FACHGEBIET DER ERFINDUNG
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Diese Erfindung betrifft eine Methode zur Stimulierung einer Immunantwort in einem
Individuum, die die Verabreichung einer wirksamen Menge eines oligomeren CD40-
Liganden und daher nützlicher Mischungen umfasst.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Eine Immunantwort auf ein Pathogen kann grob als zellvermittelt (Zellimmunität) oder
antikörpervermittelt (Humoralimmunität) eingeordnet werden. Bei der Zellimmunität
nehmen aktivierte Makrophage und zytotoxische Lymphozyten die Eliminierung des
Pathogens vor. Die Humoralimmunität hingegen wirkt in erster Linie durch die
Antikörperproduktion. Es wird gegenwärtig angenommen, dass diese beiden Waffen
der Immunantwort durch bestimmte Teilmengen von Helfer-T-(TH)-Zellen gesteuert
werden, die spezifische Cytokinarrays ausscheiden (wird in Immunological Reviews
123, 1991 behandelt).
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Typ 1-TH-Zellen (TH1-Zellen) vermitteln eine verzögerte Überempfindlichkeit (DTH)
und scheiden Interferon-γ (IFN-γ) und Interleukin-2 (IL-2) aus, während Typ 2-TH-
Zellen (TH2-Zellen) in erster Linie die Interleukine 4, 5 und 10 (IL-4, IL-5 bzw. IL-10)
ausscheiden und B-Zellhilfe bieten. Die Entwicklung der Immunantwort über den TH1-
oder TH2-Weg ist bei einer Infektion häufig früh offensichtlich und scheint von dem
Organismustyp gesteuert zu werden, der die Infektion verursacht (Scott und
Kaufmann, Immunol. Today 12: 346, 1991) und durch die genetische Struktur des
infizierten Wirts. Die Nichtbekämpfung einer Krankheit oder die Entwicklung einer
Immunpathologie kann sich ergeben, wenn die Immunantwort nicht entsprechend
erfolgt. Die Fähigkeit, eine Immunantwort in eine TH1-zellvermittelte Antwort oder
eine TH2-, antikörpervermittelte Antwort zu manipulieren, würde ein nützliches
Instrument nicht nur bei Infektionskrankheiten, sondern auch bei Entzündungs- sowie
Allergiekrankheiten schaffen (s. z. B. Powrie and Coffman, Immunol. Today 14: 270,
1993).
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Diese Erfindung betrifft die Herstellung einer Mischung für eine Methode für die
Behandlung eines durch einen pathogenen oder opportunistischen Organismus
infizierten Säugetiers, deren Zusammensetzung ein CD40-Bindungsprotein umfasst,
das für die Stimulierung einer TH1-Immunschutzantwort an den Organismus wirksam
wird. CD40-Bindungsproteine sind pharmazeutische Mischungen, die in der Lage
sind, CD40 zu binden und in ein biologisches Signal umzuwandeln. Pathogene oder
opportunistische Organismen umfassen z. B. Arten der Leishmania, Listeria,
Mycobacteria, Salmonella, Trypanosoma, Pneumocystis und Toxoplasma einzeln
oder kombiniert. CD40-Bindungsproteine werden aus der Gruppe ausgewählt, die
sich aus CD40-Liganden, monoklonalen Antikörpern, die speziell CD40 und seine
Kombinationen binden, zusammensetzen.
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Interleukin-12 (IL-12) ist ein Schlüsselcytokin, das durch Makrophage/Monozyte
produziert wird, das für die Beeinflussung der Entwicklung einer TH1-Schutzantwort
wichtig ist. IL-12 wird bei Stimulierung mit CD40-Bindungsproteinen produziert.
CD40-Bindungsproteine werden somit für die Behandlung einer Krankheit nützlich,
für die eine TH1-Antwort wünschenswert ist, bei der Verhütung der Krankheit durch
Entwicklung einer entsprechenden TH1-Antwort und bei der Behandlung der
Krankheit von Individuen, die die zellvermittelte Immunität unterdrückt haben.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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Abb. 1 zeigt, dass anti-CD3-aktivierte Splenozyten von CD40L-defizitären Mäusen in
ihrer Fähigkeit, IL-12, jedoch nicht IL-2, IFN-γ oder IL-10, zu produzieren,
beeinträchtigt werden. Splenozyten wurden, wie im Beispiel 3 beschrieben,
behandelt. Die überstehende Flüssigkeit wurde durch einen Bioversuch auf das
Vorhandensein von IL-12 oder IL-2 (Abb. 1A und 1B) bzw. durch einen
Enzymimmunversuch auf IFN-γ bzw. IL-10 (Abb. 1C und 1D) hin getestet.
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Abb. 2 zeigt eine Verbesserung der T-Zellen-abhängigen IL-12-Produktion
durch Anti-IL-10. Es wurden Versuche, wie im Beispiel 4 beschrieben, durchgeführt.
Die überstehende Flüssigkeit der Kontrollsplenozyten, stimuliert mit Anti-CD3 in
Anwesenheit von Anti-IL-10, enthielt etwa vier Mal größere Mengen an IL-12 als die
in Abwesenheit von Anti-IL-10 erzeugten. Des weiteren wurden in der überstehenden
Flüssigkeit niedrigere Mengen an IL-12 für CD40L KO-Splenozyte, inkubiert mit Anti-
CD3 und Anti-IL-10, entdeckt.
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Abb. 3 zeigt die Ergebnisse, die bestätigen, dass CD40L für die Entwicklung einer
Zellimmunantwort an das Antigen entscheidend ist. Die Versuche wurden, wie im
Beispiel 6 beschrieben, durchgeführt. Obwohl eine gewisse Schwankung in der DTH-
Reaktion unter den einzelnen getesteten CD40L KO-Mäusen (Abb. 3A) auftrat,
waren die CD40L-defizitären Mäuse als Gruppe in ihrer Fähigkeit, eine DTH-
Reaktion an das Antigen (Abb. 3B) aufzubauen, stark beeinträchtigt.
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Abb. 4 zeigt die zunehmende Schwellung der Pfote nach der Infektion mit L. major,
die bei Mäusen, die nicht genügend CD40-Liganden aufwiesen, zu beobachten war,
im Gegensatz zu den Elternmausrassen, von denen sie abstammten. Die Mäuse
wurden, wie im Beispiel 7 beschrieben, infiziert, und das Fortschreiten der Krankheit
wurde durch Messung der Pfotendicke bestimmt.
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Abb. 5 zeigt die Ergebnisse, die anzeigen, dass bei Verabreichung von CD40LT die
Schwere der Infektion bei anfälligen Mäusen abnimmt. Die infizierten Mäuse wurden,
wie im Beispiel 8 beschrieben, behandelt. Die Wirkung der Behandlung wurde durch
Messen der Pfotendicke ermittelt.
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Abb. 6 zeigt, dass CD40LT die Pneumocystis-Infektion bei anfälligen Mäusen, die
einen Mangel an CD40-Liganden aufwiesen, kontrolliert oder verbessert. Die Mäuse
wurden behandelt, wie es im Beispiel 9 beschrieben wird, und einer Nekropsie
unterzogen, um die Todesursache festzustellen.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Diese Erfindung betrifft die Herstellung einer Mischung für eine Methode für die
Behandlung eines durch einen pathogenen oder opportunistischen Organismus
infizierten Säugetiers, deren Zusammensetzung ein CD40-Bindungsprotein umfasst,
das für die Stimulierung einer Immunantwort an das Pathogen wirksam wird. Die mit
dem Pathogen Leishmania infizierten Mäuse wurden mit einem CD40-
Bindungsprotein behandelt, das eine effektive Immunantwort an das Pathogen
stimuliert. Diejenigen, die Ergebnisse vorlegen können, die mit den mit
verschiedenen Säugetierarten, einschließlich Menschen, erhaltenen Ergebnissen in
Übereinstimmung gebracht werden können und die auch andere infektiöse
Organismen betreffen, setzen Hoffnungen auf das verwendete Mausmodell.
