DE69733695T2 - Notch-liganden zur verwendung in der immuntherapie - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung therapeutischer Verbindungen zur Modifikation der T-Zellaktivierung. Insbesondere betrifft sie deren Verwendung bei der Modulation der Interaktion zwischen Mitgliedern der Notch-Proteinfamilie und deren Liganden und die Verwendung solcher Verbindungen bei der Therapie von Zuständen wie etwa Transplantatabstoßung, Autoimmunität, Allergie, Asthma, infektiösen Erkrankungen und Tumoren.
  • Die kontrollierte Interaktion zwischen T-Zellen und zwischen Antigen-präsentierenden Zellen (APC) und T-Zellen ist lebenswichtig für die Funktion des humanen Immunsystems. Jedoch kann es bei bestimmten pathologischen Zuständen therapeutisch nutzbringend sein, solche Interaktionen in positiver oder negativer Weise zu modifizieren. Beispielsweise ist es bei Zuständen wie Autoimmunität, Allergie und Transplantatabstoßung wünschenswert, das Herunterregulieren einer Immunantwort zu induzieren, indem man negative T-Zell- oder T-Zell-APC-Interaktionen stimuliert. Modelle der „infektiösen Toleranz" und „gekoppelten Suppression" legen nahe, dass Toleranz bei einer kleinen Anzahl von T-Zellen induziert werden kann, und dass diese T-Zellen dann diese Toleranz an andere T-Zellen weitergeben und somit einen wirkungsvollen Immunangriff verhindern. Bei anderen pathologischen Zuständen, wie etwa tumorinduzierter Immunsuppression, parasitären, viralen oder bakteriellen Infektionen, ist Immunsuppression ein verbreitetes Merkmal. Unter solchen Umständen wäre es daher wünschenswert, die T-Zell-Interaktionen, die die infektiöse Toleranz weitergeben, zu inhibieren.
  • Bis jetzt jedoch ist der Mechanismus, der diesen T-Zell- und T-Zell-APC-Interaktionen zugrunde liegt, nicht verstanden, wurden.
  • Die WO 92/19734 gibt an, die Nukleotidsequenz der humanen Gene Notch und Delta sowie die Aminosäuresequenzen der davon codierten Proteine zu offenbaren. Die Offenbarung zeigt, dass die Notch-Genfamilie in guter Weise als essentiell für die korrekte embryonale Zelllinienentwicklung von Insekten, wie Drosophila, charakterisiert worden ist.
  • Die zu der Notch-Familie gehörenden Proteine sind Transmembran-Rezeptoren, die verschiedene konservierte Peptidmotive beinhalten. Jedes Protein innerhalb der Familie zeigt charakteristische extrazelluläre EGF (Epidermiswachstumsfaktor)-artige Wiederholungssequenzen (Repeats) und ein an die Membran angrenzendes Lin-12/Notch-Motiv. Zusätzlich besitzt jedes Protein 6–8 Ankyrin-Repeat-Motive am zytoplasmatischen Schwanz zusammen mit einer PEST- Sequenz. Die Notch-Liganden besitzen eine diagnostische DSL-Domäne (D, Delta, S, Serrate, L, Lag2), die 20–22 Aminosäuren am Amino-Terminus des Proteins umfasst, und zwischen 3–8 EGF-artige Repeats auf der extrazellulären Oberfläche. Die Proteine besitzen einen kurzen zytoplasmatischen Schwanz ohne konservierte funktionelle Domänen.
  • Die jüngsten Erkenntnisse legen nahe, dass die Signalerzeugung von Notch zu der Zelllinien-Festlegung von unreifen T-Zellen im Thymus beiträgt, wobei sie die Thymozyten-Entwicklung für die CD8+-Abstammungslinie geneigt macht, die unabhängig von der MHC-Erkennung ist (Robey E, et al., Cell 1996, 87:483–492). Während der Reifung im Thymus erlangen T-Zellen die Fähigkeit, Selbst-Antigene von denjenigen Antigenen zu unterscheiden, die nicht-selbst sind, ein Prozess, der als Selbsttoleranz bezeichnet wird (von Boehmer H, et al., Ann Rev Immunol. 1990; 8:531). Es existieren außerdem Mechanismen in der Peripherie für die Induktion und Aufrechterhaltung von Toleranz, deren Bedeutung in vielerlei Hinsicht unterschätzt wird. Es existieren viele Versuchsmodelle von Transplantatabstoßung, Autoimmunerkrankungen und spezifischen Reaktionen auf Allergene, die klar die Fähigkeit aufzeigen, bei dem Empfänger durch Immunisierung mit einem Antigen einen Zustand spezifischer Antwortlosigkeit (Toleranz oder Anergie) zu induzieren. Aus diesen Systemen ergeben sich zwei wichtige Erkenntnisse. Zum ersten kann die Immunisierung mit einem Peptidfragment eines Antigens unter ausgewählten Bedingungen spezifische Antworten nicht nur gegen sich selbst, sondern auch gegen andere Regionen in demselben Molekül inhibieren, unter der Voraussetzung, dass das intakte Protein für die Belastungs-Immunisierung verwendet wird (gekoppelte Suppression; Hoyne GF et al., J. Exp. Med. 1993; 178:183 und Metzler B, Wraith DC. Int. Immunol. 1993; 5:1159). Zweitens gibt es das Phänomen der „infektiösen Toleranz", wie es am besten in Versuchsmodellen der Transplantation beschrieben wurde, bei dem postuliert wird, dass immunkompetente Zellen, die gegen ein spezifisches Antigen tolerant gemacht wurden, in der Lage sind, andere Zellen von der Antwort abzuhalten und weiterhin, dass diese zweite Zellpopulation regulatorisch und tolerant wird (Qin, SX et al., Science 1993; 258:974). Die immunologischen Mechanismen, die diesen Phänomenen zugrunde liegen, sind bislang noch nicht festgestellt worden.
  • Die vorliegende Erfindung geht aus der Entdeckung hervor, dass die Notch-Rezeptorfamilie und ihre Liganden Delta und Serrate auf der Zelloberfläche normaler adulter Zellen des peripheren Immunsystems exprimiert werden.
  • Dementsprechend wird gemäß der vorliegenden Erfindung die Verwendung eines Notch-Liganden oder eines therapeutisch wirksamen Fragments oder Derivats hiervon, oder eines Polynukleotids, das für einen Notch-Liganden oder ein therapeutisch wirksames Fragment oder Derivat hiervon codiert, für die Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in der Immuntherapie bereitgestellt.
  • Das Expressionsmuster der Notch-Familie der Rezeptoren und ihrer Liganden im normalen peripheren adulten Immunsystem ist zuvor noch nicht beschrieben worden, jedoch haben die vorliegenden Erfinder gezeigt, dass T-Zellen Notch 1 mRNA konstitutiv exprimieren, während die Expression von Delta auf nur eine Untergruppe von T-Zellen in den peripheren lymphoidalen Geweben begrenzt ist. Die Expression von Serrate scheint auf eine Untergruppe von Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) in der Peripherie begrenzt zu sein (1). Somit kann diese Rezeptor-Liganden-Familie über die Embryonalentwicklung hinaus damit fortfahren, Zellschicksalsentscheidungen im Immunsystem zu regulieren, wie dies in anderen Geweben gezeigt wurde (Ellisen LW et al., Cell 1991; 66:649). Das Notch-Signal könnte eine zentrale Rolle bei der Induktion der peripheren Antwortlosigkeit (Toleranz oder Anergie) spielen und eine physikalische Erklärung für die gekoppelte Suppression und die infektiöse Toleranz liefern.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung eines Notch-Liganden bei der Behandlung einer T-Zell-vermittelten Reaktion. Hierbei ist beobachtet worden, dass der Notch-Ligand bei Exposition einer Population naiver T-Zellen gegenüber einem von einer APC exprimierten Notch-Liganden in Gegenwart eines Allergens oder Antigens dazu in der Lage ist, die T-Zellpopulation tolerant gegenüber dem Allergen oder Antigen zu machen. Weiterhin ist diese T-Zellpopulation, wenn sie nachfolgend mit einer zweiten Population naiver T-Zellen in Kontakt tritt, dazu befähigt, die zweite Population tolerant gegenüber dem Allergen oder Antigen zu machen.
