KR100393234B1 - 노츠 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 T-세포, T-세포-항원 발현세포(APC) 반응 및 병원 유기체와 숙주의 면역경쟁 세포사이의 상호반응을 조절하는 치료화합물의 용도에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 노츠단백질과 그 리간드사이의 상호작용을 조절하는 상기 화합물의 용도 및 이식거부반응, 자가면역, 알레르기 및 천식 및 감염성 질병과 같은 조건의 치료에 이와 같은 화합물을 사용하는 것에 관한 것이다.

Description

노츠{Notch}
T-세포와 항원 발현세포(antigen presenting cell; APC) 및 T세포와의 조절된 상호반응은 인체면역시스템의 작용에 중요한 것이다. 그러나 특정 병리학적 상태에서 이와 같은 상호작용을 변형, 양성적으로 혹은 음성적으로 변형하는 것이 치료에 이로울 수 있다. 예를들어, 자가면역, 알레르기 및 거부반응같은 조건에서 음성 T 세포 혹은 T 세포-APT 상호작용의 자극에의한 면역반응의 하향조절(downregulation)을 유도하는 것이 바람직하다. '감염내성' 및 '연쇄억압(linked suppression)' 모델은 내성이 소수의 T 세포에서 유도될 수 있으며 그 후 이들 T 세포가 내성(tolerance)을 다른 T 세포에 전달하여 따라서 효과적으로 면역공격을 예방할 수 있음을 제시하는 것이다. 종양유도된 면역억제, 기생 바이러스 혹은 박테리아성 감염과 같은 다른 병리학적 조건에서 면역억제는 일반적인 특징이다. 따라서, 이와같은 환경에서 감염관용을 전달하는 T 세포 상호작용을 억제하는 것이 바람직하다.
그러나, 지금까지는 이와같은 T 세포과 T 세포-APC의 상호작용과 같은 기초적인 메카니즘이 밝혀지지 않았다.
WO 92/19734의 목적은 인체 노츠(Notch) 및 델타(Delta) 유전자의 뉴클레오티드 배열 및 이에 암호화되어 있는 단백질의 아미노산 배열을 개시하는 것이다.
상기 개시는 노츠 유전자과는 드로소필라(Drosophila)와 같은 해충의 발생학상 세포 계통 발생 교정에 필수적인 것으로 특성화 되어있다.
노츠과에 속하는 단백질은 몇몇의 보존된 펩타이드 모티브를 함유하는 막 수용체이다. 과(科)내의 각 단백질은 세포외 EGF(epidermal growth factor)-같은 반복 및 방수질막(juxtamembrane) Lin-12/노츠(Notch)모티브 특성을 나타낸다. 더욱이 각 단백질은 PEST 배열과 함께 세포질 말단에 6-8개의 앤키린(ankyrin) 반복 모티브를 갖는다. 노츠 리간드는 단백질의 아미노말단과 세포외표면상의 3-8 EGF-같은 반복사이에 20-22 아미노산을 포함하는 진단 DSL 도메인(D.Delta,S,Serrate,L, Lag 2)을 갖는다. 상기 단백질은 보존되지 않은 작용성 도메인과 함께 짧은 세포질 말단을 갖는다.
근래의 증거는 노츠 신호가 흉선세포의 전개가 MHC 인식에 의존하지 않는 CD8+ 계통으로 치우치도록 흉선에서 미성숙 T 세포의 계통(lineage) 실행에 기여함을 나타낸다. (Robey E, et al. Cell 1996, 87:483-492) 흉선에서 성숙하는 동안 자기 관용공정에서 T 세포는 비자기성 항원으로 부터 자기성 항원을 구별하는 능력을 획득한다.(Von Boehmer H, et al. Ann Rev Immunol. 1990;8:531). 메카니즘은 또한 내성을 유도 및 유지하기 위해 말초에 존재하며, 많은 경우에 이들의 중요성이 낮게 평가된다. 이식거부, 자가면역병 및 특정한 비반응성(내성 또는 에네르기) 상태가 항원과 함께 면역에 의해 수용자에게 유도되는 능력을 명확하게 예시하는 알레르겐에 대한 특정한 반응을 나타내는 많은 시험적 모델이 있다. 이들 시스템으로 부터 두가지의 중요한 사실이 제기된다. 첫째는 선택된 조건하에서 항체의 펩타이드 분절을 갖는 면역은 본래의 단백질이 항원투여 면역(challenge immunisation)에 사용되면 그 자체에 대하여 뿐만아니라 같은 분자내의 다른 부분에 대한 특정한 반응이 억제될 수 있다.(연쇄 억제; Hoyne GF, et al. J. Exp Med. 1993; 178:183. 및 Metzler B, Wraith DC. Int. Immunol. 1993;5:1159). 둘째로, 이식의 시험적 모델에서 '감염내성'현상으로 기술되어 있는 바와 같이 특정한 항원에 대하여 내성을 갖도록 하는 면역감응세포가 다른 세포가 반응하지 않도록 하며, 더욱이 세포의 2차 집단은 조절 및 내성을 갖게된다. (Qin Sx. et al. Science 1993;258:974).