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Somit bieten die hier beschriebenen Erkenntnisse in einem Vorhersagetiermodell
Daten, die die Anwendung der Erfindung in der Methode der Behandlung eines
Säugetiers, das mit einem pathogenen oder opportunistischen Organismus infiziert
wurde, mit einer pharmazeutischen Mischung, die eine Substanz mit einer CD40-
Bindungsproteinaktivität enthält, vollständig ermöglichen.
Pathogene/opportunistische Organismen
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Pathogene Organismen sind Organismen, die eine Krankheit eines gesunden
Individuums verursachen können, während opportunistische Organismen in der
Regel keine Krankheit eines gesunden Individuums verursachen, jedoch zu
krankhaften Verhältnissen bei immunkompromittierten Wirten führen können. Beide
Organismenarten schließen Viren, Bakterien, Hefe, Pilze und Protozoen ein.
Außerdem können bei einigen Syndromen mehrere Organismen vorhanden sein und
eine ursächliche Rolle für das Syndrom spielen.
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Ein Beispiel eines pathogenen Protozons ist Leishmania, ein obligater intrazellularer
Makrophagenparasit, der eine Vielzahl von Krankheiten verursacht, die durch
viszerale, kutane oder mukosale Schädigungen gekennzeichnet sind. Verschiedene
Arten und Isolate von Leishmania schwanken in ihrer Fähigkeit, zu infizieren und in
Makrophagen in vivo und in vitro zu kopieren. Klinisch stellen Infektionen mit L.
braziliensis eine einzige oder mehrfache kutane Schädigungen dar, die sich bei
einem kleinen Prozentsatz zu einer schwereren mukosalen Krankheit entwickeln.
Während die kutanen Schädigungen spontan heilen oder gut auf eine
Chemotherapie reagieren, sind häufig mukosale Schädigungen höchst destruktiv und
gegenüber einer Behandlung relativ hartnäckig. Selbst wenn die mukosale
Schädigung geheilt wird, tritt häufig vielleicht Jahre später ein spontaner Rückfall auf.
Der Verlauf der Infektion mit dem Protozoon und dem Makrophagpathogen
Leishmania wird teilweise durch die frühe Kopierung in Makrophagen bestimmt, den
ausschließlichen Wirtszellen für diese Organismen. Obwohl die Faktoren, die zu
einer Hemmung oder Wucherung von Leishmania beitragen, nicht bekannt sind,
können gewisse Cytokine den Verlauf der Infektion beeinflussen. Zum Beispiel heilt
IL-12 Leishmaniasis bei empfindlichen BALB/c-Mäusen (Heinzel und and., J. Exp.
Med. 177: 1505, 1993).
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Das pathogene Haemoflagellatprotozoon Trypanosoma cruzi (T. cruzi) verursacht die
Chagas-Krankheit, ein größeres öffentliches Gesundheitsproblem in vielen Ländern
Lateinamerikas. Die Infektion mit diesem Parasiten kann akut oder chronisch sein
und schließt häufig die Entwicklung einer progressiven Pathologie im Gewebe des
Herzens, Esophagus und Kolons ein. Die Parasiten infizieren eine Vielzahl von
kernhaltigen Zellen, einschließlich Makrophagen. Beim Menschen und bei
Labortieren wird die I. cruzi-Infektion von einer unspezifischen Immununterdrückung
begleitet, die von T-Zellen und Makrophagen vermittelt wird. Mechanismen, die die
Parasitenkopierung in der akuten und der chronischen Phase steuern und eine
geringe, jedoch persistente Anzahl zirkulierender Parasiten in der chronischen Phase
aufrechterhalten, sind nicht allgemein bekannt.
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Weitere Beispiel von Pathogenen schließen Mycobacterium tuberculosis und
Mycobacterium leprae sowie das Protozoon Toxoplasma gondii ein. Die Pilze
Histoplasma capsulatum, Candida albicans, Candida parapsilosis und Cryptococcus
neoformans können auch als opportunistische oder pathogene Organismen
betrachtet werden. Einige der Rickettsia, z. B. R. prowazekii, R. coronii und R.
Tsutsugamishi, sind auch eingeschlossen, ebenso wie Kombinationen von zwei oder
mehreren Organismen.
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Außer dass sie Menschen infizieren, infizieren viele dieser Organismen andere
Säugetiere, die dann als Infektionsreservoir für Menschen dienen können. Es wird
z. B. angenommen, dass domestizierte Hunde als größeres Reservoir von
Leishmania dienen können, während von Katzen bekannt ist, dass sie Träger von
Toxoplasma sein können. Methoden zur Verbesserung der Immun- und/oder
Entzündungsantwort eines Säugetiers an diese Organismen sind somit
wahrscheinlich für andere Säugetierarten als den Menschen nützlich.
CD40
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Das menschliche CD40-Antigen (CD40) ist ein Peptid von 277 Aminosäuren mit
einem Molekulargewicht von 30.600 (Stamenkovic und and., EM80 J. 8: 1403,
1989). Ein cDNA kodierendes menschliches CD40 wurde aus einer cDNA-Bibliothek,
die aus einer Burkitt-Lymphomzellinie Raji erstellt wurde, isoliert. Das durch CD40
cDNA kodierte putative Protein enthält eine putative Leitsequenz, einen
Transmembranbereich und eine Reihe anderen Merkmale, die für
membrangebundene Rezeptorproteine üblich sind. Es wurde festgestellt, dass CD40
an B-Lymphozyten, Epithelzellen und anderen Karzinomzellinien ausgeschieden
wird.
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CD40 ist Bestandteil der Rezeptorfamilie des Tumornekrosefaktors
(TNF)/Nervenwachstumsfaktors (NGF), was durch das Vorhandensein von
zysteinreichen Motiven im extrazellulären Bereich bestimmt wird (Smith und and.,
Science 248: 1019, 1990; Mallett und Barclay, Immunology Today 12: 220; 1991).
Diese Familie enthält das Lymphozytantigen CD27, CD30 (ein Antigen, das am
Hodgkin-Lymphom und an Reed-Sternberg-Zellen festgestellt wurde), zwei
Rezeptoren für TNF, ein Mäuseprotein, als 4-1BB bezeichnet, ein OX40-
Rattenantigen, einen NGF-Rezeptor und ein Fas-Antigen.
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CD40 kann an der Zelloberfläche mit einem oder mehreren in diesem Bereich
bekannten Mitteln festgestellt werden. Ein für CD40 spezifischer Antikörper kann z. B.
für ein fluoreszenz-aktiviertes Zellsortierverfahren für die Feststellung, ob Zellen
CD40 exprimieren, verwendet werden. Andere Methoden für die Feststellung von
Zelloberflächenmolekülen sind auch für die Feststellung von CD40 nützlich.
Monoklonale CD40-Antikörper
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Monoklonale Antikörper, die gegen das CD40-Oberflächenantigen gerichtet sind
(CD40 mAb), vermitteln erwiesenermaßen verschiedene biologische Aktivitäten an
menschlichen B-Zellen. Zum Beispiel induziert CD40 mAb eine homotypische und
heterotypische Adhäsion (Barrett und and., J. Immunol. 146: 1722, 1991; Gordon
und and., J. Immunol. 140: 1425, 1988) und erhöht die Zellgröße (Gordon und and.,
J. Immunol. 140: 1425, 1988; Valle und and., Eur. J. Immunol. 19: 1463, 1989).
CD40 mAb induziert auch die Wucherung von B-Zellen, aktiviert mit Anti-IgM, CD20
mAb oder nur Phorbolester (Clark und Ledbetter, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:
4494, 1986; Gordon und and., LEUKOCYTE TYPING III; A. J. McMichael ed. Oxford
University Press. Oxford, S. 426; Paulie und and., J. Immunol. 142: 590, 1989) oder
im Zusammenwirken mit IL-4 (Valle und And., Eur. J. Immunol. 19: 1463, 1989,
Gordon und and. Eur. J. Immunol. 17: 1535, 1987) und produziert IgE (Jabara und
and., J. Exp. Med. 172: 1861, 1990; Gascan und and., J. Immunol. 147: 8, 1991),
IgG und IgM (Gascan und and., J. Immunol. 147: 8, 1991) aus durch IL-4 stimulierten
T-Zellen-entzogenen Kulturen.