  • Somit wird gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung die Verwendung eines Notch-Liganden oder eines therapeutisch wirksamen Fragments oder Derivats hiervon, oder eines für einen Notch-Liganden oder ein therapeutisch wirksames Fragment oder Derivat hiervon codierenden Polynukleotids für die Herstellung eines Medikaments zur Beeinflussung der gekoppelten Suppression bereitgestellt.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung eines Notch-Liganden oder eines therapeutisch wirksamen Fragments oder Derivats hiervon, oder eines für einen Notch-Liganden oder ein therapeutisch wirksames Fragment oder Derivat hiervon codierenden Polynukleotids für die Herstellung eines Medikaments zur Beeinflussung der infektiösen Toleranz (auch in der Technik als „Bystander-Toleranz" bekannt) bereitgestellt.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung eines Notch-Liganden bei der Modulation der Expression eines funktionellen Notch-Proteins oder eines Notch-Signalweges.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt, um T-Zellen gegenüber einem Allergen oder Antigen tolerant zu machen, umfassend das Inkubieren der T-Zellen mit bzw. die Exposition der T-Zellen in Zellkultur gegenüber Antigen-präsentierenden Zellen, die einen Notch-Liganden in Gegenwart des Allergens oder Antigens exprimieren oder überexprimieren.
  • Bei den oben beschriebenen Aspekten der vorliegenden Erfindung kann der Notch-Ligand mit den T-Zellen in Kontakt gebracht werden, indem man die T-Zellen mit Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) oder dergleichen inkubiert/mischt, die einen Notch-Liganden in Gegenwart eines Allergens oder Antigens exprimieren oder überexprimieren. Die (Über)expression des Gens für den Notch-Liganden kann mittels APCs verwirklicht werden, die mit einem Gen transfiziert sind, das zur Expression eines Notch-Liganden befähigt ist, oder durch APCs, die einem Mittel ausgesetzt werden, das in der Lage ist, die Expression eines endogenen Notch-Ligandengens bzw. endogener Notch-Ligandengene heraufzuregulieren.
  • Geeignete Mittel, die die Expression von Notch-Liganden beeinflussen, beinhalten Mittel, die die Expression der Gene Delta und/oder Serrate beeinflussen. Im Fall der Delta-Expression führt beispielsweise die Bindung von extrazellulären BMPs (Bone Morphogenetic Proteins, Wilson, P.A. und Hemmati-Brivanlou A., 1997 Neuron 18: 699–710, Hemmati-Brivanlou, A. und Melton, D., 1997 Cell 88: 13–17) an ihre Rezeptoren zu einer herunterregulierten Delta-Transkription aufgrund der Inhibition der Expression des Achaete/Scute-Komplex-Transkriptionsfaktors. Von diesem Komplex nimmt man an, dass er direkt an der Regulation der Delta-Expression beteiligt ist. Somit ist jedes Mittel, das die Bindung von BMPs an ihre Rezeptoren inhibiert, in der Lage, einen Anstieg der Expression von Delta und/oder Serrate hervorzurufen. Diese Mittel beinhalten Noggin, Chordin, Follistatin, Xnr3, FGFs, Fringe und Derivate und Varianten hiervon (siehe Literaturstellen zu noggin – Smith, W.C. und Harland, R.M., Cell 70:829–840, chordin – Sasai, Y. et al, 1994 Cell 79: 779–790). Noggin und Chordin binden an die BMPs und verhindern dadurch die Aktivierung von deren Signalkaskade, die zu einer verminderten Delta-Transkription führt.
  • Bei bestimmten Krankheitszuständen kann der Körper immungeschwächt sein, und es kann wünschenswert sein, die Expression von Delta und/oder Serrate herunterzuregulieren, um die auferlegte Immunsuppression zu überwinden. Mittel, die die Expression von Delta und/oder Serrate inhibieren, können unter solchen Umständen verwendet werden. Beispiele für Mittel, die die Expression von Delta und/oder Serrate inhibieren, beinhalten das Protein Toll (Medzhitov, R. et al., 1997 Nature 388: 394–397), BMPs und andere Mittel, die die Produktion von Noggin, Chordin, Follistatin, Xnr3, FGFs und Fringe herabsetzen oder in diese eingreifen. Somit wird gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung die Verwendung eines Mittels, das in der Lage ist, die Expression der Delta- oder Serrate-Proteine herunterzuregulieren oder deren Präsentation als Zellmembranproteine zu verringern, zur Herstellung eines Medikaments für die Verwendung zur Aufhebung der durch Bakterien, Infektionen oder Tumoren induzierten Immunsuppression bereitgestellt, wobei das Mittel ein Toll-Protein oder ein Bone Morphogenetic Protein ist.
  • Wie oben diskutiert, betrifft die Erfindung auch die Modifikation der Notch-Proteinexpression oder -Präsentation auf der Zellmembran oder der entsprechenden Signalwege. Für diese ist gezeigt worden, dass sie an T-Zell-vermittelten Antworten beteiligt sind, die bei der Induktion von Toleranz (gekoppelte Toleranz und/oder Bystander) beteiligt sind. Mittel, die die Präsentation eines voll funktionalen Notch-Proteins auf der Zelloberfläche verstärken, beinhalten Matrixmetalloproteinasen, wie etwa das Produkt des Gens Kuzbanian von Drosophila (Dkuz, Pan, D und Rubin, G.M., 1997 Cell 90: 271–280) und andere Mitglieder der ADAMALYSIN-Genfamilie. Mittel, die seine Präsentation als voll funktionales Zellmembranprotein verringern oder in diese eingreifen, können MMP-Inhibitoren, wie etwa auf Hydroxymat basierende Inhibitoren, beinhalten.
  • Der Begriff „Antigen-präsentierende Zelle oder dergleichen" ist, wie er hier verwendet wird, nicht dazu gedacht, um auf die APCs beschränkt zu sein. Der Fachmann wird erkennen, dass jedes Vehikel, das befähigt ist, der T-Zellpopulation den gewünschten Notch-Liganden zu präsentieren, verwendet werden kann, jedoch wird aus Gründen der Einfachheit der Begriff APCs verwendet, um sich auf alle diese Beispiele zu beziehen. Folglich beinhalten Beispiele für geeignete APCs dendritische Zellen, L-Zellen, Hybridome, Lymphome, Makrophagen, B-Zellen oder synthetische APCs, wie etwa Lipidmembranen.
  • Wenn die APCs mit einem Gen transfiziert werden, das zur Expression eines Notch-Liganden befähigt ist, so kann die Transfektion durch ein Virus, wie etwa ein Retrovirus oder Adenovirus, oder mittels eines anderen Vehikels oder Verfahrens bewerkstelligt werden, das befähigt ist, ein Gen an die Zellen auszuliefern. Diese umfassen alle Vehikel oder Verfahren, die sich als wirksam für die Gentherapie erwiesen haben, und beinhalten Retroviren, Liposomen, Elektroporation, weitere Viren, wie etwa Adenovirus, Adeno-assoziiertes Virus, Herpesvirus, Vaccinia, durch Calciumphosphat präzipitierte DNA, DEAE-Dextran-assistierte Transfektion, Mikroinjektion, Polyethylenglykol und Protein-DNA-Komplexe.