이러한 현상에 기초하는 면역 메카니즘은 지금까지 특정화되지 않았다.
본 발명은 T-세포의 활성 변형에 대한 치료화합물의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 노츠(Notch) 단백질과(科)멤버와 이들의 리간드사이의 작용 조절에 대한 화합물의 용도 및 이식 거부반응, 자가면역, 알레르기, 천식, 감염증 및 종양등의 치료에 대한 상기 화합물의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 말초 면역시스템의 정상적인 성숙 세포의 세포표면에 발현되는 노츠(Notch) 수용체과 및 그 리간드, 델타(Delta) 및 세레이트(Serrate),를 발견함에 따른 것이다.
본 발명에 있어서, 면역치료용 약제제조에 있어서 노츠 리간드의 용도가 제공된다.
정상 말초 성숙 면역시스템에서 수용체의 노츠와 이들의 리간드의 발현 패턴은 종래 기술된바 없으나, 본 발명자들은 델타(Delta) 발현은 말초 림프계 조직에서 T세포의 일부(subset)에만 한정됨에 반하여, T 세포가 노츠 1 mRNA를 본질적으로 발현함을 나타낸다. 세레이트 발현은 말초에서 항원 발현세포(APCs)의 일부에만 한정된다(도 1). 따라서 상기 수용체 리간드과는 다른 조직에서 나타내어진 바와 같이 배발생시기를 지나서, 면역시스템에서 세포 운명의 결정을 계속하여 조절할 수 있다(Ellisen LW, et al. Cell 1991;66:649). 노츠 신호는 말초 비반응성(내성 혹은 에네르기) 유도에 중심적인 역할을 하며 연쇄억제 및 감염 내성을 물리적으로 설명할 수 있는 것이다.
나아가, 본 발명은 T 세포 매개성 반응의 처리에 노츠-리간드를 사용하는 바에 관한 것이다. 따라서, 순수한 T 세포 집단을 알레르겐 혹은 항원존재하에 APC에의해 발현되는 노츠-리간드에 노출함으로써, 노츠-리간드가 상기 알레르겐 혹은 항원에 대하여 T 세포 집단 내성을 형성할 수 있는 것으로 관찰되었다. 나아가 상기 T 세포 집단은 순수한 T 세포의 제 2 집단에 후속적으로 노출되는 경우, 상기 알레르겐 혹은 항원에 제 2 집단 내성을 부여할 수 있다.
따라서 본 발명은 또한 노츠-리간드를 영향을 주는 연쇄 내성 및/또는 방관내성(이 기술 분야에 감염 내성으로 또한 알려져 있다.)에 사용하는 것에 관한 것이다.
다른 견지에 있어서, 본 발명은 노츠-리간드를 작용성 노츠-단백질 혹은 노츠 신호 경로 발현의 조절에 사용하는 것에 관한 것이다.
상기한 본 발명에 있어서, 상기 노츠-리간드는 상기 T 세포를 항원 발현세포 (APCs) 혹은 노츠-리간드를 알레르겐 혹은 항원에서 노츠-리간드를 발현 혹은 과발현 할 수 있는 세포와 함께 배양/혼합함으로 T 세포에 노출될 수 있다. 상기 노츠-리간드 유전자의 (과)발현은 노츠-리간드를 발현할 수 있는 유전자에 의해 형질감염된 APCs 혹은 내인성 노츠-리간드 유전자의 상향-조절 발현을 가능하게 하는 약제(agent)에 노출되는 APCs에 의해 도입될 수 있다.
