DE69730029T2

DE69730029T2 - T-zell selektive interleukin-4 agoniste

Info

Publication number: DE69730029T2
Application number: DE69730029T
Authority: DE
Inventors: B. Armen SHANAFELT; Jeffrey Greve; Robert Gundel
Original assignee: Bayer AG; Bayer Corp
Current assignee: Bayer AG; Bayer Corp
Priority date: 1996-06-14
Filing date: 1997-05-30
Publication date: 2005-07-21
Anticipated expiration: 2017-05-31
Also published as: EP0912741B1; ES2225977T3; HUP9902824A3; JP2000515007A; TW508356B; PL330413A1; AR008233A1; CA2256459A1; ID18992A; DE69730029D1; ATE272118T1; NZ332790A; PL187846B1; EP0912741A2; IL126995A0; AU3222097A; HUP9902824A2; AU725090B2; TR199802591T2; WO1997047744A2

Description

1. Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ganz allgemein Gebiete der Pharmakologie und Immunologie. Spezifischer ist die Erfindung auf neue Zusammensetzungen aus einer Materie zur selektiven Aktivierung von T-Zellen gerichtet, wobei die Zusammensetzungen eine verringerte Aktivierung der Endothelialzellen oder -fibroblasten aufweisen. Die neuen Zusammensetzungen schließen Varianten der Zytokin-Familie und insbesondere menschliches Interleukin-4 (IL-4) ein.
2. Beschreibung des Standes der Technik
Interleukin-4 (IL-4) ist ein pleiotropisches Zytokin, das Aktivitäten auf Zellen des Immunsystems, Endotheliums und auf denjenigen fibroblastischer Natur aufweist. In vitro-Effekte einer Verabreichung von IL-4, über die berichtet wird, schließen die Fortpflanzung von T-Zellen unter Verschiebung der Immunoglobulin-Klasse in den B-Zellen ein. In T-Zellen stimuliert IL-4 die Fortpflanzung von T-Zellen nach Voraktivierung mit Mitogenen und reguliert die IFN-γ-Produktion herunter. In Monozyten induziert IL-4 die Exprimierung von Klasse II-MHC-Molekülen, eine Freisetzung von Lipopolysaccharid-induzierter tPA und eine CD23-Exprimierung. In Endothelialzellen (EC) induziert IL-4 die Exprimierung von VCAM-1 und eine Freisetzung von IL-6 und senkt die Exprimierung von ICAM-1 ab (Maker DW et al., Human Interleukin-4: An Immunomodulator with Potential Therapeutic Applications, Progress in Growth Factor Research 3: 43–56 (1991)).
Wegen ihrer Fähigkeit zur Stimulierung der Fortpflanzung von T-Zellen, die durch IL-2 aktiviert werden, ist eine Therapie mit IL-4 untersucht und verfolgt worden. Beispielsweise ist mit IL-4 eine anti-neoplastische Aktivität in Lebewesen-Modellen von Nieren-Karzinomen belegt worden, und es ist ein Rückgang des Tumors bei Mäusen induziert worden (Bosco M. et al., Low Doses of IL-4 Injected Perilymphatically in Tumor-bearing Mice Inhibit the Growth of Poorly and Apparently Nonimmunogenic Tumors and Induce a Tumor Specific Immune Memory, J. Immunol. 145: 3136–43 (1990)). Allerdings limitiert dessen Toxizität die Dosierung bei Menschen (Margolin K. et al., Phase II Studies of Human Recombinant Interleukin-4 in Advanced Renal Cancer and Malignant Melanoma, J. Immunotherapy 15: 147–153 (1994)).
Wegen ihrer immunoregulatorischen Aktivität ist eine Anzahl klinischer Anwendungen für IL-4 vorgeschlagen worden. Unter diesen klinischen Anwendungen sind diese auf Störungen gerichtet, die durch Ungleichgewichte des Immunsystems, insbesondere durch Ungleichgewichte von T-Helfer (Th)-Zell-Reaktionen auf Antigen, verursacht werden. Diese Krankheiten schließen bestimmte Autoimmunkrankheiten, rheumatische, dermatologische und infektiöse Krankheiten ein. Ein umfängliches Versuchswerk ist erstellt worden, und zwar dahingehend, dass Th-Zellen in zwei breite Klassen zerfallen, die als Th1 und Th2 bezeichnet werden (Mosmann T. R., Cherwinski H., Bond M. W., Giedlin M. A. und Coffman R. L., Two types of murine helper T cell clone: I. Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins, J. Immunol. 136: 2348–2357 (1986); Mosmann T. R., Cytokines, differentiation and functions of subsets of CD4 and CD8 T cells, Behring Inst. Mitt. 1–6 (1995)). Diese T-Zellklassen werden durch die Zytokine definiert, die exprimieren: Th1-Zellen erzeugen IL-2, INF-γ und TNF-α, während Th2-Zellen IL-4 und IL-5 erzeugen. Th1- und Th2-Zellen werden aus nativen CD4⁺-T-Zellen gebildet. Die Differenzierung in Th1- oder Th2-Subsätze hängt von dem Zytokin ab, das während der Antigen-Stimulierung vorliegt: IFN-γ und IL-12 steuern die Differenzierung nativer Zellen zum Th-1-Phänotyp, während IL-4 die Differenzierung zum Th2-Phänotyp steuert. Während die Th1- und Th2-Subsätze Extreme entlang einem Kontinuum von Th-Zell-Phänotypen darstellen können (z. B. sind Th0-Zellen, die niedrige Gehaltsmengen von sowohl INF-γ als auch von IL-4 exprimieren, beschrieben worden), diese Klassifikation stellt dennoch das Haupt-Paradigma auf dem Immunologie-Gebiet zur Beschreibung des Charakters der Immunreaktion dar.
Es ist beobachtet worden, dass bestimmte Organ-spezifische Autoimmunkrankheiten mit einer vorrangigen Th1-T-Zell-Reaktion gegen Autoantigen zusammenhängen (Liblau RS, Singer SM, McDevitt HO, Th1 and Th2 CD4⁺ T cells in the pathogenesis of organ-specific autoimmune diseases, Immunol. Today 16: 34–38 (1995)). Eine solche Autoimmunkrankheit ist Insulin-abhängige Diabetes (IDDM), eine Störung, die durch T-Zell-mediierte Zerstörung pankreatischer β-Zellen gekennzeichnet ist. Einige Beweislinien legen es nahe, dass Th1-Typ-Zellen in erster Linie für die pankreatische β-Zell-Zerstörung verantwortlich sind (Übersichtsartikel in Tisch R. et al., Review: Insulindependent Diabetes Mellitus, Cell 85: 291–297 (1996)). Die Verabreichung von IL-4 an NOD-Mäuse, die als ein Lebewesen-Modell von IDDM dienen, reguliert die Th1-Zellpopulation herunter und verzögert signifikant das Einsetzen von Diabetes (Rapoport et al., IL-4 Reverses T cell Proliferation Unresponsiveness and Prevents the Onset of Diabetes in NOD Mice, J. Exp. Med. 178: 87–99 (1993)). Eine weitere derartige Autoimmunkrankheit ist Multiple Sklerose (MS), eine Krankheit, die durch einen Autoimmunangriff auf den die Nervenzellen umgebenden Myelin-Schaft gekennzeichnet ist. Studien bei Menschen mit MS haben belegt, dass die Verschlimmerung von MS mit dem Vorliegen von Autoantigen-spezifischen Th1- und Th0-Zellen und ein entsprechender Rückgang mit dem Vorliegen Autoantigen-spezifischer Th2- und Th0-Zellen zusammenhängen (Correale J. et al., Patterns of cytokine secretion by autoreactive proteolipid protein-specific T cell clones during the course of multiple sclerosis, J. Immunol. 154: 2959–2968 (1995)). Mäuse mit experimenteller Autoimmun-Encephalomyelitis (EAE), ein Lebewesen-Modell für MS, zeigen ebenfalls die Th1-Zell-Polarisation (Cua DJ, Hinton DR und Stohlman SA, J. Immunol. 155: 4052–4059 (1995)). Ein indirekter Beweis aus einer Studie im EAE-Modell legt es nahe, dass IL-4 eine kritische Rolle bei der Abschwächung der Krankheit spielt, die aus einer Behandlung mit einem tolerogenen. Peptid resultiert (Brocke S. et al., Treatment of experimental encephalomyelitis with a tolerogenic peptid analogue of myelin basic protein, Nature 379: 343–346 (1996)).
Weitere Autoimmun-Krankheiten wie Rheumatoide Arthritis (RA) stellen ebenfalls Ziele für IL-4-basierte Therapien dar. Lebewesen-Modelle von RA haben ein Disgleichgewicht von Zellprofilen, welches gegen Th1-Zellen ankämpft, aufgezeigt, und in Mäusen, die TNF-α überexprimieren, haben anti-TNF-α-Antikörper eine Verminderung der Krankheit belegt, was es nahe legt, dass IL-4-Therapien, die zu einer Herunterregulierung von Th1-Zellpopulationen führen, einen anti-TNF-α-Effekt ebenfalls aufweisen können (siehe Feldmann M. et al., Review: Rheumatoid Arthritis, Cell 85: 307–310 (1996)).
Psoriasis vulgaris ist eine chronische dermatologische Störung, die durch Infiltration befallener Haut mit Monozyten und T-Zellen gekennzeichnet ist. Einige Berichte zeigen an, dass psoriatische Hautverletzungs-T-Zellen und PBL vorrangig vom Th1-Phänotyp sind (Uyemura K, Yamamura M, Fivenson DF, Modlin RL, Nickoloff BJ, The cytokine network in lesional and lesion-free psoriatic skin is characterized by a T-helper type 1 cellmediated response, J Invest Dermatol. 101: 701–705 (1993); Schlaak JF, Buslau M, Jochum W, Hermann E, Girndt M, Gallati H, Meyer zum Bischenfelde KH, Fleischer B, T cells involved in psoriasis vulgaris belong to the Th1 subset, J. Invest Dermatol, 102: 145–149 (1994)). Ferner ist bei Monomethylfumarat, einer Arznei, von der berichtet worden ist, dass sie von klinischem Nutzen für Patienten mit Psoriasis ist, gezeigt wurden, dass es selektiv eine Th2-Zytokin-Sekretion aus PBMC stimuliert (de Jong R, Bezemer AC, Zo merdijk TP, van de Pouw-Kraan T, Ottenhoff TH, Nibbering PH, Selective stimulation of T helper 2 cytokine responses by the anti-psoriasis agent monomethylfumarate, Eur J Immunol. 26: 2067–2074 (1996)). Daher wäre von IL-4 zu erwarten, die Th-Polarisation umzukehren und von klinischem Nutzen bei Psoriasis zu sein.
Bestimmte infektiöse Krankheiten werden mit polarisierten Th-Zell-Reaktionen auf das infektiöse Agens in Zusammenhang gebracht. Th2-Reaktionen sind in einigen Fällen mit einer Resistenz gegen das infektiöse Agens in Zusammenhang gebracht worden. Ein Beispiel ist Borrelia burgdorferi, das infektiöse Agens für die Lyme-Krankheit. Mit B. burgdorferi infizierte Menschen zeigen vorherrschend ein Th1-artiges Zytokin-Profil (Oksi J, Savolainen J, Pene J, Bousquet J, Laippala P, Viljanen MK, Decreased interleukin-4 and increased gamma interferon production by peripheral blood mononuclear cells of patients with Lyme borreliosis, Infect. Immun. 64: 3620–3623 (1996)). In einem Maus-Modell von B. burgdorferi-induzierter Arthritis wird die Krankheitsresistenz mit einer IL-4-Produktion in Zusammenhang gebracht, während die Empfänglichkeit dafür mit einer INF-γ-Produktion in Zusammenhang gebracht wird (Matyniak JE, Reiner SL, T helper phenotype and genetic susceptibility in experimental Lyme disease, J Exp Med 181(3): 1251–1254 (1995); Keane-Myers A, Nickell SP, Role of IL-4 and IFN-gamma in modulation of immunity to Borrelia burgdorferi in mice, J Immunol. 155: 202–2028 (1995)). Eine Behandlung von B. burgdorferi-infizierten Mäusen mit IL-4 verstärkt die Resistenz gegen die Infektion (Keane-Myers A, Maliszewski CR, Finkelman FD, Nickell SP, Recombinant IL-4 treatment augments resistance to Borrelia burdorferi infection in both normal susceptible and antibody-deficient susceptible mice, J Immunol. 156: 2488–2494 (1996)).
Von IL-4 ist berichtet worden, dass es einen direkten Effekt auf die Inhibierung des Wachstums von Lymphomen und Leukämien aufweist (Akashi K, The role of interleukin-4 in the negative regulation of leukemia cell growth, Leuk Lymphoma 9: 205–9 (1993)). Beispielsweise ist von IL-4 berichtet worden, dass es Apoptose in Zellen aus Patienten mit akuter lymphoblastischer Leukämie induziert (Manabe A et al., Interleukin-4 induces programmed cell death (apoptosis) in cases of high-risk acute lymphoblastic leukemia, Blood 83: 1731–7 (1994)) und das Wachstum von Zellen aus Patienten mit nicht-Hodgkin's B-Zelllymphomen inhibiert (Defrance T. et al., Antiproliferative effects of interleukin-4 on freshly isolated non-Hodgkin malignant B-lymphoma cells, Blood 79: 990–6 (1992)).
Von IL-4 ist auch berichtet worden, dass es Aktivitäten zeigt und ergibt, welche nahe legen, dass es von klinischem Nutzen bei Osteoarthritis wäre. Osteoarthritis ist eine Krankheit, bei der der Abbau von Knorpelmasse die primäre Pathologie ist (Sack KE, Osteoarthritis, A continuing challenge, West J Med 163: 579–86 (1995); Oddis CV, New perspectives on osteoarthritis, Am J Med 100: 10S–15S (1996)). IL-4 inhibiert TNF-α und die IL-1-β-Produktion durch Monozyten und Synoviozyten aus Patienten mit Osteorarthritis (Bendrups A, Hilton A, Meager A und Hamilton JA, Reduction of tumor necrosis factor alpha and interleukin-1 beta levels in human synovial tissue by interleukin-4 and glucocorticoid, Rhematol Int 12: 217–20 (1993); Seitz M. et al., Production of interleukin-1 receptor antagonist, inflammatory chemotactic proteins, and prostaglandin E by rhematoid and osteoarthritic synoviocytes-regulation by IFN-gamma and IL-4, J Immunol 152: 2060–5 (1994)). Außerdem ist von IL-4 berichtet worden, dass es direkt den Knorpelabbau in ex vivo-Knorpelauspflanzungen blockiert (Yeh LA, Augstine AJ, Lee P, Riviere LR und Sheldon A, Interleukin-4, an inhibitor of cartilage breakdown in bovine articular cartilage explants, J Rheumatol 22: 1740–6 (1995)). Diese Aktivitäten legen nahe, dass IL-4 bei Osteoarthritis von klinischem Nutzen wäre.
Allerdings ist die klinische Anwendung von IL-4 wegen seiner akuten Toxizität eingeschränkt, die sich als ein Gefäß-Lecksyndrom manifestiert (Margolin K. et al., Phase II Studies of Human Recombinant Interleukin-4 in Advanced Renal Cancer and Malignant Melanoma, J. Immunotherapy 15: 147–153 (1994)). Es gibt keinen Stand der Technik in der Literatur, welcher den Mechanismus des akuten toxischen Effekts von IL-4 beschreibt, und es werden auch keine Analoga oder Mutanten von IL-4 beschrieben, die immunoregulatorische Aktivität, aber eine verringerte akute Toxizität aufweisen.
Mutante IL-4-Proteine ("Muteine") sind bekannt. Das IL-4-Mutein IL-4/Y124D ist ein T-Zell-Antagonist (Kruse N, Tony HP, Sebald W, Conversion of human interleukin-4 into a high affinity antagonist by a single amino acid replacement, Embo J 11: 3237–44 (1992)).