  • Unter Verwendung solcher Vehikel oder Verfahren alleine oder in Kombination ist es möglich, die Genauslieferung ortsgenau zu einer bestimmten Zellpopulation zu lenken, was es somit ermöglicht, das Verfahren der vorliegenden Erfindung in vivo durchzuführen. Beispielsweise kann ein Virus in Kombination mit Liposomen verwendet werden, um die Effizienz der DNA-Aufnahme zu erhöhen. Die Ortsspezifität der Auslieferung kann durch die Einbeziehung spezifischer Proteine (z.B. eines Einzelketten-Antikörpers, der mit dem CD11c für dendritische Zellen/Makrophagen reagiert) in die Virushülle oder das Liposom erreicht werden.
  • Vorzugsweise können Konstrukte verwendet werden, durch welche die Expression des Gens (z.B. Serrate) mit der Antigen-Expression gekoppelt ist. APCs, die Serrate (über)exprimieren, würden somit auch hohe Mengen des relevanten Antigens exprimieren und so bevorzugt mit T-Zellen der geeigneten Spezifität interagieren.
  • Gemäß einem wiederum weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Molekül bereitgestellt, das eine Notch-Liganden-Gruppierung beinhaltet, die funktionsfähig mit einem T-Zell-Allergen oder einer Antigen-Gruppierung verbunden ist, sodass bei einer Exposition gegenüber T-Zellen beide Gruppierungen dazu in der Lage sind, an ihre jeweiligen Stellen zu binden. Ein derartiges Molekül ist befähigt, eine Antigen/Allergen-spezifische T-Zelle tolerant gegenüber demjenigen Allergen oder Antigen zu machen, auf dem das Allergen oder die Antigen-Gruppierung basiert, da die Spezifität, die für die Notch-Liganden-Gruppierung benötigt wird, durch die enge Nachbarschaft zu der Allergen- oder Antigengruppierung bereitgestellt wird.
  • Die Antigen- oder Allergen-Gruppierung kann z.B. ein synthetischer MHC-Peptidkomplex sein. Dies ist ein Fragment des MHC-Moleküls, das die Antigen-Grube aufweist, die ein Element des Antigens trägt. Derartige Komplexe sind in Altman JD et al., Science 1996, 274: 94–6 beschrieben worden.
  • Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Verbindung ein Fusionsprotein, das ein Segment der extrazellulären Domäne von Notch oder einem Notch-Liganden und ein Immunglobulin Fc-Segment, vorzugsweise IgGFc oder IgMFc, umfasst. Somit wird gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung die Verwendung eines Fusionsproteins, das ein Segment der extrazellulären Domäne eines Notch-Liganden und ein Immunglobulin Fc-Segment umfasst, für die Herstellung eines Medikaments zur Immuntherapie bereitgestellt.
  • Bei allen oben dargestellten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, dass der Notch-Ligand aus der Serrate-Familie oder der Delta-Familie der Proteine, bzw. der zugehörigen Derivate, Fragmente oder Analoga stammt.
  • Erkrankungen oder infektiöse Zustände, die als T-Zell-vermittelt beschrieben werden können, beinhalten beliebige oder mehrere von Asthma, Allergie, Transplantatabstoßung, Autoimmunität, Tumor-induzierten Anomalien des T-Zell-Systems und infektiösen Erkrankungen, wie etwa solche, die verursacht werden von Plasmodium-Arten, Microfilariae, Helminthen, Mycobakterien, HIV, Cytomegalievirus, Pseudomonas, Toxoplasma, Echinococcus, Haemophilus influenza Typ B, Masern, Hepatitis C oder Toxicara. Somit kann durch die Verwendung des geeigneten Allergens oder Antigens ein Notch-Ligand gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um die Erkrankung oder Infektion zu behandeln.
  • Wir stellen außerdem ein Verfahren zur Detektion der durch einen eindringenden Organismus verursachten Immunsuppression bereit. Solche Organismen können lösliche Formen von Familienmitgliedern von Serrate, Notch und/oder Delta oder Derivate hiervon oder Proteine, die deren Expression in vivo beeinflussen, erzeugen, und somit eine Immunsuppression durch infektiöse Toleranz hervorrufen. Das Verfahren umfasst einen Test auf Anwesenheit von in vivo nicht membrangebundenem Serrate, Delta, Notch oder Derivaten hiervon, und umfasst bevorzugt einen Antikörper gegen Serrate, Delta oder Notch oder deren Derivate.
  • Verfahren zur Verwendung in Screening-Tests für die Detektion von erhöhter oder verminderter Expression und/oder Prozessierung von Notch, Delta/Serrate beinhalten:
  • 1. Test auf Expression von Delta/Serrate, Notch und Fringe nach der Exposition isolierter Zellen gegenüber Testverbindungen in Kultur, unter Verwendung z.B. folgender Mittel:
    • (a) auf der Proteinebene mittels spezifischer Antikörperfärbung unter Verwendung von Immunhistochemie oder Durchfluss-Zytometrie
    • (b) auf der RNA-Ebene durch quantitative reverse Transkriptase-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR). Die RT-PCR kann unter Verwendung eines Kontrollplasmids mit eingebauten Standards zur Messung der Expression endogener Gene mittels Primern durchgeführt werden, die spezifisch für Notch 1 und Notch 2, Serrate 1 und Serrate 2, Delta 1, Delta 2, Delta 3 und Fringe sind. Diese Konstrukte können modifiziert werden, wenn neue Ligandenmitglieder identifiziert werden.
    • (c) auf der funktionalen Ebene in Zelladhäsionstests.
  • Die gesteigerte Expression von Delta/Serrate oder Notch sollte zu einer erhöhten Adhäsion zwischen den Zellen führen, die Notch bzw. dessen Liganden Delta/Serrate exprimieren. Testzellen werden einer bestimmten Behandlung in Kultur ausgesetzt, und radioaktiv markierte oder mit Fluorescein markierte Zielzellen (mit Notch/Delta/Serrate Protein transfiziert) werden darauf geschichtet. Die Zellgemische werden für 2 h bei 37°C inkubiert. Nicht angeheftete Zellen werden durch Waschen entfernt, und das Niveau der Anhaftung wird über die Stärke der Radioaktivität/Immunfluoreszenz an der Plattenoberfläche gemessen.
  • Unter Verwendung solcher Verfahren ist es möglich, Verbindungen oder Notch-Liganden zu detektieren, die die Expression oder Prozessierung eines Notch-Proteins oder eines Notch-Liganden beeinflussen.
  • Wir stellen außerdem ein Testverfahren bereit, das folgendes umfasst:
    In-Kontakt-Bringen (a) eines Notch-Proteins und eines Liganden, der zur Bindung an das Notch-Protein befähigt ist mit (b) einer Verbindung; und Bestimmen, ob die Verbindung die Bindung des Liganden an das Notch-Protein beeinflusst, bevorzugt, wenn das Notch-Protein mit einer T-Zelle assoziiert ist.
  • Die Notch-Liganden zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung sind bevorzugt Mitgliederproteine der Delta- oder Serrate-Familie oder Polypeptide oder Derivate hiervon. Diese werden vorzugsweise unter Verwendung von Standardtechniken der rekombinanten Technik erhalten, wie diese dem Fachmann wohlbekannt sind. Geeignete Gensequenzen für die Verwendung zur Erzeugung derartiger Verbindungen der vorliegenden Erfindung können erhalten werden aus Veröffentlichungen, wie etwa der WO 97/01571, WO 96/27610 und WO 92/19734. Die Erfindung ist jedoch in keiner Weise auf die Notch-, Delta- und Serrate-Sequenzen begrenzt, die in diesen Veröffentlichungen offenbart sind. Bevorzugter sind diese von Notch, Delta und Serrate oder Familienmitgliedern stammenden Proteine, Polypeptide oder Derivate Fragmente der extrazellulären Domänen von Notch, Delta, Serrate oder den Familienmitgliedern, oder es sind Derivate derartiger Fragmente. Wie hier verwendet, schließt der Begriff „Notch-Ligand" weiterhin jeden Liganden oder jedes Liganden-Familienmitglied ein, das mit einem Mitglied der Notch-Proteinfamilie interagiert; dies beinhaltet die Gruppe der Proteine, die als „toporythmische Proteine" bezeichnet werden, d.h. die Proteinprodukte der Delta-, Serrate-, Deltex- und Enhancer of split-Gene, ebenso wie andere Mitglieder dieser Genfamilie, die über die Fähigkeit ihrer Gensequenzen zu entsprechender Hybridisierung, bzw. wegen ihrer Homologie zu den Notch-, Delta oder Serrate-Proteinen oder aufgrund der Fähigkeit ihrer Gene zu phänotypischen Wechselwirkungen identifiziert werden können.