노츠-리간드의 발현에 영향을 주는 적절한 약제로는 델타(Delta) 및/또는 세라이트(Serrate) 유전자의 발현에 영향을 주는 약제를 포함한다. 예를들어, 델타 발현에서, 세포외 BMPs(골 형태발생 단백질, Wilson, P.A. and Hemmati-Brivanlou A. 1997 Neuron 18: 699-710, Hemmati-Brivanlou, A and Melton, D. 1997 Cell 88:13-17)를 이들의 수용체에 결합함으로써 아케이트(Achaete)/스쿠테 (Scute) 복합물 전사 인자 발현의 저해에 기인하는 하향-조절된(down-regulated) 델타 전이가 유도된다. 상기 복합물은 델타 발현 조절에 직접 관여하는 것으로 여겨진다. 따라서, BMPs가 그 수용체에 결합하는 것을 저해하는 어떠한 약제가 델타 및/또는 세레이트 발현을 증대시킬수 있다. 이와같은 약제로는 노긴(Noggin), 초르딘(Chordin), 폴리스타틴(Follistatin), Xnr3, FGFs, 프린지(Fringe), 그 유도체 및 변종을 포함한다(noggin-Smith W.C. and Harland, R.M Cell 70:829-840, chordin-Sasai, Yet al., 1994 Cell 79: 779-790 참조). 노긴 및 초르딘은 BMPs에 결합되고 따라서 감소된 델타 전이를 유도하는 그의 신호 케스케이드 활성을 방지한다.
몇몇 질병상태에서, 신체는 면역-타협될 수 있으며 이는 가하여진 면역억제를 극복하기 위해 델타 및/또는 세레이트의 발현을 하향조절하는 것이 바람직한 것이다. 델타 및/또는 세레이트의 발현을 억제하는 약제가 이와 같은 상황에 사용될 수 있다. 델타 및/또는 세레이트의 발현을 억제하는 약제의 예로는 톨 단백질(Toll protein)(Medzhitov, R.et al., 1997 Nature 388: 394-397) BMPs 및 노긴, 초르딘, 폴리스타틴, Xnr3, FGFs 및 프린지의 생성을 감소시키거나 혹은 방해하는 다른 약제를 포함한다. 따라서, 본 발명은 델타 혹은 세레이트 단백질의 발현을 하향조절할 수 있는 약제를 박테리아 감염 혹은 종양-유도된 면역을 억제하기 위한 적절한 약제제조에 사용하는 것에 관한 것이다.
상기한 바와 같이, 본 발명은 또한 세포막 혹은 신호경로상의 노츠 단백질의 발현 혹은 표현을 조절하는 것에 관한 것이다. 이들은 내성(연쇄 및/또는 방관) 유도에 참여하는 T 세포 매개성 반응에 포함되는 것으로 나타내어져 왔다. 세포 표면에 완전한 작용성 노츠-단백질의 표현을 증대시키는 약제로는 드로소필라 (Drosophila)의 쿠즈바니언(Kuzbanian) 유전자(Dkuz, Pan, D and Rubin, G.M. 1997 Cell 90: 271-280) 및 다른 아다말리신(Adamalysin) 유전자과멤버의 생성물과 같은 매트릭스 금속단백질분해효소를 포함한다. 완전한 작용성 세포막 단백질로서 그 표현을 감소 혹은 방해하는 약제로는 히드록시메이트-기초 저해제와 같은 MMP 저해제를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 '항원 발현세포등'은 이를 APCs로 한정하는 것은 아니다. 이 기술분야의 숙련된 자는 필요로하는 노츠-리간드를 T 세포 집단에 제공할수 있는 어떠한 매개체가 사용될 수 있음을 이해할 수 있으며, 용어 APCs는 편리하게 이들 모두를 칭하는 것으로 사용된다. 따라서 적절한 APCs의 예로는 수상돌기세포, L 세포, 하이브리도마, 림프종, 마크로파아지, B 세포 혹은 지질막과 같은 합성 APCs를 포함한다.
APCs가 노츠-리간드를 발현할 수 있는 유전자로 형질감염되는 경우, 형질감염(transfection)은 레트로바이러스 혹은 아데노바이러스와 같은 바이러스 혹은 유전자를 세포에 운반할 수 있는 다른 매개체 혹은 방법으로 행하여질 수 있다. 이들로는 유전자치료에 효과적인 것으로 알려져 있는 어떠한 매개체 혹은 방법을 포함하며 레트로바이러스, 리포좀, 일렉트로포레이션(electroporation), 아데노바이러스, 아데노-관련(adeno-associated) 바이러스, 헤르페스 바이러스, 백시니아(vaccinia)와 같은 다른 바이러스, 인산칼슘 침전된 DNA, DEAE 덱스트란 보조 형질감염, 마이크로주사, 폴리에틸렌 글리콜, 단백질-DNA 복합물을 포함한다.
이와같은 매개체 혹은 방법을 단독으로 혹은 함께 사용함에 있어서, 유전자유도는 세포의 특정한 개체로 위치를 자리-이동하도록하고, 따라서 본 발명의 방법은 생체내에서 행하여지게 된다. 예를들어, 바이러스는 DNA 흡수 효율을 증대시키기위해 리포좀과 결합하여 사용될 수 있다. 이동 자리의 특이성은 특정한 단백질을 바이러스 피복면 혹은 리포좀에 포함시킴으로써 달성할 수 있다.(예를들어 수상돌기세포/마이크로파아지에 대한 단일사슬 항체와 CD11c의 반응).
