DE69931944T2

DE69931944T2 - Umkehr des viral-induzierten systemischen schocks und des atemnotsyndroms durch blockierung des lymphotoxin-beta- aktivierungsweges

Info

Publication number: DE69931944T2
Application number: DE69931944T
Authority: DE
Inventors: Jeff Brookine BROWNING; Maryann Atlanta PUGLIELLI; Rafi Atlanta AHMED
Original assignee: Emory University; Biogen Idec Inc; Biogen Idec MA Inc
Current assignee: Emory University; Biogen Inc; Biogen MA Inc
Priority date: 1998-10-09
Filing date: 1999-10-08
Publication date: 2007-02-08
Anticipated expiration: 2019-10-09
Also published as: IL142284A; SK4662001A3; CN1323223A; JP4713738B2; TR200100974T2; EP1119370A1; US20090087403A1; IL142284A0; US20020001585A1; AU777492B2; JP2010155852A; EA006703B1; EA200100430A1; CA2344049A1; CA2344049C; PT1119370E; EP1119370B1; WO2000021558A1; HUP0103773A3; NO20011757D0

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft im Allgemeinen Arzneimittel, die eine antivirale Antwortreaktion in einem Individuum induzieren. Insbesondere stellt diese Erfindung Arzneimittel für die Behandlung des viral induzierten systemischen Schocks und der Atemnot in einem Individuum bereit. Die Verfahren umfassen die Verabreichung bestimmter „Lymphotoxin-beta-blockierender Agenzien".
Hintergrund der Erfindung
Einige Viren, einschließlich Sin Nombre (SNV), Ebola, Marburg, Lassa und Dengue, verursachen alle akute Erkrankungen mit vielen der folgenden Symptome: rascher Ausbruch, Fieber, systemischer Schock und Lungenleiden (Lacy et al. (1997) Adv. Ped. Inf. Dis. 12:21). Eine andere Gemeinsamkeit dieser Infektionen ist die systemische Verbreitung der viralen Infektion, die Endothelzellen und Makrophagen angreift (Lacy et al. (1997) Adv. Ped. Inf. Dis. 12:21). Die meisten dieser in Erscheinung tretenden Viren, mit der Ausnahme des SNV, wurden bereits vor Jahrzehnten identifiziert. In den Jahren nach ihrer Entdeckung tauchten diese Pathogene in Ausbrüchen weltweit erneut auf. Bis zum Juni 1998 gab es 183 bestätigte Fälle von SNV, dem verursachenden Agens des Hantavirus-Lungen-Schocksyndroms (Hantavirus Pulmonary Shock Syndrome), in den südwestlichen Vereinigten Staaten, und zwar aufgrund einer Zunahme der Hirschmaus-Population („deer mouse"). Nur 55% dieser Fälle überlebten die Infektion (Centers for Disease Control and Prevention. MMWR 47, 449 (1998)). Derzeit ist wenig über die Pathogenese dieser Viren bekannt, noch wie die Tausende von Patienten, die jedes Jahr weltweit infiziert werden und die unter einem viral induzierten systemischen Schock und Atemnot leiden, wirksam behandelt werden können.
Daher besteht ein Bedarf an der Identifizierung neuer Verfahren zur Behandlung des viral induzierten systemischen Schocks und der Atemnot in einem Individuum.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung löst das Problem, auf das vorstehend Bezug genommen wurde, durch die Bereitstellung von Arzneimitteln zur Behandlung des viral induzierten systemischen Schocks und der Atemnot in einem Individuum.
Die Zusammensetzungen dieser Erfindung nutzen zum Teil die Entdeckung aus, dass bestimmten Agenzien, die hierin als Lymphotoxin-beta- (LT-β) blockierende Agenzien definiert werden, zur Behandlung des viral induzierten systemischen Schocks und der Atemnot in einem Individuum verwendet werden können. In einer Ausführungsform ist das LT-β-blockierende Agens ein den Lymphotoxin-beta-Rezeptor (LT-β-R) blockierendes Agens. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der LT-β-R ein Antikörper gegen den Lymphotoxin-β-Rezeptor oder ein löslicher Lymphotoxin-β-Rezeptor. In der am stärksten bevorzugten Ausführungsform ist das den LT-β-R blockierende Agens ein rekombinantes LT-β-R-Fusionsprotein, das die extrazelluläre Liganden-Bindedomäne des LT-β-R enthält, die mit einer konstanten Domäne der schweren Kette eines Immunglobulins fusioniert ist.
Die vorstehenden und andere Aufgaben, Eigenschaften, Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung sowie die Erfindung selbst können durch die folgende Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen besser verstanden werden.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 zeigt, dass die Infektion von NZB-Mäusen mit dem Clon 13 des LCMV zu Sterblichkeit führt. Sterblichkeitskurve von NZB-Mäusen, die mit LCMV-13 infiziert wurden (n = 14), und die Virentiter in verschieden Geweben von mit LCMV-13 (n = 7) infizierten Mäusen sechs Tage nach der Infektion.
2 zeigt das histologische Profil einer Infektion mit LCMV-13 in NZB-Mäusen. (A) Normale Lunge (100X, H+E), (B) Interstitielle Pneumonitis mit mononucleärem Zell-Infiltrat und alveolärer Wandverdickung in der Lunge am Tag 5 nach der Infektion (100X, H+E), (C) Lymphoid-Verarmung, zelluläre Nekrose und Verwüstung der Follikel-Architektur in der Milz (25X, H+E), (D) Höhere Auflösung, die die zelluläre Nekrose und die Zellkerntrümmer in der Milz zeigt (158, H+E), (E) LCMV-13-positive Endothelzellen (Pfeile) und Makrophagen (weiße Pfeile) in der Lunge (100X, IHC), (F) LCMV-13-positive Endothelzellen (Pfeile) und Mesothelzellen (Pfeilköpfe) und Makrophagen (weiße Pfeile) in der Milz (50X, IHC), (G) LCMV-13-positive Endothelzellen im Herzen (100X, IHC), (H) LCMV-13-positive Kupffer-Zellen und sinusoidale Auskleidezellen in der Leber (100X, IHC).
3 zeigt, dass die Blockierung der LTβR-Signalwege die Überlebensraten der mit dem Clon 13 infizierten NZB-Mäuse signifikant verbessert. Hier sind die Sterblichkeitskurven der mit dem Clon 13 infizierten NZB-Mäuse dargestellt, die, wie beschrieben, behandelt wurden. NZB-Mäusen wurden 2,5 × 10⁶ PBE Clon 13 i.v. verabreicht, gefolgt von zwei i.p.-Injektionen, die 250 μg des TN3-19.12-Antikörpers in Endotoxin-freiem PBS enthielten (vergleiche mit Referenz S), und zwar an dem Tag 1 und dem Tag 4 nach der Infektion. Kontrollmäusen wurde das gleiche Volumen an PBS ohne Antikörper an den gleichen Tagen injiziert. Die Mäuse wurden, wie in Referenz R beschrieben, behandelt. Bei der dreifach behandelten Gruppe wurden TNFR55-Ig- und LTβR-Ig-Proteine am Tag 0 und am Tag 3 nach der Infektion in Mengen von 200 μg i.p. verabreicht. Den Kontrollmäusen wurde der menschliche Antikörper, der bei der Synthese dieser Fusionsproteine verwendet worden war (AY1943-29), an den gleichen Tagen in identischen Mengen verabreicht. Mäuse, die nur LTβR-Ig erhielten, wurden identisch behandelt, mit der Ausnahme, dass die Injektionen mit TNFR55-Ig ausgelassen wurden. Die Daten wurden aus mehreren Experimenten zusammengefasst: anti-TNF (TN3-19.12) alleine, n = 16 für LTβR-Ig alleine, n = 10 für die dreifach behandelte Gruppe, (n = 10 für die dreifach behandelte Gruppe, n = 22 für LTβR-Ig alleine, n = 10 für die LTβR-Ig + TNFR55-Ig-Gruppe, n = 5 für die mit anti-TNF und TNFR55-Ig behandelte Gruppe, n = 6 für anti-TNF (TN3-19.12) alleine und n = 25 für die Kontrolle).
4 zeigt, dass die Blockierung des LTβR-Signalweges zu einer Abnahme der CD8-T-Zellen-Funktion führt. Milzzellen aus Mäusen der unterschiedlichen Behandlungsgruppen wurden am Tag 6 nach der Infektion geerntet und mit einem L^d-Tetramer angefärbt, das ein 9-mer Peptid des NP118 enthielt, wie vorher beschrieben wurde. Die angegebenen Werte wurden um die unspezifischen Hintergrundfärbung angepasst. Um die Produktion von Interferon-gamma als Antwortreaktion auf das gleiche Peptid zu überwachen, wurden die Zellen 5 Stunden bei 37 °C in Anwesenheit von NP118 in einer Endkonzentration von 0,1 μg/ml und mit IL-2 inkubiert. Die hier angegebenen Werte wurden um den Hintergrundspiegel bei Abwesenheit des Peptids korrigiert. Die Milzzellen aus drei Mäusen, die mit dem menschlichen Kontroll-Ig behandelt worden waren, wurden vereinigt, ebenso wie diejenigen aus zwei LTβR-Ig-Mäusen (LT-beta #2/3). Alle anderen Ergebnisse stammen von individuellen Mäusen.
5 zeigt, dass die Verarmung an CD8⁺-T-Zellen, und nicht an CD4⁺-T-Zellen, die letalen Wirkungen einer LCMV-13-Infektion in NZB-Mäusen umkehrt. Die Mäuse wurden so behandelt, wie es für die Verarmung von Zellpopulationen in vivo beschrieben wurde. Für jede der behandelten Gruppen (n = 4) ist eine Sterblichkeitskurve dargestellt.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Definitionen
Um den Gegenstand der beanspruchten Erfindung klarer und präziser herauszustellen, werden die folgenden Definitionen für spezifische Begriffe angegeben, die in der folgenden schriftlichen Beschreibung und in den angehängten Ansprüchen verwendet werden.
Lymphotoxin-beta (LT-beta) ist ein Mitglied der TNF-Ligandenfamilie, die auch die Liganden für den Fas-, CD27-, CD30-, CD40-, OX-40 und den 4-1 BB-Rezeptor umfasst (Smith et al., Cell 76, S. 959–962 (1994)). Die Signalübertragung durch verschiedene Mitglieder der TNF-Familie, einschließlich TNF, LT-alpha, LT-beta und Fas, kann den Tod von Tumorzellen durch Nekrose oder Apoptose (programmierter Zelltod) induzieren. In nicht-tumorbildende Zellen beeinflussen die TNF- und viele der TNF-Ligandenfamilie Rezeptor-Wechselwirkungen die Entwicklung des Immunsystems und die Antwortreaktionen auf verschiedene Immunherausforderungen.