Therapeutische Anwendungen von IL-4, die in Patenten oder Patentanmeldungen vorgefunden werden, schließen die folgenden ein: Die Anwendung von IL-4 zur Potenzierung von Antikrebseffekten chemotherapeutischer Mittel, insbesondere bei Hodgkin's Krankheit und nicht-Hodgkin's Lymphomen (siehe WO 96/07422); die Anwendung antigenischer Fragmente von IL-4 zur Erzeugung von Antikörpern zur Behandlung von auf IL-4 bezogenen Krankheiten durch Unterdrückung oder Nachahmung der Bindungsaktivität von IL-4 (siehe WO 95/24481) und zu Nachweis, Messung und Immunoreinigung von IL-4 (siehe WO 93/17106); zur Induzierung der Differenzierung von Vorstufen-B-Zellen zu Immunoglobulin-ausscheidenden Zellen, wobei die reifen B-Zellen zum Wiederaufbau der Immunfunktion bei Immun-beeinträchtigten Patienten angewandt werden (siehe WO 94/04658); bei Verwendung in Kombination mit IL-10 als eine Therapie zur Behandlung von Leukämie, Lymphomen, Darmentzündungskrankheiten und von Hyperempfindlichkeit vom verzögerten Typ (z. B. von Magengeschwür-Colitis und Crohn's Krankheit) (siehe WO 94/04180); eine Behandlung von HIV-Infektion durch Verabreichung von IL-4 zur Inhibierung viraler Replikation in Monozyten und Makrophagen und zur Erhöhung ihrer Zytotoxizität gegenüber einigen Tumorzellen (siehe WO 94/09179); zur Stimulierung einer Hautfibroblast-Fortpflanzung durch Behandlung von Wunden bei diabetischen und Immuno-beeinträchtigten Patienten (siehe WO 92/11861); zur Steigerung der Primärimmunreaktion bei Verabreichung bakterieller, toxoider und viraler Impfstoffe, besonders von Tetanus-Toxoidimpfstoff (siehe WO 92/11030); zur Inhibierung von mit IL-2 induzierter Fortpflanzung von B-Zell-Bösartigkeiten, besonders von chronischer lymphozytischer Leukämie, nicht-Hodgkin's bösartigen Lymphomen (siehe WO 92/10201); Anwendung von IL-4 zur Behandlung von Melanomen, renalen und basalen Zellkarzinomen (siehe WO 92/04049).
Die Patent-Literatur offenbart IL-4-Proteine und einige Muteine, jedoch keine, die auf eine IL-4-Therapie mit verringerten Nebenwirkungen gerichtet wären. US 5 017 691 ("das '691-Patent") von Lee et al. ist auf Säugetier-Proteine und -Muteine von menschlichem IL-4 gerichtet und offenbart sowohl B-Zell-Wachstumsfaktor-Aktivität als auch T-Zell-Wachstumsfaktor-Aktivität. Es werden Nucleinsäuren, die für Polypeptide codieren, die eine IL-4-Aktivität ergeben, sowie die Polypeptide selbst und Verfahren zu deren Herstellung offenbart. Muteine zum Wild-Typ-IL-4 an Aminosäure-Positionen werden offenbart, die ihre Befähigung zur Stimulierung von sowohl einer B- als auch einer T-Zell-Fortpflanzung in vitro beibehalten. Allerdings legt nichts bei Lee nahe, was auf T-Zell-selektive IL-4-Muteine, eine vorweggenommene Aktivierung von EC's oder auf eine Neigung zu Leckagen bei Endotheliazellen schließen lassen könnte und mit einer Verabreichung von IL-4 einhergehen würde. Somit ist IL-4 selbst nicht als eine therapeutische Modalität wegen dessen die Dosis limitierender Toxizität befähigt.
In US 5 013 824 sind hIL-4-Peptid-Derivate aus 6 bis 40 Aminosäuren des nativen hIL-4 beschrieben. Es sind auch Immunogene offenbart, die Konjugate der Peptide und Träger umfassen. Die Träger schließen Erythrozyten, Bakteriophagen, Proteine, synthetische Partikel oder eine Substanz mit der Befähigung zur Auslösung einer Antikörper-Produktion gegen das konjugierte Peptid ein. Es werden keine Muteine von IL-4 offenbart.
WO 96/04306-A2 offenbart Einzel-Muteine, die Antagonisten und partielle Agonisten von hIL-2 und hIL-13 sind. Es werden keine Daten bezüglich IL-4 offenbart. In WO 95/27052 sind Spleiß-Mutanten von IL-2 und IL-4, enthaltend Exone 1, 2 und 4, offenbart.
Es besteht ein Bedarf für ein verbessertes IL-4-Molekül, das verringerte Toxizität aufweist und allgemeiner toleriert wird.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung ist auf menschliche IL-4-Muteine gerichtet, die gemäß Wild-Typ-IL-4 nummeriert sind und T-Zell-Aktivierungsaktivität, aber eine verringerte Endothelialzell-Aktivierungsaktivität aufweisen. Insbesondere handelt es sich um menschliche IL-4-Muteine, in denen die an der Oberfläche freigelegten Reste der D-Helix des Wild-Typ-IL-4 mutiert sind, wodurch das entstandene Mutein die T-Zell-Fortpflanzung und eine verringerte IL-6-Sekretion aus HUVECs, relativ zu Wild-Typ-IL-4, verursacht. Durch die vorliegende Erfindung wird ein weniger toxisches IL-4-Mutein bereitgestellt, wodurch sich eine größere therapeutische Anwendungsbreite des vorliegenden Interleukins ergibt.
Ferner ist die Erfindung auf IL-4-Muteine mit Ein-, Zwei- und Dreifach-Mutationen gerichtet, dargestellt durch die Designatoren R121A, R121D, R121E, R121F, R121H, R121I, R121K, R121N, R121P, R121T, R121W; Y124A, Y124Q, Y124R, Y124S, Y124T; Y124A/S125A, T13D/R121E; und R121T/E122F/Y124Q, wenn diese gemäß Wild-Typ-IL-4 (His = 1) nummiert werden. Die Erfindung schließt auch Polynucleotide, die für die Muteine der Erfindung codieren, Vektoren, die die Polynucleotide enthalten, transformierte Wirtszellen, pharmazeutische Zusammensetzungen, die die Muteine umfassen, und therapeutische Behandlungsverfahren ein.
Die Erfindung ist auch auf einen Vektor gerichtet, der das Polynucleotid umfasst, das ein Mutein der vorliegenden Erfindung eincodiert, wobei der Vektor die Exprimierung eines menschlichen IL-4-Muteins mit T-Zell-Aktivierungsaktivität, aber verringerter Endothelialzell-Aktivierungsaktivität dirigiert und zur Transfizierung eines Ziel-Organismus und anschließenden in vivo-Exprimierung des genannten menschlichen IL-4-Muteins befähigt ist, für das durch das genannte Polynucleotid codiert wird.
Die Erfindung ist auch auf ein Verfahren zur Auswahl eines menschlichen IL-4-Muteins gerichtet, das gemäß Wild-Typ-IL-4 nummeriert ist und T- Zell-Aktivierungsaktivität, aber verringerte Endothelialzell-Aktivierungsaktivität aufweist, worin die auf der Oberfläche freigelegten Reste der D-Helix des Wild-Typ-IL-4 mutiert sind, wodurch das entstandene Mutein die T-Zell-Fortpflanzung und eine verringerte IL-6-Sekretion aus HUVECs, relativ zum Wild-Typ, verursacht.
Die Erfindung ist auch auf ein Verfahren zur Behandlung von Patienten, die in Konflikt mit einer mit IL-4 behandelbaren Krankheitsbedingung geraten sind, durch Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines menschlichen IL-4-Muteins gerichtet, das gemäß Wild-Typ-IL-4 nummeriert ist und T-Zell-Aktivierungsaktivität, aber verringerte Endothelialzell-Aktivierungsaktivität aufweist. Das Verfahren ist anwendbar, wobei die mit IL-4-behandelbare Krankheitsbedingung eine Autoimmunstörung, Krebs, eine infektiöse Krankheit, Knorpel- und Psoriasis-Störungen darstellt.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine Aminosäure-Sequenz (SEQ ID NO: 1) von reifem menschlichen Wild-Typ-IL-4, das in der vorliegenden Studie zur Anwendung gelangt. Helices sind unterstrichen und der Reihe nach mit A, B, C und D markiert. Positionen, die bei Mutation Zell-selektive IL-4-Agonisten ergaben, sind fett gedruckt angegeben.
2 ist eine grafische Darstellung des T-Zell-selektiven Agonist-Konzepts.
3 ist eine zusammengesetzte Dosis-Reaktion-Kurve für selektive Agonist-Muteine im HUVEC-IL-6-Sekretionsassay. Versuchsgruppe A: O, Wild-Typ-IL-4; •, R121E; ∇, R121P;
, R121T/E122F/Y124Q. Versuchsgruppe B: O, Wild-Typ-IL-4; •, Y124Q; ∇, Y124R;
, Y124A/S125A.
4 sind individuelle Dosis-Reaktion-Kurven selektiver Agonist-Muteine im HUVEC-IL-6-Sekretionsassay: Versuchsgruppe A: O, Wild-Typ-IL-4; •, R121E. Versuchsgruppe B: O, Wild-Typ-IL-4; •, R121P. Versuchsgruppe C: O, Wild-Typ-IL-4; •, Y124Q. Versuchsgruppe D: O, Wild-Typ-IL-4; • Y124R. Versuchsgruppe E: O, Wild-Typ-IL-4; •, Y124A/S125A. Versuchsgruppe F: O, Wild-Typ-IL-4; •, R121T/E122F/Y124Q.
5 ist eine zusammengesetzte Dosis-Reaktion-Kurve selektiver Agonsit-Muteine für die biologische Reaktion von IL-4-Muteinen in 1° T-Zell-Fortpflanzungsassays. Versuchsgruppe A: O, Wild-Typ-IL-4; •, R121E; ∇, R121P;
R121T/E122F/Y124Q. Versuchsgruppe B: O, Wild-Typ-IL-4; •, Y124Y; ∇, Y1214R;
, Y124A/S125A.
6 sind individuelle Dosis-Reaktion-Kurven des 1° T-Zell-Fortpflanzungsassay. Versuchsgruppe A: O, Wild-Typ-IL-4; •, R121E. Ver suchsgruppe B: O, Wild-Typ-IL-4; •, R121P. Versuchsgruppe C: O, Wild-Typ-IL-4; •, Y124Q. Versuchsgruppe D: O, Wild-Typ-IL-4; • Y124R. Versuchsgruppe E: O, Wild-Typ-IL-4; •, Y124A/S125A. Versuchsgruppe F: O, Wild-Typ-IL-4; •, R121T/E122F/Y124Q.
7 sind individuelle Dosis-Reaktion-Kurven, die den Antagonismus von IL-4-induzierter IL-6-Sekretion auf HUVEC durch die T-Zell-selektiven Agonist-IL-4-Muteine R121E (•) und Y124Q (∇) darstellen. Die Dosisreaktion des IL-4-Antagonist R121D/Y124D (O) ist als Vergleich enthalten.
8A, 8B sind individuelle Dosis-Reaktion-Kurven: Versuchsgruppe A zeigt die biologische Reaktion des R121D-Muteins in einem 1° T-Zell-Fortpflanzungsassay (O = IL-4, • = R121D); Versuchsgruppe B zeigt die Unfähigkeit von R121D zur Induzierung der IL-6-Sekretion auf HUVEC (O = IL-4, • = R121D).
9A sind die individuellen Dosis-Reaktion-Kurven für IL-4 (O) und für die T-Zell-selektiven Agonist-Muteine R121E (Δ) und für T13D/R121E (
) im 1° T-Zell-Fortpflanzungsassay.
9B sind individuelle Dosis-Reaktion-Kurven, die den Antagonismus der IL-4-induzierten IL-6-Sekretion auf HUVEC durch die T-Zell-selektiven IL-4-Agonist-Muteine R121E (Δ) und T13D R121E (
) darstellen.
Beschreibung der bevorzugten Ausgestaltungen
A. Hintergrund
Mit IL-4 ist dargelegt worden, dass es eine Vielzahl zellulärer Reaktionen in vitro mediiert, einschließlich verschiedener Efekte auf B-Zellen, T-Zellen und Monozyten sowie auf Endothelialzellen (Maher DW, Davis I, Boyd AW, Morstyn G: Human intrleukin-4: an immunomodulator with potential therapeutic applications, Prog Growth Factor Res 3: 43–56, 1991; Powrie F, Coffman RL: Cytokine regulation of T cell function: potential for therapeutic intervention, Immunol Today 14: 270–4, 1993). Insbesondere stellen die Heraufregulierung des Vaskular-Zell-Adhäsionsmoleküls-1 (VCAM-1; (Swerlick RA, Lee KH, Li LJ, Sepp NT, Caughman SW, Lawley TJ: Regulation of vascular cell adhesion molecule 1 on human dermal microvascular endothelial cells, J Immunol 149: 698–705, 1992)) und die Induktion von IL-6 (Colotta F, Sironi M, Borre A, Luini W, Maddalena F, Mantovani A: Interleukin 4 amplifies monocyte chemotactic protein and interleukin 6 production by endothelial cells, Cytokine 4: 24–8, 1992) und von Monozyt-Chemoattractant-Protein-1 (MCP-1; Colotta F, Sironi M, Borre A, Luini W, Maddalena F, Mantovani A: Interleukin 4 amplifies monocyte chemotactic protein and interleukin 6 production by endothelial cells, Cytokine 4: 24–8, 1992; Rollins BJ, Prober JS: Inter leukin-4 induces the synthesis and secretion of MCP-1/JE by human endothelial cells, Am J Pathol 138: 1315–9, 1991)) direkte Efekte von IL-4 auf gezüchteten Endothelialzellen dar; die Heraufregulierung von VCAM-1 korreliert mit der gestiegenen Adhäsion von Lymphozyten sowohl in vitro (Carlos TM, Schwartz BR, Kovach NL, Yee E, Rosa M, Osborn L, Chi-Rosso G, Newman B, Lobb R, Rosso M et al.: Vascular cell adhesion molecule-1 mediates lymphocyte adherence to cytokine-activated cultured human endothelial cells; Blood 76: 965–70, 1990; Thornhill MH, Wellicome SM, Mahiouz DL, Lanchbury JS, Kyan-Aung U, Haskard DO: Tumor necrosis factor combines with IL-4 or IFN-gamma to selectively enhance endothelial cell adhesiveness for T cells. The contribution of vascular cell adhesion molecule-1-dependent and -independent binding mechanisms, J Immunol 146: 592–8, 1991) als auch in vivo (Briscoe DM, Cotran RS, Pober JS: Effects of tumor necrosis factor, lipopolysaccharide, and IL-4 on the expression of vascular cell adhesion molecule-1 in vivo. Correlation with CD3+ T cell infiltration, J Immunol 149: 2954–60, 1992).