  • Notch, Delta und Serrate wurden zuerst in Drosophila beschrieben und stellen daher prototypische Proteine unter den Notch-Rezeptor- bzw. Notch-Liganden-Familienmitgliedern dar. Es sind inzwischen zahlreiche Notch-Proteine und Notch-Liganden bei vielen Invertebraten- und Vertebratenarten beschrieben worden, jedoch kann ihre Benennung von derjenigen, die bei der Fliege verwendet wird, abweichen. Beispielsweise ist Notch ein Homologes von Lin 12 und Glp 1, während Serrate/Delta Homologe von Jagged, Apx1 und Lag2 sind.
  • Pharmazeutische Formulierungen der vorliegenden Erfindung können gemäß in der Technik wohlbekannter Prinzipien formuliert werden. Somit wird die Natur des Trägerstoffs und die Menge an Aktivität von der Verbindung der vorliegenden Erfindung abhängen, die formuliert werden soll.
  • Bevorzugt liegen die pharmazeutischen Zusammensetzungen in Form einer Einheitsdosis vor.
  • Die Dosierungen der Verbindungen der vorliegenden Erfindung, die einem Patienten in Form pharmazeutischer Formulierungen zu verabreichen sind, können von einem geeigneten Arzt bestimmt werden.
  • Die bevorzugte Verabreichungsroute einer Formulierung der vorliegenden Erfindung kann ein beliebiges der üblichen Verabreichungsverfahren sein, einschließlich intramuskulärer, intraperitonealer und intravenöser Injektion, intranasaler Inhalation, Lungeninhalation, subkutaner, intradermaler, intraartikulärer, intrathekaler und topischer Applikation, sowie über den Verdauungstrakt (z.B. über die Peyerschen Plaques).
  • Der Begriff „Derivat", wie er hier im Bezug auf die Proteine oder Polypeptide der vorliegenden Erfindung verwendet wird, beinhaltet jedwede Substitution, Variation, Modifikation an, sowie jedweden Austausch, jede Deletion oder Addition eines (oder mehrerer) Aminosäurereste bei der Sequenz, vorausgesetzt, dass das resultierende Protein oder Polypeptid die Fähigkeit besitzt, die Interaktionen von Notch und den Notch-Liganden zu modulieren.
  • Der Begriff „Variante", wie er hier im Bezug auf die Proteine oder Polypeptide der vorliegenden Erfindung verwendet wird, beinhaltet jedwede Substitution, Variation, Modifikation an, sowie jedweden Austausch, jede Deletion oder Addition eines (oder mehrerer) Aminosäurereste bei der Sequenz, vorausgesetzt, dass das resultierende Protein oder Polypeptid die Fähigkeit besitzt, die Interaktionen von Notch und den Notch-Liganden zu modulieren.
  • Der Begriff „Analogon", wie er hier im Bezug auf die Proteine oder Polypeptide der vorliegenden Erfindung verwendet wird, beinhaltet jedwedes Peptidomimetikum, d.h. eine chemische Verbindung, die die Fähigkeit besitzt, die Notch-Notch-Liganden-Interaktionen in einer ähnlichen Weise zu modulieren wie das Elternprotein oder Elternpolypeptid. Diese beinhalten Verbindungen, die agonistisch oder antagonistisch auf die Expression oder Aktivität eines Notch-Proteins oder Notch-Liganden wirken können.
  • Eine Verbindung kann als Modulator der Notch-Notch-Liganden-Interaktionen angesehen werden, wenn sie befähigt ist, die Interaktion von Notch mit seinen Liganden entweder zu inhibieren oder zu verstärken, bevorzugt in einem Ausmaß, das hinreichend ist, um therapeutische Wirksamkeit bereitzustellen.
  • Der Ausdruck „Notch-Notch-Ligand", wie er hier verwendet wird, bedeutet die Interaktion zwischen einem Notch-Familienmitglied und einem Liganden, der befähigt ist, an eines oder mehrere dieser Mitglieder zu binden.
  • Der Begriff „Therapie", wie er hier verwendet wird, ist so zu betrachten, dass er diagnostische und prophylaktische Anwendungen einschließt.
  • Der Begriff „medizinisch" beinhaltet humane und veterinärmedizinische Anwendungen.
  • Wie hier verwendet, können die Begriffe „Protein" und „Polypeptid" als synonym angesehen werden, wobei „Protein" lediglich in einem allgemeineren Sinne verwendet wird, um eine relativ längere Aminosäuresequenz anzuzeigen als diejenige, die in einem Polypeptid vorliegt.
  • Die vorliegende Erfindung wird nun mittels nicht einschränkender Beispiele und unter Bezugnahme auf die begleitenden Zeichnungen beschrieben, von denen:
  • 1 die Ergebnisse von in situ-Hybridisierungen zeigt, die gemäß der hier vorliegenden Beschreibung in Beispiel 1 durchgeführt wurden;
  • 2 die Ergebnisse des in Beispiel 4 beschriebenen Versuchs zeigt;
  • 3 die Ergebnisse des in Beispiel 5 beschriebenen Versuchs zeigt;
  • 4 die Ergebnisse des in Beispiel 6 beschriebenen Versuchs zeigt;
  • 5 die Ergebnisse des in Beispiel 7 beschriebenen Versuchs zeigt;
  • 6 die Ergebnisse des in Beispiel 8 beschriebenen Versuchs zeigt;
  • 7 die Ergebnisse des in Beispiel 9 beschriebenen Versuchs zeigt;
  • 8a und 8b die Ergebnisse des in Beispiel 10 beschriebenen Versuchs zeigen;
  • 9 die Ergebnisse des in Beispiel 11 beschriebenen Versuchs zeigt.
  • BEISPIEL 1
  • Notch, Delta und Serrate werden im peripheren Immunsystem exprimiert
  • Es wurden für Notch 1, Delta 1 und Serrate 1 spezifische Antisense-RNA-Sonden synthetisiert und Digoxigenin-markiertes UTP darin eingebaut. Jede Sonde wurde in Hybridisierungspuffer gelöst, für 5–10 Minuten auf 70°C erhitzt und zu TESPA-beschichteten Objektträgern gegeben, die 10 mm-Schnitte von Milz oder Thymus enthielten, die zuvor mit 4% Paraformaldehyd + PBS fixiert worden waren. Die Objektträger wurden über Nacht bei 65°C hybridisiert. Am folgenden Tag wurden die Objektträger zweimal bei 65°C und zweimal bei Raumtemperatur (RT) mit 1 × SSC/50%Formamid/0,1% Tween 20 gewaschen. Die Objektträger wurden zweimal bei RT mit 0,1 M Maleinsäure/0,15 M NaCl/0,1 % Tween 20 pH 7,5 (MABT)-Puffer gewaschen und dann für 2 h mit MABT + 20% Ziegenserum + 296 Boehringer Blockingreagenz (BBR) geblockt. Die Objektträger wurden über Nacht bei RT mit anti-Digoxigenin-Fab-Fragmenten inkubiert. Nach vier Waschschritten mit MABT wurden die Objektträger weitere zweimal in alkalischem Substratpuffer gewaschen. Die Anwesenheit gebundener Antisense-RNA-Sonden wurde detektiert, indem man die Objektträger im Dunkeln in Substratpuffer mit NBT + BCIP inkubierte. Die Objektträger wurden mit Hämatoxylin gegengefärbt und in Depx-Haltemedium fixiert.