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Außerdem wurde berichtet, dass CD40 mAB die durch IL-4 vermittelte Freisetzung
von löslichem CD23/FcεRII aus B-Zellen verbessert (Gordon und Guy, Immunol.
Today 8: 339, 1987; Carins und and., J. Immunol. 18: 349, 1988) und die B-
Zellenproduktion von IL-6 fördert (Clark und Shu, J. Immunol. 145: 1400, 1990). Vor
kurzem wurden menschliche B-Zellenlinien in Anwesenheit von CDw32+adhärenten
Zellen aus Primär-b-Zellenpopulationen mit IL-4 und CD40 mAb produziert
(Banchereau und and., Science 241: 70, 1991). Des weiteren können
Keimmittezentrozyten an einer Apoptosis gehindert werden, wenn sie durch CD40
und/oder Rezeptoren für Antigen aktiviert werden (Liu und and., Nature 342: 929,
1989). Jede der o. g. Publikationen beschreibt CD40 mAB, das die biologische
Aktivität von B-Zellen stimuliert.
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U.S.S.N. 08/130, 541, angemeldet am 1.10.1993, dessen relevante Entdeckung
durch eine Bezugnahme aufgenommen wurde, entdeckt zwei monoklonale
Antikörper, die speziell CD40 binden, als hCD40m2 und hCD40m3 bezeichnet.
Anders als CD40 mAB bindet hCD40m2 (ATCC HB11459) und hCD40m3 CD40 und
hemmt die Bindung von CD40 an Zellen, die im wesentlichen CD40L ausscheiden.
Eine größere Hemmung der Bindung als 95% war mit hCD40m2 oder mit CD40 mAb
M3 bei Konzentrationen von 12,5 ug/ml zu beobachten, gegenüber dem irrelevanten
IgG oder einem Kontroll-CD40 mAb, G28.5. hCD40m2 war auch in der Lage, die
durch CD40L induzierte TNF-α-Produktion zu hemmen.
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Zusätzliche monoklonale CD40-Antikörper können mit konventionellen Methoden
erzeugt werden (siehe US-Patent Nr. RE 32,011, 4,902,614, 4,543,439 und
4,411,993, die durch eine Bezugnahme hier einbezogen sind; siehe auch Monoclonal
Antibodies, Hybridomas: A new Dimension in Biological Analyses (Monoklonale
Antikörper, Hybridome: eine neue Dimension bei biologischen Analysen) Plenum
Press, Kennett, McKearn und Bechtol (Herausg.), 1980 und Antibodies: A Laboratory
Manual (Antikörper: ein Laborhandbuch), Harlow und Lane (Herausg.), Cold Spring
Harbor Laboratory Press, 1988, die auch durch eine Bezugnahme hier einbezogen
sind).
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Kurz gesagt, einem Tier wird eine Form von CD40 injiziert, die eine Immunantwort
gegen CD40 erzeugen kann. Das Tier kann ggf. wiederholt immunisiert werden, bis
der Serumantikörperpegel gegen CD40 Stabilität erreicht hat. Dann kann ein letzter
Schub von löslichem CD40 verabreicht werden und drei bis vier Tage später kann es
geopfert werden. Organe, die eine große Anzahl von B-Zellen enthalten, wie Milz und
Lymphknoten, werden entnommen und zu einer Zellsuspension zerkleinert, indem
die Organe durch ein Maschensieb gepresst werden oder durch Zerreißen der Milz-
oder Lymphknotenmembrane, die die Zellen umgeben.
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Alternativ werden geeignete Zellen für die Bereitung monoklonaler Antikörper durch
Anwendung von in-vitro-Immunisierungsmethoden gewonnen. Kurz gesagt, ein Tier
wird geopfert, und die Milz und Lymphknotenzellen werden entfernt. Eine
Zellsuspension wird bereitet, und die Zellen werden in eine Kultur eingebracht, die
eine CD40-Form enthält, die geeignet ist, eine Immunantwort, wie oben beschrieben,
zu erzeugen. Danach werden Lymphozyten entnommen und vermischt, wie oben
beschrieben.
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Zellen, die durch die Anwendung der In-vitro-Immunisierung oder von einem
immunisierten Tier, wie oben beschrieben, gewonnen werden, können durch
Transfektion mit einem Virus immortalisiert werden. Zum Beispiel kann der Epstein-
Barr-Virus (EBV; siehe Glasky und Reading, Hybridoma 8(4): 377-389, 1989)
menschliche B-Zellen umwandeln. Alternativ werden die Suspensionen aus der
entnommenen Milz und/oder Lymphknotenzellen mit einer geeigneten Myelomzelle
verschmolzen, um ein "Hybridom" zu erzeugen, das den monoklonalen Antikörper
abscheidet. Geeignete Myelomlinien sind vor allem beim Aufbau oder bei der
Ausscheidung von Antikörpern unzulänglich und sind darüber hinaus mit den Zellen
vom immunisierten Tier syngen. Viele dieser Myelomzellinien sind gut bekannt und
können aus Quellen wie der American Type Culture collection (Kultursammlung vom
amerikanischen Typ) (ATCC), Rockville, Maryland (siehe Catalogue of Cell Lines &
Hybridomas, 6. Ausgabe, ATCC, 1988) erhalten werden.
CD40-Ligand
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Aktivierte CD4+T-Zellen scheiden große Mengen eines Liganden für CD40 (CD40L)
aus. Menschliches CD40L, ein membrangebundenes Glykoprotein, wurde kürzlich
aus peripheren Blut-T-Zellen, wie bei Springs und and., J. Exp. Med. 176: 1543
(1992), und in der Patentanmeldung der USA Nr. 07/969, am 23.10.1992
angemeldet, beschrieben, dessen Entdeckung durch eine Bezugnahme hier
einbezogen ist. Das Klonen des Mäuse-CD40L wird bei Armitage und and., Nature
357: 80, 1992, beschrieben. CD40L induziert eine B-Zellenwucherung in
Abwesenheit eines Co-Stimulus und kann auch die Produktion von
Immunoglobulinen in Anwesenheit von Cytokinen bewirken. Darüber hinaus können
durch einen CD40-Liganden einer Transfektion unterzogene Zellen Monozyte
stimulieren, tumorartig zu werden (Alderson und and., J. Exp. Med. 178: 669, 1993).
CD40L ist ein Membranpolypeptid vom Typ II mit einem extrazellularen Bereich an
seinem C-Ende, einem Transmembranbereich und einen intrazellulären Bereich an
seinem N-Ende. Lösliches CD40L umfasst einen extrazellulären Bereich von CD40L
(Aminosäure 47 zu Aminosäure 261 von SEQ ID Nr. 1) oder ein Fragment davon. Die
biologische Aktvität von CD40L wird durch Bindung des extrazellulären Bereichs von
CD40L mit CD40 vermittelt und schließt eine B-Zellenwucherung ein und die
Induktion der Antikörperausscheidung (einschließlich IgE-Ausscheidung).