Lymphotoxin-beta (auch als p33 bezeichnet) wurde auf der Oberfläche von T-Lymphocyten, T-Zelllinien, B-Zelllinien und der durch Lymphokine aktivierten Killerzellen (LAK) identifiziert. LT-beta ist der Gegenstand der gleichzeitig anhängigen internationalen Anmeldungen PCT/US91/04588, veröffentlicht am 9. Jan. 1992 als WO 92/00329 und PCT/US93/11669, veröffentlicht am 23. Jun. 1994 als WO 94/13808, des Anmelders.
Der LT-beta-Rezeptor, ein Mitglied der TNF-Rezeptorenfamilie, bindet spezifisch an Oberflächen-LT-Liganden. Der LT-beta-R bindet heteromere LT-Komplexe (vorwiegend LT-alpha 1/beta 2 und LT-alpha 2/beta 1), bindet aber nicht den TNF oder LT-alpha (Crowe et al., Science 264, S. 707–710 (1994)). Die Signalübertragung durch den LT-beta-R kann eine Rolle bei der Entwicklung der peripheren Lymphorgane und bei humoralen Immunantworten spielen.
Die LT-beta-R-mRNA findet sich in der menschlichen Milz, dem Thymus und anderen wichtigen Organen. Die Expressionsmuster des LT-beta-R sind ähnlich denjenigen, die für den p55-TNF-R beschrieben wurden, mit der Ausnahme, dass der LT-beta-R auf peripheren Blut-T-Zellen und -T-Zelllinien fehlt.
Der Begriff „LT-beta-blockierendes Agens" bezieht sich auf ein Agens, das die Ligandenbindung an LT-beta, die Zelloberflächen-LT-beta-Clusterbildung oder die LT-beta-Signalübertragung vermindern kann, oder das beeinflussen kann, wie das LT-beta-Signal innerhalb der Zelle interpretiert wird. Beispiele für LT-beta-blockierende Agentien umfassen anti-LT-beta-AK, lösliche LT-beta-R-Fc-Moleküle und anti-LT-alpha-, anti-LT-alpha/beta- und anti-LT-beta-R-AK. Vorzugsweise reagieren die Antikörper nicht mit der sekretierten Form von LT-alpha.
Der Begriff „LT-beta-Rezeptor-blockierendes Agens" bezieht sich auf ein Agens, das die Ligandenbindung an den LT-beta-R, die Zelloberflächen-LT-beta-R- Clusterbildung oder die LT-beta-R-Signalübertragung vermindern kann, oder das beeinflussen kann, wie das LT-beta-R-Signal innerhalb der Zelle interpretiert wird. Beispiele für LT-beta-R-blockierende Agentien umfassen lösliche LT-beta-R-Fc-Moleküle und anti-LT-beta-R-AK. Vorzugsweise reagieren die Antikörper nicht mit der sekretierten Form von LT-alpha.
Der Begriff „anti-LT-beta-Rezeptor-AK" bezieht sich auf jeden beliebigen Antikörper, der mindestens an ein Epitop auf dem LT-beta-Rezeptor spezifisch bindet.
Der Begriff „anti-LT-AK" bezieht sich auf jeden beliebigen Antikörper, der mindestens an ein Epitop auf LT-alpha, LT-beta oder dem LT-alpha/beta-Komplex spezifisch bindet.
Der Begriff „LT-Ligand" bezieht sich auf einen heteromeren LT-Komplex oder ein Derivat davon, das an den LT-beta-Rezeptor spezifisch binden kann.
Der Begriff „LT-beta-R-Signalübertragung" bezieht sich auf molekulare Reaktionen, die mit dem LT-beta-R-Signalweg assoziiert sind, und auf die anschließenden molekularen Reaktionen, die daraus resultieren.
Der Begriff „LT-beta-R-Liganden-Bindedomäne" bezieht sich auf den Teil oder Teile des LT-beta-R, die an der spezifischen Erkennung von und an der Wechselwirkung mit einem LT-Liganden beteiligt sind.
Die Begriffe „heteromerer LT-alpha/beta-Komplex" und „heteromerer LT-Komplex" beziehen sich auf eine stabile Assoziation zwischen mindestens einer LT-alpha- und einer oder mehreren LT-beta-Untereinheiten, einschließlich löslichen, mutierten, veränderten und chimären Formen einer oder mehrerer der Untereinheiten. Die Untereinheiten können über elektrostatische, über van der Waals- oder über kovalente Wechselwirkungen assoziieren. Vorzugsweise besitzt der heteromere LT-alpha/62-Komplex mindestens zwei benachbarte LT-beta-Untereinheiten und ihm fehlen benachbarte LT-alpha-Untereinheiten. Wenn der heteromere LT-alpha/beta-Komplex als ein den LT-beta-R aktivierendes Agens in einem Zellwachstums-Testansatz dient, ist der Komplex bevorzugt löslich und besitzt die Stöchiometrie LT-alpha 1/beta 2.
Löslichen heteromeren LT-alpha/62-Komplexen fehlt die transmembrane Domäne und sie können durch eine geeignete Wirtszelle sekretiert werden, die so konstruiert wurde, dass sie LT-alpha- und/oder LT-beta-Untereinheiten exprimiert (Crowe et al., J. Immunol. Methods 168, S. 79–89 (1994)).
Die Begriffe „Oberflächen-LT-alpha/62-Komplex" und „Oberflächen-LT-Komplex" beziehen sich auf einen Komplex, der LT-alpha- und membrangebundene LT-beta-Untereinheiten umfasst, einschließlich mutierter, veränderter und chimärer Formen einer oder mehrerer der Untereinheiten, und der auf der Zelloberfläche exponiert wird. „Oberflächen-LT-Ligand" bezieht sich auf einen Oberflächen-LT-Komplex oder ein Derivat davon, der/das spezifisch an den LT-beta-Rezeptor binden kann.
Eine „wirksame Menge" ist eine Menge, die ausreicht, um nützliche oder gewünschte klinischer Ergebnisse zu bewirken. Eine wirksame Menge kann in einer oder in mehreren Verabreichungen verabreicht werden. Für die Zwecke dieser Erfindung ist eine wirksame Menge eines Agens, das die Bindung von Lymphotoxin-β an seinen Rezeptor blockiert, eine Menge des Agens, die ausreicht, die Entwicklung einer viralen Antwortreaktion zu verbessern, zu stabilisieren oder zu verzögern. Insbesondere ein Agens, das ausreicht, die Entwicklung eines viral induzierten systemischen Schocks und die Atemnot zu verbessern, zu stabilisieren oder zu verzögern. Nachweis und Messung dieser Indikatoren für die Wirksamkeit sind den Fachleuten bekannt.
Ein „Individuum" bezieht sich auf Wirbeltiere, insbesondere auf Mitglieder einer Säugerart, und umfasst auch Haustiere, im Sport eingesetzte Tiere und Primaten, einschließlich dem Menschen, ist aber nicht auf diese beschränkt.
Ein „funktionelles Äquivalent" eines Aminosäurerests ist (i) eine Aminosäure, die ähnliche Reaktionseigenschaften wie der Aminosäurerest aufweist, der durch das funktionelle Äquivalent ersetzt wurde; (ii) eine Aminosäure eines Antagonisten der Erfindung, wobei die Aminosäure ähnliche Eigenschaften wie der Aminosäurerest aufweist, der durch das funktionelle Äquivalent ersetzt wurde; (iii) ein Molekül, das keine Aminosäure ist, und das ähnliche Eigenschaften wie der Aminosäurerest aufweist, der durch das funktionelle Äquivalent ersetzt wurde.
Ein erstes Polynucleotid, das einen aus Protein bestehenden Antagonisten der Erfindung codiert, ist im Vergleich zu einem zweiten Polynucleotid, welches das Antagonisten-Protein codiert, „funktionell äquivalent", wenn es mindestens eine der folgenden Bedingungen erfüllt:

(a) das „funktionelle Äquivalent" ist ein erstes Polynucleotid, das mit dem zweiten Polynucleotid unter Standard-Hybridisierungsbedingungen hybridisiert und/oder das zu der ersten Polynucleotidsequenz degeneriert ist. Am stärksten bevorzugt codiert es ein mutiertes Protein, das die Aktivität eines Integrin-Antagonisten-Proteins besitzt.
(b) das „funktionelle Äquivalent" ist ein erstes Polynucleotid, das die Expression einer Aminosäuresequenz codiert, die durch das zweite Polynucleotid codiert wird.

Die LT-β-blockierenden Agentien, die in der Erfindung verwendet werden, umfassen die hierin angeführten Agentien sowie ihre funktionellen Äquivalente, sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Wie er hierin verwendet wird, bezieht sich der Begriff „funktionelles Äquivalent" daher auf ein LT-β-blockierendes Agens oder auf ein Polynucleotid, welches das LT-β-blockierendes Agens codiert, das die gleiche oder eine verbesserte nützliche Wirkung auf den Empfänger hat wie das LT-β-blockierende Agens, von dem es ein funktionelles Äquivalent sein soll. Wie Fachleute erkennen werden, kann ein funktionell äquivalentes Protein durch rekombinante Verfahren hergestellt werden, wie z. B. durch die Expression einer „funktionell äquivalenten DNA". Dementsprechend umfasst die vorliegende Erfindung LT-β-blockierende Agenzien, die durch natürlich vorkommende DNAs codiert werden, sowie durch nicht natürlich vorkommende DNAs, und die das gleiche Protein codieren, wie es durch die natürlich vorkommende DNA codiert wird. Aufgrund der Degeneriertheit der codierenden Nucleotidsequenzen können andere Polynucleotide verwendet werden, um LT-β-blockierende Agentien zu codieren. Diese umfassen alle oder Teile der vorstehenden Sequenzen, die durch den Austausch unterschiedlicher Codons verändert wurden, welche den gleichen Aminosäurerest innerhalb der Sequenz codieren, wodurch ein stiller Austausch erfolgt. Solche veränderten Sequenzen werden als Äquivalente dieser Sequenzen angesehen. So wird zum Beispiel Phe (F) durch zwei Codons, TTC oder TTT, codiert, Tyr (Y) wird durch TAC oder TAT codiert, und His (N) wird durch CAC oder CAT codiert. Andererseits wird Trp (W) nur durch ein einziges Codon, TTG, codiert. Dementsprechend wird anerkannt werden, dass für eine bestimmte DNA-Sequenz, die ein bestimmtes Integrin codiert, es viele degenerierte DNA-Sequenzen gibt, die es codieren. Diese degenerierten DNA-Sequenzen fallen in den Rahmen dieser Erfindung.