  • Ergebnisse: Die Ergebnisse dieser Hybridisierungen sind in 1 gezeigt, die zeigt, dass in der Milz einer 3 Monate alten Maus Delta und Serrate durch isolierte Zellen in der periarteriellen Scheide und nicht im Keimzentrum (germinal centre (gc)) exprimiert werden. Notch wird in vielen Zellen wiederum in der periarteriellen Scheide exprimiert.
  • BEISPIEL 2
  • Produktion von Delta-Fc-Fusionsprotein
  • Der Expressionsvektor pIG-1 [D. Simmons, „Cloning cell surface molecules by transient surface expression in mammalian cells", S. 93–128, Cellular Interactions in Development, Herausgeber D. Hartley, pub. Ox. Uni. Press (1993)] erlaubt die Produktion eines Fusionsproteins, das den extrazellulären Teil von Delta 1 in Verbindung mit der humanen IgG1-Fc-Domäne enthält. Ein Restriktionsenzym-Fragment, das nur die extrazelluläre Domäne des Delta 1-Proteins enthält, wurde in den pIG-1-Vektor einkloniert. Das resultierende Plasmid wurde in E. coli MC 1061 transformiert und in SOB mit 10 μg/ml Tetracyclin/Ampicillin vermehrt. Der gereinigte Vektor wurde verwendet, um COS-Zellen in vitro zu transfizieren. Die COS-Zellen wurden bis auf 50–75% Konfluenz herangezogen, und die Transfektion wurde mit 10 μg Plasmid-DNA pro Schale mittels des DEAE-Dextran-Verfahrens vorgenommen. 24 Stunden nach der Transfektion wurde das Kulturmedium ersetzt durch Kulturmedium mit 1 % FCS, und die Zellen wurden für weitere 3–6 Tage in vitro kultiviert. Die Zellen wurden für 5 min bei 5000 rpm zentrifugiert, um Zellen und Bruchstücke zu pelletieren, während der Überstand abgenommen und bis zur weiteren Verwendung gelagert wurde. Die Delta-Fc-Fusion wurde aus den Kulturüberständen gereinigt, indem man 2 ml einer 50% Aufschlämmung an Protein A – Sepharose (Pharmacia) zugab und über Nacht bei 4°C rotieren ließ. Die Sepharose-Kügelchen wurden isoliert, indem man die Kulturüberstände durch einen 0,45 mm-Filter leitete, wusch und auf eine 10 ml-Plastiksäule transferierte. Das Delta-Fc-Fusionskonstrukt wurde mit 2 ml Elutionspuffer pH 4,0 eluiert. Das Eluat wurde durch die Zugabe von 1 M Tris-Base neutralisiert.
  • BEISPIEL 3
  • Beispiele für Modelle, an denen der Notch-Liganden-Signalweg untersucht werden kann
  • Die periphere Toleranz gegenüber Selbst-Antigenen kann anhand von transgenen T-Zell-Rezeptor (TCR)-Mäusen analysiert werden, bei denen der TCR-Ligand als ein Selbstantigen nur in der Peripherie exprimiert wird. Die periphere Toleranz gegen Transplantationsantigene kann auf verschiedene Weise induziert werden, einschließlich der Vorbehandlung des Empfängers mit T-Zellantikörpern oder einer Blockade der Co-Stimulation. Es ist daher möglich, sowohl gekoppelte Suppression als auch infektiöse Toleranz zu zeigen. Die periphere Toleranz gegen Allergene kann durch die intranasale Zufuhr von aus dem Allergen abgeleiteten Peptiden induziert werden. Die Expression von Notch-Notch-Liganden wird auf Zellen gemessen, die nach der Allergen-Inhalation in die Luftwege und/oder die lymphoidalen Gewebe rekrutiert wurden, und es werden Modifikationen der Toleranz aufgezeigt. Weiterhin kann die Expression von Notch-Notch-Liganden bei Versuchsmodellen von Infektionen mit infektiösen Agenzien an dem Organismus (Pathogen) sowie bei immunkompetenten Zellen des Wirts gemessen werden.
  • BEISPIEL 4
  • Delta-exprimierende Hybridome können die Antworten Antigen-instruierter Lymphozyten inhibieren
  • Mäuse wurden mit einem synthetischen Peptid immunisiert, das ein immundominantes Epitop des Hausstaubmilben-Allergens (HDM), Der p1 (p110-31) enthielt, oder mit Ovalbumin (OVA, Hühnereiweiß-Protein). Eine Woche später wurden die Lymphknotenzellen (LNCs) entnommen und Zellsuspensionen hergestellt. Die Lymphknoten von Tieren, die mit verschiedenen Antigenen immunisiert wurden, wurden getrennt aufbewahrt. Diese Zellen werden als instruierte LNCs (primed LNCs) bezeichnet.
  • Die T-Zell-Hybridome wurden entweder mit Delta voller Länge oder mit einem Kontrollplasmid transfiziert, sodass Delta als Membranprotein exprimiert wird. Nach zwei Tagen in Kultur wurden die Hybridome bestrahlt, um sie von der Proliferation oder der Produktion von Zytokinen abzuhalten. Daher stammt die einzige Antwort, die in dem Test gemessen wurde, alleine von den Lymphknotenzellen.
  • Die bestrahlten Hybridome wurden in steigender Anzahl zu Kulturen hinzugegeben, die die instruierten LNCs enthielten. Das passende Antigen (d.h. p110-131 oder OVA) wurde hinzugegeben, und die Zellen wurden für 24 Stunden kultiviert. Die flüssigen Überstände wurden dann gesammelt und auf den Gehalt an IL-2 (einem Haupt-T-Zell-Wachstumsfaktor) getestet. Die Zellteilungsantworten der Lymphknotenzellen nach 72 Stunden wurden ebenfalls gemessen.
  • Ergebnisse: Lymphknotenzellen, die in Gegenwart bestrahlter Hybridome kultiviert wurden, die ein Kontrollplasmid exprimierten, proliferierten weiterhin, wie in 2 gezeigt, und sekretierten IL-2, wenn sie in Kultur mit dem geeigneten Antigen stimuliert wurden. Ihre Antwortbereitschaft wurde bei einem Verhältnis von 1:1 LNC:Hybridom aufrechterhalten. Im Gegensatz dazu wurden die Zellteilungsantwort und die Produktion von IL-2 durch Lymphknotenzellen um wenigstens 88% reduziert, wenn diese in Gegenwart von Hybridomen kultiviert wurden, die Delta voller Länge (im Verhältnis 1:1) zusammen mit dem geeigneten Antigen exprimierten. Die Hybridome waren mit Kontrollvirus (offene Kreise) bzw. Delta-Virus (offene Quadrate) transfiziert. 2 zeigt die Daten, die als Zählimpulse pro Minute (cpm) von 3H-Tdr sind, das 72 Stunden nach dem Beginn der Kultur eingebaut wurde: cpm von Lymphknotenzellen (LNC), die mit Hybridomen kultiviert wurden, die Delta oder Kontrollkonstrukte exprimieren. Gesamtzahl der Zellen/Well = 4 × 105 (d.h. die Anzahl der LNCs variiert gemäß dem Verhältnis der Hybridome gegenüber den LNCs, sodass der cpm-Wert variieren wird). p110-131 LNCs sind Zellen, die mit Der p1 (p110-131) instruiert wurden, OVA LNCs sind Zellen, die mit OVA instruiert wurden. 2BB11 und 2BC3 sind zwei verschiedene Der p1 reaktive Hybridome. Diese Daten zeigen, dass die Inhibition der Antworten durch Delta exprimierende T-Zellen in trans vermittelt werden kann. Obwohl bei diesem Kultursystem Delta exprimierende T-Hybridome mit Spezifität für Derp 1 in der Lage waren, die Antwort von OVA-instruierten T-Zellen zu inhibieren, so scheint dieser scheinbare Mangel an Spezifität an der engen Nachbarschaft der Zellen zu liegen, die durch das Kultursystem erzwungen wurde. Tatsächlich zeigen die Daten, die in den 8a und 8b dargestellt sind, dass bei den Tieren die Delta exprimierenden Hybridome Antigenspezifität mit dem Immunogen teilen müssen, damit ein modulierender Effekt auf die Immunantwort gegenüber diesem Immunogen auftritt. In diesem Fall scheint es so zu sein, dass die Delta exprimierenden T-Zellen nur dann in enge Nachbarschaft mit den antwortenden T-Zellen gebracht werden können, wenn sie das gleiche Antigen auf derselben APC erkennen.