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U.S.S.N. 07/969, 703 beschreibt die Herstellung eines löslichen CD40L/Fc-
Fusionsproteins, das als CD40L/FC2 bezeichnet wird. CD40L/FC2 enthält eine
hydrophile Acht-Aminosäurensequenz, die von Hopp und and. (Hopp und And.,
Bio/Technology 6: 1204, 1988, als Flag® bezeichnet, einen IgG¹ Fc-Bereich, eine
Verbindungssequenz (beschrieben im US-Patent 5,073,627) beschrieben wird und
den extrazellulären Bereich von menschlichem CD40L. Ebenfalls in U.S.S.N
07/969,703 beschrieben wird ein lösliches CD40L-Fusionsprotein, das als trimeres
CD40L bezeichnet wird, das eine 33-Aminosäurensequenz enthält, als "Leucine-
Zipper" bezeichnet, die von Hopp und and. (oben) beschriebene hydrophile Acht-
Aminosäurensequenz, gefolgt vom extrazellulären Bereich des menschlichen CD40L.
Beide oligomeren Formen von CD40L induzieren die Wucherung von menschlichen
B-Zellen in Abwesenheit von Co-Stimuli, und führen (in Verbindung mit dem
entsprechenden Cytokin) zur Produktion von IgG, IgE, IgA und IgM.
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Das in U.S.S.N. 07/969, 703 beschriebene CD40L/FC2 und das trimere CD40L sind
für die vorliegenden Methoden der Erfindung nützlich, ebenso andere Formen von
CD40L, die mit den bekannten Methoden für die Herstellung rekombinanter Proteine
hergestellt werden können.
Zusätzliche CD40-Bindungsproteine
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Bindungsproteine können auch mit rekombinanten DNA-Methoden aufgebaut
werden, um die variablen Bereiche eines Gens, das einen Antikörper in CD40
kodiert, einzubeziehen. (Siehe James W. Larrick und and. "Polymerase Chain
Reaction Using Mixed Primers: Cloning of Human Monoclonal Antibody Variable
Region Genes From Single Hybridoma Cells (Polymerasekettenreaktion bei
Anwendung gemischter Primer: Klonung von Genen des variablen Bereichs des
menschlichen monoklonalen Antikörpers aus einzelnen Hybridomzellen",
Biotechnology 7: 934-938, September 1989; Reichmann und and., "Reshaping
Human Antibodies for Therapy" (Umformung menschlicher Antikörper für die
Therapie"), Nature 332: 323-327, 1988, Roberts und and. "Generation of an Antibody
with Enhanced Affinity and Specificity for its Antigen by Protein Engineering"
(Erzeugung eines Antikörpers mit einer gesteigerten Affinität und Spezifizität für sein
Antigen durch Proteintechnik) Nature 328: 731-734, 1987; Verhoeyen und and.
"Reshaping Human Antibodies: Grafting an Antilysozyme Activity", Science 239:
1534-1536, 1988; Chaudhary und and., "A Recombinant Immunotoxin Consisting of
Two Antibody Variable Domains Fused to Pseudomonas Exotoxin (Ein
rekombinantes Immuntoxin, das sich aus zwei variablen Antikörperbereichen
zusammensetzt, die zu Pseudomonas Exotoxin verschmolzen wurden), Nature 339:
394-397, 1989).
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Kurz gesagt, die DNA, die die Antigenbindestelle (oder den CD40-Bindungsbereich;
variablen Bereich) eines CD40 mAB kodiert, wird abgeschieden, verstärkt und mit
einer DNA verbunden, die ein anderes Protein kodiert, z. B. das menschliche IgG
(siehe Verhoeyen und and., oben, siehe auch Reichmann und andere, oben).
Alternativ kann die Antigenbindestelle (der variable Bereich) entweder mit einem
weiteren, völlig anderen Protein (siehe Chaudhary und and., oben) verbunden oder
darin eingesetzt werden, wobei sich ein neues Protein mit Antigenbindestellen des
Antikörpers sowie die funktionelle Aktivität des völlig anderen Proteins ergibt.
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Des weiteren können DNA-Sequenzen, die kleinere Teile des Antikörpers oder
variable Bereiche kodieren, die sich speziell an Säugetier-CD40 binden, auch im
Rahmen dieser Erfindung verwendet werden. Ähnlich kann der CD40-
Bindungsbereich (extrazelluläre Bereich) eines CD40-Liganden für die Herstellung
anderer CD40-Bindungsproteine verwendet werden. DNA-Sequenzen, die Proteine
oder Peptide kodieren, die Oligomere bilden, werden für die Herstellung von CD40
Bindendungsproteinen, die einen Antigenbindungsbereich des CD40-Antikörpers
oder einen extrazellulären Bereich eines CD40-Liganden umfassen, besonders
nützlich sein. Einige dieser Oligomer bildenden Proteine werden in U.S.S.N. 07/969,
703 beschrieben; außerdem werden nützliche Oligomer bildende Proteine auch in
U.S.S.N. 08/107, 353, angemeldet am 13.8.1993, und in U.S.S.N. 08/45, 830,
angemeldet am 29.9.1993, beschrieben.
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Wenn geeignete Antikörper oder Bindungsproteine erzielt wurden, können sie mit
vielen Methoden, die als einfache Fähigkeiten auf dem Gebiet wohl bekannt sind,
ausgeschieden oder gereinigt werden (siehe Antibodies: A Laboratory Manual
(Antikörper: Ein Laborhandbuch), Harlow und Lande (Herausg.), Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 1988). Geeignete Methoden schließen Peptid- oder
Proteinaffinitätssäulen, HPLC oder RP-HPLC, Reinigung in Protein A- oder Protein
G-Säulen, oder eine Kombination dieser Methoden ein. Rekombinante CD40-
Bindungsproteine können mit Standardmethoden hergestellt und auf die
Bindespezifiziät an CD40, unter Anwendung der auf diesem Gebiet bekannten
Versuche, einschließlich z. B. ELISA, ABC oder Dot-Blot-Versuche, sowie durch
Bioaktivitätsversuche, wie sie für CD40 mAb beschrieben wurden, hin geprüft
werden.
In vitro- und In vivo-Modelle
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Das Mäusemodell von Leishmaniasis, das hier beschrieben wird, wird als geeignetes
Tiermodell einer Infektionskrankheit, die eine TH1-Antwort erfordert, anerkannt.
Mäusemodelle vieler anderer Infektionskrankheiten des Menschen sind auf dem
Gebiet bekannt. Sher (Imm. Rev. 127: 183-204, 1992) diskutiert z. B. Mäusemodelle
verschiedener menschlicher Krankheiten, einschließlich des erworbenen
Immunmangelsyndroms (AIDS), Toxoplasmose, Leishmaniasis, Trypanosomiasis
und Shistosomiasis. Nathan (in: Mechanisms of Host Resistance to Infectious
Agents, Tumors and Allografts (Mechanismen der Widerstandsfähigkeit des Wirts
gegenüber Infektionsmitteln, Tumoren und Allografts) R. M. Steinman und R. J. North
(Herausg.) Rockefeller University Press, New York, S. 165-184, 1986) bespricht auch
die Verwendung von Mäusen in der Studie verschiedener menschlicher Krankheiten
und legt des weiteren Ergebnisse der an Menschen durchgeführten Studien vor, die
die zuerst bei Mäusemodellen beobachteten Ergebnisse bestätigen. Ratten und/oder
Mäuse wurden auch in Tiermodellen von Cryptosporidiosis verwendet (Meulbroek
und and. Workshop on Pneumocystis, Cryptopspridium und Microsporidium 113 S),
Salmonella typhimurium-Infektionen (Hougen und and., ARMIS 98: 30; 1990),
Mycobacterium avium-Infektionen (Furney und and. Antimicrobial Agents and
Chemotherapy (Mikrobenbekämpfungsmittel und Chemotherapie) 34: 1629; 1990)
und von Pneumocystis carini-Pneumonia (Boyland und current, J. Protozool. 38: 138
S. 1991; Soulez und and. Workshop on Pneumocystis, Cryptospridium und
Microsporidium 123S).