Das IL-4-Mutein IL-4/Y124D (Substitution der Asparaginsäure für Tyrosin an Position 124) ist ein T-Zell-Antagonist (Kruse N, Tony HP, Sebald W: Conversion of human interleukin-4 into a high affinity antagonist by a single amino acid replacement, Embo J 11: 3237–44, 1992). In vivo-Versuche, die von den Erfindern durchgeführt wurden, haben belegt, dass IL-4/Y124D eine akute Toxizität ähnlich derjenigen von Wild-Typ-IL-4 bei Affen zeigt und ergibt, was eine bisher nicht beschriebene Beobachtung und Erkenntnis darstellt. Die zellulären Vorgänge im Zusammenhang mit sowohl Wild-Typ-IL-4- als auch mit IL-4/Y124D-mediierter Toxizität schließen eine Heraufregulierung von VCAM-1, eine Heraufregulierung von MCP-1 in Serum, Zunahmen bei zirkulierenden Monozyten zusammen mit einer einhergehenden Abnahme bei zirkulierenden Lymphozyten und eine Zunahme des Hämatokrit-Wertes ein. Ähnliche zelluläre Verhaltensabläufe sind in klinischen Versuchsreihen mit IL-4 bei Menschen beobachtet worden (Wong HL, Lotze MT, Wahl LM, Wahl SM: Administration of recombinant IL-4 to humans regulates gene expression, phenotype and function in circulating monocytes, J Immunol 148: 2118–25, 1992). Wegen seiner Eigenschaften als Antagonist von T-Zellen legen es diese Ergebnisse nahe, dass die mit IL-4/Y124D belegten Toxizitäten durch Agonist-Aktivitäten auf Zellen, die sich von T-Zellen unterscheiden, entwickelt und durch diese mediiert werden. Die beobachteten in vivo-Toxizitäten unter Anwendung von IL-4/Y124D und die bekannten Effekte von IL-4 auf Endothelial zellen sind mit dem Mechanismus konsistent, dass die in vivo-IL-4-Toxizität durch direkte Effekte von IL-4 auf dem Gefäß-Endothelium mediiert werden.
Durch diese (und ähnliche) Untersuchungen haben die Erfinder herausgefunden, dass ein neuer IL-4-Rezeptor auf Endothelialzellen ("EC") vorliegen kann. Diese Möglichkeit führte zu Anstrengungen, IL-4-Muteine zu synthetisieren, die T-Zellen, aber nicht EC selektiv aktivieren würden. Während T-Zellen einen IL-4-Rezeptor aus IL-4Rα- und IL-2Rγ-Untereinheiten exprimieren, haben die Erfinder herausgefunden, dass menschliche Nabelader-Endothelialzellen (human umbilical vein endothelial cells = HUVEC) IL-4Rα, aber nicht IL-2Rγ exprimierten. Vernetzungsstudien haben gezeigt, dass 2 Rezeptor-Ketten an der Zelloberfläche von HUVEC exprimiert werden: das Molekulargewicht der einen Kette ist mit IL-4Rα und die zweite Kette ist mit einer Kette mit niedrigerem Molekulargewicht konsistent. Diese Ergebnisse legen es nahe, dass eine neue IL-4-Rezeptorkomponente, die bezüglich ihrer Funktion IL-2Rγ ähnelt, sich aber bei der Sequenz unterscheidet, auf HUVECs exprimiert wird. Die Unterschiede in den spezifischen Molekularstrukturen zwischen diesen beiden Rezeptoren wurden somit ausgenutzt, um eine IL-4-Variante zu erzeugen, die selektiv für den einen Rezeptor gegenüber dem anderen (z. B. einem T-Zell-selektiven Agonist) ist.
In 2 ist das selektive Agonist-Konzept grafisch dargestellt. Es zeigt den T-Zell-IL-4-Rezeptor auf der IL-4Rα/IL-2Rγ-Untereinheit und einen Endothelialzell-IL-4-Rezeptor aus der IL-4Rα/γ-artigen Rezeptor-Untereinheit. Obwohl hier lediglich zur Veranschaulichung zusammen dargestellt, werden die beiden Rezeptoren für IL-4 auf unterschiedlichen Zell-Typen exprimiert. Der T-Zell-Rezeptor ist aus IL-4Rα und IL-2Rγ zusammengesetzt; die IL-4-Bindung induziert eine Rezeptor-Heterodimer-Bildung, die zu einer zellulären Signalisierung führt. IL-4-induzierte Rezeptor-Heterodimer-Bildung tritt in ähnlicher Weise auf ECs auf, mit der Ausnahme, dass der Rezeptor für IL-4 aus IL-4Rα und aus einer γ-artigen Rezeptorkomponente zusammengesetzt ist. Die γ-artige Rezeptorkomponente unterscheidet sich von IL-2Rγ. T-Zell-selektive IL-4-Agonisten sind diejenigen Varianten von IL-4, die ihre Fähigkeit zur Wechselwirkung mit dem T-Zell-Rezeptor IL-4Rα/IL-2Rγ beibehalten, aber unfähig zur Induzierung einer Heterodimerisierung und somit zur Signalisierung der Nicht-T-Zell-Rezeptor-IL-4Rα/γ-artigen Untereinheit sind. Derartige T-Zell-selektive IL-4-Agonisten behalten ihre Fähigkeit zur Wechselwirkung mit IL-4Rα bei; es ist deren Fähigkeit zur Unterscheidung zwischen IL-2Rγ und der γ-artigen Untereinheit, welche ihnen ihre Zell-selektiven Aktivierunaseigenschaften verleiht.
Die 2 Komponenten der T-Zell-Rezeptoren, IL-4Rα und IL-2Rγ, gelangen in Kontakt mit unterschiedlichen Regionen des IL-4-Moleküls, und daher haben die Erfinder ihren Blick auf eine kleine Region von IL-4 gerichtet, um diese zu modifizieren. Unter der Hypothese, dass die neue Rezeptor-Untereinheit in Kontakt mit der gleichen Region von IL-4 gelangt, wie dies mit IL-2Rγ der Fall ist, führten die Erfinder eine Anzahl von Substitutionen in der D-Helix, insbesondere bei den Resten 121, 124 und 125, durch.
Die D-Helix ist mit sowohl IL-2Rγ als auch mit dem vermutlichen neuen Rezeptor auf HUVEC in Zusammenhang gebracht worden (ganz spezifisch ist das IL-4-Mutein R121D/Y124D ein HUVEC-Antagonist). Muteine, die Modifikationen zur D-Helix von IL-4 enthalten (an den Resten 110 bis 126; His = 1), wurden bezüglich ihrer Fähigkeit zur Stimulierung von entweder einer T-Zell-Fortpflanzung oder einer menschlichen Nabelader-Endothelialzell-(HUVEC)-Sekretion von IL-6 ausgesiebt. Muteine, die eine differenziellere Reaktion auf T-Zellen relativ zu HUBEC induzierten, wurden durch weitere Mutagenese noch weiter charakterisiert.
Ein Anfangsraster der D-Helix wurde unternommen, um die potentiellen Wechselwirkungsflächen zu ermitteln. Außerdem wurden Alanin-Rasterungssubstitutionen der AB-Schleife ebenfalls erzeugt, da es bei dieser Region nahe liegt, dass sie in die Wechselwirkung des Zytokin-Ligand und der mit der D-Helix wechselwirkenden Rezeptor-Untereinheit verwickelt wird. Insbesondere wurden die an der Oberfläche freigelegten Reste Glu-110, Asn-111, Glu-114, Arg-115, Lys-117, Thr-118, Arg-121, Glu-122, Tyr-124, Ser-125 und Lys-126 als Ziel-Reste zur Untersuchung eingesetzt und stellen bevorzugte Ziele für eine Mutationsanalyse dar. Die Stellen 118 bis 126 sind die bevorzugteren, und die Stellen 121 bis 125 sind am meisten bevorzugt. Vergleiche zwischen IL-2, IL-4, IL-7 und IL-15 in dieser Region identifizieren auch die Unterschiede zwischen IL-4 und IL-2, IL-7 und IL-15 und legen möglicherweise spezifische Reste nahe, die für die HUVEC-Rezeptor-Wechselwirkung verantwortlich sind. Aus einer Anordnung zwischen IL-2 und IL-4 abgeleitete spezifische Substitutionen wurden in IL-4 eingeführt. Diese schlossen ein: Arg-115 zu Phe; Lys-117 zu Asn; Glu-122 zu Phe; Lys-126 zu Ile; und 3 gleichzeitige Veränderungen von Arg-121 zu Thr, Glu-122 zu Phe und Tyr-124 zu Gln.
Mutationen wurden mit Stellen-dirigierter Mutagenese auf menschlicher Wild-Typ-IL-4-cDNA eingeführt. Korrekte Clone wurden zu einem Expressionsvektor subcloniert, der sich zur Exprimierung in einem heterologen System (z. B. in E. Coli, Baculovirus oder in CHO-Zellen) eignet. Gereinigte Mutei ne wurden in T-Zell-Fortpflanzungs- und HUVEC-Zytokin-Sekretionsassays getestet (IL-6). Unterschiedliche Reaktionen, die durch die individuelle Muteine zwischen diesen Assays entweder beim EC₅₀-Wert oder bei der Maximalreaktion (Plateau) erzeugt werden, zeigen Mutationen an, die diese Aktivitäten bewirken. In spezifischer Weise legen Muteine, die eine relativ stärkere Reaktion im T-Zell-Assay (gegen Wild-Typ-IL-4) im Vergleich zur Reaktion auf HUVEC (gegen Wild-Typ-IL-4) stimulieren, Positionen nahe, die wichtiger zur Wechselwirkung von IL-4 mit IL-2Rγ als die Wechselwirkung von IL-4 mit dem neuen HUVEC-IL-4-Rezeptor sind. Weitere Analyse und Mutagenese (z. B. kombinatorische Änderungen, Substitution bei allen Aminosäuren) der identifizierten Positionen produzieren ein IL-4-Mutein mit selektiven Agonist-Eigenschaften für den T-Zell-IL-4-Rezeptor. Dieses Protein stellt ebenfalls einen selektiven Antagonist für IL-4-induzierte HUVEC-Reaktionen dar.
B. Definitionen
Hierin beschrieben sind neue Muteine und ein Mechanismus zur Ableitung neuer IL-4-Muteine mit selektiven Agonist-Eigenschaften auf T-Zellen und mit verringerter Toxizität. Eine ähnliche Strategie kann zur Identifizierung eines T-Zell-selektiven Antagonist angewandt werden.
Wie hierin verwendet, bedeutet "Wild-Typ-IL-4" IL-4, sei es nativ oder rekombinant, das die normalerweise auftretende 129er-Aminosäure-Sequenz von nativem menschlichen IL-4 aufweist, wie dargestellt, z. B. in 1.
Wie hierin verwendet, bedeutet "IL-4-Mutein" ein Polypeptid, worin spezifische Substitutionen am menschlichen reifen Interleukin-4-Protein durchgeführt worden sind. Wie hierin spezifisch offenbart, ist der Arginin-Rest (R) an Position 121 ("Arg-121"), nummeriert gemäß Wild-Typ-IL-4, mit Alanin (A), Aspartat (D), Glutamat (E), Phenylalanin (F), Histidin (H), Isoleucin (I), Lysin (K), Asparagin (N), Prolin (P), Threonin (T) oder mit Tryptophan (W) substituiert; oder der Glutamat (E)-Rest an Position 122 ist mit Phenylalanin (F) substituiert; oder der Tyrosin-Rest an Position 124 ist mit Alanin (A), Glutamin (Q), Arginin (R), Serin (S) oder mit Threonin (T) substituiert; oder der Serin (S)-Rest an Position 125 ist mit Alanin (A) substituiert. Die vorliegenden, am meisten bevorzugten IL-4-Muteine weisen eine zu Wild-Typ-IL-4 identische Aminosäure-Sequenz an den anderen, nicht substituierten Resten auf. Allerdings können die IL-4-Muteine der vorliegenden Erfindung auch durch Aminosäure-Insertionen, -Löschungen, -Substitutionen und -Modifikationen an einer oder mehreren Stellen in oder an den weiteren Resten der nativen IL-4-Polypeptid-Kette gekennzeichnet sein. Gemäß der vorliegenden Erfindung ergeben derartige Insertionen, Löschungen, Substitutionen und Modifikationen ein IL-4-Mutein, das seine T-Zell-selektive Aktivität beibehält, während es eine verringerte Fähigkeit zur Aktivierung der Endothelialzellen aufweist.
Es werden konservative Modifikationen und Substitutionen an weiteren Positionen von IL-4 (d. h. an denjenigen, die eine minimale Auswirkung auf die Sekundär- oder Tertiärstruktur des Muteins ergeben) bevorzugt. Solche konservativen Substitutionen schließen die von Dayhoff in The Atlas of Protein Sequence and Structure 5 (1978) und von Argos in EMBO J. 8: 779–785 (1989) beschriebenen ein. Beispielsweise stellen Aminosäuren, die zu einer der folgenden Gruppen gehören, konservative Änderungen dar:

– Ala, Pro, Gly, Gln, Asn, Ser, Thr;
– Cys, Ser, Tyr, Thr;
– Val, Ile, Leu, Met, Ala, Phe;
– Lys, Arg, His;
– Phe, Tyr, Trp, His; und
– Asp, Glu.

Es werden auch Modifikationen oder Substitutionen bevorzugt, mit denen keine Stellen zur zusätzlichen intermolekularen Vernetzung oder inkorrekten Disulfid-Bindungsbildung eingeführt werden. Beispielsweise ist von IL-4 bekannt, dass es 6 Cys-Reste auf den Wild-Typ-Positionen 3, 24, 46, 65, 99 und 127 aufweist.
Unter "nummeriert gemäß Wild-Typ-IL-4" wird verstanden, dass eine gewählte Aminosäure bezüglich der Position identifiziert wird, an der diese Aminosäure im Normalfall im Wild-Typ-IL-4 auftritt. Werden Insertionen oder Löschungen am IL-4-Mutein durchgeführt, erkennt der Fachmann an, dass das Ser (S), das im Normal an Position 125, nummeriert gemäß Wild-Typ-IL-4, auftritt, bezüglich seiner Position im Mutein verschoben sein kann. Allerdings kann der Ort des verschobenen Ser (S) rasch durch Inspektion und Korrelation der flankierenden Aminosäuren mit denjenigen, die Ser im Wild-Typ-IL-4 flankieren, bestimmt werden.
Die IL-4-Muteine der vorliegenden Erfindung können mit einem im Stand der Technik bekannten geeigneten Verfahren hergestellt werden. Solche Verfahren schließen den Aufbau einer DNA-Sequenz, die die IL-4-Muteine der vorliegenden Erfindung eincodieren, und die Exprimierung dieser Sequenzen in einem geeignet transformierten Wirt ein. Mit dem vorliegenden Verfahren werden rekombinante Muteine der vorliegenden Erfindung hergestellt. Aller dings können die Muteine der vorliegenden Erfindung auch, obgleich weniger bevorzugt, durch chemische Synthese oder eine Kombination chemischer Synthesen und rekombinanter DNA-Technologie hergestellt werden.
In einer Ausführungsform eines rekombinanten Verfahrens zur Herstellung eines Muteins der vorliegenden Erfindung wird eine DNA-Sequenz durch Isolierung oder Synthese einer DNA-Sequenz aufgebaut, die das Wild-Typ-IL-4 eincodiert und dann das Codon für Arg121 zu einem Codon für Alanin (A), Aspartat (D), Glutamat (E), Phenylalanin (F), Histin (H), Isoleucin (I), Lysin (K), Asparagin (N), Prolin (P), Threonin (T) oder für Tryptophan (W) durch Stellen-spezifische Mutagenese verändert. Diese Verfahrenstechnik ist gut bekannt. Siehe z. B. Mark et al., "Site-specific Mutagenesis Of The Human Fibroblast Interferon Gene", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, S. 5662–66 (1984); US 4 588 585 .
Ein weiteres Verfahren zum Aufbau einer DNA-Sequenz, die die IL-4-Muteine der vorliegenden Erfindung eincodiert, wäre die chemische Synthese. Beispielsweise kann ein Gen, das das gewünschte IL-4-Mutein eincodiert, mit chemischen Mitteln unter Anwendung eines Oligonucleotid-Synthetisiergeräts synthetisiert werden. Derartige Oligonucleotide werden auf Basis der Aminosäure-Sequenz des gewünschten IL-4-Muteins entworfen, wobei vorzugsweise diejenigen Codons ausgewählt werden, die in der Wirtszelle begünstigt sind, in welcher das rekombinante Mutein produziert wird. Diesbezüglich ist es gut bekannt, dass der genetische Code degeneriert ist – dass für eine Aminosäure durch mehr als 1 Codon codiert werden kann. Beispielsweise wird für Phe (F) durch zwei Codons, TTC oder TTT, für Tyr (Y) durch TAC oder TAT und für His (H) durch CAC oder CAT codiert. Für Trp (W) wird durch das Einzelcodon, TGG, codiert. Demzufolge wird anzuerkennen sein, dass es für eine gegebene DNA-Sequenz, die ein besonderes IL-4-Mutein eincodiert, viele DNA-Degenerat-Sequenzen gibt, die für das IL-4-Mutein codieren. Beispielsweise wird anzuerkennen sein, dass es zusätzlich zur bevorzugten DNA-Sequenz für das in SEQ ID NO: 3 dargestellte Mutein R121E viele Degenerat-DNA-Sequenzen gibt, die für das dargesellte IL-4-Mutein codieren. Diese Degenerat-DNA-Sequenzen werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen. Daher bedeuten "Degenerat-Varianten davon" im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung alle DNA-Sequenzen, die für ein besonderes Mutein codieren.