바람직하게는 유전자(예를들어 세레이트) 발현이 항원발현에 연쇄되는 구조로 사용될 수 있다. 따라서, APCs (과)발현 세레이트는 또한 관련된 항원을 높은 수준으로 발현하며 따라서 적절한 특이성을 갖는 T 세포와 선택적으로 반응한다.
나아가, 본 발명의 또 다른 견지에 있어서, 본발명은 T 세포에 노출되는 경우 두 부분이 이들 각각의 자리에 결합될 수 있도록 T 세포 알레르겐 혹은 항원부위에 작용적으로 결합된 노츠-리간드 부분을 포함하는 분자에 관한 것이다. 알레르겐 혹은 황원 부위가 가까이 인접함으로써 노츠-리간드 부위의 요구되는 특이성이 제공됨에 따라 알레르겐 혹은 항원부위가 기초가 되어 이와같은 분자는 알레르겐 혹은 항원에 대하여 항원/알레르겐 특정 T 세포내성을 부여하게 된다.
상기 항원 혹은 알레르겐 부위는 예를들어 합성 MHC-펩타이드 복합물일 수 있다. 이는 항원요소를 갖는 항원구를 포함하는 MHC 분자 분절이다. 이와같은 복합물은 Altman JD et al Science 1996 274: 94-6에 개시되어 있다.
나아가 보다 바람직하게는, 상기 화합물은 노츠 혹은 노츠 리간드 세포외 영역의 분절 및 면역글로블린 Fc 분절, 바람직하게는 IgGFc 혹은 IgMFc를 포함하는 융합 단백질(fusion protein)이다.
상기 본 발명의 모든 견지에 있어서, 상기 노츠-리간드가 단백질의 세레이트과 혹은 단백질의 델타과, 그 유도체, 분절 혹은 유사체의 노츠-리간드인 것이 바람직하다.
T 세포에 의해 매개된 것으로 기술할 수 있는 병에 걸린 혹은 감염된 상태는 하나 또는 그 이상의 천식, 알레르기, 이식거부반응, 자가면역, T 세포 시스템에 대하여 종양 유도된 이상(abberation) 및 플라스모디움종(Plasmodium species), 미크로필라리아(Microfilariae), 헬민스(Helminths), 마이코박테리아(Mycobacteria), HIV, 사이토메갈로 바이러스(Cytomegalovirus), 슈도모나스(Pseudomonas), 톡소플라즈마(Toxoplasma), 에키노코쿠스(Echinococcus), 헤모필러스 인플루엔자 타입 B(Haemophilus influenza type B), 홍역, C형 간염(Hepatitis C) 혹은 톡시카라(Toxicara)에 기인한 것과 같은 감염성 질병을 포함한다. 따라서, 적절한 알레르겐 혹은 항원과 함께, 본 발명에 의하여 상기 질병 혹은 감염을 치료하기위해 노츠-리간드를 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 침범한 유기물에 의해 유도된 면역 억제를 검출하는 방법을 제공하는 것이다. 이와같은 유기물은 세레이트, 노츠 및/또는 델타 혹은 그 유도체의 속멤버 혹은 이들의 생체내 발현에 영향을 주는 단백질을 용해성 형태로 발생 시킴으로써, 감염 관용 면역억제를 유도한다. 상기 방법은 비-막 결합된 세레이트, 델타, 노츠 혹은 그 유도체의 생체내 존재에 대한 분석을 포함하며 바람직하게는 세레이트, 델타 혹은 노츠 혹은 그 유도체에 대한 항체를 포함한다.
증대된 혹은 감소된 노츠, 델타/세레이트 발현 및/또는 진행을 검출하는 선별분석(screening assays)법은
1. 델타/세레이트, 노츠 및 프린지 발현은
예를들어,
(a) 면역조직화학법 혹은 유동 세포분석법으로 특정한 항체 염색(staining) 에 의한 단백질 수준.
(b) 양적인 역전사-중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)에 의한 RNA 수준. RT-PCR은 노츠 1과 노츠 2, 세레이트 1과 세레이트 2, 델타 1과 델타 2, 델타 3과 프린지(Fringe)에 대한 특정한 프라이머를 발현하는 내재성 유전자를 측정하기 위해 인-빌트 표준법(in-built standards)으로 규준 플라스미드(control plasmid)를 사용하여 행할 수 있다. 이 구조는 확인된 새로운 리간드멤버로 조절할 수 있다.