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Andere Arten bieten auch nützliche Tiermodelle. Wyand (AIDS Res. and Human
Retroviruses 8: 349; 1992) bespricht z. B. die Verwendung von SIV-infizierten
Rhesusaffen für die vorklinische Bewertung von AIDS-Pillen und Impfstoffen. Affen-
und Katzenmodelle (Garnder, Antiviral Res. 15: 267; 1991; Stahl-Hennig und and.,
AIDS 4: 611; 1990) und Mäusemodelle (Ruprecht und and., Cancer Res. 50: 5618s;
1990) wurden für die Einschätzung der Antiretroviraltherapie empfohlen. Rhesusaffen
wurden auch in einem Modell der Chagas-Krankheit verwendet (Bonecini-Almeida
und and., Mem. Inst. Osaldo Cruz 85: 163; 1990 Rio de Janeiro). Es wurde
beobachtet, dass verschiedene nichtmenschliche Primate an einer natürlich oder
experimentell erworbenen Lepra leiden (Meyers und and., Am. J. Trop. Med und
Hyg. 44: 24; 1991). Die Fachleute auf diesem Gebiet erkennen sie, und viele andere
mögliche Tiermodelle der Krankheit haben zu Makrophagpathogenen geführt.
Makrophage/Monozyte
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Aktivierte Makrophage nehmen (Phagozytose) Mikroben auf, produzieren und setzen
hochreaktive intrazelluläre Sauerstoffarten frei und scheiden verschiedene Cytokine
aus, die Immun- und Entzündungsantworten von Säugetieren an die Mikrobe oder
Mikroben hochregeln. Die Aktivierung von Makrophagen wird in vitro mit
verschiedenen Mitteln bestätigt, einschließlich dem Messen einer oder mehrerer
dieser Aktivitäten.
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Eine der Primärfunktionen der peripheren Blutmonozyten ist, eine Immun- oder
Entzündungsantwort durch die Synthese und Ausscheidung einer Reihe biologisch
aktiver Moleküle zu steuern, einschließlich Enzymen, Plasmaproteinen und
Cytokinen. Aus einem Monozyt hergeleitete Cytokine schließen IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-
8, IL-12 und TNF-α ein. Alle diese Cytokine, die durch Monozyte produziert wurden,
haben breite immunsteuernde Eigenschaften, die für die Wirtsantwort auf die
Infektion wesentlich sind.
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Mikrobenprodukte wie LPS und Peptidglykan sind effektive Verursacher der
Cytokinabscheidung durch Monozyte. Durch Monozyte synthetisierte Cytokine haben
auch gezeigt, dass sie die Monocyt-Cytokinsynthese durch eine Selbstregulierung
steuern. Insbesondere haben IL-1α, IL-β, TNF-α, TGF-β, IFN-γ, GM-CSF und IL-3
gezeigt, dass sie einen gewissen Aspekt der Cytokinabscheidung durch Monozyt
stimulieren, wobei sie entweder allein oder zusammen mit anderen Stimuli wirken.
Umgekehrt hat IL-4 wirksame antagonistische Auswirkungen auf die Induktion der
Monozytaktivierung, einschließlich der Cytokinabscheidung und der
Atmungsstoßaktivität.
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Aktivierte Makrophage produzieren verschiedene Cytokine und scheiden sie ab,
einschließlich Interleukin-6 (IL-6), Interleukin-1 α und β (IL-1α, IL-1β),
Tumornekrosefaktor α, (TNF-α), Interleukin-8 (IL-8). Makrophageninhibitionspeptid-
1α (MIP-1α), Makrophageninhibitionspeptid-1β, MIP-1β, Interleukin-12 (IL-12) und
das Wachstumregelungsprotein (GRO). Die Aktivierung kann so durch Messen der
Abscheidung eines oder mehrerer dieser Cytokine oder durch Analyse der Höhe der
mRNA-Transkription für eines oder mehrerer dieser Cytokine bestimmt werden.
Darüber hinaus können Makrophage in vitro erhalten und kultiviert werden (nach
Aktivierung entweder in vitro oder in vivo), und die Aktivierung kann durch
Beobachtung der effektiven Phagozytose der Mikrobenorganismen und/oder der
Produktion verschiedener Cytokine bestimmt werden. Die Methoden für das Messen
der Produktion und Freisetzung der reaktiven Sauerstoffarten sind im Bereich wohl
bekannt.
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Von IL-12, das durch Makrophage als Antwort auf bestimmte Stimuli synthetisiert
wird, wird angenommen, dass es ein Initiierungscytokin für die Zellimmunität ist
(Scott, R., Science 260; 496, 1993; Romagnini, R. Immunol. Today 13: 379, 1992;
Locksley, R. M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5970, 1993). Monozyte/Makrophage
setzen IL-12 als Reaktion auf verschiedene Pathogene frei und stimulieren die
natürlichen Killerzellen (NK) und die nichtgebundenen T-Zellen, IFN-γ abzuscheiden
(Trinchieri, G., Immunol. Today 14: 335, 1993). IL-12 erhöht auch die zytolytische
Aktivität der T-Zellen und NK-Zellen (Gately und and., Int. Immunol. 6: 57, 1994), und
es wurde gezeigt, dass es eine wichtige Rolle für eine Reihe von
Infektionskrankheiten spielt (Gazzinelli und and., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:
6115, 1993; Heinzel und and., J. Exp. Med. 177: 1505, 1993; Hsieh und and.,
Science 260: 547, 1993; Tripp und and., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 3725, 1993;
Sypek und and., J. Exp. Med. 177: 1797, 1993).
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In anderen Studien zeigte IL-12 Antitumor- und Antimetastasenaktivitäten (Brunda
und and. J. Exp. Med. 178: 1223, 1993). Des weiteren wurde festgestellt, dass die IL-
12-Produktion bei Individuen, die mit dem menschlichen Immunschwächevirus (HIV)
infiziert waren, beeinträchtigt war. Die IL-12-Höhe kann z. B. eingeschätzt werden,
wie von Zhang und and. beschrieben (J. Clin. Invest. 93: 1733, 1994) oder durch den
Enzymimmunversuch oder Bioversuch, wie er hier beschrieben wird.
Verabreichung von CD40-Bindungsproteinen
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Diese Erfindung bietet Methoden für die Anwendung therapeutischer Mischungen,
die eine wirksame Menge an CD40-Bindungsprotein und ein geeignetes
Verdünnungsmittel und einen Träger enthalten und Methoden für die Steuerung einer
Immun- oder Entzündungsantwort. Es wird auch über die Verwendung von CD40-
Bindungsproteinen in Verbindung mit löslichen Cytokinrezeptoren oder Cytokinen
oder anderen immunitätssteuernden Molekülen nachgedacht. CD40-
Bindungsproteine können z. B. in Verbindung mit Faktoren verwendet werden, die
bekanntlich Monozyte/Makrophage wie den Granulozyt-Makrophag-Kolonie
stimulierenden Faktor (GM-CSF), Interferon-Gamma (IFN-γ), und Fusionsproteine,
die GM-CSF, wie im U. S-Patent 5,073,627 beschrieben, enthalten. Die CD40-
Bindungsproteine und die Faktoren können entweder in einer geeigneten Lösung
kombiniert oder gleichzeitig, nacheinander oder separat verabreicht werden.
Für die therapeutische Anwendung wird gereinigtes CD40-Bindungsprotein einem
Patienten, vorzugsweise einem Menschen, für die Behandlung in einer der Indikation
angemessenen Form verabreicht. So können z. B. CD40-
Bindungsproteinmischungen, die verabreicht werden, um die Immun- und/oder
Entzündungsantwort zu verbessern, durch Bolusinjektion, Dauerfusion, anhaltende
Freisetzung aus Implantaten oder mit einem anderen geeigneten Verfahren
verabreicht werden. Typischerweise wird ein therapeutisches Mittel in Form einer
Mischung verabreicht, die ein gereinigtes CD40-Bindungsprotein enthält, in
Verbindung mit physiologisch akzeptablen Trägern, Mitteln oder Verdünnungsmitteln.