  • BEISPIEL 5
  • Serrate exprimierende Dendritische Zellen verhindern die Antigen-Instruktion von T-Lymphozyten
  • Dendritische Zellen (DCs) sind die primären Antigen-präsentierenden Zellen im Immunsystem und sind wesentlich für das Stimulieren der T-Zellantworten. DCs wurden aus der Milz gewonnen und entweder mit einem Retrovirus transfiziert, der die Expression des Serrate-Proteins voller Länge erlaubt, oder mit einem Kontroll-Retrovirus. Die DCs erhielten außerdem eine Stoßbehandlung (Puls) mit dem HDM-Peptid p110–131 für 3 Stunden in vitro bei 37°C. Die DCs wurden dann gewaschen und dazu verwendet, naive Mäuse zu immunisieren, wobei 105 Zellen/Maus auf subkutanem Wege eingesetzt wurden. Nach 7 Tagen wurden die freigesetzten LNCs gewonnen und in Kultur erneut mit Peptid bei 4 × 105 Zellen/Well stimuliert. Da die Mäuse nur mit Peptid-gepulsten DCs immunisiert wurden, gibt uns dies ein Maß für die Fähigkeit dieser Zellen, eine Immunantwort zu instruieren.
  • Ergebnisse: 3 zeigt die Daten, die als cpm der LNCs 72 Stunden nach der Kultur bei Tieren gezeigt werden, die mit kontroll-transfizierten (offene Kreise) oder Serrate-transfizierten (offene Quadrate) dendritischen Zellen (DCs) immunisiert wurden.
  • Die Immunisierung von Mäusen mit Serrate exprimierenden DCs resultierte im Vergleich zu der Immunisierung mit Kontroll-DCs in einer 10fachen Abnahme bei der Anzahl von Zellen, die aus Lymphknoten erhalten wurden. Wir haben weiterhin herausgefunden, dass die LNCs von Mäusen, die mit DCs + Serrate immunisiert wurden, keine Proliferation zeigten (93% Abnahme bezogen auf die Kontrollwerte, 3) oder kein IL-2 sekretieren, wenn sie mit Zellen von Mäusen verglichen wurden, die mit Kontroll-DCs immunisiert wurden.
  • BEISPIEL 6
  • Delta exprimierende T-Zell-Hybridome sind befähigt, die Entwicklung von Immunität gegen Der p1-Antigen bei Tieren zu inhibieren
  • T-Zell-Hybridome (reaktiv gegenüber Der p1) wurden mit einem Retrovirus transfiziert, das Maus-Delta enthielt, sodass Delta auf der Zelloberfläche exprimiert wurde, oder mit einem Kontrollretrovirus. C57 BL-Mäuse erhielten Injektionen mit 10 Millionen bestrahlten Hybridomen i.p. und wurden mit 50 Mikrogramm Der p1, emulgiert in vollständigem Freunds Adjuvans (CFA), subkutan immunisiert. Nach 7 Tagen wurden die ausgetretenen Lymphknotenzellen gesammelt und mit 4 × 105 Zellen/Well mit Der p1 (10 Mikrogramm/ml), Peptid 110–131 von Der p1 (10 Mikrogramm/ml) oder mit Peptid 81–102 von Der p1 (10 Mikrogramm/ml) kultiviert. Die Kulturen wurden bei 37°C für 72 Stunden inkubiert und Tritium-markiertes Thymidin für die letzten 8 Stunden der Kultur hinzugegeben. Die Ergebnisse der Proliferationstests der Zellen von Tieren, die Injektionen der Kontroll-Transfektante (puro) oder der Delta-Transfektante (Delta-FL) erhalten hatten, sind in 4 dargestellt.
  • Ergebnisse: LNCs von Tieren, denen die mit Kontrollvirus transfizierten Hybridome injiziert wurden, produzierten hohe Spiegel an IL-2 und teilten sich in Kultur in Gegenwart von Der p1, Peptid 110–131 oder Peptid 81–102. Im Gegensatz dazu zeigten Zellen von Tieren, denen Delta-exprimierende Hybridome injiziert worden waren, keine Antwort auf irgendeines der Der p1-Antigene (4).
  • BEISPIEL 7
  • Delta exprimierende humane T-Zellen können die Antwort normaler T-Zellen blockieren
  • Ein Influenza-reaktiver humaner T-Zell-Klon (HA1.7) wurde unter Verwendung eines retroviralen Konstrukts mit Maus-Delta transfiziert, um eine Zelloberflächenexpression des Delta-Proteins zu ermöglichen. Das Mischen dieser Zellpopulation mit normalem HA1.7 verhinderte die nachfolgende Reaktivität dieses normalen HA1.7 gegenüber Peptid HA306–318 und Antigen-präsentierenden Zellen. 5 × 105 HA1.7 wurden mit 1 × 106 bestrahlten DRB1*0101 peripheren einkernigen Blutzellen (PBMC) + 1 Mikrogramm HA306–318 gemischt und bei 37°C kultiviert. 6 Stunden später wurden 5% Lymphocult (IL-2 enthaltendes Medium) in einem Gesamtvolumen von 1 ml hinzugegeben. 24 Stunden nach dem Start der Kultur wurde Delta oder Kontrollretrovirus oder nichts hinzugegeben. 7 Tage nach dem Start der Kultur wurden die Zellen geerntet, gewaschen, und die transfizierten Zellen wurden bestrahlt. Die transfizierten Zellen wurden in einem Verhältnis von 2:1 mit unbehandeltem HA1.7 gemischt und für 2 Tage kultiviert. Die gemischten Kulturen wurden dann geerntet, gewaschen und ausplattiert, wobei 2 × 104 lebensfähige Zellen/Well zusammen mit
    • a) 2,5 × 104 DRB1*0101 PBMCs (Medium)
    • b) 2,5 × 104 DRB1*0101 PBMCs + Peptid (Ag + APC)
    • c) 5% Lymphocult (IL-2)
    verwendet wurden.
  • Die Zellen wurden nach 68 Stunden geerntet, wobei für die letzten 8 Stunden Tritium-markiertes Thymidin zugegeben worden war. Die Ergebnisse sind in 5 dargestellt.
  • Ergebnisse: Nach der Kultur alleine oder mit dem mit Kontrollvirus transfizierten HA1.7 zeigte der unbehandelte HA1.7 eine gute Antwort gegenüber Peptid + Antigen-präsentierenden Zellen. Die Inkubation mit dem Delta-transfizierten, bestrahlten HA1.7 verhindert vollständig die Antwort von unbehandeltem HA1.7 auf Antigen + APC. Jedoch antworten diese Zellen ebenso wie das unbehandelte oder das mit Kontrollvirus inkubierte HA1.7 auf IL-2, was anzeigt, dass diese Zellen nicht einfach unfähig zur Proliferation sind (5).