Die DNA-Sequenz, die das IL-4-Mutein der vorliegenden Erfindung eincodiert, kann, ob sie durch Stellen-dirigierte Mutagenese, Synthese oder weitere Verfahren hergestellt wird, auch DNA-Seauenzen einschließen, die eine Signal-Sequenz eincodieren, oder sie kann diese auch nicht einschlie ßen. Eine derartige Signal-Sequenz sollte, falls vorliegend, eine sein, die durch die Zelle erkannt wird, die zur Exprimierung des IL-4-Muteins gewählt ist. Diese kann prokaryotisch, eukaryotisch oder eine Kombination der beiden sein. Sie kann auch die Signal-Sequenz von nativem IL-4 sein. Der Einschluss einer Signal-Sequenz hängt davon ab, ob es erwünscht ist, das IL-4-Mutein aus den rekombinanten Zellen auszuscheiden, in denen es hergestellt wird. Sind die gewählten Zellen prokaryotische, ist es im allgemeinen bevorzugt, dass die DNA-Sequenz eine Signal-Sequenz nicht eincodiert. Sind die gewählten Zellen eukaryotische, ist es im allgemeinen bevorzugt, dass eine Signal-Sequenz eincodiert wird, und es ist am meisten bevorzugt, dass die Wild-Typ-IL-4-Signal-Sequenz eingesetzt wird.
Standardverfahren können zur Synthese eines Gens angewandt werden, das ein IL-4-Mutein gemäß der vorliegenden Erfindung eincodiert. Beispielsweise kann die komplette Aminosäure-Sequenz eingesetzt werden, um ein rückübersetztes Gen aufzubauen. Ein DNA-Oligomer, das eine für IL-4-Mutein codierende Nucleotid-Sequenz enthält, kann synthetisiert werden. Beispielsweise können einige kleine Oligonucleotide, die für Anteile des gewünschten Polypeptids codieren, synthetisiert und dann ligasiert werden. Die individuellen Oligonucleotide enthalten in typischer Weise 5'- oder 3'-Überhänge zum komplementären Zusammenbau.
Sobald sie (durch Synthese, Stellen-dirigierte Mutagenese oder ein weiteres Verfahren) zusammengebaut sind, werden die DNA-Sequenzen, die ein IL-4-Mutein der vorliegenden Erfindung eincodieren, in einen Expressionsvektor eingebaut und operativ mit einer Expressions-Steuerungssequenz verbunden, die sich zur Exprimierung des IL-4-Muteins im gewünschten transformierten Wirt eignet. Der saubere Zusammenbau kann durch Nucleotid-Sequenzierung, Restriktionskartierung und Exprimierung eines biologisch aktiven Polypeptids in einem geeigneten Wirt bestätigt werden. Wie es zum Erhalt hoher Exprimierungsniveaus eines transfizierten Gens in einem Wirt im Stand der Technik gut bekannt ist, muss das Gen operativ mit den Transkriptions- und Translations-Expressions-Steuerungssequenzen verbunden werden, die funktional im gewählten Expressionswirt sind.
Die Wahl der Expressions-Steuerungssequenz und des Expressionsvektors hängt von der Wahl des Wirts ab. Eine breite Vielfalt von Expressionswirt/Vektor-Kombinationen kann angewandt werden. Geeignete Expressionsvektoren für eukaryotische Wirte schließen z. B. Vektoren, umfassend Expressions-Steuerungssequenzen aus SV40, Rinder-Papillomavirus, Adenovirus und aus Cytomegalovirus, ein. Geeignete Expressionsvektoren für bakterielle Wirte schließen bekannte bakterielle Plasmide, wie Plasmide aus E. coli, einschließlich col E1, pCR1, pER32z, pMB9 und deren Derivate, Plasmide eines breiteren Wirtsbereichs, wie RP4, Phagen-DNAs, z. B. die zahlreichen Derivate von Phage lambda, z. B. NM989 und weitere DNA-Phagen, wie M13 und filamentöse einzelstrangige DNA-Phagen, ein: Geeignete Expressionsvektoren für Hefezellen schließen das 2 μ-Plasmid und Derivate davon ein. Geeignete Vektoren für Insektenzellen schließen pVL941 ein. Bevorzugt wird pFastBac^TM I (GibcoBRL, Gaithersburg, MD), Cate et al., "Isolation Of The Bovine And Human Genes For Mullerian Inhibiting Substance And Expression Of The Human Gene In Animal Cells", Cell 45, S. 685–98 (1986).
Außerdem können jegliche einer breiten Vielfalt von Expressions-Steuerungssequenzen in diesen Vektoren zur Anwendung gelangen. Derartige geeignete Expressions-Steuerungssequenzen schließen die Expressions-Steuerungssequenzen ein, die mit strukturellen Genen der vorhergehenden Expressionsvektoren zusammenhängen. Beispiele geeigneter Expressions-Steuerungssequenzen schließen z. B. die frühen und späten Promotoren von SV40 oder von Adenovirus, das Lac-System, das Trp-System, das TAC- oder TRC-System, die Hauptoperator- und -promotorregionen von Phage lambda, z. B. PL, die Steuerungsregionen von fd-Überzugsprotein, den Promotor für 3-Phosphoglycerat-Kinase oder für weitere glycolytische Enzyme, die Promotoren von saurer Phosphatase, z. B. PhoA, die Promotoren des Hefe-α-Paarungssystems, den Polyhedron-Promotor von Baculovirus und weitere Sequenzen, von denen es bekannt ist, dass sie die Exprimierung von Genen prokaryotischer oder eukaryotischer Zellen oder von deren Viren steuern, und verschiedene Kombinationen davon ein.
Jeder geeignete Wirt kann zur Herstellung der IL-4-Muteine der vorliegenden Erfindung verwendet werden, einschließlich Bakterien, Fungi (einschließlich Hefen), Pflanzen, Insekten, Säugern oder weiterer geeigneter Lebewesenzellen oder -zelllinien, sowie transgenischer Lebewesen oder Pflanzen. Insbesondere können diese Wirte gut bekannte eukaryotische und prokaryotische Wirte, wie Stämme von E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, Fungi, Hefe, Insektenzellen wie Spodoptera frugiperda (Sf9), Lebewesenzellen wie Chinesische Hamster-Eierstock (Chinese hamster ovary = CHO)- und Maus-Zellen wie NS/O, Afrikanische Grünaffen-Zellen wie COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40 und BNT 10, und menschliche Zellen sowie Pflanzenzellen in Gewebekultur einschließen. Zur Lebewesen-Zellexpression werden CHO-Zellen und COS 7-Zellen in Kulturen und insbesondere die CHO-Zelllinie CHO (D HFR-) bevorzugt.
Es sollte natürlich klar sein, dass nicht alle Vektoren und Expressions-Steuerungssequenzen gleich gut zur Exprimierung der hierin beschriebenen DNA-Sequenzen funktionieren. Auch funktionieren nicht alle Wirte gleich gut mit dem gleichen Expressionssystem. Allerdings kann der Fachmann eine Auswahl unter diesen Vektoren, Expressions-Steuerungssequenzen und Wirten ohne unangemessenen Versuchsaufwand treffen. Beispielsweise muss bei der Auswahl eines Vektors der Wirt in Betracht gezogen werden, weil der Vektor in ihm repliziert werden muss. Die Kopieanzahl des Vektors, die Fähigkeit zur Steuerung dieser Kopieanzahl und die Exprimierung jeglicher weiterer Proteine, die durch den Vektor eincodiert werden, wie antibiotische Marker, sollten ebenfalls in Betracht gezogen werden. Beispielsweise schließen bevorzugte Vektoren zur Anwendung in der vorliegenden Erfindung diejenigen ein, die es ermöglichen, dass die DNA, die die IL-4-Muteine eincodiert, bei der Kopieanzahl amplifiziert wird. Solche amplifizierbaren Vektoren sind im Stand der Technik gut bekannt. Sie schließen beispielsweise Vektoren ein, die fähig sind, durch DHFR-Amplifikation (siehe z. B. Kaufman, US 4 470 461 , Kaufman und Sharp, "Construction Of A Modular Dihydrofolate Reductase cDNA Gene: Analysis Of Signals Utilized For Efficient Expression", Mol. Cell. Biol 2, S. 1304–19 (1982)) oder durch Glutamin-Synthetase ("GS")-Amplifikation (siehe z. B. US 5 122 464 und die veröffentlichte EP 338 841 ) amplifiziert zu werden.
Zur Auswahl einer Expressions-Steuerungssequenz sollte auch eine Vielzahl von Faktoren in Betracht gezogen werden. Diese schließen beispielsweise die relative Stärke der Sequenz, ihre Steuerbarkeit und ihre Kompatibilität mit der tatsächlichen DNA-Sequenz, die das IL-4-Mutein der vorliegenden Erfindung eincodiert, insbesondere im Hinblick auf potentielle Sekundärstrukturen ein. Die Wirte sollten durch Einbeziehung ihrer Kompatibilität mit dem gewählten Vektor, der Toxizität des Produkts, für das durch die DNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung codiert wird, deren Sekretionscharakteristika, deren Fähigkeit zur korrekten Faltung der Polypeptide, deren Fermentations- oder Züchtungserfordernisse und der Leichtigkeit der Reinigung der Produkte, für die durch die DNA-Sequenzen codiert wird, ausgewählt werden.
Innerhalb dieser Parameter kann der Fachmann verschiedene Vektor/Expressions-Steuerungssequenz/Wirt-Kombinationen auswählen, welche die gewünschten DNA-Sequenzen bei Fermentation oder in einer Lebewesenkultur in großem Maßstab, z. B. unter Anwendung von CHO- oder COS 7-Zellen, exprimieren.
Die gemäß der vorliegenden Erfindung erhaltenen IL-4-Muteine können in Abhängigkeit vom Wirtsorganismus, der zur Herstellung des Muteins eingesetzt wird, glycosyliert oder unglycosyliert sein. Falls Bakterien als der Wirt gewählt sind, wird dann das hergestellte IL-4-Mutein unglycosyliert sein. Eukaryotische Zellen glycosylieren andererseits die IL-4-Muteine, obwohl vielleicht nicht in der gleichen Weise, wie natives IL-4 glycosyliert wird.
Das IL-4-Mutein, das durch den transformierten Wirt hergestellt wird, kann gemäß geeigneten Verfahren gereinigt werden. Verschiedene Verfahren sind zur Reinigung von IL-4 bekannt. Siehe z. B. US 5 013 824 , 5 017 691 und WO 96/04306 A2. Bevorzugt wird eine Immunoaffinitätsreinigung. Siehe z. B. Okamura et al., "Human Fibroblastoid Interferon: Immunosorbent Column Chromatography And N-Terminal Amino Acid Sequence", Biochem. 19, S. 3831–35 (1980).
Die biologische Aktivität der IL-4-Muteine der vorliegenden Erfindung kann mit geeigneten Verfahren analysiert werden, die im Stand der Technik bekannt sind. Solche Assayverfahren schließen Antikörper-Neutralisiation antiviraler Aktivität, Induktion von Protein-Kinase-, Oligoadenylat-2,5-A-Synthetase- oder Phosphodiesterase-Aktivitäten ein, wie beschrieben in EP-B1-41 313. Derartige Assayverfahren schließen auch immunomodulatorische Assays (siehe z. B. US 4 753 795 ), Wachstumsinhibierungsassays, T-Zell-Fortpflanzung, Induktion von IL-6 (MCP-1 oder VCAM-1) auf EC und eine Messung der Bindung an Zellen ein, die Interleukin-4-Rezeptoren exprimieren. Siehe auch Spits H, Yssel H, Takebe Y et al., Recombinant Interleukin-4 Promotes the Growth of Human T Cells, J. IMMUNOL 139: 1142–47 (1987).
Das IL-4-Mutein der vorliegenden Erfindung wird mit einer Dosis verabreicht, die ungefähr parallel zu derjenigen oder größer als diejenige verläuft, die in einer Therapie mit nativem oder rekombinanten Wild-Typ-IL-4 zur Anwendung gelangt. Es wird eine wirksame Menge des IL-4-Muteins bevorzugt verabreicht. Eine "wirksame Menge" bedeutet eine Menge mit der Befähigung zur Verhinderung oder Abschwächung der Strenge oder Ausbreitung der Krankheitsbedingung oder Indikation, die behandelt werden. Der Fachmann wird erkennen, dass die wirksame Menge an IL-4-Mutein u. a. von der Krankheit, der Dosis, des Verabreichungszeitplans des IL-4-Muteins, ob das IL-4-Mutein allein oder im Zusammenwirken mit weiteren therapeutischen Mitteln verabreicht wird, von der Serum-Halbwertszeit der Zusammensetzung und vom allgemeinen Gesundheitszustand des Patienten abhängt.
Das IL-4-Mutein wird bevorzugt in einer Zusammensetzung verabreicht, die einen pharmazeutisch zulässigen Träger einschließt. "Pharmazeutisch zulässiger Träger" bedeutet einen Träger, der keine ungünstigen Auswirkungen bei den Patienten verursacht, an die er verabreicht wird. Derartige pharmazeutisch zulässigen Träger sind im Stand der Technik gut bekannt. Bevorzugt sind 2% HSA/PBS bei pH = 7,0.
Die IL-4-Muteine der vorliegenden Erfindung können zu den pharmazeutischen Zusammensetzungen mit gut bekannten Verfahren zubereitet und formuliert werden. Siehe z. B. Remington's Pharmaceutical Science by E. W. Martin, worin geeignete Formulierungen bzw. Zubereitungen beschrieben sind. Die pharmazeutische Zusammensetzung des IL-4-Muteins kann in einer Vielzahl von Formen, einschließlich einer Flüssigkeit, eines Gels, lyophilisiert oder einer weiteren geeigneten Form, formuliert und zubereitet sein und werden. Die bevorzugte Form hängt von der besonderen Indikation, die behandelt wird, ab und ist für den Fachmann erkennbar.
Die IL-4-Mutein-Pharmazeutikum-Zusammensetzung kann oral, durch Aerosol, intravenös, intramuskulär, intraperitoneal, intradermal oder subkutan oder in jeder weiteren geeigneten Weise verabreicht werden. Die bevorzugte Verabreichungsart hängt von der besonderen Indikation, die behandelt wird, ab und ist für den Fachmann erkennbar. Die pharmazeutische Zusammensetzung des Il-4-Muteins kann zusammen mit weiteren therapeutischen Mitteln verabreicht werden. Diese Mittel können als Teil der gleichen pharmazeutischen Zusammensetzung eingeschlossen oder getrennt vom IL-4-Mutein entweder gleichzeitig oder gemäß einem anderen geeigneten Behandlungszeitplan verabreicht werden. Außerdem kann die IL-4-Mutein enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung als Zusatz zu weiteren Therapien angewandt werden.