Diese Träger werden für die Empfänger in den angewendeten Dosen und
Konzentrationen nicht toxisch sein.
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Gewöhnlich schließt die Herstellung solcher
CD40-Bindungsproteinzusammensetzungen die Kombination des CD40-Bindungsproteins mit Puffern, Antioxidantien
wie Askorbinsäure, Polypeptiden mit niedrigem Molekulargewicht (weniger als etwa
10 Rückstände), Polypeptiden, Proteinen, Aminosäuren, Kohlehydraten,
einschließlich Glukose, Sucrose oder Dextrinen, Chelatbildungsmitteln wie EDTA,
Glutathion und anderen Stabilisatoren und Arzneistoffträgern ein. Neutral gepufferte
Salzlösung oder Salzlösung, gemischt mit dem conspezifischen Serum Albumin, sind
Beispiele für geeignete Verdünnungsmittel. Vorzugsweise wird das Produkt als
Lyophilisat gebildet, wobei geeignete Arzneistoffträgerlösungen (z. B. Sucrose) als
Verdünnungsmittel verwendet werden.
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Die entsprechenden Dosen können in Versuchen ermittelt werden, zunächst in einem
entsprechenden Tiermodell, und dann in den zu behandelnden Arten. Die Menge und
Häufigkeit der Verabreichung wird natürlich von Faktoren abhängen wie dem
Charakter und der Schwere der zu behandelnden Indikation, der gewünschten
Antwort, dem Zustand des zu behandelnden Individuums usw. Die entsprechenden
Dosen liegen im Bereich von etwa 10 ng/kg/Tag bis zu etwa 100 ug/kg/Tag, allein
oder kombiniert mit anderen, die Immunantwort steuernden Mitteln. Es ist zu
erwarten, dass vorzugsweise eine Dosis von 100 ng/kg/Tag bis etwa 1000 ng/kg/Tag
für etwa 1-20 Tage einen entsprechenden biologischen Effekt bewirkt. Alternativ
können Bolusinjektionen von etwa 1 ug/kg/Tag bis etwa 100 ug/kg/Tag in Abständen
von etwa 4 Tagen verabreicht werden, um Wirkungen über die Stimulierung der
Immun- und/oder Entzündungsantwort zu erzielen.
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Die relevanten Entdeckungen aller hier angeführten Hinweise sind speziell durch die
Bezugnahme einbezogen. Die folgenden Beispiele sollen besondere Darstellungen
der Erfindung zeigen und nicht ihren Bereich begrenzen.
Beispiel 1
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Dieses Beispiel zeigt, dass der CD40-Ligand in die T-Zellen-abhängige Steuerung
der IL-12-Produktion durch Antigen präsentierede Milzzellen (APC) einbezogen ist.
Es wurde angenommen, dass in diesem System Anti-CD3 Milz-T-Zellen aktiviert und
ihnen ermöglichen würde, die Produktion von IL-12 durch Milz-APC zu steuern.
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Nichtfraktioniere, nichtbestrahlte Splenozyten von natürlichen C57BL/6-Mäusen
wurden auf 4 · 10&sup5; Zellen/Well auf 96-Well-Platten, überdeckt mit einem Antikörper
gegen CD3 (333 ng/Well) in Anwesenheit oder Abwesenheit von 10 ug/Well von Anti-
CD40L, kultiviert (MR1; erhältlich bei PharMingen, San Diego, CA). Die
überstehende Flüssigkeit wurde nach 20 Stunden entfernt und auf das
Vorhandensein verschiedener Cytokine hin getestet. IFN-γ-Mengen wurden durch
einen ELISA an zwei Stellen bestimmt, wobei im Handel erhältliche monoklonale
Antikörperpaare (PharMingen, San Diego, CA) verwendet wurden, und es wurde
gemäß einem von PharMingen vorgelegten Protokoll verfahren. Der ELISA für IFN-γ
sprach auf 100 pg/ml von IFN-γ an, wobei als Standardsubstanz Mäuse- IFN-γ von
Genzyme (Cambridge, MA), verwendet wurde. Der Versuch für IL-12 wurde, wie bei
Kennedy und and., Eur. J. Immnunol. 24: 2271 (1994), beschrieben wird,
durchgeführt. Wie in der nachfolgenden Tabelle 1 gezeigt wird, wurde IL-12 in diesen
Kulturen hergestellt und die Aufnahme von Anti-CD40L hat die IL-12-Produktion zu
> 90% gehemmt.
Tabelle 1: Auswirkung von Anti-CD40L auf die Cytokinproduktion durch aktivierte
Splenozyten
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Anti-CD40L hat auch die IFN-γ-Produktion teilweise gehemmt, jedoch nicht die IL-2-
Produktion. Des weiteren hat Anti-CD40L die IL-10-Produktion durch die stimulierten
Splenozyten nicht verbessert. Somit hat CD40L die IL-12-Produktion nicht gehemmt
durch Induktion von IL-10.
Beispiel 2
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Dieses Beispiel zeigt, dass die IL-12-Produktion in einem antigenabhängigen System
von CD40L abhängt. Eine schwankende Anzahl eines TH1-Klons, das als CD6
bezeichnet wird (speziell für Keyhole Limpet-Hämocyanin; KLH), wurde auf 96-Well-
Platten mit 4 · 10&sup5; bestrahlten syngenen Splenozyten und Antigen (50 ug/ml KLH) in
Anwesenheit oder Abwesenheit von Anti-CD40L stimuliert. Die überstehende
Flüssigkeit wurde nach von 20 Stunden gesammelt und auf IL-12 oder IFN-γ hin, wie
oben beschrieben, getestet. Die Ergebnisse werden in der nachstehenden Tabelle 2
gezeigt.
Tabelle 2: Abhängigkeit der von Antigen abhängigen IL-12-Produktion von CD40L
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a: 10 mg/ml MR1, erhältlich bei PharMingen, San Diego, CA
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b: 1 : 500 (v/v) XMG1.2, erhältlich bei PharMingen, San Diego, CA
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Die Aufnahme von Anti-CD40L hemmte die Produktion von IL-12 in diesem von
Antigen abhängigen System um > 90%. Die Aufnahme eines neutralisierenden
Antikörpers gegen IFN-γ hatte hingegen keine hemmende Wirkung auf die IL-12-
Produktion. Trotz seiner starken hemmenden Wirkung auf die IL-12-Produktion
hemmte Anti-CD40L die IFN-γ-Produktion in diesen Kulturen nur teilweise. In der
überstehenden Flüssigkeit wurde kein IL-2 entdeckt.
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Ähnliche Ergebnisse waren zu beobachten, wenn ein H-2d-spezifisches, alloreaktives
TH1-Klon, als C3G9 bezeichnet, durch bestrahlte C.B17 SCID-Splenozyte oder
haftende peritoneale BALB/c-Exsudatzellen (PEC) stimuliert wurde. In beiden Fällen
hemmte die Aufnahme von Anti-CD40L in diese Kulturen die IL-12-Produktion um
> 90%, während die Aufnahme von Anti-IFN-γ keine hemmende Wirkung hatte.
Beispiel 3
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Dieses Beispiel zeigt, dass Splenozyte von Mäusen, denen ein funktionales CD40L
fehlt, einen Mangel an T-Zellen-abhängiger IL-12-Produktion aufzuweisen scheinen.
Splenozyte wurden im wesentlichen, wie im Beispiel 1 oben beschrieben, stimuliert.
