Epitope produziert und sezerniert, umfassend die Schritte der Transfektion der Zelle mit einer DNA-Sequenz nach Anspruch 6 oder mit einem rekombinanten DNA-Molekül nach Anspruch 7 und der Expression dieser DNA in der Zelle.

14. Verfahren zur Steigerung der gezielten, tumorzerstörenden Aktivität von tumorinfiltrierenden Lymphocyten, welches die Schritte der Transfektion der Lymphocyten mit einer DNA-Sequenz nach Anspruch 6 oder mit einem rekombinanten DNA-Molekül nach Anspruch 7 und die Zubereitung der transformierten Lymphocyten für die Einführung in einen Patienten umfasst.

15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei die transformierten Lymphocyten vor oder nach der Transfektion mit der DNA-Sequenz nach Anspruch 6 oder dem rekombinanten DNA-Molekül nach Anspruch 7 mit einem Lymphokin inkubiert werden.

16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei das Lymphokin IL-2 ist.

17. Zusammensetzung, die ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5, einen Polypeptidkomplex nach Anspruch 11 oder 12 oder Antikörper gegen obige und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.

18. Verwendung eines Polypeptides nach einem der Ansprüche 1 bis 5, eines Polypeptidkomplexes nach Anspruch 11 oder 12 oder von Antikörpern gegen obige, zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Verhinderung oder Verminderung der Ausbreitung, Heftigkeit, oder der das Immunsystem schwächenden Effekte einer HIV-Infektion.

19. Verwendung eines Polypeptides nach einem der Ansprüche 1 bis 5, eines Polypeptidkomplexes nach Anspruch 11 oder 12 oder von Antikörpern gegen obige, zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Verhinderung, Behandlung oder Verminderung der Ausbreitung, Heftigkeit oder Auswirkungen von Neoplasie.

20. Verwendung eines Polypeptides nach einem der Ansprüche 1 bis 5, eines Polypeptidkomplexes nach Anspruch 11 oder 12, oder von Antikörpern gegen obige, zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Verhinderung, Behandlung oder Verminderung der Ausbreitung, Heftigkeit oder Auswirkungen von Entzündungen oder entzündlichen Erkrankungen.

21. Verwendung eines Polypeptides nach einem der Ansprüche 1 bis 5, eines Polypeptidkomplexes nach Anspruch 11 oder 12 oder von Antikörpern gegen obige, zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Modulation der Immunantwort eines Patienten.

22. Verfahren zur Herstellung der DNA-Sequenz nach Anspruch 6, welches die Sequenzierung eines Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 5, die Synthese von DNA-Sonden und das Durchmustern einer geeigneten DNA- Bibliothek umfasst.

23. Verfahren zur Herstellung des rekombinanten DNA-Moleküls nach Anspruch 7, welches das Einbringen einer DNA-Sequenz in einen Vektor umfasst.

24. Verfahren zur Herstellung des Polypeptid-Komplexes nach Anspruch 11 oder 12, welches die Bildung eines Komplexes zwischen dem Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder hergestellt nach Anspruch 10 und einem Lymphotoxin umfasst.

25. Verfahren zur Herstellung der Zusammensetzung nach Anspruch 17, welches das Kombinieren des Polypeptides nach einem der Ansprüche 1 bis 5, eines Polypeptid-Komplexes nach Anspruch 11 oder 12 oder von Antikörpern gegen obige, mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.