Demnach werden durch die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen und Verfahren zur Behandlung von Immunstörungen, Krebs oder Tumoren, von abnormem Zellwachstum oder zur Immunomodulation bei jedem entsprechenden Lebewesen, vorzugsweise einem Säuger, am meisten bevorzugt beim Menschen, bereitgestellt und angegeben. Wie vorher im Abschnitt über den Hintergrund angemerkt, ergibt IL-4 viele Effekte. Einige dieser sind die Stimulation der T-Zell-Fortpflanzung, eine T-Helferzell-Differenzierung, eine Induktion menschlicher B-Zell-Aktivierung und -Fortpflanzung und eine Lymphokindirigierte Immunoglobulinklassen-Verschiebung. Auswirkungen auf das lymphoide System schließen einen Anstieg der Exprimierung von MHC-Klasse II-Antigen (Noelle R. et al., Increased Expression of Ia Antigens on resting B cells: a New Role für B Cell Growth Factor, PNAS USA 81: 6149–53 (1984)) und von CD 23 auf B-Zellen ein (Kikutani H. et al., Molecular Structur of Human Lymphocyte Receptor for Immunoglobulin, Cell 47: 657–61 (1986)). T-Helferzell-Typ 1 (Th1) und -Typ 2 (Th2) sind in die Immunreaktion verwickelt. Stimulierte Th2-Zellen sekretieren IL-4 und blockieren ein Th1-Fortschreiten. Somit ist eine Th1-implizierte Krankheit einer Behandlung durch IL-4 oder durch Analoga davon zugänglich.
Ebenfalls in Betracht gezogen ist die Anwendung der DNA-Sequenzen, die die IL-4-Muteine der vorliegenden Erfindung eincodieren, in Gen-Therapie-Anwendungen. Gen-Therapie-Anwendungen, die in Betracht gezogen werden, schließen eine Behandlung solcher Krankheiten ein, bei denen von IL-4 erwartet wird, dass damit eine wirkungsvolle Therapie durch ihre Immunomodulatoraktivität erzielt wird, z. B. für Multiple Sklerose (MS), Insulin-abhängige Diabetes Mellitus (IDDM), Rheumatoide Arthritis (RA), Systemischen Lupus Erythematosus (SLE), Uveitis, Orchitis, primäre Leberzirrhose, Malaria, Lepra, Lyme-Krankheit (Lyme-Borriolose), Kontaktdermatitis, Psoriasis, B-Zell-Lymphome, akute lymphoblastische Leukämie, nicht-Hodgkin's-Lymphome, Krebs, Osteoarthritis und für Krankheiten, die auf sonstige Weise auf IL-4 oder auf infektiöse Mittel reagieren, die gegen IL-4-mediierte Immunreaktionen empfindlich sind.
Eine örtliche Abgabe der IL-4-Muteine unter Anwendung einer Gen-Therapie kann die Zielfläche mit dem therapeutischen Mittel versorgen. Sowohl in vitro- als auch in vivo-Gen-Therapie-Methodologien werden in Betracht gezogen. Einige Verfahren zur Übertragung potentiell therapeutischer Gene auf definierte Zellpopulationen sind bekannt. Siehe z. B. Mulligan, "The Basic Science Of Gene Therapy", Science 260: 926–31 (1993). Diese Verfahren schließen ein:

1) Direkten Gen-Transfer. Siehe z. B. Wolff et al., "Direct Gene transfer Into Mouse Muscle In Vivo", Science 247: 1465–68 (1990);
2) Liposom-mediierten DNA-Transfer. Siehe z. B. Caplen et al., "Liposome-mediated CFTR Gene Transfer to The Nasal Epithelium Of Patients With Cystic Fibrosis", Nature Med. 3: 39–46 (1995); Crystal, "The Gene As A Drug", Nature Med. 1: 15–17 (1995); Gao und Huang, "Novel Cationic Liposome Reagent For Efficient Transfection Of Mammalian Cells", Biochem. Biophys. Res. Comm. 179: 280–85 (1991);
3) Retrovirus-mediierten DNA-Transfer. Siehe z. B. Kay et al. "In Vivo Gene Therapy Of Hemophilia B: Sustained Partial Correction In Factor IX- Deficient Dogs", Science 262: 117–19 (1993); Anderson, "Human Gene Therapy", Science 256: 808–13 (1992);
4) DNA-Virus-mediiertem DNA-Transfer. Solche DNA-Viren schließen Adenoviren (vorzugsweise Ad-2- oder Ad-5-basierte Vektoren), Herpes-Viren (vorzugsweise Herpes simplex-Virus-basierte Vektoren) und Parvoviren (vorzugsweise "mangelhafter" oder nicht-autonomer Parvovirus-basierte Vektoren, bevorzugter Adeno-verbundener Virus-basierte Vektoren, am meisten bevorzugt AAV-2-basierte Vektoren) ein. Siehe z. B. Ali et. al., "The Use Of DNA Viruses As Vectors For Gene Therapy", Gene Therapy 1: 367–84 (1994); US 4 797 368 und US 5 139 941 .

Die Wahl eines besonderen Vektor-Systems zur Übertragung des Gens von Interesse hängt von einer Vielzahl von Faktoren ab. Einen wichtigen Faktor stellt die Natur der Ziel-Zellpopulation dar. Obwohl retrovirale Vektoren umfänglich untersucht und in einer Anzahl von Gen-Therapieanwendungen eingesetzt worden sind, sind diese Vektoren im allgemeinen ungeeignet zur Infizierung nicht-teilender Zellen. Außerdem weisen Retroviren das Potential zur Onkogenizität (Krebserzeugung) auf.
Adenoviren haben den Vorteil, dass sie einen breiten Wirtsbereich aufweisen, ruhende oder terminal differenzierte Zellen, wie Neuronen oder Hepatozyten, zu infizieren vermögen und im wesentlichen nicht-onkogenisch (nicht krebserzeugend) zu sein scheinen. Siehe z. B. Ali et al., oben, S. 367. Adenoviren scheinen nicht im Wirts-Genom integriert zu werden. Weil sie extrachromosomal existieren, ist das Risiko einer Einreihungsmutagenese größtenteils verringert. Ali et al., oben, S. 373.
Adeno-verbundene Viren zeigen und ergeben ähnliche Vorteile wie adenoviral-basierte Vektoren. Allerdings zeigen und ergeben AAVs eine Stellen-spezifische Integration auf menschlichem Chromosom 19. Ali et al., siehe oben, S. 377.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die IL-4-Mutein-eincodierende DNA der vorliegenden Erfindung in der Gen-Therapie für Autoimmunkrankheiten wie MS, IDDM und RA, infektiöse Krankheiten wie Lyme-Krankheit und Lepra, Krebs, wie nicht-Hodgkin's Lymphome und ALL, Knorpelstörungen, wie Osteoarthritis, und für psoriatische Krankheitsbedingungen wie Psoriasis, angewandt.
Gemäß dieser Ausführungsform wird die Gen-Therapie mit einer die IL-4-Muteine der vorliegenden Erfindung eincodierenden DNA bei einem Patienten, der dieser bedarf, gleichzeitig mit oder unmittelbar nach der Diagnose angewandt.
Dieser Lösungsansatz nutzt den Vorteil der selektiven Aktivität der IL-4-Muteine der vorliegenden Erfindung zur Verhinderung einer unerwünschten Autoimmunstimulierung. Der Fachmann wird anerkennen, dass jeder geeignete Gen-Therapie-Vektor, der IL-4-Mutein-DNA enthält, gemäß dieser Ausführungsform zur Anwendung gelangen kann. Die Verfahrenstechniken zur Erstellung eines derartigen Vektors sind bekannt. Siehe z. B. Ohno et al., oben, S. 784; Chang et al., oben, S. 522. Die Einführung des IL-4-Mutein-DNA-enthaltenden Vektors in die Zielstelle kann mit bekannten Verfahrenstechniken, z. B. wie beschrieben in Ohno et al., oben, S. 784, durchgeführt werden.
Zur besseren Verständlichkeit der vorliegenden Erfindung sind die folgenden Beispiele angegeben. Diese Beispiele dienen lediglich einer Verdeutlichung und sollen in keiner Weise den Umfang der Erfindung einschränken.
Beispiele
Allgemeines
Die Aminosäure-Sequenz von reifem menschlichen IL-4, das in der vorliegenden Studie verwendet wird, ist unten angegeben. Aminosäuren, an denen Substitutionen T-Zell-selektive Agonisten ergaben, sind fett gedruckt angegeben:
Muteine wurden in einem Baculovirus-System exprimiert, zur Homogenität gereinigt und in biologischen Assays bewertet, die eine unterschiedli che IL-4-Rezeptor-Anwendung reflektierten. 2 Assays wurden angewandt, um einen Test bezüglich selektiver Agonistaktivität, IL-4-induziertem HUVEC-IL-5-Sekretionsassay und bezüglich einem 1° T-Zell-Fortpflanzungsassay für eine positive IL-4-Aktivität durchzuführen. Verbindungen, die die Fähigkeit zur Induzierung einer 1° T-Zell-Fortpflanzung, jedoch eine verringerte Fähigkeit zur Induzierung einer IL-6-Sekretion aufweisen, sind T-Zell-selektive IL-4-Agonisten und fallen in den Umfang der vorliegenden Erfindung. In spezifischerer Weise wurden menschliche Nabelader-Endothelialzellen (HUVEC) zur Aktivitätsbewertung des abwechselnden IL-4-Rezeptors (der IL-4Rα/γ-artigen Rezeptorkomponente) angewandt.
Beispiel 1. Herstellung von Muteinen
Muteine wurden durch Stellendirigierte Mutagenese mit Primern erzeugt, die Codons enthielten, die der gewünschten Mutation entsprachen, wie im wesentlichen beschrieben von Kunkel TA, Roberts JD und Zakour RA, "Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection" (1987), Methods Enzymol 154: 367–382. Kurz gesagt, wurde menschliche IL-4-cDNA, enthaltend die Restriktionsenzymstellen Bam HI und Xba I, in den M13-Phagenvektor M13 mp19 (New England Biolabs, Beverly, MA) unter Anwendung der gleichen Stellen subcloniert. Wild-Typ-IL-4-cDNA wurde unter Anwendung der Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction = "PCR") aus einem cDNA-Pool erhalten, der aus mRNA erzeugt wurde, die aus menschlichen peripheralen Blutlymphozyten isoliert wurden, die 24 h lang mit Phorbol-12-myristat-13-acetat (10 ng/mL) induziert wurden. Die eingesetzten PCR-Primer waren für das 5'-Ende des IL-4-Offen-Ablesungsrahmens:
5'-CGC GGA TCC ATG GGT CTC ACC TCC-3' (SEQ ID NO: 22)
und für das 3'-Ende des IL-4-Offen-Ablesungsrahmens:
5'-CGC TCT AGA CTA GCT CGA ACA CTT TGA AT-3' (SEQ ID NO: 23).
Restriktionsenzymstellen BamHI (5'-Ende) und XbaI (3'-Ende) wurden in jedes Oligonucleotid eingebracht und sind kursiv angegeben. Die angewandten PCR-Bedingungen waren 1 Minute bei 94°C, 1 Minute bei 58,7°C und 1 Minute bei 72°C für 25 Zyklen. Die so erhaltene korrekte IL-4-cDNA-Sequenz wurde durch Sequenzierung mit dem Sequenase^® Sequenzier-Kit (Amersham Life Sciences, Arlington Heights, IL) bestätigt, wie vom Hersteller beschrieben. Uracil-enthaltende Einzelstrang-DNA (U-DNA) wurde durch Transformierung des E. coli-Stammes CJ236 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) mit IL-4-cDNA-enthaltendem M13 mp19 erhalten. Es erfolgte eine Stellen-dirigierte Mutagenese, die in allgemeinen Primern, enthaltend 15 Nucleotide, homolog zum Templat U-DNA-5' zu den Codon(s), die als Ziele zur Mutagenase dienten, Nucleotide, die die gewünschte Änderung einverleibten, und enthaltend zusätzliche 10 Nucleotide, homolog zum Templat U-DNA-3' des letzten geänderten Nucleotids, angewandt wurde. Die eingesetzten spezifischen Primer waren:
Regionen mutierter Nucleotide sind unterstrichen. Die Primer wurden mit T4-Polynucleotid-Kinase (New England Biolabs, Beverly, MA) unter Anwendung des Protokolls des Herstellers phosphoryliert. Nach Reassoziieren des Primers an das U-DNA-Templat und Verlängerung mit T7-DNA-Polymerase (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) wurden Zellen des E. coli-Stammes DH5α^TM (GibcoBRL, Gaithersburg, MD) mit 5 μL Reaktionsmischung transformiert und in LB-Medium, enthaltend 0,7% Agar, plattiert. Nach Inkubation bei 37°C wurden Plaquen expandiert, indem ein Einzelplaque herausgepickt und auf 2 mL LB-Medium übertragen und über Nacht bei 37°C gezüchtet wurde. Einzelstrang-DNA wurde unter Anwendung eines M13-Reinigungs-Kit (Qiagen, Inc., Chatsworth, CA) per Protokoll des Herstellers isoliert, und Clone, die die gewünschte Mutation enthielten, wurden durch Sequenzierung der einzelstrangigen DNA unter Anwendung des Sequenase^®-Sequenzier-Kit (Amersham Life Sciences, Arlington Heights, IL) per Protokoll des Herstellers identifiziert. IL-4-Mutein-cDNA aus Replikativ-Form-DNA, entsprechend Plaquen, enthaltend die korrekte mutierte Sequenz, wurden unter Anwendung von BamHI und von XbaI isoliert und zum Plasmidvektor pFastBac^TM1 (GibcoBRL, Gaithers burg, MD) subcloniert. Nach Subclonierung, wurde rekombinante Baculovirus-DNA (nachfolgend bezeichnet als Bacmid) durch Transformierung von pFastBac^TM1, enthaltend die Mutein-cDNA, zum E. coli-Stamm DH10Bac^TM (GibcoBRL, Gaithersburg, MD), erzeugt, wie vom Hersteller beschrieben. Muteine wurden in Spodoptera frugiperda (Sf)9-Zellen unter Anwendung des Bac-zu-Bac-(GibcoBRL, Gaithersburg, MD)-Baculovirus-Expressionssystems exprimiert. Alle Insektenzellinkubationen erfolgten bei 28°C. Kurz gesagt, wurden 2 mL Kulturen von (Sf)9-Zellen mit 5 μL rekombinanter Bacmid unter Verwendung von CellFECTIN (GibcoBRL, Gaithersburg, MD) transfiziert. Der Überstand wurde 60 h nach der Transfektion geerntet und zur Infizierung einer 100 bis 200 mL Kultur von 1 × 10⁶ Sf9-Zellen/mL in Grace's Medium (GibcoBRL, Gaithersburg, MD) eingesetzt. Per Protokoll des Herstellers wurden die Überstände 48 bis 60 h nach der Infektion durch Zentrifugation bei 5000 U/min 10 min lang in einer Sorvall^® RC-5B-Zentrifuge unter Anwendung eines GSA-Rotors (Dupont Instrument Co., Willmington, DE) geerntet und bezüglich des Virus-Titers analysiert (in typischer Weise wurden > 1 × 10⁸ Plaque-bildende Einheiten/mL erhalten). Zur Protein-Produktion wurden 2 bis 3 × 10⁶ Sf9-Zellen/mL in 500 mL SF900 II-Medium (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) bei einer Infizierungsvervielfältigung von 4 bis 10 infiziert, und der Überstand wurde 60 bis 72 h nach der Infektion durch Zentrifugation bei 5000 U/min 10 min lang in einer Sorvall^® RC-5B-Zentrifuge unter Anwendung eines GSA-Rotors (Dupont Instrument Co., Willmington, DE) geerntet und durch eine sterile 0,2 μm Filtereinheit filtriert.