Nichtfraktioniere, nichtbestrahlte Splenozyten von natürlichen C57BL/6 · 129/J-
Mäusen, homozygot für die Trennung des CD40-Ligandengens (Ausdrücken von
DC40-Liganden oder CD40L KO-Mäuse, in USSN 08/184,422, angemeldet am
20.1.1994, jetzt schwebend, beschrieben) oder die Kontrollsubstanz B6 (C57BL/6)
oder F1 (B6 · 129) wurden in 4 · 10&sup5; Zellen/Wellen auf 96-Wellplatten, die mit einem
Antikörper gegen CD3 (333 ng/Well) beschichtet waren, kultiviert. Die überstehende
Flüssigkeit wurde nach 20 Stunden entfernt und auf die Anwesenheit verschiedener
Cytokine entweder durch einen Bioversuch (IL-12 und IL-2, Abb. 1A und 1B) oder
ELISA (IFN-γ und IL-10, Abb. 1C und ID) getestet. Der IL-2-Bioversuch verwendete
die CTLL-2-Zellinie, wie bei Kennedy und and. oben beschrieben wurde. Der IL-10-
ELISA war dem IFN-γ-ELISA, der bereits beschrieben wurde, ähnlich, wobei
monoklonale Antikörper und das Protokoll von PharMingen verwendet wurden.
Gereinigte IL-10, die als Standardsubstanz verwendet wurde, ist bei Biosource
International (Camarillo, CA) oder Genzyme (Cambridge, MA) erhältlich. Die
Ergebnisse werden in Abb. 1 vorgestellt und sind für drei Versuche repräsentativ.
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IL-12 wurde durch Anti-CD3-stimulierte Splenozyte von B6- und F1-Mäusen
produziert und war in der überstehenden Flüssigkeit von durch Anti-CD3 stimulierten
CD40L KO-Splenozyten nicht zu entdecken (< 2 pg/ml). Hingegen wiesen CD40L-
Splenozyten keinen offensichtlichen Mangel in bezug auf ihre Fähigkeit, IL-2, IL-10
oder IFN-γ zu produzieren auf, obwohl die von CD40L KO-Splenozyten produzierte
IFN-γ-Menge geringer war, als die der Kontrollproben (Abb. 1 C). Die von CD40L KO-
und B6-Kontrollmäusen produzierte IL-10-Menge war ständig geringer, als die von
den F1-Kontrollmäusen produzierte (Abb. 1D). In den Kulturen, die einen Anti-CD3-
Mangel aufwiesen, wurden keine Cytokine entdeckt.
Beispiel 4
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Dieses Beispiel zeigt, dass Anti-IL-10 und eine lösliche, trimere Form von CD40L die
T-Zellen-abhängige IL-12-Produktion durch CD40L KO-Splenozyte verbessern. Da
IL-10, das die IL-12-Produktion hemmt, auch in den oben beschriebenen Kulturen
vorhanden ist, wurden doppelte Kulturen, wie oben beschrieben, angesetzt, nur in
Anwesenheit von Anti-CD3, oder mit Aufnahme von Anti-IL-10 (2 ug/ml). Die
überstehende Flüssigkeit von den Kontrollsplenozyten, die mit Anti-CD3 in
Anwesenheit von Anti-IL-10 stimuliert wurden, enthielt etwa vier Mal höhere IL-12-
Mengen, als die, die in Abwesenheit von Anti-IL-10 hergestellt wurde (Abb. 2).
Darüber hinaus wurden niedrige IL-12-Mengen in der überstehenden Flüssigkeit für
CD40L KO-Splenozyten entdeckt, die mit Anti-CD3 und Anti-IL-10 inkubiert wurden
(Abb. 2).
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Die Fähigkeit der CD40L KO-Splenozyten, IL-12 unter diesen Bedingungen in
Anwesenheit oder Abwesenheit von CD40LT zu produzieren, wird in Tabelle 3 unten
gezeigt.
Tabelle 3: Auswirkung von Anti-IL-10 und CD40LT auf die Cytokinproduktion
durch aktivierte Splenozyten mit einem Mangel an CD40L
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a: pg/ml
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b: ng/ml
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c: nicht getestet
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CD40L KO-Splenozyte, mit Anti-CD3, Anti-IL-10 und CD40L-Trimer (25 ug/ml)
stimuliert, haben eine etwa 5 Mal höhere IL-12-Menge produziert, als CD40L KO-
Splenozyte, die nur mit Anti-CD3 + Anti-IL-10 stimuliert wurden. CD40LT führte auch
zu geringeren IL-12-Mengen in Kulturen, die Anti-CD3 enthielten, jedoch kein Anti-IL-
10. Im Gegensatz zu seinen Auswirkungen auf die Produktion von IL-12 durch die mit
Anti-CD3 aktivierten CD40L KO-Splenozyte, verbesserte CD40LT die Produktion von
IL-2 oder IFN-γ in diesen Kulturen nicht durchweg. In den Kulturen, die einen Anti-
CD3-Mangel aufwiesen, wurden keine Cytokine entdeckt.
Beispiel 5
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Dieses Beispiel zeigt, dass eine lösliche, trimere Form von CD40L (CD40LT) die IL-
12-Produktion durch menschliche Monozyte verbessert. Vollblut wurde von zwei
verschiedenen Spendern erhalten. Die Monozyte wurden durch
Gegenstromausschwemmen, wie bei Alderson und and., J. Exp. Med. 178: 669
(1993) beschrieben, isoliert. Die Monozyte wurden auf 5 · 10&sup5; Zellen/Well auf 24-
Well-Platten (Costar Corp., Cambridge, MA) entweder nur im Medium oder in
Anwesenheit von CD40LT (1 ug/ml), IFN-γ (10 ng/ml) oder GM-CSF (10 ng/ml), allein
oder kombiniert (CD40LT + IFN-γ oder CD40LT + GM-CSF) kultiviert. Ein
neutralisierender monoklonaler Antikörper gegen CD40L (10 ug/ml) wurde
aufgenommen, um zu ermitteln, ob die co-stimulierende Wirkung spezifisch war.
Nach 24-stündigem Kultivieren wurde die überstehende Flüssigkeit entfernt und auf
das Vorhandensein von IL-12 getestet, wobei eine im Handel erhältliche EIA
verwendet wurde, die das heterodimere IL-12 feststellt (R&D Systems, Minneapolis,
MN). Die Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle gezeigt.
Tabelle 4; Auswirkungen von CD40LT auf die IL-12-Produktion durch menschliche
Monozyte
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Der Zusatz von CD40LT und IFN-γ zum Kulturmedium führte zu einer verbesserten
IL-12-Produktion (vier - bis fünffachen), im Vergleich zu IFN-γ allein. Diese
Verbesserung war speziell auf CD40LT zurückzuführen, wie durch die Fähigkeit
gezeigt wurde, die Wirkung mit einem monoklonalen Antikörper, der CD40L speziell
bindet und die Bindung von CD40 an seiner Rezeptor hemmt, zu blockieren. GM-
CSF und CD40LT, allein oder kombiniert, haben nicht die Abscheidung von IL-12 bei
diesen Experimenten stimuliert, ein deutlicher Unterschied zur Fähigkeit von GM-
CSF oder IFN-γ, die Produktion anderer Cytokine durch Monozyte, stimuliert durch
membrangebundene CD40L, zu co-stimulieren (Alderson und and. oben). Diese
Ergebnisse zeigen, dass lösliches CD40L ein potenter Co-Stimulus für die
Abscheidung von IL-12 durch menschliche Monozyte ist.
Beispiel 6
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Dieses Beispiel zeigt, dass CD40L KO-Mäuse eine starke T-Zellenanergie zeigen.
CD40L KO-Mäuse und C57BL/6 · 129/J F1-Kontrollhybride (F1) wurden auf eine
verzögerte Überempfindlichkeitsreaktion gegenüber einem gereinigten Proteinderivat
(PPD) hin, im wesentlichen nach der Methode von Gray und Jennings, getestet (Ann.
Rev. Tuberculosis 72: 171, 1955, wie bei Van Buren und and. Transplantation 40:
694 (1985) beschrieben).