  • BEISPIEL 8
  • Serrate-Expression durch Antigen-präsentierende Zellen verhindert T-Zell-Antworten
  • Der Klon HA1.7 wurde mit dem Peptid HA306–318 (1,0 Mikrogramm/ml) in Gegenwart von L-Zellen gemischt, die HLA-DRB1*0101 exprimieren (als Antigen-präsentierende Zellen), wobei 2 × 104 Zellen jedes Zelltyps verwendet wurden. Die L-Zellen wurden entweder mit dem die Kontrolle (puro) exprimierenden oder mit Serrate exprimierendem Retrovirus (Serrate L-Zellen) transfiziert. Die Proliferationsantwort wurde nach 72 Stunden gemessen, und zwar nach der Zugabe von Tritium-markiertem Thymidin für die letzten 8 Stunden der Kultur. Die Ergebnisse für die HA1.7-Kulturen sind in 6 dargestellt:
    • a) alleine
      Figure 00160001
    • b) + IL-2
      Figure 00160002
    • c) + Peptid + DRB1*0101-L-Zellen
      Figure 00160003
    • d) + Peptid + DRB1*0101-L-Zellen, die mit Kontrollvirus transfiziert sind
      Figure 00160004
    • e) + Peptid + DRB1*0101-L-Zellen, die mit Serrate-Virus transfiziert sind ⧅
  • Ergebnisse: HA1.7, das durch Serrate exprimierende L-Zellen stimuliert wurde, zeigte nur eine schwache Antwort auf Antigen im Vergleich zu HA1.7-Zellen, die durch die mit der Kontrolle transfizierten L-Zellen stimuliert worden waren (6).
  • BEISPIEL 9
  • Serrate exprimierende, Antigen präsentierende Zellen induzieren regulatorische T-Zellen
  • Der Klon HA1.7 wurde mit dem Peptid HA306–318 und L-Zellen (die DRB1*0101 als Antigen-präsentierende Zellen exprimieren) in Gegenwart von 2% IL-2 gemischt. Die L-Zellen wurden entweder mit Kontrolle oder Serrate exprimierendem Retrovirus transfiziert. Nach 7 Tagen in Kultur wurden die HA1.7-Zellen geerntet, gewaschen und bestrahlt, bevor sie mit frischem HA1.7 gemischt wurden (unter Verwendung von 2 × 104 jeder Population). Die Zellen wurden für weitere 2 Tage kultiviert, bevor sie mit Peptid (1,0 Mikrogramm/ml) + normalen Antigen-präsentierenden Zellen (DRB1*0101 PBMCs) stimuliert wurden. Die Messung der Proliferationsantwort erfolgte nach 72 Stunden, nachdem für die letzten 8 Stunden der Kultur Tritium-markiertes Thymidin zugegeben worden war. Die Ergebnisse für die frisch kultivierten HA1.7 sind in 7 dargestellt:
    • a) alleine
      Figure 00170001
    • b) + IL-2
      Figure 00170002
    • c) + Kontroll-Virus induziertem HA1.7, dann Peptid + DRB1*0101 PBMC
      Figure 00170003
    • d) + Serrate-Virus induziertem HA1.7, dann Peptid + DRB1*0101 PBMC
      Figure 00170004
  • Ergebnisse: HA1.7, das durch die Serrate exprimierenden L-Zellen induziert wurde (Serrate-induziertes HA1.7), verhinderte die Antwort von normalem HA1.7 auf einen normalen Antigen-Stimulus (7). Dies zeigt die Fähigkeit von Zellen, die durch Exposition gegenüber Serrate tolerant gemacht wurden, ihre Toleranz an eine naive Zellpopulation weiterzugeben (infektiöse/Bystander-Toleranz).
  • BEISPIEL 10
  • Die Regulation, die durch Delta exprimierende T-Zellen induziert wird, ist Antigen-spezifisch
  • Mäuse erhielten Injektionen mit 107 T-Zell-Hybridomzellen, die entweder mit Delta oder Kontrollretrovirus transduziert waren. Das Hybridom war 2BC3, das Spezifität für das Peptid 110–131 von Der p1 besitzt. Zur gleichen Zeit erhielten die Tiere entweder Der p1 oder Ovalbumin, das in vollständigem Freunds Adjuvans emulgiert war. 7 Tage später wurden die Lymphknotenzellen entfernt und 4 × 105 Zellen wurden in Gegenwart von der p1 oder Ovalbumin kultiviert (unter Verwendung desselben Antigens, mit dem bereits die Immunisierung vorgenommen worden war).
  • Die Produktion von IL-2 wurde 24 Stunden nach dem Start der Kultur gemessen. Die Stimulations-Indizes für die IL-2-Produktion sind in den 8a (Antworten von Tieren, die mit Der p1 immunisiert worden waren) und 8b (Antworten von Tieren, die mit OVA immunisiert worden waren) für Tiere dargestellt, die Injektionen mit Hybridomen erhalten hatten, die mit der Kontrolle (puro) oder mit Delta (delta)-Retrovirus transfiziert worden waren.
  • Ergebnisse: Die Antwort auf Der p1 bei Tieren, denen delta exprimierende 2BC3-Hybridome injiziert worden waren, war praktisch vollständig aufgehoben, wogegen die Antwort auf Ovalbumin unbeeinflusst war. Diese Daten sind in den 8a und 8b gezeigt, wo jeder Punkt die IL-2-Produktion durch eine individuelle Maus gegen Antigen als einen Stimulations-Index (SI) bezogen auf die Kontrollantworten (ohne Antigen-Zugabe) zeigt.
  • BEISPIEL 11
  • Delta wird während der Induktion von Toleranz auf T-Zellen exprimiert
  • HA1.7 wurde in Gegenwart von Peptid HA306–318 (50 μg/ml) in Abwesenheit von APCs kultiviert. Solche Bedingungen resultieren in einem Zustand der Toleranz bei HA1.7. Nach 0, 30, 120, 240 oder 360 Minuten wurden die Zellen (1,5 × 106) geerntet, pelletiert und eingefroren. RNA wurde aus den Zellpellets durch Homogenisieren in Guanidinthiocyanat-Lösung, gefolgt von CsCl-Dichtezentrifugation, gewonnen. 1 μg RNA wurde unter Verwendung eines Oligo-dT-Primers in cDNA umgewandelt. Von der resultierenden cDNA wurde 1/20 für die PCR (40 Zyklen) verwendet, wobei Primer verwendet wurden, die für das humane Delta-Homolog spezifisch waren. Die PCR-Proben wurden mittels Gelelektrophorese analysiert (9), wobei Spur 1, Marker; Spur 2, t = 0; Spur 3, t = 30 min; Spur 4, t = 120 min; Spur 5, t = 240 min; Spur 6, t = 360 min; und Spur 7 die Negativkontrolle darstellt.
  • Ergebnisse: Ruhendes HA1.7 exprimierte keine Delta mRNA, jedoch erschienen Transkripte innerhalb von 2 Stunden der Initialisierung des Protokolls der Toleranzerzeugung.