Der Begriff „Fusion" oder „Fusionsprotein" bezieht sich auf eine kolineare kovalente Verbindung von zwei oder mehreren Proteinen oder Fragmenten davon über ihre individuellen Peptid-Gerüste, und am stärksten bevorzugt durch die Genexpression eines Polynucleotidmoleküls, das dieses Protein codiert, (hergestellt wird. Es wird bevorzugt, dass die Proteine oder die Fragmente davon aus unterschiedlichen Quellen stammen, so dass diese Art eines Fusionsproteins ein „chimäres" Molekül genannt wird. Daher sind bevorzugte Fusionsproteine chimäre Proteine, die ein LT-β-blockierendes Agens oder ein Fragment enthalten, das kovalent mit einer zweiten Einheit verbunden ist, die kein LT-β-blockierendes Agens darstellt. Bevorzugte Fusionsproteine der Erfindung können Teile von intakten Antikörpern enthalten, die ihre Antigen-bindende Spezifität beibehalten haben, wie zum Beispiel Fab-Fragmente, Fab'-Fragmente, F(ab')2-Fragmente, F(v)-Fragmente, Monomere oder Dimere schwerer Ketten, Monomere oder Dimere leichter Ketten, Dimere, die aus einer schweren und aus einer leichten Kette bestehen, und ähnliche.
Die am stärksten bevorzugten Fusionsproteine sind chimär und umfassen eine Einheit aus einem LT-β-blockierenden Agens, das mit der vollständigen oder einem Teil der Gelenk- und der konstanten Region einer leichten oder einer schweren Kette oder mit beiden eines Immunglobulins fusioniert oder auf andere Weise verbunden ist. Daher kennzeichnet diese Erfindung ein Molekül, umfassend: (1) eine Einheit eines LT-β-blockierenden Agens, (2) ein zweites Peptid, wie z. B. eines, das die Löslichkeit oder die in vivo-Lebenszeit der LT-β-blockierendes-Agens-Einheit erhöht, wie z. B. ein Mitglied der Immunglobulin-Superfamilie oder ein Fragment oder ein Teil davon wie z. B. ein Teil oder ein Fragment eines IgG wie z. B. die konstante Region der schweren Kette des menschlichen IgG1 wie z. B. CH2, CH3 und die Gelenk-Region. Spezifisch ist eine „LT-β- oder eine LT-β-R/Ig-Fusion" ein Protein, das eine biologisch aktive Blockierung des LT-β der Erfindung umfasst (z. B. ein löslicher LT-β-R oder ein biologisch aktives Fragment davon, das mit dem N-Terminus einer Immunglobulinkette verbunden ist, wobei ein Teil des N-Terminus des Immunglobulins durch das LT-β-blockierende Agens ausgetauscht wurde). Eine Art einer LT-β- oder einer LT-β-R/Ig-Fusion ist eine „LT-β-R/Fc-Fusion", die ein Protein darstellt, das den LT-β-R der Erfindung umfasst, der mit mindestens einem Teil der konstanten Domäne eines Immunglobulins verbunden ist. Eine bevorzugte Fc-Fusion umfasst ein LT-β-blockierendes Agens der Erfindung, das mit einem Fragment eines Antikörpers verbunden ist, welches die C-terminale Domäne der schweren Immunglobulinketten enthält.
„Standard-Hybridisierungsbedingungen" bedeutet Salz- und Temperaturbedingungen, die im Wesentlichen mit 0,5 × SSC bis etwa 5 × SSC und 65°C sowohl für die Hybridisierung als auch für die Waschungen äquivalent sind. Der Begriff „Standard-Hybridisierungsbedingungen", wie er hierin verwendet wird, stellt daher eine operationale Definition dar und umfasst einen Bereich von Hybridisierungsbedingungen. Stärker stringente Bedingungen können zum Beispiel die Hybridisierung mit Plaque-Durchmusterungs-Puffer (0,2 % Polyvinylpyrrolidon; 0,2 % Ficoll 400; 0,2 % Rinderserumalbumin; 50 mM Tris-HCl (pH 7,5); 1 M NaCl; 0,1 % Natriumpyrophosphat; 1 % SDS); 10 % Dextransulfat und 100 μg/ml denaturierter, mit Ultraschall behandelter Lachssperma-DNA bei 65°C über 12–20 Stunden und die Waschung mit 75 mM NaCl/7,5 mM Natriumcitrat (0,5 × SSC)/1 % SDS bei 65°C umfassen. Niedriger stringente Bedingungen können zum Beispiel die Hybridisierung mit Plaque-Durchmusterungs-Puffer, 10 % Dextransulfat und 110 μg/ml denaturierter, mit Ultraschall behandelter Lachssperma-DNA bei 55°C über 12–20 Stunden und die Waschung mit 300 mM NaCl/30 mM Natriumcitrat (2,0 × SSC)/1 % SDS bei 55°C umfassen. Vergleiche auch mit Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, Abschnitte 6.3.1.–6.3.6. (1989).
Eine „therapeutische Zusammensetzung", wie sie hierin verwendet wird, ist so definiert, dass sie die Proteine der Erfindung und andere biologisch verträgliche Bestandteile enthält. Die therapeutische Zusammensetzung kann Excipienten wie z. B. Wasser, Mineralien und Träger wie z. B. ein Protein enthalten.
II. Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Die vorliegende Erfindung hängt zum Teil von der Entdeckung ab, dass LT-β-blockierende Agenzien eine antivirale Antwortreaktion in einem Individuum hervorrufen können. Es wurde herausgefunden, dass die Behandlung eines Individuums, das mit einem Virus infiziert ist, die Überlebensrate des Individuums stark erhöhen kann. Spezifisch wurde gezeigt, dass die Behandlung von mit LCMV-13 infizierten NZB-Mäusen mit einem LT-β-blockierenden Agens wie z. B. einem LTβR-Ig-Fusionsprotein ihre Überlebensrate um 73 % erhöhte.
Die derzeitige Behandlung von Ebola, Dengue, SNV und anderen Viren, die hierin erwähnt werden, erfolgt präventiv durch die Aufklärung über die Übertragung der Krankheit. Für diese hoch pathogenen Viren gibt es keine Impfstoffe. Ribavirin, ein Guanidin-Analog, wurde als ein genereller antiviraler Arzneistoff gegen einige dieser Infektionen eingesetzt, wobei ein reproduzierbarer Erfolg nur bei der Behandlung von Lassa-Fieber dokumentiert ist, wenn es in einem frühern Stadium der Erkrankung verwendet wird (M.D. Lacy und R.A. Smego, Adv. Ped. Inf. Dis. 12, 21 (1997). Unsere Daten weisen darauf hin, dass einige der Pathologien, die mit diesen Viren verbunden sind, über das Immunsystem vermittelt werden. Eine Blockierung des LT-Systems könnte die Chance für ein Überleben stark erhöhen, und zwar über eine transiente Verminderung der Virus-spezifischen CD8-T-Zellzahlen und ihrer Funktionalität. Klinische Versuche, die verschiedene Mittel zur Blockierung des TNFα-Signalweges verwenden, werden bereits für die Behandlung einiger Leiden durchgeführt (H.I. Pass, D. Mew, H.A. Pass et al., Chest Surg. Clin. N. Amer. 5, 73 (1995). Wir glauben, dass die Behandlung mit LTβR-Ig für weitere Untersuchungen in Tiermodellen in Betracht gezogen werden sollte, und zwar, um sie schließlich bei Versuchen am Menschen einzusetzen, die Patienten mit akuten, rasch fortschreitenden Virusinfektionen einschließlich Schock und/oder Atemnot einbeziehen.
LT-β-blockierendes Agens
In einer Ausführungsform dieser Erfindung umfasst das LT-beta-blockierende Agens einen Antikörper (Ak), der gegen LT-beta gerichtet ist und der die LT-beta- Signalübertragung hemmt. Bevorzugt handelt es sich bei dem anti-LT-beta-Ak um einen monoclonalen Antikörper (mAk). Hemmende anti-LT-beta-Ak und andere LT-beta-blockierende Agentien können unter Verwendung von Durchmusterungsverfahren identifiziert werden, die die Fähigkeit eines oder mehrerer Agentien nachweisen, an einen LT-Liganden binden oder die Wirkungen der LT-beta-Signalübertragung auf die Zellen hemmen zu können.
In einer anderen Ausführungsform dieser Erfindung umfasst das LT-beta-blockierende Agens ein den LT-beta-Rezeptor (LT-β-R) blockierendes Agens. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das den LT-β-R blockierende Agens ein Antikörper (Ak), der gegen den LT-beta-R gerichtet ist und der die LT-beta-R-Signalübertragung hemmt. Bevorzugt handelt es sich bei dem anti-LT-beta-R-Ak um einen monoclonalen Antikörper (mAk). Ein solcher hemmender anti-LT-beta-R-mAk ist der BDA8-mAk. Hemmende anti-LT-beta-R-Ak und andere den LT-beta-R blockierende Agentien können unter Verwendung von Durchmusterungsverfahren identifiziert werden, die die Fähigkeit eines oder mehrerer Agentien nachweisen, entweder an den LT-beta-R oder an einen LT-Liganden binden oder die Wirkungen der Signalübertragung durch den LT-beta-R auf die Zellen hemmen zu können.
Ein Durchmusterungsverfahren verwendet die cytotoxischen Wirkungen der LT-beta-R-Signalübertragung auf Tumorzellen, die den LT-beta-R tragen. Tumorzellen werden einem oder mehreren LT-beta-R-aktivierenden Agentien ausgesetzt, um die LT-beta-R-Signalübertragung zu induzieren. Die den LT-beta-R aktivierenden Agentien umfassen heteromere LT-alpha/62-Komplexe (bevorzugt lösliches LT-alpha 1/beta 2) in Gegenwart von IFN-gamma oder einem aktivierenden anti-LT-beta-R-Ak (vergleiche mit dem Nachstehenden; dies wird auch in WO 96/22788 beschrieben).
Antikörper und andere Agentien, die die LT-beta-R-Signalübertragung blockieren können, werden aufgrund ihrer Fähigkeit ausgewählt, die cytotoxische Wirkung der LT-beta-R-Signalübertragung auf die Tumorzellen zu hemmen, und zwar mit folgendem Testansatz:

1) Tumorzellen wie z. B. HT29-Zellen werden drei bis vier Tage in einer Reihe von Gewebekultur-Vertiefungen angezogen, die ein Medium und mindestens ein den LT-beta-R aktivierendes Agens in Gegenwart oder in Abwesenheit einer Verdünnungsreihe des zu untersuchenden Agens enthalten;
2) Ein Farbstoff für eine Vitalfärbung, der die mitochondrielle Funktion misst, wie z. B. MTT, wird dem Tumorzellen-Gemisch hinzugefügt und über mehrere Stunden reagieren gelassen;
3) Die optische Dichte des Gemisches in jeder Vertiefung wird mit Licht der Wellenlänge von 550 nm (OD550) quantifiziert. Die OD550 ist der Zahl an Tumorzellen proportional, die in Gegenwart des LT-beta-R-aktivierenden Agens und des zu testenden, den LT-beta-R blockierenden Agens in jeder Vertiefung verbleiben. Ein Agens oder eine Kombination von Agentien, das/die die durch den LT-beta-R aktivierte Tumorzellen-Cytotoxizität um mindestens 20 % in diesem Testansatz vermindern kann, ist ein den LT-beta-R blockierendes Agenz im Rahmen dieser Erfindung.