Beispiel 2. Reinigigung der Muteine
Anti-Mensch-IL-4-Monoclonalantikörper C400.1 und C400.17 wurden mit Standardprotokoll aus Mäusen unter Anwendung von rekombinantem menschlichen IL-4 (Genzyme Diagnostics, Cambridge, MA) als Immunogen erzeugt, als Ascites-Flüssigkeit hergestellt, gereinigt und an CNBr-aktivierte Sepharose (Pharmacia Uppsala, Schweden) gemäß Protokoll des Herstellers gekuppelt. Sf9-Zell-Überstände, erzeugt aus Infektion von Sf9-Zellen durch rekombinanten Baculovirus, enthaltend das jeweilige IL-4-Mutein, wurden auf eine 1 mL Säule einer IL-4-Affinitätsmatrix gegeben, mit 100 mM NaHCO₃, 500 mM NaCl, pH = 8,3, und mit Wasser zur Entfernung von Salzen gewaschen und mit 8 Säulenvolumina von 100 mM Glycin, pH = 3,0, eluiert Die Fraktionen wurden in siliconisierten Fläschchen gesammelt, die 0,1 Volumina 1 M Tris, pH = 8,0, enthielten. Mutein-Protein wurde durch Umkehrphasen-Chromatografie an einer Dynamax^®-300 Å-C18-Säule (Rainin Instrument Co., Woburn, MA) mit einem 0 bis 100% Gradient von Puffer A zu B (Puffer A: Wasser; Puffer B: Acetonitril, 0,1% Trifluoressigsäure) weiter gereinigt. Die Fraktionen wurden mit SDS-PAGE bewertet, und die Mutein enthaltenden Fraktionen wurden zur Aufbewahrung lyophilisiert und in steriler Phosphat-gepufferter Salzlösung für Assayverfahren resuspendiert. So gereinigtes Mutein war in typischer Weise eine Einzelbande, wie beobachtet mit SDS-PAGE (Silber-Färbung) und wurde durch Aminosäure-Analyse quantitativ bestimmt (die Genauigkeit beträgt in typischerweise > 90%).
Beispiel 3. 1° T-Zell-Fortpflanzungsassay
Primäre T-Zellen wurden aus Frischblut von Normalspendern erhalten und durch Zentrifugation mit Ficoll-Paque^® Plus (Pharmacia, Upsalla, Schweden) gereinigt, wie im wesentlichen beschrieben von Kruse N., Tony H. P. und Sebald W., "Conversion of human interleukin-4 into a high affinity antagonist by a single amine acid replacement", Embo J. 11: 3237–44 (1992). Die gereinigten peripheralen Blut-Einkernzellen wurden 7 Tage lang mit 10 μg/mL Phytohemagglutinin (Sigma Chemical Co., ST. Louis, MO) inkubiert, durch Zentrifugation geerntet und in RPMI 1640-Medium (GibcoBRL, Gaithersburg, MD) gewaschen. 5 × 10⁴ aktivierte T-Zellen/Vertiefung (PHA-Blasts) wurden mit variierenden Mengen von IL-4 oder von Mutein in RPMI 1640-Medium, enthaltend 10% fötales Rinderserum, 10 mM HEPES, pH = 7,5, 2 mM L-Glutamin, 100 Einheiten/mL Penicillin G und 100 μg/mL Streptomycinsulfat, in Platten mit 96 Vertiefungen 72 h lang bei 37°C inkubiert, mit 1 μCi³H-Thymidin (DuPont NEN^®, Boston, MA)/Vertiefung 6 h lang gepulst, geerntet und bezüglich der Radioaktivität in einem TopCount^TM-Szintillationszähler (Packard Instrument Co., Meriden, CT) gemessen.
Beispiel 4. HUVEC-IL-6-Sekretionsassay
Menschliche Nabelader-Endothelialzellen (HUVEC) wurden von Clonetics^® Corp. (San Diego, CA) erhalten und gemäß Protokollen des Herstellers aufbewahrt. Zellen (Durchlauf 3 bis 6) wurden durch Inkubation mit Trypsin/EDTA geerntet, gewaschen und bei subkonfluenten Dichten in Platten mit 48 Vertiefungen in EGM^®-Medium (Clonetics^® Corp., San Diego, CA), enthaltend Rinderhirnextrakt (bovine brain extract) (BBE; Clonetics^® Corp., San Diego, CA), plattiert. Bei Konfluenz (3–4 Tage bei 37°C) wurde das Medium entfernt und durch ein EGM^®-Medium ohne BBE ersetzt. 24 h später wurden variierende Konzentrationen von IL-4 oder von Mutein zu den Zellen in frischem EGM^® ohne BBE gegeben und weitere 24 h lang inkubiert. Die Überstände wurden geerntet, und die Konzentration von IL-6 wurde mit einem Mensch-IL-6-ELISA analysiert. Die Bedingungen waren identisch, mit der Ausnahme, dass für Antagonist-Assayverfahren variierende Konzentrationen von Mutein auf eine konstante Konzentration von 100 pM IL-4 zugegeben wurden. Kurz gesagt, wurden Immunolon^® 2-Platten mit 96 Vertiefungen (Dynatech Laboratories, Inc., Chantilly, VA) mit 5 μg/mL arti-Mensch-IL-6-Mab, Kat#1618-01 (Genzyme Diagostics, Cambridge, MA), über Nacht bei 4°C überzogen. Mensch-IL-Standard (Genzyme Diagnostics, Cambridge, MA) oder Proben wurden in Duplikaten titriert und mit der überzogenen Platte inkubiert; nach Wäschen wurde der sekundäre Antikörper Kaninchen-anti-Mensch-IL-6-PAb (Caltag Laboratories, South San Francisco, CA, Cat#PS-37) mit einer 1 : 1000 Verdünnung zugegeben. Das Vorliegen von gebundenem Kaninchen-anti-IL-6-PAb wurde mit alkalische Phosphatase-gekuppeltem Esel-anti-Kaninchen-Ig PAb (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA, Kat#711-055-152), verdünnt auf 1 : 2000, nachgewiesen und mit pNPP (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, Kat#N2770 oder N1891) entwickelt. Die Absorption wurde bei 405 nm mit einem Vmax^TM-Kinetik-Mikroplatten-Ablesegerät (Molecular Devices Corp., Menlo Park, CA) abgelesen.
Beispiel 5. Aktivitäten der Muteine
In Tabelle 1 sind die Ergebnisse der Muteine in den beiden oben beschriebenen Assayverfahren zusammengefasst. "EC₅₀, pM" ist die effektive Konzentration, die eine 50%ige Maximalreaktion erzeugt, gemessen in der Konzentration von Picomolen/Liter. Die Aktivität ist eine Funktion von sowohl der Potenz (EC₅₀) als auch der Maximalreaktion (R_max). Zell-selektive Muteine ergaben eine differenzielle Aktivität von entweder einer Relativverringerung bei R_max und/oder einer Relativverringerung der Potenz (Anstieg bei E₅₀) im HUVEC-Assay gegen den T-Zell-Assay. "R_max, Gew.-%" ist die Maximalreaktion, gemessen relativ zu Wild-Typ-IL-4. Gemäß Definition ergibt das Wild-Typ-IL-4 100% Reaktion. Alle Muteine waren aktiv im T-Zell-Fortpflanzungsassay. Die Muteine R121D, R121E, R121P und R121T/E122F/Y124Q waren potenter als das Wild-Typ-IL-4 in diesem Assay, obwohl das Mutein R121T/E122F/Y124Q eine verringerte Maximalreaktion ergab. Die Muteine Y124Q, Y124R und Y124A/S125A ergaben 2 bis 3-fach gesteigerte EC₅₀-Werte gegenüber dem Wild-Typ sowie eine verringerte Maximalreaktion. Allerdings scheinen sie einen beachtlichen Anteil an IL-4-Aktivität auf T-Zellen beizubehalten. Die Muteine R121E, Y124Q und R121T/E122F/Y124Q wiesen keine messbare Aktivität im HUVEC-Assay auf, was diese ganz klar T-Zell-selektiv und somit selektiv für den IL-4-Rezeptor macht, der auf T-Zellen (IL-4Rα/IL-2Rγ) exprimiert wird. Diese Muteine sind IL-4-Antagonisten auf Endothelialzellen, weil sie, obwohl sie im Normalfall mit IL-4Rα wechselwirken, die komplexe IL-4Rα/γ-artige Untereinheit nicht aktivieren. Die Muteine R121P und Y124R zeigen Aktivität im HUVEC-Assay, aber ihre EC₅₀-Werte sind um das 50 bis 150-Fache gesteigert, und sie ergeben verringerte Maximalreaktionen relativ zu ihrer Fähigkeit zur Stimulierung von T-Zellen. Obwohl diese beiden Proteine nicht absolut T-Zell-selektiv erscheinen, ergeben sie eine Bevorzugung für ihre Aktivierung des T-Zell-IL-4-Rezeptors gegenüber dem HUVEC-IL-4-Rezeptor.
Tabelle 1: Muteine mit vorrangiger Aktivität auf T-Zellen gegenüber Endothelialzellen
Beispiel 6. Biologische Reaktion der IL-4-Muteine in HUVEC-Assays
2A und B sind eine Serie von Dosis-Reaktion-Auftragungen der HUVEC-IL-6-Sekretion durch die T-Zell-selektiven Agonisten relativ zu Wild-Typ. IL-4 wurde als interner Vergleich auf jeder Platte eingeschlossen, die zum Assay der Mutein-Aktivität eingesetzt wurde; eine repräsentative Kurve ist dargestellt. 4A ist die Dosis-Reaktion-Kurve für R121E gegen Wild-Typ-IL-4. In ähnlicher Weise sind 4B bis F die Dosis-Reaktion-Kurven für R121P, Y124Q, Q124R, Y124A/S125A bzw. R121T/E122F/Y124Y gegen Wild-Typ-IL-4. Die Aktivitäten sind relativ zu den IL-4-Vergleichsreaktionen normalisiert. Die Muteine R121E, Y124Q und R121T/E122F/Y124Q belegen keine Aktivität in diesem Assay. Die Muteine R121P und Y124R sind, obwohl sie eine teilweise Angonist-Aktivität in diesem Assay ergeben, relativ weniger potent zu Wild-Typ-IL-4, als sie es im 1° T-Zell-Assay sind. Somit belegen sie, trotz ihrer Aktivität, immer noch eine vorrangige Aktivierung des T-Zell-IL-4-Rezeptors.
Beispiel 7. Biologische Reaktion der IL-4-Muteine in 1° T-Zell-Assays
4A und B zeigen Dosis-Reaktion-Kurven der T-Zell-selektiven Agonist-Muteine in einem repräsentativen Assay mit Zellen von einem Normalspender. IL-4 wurde als interner Vergleich auf jeder Platte eingeschlossen, die zum Assay der Mutein-Aktivität eingesetzt wurde; eine repräsentative Kurve ist dargestellt. 6A ist die Dosis-Reaktion-Kurve für R121E gegen Wild-Typ-IL-4. In ähnlicher Weise sind 6B bis F die Dosis-Reaktion-Kurven für R121P, Y124Q, Y124R, Y124A/S125A bzw. R121T/E122F/Y124Q gegen Wild-Typ-IL-4. Die Aktivitäten sind relativ zu den IL-4-Vergleichsreaktionen normalisiert worden. Die Muteine R121E, R121P und R121T/E122F/Y124Q sind potenter als das Wild-Typ-IL-4, obwohl R121T/E122F/Y124Q lediglich ein teilweiser Agonist in diesem Assay ist. Obwohl nicht so potent wie das Wild-Typ-IL-4 in diesem Assay, sind die Muteine Y124Q, Y124R und Y124A/S125A immer noch wirkungsvolle Teil-Agonisten (R_max-Werte von 60 bis 70% des Wild-Typs). In 6 wird die Aktivität relativ zur IL-4-Reaktion in der gleichen Platte für jedes Mutein gesehen. Besonders hinzuweisen ist auf die Muteine R121E und Y124Q, die eine signifikante Aktivität im T-Zell-Assay, jedoch keine erkennbare Aktivität im HUVEC-Assay ergeben. Jedes dieser Muteine ist ein klarer T-Zell-selektiver Agonist.
Beispiel 8. Antagonismus der HUVEC-IL-4-induzierten IL-6-Sekretion durch T-Zell-selektive Muteine
Die T-Zell-selektiven IL-4-Muteine R121E (•) und Y124Q (O) und der IL-4-Antagonist R121D/Y124D (O) (7) wurden gegen eine konstante Konzentration von 100 pM IL-4 titriert. Der IL-4-Antagonist R121D/Y124D antagonisiert IL-4 mit einem K_I von ca. 1,5 nM unter diesen Bedingungen. HUVECs exprimieren IL-2Rγ nicht, sie exprimieren aber die IL-4-Rezeptor γ-artige Untereinheit. Die substituierten Reste von R121E und Y124Q sind in der D-Helx von IL-4 und beeinflussen somit nur Wechselwirkungen von IL-4 mit IL-2Rγ (funktionelle Wechselwirkung) und die γ-artige Untereinheit (keine oder nicht-funktionelle Wechselwirkung), aber sie beeinflussen nicht die Fähigkeit dieser Muteine zur Bindung an IL-4Rα. Somit sind die T-Zell-selektiven Agonisten R121E und Y124Q durch ihre Fähigkeit zur selektiven Wechselwirkung mit IL-2Rγ auf T-Zellen ohne Förderung einer Aktivierung der γ-artigen Rezeptor-Untereinheit auf Endothelialzellen fähig, mit IL-4-induzierten Reaktionen auf diesen Endothelialzellen (K_I von ca. 0,8 bis 1 nM unter diesen Bedingungen) zu konkurrieren. Ein solcher Antagonismus durch T-Zell-selektive IL-4-Muteine kann die Effekte von endogen erzeugtem IL-4 auf Endothelialzellen während einer T-Zell-dirigierten Therapie mit den genannten Muteinen antagonisieren.
Beispiel 9. Biologische Reaktion des IL-4-Muteins R121D
Das IL-4-Mutein R121D (Arg-121 ist substituiert durch Asp) wurde wie beschrieben in den 1° T-Zell- und HUVEC-Assays erzeugt und analysiert. Bezüglich 8A und 8B, sind Daten sowohl für IL-4 (O) als auch für R121D (•) sowohl in den T-Zell- (8A) als auch in den HUVEC-(8B)-Assays dargestellt. Im T-Zell-Assay ergab R121D ein EC₅₀ von ca. 100 pM und einen R_max-Wert von ca. 60% relativ zu Wild-Typ-Il-4. Es war inaktiv im HUVEC-Assay (EC₅₀ = •; R_max = O). Diese Ergebnisse belegen, dass die Einzelsubstitution von Arg-121 von menschlichem IL-4 durch Asp ein Protein ergibt, das selektive Aktivität auf T-Zellen aufweist und jeglicher erkennbaren Aktivität auf Endothelialzellen ermangelt. Obwohl das Mutein R121D ein Teil-Agonist im T-Zell-Assay ist, ist es potenter als das Wild-Typ-IL-4. Wie das Mutein R121E ergibt allerdings R121D keine Aktivität im HUVEC-Assay, wodurch belegt wird, dass es ein klarer T-Zell-selektiver Agonist ist.
Beispiel 10. Biologische Aktivität des IL-4-Muteins T13D/R121E
Das IL-4-Mutein T13D/R121E (Thr-13 ist durch Asp substituiert, zusammen mit Arg-121, das durch Glu substituiert ist) wurde wie beschrieben in den 1° T-Zell- und HUVEC-Assays erzeugt und analysiert. Was ganz spezifisch die 9A bis B betrifft, ergab im T–Zell-Assay (Versuchsgruppe A) das T13D/R121E (
) ein EC₅₀ von ca. 100 pM, ca. 2 bis 3-fach besser als IL-4 (0) oder R121E (Δ), und einen R_max-Wert von 100% relativ zu IL-4. In HUVEC-Antagonist-Assays (Versuchsgruppe B) war das T13D/R121E (
) ein ca. 27-fach potenterer Antagonist der IL-4-Aktivität als R121E (Δ), das jeweils ein IC₅₀ von ca. 2,2 nM gegen ca. 60 nM ergab. Die Substitution von Thr-13 zu Asp steigert die Potenz des T13D/R121E relativ zu R121E (sowohl als ein Agonist im T-Zell-Assay als auch als ein Antagonist im HUVEC-Assay), während die Substitution von Arg-121 zu Glu eine T-Zell-selektive Aktivität auf das T13D/R121E überträgt (voller Agonist im T-Zell-Assay, IL-4-Antagonist im HUVEC-Assay).