(c) 세포 부착분석에서 작용성 수준.
을 사용하여 배양주에 시험 화합물에 대한 분리된 세포를 노출시킨 후 평가된다.
증대된 델타/세레이트 혹은 노츠 발현은 노츠를 발현시키는 세포와 그 리간드 델타/세레이트사이의 부착이 증대되도록한다. 시험 세포는 배양주의 특정한 처리에 노출되거나, 혹은 적층되는 표적세포(노츠/델타/세레이트 단백질로 형질감염됨)를 방사선동위원소를 사용하여 식별하거나 혹은 형광으로 식별할 수 있다. 세포 혼합물은 37℃에서 2시간동안 배양할 수 있다. 부착되지 않은 세포는 씻어내고 부착된수준은 평평한 표면에서 방사능/면역형광의 수준으로 측정한다.
이와같은 방법을 사용함으로써, 노츠-단백질 혹은 노츠-리간드의 발현 혹은 진행에 영향을 주는 화합물 혹은 노츠-리간드를 검출할 수 있다. 본 발명은 또한 상기 분석법으로 검출할 수 있는 화합물 혹은 노츠-리간드에 관한 것이다.
본 발명은 또한 (a) 노츠 단백질 및 노츠 단백질에 결합할 수 있는 리간드와 (b)화합물을 접촉시키는 단계; 및 상기 화합물이 상기 리간드가 노츠단백질 (바람직하게는 노츠 단백질이 T 세포와 관련된 경우)에 결합되도록 영향을 주는 지를 결정하는 단계;를 포함하는 분석방법을 포함한다.
본 발명에서 사용되는 노츠-리간드는 바람직하게는 델타 혹은 세레이트 과 멤버의 단백질 혹은 폴리펩티드 혹은 그 유도체이다. 이들은 바람직하게는 이 기술분야의 숙련된 기술자에게 잘 알려져있는 표준 재조합법을 사용하여 얻어진다. 본 발명에 의한 이와같은 화합물을 발생시키기 위해 사용되는 적절한 유전자 배열은 WO97/01571, WO 96/27610 및 WO 92/19734로 부터 수득할 수 있다. 그러나 본 발명은 상기 문헌에 개시되어 있는 노츠, 델타 및 세레이트 배열로 한정하는 것은 아니다. 보다 바람직하게는 노츠, 델타 혹은 세레이트 혹은 그 과의 멤버, 단백질 혹은 폴리펩티드 혹은 그 유도체는 노츠, 델타 혹은 세레이트 혹은 과멤버의 분절 혹은 이와 같은 분절의 유도체이다. 본 명세서에서 사용된 용어 '노츠 리간드'는 나아가 노츠 단백질류와 상호반응하는 어떠한 리간드 혹은 리간드과멤버를 포함하며, '토포리슴 단백질(toporythmic proteins)'으로 불리는 단백질 그룹 즉, 델타, 세레이트, 델텍스(Deltex) 및 스플리트 인핸서(Enhancer of split) 유전자 뿐만아니라 교잡할 수 있는 유전자 배열의 능력에 의해 혹은 노츠, 델타 혹은 세레이트 단백질 혹은 표현 상호작용을 나타내는 그 유전자의 능력에 따라 동일시할 수 있는 상기 유전자과의 다른 멤버를 포함한다.
노츠, 델타 및 세레이트는 처음에 초파리에서 대하여 기술되었으며, 따라서 각각 노츠 수용체 및 노츠-리간드과멤버의 원형 단백질을 나타낸다. 다중 노츠 단백질및 리간드는 많은 무척추동물문 및 척추동물문종에서 기술되고 있으나 이들의 명명법은 파리에 사용되는 경우와 다를수 있다. 예를들어 노츠는 Lin 12와 Glp 1에 상당하는 것이며, 세레이트/델타는 Jagged, Apx 1 및 Lag-2에 상응하는 것이다.
본 발명의 약리학적 배합은 이 기술분야에 잘 알려진 원리에 따라 배합될 수 있다. 따라서 결합제(excipient)의 물성 및 활성양은 배합하려는 본 발명의 화합물에 의존한다.
바람직하게는 상기 약리학적 조성물은 단위 사용양의 형태이다.
약제학적 배합물의 형태로 환자에게 투여되는 본 발명에 의한 화합물의 사용량은 적절한 의사에 의해 결정될 수 있다.
본 발명에 의한 배합물의 바람직한 투여 경로로는 근육내 및 복막내, 정맥내 주사, 내비강 흡입, 폐 흡입, 피하, 피내(皮內), 내-동맥, 내포막(內包膜), 국소 및 소화관을 경류(예를들어 Peyers patches)를 포함하는 통상의 투약방법중 어떠한 방법이 사용된다.