Jedes beliebige Agens oder eine Kombination von Agentien, die die LT-beta-R-Signalübertragung aktivieren, kann in dem vorstehenden Testansatz verwendet werden, um LT-beta-R-blockierende Agentien zu identifizieren. LT-beta-R-aktivierende Agenzien, die die LT-beta-R-Signalübertragung induzieren (wie z. B. aktivierende anti-LT-beta-R-mAks), können aufgrund ihrer Fähigkeit ausgewählt werden, alleine oder in Kombination mit anderen Agentien, die Tumorzellen-Cytotoxizität zu potenzieren, und zwar unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Tumorzellen-Testansatzes.
Ein anderes Verfahren für die Auswahl eines den LT-beta-R blockierenden Agens besteht in der Überwachung der Fähigkeit des potenziellen Agens, direkt die LT-Liganden-Rezeptor-Bindung zu beeinträchtigen. Ein Agens oder eine Kombination von Agentien, das/die die Liganden-Rezeptor-Bindung um mindestens 20 % blockieren kann, ist ein den LT-beta-R blockierendes Agens im Rahmen dieser Erfindung.
Es kann eine beliebigen Zahl an Testansätzen, die die Stärke der Liganden-Rezeptor-Bindung messen, verwendet werden, um Kompetitions-Testansätze mit potenziellen LT-beta-R-blockierenden Agentien durchzuführen. Die Stärke der Bindung zwischen einem Rezeptor und einem Liganden kann unter Verwendung eines enzymverbundenen Immunadsorptions-Testansatzes (ELISA) oder eines Radio-Immuntestansatzes (RIA) gemessen werden. Eine spezifische Bindung kann ebenfalls durch die Fluoreszenzmarkierung von Antikörper-Antigen-Komplexen und die Durchführung einer Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierungs- (FACS) Analyse gemessen werden, oder durch die Durchführung anderer solcher Immun-Nachweisverfahren, die alle im Fachgebiet wohlbekannt sind.
Die Liganden-Rezeptor-Bindungswechselwirkung kann auch mit dem BIAcore TM-Instrument (Pharmacia Biosensor) gemessen werden, das den Nachweis der Plasmonresonanz ausnutzt (Zhou et al., Biochemistry 32, S. 8193–8198 (1993); Faegerstram und O'Shannessy, „Surface plasmon resonance detection in affinity technologies", in: Handbook of Affinity Chromatography, S. 229–252, Marcel Dekker, Inc., New York (1993)).
Die BIAcore TM-Technologie erlaubt es, den Rezeptor an eine Goldoberfläche zu binden und den Liganden darüber fliesen zu lassen. Der Nachweis der Plasmonresonanz liefert eine direkte Quantifizierung der Menge der Masse, die an die Oberfläche in Echtzeit gebunden wird. Diese Technik ergibt sowohl An(lagerungs)- als auch Ab(lösungs)-Raten-Konstanten, und somit können die Liganden-Rezeptor-Dissoziationskonstante und die Affinitätskonstante direkt in Gegenwart und in Abwesenheit des potenziellen LT-beta-R-blockierenden Agens bestimmt werden.
Mit irgendeinem dieser oder mit anderen Verfahren zur Messung der Rezeptor-Liganden-Wechselwirkungen kann man die Fähigkeit eines den LT-beta-R blockierenden Agens abschätzen, alleine oder in Kombination mit anderen Agentien, die Bindung von Oberflächen- oder von löslichen LT-Liganden an Oberflächen- oder an lösliche LT-beta-R-Moleküle zu hemmen. Solche Testansätze können auch verwendet werden, um LT-beta-R-blockierende Agentien oder Derivate solcher Agentien (z. B. Fusionen, Chimären, Mutanten und chemisch veränderte Formen), alleine oder in Kombination, zu untersuchen, um die Fähigkeit dieses veränderten Agens zur Blockierung der Aktivierung des LT-beta-R zu optimieren.
Die den LT-beta-R blockierenden Agenzien umfassen in einer Ausführungsform dieser Erfindung lösliche LT-beta-Rezeptor-Moleküle. Die Sequenz des extrazellulären Teils des menschlichen LT-beta-R, die die Liganden-Bindedomäne codiert, wird in der 1 des U.S.-Patents Nr. 5,925,351 gezeigt.
Unter Verwendung der Sequenzinformation in der 1 des U.S.-Patents Nr. 5,925,351 und rekombianten DNA-Verfahren, die im Fachgebiet wohlbekannt sind, können funktionelle Fragmente, die die LT-beta-R-Liganden-Bindedomäne codieren, in einen Vektor cloniert und in einem geeigneten Wirt exprimiert werden, um ein lösliches LT-beta-R-Molekül herzustellen. Lösliche LT-beta-R-Moleküle, die mit den nativen LT-beta-Rezeptoren um die Bindung des LT-Liganden entsprechend den hierin beschriebenen Testansätzen kompetitieren können, werden als den LT-beta-R blockierende Agentien ausgewählt.
Ein löslicher LT-beta-Rezeptor, der die Aminosäuresequenzen umfasst, die aus denjenigen, die in der 1 des US-Patents Nr. 5,925,351 gezeigt werden, ausgewählt wurden, kann an eine oder an mehrere heterologe Proteindomänen („Fusionsdomäne") angeheftet sein, um die in vivo-Stabilität des Rezeptor-Fusionsproteins zu erhöhen oder um seine biologische Aktivität oder Lokalisierung zu modulieren. Es werden bevorzugt stabile Plasmaproteine verwendet, die typischerweise eine Halbwertszeit von über 20 Stunden im Kreislauf besitzen, um die Rezeptor-Fusionsproteine zu konstruieren. Solche Plasmaproteine umfassen Immunglobuline, Serumalbumin, Lipoproteine, Apolipoproteine und Transferrin, sind aber nicht auf diese beschränkt. Sequenzen, die das lösliche LT-beta-R-Molekül an eine bestimmte Zelle oder an einen bestimmten Gewebetyp gezielt anliefern, können an die LT-beta-R-Liganden-Bindedomäne ebenfalls angeheftet werden, um ein spezifisch lokalisiertes lösliches LT-beta-R-Fusionsprotein zu erzeugen. Es kann die vollständige oder ein funktioneller Teil der extrazellulären Region des LT-beta-R (1 des US-Patents Nr. 5,925,351), die die LT-beta-R-Liganden-Bindedomäne umfasst, mit der konstanten Region eines Immunglobulins fusioniert werden, wie z. B. der Fc-Domäne einer menschlichen schweren IgG1-Kette (Browning et al., J. Immunol., 154, S. 33–46 (1995)). Lösliche Rezeptor-IgG-Fusionsproteine sind übliche immunologische Reagenzien und Verfahren zu ihrer Konstruktion sind im Fachgebiet bekannt (vergleiche z. B. mit dem US-Patent Nr. 5,225,538). Eine funktionelle LT-beta-R-Liganden-Bindedomäne kann mit einer Immunglobulin- (Ig) Fc-Domäne fusioniert werden, die aus einer anderen Immunglobulin-Klasse oder -Unterklasse als IgG1 stammt. Die Fc-Domänen der Antikörper, die zu unterschiedlichen Ig-Klassen oder -Unterklassen gehören, können diverse sekundäre Effektorfunktionen aktivieren. Die Aktivierung erfolgt, wenn die Fc-Domäne durch einen verwandten Fc- Rezeptor gebunden wird. Sekundäre Effektorfunktionen umfassen die Fähigkeit, das Komplementsystem zu aktivieren, die Plazenta zu überqueren und an verschiedene Mikrobenproteine zu binden. Die Eigenschaften der unterschiedlichen Klassen und Unterklassen der Immunglobuline werden in Roitt et al., Immunology, S. 4.8 (Mosby-Year Book Europe Ltd., 3. Ausg. 1993) beschrieben. Die Komplement-Enzymkaskade kann durch die Fc-Domänen von an Antigene gebundenen IgG1-, IgG3- und IgM-Antikörpern aktiviert werden. Die Fc-Domäne von IgG2 scheint weniger wirksam zu sein, und die Fc-Domänen von IgG4, IgA, IgD und IgE sind bei der Aktivierung von Komplement nicht wirksam. Somit kann man eine Fc-Domäne danach auswählen, ob ihre assoziierten sekundären Effektorfunktionen für die bestimmte Immunantwort oder die Krankheit, die mit dem LT-beta-R-Fc-Fusionsprotein behandelt wird, wünschenswert sind. Wenn es vorteilhaft wäre, die den LT-Liganden tragende Zielzelle zu schädigen oder abzutöten, könnte man eine besonders aktive Fc-Domäne (IgG1) wählen, um das LT-beta-R-Fc-Fusionsprotein herzustellen. Wenn es alternativ wünschenswert wäre, das LT-beta-R-Fc-Fusionsprotein an eine Zelle gezielt hinzusteuern, ohne dabei das Komplementsystem auszulösen, könnte eine inaktive IgG4-Fc-Domäne gewählt werden.
Mutationen in den Fc-Domänen, die die Bindung an Fc-Rezeptoren und die Komplementaktivierung vermindern oder eliminieren, sind beschrieben worden (S. Morrison, Annu. Rev. Immunol. 10, S. 239–265 (1992)). Diese oder andere Mutationen können verwendet werden, alleine oder in Kombination, um die Aktivität der Fc-Domäne zu optimieren, die verwendet wird, um das LT-beta-R-Fc-Fusionsprotein zu konstruieren.
Die Herstellung eines löslichen menschlichen LT-beta-R-Fusionsproteins, das Liganden-Bindesequenzen umfasst, die mit einer menschlichen Immunglobulin-Fc-Domäne fusioniert sind (hLT-beta-R-Fc), wird in Beispiel 1 des US-Patents Nr. 5,925,351 beschrieben. Eine CHO-Linie, die gemäß Beispiel 1 hergestellt wurde und die hLT-beta-R-Fc sekretiert, wird als „hLT-beta; R-hG1 CHO#14" bezeichnet. Eine Probe dieser Linie wurde am 21. Jul. 1995 bei der American Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD) gemäß den Bedingungen des Budapester Vertrags hinterlegt, und ihr wurde die ATCC-Zugangsnummer CRL 11965 zugeordnet.
Die Herstellung eines löslichen murinen LT-beta-R-Fusionsmoleküls (mLT-beta-R-Fc) wird in Beispiel 2 des US-Patents Nr. 5,925,351 beschrieben. Eine CHO-Linie, die gemäß Beispiel 2 des US-Patents Nr. 5,925,351 hergestellt wurde und die mLT-beta-R-Fc sekretiert, wird als „mLT-beta; R-hG1 CHO#1.3.BB" bezeichnet. Eine Probe dieser Linie wurde am 21. Jul. 1995 bei der American Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD) gemäß den Bedingungen des Budapester Vertrags hinterlegt, und ihr wurde die ATCC-Zugangsnummer CRL 11964 zugeordnet.