Beispiel 11. Bewertung des IL-4-selektiven Agonist im Pathologie-Modell
Ausgewachsene männliche Cynomolgus-Affen (Macaca fasicularis, Charles River Primate Imports, Boston, Mass.), mit einem Gewicht von ca. 4 bis 6 kg wurden für diese Studien herangezogen. Die Lebewesen wurden individuell in Umwelt-gesteuerten Räumen in offenen Drahtkäfigen gehalten und 2 Mal täglich mit Nahrung und nach Belieben mit Wasser versorgt. Jedes Lebewesen wird ca. 12 h vor dem ersten Tag der Studie am Fasten gehalten.
Für jede Studie wurden die Lebewesen mit einer intramuskulären Injektion von Ketamin-Hydrochlorid (Ketaset, 10 mg/kg) betäubt. Die obere Rückenfläche eines jeden Lebewesens wird geschoren und mit einer 70%igen Alkohol-Betadin-Lösung gesäubert. IL-4, IL-4-selektiver Agonist oder Trägermittel (0,2% Humanserumalbumin, HSA) werden intradermal in die Rücken der Lebewesen in einem Volumen von 0,1 mL mit einer 1 mL Tuberculin-Spritze gespritzt. Die gespritzten Stellen liegen um mindestens 10 cm getrennt voneinander vor und werden mit einem unauslöschbaren Marker markiert. Gewebe-Biopsieproben werden mit einem 6 mm Stanz-Biopsiewerkzeug erhalten, und die Proben werden in OCT gelegt und in flüssigem Stickstoff abgeschreckt und gefroren. Biopsien werden 0, 4, 8 und 24 h nach der Injektion erhalten.
Die systemische Reaktion auf IL-4, IL-4-selektiven Agonist oder auf das Trägermittel wird in folgender Weise analysiert. Der Testartikel wird subkutan 2 Mal täglich (im Abstand von ca. 10 bis 12 h) über 4 aufeinanderfolgende Tag in einem Volumen von 0,1 mL/kg mit Dosierungen von 0, 2, 5, 25 oder 250 μg/kg verabreicht, das eine gesamte tägliche Dosismenge von 0, 5, 50 bzw. 500 μg/kg ergibt. Die peripherale Blutprobe wird von jedem Lebewesen vor der ersten Injektion des Trägermittels oder des IL-4 und am Beginn eines jeden Tages der Studie erhalten, und es werden Anteilsmengen bezüglich kompletter Blutzell-Zahlen und -Differenziale analysiert, und es wird eine Fließzytometrie-Analyse der peripheralen Blut-Einkern-Zelloberflächenmarker durchgeführt. Die Restmenge der Blutprobe wird zentrifugiert und Plasma-Anteilsmengen werden bei –70°C zur anschließenden Analyse von Chemokine-Niveaus aufbewahrt.
Gefrorene Schnitte wurden hergestellt und auf Raumtemperatur ins Gleichgewicht gesetzt, an der Luft getrocknet und in Aceton bei 4°C 5 min lang fixiert. Objektträger werden auf 10 mM PBS mit 0,1% BSA 5 min lang übertragen. VCAM-1 wird mit der Anwendung von C313.3, einem monoclonalen Antikörper zu menschlichem VCAM-1, lokalisiert. Ein irrelevantes, Isotypabgeglichenes Immunoglobulin mit der geeigneten Konzentration wird als Negativvergleich herangezogen. Endogenes Biotin wird mit dem Vektor-Biotin- Blockierkit (Vector Laboratories, Burlingame, CA) als Blockierung angewandt. Die Schnitte werden 1,5 h lang bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer mit den angegebenen Antiseren, verdünnt mit PBS mit 0,1% BSA und 1% Normal-Kaninchenserum, inkubiert. Nach 3 Wäschen mit PBS werden die Objektträger mit dem Vektor-ABC-Elite-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers gefärbt, und es wird das Antikörper-Konjugat durch Inkubieren der Objektträger in 3-Amino-9-ethylcarbazol/Wasserstoffperoxid (AEC-Substrat-Kit, Vektor) nachgewiesen. Die Schnitte werden gründlich mit 0,1 M Acetat-Puffer und in destilliertem Wasser gewaschen und in Lerner AQUA-MOUNT (Lerner Laboratories, Pittsburgh, PA) montiert.
Die Specimen werden von zwei unabhängigen Betrachtern in einer Weise mit Blindversuch bewertet, wobei festgelegte Maßstäbe zwischen 0 und 3+ angewandt werden, die entworfen sind, um die Intensität sowie die Verteilung der Färbung zu bewerten. Das Bewertungssystem zur VCAM-1-Expression ist: 0 = abwesende oder schwache Färbung eines gelegentlichen Gefäßes; 1+ = schwache Färbung einiger Gefäße; 2+ = gemäßigte Intensität einer Färbung der meisten Gefäße; 3+ = intensive Färbung der meisten Gefäße. Die Blutgefäße werden in reihenweisen Schnitten identifiziert, die für den von Willebrand-Faktor gefärbt werden (polyclonaer Kaninchen-anti-Mensch-VWF; Dakoplatts, Carpinteria, CA).
Die Analyse der Erythrozyt-Zahl, des Hämatokrits, der Leukozyt-Zahl und der Plättchenzahlen werden an heparinisierten Blutproben mit einem Serono 9000 Blood Analyzer (Baker Diagnostics, Allentown, PA) durchgeführt. Leukozyt-Differenziale werden an Diff-Quick-gefärbten Blutverschmierungen bewertet, wobei insgesamt 200 Zellen gezählt und der Prozentsatz jedes Zelltyps ermittelt werden.
Die Analyse der peripheralen Blut-Einkernzell-(peripheral blood mononuclear cell = PBMC)-Oberflächenmarker wird in der folgenden Weise durchgeführt. Eine 4 mL Probe von heparinisiertem Blut wird in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS, ohne Mg⁺⁺ oder Ca⁺⁺) heparinisiert und auf 4 mL Percoll (1,070 g/mL Dichte) geschichtet. Die Röhrchen werden bei 1800 U/min (Beckman GS-6R) 20 min lang bei 24°C zentrifiziert. Die Lymphozyt enthaltende Schicht wird angesaugt und bei 1100 U/min 10 min lang zentrifugiert. Das entstandene Zell-Pellet wird in 6 mL Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS), enthaltend 0,1% Azid und 5% Ziegenserum, resuspendiert. Anteilsmengen von 1 mL werden zur Zell-Oberflächenmarker-Analyse, wie unten beschrieben, herangezogen.
Antikörper gegen CD2, CD4, CD8, CD11b, CD16, CD25, CD49 und gegen HLA-DR (R&D Systems, Minneapolis MN) werden zur Analyse durch Fließzytometrie herangezogen. 20 μL Anteilsmengen von Marker-Antikörpern werden mit 1 mL Anteilsmengen Zell-Suspension im Dunkeln 60 min lang bei 4°C inkubiert, und die Proben werden zentrifugiert (1000 U/min, 10 min bei 4°C). Die Pellets werden 3 Mal mit 1 mL PBS, enthaltend 0,1% Azid und 5% Ziegenserum, gewaschen, worauf FACs-Analyse folgt.
Plasmaproben, die während jeder Studie erhalten werden, werden bezüglich der Niveaus von MCP-1 mit spezifischem ELISA analysiert. Kurz gesagt, werden Platten mit 96 Vertiefungen (Nunc, Kamstrup, Dänemark) mit 50 μL/Vertiefung Kaninchen-anti-MCP-1 16 h lang bei 4°C überzogen und dann in PBS, pH = 7,5, 0,05% Tween-20 (Wasch-Puffer), gewaschen. Nichtspezifische Bindungsstellen werden mit 2% BSA in PBS (200 μL) blockiert und die Platten 90 min bei 37°C inkubiert. Die Platten werden 3 Mal mit Wasch-Puffer gespült, und es wird verdünnte (rein, 1 : 5 und 1 : 10) Testprobe (50 μL) in Duplikaten zugegeben, worauf 1 h lang bei 37°C inkubiert wird. Die Platten werden 4 Mal gewaschen, und es werden 50 μL/Vertiefung biotinyliertes Kaninchen-anti-MCP-1 45 min lang bei 37°C zugegeben. Die Platten werden 4 Mal gewaschen, Streptavidin-Peroxidase-Konjugat (100 μg/mL) (Dakopatts, Carpinteria, CA) wird zugegeben, und die Platten werden 30 min bei 37°C inkubiert. Die Platten werden 3 Mal gewaschen, und es werden 100 μL Chromogen-Substrat (0,67 mg/mL o-Phenylendiamin-Dihydrochlorid, Dakopatts, Carpinteria, CA) zugefügt. Die Platten werden bei 25°C 6 min lang inkubiert, und die Reaktion wird mit 50 μL/Vertiefung 3 M H₂SO₄-Lösung in Wasch-Puffer plus 2% FCS terminiert. Die Platten werden bei 490 nm in einem ELISA-Ablesegerät abgelesen. Standards sind 0,5 log-Verdünnungen von rekombinantem MCP-1 von 100 ng/mL bis 1 pg/mL (50 μL/Vertiefung). Der ELISA weist konsistent MCP-1-Konzentrationen > 50 pg/mL nach.
Beispiel 12. Behandlung multipler Sklerose mit IL-4-selektivem Agonist
Die Anwendung eines Lebewesen-Modells als eine Vorhersage zur pharmakologischen Anwendbarkeit beim Menschen ist ein gut akzeptiertes Forschungsmittel. Die anfängliche Testung des IL-4-selektiven Agonist für Multiple Sklerose (MS) wird in einem Seidenäffchen-Modell unter Anwendung eines rekombinanten menschlichen IL-4-selektiven Agonist-Proteins durchgeführt. Diese Studien werden durchgeführt, um die Auswirkung einer prophylaktischen und therapeutischen Behandlung auf die Krankheitsinduktion und -strenge für sowohl die akute Symptomologie als auch für die chronische abklingende-erneut ersetzende Krankheit zu untersuchen.
Experimentelle Autoimmunencephalomyelitis (EAE) ist eine CD4+ T-Zell-mediierte Autoimmun-Entzündungskrankheit des Zentralnervensystems. Die Induktion von EAE wird in Seidenäffchen (C. jacchus) mit einem Gewicht von 300 bis 400 g durch Immunisierung mit 200 mg frisch-gefrorenem, nach dem Tod gewonnenen menschlichen Gehirn-Weißmasse-Homogenat (BH), emulgiert mit kompletten Freund's Adjuvans (CFA), enthaltend 3 mg/mL abgetötetes Mycobacterium tuberculosis, wie beschrieben in Massacesi et al., Ann. Neurol. 37: 519 (1995), induziert. Am Tag der Immunisierung und erneut 2 Tage später werden 10¹⁰ inaktivierte Bordetella pertussis-Organismen in 10 mL Salzlösung verdünnt und intravenös verabreicht.
EAE wird durch klinische und pathologische Kriterien bewertet. Ein standardisiertes Bewertungssystem wird angewandt, um die Strenge der klinischen Krankheit anzugeben: 0 = normale neurologische Befunde; 1 = Lethargie, Anarexie, Gewichtsverlust; 2 = Ataxie und entweder Paraparese/Monoparese, senorischer Verlust oder Hirnstamm-Syndrom, einschließlich Starrblick-Lähmung oder Blindheit; 3 = Paraplegie oder Hemiplegie; 4 = Quadriplegie.
Magnetische Resonanzbildbildung ((Magnetic resonance imaging = MRI) hat sich als nutzbringende Verfahrenstechnik zur Charakterisierung von frühen wie auch späten Immun-mediierten Verletzungen von MS erwiesen (Stewart et al., Brain 114: 1069 (1991)). MRI wird angewandt, um Lebewesen nach Immunisierung zu bewerten, um das Fortschreiten der Krankheit im Zeitablauf zu verfolgen und aufzuzeichnen. MRI-Messwerte werden an einem Picker International NMR Cryogenic '2000-System, das bei einer Feldstärke von 0,15 Tesla betrieben wird, mit einer Empfänger-Spule mit einer Öffnung von 15 cm gesammelt, um die Bilder zu erhalten. Vielschnitt-Spin-Echo- und Inversion-Rückgewinnungspuls-Sequenzen werden angewandt. Es werden Echo-Verzugszeiten von entweder 40 und 60 ms oder von 40 und 80 ms in den Spin-Echo-Sequenzen angewandt. In den Inversion-Rückgewinnung-Sequenzen beträgt die 180 bis 90-Interpuls-Verzögerung 400 ms.
Die Seidenäffchen werden mit Ketamin-Hydrochlorid betäubt und in den Scanner eingebracht, wobei ein Laser angewandt wird, der zur Patient-Anordnung so verfügbar ist, dass die inneren Canthi der Augen senkrecht zur Richtung des statischen Magnetfelds angeordnet werden. Die Lebewesen werden vor der Immunisierung und dann täglich vom Tag 9 an nach der Immunisierung gerastert. Vor der Rasterung an jedem Tag werden die Lebewesen bezüglich Anzeichen einer neurologischen Beeinträchtigung überprüft.
Die Lebewesen werden zu verschiedenen Zeiten nach der Immunisierung geopfert. Das CNS (Zentralnervensystem) wird entfernt und in 10%igem Forma lin fixiert. Paraffin-Schnitte von Gehirn- und Rückenmarkstrang werden zubereitet und mit Hematoxylin und Eosin gefärbt. Jeder koronale Gehirn- oder horizontale Rückenmarkstrang-Schnitt wird bezüglich histopathologischer Befunde einer Entzündung und Demyelination gemäß einer willkürzlichen Skala analysiert: Entzündung 0 = keine Entzündung vorhanden, + = seltene perivaskuläre Stulpen/Durchschnittsgesamtschnitt; ++ = mäßige Anzahl perivaskulärer Stulpen/Schnitt; sie können eine Hirnhautentzündung aufweisen; +++ = weit verbreitete perivaskuläre Stulpenbildung und parenchymale Infiltration durch Entzündungszellen. Demyelinationsbewertung: 0 = eine Demyelination vorhanden; + = seltene Demyelinationsherde; ++ = gemäßigte Demyelination; +++ = extensive Demyelination mit großen ineinander fließenden Verletzungen.
Für Vorbehandlungsstudien an akuter Krankheitspathologie wird die Testarznei subkutan bei einem Dosierungsbereich von 1 bis 500 μg/kg gemäß einem Dosierungsregimen von 1 Verabreichung pro Tag bis 1 Verabreichung pro Woche vor dem Einsetzen von Krankheitssymptomen verabreicht. Zur therapeutischen Intervention bei existierender Krankheit wird der Testartikel subkutan bei einem Dosierungsbereich von 1 bis 500 μg/kg gemäß einem verlängerten Dosierungsregimen von 1 Behandlung pro Tag bis 1 Behandlung pro Woche über einen Zeitraum von einigen Monaten verabreicht.
Beispiel 13. Behandlung rheumatoider Arthritis
Rheumatoide Arthritis (RA) ist eine schwächende Entzündungskrankheit, bei der eine chronische Aktivierung verweilender und infiltrierender Synovialzellen eine Zerstörung von Knorpel und Knochen verursacht und zu Fibrose und Funktionsverlust führt. Zytokine, die aus aktivierten T-Zellen freigesetzt werden, sollen eine Rolle bei der Aufrechterhaltung der chronischen Entzündungsreaktion spielen.