본 명세서에서 본 발명의 단백질 혹은 폴리펩티드와 관련되어 사용된 용어 '유도체(derivative)'는 폴리펩티드에서 결과물인 단백질이 노츠-노츠 리간드 상호작용을 조절할 수 있는 능력을 갖으면 배열로 부터 혹은 배열에 대한 하나 (또는 그 이상의) 아미노산 잔기의 어떠한 치환, 변형, 개변, 복위, 결실 혹은 부가를 포함한다.
본 명세서에서 본 발명의 단백질 혹은 폴리펩티드와 관련되어 사용된 용어 '변이체(variant)'는 배열로 부터 혹은 배열에 대한 하나 (또는 그 이상의) 아미노산 잔기의 어떠한 치환, 변이, 변형, 복위, 결실 혹은 부가를 포함하며, 이는 폴리펩티드상의 그 결과물인 단백질이 노츠-노츠 리간드 상호작용을 조절할 수 있는 능력을 갖는 것이다.
본 발명의 단백질 혹은 폴리펩티드와 관련되어 본 명세세에서 사용된 용어 '유사체(analog)'는 어떠한 펩티도미메트(peptidomimetic) 즉, 모 단백질 혹은 폴리펩티드에 대하여 유사한 방법으로 노츠-노츠 리간드 상호작용을 조절할 수 있는 능력을 갖는 화학적 화합물을 포함한다.
만약 화합물이 노츠와 그 리간드의 상호작용을, 바람직하게는 치료효과를 제공하기에 충분한 정도로 저해 혹은 증대시킬수 있으면 화합물은 노츠-노츠 리간드 상호작용을 조절할 수 있는 것으로 여겨진다.
본 명세서에서 사용된 표현 '노츠-노츠 리간드'는 노츠과 멤버와 하나 또는 그 이상의 이와같은 멤버에 결합할 수 있는 리간드 사이의 상호작용을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 '치료'는 진단 및 예방적용을 포함하는 것으로 이해된다.
용어 '의약(medical)'은 인체 및 수의학에 대한 적용을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 단백질 및 폴리펩티드는 동의어라 할 수 있으며, 단백질은 단지 폴리펩티드에 존재하는 배열에 비하여 비교적 긴 아미노산 배열을 나타내는 일반적인 의미로 사용된다.
이하, 도면을 참조하여 본 발명에 대하여 설명한다. 그러나 본 발명을 이로서 한정하는 것은 아니다.
도 1은 실시예 1에 기술한 바와 같이 실시한 원위치(in situ) 교잡 결과를 나타내는 것이다.
도 2는 실시예 4에 기술한 시험 결과를 나타내는 것이다.
도 3은 실시예 5에 기술한 시험결과는 나타내는 것이다.
도 4는 실시예 6에 기술한 시험결과는 나타내는 것이다.
도 5는 실시예 7에 기술한 시험결과를 나타내는 것이다.
도 6은 실시예 8에 기술한 시험결과는 나타내는 것이다.
도 7은 실시예 9에 기술한 시험결과는 나타내는 것이다.
도 8a 및 8b는 실시예 10에 기술한 시험결과는 나타내는 것이다.
도 9는 실시예 11에 기술한 시험결과는 나타내는 것이다.
실시예 1
노츠, 델타 및 세레이트는 말초 면역계에서 발현됨
노츠 1, 델타 1 및 세레이트 1에 대한 특정한 안티센스 RNA 탐침(probes)을 합성하고 디옥시제닌 표식된-UTP를 편입하였다. 각 탐침을 교잡(hybridization) 버퍼에 용해시키고 70℃로 5∼10분간 가열하고 미리 4% 파라포름알데히드 + PBS로 고정한 지라 혹은 흉선의 10㎜ 마디(section)를 갖는 TESPA 코팅된 슬라이드에 첨가하였다. 슬라이드를 밤새 65℃로 교잡하였다. 다음날, 슬라이드를 65℃에서 두번 그리고 실온(RT)에서 두번 1xSSC/50% 포름아미드/0.1% Tween 20으로 세척하였다. 슬라이드를 0.1M 말레산/0.15M NaCl/0.1% Tween 20 pH 7.5(MABT)로 실온에서 두번 세척한 후 2시간 동안 MABT + 20% 염소 혈청 + 296 Boehringer 차단체(BBR)로 차단하였다. 슬라이드를 밤새 실온에서 안티-디그옥시데닌(anti-digoxidenin) Fab분절로 배양하였다. MABT로 4번 세척한 후, 슬라이드를 알카리 기질 버퍼로 2번 더 세척하였다. 결합된 안티센스 RNA 탐침의 존재는 슬라이드를 NBT + BCIP를 함유하는 기질 버퍼에서 어둡게하여 배양함으로써 검출하였다. 슬라이드를 헤모톡실린(haemotoxylin)으로 대조염색하고 Depx 탑재 매질에 탑재하였다.