Die unterschiedlichen Aminosäurereste, die die Verbindungsstelle des Rezeptor-Ig-Fusionsproteins bilden, können die Struktur, die Stabilität und letztlich die biologische Aktivität des löslichen LT-beta-Rezeptor-Fusionsproteins verändern. Es können eine oder mehrere Aminosäuren dem C-Terminus des ausgewählten LT-beta-R-Fragments hinzugefügt werden, um die Verbindungsstelle mit der ausgewählten Fusionsdomäne zu modifizieren.
Der N-Terminus des LT-beta-R-Fusionsproteins kann ebenfalls durch eine Veränderung der Position variiert werden, an dem das ausgewählte LT-beta-R-DNA-Fragment an seinem 5'-Ende für den Einbau in einen rekombinanten Expressionsvektor gespalten wird. Die Stabilität und die Aktivität jedes LT-beta-R-Fusionsproteins können unter Verwendung von Routineexperimenten und den Testansätzen zur Auswahl der den LT-beta-R blockierenden Agenzien, die hierin beschrieben werden, untersucht und optimiert werden.
Unter Verwendung der LT-beta-R-Liganden-Bindedomänen-Sequenzen innerhalb der extrazellulären Domäne, die in der 1 des US-Patents Nr. 5,925,351 gezeigt werden, können ebenfalls Aminosäure-Sequenzvarianten konstruiert werden, um die Affinität des löslichen LT-beta-Rezeptors oder des Fusionsproteins für den LT-Liganden zu modifizieren. Die löslichen LT-beta-R-Moleküle dieser Erfindung können um die Oberflächen-LT-Liganden-Bindung mit endogenen Zelloberflächen-LT-beta-Rezeptoren kompetitieren. Es wird beabsichtigt, dass jedes beliebige lösliche Molekül, das eine LT-beta-R-Liganden-Bindedomäne enthält, die mit den Zelloberflächen-LT-beta-Rezeptoren um die Bindung des LT-Liganden kompetitieren kann, ein den LT-beta-R blockierendes Agens darstellt, das in den Rahmen dieser Erfindung fällt.
In einer anderen Ausführungsform dieser Erfindung fungieren Antikörper, die gegen den menschlichen LT-beta-Rezeptor gerichtet sind (anti-LT-beta-R-Ak), als den LT-beta-R blockierende Agenzien zur Behandlung von Situationen, die Individuen, einschließlich des Menschen, einem viral induzierten systemischen Schock und einer Atemnot aussetzen oder diese Individuen dem Risiko eines viral induzierten systemischen Schocks oder der Atemnot auszusetzen. Die anti-LT-beta-R-Ak dieser Erfindung können polyclonale oder monoclonale Antikörper (mAk) sein, und sie können modifiziert werden, um ihre Fähigkeit, die LT-beta-R-Signalübertragung zu blockieren, sowie ihre Bioverfügbarkeit in vivo, ihre Stabilität oder andere gewünschte Eigenschaften zu optimieren.
Polyclonale Antikörperseren, die gegen den menschlichen LT-beta-Rezeptor gerichtet sind, werden unter Verwendung von herkömmlichen Verfahren hergestellt, und zwar durch die subcutane Injektion von Tieren wie z. B. Ziegen, Kaninchen, Ratten, Hamstern oder Mäusen mit einem menschlichen LT-beta-Rezeptor-Fc-Fusionsprotein (Beispiel 1 des US-Patents Nr. 5,925,351) in komplettem Freundschem Adjuvanz, gefolgt von einer intraperitonealen oder subcutanen Booster-Injektion mit inkomplettem Freundschem Adjuvanz. Die polyclonalen Antiseren, die die gewünschten Antikörper enthalten, die gegen den LT-beta-Rezeptor gerichtet sind, werden durch die üblichen immunologischen Verfahren durchmustert.
Monoclonale Antikörper (mAk) der Maus, die gegen das menschliche LT-beta-Rezeptor-Fc-Fusionsprotein gerichtet sind, werden, wie in Beispiel 5 des US-Patents Nr. 5,925,351 beschrieben, hergestellt. Eine Hybridom-Zelllinie (BD.A8.AB9), die den anti-Mensch-LT-beta-R-Maus-mAk BDA8 herstellt, wurde am 12. Jan. 1995 bei der American Type Culture Collection (ATCC) (10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209) gemäß den Bedingungen des Budapester Vertrags hinterlegt, und ihr wurde die ATCC-Zugangsnummer HB11798 zugeordnet.
Verschiedene Formen von anti-LT-beta-R-Antikörpern können auch unter Verwendung von rekombinanten Standard-DNA-Verfahren hergestellt werden (Winter und Milstein, Nature 349, S. 293–299 (1991)). So können zum Beispiel „chimäre" Antikörper konstruiert werden, bei denen die Antigen-Bindedomäne aus einem tierischen Antikörper mit einer menschlichen konstanten Domäne verbunden ist (z. B. Cabilly et al., US-Patent Nr. 4,816,567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, S. 6851–6855 (1984)). Chimäre Antikörper vermindern die beobachteten immunogenen Antwortreaktionen, die durch tierische Antikörper hervorgerufen werden, wenn sie bei klinischen Behandlungen am Menschen verwendet werden. Darüber hinaus können rekombinante „humanisierte Antikörper", die den LT-beta-R erkennen, synthetisiert werden. Humanisierte Antikörper sind Chimären, die größtenteils menschliche IgG-Sequenzen umfassen, in die Regionen, die für die spezifische Antigenbindung verantwortlich sind, inseriert wurden (z. B. WO 94/04679). Die Tiere werden mit dem gewünschten Antigen immunisiert, die entsprechenden Antikörper werden isoliert, und der Anteil der Sequenzen in den variablen Regionen, der für die spezifische Antigenbindung verantwortlich ist, wird entfernt. Die aus dem Tier stammenden Antigen-bindenden Regionen werden dann in die geeignete Position von menschlichen Antikörpergenen cloniert, in denen die Antigen-bindenden Regionen deletiert wurden. Humanisierte Antikörper minimieren die Verwendung von heterologen (zwischenartlichen) Sequenzen in menschlichen Antikörpern, und es ist weniger wahrscheinlich, dass sie Immunantworten in dem behandelten Individuum hervorrufen.
Die Konstruktion unterschiedlicher Klassen an rekombinanten anti-LT-beta-R-Antikörpern kann ebenfalls durch die Herstellung von chimären oder humanisierten Antikörpern durchgeführt werden, die die variablen Domänen eines anti-LT-beta-R-(Ak) und die menschlichen konstanten Domänen (CH1, CH2, CH3) enthalten, die aus unterschiedlichen Klassen von Immunglobulinen isoliert wurden. So können zum Beispiel anti-LT-beta-R-IgM-Antikörper mit vermehrten Antigen-Bindestellen-Valenzen rekombinant hergestellt werden, und zwar durch die Clonierung der Antigen-Bindestelle in Vektoren, die die konstante Region einer menschlichen μ-Kette tragen. (Arulanandam et al., J. Exp. Med. 177, S. 1439–1450 (1993); Lane et al., Eur. J. Immunol. 22, S. 2573–2578 (1993); Traunecker et al., Nature 339, S. 68–70 (1989)). Darüber hinaus können die rekombinanten Standard-DNA-Verfahren dazu verwendet werden, die Bindeaffinitäten von rekombinanten Antikörpern mit ihren Antigenen durch eine Veränderung der Aminosäurereste in der Nähe der Antigen-Bindestellen zu verändern. Die Antigen-Bindungsaffinität eines humanisierten Antikörpers kann durch Mutagenese auf Grundlage einer molekularen Modellierung erhöht werden (Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, S. 10029–10033 (1989); WO 94/04679).
Es kann wünschenswert sein, die Affinität der anti-LT-beta-R-Ak für den LT-beta-R in Abhängigkeit von dem angezielten Gewebetyp oder eines bestimmten beabsichtigten Behandlungsprotokolls zu erhöhen oder zu vermindern. So kann es zu Beispiel vorteilhaft sein, einen Patienten mit konstanten Spiegeln an anti-LT-beta-R-Ak mit einer verminderten Fähigkeit zur Signalübertragung über den LT-beta-Signalweg im Rahmen einer halb-vorbeugenden Behandlung zu behandeln. In gleicher Weise können hemmende anti-LT-beta-R-Ak mit einer gesteigerten Affinität für den LT-beta-R für kurzzeitige Behandlungen vorteilhaft sein.
Durch die Untersuchung anderer Antikörper, die gegen den menschlichen LT-beta-Rezeptor gerichtet sind, wird erwartet, dass zusätzliche anti-LT-beta-R-Ak, die als den LT-beta-R blockierende Agenzien im Menschen wirken, identifiziert werden können, und zwar um Situationen zu behandeln, die Individuen, einschließlich Menschen, einem viral induzierten systemischen Schock oder einer Atemnot aussetzen oder diese Individuen dem Risiko aussetzen, einen viral induzierten systemischen Schock und eine Atemnot zu erleiden; dies kann unter Verwendung von Routineexperimenten und den hierin beschriebenen Testansätzen erfolgen.
Eine andere bevorzugte Ausführungsform dieser Erfindung umfasst Zusammensetzungen und Verfahren, die Antiköper umfassen, welche gegen den LT-Liganden gerichtet sind und die als LT-beta-R-blockierende Agenzien fungieren. Wie vorstehend für die anti-LT-beta-R-Ak beschrieben, können anti-LT-Liganden-Antikörper, die als den LT-beta-R blockierende Agenzien wirken, polyclonal oder monoclonal sein, und sie können gemäß Routineverfahren modifiziert werden, um ihre Antigen-Bindeeigenschaften und ihre Immunogenität zu modulieren. Die anti-LT-Antikörper dieser Erfindung können gegen jede der beiden LT-Untereinheiten individuell erzeugt werden, einschließlich löslichen, mutierten, veränderten und chimären Formen der LT-Untereinheit. Wenn eine LT-Untereinheit als Antigen verwendet wird, handelt es sich bevorzugt um die LT-beta-Untereinheit. Wenn die LT-alpha-Untereinheit verwendet wird, wird bevorzugt, dass die so erhaltenen anti-LT-alpha-Antikörper an den Oberflächen-LT-Liganden binden und nicht mit sekretiertem LT-alpha kreuzreagieren oder die TNF-R-Aktivität modulieren (gemäß den in Beispiel 3 des US-Patents Nr. 5,925,351 beschriebenen Testansätzen).
Alternativ können Antikörper, die gegen einen homomeren (LT-beta) oder einen heteromeren (LT-alpha/62) Komplex gerichtet sind, der eine oder mehrere LT-Untereinheiten umfasst, erzeugt und auf eine Aktivität als ein den LT-beta-R blockierendes Agens hin durchmustert werden. Es werden bevorzugt LT-alpha 1/beta 2-Komplexe als Antigen verwendet. Wie vorstehend diskutiert, wird bevorzugt, dass die so erhaltenen anti-LT-alpha 1/beta 2-Antikörper an den Oberflächen-LT-Liganden binden, ohne dass sie an sekretiertes LT-alpha binden und ohne dass sie die TNF-R-Aktivität beeinflussen.