RA wird in DBA/1-Mäusen mit Typ II-Kollagen induziert, wie beschrieben von Joosten et al., Arthritis & Rheumatism 39: 797 (1996). Kollageninduzierte Arthritis (CIA) wird durch Immunisierung der Mäuse über intradermale Injektion an der Basis des Schwanzes mit einer 100 μL Emulsion, enthaltend 100 μg Kollagen, induziert. Am Tag 21 wird den Lebewesen eine intraperitoneale Booster-Injektion vom Typ II-Kollagen (100 μg), gelöst in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS), gegeben.
Die Bewertung der CIA wird durch visuelle Untersuchung der Mäuse bezüglich des Auftretens von Arthritis in den peripheralen Gelenken durchgeführt, und es werden Bewertungen für die Strenge der Arthritis zugeordnet. Mäuse werden angesehen, eine Arthritis aufzuweisen, wenn signifikante Ände rungen in Rötung und/oder Schwellung in den Zehen oder in anderen Teilen bei einem Minimum von 2 Pfoten bemerkt werden.
Die klinische Strenge der Arthritis wird auf einer Skala von 0 bis 2 für jede Pfote gemäß Änderungen bei Rötung und Schwellung bewertet (0 = keine Änderung, 0,5 = signifikant, 1,0 = moderat, 1,5 = deutlich und 2,0 = strenge maximale Schwellung und Rötung. Die Bewertung erfolgt mit mindestens 2 Betrachtern unter Einschluss von Blindversuchen.
Am Ende der Studie werden einige der Lebewesen geopfert, und es wird ein Pfoten- und Gelenksgewebe zur pathologischen und histopathologischen Untersuchung erhalten. Das Gewebe wird zur immunohistochemischen Färbung (gefrorene Schnitte) verarbeitet oder in Paraffin fixiert und eingebettet, geschnitten und mit H&E zur Analyse zellulärer Infiltration gefärbt.
Die Bewertung eines Maus-Analog des IL-4-selektiven Agonists der vorliegenden Erfindung im CIA-Modell wird mit einem Maus-äquivalenten Proteinmolekül durchgeführt. Ein Fachmann ist dazu befähigt, die Maus-IL-4-Struktur mit der menschlichen IL-4-Struktur zu vergleichen, parallele Maus-IL-4-Muteine zu erzeugen und jegliche notwendigen Anpassungen auf Basis von Reaktionen in in vitro-Assays durchzuführen, wobei Zelllinien, die entweder eine IL-4Rα/IL-2Rγ- oder eine IL-4Rα/γ-artige Untereinheit exprimieren, in analoger Weise zu derjenigen angewandt werden, die für menschliche IL-4-Muteine mit T-Zellen und HUVEC zur Anwendung gelangen. Lebewesen werden 1 Tag vor der Booster-Verabreichung von Kollagen dosiert und auf einem Dosierungsregimen im Bereich von 1 Mal täglich bis 1 Mal wöchentlich für die Dauer der Studie (40+ Tage lang) gehalten. Die Lebewesen werden mit einem Konzentrationbereich des IL-4-selektiven Agonist im Bereich von 1 bis 100 μg/kg dosiert.
Beispiel 14. Behandlung von Insulin-abhängiger Diabetes mellitus (IDDM)
Es gibt Belege in der Literatur für eine Th1-Zell-Beteiligung an IDDM bei Menschen- und Lebewesen-Modellen der Krankheit beim Menschen. Nonobese-Diabetiker-(NOD)-Mäuse werden herangezogen, um die Wirksamkeit eines Maus-IL-4-Äquivalents von IL-4-selektivem Agonist bei der Behandlung von IDDM zu untersuchen. Ein Fachmann ist befähigt, die Maus-IL-4-Struktur mit der Mensch-IL-4-Struktur zu vergleichen, parallele Maus-IL-4-Muteine zu erzeugen und jegliche notwendige Anpassungen auf Basis von Reaktionen in in vitro-Assays durchzuführen, wobei Zelllinien, die entweder eine IL-4- IL-4Rα/IL-2Rγ- oder eine IL-4Rα/γ-artige Untereinheit exprimieren, in analoger Weise zu derjenigen angewandt werden, die für Mensch-IL-4-Muteine mit T-Zellen und HUVEC zur Anwendung gelangen. Vordiabetiker-NOD-Mäuse (ca. 7 Wochen alt) zeigen ein proliferatives Unreaktionsvermögen in vitro nach T-Zell-Stimulierung. Der Zeitablauf dieses Unreaktionsvermögens steht nicht in Zusammenhang mit Insulitis und dauert bis zum Einsetzen von Diabetes an, die in einem Alter von 24 Wochen auftritt.
Die Bewertung des IL-4-selektiven Agonist in NOD-Mäusen wird in ähnlicher Weise wie in den Studien durchgeführt, über die von Rapoport et al. in J. Exp Med. 178: S. 87 (1993) berichtet wird. Den NOD-Mäusen wird Testmaterial bei einem Alter von ca. 3 Wochen gespritzt, worauf ein Dosierungsregimen von 1 täglicher Behandlung oder 1 wöchentlicher Behandlung über einen Zeitraum von 12 Wochen erfolgt, bis die Mäuse 15 Wochen alt sind. Eine Vergleichsgruppe von Lebewesen erhält eine Behandlung mit einem inerten Protein-Äquivalent.
Die Mäuse werden bezüglich Glycosurie mit Tes-Tape getestet und bezüglich Diabetes gemäß der Bestimmung von Glycosurie über mindestens 2 aufeinander folgende Wochen diagnostiziert. Am Ende von 52 Wochen werden die Lebewesen geopfert, um verschiedene Organe und Gewebe zur Pathologie-Bewertung zu erhalten. Gewebe aus der Bauchspeicheldrüse, aus submandibularen Speicheldrüsen und aus der Niere von jeder Maus wird in Paraffin fixiert und eingebettet, geschnitten und gefärbt. Eine Aldehyd-Fuchsin-Färbung von Bauchspeicheldrüsen-Schnitten wird angewandt, um das Ausmaß zu untersuchen, bis zu welchem insulitische Infiltrate eine verringerte Masse von granulierten β-Zellen aufweisen. Milz-Leukozyten werden mit FAC-Rasteranalysen unter Anwendung von anti-Thy-1,2-, anti-CD4- und von anti-CD8-mabs in Ascites gezählt, wie beschrieben von Zipris et al. J Immunol 146, S. 3763 (1991).
Weitere Ausführungsformen der Erfindung werden für den Fachmann erkennbar. Die vorliegende Erfindung vermittelt die technische Lehre, wie Muteine ebenfalls zu erhalten sind, die hierin nicht spezifisch beschrieben sind, aber T-Zell-Aktivierungsfähigkeit und verringerte Endothelialzell-Aktivierungsfähigkeit aufweisen, und dadurch fallen diese Muteine in den Inhalt und Rahmen der Erfindung. Das hierin beschriebene Konzept und der experimentelle Lösungsansatz sollten auch auf weitere Zytokine anwendbar sein, wobei von heterologen multimeren Rezeptor-Systemen, insbesondere von IL-2 und verwandten Zytokinen (z. B. von IL-7, IL-9 und von IL-15), von IL-10, Interferon-α und von Interferon-γ Gebrauch gemacht wird.
SEQUENZEN
Die folgenden Sequenzen sind in der vorliegenden Anmeldung enthalten:
SEQ ID NO: 1: hIL-4 (Aminosäure)
SEQ ID NO: 2: hIL-4 (Aminosäure, cDNA)
SEQ ID NO: 3: R121A (Aminosäure, cDNA)
SEQ ID NO: 4: R121D (Aminosäure, cDNA)
SEQ ID NO: 5: R121E (Aminosäure, cDNA)
SEQ ID NO: 6: R121F (Aminosäure, cDNA)
SEQ ID NO: 7: R121H (Aminosäure, cDNA)
SEQ ID NO: 8: R121I (Aminosäure, cDNA)
SEQ ID NO: 9: R121K (Aminosäure, cDNA)
SEQ ID NO: 10: R121N (Aminosäure, cDNA)
SEQ ID NO: 11: R121P (Aminosäure, cDNA)
SEQ ID NO: 12: R121T (Aminosäure, cDNA)
SEQ ID NO: 13: R121W (Aminosäure, cDNA)
SEQ ID NO: 14: Y124A (Aminosäure, cDNA)
SEQ ID NO: 15: Y124Q (Aminosäure, cDNA)
SEQ ID NO: 16: Y124R (Aminosäure, cDNA)
SEQ ID NO: 17: Y121S (Aminosäure, cDNA)
SEQ ID NO: 18: R121T (Aminosäure, cDNA)
SEQ ID NO: 19: Y124A/S125A (Aminosäure, cDNA)
SEQ ID NO: 20: T13D/R121E (Aminosäure, cDNA)
SEQ ID NO: 21: R121T/E122F/Y124Q (Aminosäure, cDNA)
SEQ ID NO: 22: 5'-PCR-Primer, IL-4
SEQ ID NO: 23: 3'-PCR-Primer, IL-4
SEQ ID NO: 24: Mutagenese-Primer für R121A
SEQ ID NO: 25: Mutagenese-Primer für R121D
SEQ ID NO: 26: Mutagenese-Primer für R121E
SEQ ID NO: 27: Mutagenese-Primer für R121F
SEQ ID NO: 28: Mutagenese-Primer für R121H
SEQ ID NO: 29: Mutagenese-Primer für R121I
SEQ ID NO: 30: Mutagenese-Primer für R121K
SEQ ID NO: 31: Mutagenese-Primer für R121N
SEQ ID NO: 32: Mutagenese-Primer für R121P
SEQ ID NO: 33: Mutagenese-Primer für R121T
SEQ ID NO: 34: Mutagenese-Primer für R121W
SEQ ID NO: 35: Mutagenese-Primer für Y124A
SEQ ID NO: 36: Mutagenese-Primer für Y124Q
SEQ ID NO: 37: Mutagenese-Primer für Y124R
SEQ ID NO: 38: Mutagenese-Primer für Y124S
SEQ ID NO: 39: Mutagenese-Primer für Y124T
SEQ ID NO: 40: Mutagenese-Primer für Y124A/S125A
SEQ ID NO: 41: Mutagenese-Primer für T13D
SEQ ID NO: 42: Mutagenese-Primer für R121T/E122F/Y124Q
Anmerkung: Für das T13D/R121E-Mutein werden die Primer SEQ ID NO: 26 und 41 verwendet.
SEQUENZLISTE

Claims

Menschliches IL-4-Mutein, beziffert gemäß Wild-Typ-IL-4, mit Aminosäure-Substitutionen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus R121A, R121E, R121F, R121H, R121I, R121K, R121N, R121P, R121T, R121W, Y124A, Y124Q, Y124R, Y124S und aus Y124T, wobei die genannten Substitutionen native T-Zell-Aktivierungsaktivität bewahren, aber verringerte Endothelial-Zell-Aktivierungsaktivität aufweisen.
Menschliches IL-4-Mutein, worin die an der Oberfläche freigelegten Reste der D-Helix des genannten Wild-Typ-IL-4 mit einer Aminosäure mutiert sind, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Alanin, Glutaminsäure, Phenylalanin, Histidin, Isoleucin, Prolin, Threonin und aus Tryptophan, wobei das sich ergebende Mutein T-Zell-Fortpflanzung und verringerte IL-6-Sekretion aus HUVECs relativ zu Wild-Typ-IL-4 verursacht, und worin die an der Oberfläche freigelegten Reste der D-Helix des genannten Wild-Typ-IL-4 Glu-110, Asn-111, Glu-114, Arg-115, Lys-117, Thr-118, Arg-121, Glu-122, Tyr-124, Ser-125, Lys-126 oder einer der Reste 118–126 sind.
Menschliches IL-4-Mutein gemäß Anspruch 1, worin die genannte Position mit Alanin substituiert ist.
Menschliches IL-4-Mutein gemäß Anspruch 1, worin Position 121 mit Glutaminsäure substituiert ist.
Menschliches IL-4-Mutein gemäß Anspruch 1, worin Position 121 mit Phenylalanin substituiert ist.
Menschliches IL-4-Mutein gemäß Anspruch 1, worin Position 121 mit Histidin substituiert ist.
Menschliches IL-4-Mutein gemäß Anspruch 1, worin Position 121 mit Isoleucin substituiert ist.
Menschliches IL-4-Mutein gemäß Anspruch 1, worin Position 121 mit Lysin substituiert ist.
Menschliches IL-4-Mutein gemäß Anspruch 1, worin Position 121 mit Asparagin substituiert ist.
Menschliches IL-4-Mutein gemäß Anspruch 1, worin Position 121 mit Prolin substituiert ist.
Menschliches IL-4-Mutein gemäß Anspruch 1, worin Position 121 mit Threonin substituiert ist.
Menschliches IL-4-Mutein gemäß Anspruch 1, worin Position 121 mit Tryptophan substituiert ist.
Menschliches IL-4-Mutein gemäß Anspruch 1, worin Position 124 mit Alanin substituiert ist.
Menschliches IL-4-Mutein gemäß Anspruch 1, worin die genannte Position 124 mit Glutamin substituiert ist.
Menschliches IL-4-Mutein gemäß Anspruch 1, worin die genannte Position 124 mit Arginin substituiert ist.
Menschliches IL-4-Mutein gemäß Anspruch 1, worin die genannte Position 124 mit Serin substituiert ist.
Menschliches IL-4-Mutein gemäß Anspruch 1, worin die genannte Position 124 mit Threonin substituiert ist.
Menschliches IL-4-Mutein gemäß Anspruch 1, worin die genannten Positionen 124 und 125 mit Alanin substituiert sind.
Menschliches IL-4-Mutein gemäß Anspruch 1, worin die Positionen 121 mit Threonin, 122 mit Phenylalanin und 124 mit Glutamin substituiert sind.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine wirksame Menge des menschlichen IL-4-Mutein gemäß Anspruch 1.
Polynucleotid-Molekül, das das menschliche IL-4-Mutein gemäß Anspruch 1 codiert.
Wirtszelle, die mit dem Polynucleotid gemäß Anspruch 21 transformiert ist.
Vektor, umfassend das Polynucleotid gemäß Anspruch 21, das auf die Exprimierung des menschlichen IL-4-Mutein gerichtet ist, das T-Zellaktivierungsaktivität, aber verringerte Endothelial-Zell-Aktivierungsaktivität aufweist, wobei der Vektor zur Transfizierung eines Ziel-Organismus und zur anschließenden in vivo-Exprimierung des genannten menschlichen IL-4-Mutein befähigt ist, das dafür durch das genannte Polynucleotid codiert ist.
Verfahren zur Selektierung eines menschlichen IL-4-Mutein, beziffert gemäß Wild-Typ-IL-4, mit T-Zell-Aktivierungsaktivität, aber mit verringerter Endothelial-Zell-Aktivierungsaktivität, wobei das Verfahren eine Stufe umfasst, in der die an der Oberfläche freigelegten Reste der D-Helix mit einer Aminosäure mutiert werden, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Alanin, Glutamin, Arginin, Serin und aus Threonin, wobei das sich ergebende Mutein T-Zell-Fortpflanzung und verringerte IL-6-Sekretion aus HUVECs, relativ zu Wild-Typ, verursacht.
Verwendung des IL-4-Mutein gemäß Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer mit IL-4 behandelbaren Krankheitsbedingung.
Verwendung des IL-4-Mutein gemäß Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Autoimmun-Störung.
Verwendung des IL-4-Mutein gemäß Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung multipler Sklerose.
Verwendung des IL-4-Mutein gemäß Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung rheumatoider Arthritis.
Verwendung des IL-4-Mutein gemäß Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Diabetes melitus.
Verwendung des IL-4-Mutein gemäß Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von systemischem Lupus erythematosus.
Verwendung des IL-4-Mutein gemäß Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer infektiösen Krankheit.
Verwendung des IL-4-Mutein gemäß Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung der Lyme-Krankheit (Lyme-Borriolose).
Verwendung des IL-4-Mutein gemäß Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Th-1-polarisierten Krankheit.
Verwendung des IL-4-Mutein gemäß Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Psoriasis.