  • BEISPIEL 12
  • Analyse der Expression von Notch 1, Serrate 1 und Delta 1 während der Induktion von Toleranz mittels Immunhistologie und in situ-Hybridisierung
  • C57 BL/6J-Mäuse wurden an drei aufeinander folgenden Tagen intranasal entweder mit 100 Mikrogramm Der p1-Peptid 110–131 oder mit einer Kontroll-Lösung (Phosphat-gepufferte Saline, PBS) behandelt. Es ist bekannt, dass die intranasale Verabreichung von Antigen auf diese Weise Toleranz gegen das Antigen induziert. Man ließ einige Tiere dann für 2 Wochen ruhen, bevor eine erneute Belastung mit Antigen durch die Injektion von 50 μg Der p1/CFA subkutan in die Schwanzbasis erfolgte. Die oberflächlich gelegenen Lymphknoten und die Milz der Tiere wurden zu verschiedenen Zeitpunkten danach entnommen (wobei d0 der erste Tag der intranasalen Behandlung oder der erneuten Antigenbelastung ist) und für die Immunhistologie oder in situ-Hybridisierung weiterverarbeitet. Für die Immunhistologie wurden die Gewebe gefroren und 3μm-Schnitte erzeugt, in eiskaltem Aceton fixiert und mit polyklonalen Antikörpern gefärbt, die für Notch 1 und Serrate 1 spezifisch waren. Die Detektion des gebundenen Antikörpers erfolgte unter Verwendung eines mit Meerrettich-Peroxidase konjugierten Ziege-anti-Kaninchen-Antikörpers, wobei die Entwicklung mit Diaminobenzidin als Substrat erfolgte. Delta 1-spezifische Antikörper waren für die Studie nicht verfügbar. Für die in situ-Hybridisierung wurden gefrorene Gewebe geschnitten und in 4% Paraformaldehyd fixiert. Die Schnitte wurden mit Digoxigenin-gekoppelten Antisense-RNA-Sonden, die für Notch 1, Serrate 1 und Delta 1 spezifisch waren, bei 65°C hybridisiert. Die gebundene Sonde wurde durch mit alkalischer Phosphatase konjugiertem Ziege-anti-Digoxigenin-Antikörper detektiert, der unter Verwendung von NBT und BCIP als Substrat entwickelt wurde. Die in den Tabellen 1 und 2 gezeigten Daten sind diejenigen der Immunhistologie bzw. in situ-Hybridisierung. Die Daten stellen die Analyse von Geweben von 5 verschiedenen Mäusen nach intranasalem Peptid alleine (PBS/p110–131 primär) oder nach intranasalem und subkutanem Antigen (PBS/p110–131 erneute Belastung) dar.
    + schwache Färbung, ++ mittlere Färbung, +++ starke Färbung
  • Ergebnisse:
  • Die Basalniveaus von Notch, Delta und Serrate werden in Kontrollmäusen exprimiert, die nur PBS erhielten. Mäusen, denen intranasal PBS und subkutan Antigen verabreicht wurde, zeigten einen moderaten Anstieg der Expression aller drei Moleküle innerhalb von 8 Tagen der erneuten Antigenbelastung. Tiere, denen entweder intranasales Peptid alleine oder intranasales Peptid, gefolgt von erneuter Antigenbelastung, verabreicht wurde, zeigten dasselbe Muster einer gesteigerten Expression von Notch, Delta und Serrate, das schneller und stärker als bei den Kontrollmäusen war.
  • Tabelle 1 Expression von Notch und Serrate-Proteinen während der Induktion der Toleranz
    Figure 00200001
  • Tabelle 2 Expression von Notch, Delta und Serrate-Transkripten während der Induktion der Toleranz
    Figure 00200002
  • Weitere Modifikationen der vorliegenden Erfindung werden den entsprechenden Fachleuten auf dem Gebiet ersichtlich sein.

Claims (18)

  1. Verwendung eines Notch-Liganden oder eines therapeutisch wirksamen Fragmentes oder Derivates davon oder eines Polynukleotides, welches einen Notch-Liganden oder ein therapeutisch wirksames Fragment oder Derivat davon codiert, bei der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in der Immuntherapie.
  2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Immuntherapie die Behandlung einer durch T-Zellen vermittelten Krankheit oder Infektion umfaßt.
  3. Verwendung nach Anspruch 2, wobei die durch T-Zellen vermittelte Krankheit oder Infektion auf eines oder mehrere unter Allergie, Autoimmunität, Transplantatabstoßung, durch Tumor induzierte Anomalien des T-Zell-Systems und infektiöse Krankheiten zurückzuführen ist.
  4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Notch-Ligand unter Serrate, Delta oder Fragmenten oder Derivaten davon ausgewählt ist.
  5. Verwendung eines Notch-Liganden oder eines therapeutisch wirksamen Fragmentes oder Derivates davon oder eines Polynukleotides, welches einen Notch-Liganden oder ein therapeutisch wirksames Fragment oder ein Derivat davon codiert, bei der Herstellung eines Medikaments zur Beeinflussung von gekoppelter Suppression.
  6. Verwendung eines Notch-Liganden oder eines therapeutisch wirksamen Fragmentes oder Derivates davon oder eines Polynukleotides, welches einen Notch-Liganden oder ein therapeutisch wirksames Fragment oder ein Derivat davon codiert, bei der Herstellung eines Medikaments zur Beeinflussung von Infektionstoleranz.
  7. Verfahren des Tolerierbarmachens von T-Zellen gegenüber einem Allergen oder Antigen, wobei man die T-Zellen in Zellkultur antigenpräsentierenden Zellen, die einen Notch-Liganden exprimieren oder überexprimieren, aussetzt bzw. sie mit diesen inkubiert in der Gegenwart des Allergens oder Antigens.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Expression oder Überexpression des Notch-Liganden auf die APC, die mit einem Virus transfiziert ist, der in der Lage ist, den Liganden zu exprimieren, zurückzuführen ist.
  9. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Expression oder Überexpression des Notch-Liganden auf die APC, die durch ein Mittel stimuliert ist, welches die Expression eines einen Notch-Liganden exprimierenden Gens hochreguliert, zurückzuführen ist.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Mittel unter Noggin, Chordin, Follistatin, Xnr3, Fibroblastenwachstumsfaktoren oder Derivaten oder Fragmenten davon ausgewählt ist.
  11. Verfahren nach Anspruch 7, 8, 9 oder 10, wobei die APC unter dendritischen Zellen, L-Zellen, Hybridomen, Lymphomen, Makrophagen, B-Zellen oder synthetischen APCs ausgewählt ist.
  12. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 11, wobei der Notch-Ligand unter Serrate, Delta oder Fragmenten oder Derivaten davon ausgewählt ist.
  13. Molekül, welches einen Notch-Ligandenrest umfaßt, der funktionsfähig mit einem T-Zell-Allergen- oder -antigenrest funktionsfähig gekoppelt ist, so daß beim Aussetzen an T-Zellen beide Reste in der Lage sind, an ihre jeweiligen Stellen zu binden.
  14. Molekül nach Anspruch 12 oder 13, wobei der Notch-Ligandenrest unter Serrate, Delta oder therapeutisch wirksamen Fragmenten oder Derivaten davon ausgewählt ist.
  15. Verwendung eines Fusionsproteins, das einen Abschnitt einer extrazellulären Domäne eines Notch-Liganden und einen Immunglobulin-Fc-Abschnitt umfaßt, bei der Herstellung eines Medikaments zur Immuntherapie.
  16. Verwendung nach Anspruch 15, wobei die extrazelluläre Domäne des Notch-Liganden von Notch, Delta oder Serrate abgeleitet ist.
  17. Verwendung nach Anspruch 15 oder 16, wobei der Fc-Abschnitt IgGFc oder IgMFc ist.
  18. Verwendung eines Mittels, welches in der Lage ist, die Expression von Delta- oder Serrate-Proteinen herabzuregulieren oder deren Präsentation als ein Zellmembranprotein zu vermindern, bei der Herstellung eines Medikaments für die Verwendung bei der Reversion von durch Bakterien, Infektion oder Tumor induzierter Immunsuppression, wobei das Mittel ein Toll-Protein oder ein Knochenmorphogeneseprotein (Bone Morphogenetic Protein) ist.
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