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Die Mäuse (CD40L KO und Kontrolltiere) wurden subkutan mit 200 ul eines
kompletten Freundschen Adjuvans immunisiert (CFA; H37Ra). Drei Wochen später
wurden die immunisierten Mäuse und eine Gruppe nichtimmunisierter Kontrolltiere
durch die intrakutane Infektion von 2 ug PPD in einem Volumen von 50 ul in die
Hinterpfote herausgefordert. Die gleiche Menge normaler Kochsalzlösung wurde in
die gegenüberliegende Pfote gleichzeitig gespritzt.
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Nach 48 Stunden wurde die Dicke der Pfote mit einem Mikrometer gemessen. Die
Ergebnisse wurden als Differenz der Schwellung der mit PPD behandelten und der
mit Kochsalzlösung behandelten Pfote angegeben und wurden mit der Schwellung
bei den nichtimmunisierten Tieren, die mit PPD behandelt wurden, verglichen. Die
Ergebnisse werden in Abb. 3 gezeigt.
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Die Ergebnisse zeigen, dass die Mäuse mit CD40L-Mangel als Gruppe stark in ihrer
Fähigkeit, eine DTH-Reaktion auf das zu entwickeln Antigen (Abb. 3B), gefährdet
sind, obwohl eine gewisse Schwankung in der Reaktion unter den individuellen,
getesteten CD40L KO-Mäusen (Abb. 3A) zu verzeichnen war. Diese Ergebnisse
bestätigen, dass CD40L für die Entwicklung einer Zellimmunantwort auf das Antigen
entscheidend ist.
Beispiel 7
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Dieses Beispiel zeigt, dass der CD40-Ligand für die Erzeugung einer zell-vermittelten
Immunantwort auf Leishmania wichtig ist. Der Verlauf der L. major-Infektion wird bei
den verschiedenen, durch Inzucht erzeugten Mausarten durch die unterschiedliche
Entwicklung von TH1- bzw. TH2 CD4+-T-Lymphozyten bestimmt. Die Expansion der
IL-4 abscheidenden TH2-Zellen macht die BALB/c-Mäuse für die Krankheit und die
Verbreitung des Parasiten anfällig. Die Expansion von IFN-γ produzierenden TH1-
Zellen hingegen ermöglicht es den widerstandsfähigen Mausarten, einschließlich der
C57BL/6 und 129/J, eine Schutzimmunität zu entwickeln.
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CD40L KO-Mäuse oder Kontrollmäuse (129/J, C57BL/6) wurden mit 2 · 10&sup5; L. major
durch Injektion in die hintere Pfote infiziert. Der Krankheitsverlauf wurde durch
Beobachtung der physischem Symptome ermittelt und durch Messung der Dicke der
infizierten Pfote gegenüber der nichtinfizierten gegenüberliegenden Pfote. CD40L
KO-Mäuse entwickelten starke krankhafte Veränderungen an der infizierten hinteren
Pfote innerhalb von 4-6 Wochen nach der promastigoten Impfung. Die Kontrollmäuse
hingegen haben der Entwicklung der L. major-Infektion Widerstand geleistet. Die
mittleren Veränderungen der Pfotengröße sind auf Abb. 4 dargestellt.
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Die Lymphozyten der Milz und Lymphknoten (LNC) der infizierten Tiere wurden in
vitro mit immobilisiertem CD3 oder einem löslichen Leishmania-Antigen stimuliert,
und die Cytokinabscheidung wurde eingeschätzt. Die IFN-γ-Mengen wurden durch
einen ELISA an zwei Stellen, wie bereits beschrieben, bestimmt. Die IL-4-Mengen
wurden nach einer ähnlichen Methode bestimmt, unter Verwendung von Antikörpern
und einem Protokoll von PharMingen, wobei eine rekombinante Mäuse-IL4, die von
der Immunex Corporation (Seattle, WA) als Standardsubstanz hergestellt wird,
verwendet wurde. Die Ergebnisse werden in Tabelle 5 gezeigt.
Tabelle 5: Cytokinabscheidung durch Zellen von Leishmania infizierten Mäusen
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a: Nachweisgrenze
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b: nicht nachweisbar
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c: lösliches Leishmania-Antigen
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Zellen von CD40L KO-Mäusen haben wesentlich weniger IFN-γ und mehr IL-4
produziert, als Zellen von Kontrollmäusen, wobei anzunehmen ist, dass die CD40L
KO-Mäuse eine mangelnde Fähigkeit, eine TH1-Reaktion gegen Leishmania
aufzubauen, aufweisen. Diese Ergebnisse zeigen, dass CD40L KO-Mäuse gegen L.
major anfällig sind, trotz ihres resistenten Hintergrunds.
Beispiel 8
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Dieses Beispiel zeigt, dass ein löslicher, trimerer CD40-Ligand den Verlauf von
Leishmaniasis bei anfälligen Mäusen verbessert. CD40L KO-Mäuse, anfällige
BALB/c-Mäuse und Kontroll-C57BL/6 · 129/J F1 (F1)-Hybride wurden mit L. major,
wie oben beschrieben, infiziert. Eine lösliche, trimere Form eines rekombinanten
CD40-Liganden (CD40LT) wurde an Mäuse täglich 2 Wochen lang verabreicht,
beginnend mit dem Tag 0, dem Tag der Infektion. Der Krankheitsverlauf wurde durch
Messung der Pfotendicke, wie bereits beschrieben, und durch Beobachtung der
Krankheitssymptome überwacht. Die Ergebnisse werden auf Abb. 5 gezeigt. Der
CD40-Ligand verminderte die physiologische Stärke von Leishmaniasis bei beiden,
den CD40L KO- und den BALB/c-Mäusen.
Beispiel 9
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Das Beispiel zeigt, dass der lösliche, trimere CD-40 Ligand die Infektion der
anfälligen Mäuse mit Pneumocystis kontrolliert und verbessert. CD40L KO-Mäuse
wurden in einer spezifischen pathogenfreien Umgebung gehalten. CD40LT wurde
einer Gruppe von Mäusen (n = 12) drei Mal pro Woche zwölf Wochen lang (50
ug/Tag) verabreicht, beginnend am 2. Tag nach der Geburt. Einer zweiten Gruppe
von Mäusen (n = 12) wurde CD40LT drei Mal pro Woche fünf Wochen lang (50
ug/Tag) verabreicht, beginnend in der 16. Woche nach der Geburt. Den
Kontrollmäusen (n = 34) wurde kein CD40LT verabreicht. Die Ergebnisse werden auf
Abb. 6 gezeigt.
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Die Kontrollmäuse begannen etwa im Alter von 5 Monaten zu sterben. Nach etwa 11
Monaten waren alle tot. An den toten Tieren wurden Nekropsien vorgenommen und
histologische Untersuchungen, um die Todesursache festzustellen. Das einzige
pathogene/opportunistische Mittel, das festgestellt wurde, war Pneumocystis. Die
Lungen der toten Mäuse zeigten die charakteristischen Auswirkungen der
Pneumocystis-Infektion durch Silberbeize. Mäuse hingegen, denen CD40LT
verabreicht wurde, entweder 12 Wochen, beginnend bald nach der Geburt, oder 5
Wochen, beginnend in der 16. Lebenswoche, lebten wesentlich länger; der früheste
Tod trat etwa nach 10 Monaten ein. Die meisten Mäuse waren nach einem Jahr am
Leben und offensichtlich gesund. So sind die CD40L KO-Mäuse ein nützliches
Tiermodell der Pneumocystis-Infektion. Diese opportunistischen Organismen
scheinen bei Mäusen als "normale" Flora vorhanden zu sein. Die Krankheit wird
jedoch durch ein intaktes zellvermitteltes Immunsystem unter Kontrolle gehalten. Der
CD40-Ligand wird bei der Kontrolle der Pneumocystis-Infektion von anfälligen Tieren
nützlich sein und wird bei der Kontrolle anderer Krankheiten von Individuen mit einem
unterdrückten Zellimmunsystem ähnlich nützlich sein.