Die Herstellung polyclonaler anti-Mensch-LT-alpha-Antikörper wird in der ebenfalls anhängigen Anmeldung (WO 94/13808) der Anmelder beschrieben. Monoclonale anti-LT-alpha- und anti-LT-beta-Antikörper wurden ebenfalls beschrieben (Browning et al., J. Immunol. 54, S. 33–46 (1995)). Anti-Mensch-LT-beta-Maus-mAk wurden, wie in Beispiel 6 des US-Patents Nr. 5,925,351 beschrieben, hergestellt. Die Hybridom-Zelllinie (B9.C9.1), die den anti-Mensch-LT-beta-R-Maus-mAk B9 herstellt, wurde am 21. Jul. 1995 bei der American Type Culture Collection (ATCC) (10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209) gemäß den Bedingungen des Budapester Vertrags hinterlegt, und ihr wurde die ATCC-Zugangsnummer 11962 zugeordnet.
Monoclonale anti-Maus-LT-alpha/62-Hamster-Antikörper wurden, wie in Beispiel 7 des US-Patents Nr. 5,925,351 beschrieben, hergestellt. Die Hybridom-Zelllinie (BB.F6.1)), die den anti-Maus-LT-alpha/62-Hamster-mAk BB.F6 herstellt, wurde am 21. Jul. 1995 bei der American Type Culture Collection (ATCC) (10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209) gemäß den Bedingungen des Budapester Vertrags hinterlegt, und ihr wurde die ATCC-Zugangsnummer MB11963 zugeordnet.
Ein Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierungs- (FACS) Testansatz wurde entwickelt, um auf Antikörper hin zu durchmustern, die gegen LT-Untereinheiten und LT-Komplexe gerichtet sind und die als den LT-beta-R blockierende Agenzien, wie in den Beispielen 6 und 7 des US-Patents Nr. 5,925.351 beschrieben, fungieren können. Bei diesem Testansatz wird ein lösliches menschliches LT-beta-R-Fc- Fusionsprotein PMA-aktivierten II-23-Zellen hinzugegeben, die Oberflächen-LT-Komplexe exprimieren (Browning et al., J. Immunol. 154, S. 33–46 (1995), und zwar in Gegenwart zunehmender Mengen des Test-Antikörpers. Ein Antikörper, der die LT-beta-Rezeptor-Liganden-Wechselwirkung um mindestens 20 % hemmen kann, wird als LT-beta-R-blockierendes Agens ausgewählt.
Die Verwendung eines LT-alpha/beta-Komplexes, anstelle einer LT-Untereinheit, als Antigen zur Immunisierung eines Tieres kann zu einer noch wirksameren Immunisierung führen, oder sie kann Antikörper ergeben, die höhere Affinitäten für einen Oberflächen-LT-Liganden aufweisen. Es ist ersichtlich, dass durch die Immunisierung mit dem LT-alpha/62-Komplex Antikörper, die Aminosäurereste sowohl auf der LT-alpha- als auch auf der LT-beta-Untereinheit erkennen (wie z. B. Reste, die eine LT-alpha/62-Spalte bilden), isoliert werden können. Durch die Untersuchung von Antikörpern, die gegen heteromere menschliche LT-alpha/62-Komplexe gerichtet sind, wird erwartet, dass weitere Anti-LT-Antikörper, die als den LT-beta-R blockierende Agenzien im Menschen wirken können, unter Verwendung von Routineexperimenten und den hierin beschriebenen Testansätzen identifiziert werden können.
Verabreichung
Die hierin beschriebenen Zusammensetzungen werden in einer wirksamen Dosis bei Verfahren zur Behandlung von viral induziertem systemischen Schock und Atemnot in einem Individuum verabreicht. Die Bestimmung einer bevorzugten pharmazeutischen Formulierung und eines therapeutisch wirksamen Dosierungsprotokolls für eine bestimmte Anwendung liegt im Rahmen des Fachgebiets, wobei zum Beispiel der Zustand und das Gewicht des Patienten, das Ausmaß der gewünschten Behandlung und die Toleranz des Patienten für die Behandlung in Betracht gezogen werden. Von Dosen von etwa 1 mg/kg des löslichen LT-beta-R wird erwartet, dass sie geeignete Ausgangspunkte für eine Optimierung der Behandlungsdosen darstellen.
Die Bestimmung einer therapeutisch wirksamen Dosis kann auch durch die Durchführung von in vitro-Experimenten erfolgen, die die Konzentration des LT-beta-R-blockierenden Agens messen, die erforderlich ist, um Zielzellen (LT-beta-R- oder LT-Liganden-positive Zellen in Abhängigkeit von dem blockierenden Agenz) über 1 bis 14 Tage zu beschichten. Die Rezeptor-Liganden-Bindungs-Testansätze, die hierin beschrieben werden, können verwendet werden, um die Zellbeschichtungs-Reaktion zu überwachen. LT-beta-R- oder LT-Liganden-positive Zellen können von aktivierten Lymphocyten-Populationen unter Verwendung der FACS abgetrennt werden. Auf Grund der Ergebnisse dieser in vitro-Bindungs-Testansätze kann ein Bereich geeigneter des den LT-beta-R blockierenden Konzentrationen Agens für eine Untersuchung in Tieren gemäß den hierin beschriebenen Testansätzen ausgewählt werden.
Die Verabreichung der löslichen LT-beta-R-Moleküle, der anti-LT-Liganden- und der anti-LT-beta-R-Antikörper dieser Erfindung, alleine oder in Kombination, einschließlich isolierter und gereinigter Formen der Antikörper oder Komplexe, ihrer Salze oder pharmazeutisch verträglicher Derivate davon, kann durch die Verwendung einer beliebigen der herkömmlichen und akzeptierten Arten der Verabreichung von Agenzien durchgeführt werden, die eine das Immunsystem unterdrückende Aktivität aufweisen.
Die Arzneimittel, die in diesen Therapien verwendet werden, können auch in einer Vielzahl von Formen vorliegen. Diese umfassen zum Beispiel feste, halbfeste und flüssige Dosierungsformen wie z. B. Tabletten, Pillen, Pulver, flüssige Lösungen oder Suspensionen, Zäpfchen und Lösungen, die über eine Injektion und über eine Infusion verabreicht werden können. Die bevorzugte Form hängt von der beabsichtigten Weise der Verabreichung und von der therapeutischen Anwendung ab.
Verfahren zur Verabreichung können die orale, parenterale, subcutane, intravenöse, intraläsionale oder örtliche Verabreichung umfassen. Die löslichen LT-beta-R-Moleküle, die anti-LT-Liganden- und die anti-LT-beta-R-Ak dieser Erfindung können zum Beispiel zu sterilen, isotonischen Formulierungen mit oder ohne Kofaktoren gegeben werden, welche die Aufnahme stimulieren oder die Stabilität erhöhen. Die Formulierung erfolgt bevorzugt in flüssiger Form oder es kann sich um ein gefriergetrocknetes Pulver handeln. So können zum Beispiel die löslichen LT-beta-R-Moleküle, die anti-LT-Liganden- und die anti-LT-beta-R-Aks dieser Erfindung mit einem Formulierungspuffer verdünnt werden, der 5,0 mg/ml Citronensäure- Monohydrat, 2,7 mg/ml Tri-Natriumcitrat, 41 mg/ml Mannit, 1 mg/ml Glycin und 1 mg/ml Polysorbat 20 enthält. Diese Lösung kann gefriergetrocknet, (dan) unter kühlen Bedingungen gelagert und vor der Verabreichung mit sterilem Wasser-zur-Injektion (USP) rekonstituiert werden.
Die Zusammensetzungen werden bevorzugt ebenfalls die üblichen pharmazeutisch verträglichen Träger umfassen, die im Fachgebiet wohlbekannt sind (vergleiche zum Beispiel mit Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Ausgabe, 1980, Mac Publishing Company). Solche pharmazeutisch verträglichen Träger können andere medizinische Agenzien, Träger, genetische Träger, Adjuvanzien, Excipienten usw. umfassen, wie z. B. menschliches Serumalbumin oder Plasmapräparate. Die Zusammensetzungen liegen bevorzugt in Form einer Einheitsdosis vor und werden gewöhnlich ein bis mehrmals täglich verabreicht.
Die Arzneimittel dieser Erfindung können auch unter Verwendung von Mikrosphären, Liposomen, anderen Mikropartikel-Anlieferungssystemen oder Depot-Freisetzungs-Formulierungen verabreicht werden, die in, in der Nähe von anderweitig in Verbindungsmöglichkeit mit den betroffenen Geweben oder dem Blutkreislauf platziert werden. Geeignete Beispiele für Depot-Freisetzungs-Träger umfassen halbdurchlässige Polymer-Matrices in Form von geformten Artikeln wie z. B. Zäpfchen oder Mikrokapseln. Implantierbare oder mikrokapsuläre Depot-Freisetzungs-Matrices umfassen Polylactide (US-Patent Nr. 3,773,319; EP 58,481 ), Copolymere aus L-Glutaminsäure und Ethyl-L-glutamat (Sidman et al., Biopolymers 22, S. 547–56 (1985)); Poly(2-hydroxyethyl-methacrylat) oder Ethylenvinylacetat (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15, S. 167–277 (1981); Langer, Chem. Tech. 12, S. 98–105 (1982)).
Liposomen, die lösliche LT-beta-R-Moleküle, anti-LT-Liganden- und anti-LT-beta-R-Ak dieser Erfindung enthalten, alleine oder in Kombination, können durch wohlbekannte Verfahren hergestellt werden (vergleiche z. B. mit DE 3,218,121 ; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, S. 3688–92 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, S. 4030–34 (1980); US-Patent Nr. 4,485,045 und 4,544,545). Gewöhnlich gehören die Liposomen zu der kleinen (etwa 200–800 Angström großen) unilamellären Art, in der der Lipidgehalt höher als etwa 30 Mol-% Cholesterin liegt. Der Anteil an Cholesterin wird so gewählt, dass er die optimale Freisetzungsrate der löslichen LT-beta-R-Moleküle, der anti-LT-Liganden- und der anti-LT-beta-R-Ak kontrolliert.
Die löslichen LT-beta-R-Moleküle, die anti-LT-Liganden- und die anti-LT-beta-R-Ak dieser Erfindung können auch an Liposomen angeheftet werden, die andere LT-beta-R-blockierende Agenzien, die Immunantwort unterdrückende Agenzien oder Cytokine enthalten, um die den LT-beta-R blockierende Aktivität zu modulieren. Die Anheftung der LT-beta-R-Moleküle, der anti-LT-Liganden- und der anti-LT-beta-R-Ak an Liposomen kann durch ein beliebiges bekanntes Kreuzvernetzungsmittel durchgeführt werden, wie z. B. durch heterobifunktionelle Kreuzvernetzungsmittel, die weit verbreitet verwendet wurden, um Toxine oder chemotherapeutische Agenzien an Antikörper für die gezielte Anlieferung zu koppeln. Die Konjugation mit den Liposomen kann auch unter Verwendung des auf Kohlenhydrate gerichteten Kreuzvernetzungsreagenzes 4-(4-Maleimidphenyl)buttersäurehydrazid (MPBH) erfolgen (Duzgunes et al., J. Cell. Biochem. Abst. Erf. 16E 77 (1992)).