결과: 이들 교잡의 결과를 도 1에 나타내었으며, 결과는 3개월된 쥐의 비장에서, 델타 및 세레이트가 배중심(gc)이아닌 동맥주변 시이드(sheath)에서 분리된 세포에 의해 발현된다. 노츠는 동맥주변 시이드의 많은 세포에서 다시 발현된다.
실시예 2
델타-Fc 융합 단백질의 생성
pIG-1 [D. Simmons, 'Cloning cell surface molecules by transient surface expression in mammalian cells' pp 93-128, Cellular Interactions in Development Ed. D. Hartley, pub. Ox. Uni. Press (1993)] 발현 벡터는 인체 IgG1-Fc영역에 연쇄된 델타 1의 세포외 부분을 함유하는 융합 단백질이 생성되도록 한다. 델타 1 단백질의 세포외 영역에만 함유되어있는 제한 효소 분절은 pIG-1 벡터내로 복제된다. 결과물인 플라스미드는 E. Coli MC 1061내로 옮기고 테트라시클린/엠피실린 10㎍/㎖를 함유하는 SOB에서 성장시켰다. 정제된 벡터를 사용하여 COS 세포를 시험관내에서 형질감염시켰다. COS 세포를 50∼75% 컨플루언시(confluency)가 되도록 성장시키고 DEAE-덱스트란법으로 1접시당 플라스미드 DNA가 10㎍으로 형질감염시켰다. 형질감염후 24시간 경과시, 상기 배양매질을 1% FCS를 함유하는 배양 매질로 교체하고 세포를 시험관내에서 3∼6일동안 더 배양하였다. 세포를 5mins간 5000rpm 으로 회전시켜 세포와 조직파편을 펠릿화하고, 상층액을 제거하여 필요로할 때까지 저장하였다. 세파로세(Sepharose(Phamacia)) 단백질 50% 슬러리 2㎖를 첨가하여 델타-Fc 용합물을 배양 상청액으로 부터 정제하고 밤새 4℃에서 회전시켰다. 세파로세 비드를 0.45㎜ 필터를 통과시켜 배양 상층액을 분리, 세척하고 10㎖ 플라스틱 컬럼으로 운반하였다. 상기 델타-Fc융합 구성(construct)을 용리 버퍼 pH 4.0 2㎖로 추출하였다. 상기 용출물을 1 M Tris 염기를 첨가하여 중화하였다.
실시예 3
노츠-리간드 신호 경로가 관찰될 수 있는 모델의 예
자기항원에 대한 말초 내성은 TCR 리간드가 단지 말초에서만 자기 항원으로서 발현되는 T 세포 수용체(TCR) 형질전환된 쥐에서 분석할 수 있다. 이식 항원에 대한 말초 내성은 수용자를 T 세포 항체로 예비-처리하거나 혹은 동시자극을 차단하는 방법등을 포함하는 여러가지 방법으로 유도할 수 있다. 따라서 연쇄억제 및 감염내성 모두를 실증할 수 있다. 알레르겐에 대한 말초 내성은 항원 유도된 펩타이드의 내비강 이동에 의해 유도될 수 있다. 노츠-노츠 리간드의 발현은 알렌르겐 흡입 및 실증된 내성을 변형한 후 기관 및/또는 림프계 조직내로 보급되는 세포에서 측정한다.
더욱이, 감염인자를 갖는 감염 시험모델에서, 노츠-노츠 리간드의 발현은 유기물(병원체) 및 숙주에서의 면역감응세포에서 측정할 수 있다.
실시예 4
델타 발현 하이브리도마스가 항원 프라임드 림프구(antigen primed lymphocytes)의 반응을 억제함
쥐를 집 먼지 미세 알레르겐(House dust mite allergen; HDM), Der p1(p110-31)의 면역우성 에피토프(immunidominant epitope)를 함유하는 합성 펩타이드 혹은 OVA(ovalbumin, 달걀 백색 단백질)로 면역시켰다. 일주일후, 림프 결절 세포(LNCs)를 제거하여 세포 부유물을 제조하였다. 다른 항원으로 면역시킨 동물 림프결절을 별도로 보관하였다. 이들 세포를 프라임드(primed) LNCs라 한다.