Die den LT-beta-R blockierenden Agenzien der Zusammensetzungen und Verfahren dieser Erfindung können modifiziert werden, um einen gewünschten Spiegel der LT-beta-R-Signalübertragung in Abhängigkeit von der Situation, der Störung oder der Erkrankung, die behandelt wird, zu erreichen. Es wird beabsichtigt, dass die absoluten Spiegel der LT-beta-R-Signalübertragung durch die Manipulierung der Konzentrationen und der Affinitäten der LT-beta-R-blockierenden Agenzien für ihre entsprechenden molekularen Ziele fein reguliert werden können. Zum Beispiel werden in einer Ausführungsform dieser Erfindung die Zusammensetzungen, welche die löslichen LT-beta-R-Moleküle umfassen, einem Individuum verabreicht. Der lösliche LT-beta-Rezeptor kann mit den Zelloberflächen-LT-beta-Rezeptoren um die Bindung der Oberflächen-LT-Liganden wirksam kompetitieren. Die Fähigkeit, mit den Oberflächen-LT-Liganden zu kompetitieren, ist von den relativen Konzentrationen der löslichen und der Zelloberflächen-LT-beta-R-Moleküle und von ihren relativen Affinitäten für die Ligandenbindung abhängig.
Lösliche LT-beta-R-Moleküle, die Mutationen tragen, welche die Bindungsaffinität eines solchen mutierten löslichen LT-beta-R mit dem Oberflächen-LT-Liganden erhöhen oder vermindern, können unter Verwendung von rekombinanten Standard-DNA-Verfahren hergestellt werden, die den Fachleuten wohlbekannt sind. Es kann ein große Zahl an Molekülen mit ortsgerichteten oder zufälligen Mutationen auf ihre Fähigkeit, als LT-beta-R-blockierende Agenzien zu wirken, unter Verwendung von Routineexperimenten und den hierin beschriebenen Verfahren ausgetestet werden. In ähnlicher Weise fungieren in einer anderen Ausführungsform dieser Erfindung Antikörper, die entweder gegen den LT-beta-Rezeptor oder gegen eine oder mehrere der LT-Liganden-Untereinheiten gerichtet sind, als LT-beta-R-blockierende Agenzien. Die Fähigkeit dieser Antikörper, die LT-beta-Rezeptor-Signalübertragung zu blockieren, kann durch Mutation, chemische Modifizierung oder durch andere Verfahren, die die wirksame Konzentration oder die Aktivität des einem Individuum verabreichten Antikörpers variieren, modifiziert werden.
Anwendungen
Als genereller Punkt können die Verfahren der vorliegenden Erfindung für die Induktion einer antiviralen Antwortreaktion in einem Individuum verwendet werden; dies umfasst die Verabreichung einer wirksamen Menge eines LT-β-blockierenden Agens und eines pharmazeutisch verträglichen Trägers an das Individuum. Die virale Antwortreaktion, die behandelt werden soll, kann durch irgendeinen bekannten Virus verursacht worden sein, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Sin Nombre (SNV), Ebola, Marburg, Lassa und Dengue.
Die vorstehenden Ausführungsformen sollten in allen Beziehungen als erläuternd statt als die hierin offenbarte Erfindung einschränkend betrachtet werden. Der Rahmen der Erfindung wird daher eher durch die angehängten Ansprüche als durch die vorstehende Beschreibung angezeigt.
Beispiel
Der Tumor-Nekrose-Faktor (TNFα) spielt eine Schlüsselrolle bei der Ausübung von Antwortreaktionen, die bei akutem Schock stattfinden, auf vitale Infektionen und andere Immunogene (K.C.F. Sheehan, N.H. Ruddle und R.D. Schreiber, J. Immunol. 142, 3884 (1989); G.W.H. Wong und D.V. Goeddel, Nature 323, 819 (1986); B. Beutler, I.W. Milsark, A. Cerami, Science 229, 869 (1985); F. Mackay, P.R. Bourdon, D.A. Griffiths et al., J. Immunol. 159, 3299 (1997); P.D. Crowe, T.L. VanArsdale, B.N. Walter et al., Science 264, 707 (1994)). Im Verlauf von Episoden von Dengue-Fieber, die einen Schock beinhalteten, waren die Spiegel des TNFα in den Seren von Patienten erhöht, ebenso wie die Spiegel an löslichem TNFR-75 (D. Hober et al., J. Trop. Med. Hyg. 48, 324 (1993); D.B. Bethell, K. Flobbe, C.X.T. Phuong et al., J. Infect. Dis. 177, 778 (1998)). Wir maßen die TNFα-Spiegel in den Seren von Mäusen, die mit einer Variante des Lymphocyten-Choriomeningitis-Virus, LCMV, Clon 13 (LCMV-13) (HH, II) infiziert worden waren. Es wurde herausgefunden, dass die TNFα-Spiegel in den Seren von Mäusen, die mit LCMV-13 infiziert waren, gerade über der Nachweisgrenze des Testansatzes bis zum Tag 4 nach der Infektion lagen (die Serum-TNFα-Spiegel wurden durch einen ELISA-Testansatz (Genzyme Corporation, Katalog-Nummer 80-2802-00) bestimmt). An den Tagen 5 und 6, wenn die Erkrankung ihren Höhepunkt erreicht, erhöhte sich der Spiegel an löslichem TNFα im Serum um das 3-6-fache über den Normalwert (Daten werden nicht gezeigt). Daher entschieden wir uns, die TNFα-Funktion durch die Verwendung eines monoclonalen Antikörpers, TN3-19.12, zu blockieren, von dem bekannt ist, dass er an sekretierten TNFα bindet, wobei dessen Verarmung in der Maus verursacht wurde, wie durch einen ELISA verifiziert wurde (K.C.F. Sheehan, N.H. Ruddle und R.D. Schreiber, J. Immunol. 142, 3884 (1989); G.W.H. Wong und D.V. Goeddel, Nature 323, 819 (1986); B. Beutler, I.W. Milsark, A. Cerami, Science 229, 869 (1985); F. Mackay, P.R. Bourdon, D.A. Griffiths et al., J. Immunol. 159, 3299 (1997); P.D. Crowe, T.L. VanArsdale, B.N. Walter et al., Science 264, 707 (1994); D. Hober et al., J. Trop. Med. Hyg. 48, 324 (1993); D.B. Bethell, K. Flobbe, C.X.T. Phuong et al., J. Infect. Dis. 177, 778 (1998)). Die Serum-TNFα-Spiegel wurden mittels eines ELISA-Testansatzes gemessen (Genzyme Corporation, Katalog-Nummer 80-2802-00). NZB-Mäusen wurden 2,5 × 10⁶ PBE Clon 13 i.v., gefolgt von zwei i.p.-Injektionen, die 250 μg des TN3-19.12-Antikörpers in Endotoxinfreiem PBS enthielten (vergleiche mit Referenz S), an den Tagen 1 und 4 nach der Infektion verabreicht. Kontroll-Mäusen wurde das gleiche Volumen an PBS ohne Antikörper an den gleichen Tagen injiziert. Diese Behandlung (anti-TNF) hatte nur eine geringe Wirkung auf die Überlebensrate dieser Mäuse (3). Lymphotoxinalpha (LTα), das auch als TNFβ bekannt ist, obwohl es mit TNFα identische Rezeptoren und viele seiner biologischen Wirkungen gemein hat, wird durch diesen Antikörper nicht erkannt (F. Mackay, P.R. Bourdon, D.A. Griffiths et al., J. Immunol. 159, 3299 (1997). Es ist möglich, dass die Ansteuerung sowohl von TNFα als auch von LTα erforderlich ist, um die Überlebensraten zu erhöhen. Um diese Hypothese zu untersuchen, verwendeten wir den vorstehenden TN3-19.12-mAk und ein Rezeptor-Fusionsprotein, in dem die extrazelluläre Domäne des TNF-p55-Rezeptors mit der CH2- und der CH3-Domäne des menschlichen IgG1 fusioniert war (TNFR55-Ig) (W.R. Force, B.N. Walter, C. Hession et al., J. Immunol. 155, 5280 (1995); G.T. Miller, P.S. Hochman, W. Meier et al., JEM 178, 211 (1993); J.L. Browning, I. Dougas, A. Ngam-ek et al., J. Immunol. 154, 33 (1995). Die Mäuse wurden, wie in Referenz R beschrieben, behandelt. Bei der dreifach behandelten Gruppe wurden das TNFR55-Ig- und das LTβR-Ig-Protein am Tag 0 und am Tag 3 nach der Infektion in Mengen von 200 μg i.p. verabreicht. Kontroll-Mäusen wurde der menschliche Antikörper, der zur Synthese dieser Fusionsproteine verwendet worden war (AY1943-29), an den gleichen Tagen in identischen Mengen verabreicht. Mäuse, die nur LTβR-Ig erhielten, wurden identisch behandelt, mit der Ausnahme, dass die Injektionen mit TNFR55-Ig entfielen. Diese Behandlung veränderte die Überlebensraten in mit LCMV-13 infizierten NZB-Mäusen ebenfalls nicht signifikant (vergleiche die anti-TNF- und die TNFR55-Ig-Gruppe). Die Membranform von Lymphotoxin, ein Heteromer aus LTα und LTβ, erkennt den TNFR-75 oder den TNFR-55 nicht, sondern bindet an einen dritten Rezeptor, der als LTβR bezeichnet wird (15). Wir entschieden uns für die Verwendung eines Fusionsproteins, das die extrazelluläre Domäne des LTβR enthielt, die ebenfalls an die CH2- und die CH3-Domäne des menschlichen IgG1 angeheftet war (LTβR-Ig). Die Behandlung der Mäuse mit dem anti-TNFα-mAk, TNFR55-Ig und LTβR-Ig (dreifache Behandlung oder TNFR55-Ig und LTβR-Ig) führte zu einer drastischen Erhöhung der Überlebensrate und zwar zu 80 % beziehungsweise zu 70 %. Im Gegensatz dazu, überlebten nur 20 % der Mäuse, die mit dem anti-TNFα-mAk und TNFR55-Ig behandelt word29n waren, die Infektion. Vor kurzen wurde ein zweiter Ligand für den LTβR identifiziert, nämlich LIGHT (D.N. Mauri, R. Ebner, R.I. Montogomery et al., Immunity 8, 21 (1998); R.I. Montgomery, M.S. Warner, B. Lum et al., Cell 87, 427 (1996)). Es wurde gezeigt, dass LIGHT auch an das Protein, das das Eindringen des Herpesvirus vermittelt, bindet, ein Transmembranprotein des Typs I mit signifikanter Homologie zu Mitgliedern der TNFR-Familie, das auf aktivierten CD4- und CD8-T-Zellen exprimiert wird (D.N. Mauri, R. Ebner, R.I. Montogomery et al., Immunity 8, 21 (1998); R.I. Montgomery, M.S. Warner, B. Lum et al., Cell 87, 427 (1996)). Aufgrund der Ergebnisse, die hier vorgestellt werden, war die Verhinderung der LTβR-Signalübertragung und möglicherweise der HVEM-Signalübertragung durch die Bindung von LTβ₂α₁ und LIGHT durch LTβR-Ig wahrscheinlich für den größten Teil der Wirkung verantwortlich, die bei der dreifach behandelten Gruppe beobachtet wurde. Wir bestätigten diese Hypothese durch die Behandlung von mit LCMV-13 infizierten NZB-Mäusen nur mit dem LTβR-Ig-Fusionsprotein. Die Überlebensrate der Mäuse in dieser Gruppe (73 %) war fast so hoch wie die in der dreifach behandelten Gruppe (3). Zusammengenommen stellen diese Daten die erste Demonstration dar, dass der LTβR- und/oder der HVEM-Signalweg an der Etablierung einer akuten letalen Erkrankung beteiligt ist/sind, die systemischen Schock und Atemnot beinhaltet.
In dem Bemühen, den Mechanismus des Überlebens zu bestimmen, der hinter der LTβ-Blockierungsbehandlung steht, wurden sowohl eine CD8/Tetramer-Cofärbung von NP118-spezifischen T-Zellen, d. h. dem dominanten CD8-Epitop in dem NZB-L^D-System, als auch eine intrazelluläre Anfärbung der Interferon-gamma-Produktion in den Milzzellen, die mit dem NP118-Peptid stimuliert worden waren, an Proben aus mit LCMV-13 infizierten NZB-Mäusen, die mit dem Kontroll-Antikörper, mit LTβR-Ig alleine oder dreifach behandelt worden waren, durchgeführt. 4 zeigt eine Verminderung der Zahl an NP118-spezifischen CD8-T-Zellen, wobei die größte Wirkung bei den dreifach behandelten Mäusen beobachtet wurde. Bei den Mäusen, die mit dem Kontroll-Antikörper behandelt worden waren, produzierten nur 10 % der für das Tetramer positiven Zellen aktiv INFγ. Das Auftauchen von anergischen T-Zellen im Verlauf einer LCMV-13-Infektion wurde bereits vorher dokumentiert und ist wahrscheinlich auf hohe Spiegel an viralem Antigen in der Maus zurückzuführen (1). Es verminderte sich nicht nur die Zahl an NP118-spezifischen Zellen in den mit LTβR-Ig behandelten Mäusen, sondern der Prozentsatz der Zellen, die IFNγ herstellten, war ebenfalls vermindert. Dieser Effekt war in der dreifach behandelten Gruppe sogar noch stärker ausgeprägt. Daher ist es möglich, dass das CD8-Kompartiment die Quelle dieser für die NZB-Mäuse letalen Antwortreaktion auf die Infektion mit LCMV-13 darstellt. Die Tatsache, dass aktivierte CD8-T-Zellen dafür bekannt sind, dass sie LTβ₂α₁ präsentieren, steht mit dieser Hypothese in Einklang (Y. Abe, A. Horiuchi, Y. Osuka et al., Lymph. Cytok. Res. 11, 115 (1992); C.F. Ware, P.D. Crowe, M.H. Grayson et al., J. Immunol. 149, 3881 (1992); J.L. Browning, A. Ngam-ek, P. Lawton et al., Cell 72, 847 (1993)). Um diese Annahme zu stützen, verarmten wir infizierte NZB-Mäuse an CD8- oder CD4-positiven T-Zellen in vivo (Männlichen NZB-Mäusen wurden 2,5 × 10⁶ PBE LCMV-13 i.v. verabreicht, darauf hin folgten zwei 500 μl-Injektionen i.p. des anti-T-Zellen-Antikörpers. Der mAk Lyt2.43 wurde verwendet, um CD8⁺-T-Zellen zu verarmen, während der Antikörper GK1.5 (M1) für die Verarmung der CD4⁺-T-Zellen verwendet wurde. Beide Antikörper wurden durch eine Ammoniumsulfat-Präzipitation aus Hybridom-Überständen hergestellt, der eine Dialyse gegen PBS folgte. Es wurde eine FACS-Analyse verwendet, um die Verarmung in einigen der Mäuse zu verifizieren). Die Dezimierung der CD4-T-Zellen erhöhte die Überlebensrate nicht. Im Gegensatz dazu, führte die Dezimierung der CD8-T-Zellen, anders als bei den mit LTβR-Ig behandelten Mäusen, zum 100 %-igen Überleben bei Abwesenheit von Krankheitssymptomen (5). Da die Virus-Titer in einigen Geweben der an CD8-T-Zellen verarmten Mäuse höher waren als bei den unbehandelten, ist es wahrscheinlich, dass der Tod eher von einer toxischen Immunantwort herrührte, die durch CD8-T-Zellen vermittelt wurde, als von einer Zerstörung der Gewebe durch die virale Infektion.
Wir haben hier berichtet, dass NZB-Mäuse, wenn sie mit einer hohen Dosis an LCMV-13 intravenös infiziert werden, eine akute, rasch fortschreitende Erkrankung entwickeln, die einige gemeinsame Merkmale mit Ebola-, Marburg-, Lassa-, Dengue- und Sin Nombre-Infektionen aufweist. Die Letalität dieser Erkrankung hing von der Anwesenheit von CD8⁺-T-Zellen ab, von denen bekannt ist, dass sie den TNFα, LTα und LTβ exprimieren, wenn sie aktiviert werden. Obwohl dies eine ermutigende Feststellung ist, ist eine Behandlung der viralen Infektion durch eine Verarmung der CD8⁺-T-Zellen nicht angezeigt. Eine solche Behandlung könnte die Patienten gegenüber anderen opportunistischen Infektionen anfällig machen. Da darüber hinaus die Ausscheidung des Virus bei Abwesenheit von CTLs unwahrscheinlich ist, besteht ein sehr reales Risiko, dass der Patient nach der Reetablierung des CD8⁺-Kompartiments eine Toleranz für das Virus entwickelt. Wir haben gezeigt, dass die Blockierung der LTβR/HVEM-Signalwege durch die Verabreichung von LTβR-Ig eine hoch wirksame Behandlung darstellt, die ihrer Natur nach vorübergehend ist und bei der eine rasche Erholung bis zur Homöostase erfolgt, nachdem die Behandlung beendet ist (Mackay und Browning, unveröffentlicht). Die überlebenden Mäuse, die auf diese Weise behandelt wurden, schieden das Virus schließlich aus den untersuchten Geweben aus (Daten werden nicht gezeigt) und wiesen keine Zeichen der Erkrankung mehr auf.
Diese Daten stellen die erste Demonstration dar, dass der LTβR-Signalweg eine wichtige Rolle bei der antiviralen Antwortreaktion und der CD8-T-Zellen-Funktion spielt. Das Lymphotoxin-System ist eng mit der Organisation der Lympharchitektur verbunden, am wahrscheinlichsten über die Kontrolle der Expression verschiedener Chemokine, die die T- und die B-Zellen-Organisation steuern (Chaplin et al., Curr. Opin. Immunol. 10, 289 (1998), J. Cyster, im Druck). Der reife funktionelle Zustand der follikulären dendritischen Zellen wird durch eine konstante B-Zellen-Signalübertragung aufrechterhalten, und diese Zellen verschwinden innerhalb eines Tages nach dem Ende der LTβR-Signalübertragung. Diese Zellen sind für die Präsentation des Antigens gegenüber dem B- und T-Zellen-Kompartiment von entscheidender Bedeutung. Es ist eine vernünftige Annahme, dass einige Aspekte der Antigenpräsentation gegenüber CD8-Zellen oder die richtige Positionierung dieser Zellen in einem Chemokingradienten im Verlauf der Reifung durch die Unterbrechung der LTβR-Signalübertragung verhindert werden. Vorangegangene Untersuchungen der LT-Funktion konzentrierten sich hauptsächlich auf die Biologie der B-Zellen und die Beteiligung an einer Funktion der T-Zellen kam unerwartet. Entweder besitzt das LT zusätzliche Funktionen oder diese Daten spiegeln eine Rolle für den neuen Liganden LIGHT wider. Welche Rolle HVEM und LIGHT bei dem Voranschreiten der Erkrankung spielen, die hier dokumentiert wurde, ist derzeit noch nicht klar.

Claims

Verwendung eines Lymphotoxin-β (LT-β)-blockierenden Agens oder eines den Lymphotoxin-β-Rezeptor (LT-β-R) blockierenden Agens und eines pharmazeutisch verträglichen Trägers für die Herstellung eines Arzneimittels zur Induzierung einer antiviralen Antwort in einem Individuum, welches an einem viral induzierten systemischen Schock und/oder an einem Lungenleiden leidet.
Verwendung eines Lymphotoxin-β (LT-β)-blockierenden Agens oder eines den Lymphotoxin-β-Rezeptor (LT-β-R) blockierenden Agens und eines pharmazeutisch verträglichen Trägers für die Herstellung eines Arzneimittels zur Reduzierung eines viral induzierten systemischen Schocks in einem Individuum.
Verwendung eines Lymphotoxin-β (LT-β)-blockierenden Agens oder eines den Lymphotoxin-β-Rezeptor (LT-β-R) blockierenden Agens und eines pharmazeutisch verträglichen Trägers für die Herstellung eines Arzneimittels zur Reduzierung einer viralen Infektion in einem Individuum, welches an einem viral induzierten systemischen Schock und/oder an einem Lungenleiden leidet.
Verwendung eines Lymphotoxin-β (LT-β)-blockierenden Agens oder eines den Lymphotoxin-β-Rezeptor (LT-β-R) blockierenden Agens und eines pharmazeutisch verträglichen Trägers für die Herstellung eines Arzneimittels für die Reduzierung eines viral induzierten Lungenleidens in einem Individuum.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1, 2, 3 oder 4, wobei das LT-β-blockierende Agens ein Antikörper gegen Lymphotoxin-β ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1, 2, 3 oder 4, wobei das LT-β-R-blockierende Agens ein Antikörper gegen den Lymphotoxin-β-Rezeptor oder gegen einen löslichen Lymphotoxin-β-Rezeptor ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1, 5 oder 6, wobei das Individuum mit dem Sin-Nombre-Virus, Ebola-Virus, Marburg-Virus, Lassa-Virus oder Dengue infiziert ist.
Verwendung nach Anspruch 6 oder 7, wobei das Agens ein Lymphotoxin-β-R/Ig-Fusionsprotein ist.