델타가 막 단백질로 발현되도록 T 세포 하이브리도마를 완전한 길이의 델타 혹은 규준 플라스미드(control plasmid)로 형질감염하였다. 2일 후, 배양주에서 하이브리도마스가 증식되지 않도록 혹은 세포질분열되지 않도록 방사선을 조사하였다. 따라서 분석시 측정되는 유일한 반응은 림프 결절세포에서만 유래한 것이다.
상기 방사선 조사된 하이브리도마스는 상기 프라임드 LNCs를 함유하는 배양주에 수를 증가시키기 위해 첨가하였다. 적절한 항원(즉, p110-131 혹은 OVA)을 첨가하였으며 세포를 24시간동안 배양하였다. 그 후 상층액을 수집하였으며 IL-2(주요 T 세포 성장 요소) 함량을 분석하였다. 72시간후에 림프 결절 세포의 증식반응을 또한 측정하였다.
결과: 조절 플라스미드로 발현된 방사선 조사된 하이브리도마스의 존재하에 배양된 림프 결절 세포는 도 2에 나타낸바와 같은 계속 증식되며 배양주에서 적절한 항원으로 자극되는경우 IL-2를 분비하였다. 이들의 반응은 LNC:하이브리도마가 1:1의 비율로 유지되었다. 대조적으로, 림프 결절 세포에 의한 IL-2의 증식 반응 및 생성은 적절한 항원을 갖는(1:1 비율로) 하이브리도마스 발현 완전한 길이의 델타존재하에서 배양되는 경우 최소 88%로 감소되었다. 하이브리도마스를 조절 바이러스(개방 원형), 델타 바이러스(개방 사각형)으로 형질감염시켰다. 도 2는 배양시작후 72시간동안3H-Tdr 편입을 cpm(counts per minute)로 나타낸 결과이다. 림프 결절 세포(LNC)의 cpm은 하이브리도마스 발현 델타 혹은 규준 구성(control construct)으로 배양하였다.
cell/well의 총수 = 4 x 105(즉, LNCs의 수는 하이브리도마스:LNC의 비율에 따라 변하며 따라서 cpm이 변화된다.)
p110-131 LNC는 Der p1(p110-131)로 프라임된 세포이며, OVA LNC는 OVA로 프라임된 세포이며, 2BB11 및 2BC3은 두가지의 다른 Der p1 반응 하이브리도마스이다.
이들 결과는 델타 발현 T 세포에 의한 반응억제가 운반도중에 전달됨을 나타낸다. 배양 시스템에서 Derp 1에 대한 델타 발현 T 하이브리도마스가 OVA 프라임드 T 세포의 반응을 저해할 수 있으나, 이는 배양시스템에 의한 세포의 근접한 유사성으로 인하여 특이성이 명백하게 결여된다. 또한, 도 8a 및 8b에 나타낸 결과는 면역원에 대하여 면역 반응을 조절하는 효과가 있음으로 동물에서 델타 발현 하이브리도마는 항원 특이성을 면역원과 공유하여야 한다. 이경우, 델타 발현 T 세포는 이들이 같은 APC에서 같은 항원을 인식한다면, 단지 반응 T 세포와 유사하게 도입된다.
실시예 5
세레이트 발현 수상돌기 세포가 T 림프구의 항원 프라이밍을 방지
수상돌기 세포(DCs)는 면역시스템에서 1차 항원 발현 세포이며 T 세포 반응의 자극에 중요한 것이다. DCs는 비장에서 수득하였고 완전한 길이의 세레이트 단백질이 발현되도록 하는 레트로바이러스 혹은 조절 레트로바이러스로 형질감염시켰다. 또한 상기 DCs에 37℃의 시험관내에서 3시간동안 HDM 펩타이드 p110-131를 적용하였다. 그 후 DCs를 세척하였으며 105cells/mouse로 피하에 적용하여 감염되지 않은 쥐가 면역되도록하였다. 7일 후, LNCs소모가 회복되었으며 배양주에서 4 x 105cell/well의 펩타이드로 다시 자극시켰다. 쥐를 단지 펩타이드-적용된(pulsed) DCs로 면역시킴으로써 이는 면역반응의 프라이밍에 대한 이들 세포의 능력을 측정할 수 있다.
결과: 도 3은 조절 형질감염된(개구 원형) 혹은 세레이트 형질감염된(개구 장방형) 수상돌기 세포(DCs)로 면역된 동물로 부터 배양후 72 시간 경과시 LNCs의 cpm으로 나타낸 결과이다.
DCs발현 세레이트를 이용한 쥐의 면역은 조절 DCs로 면역시킨경우에 비하여 림프 결절로 부터 회복된 세포의 수가 10배 감소하였다. 나아가 본 발명자들은 DCs + 세레이트로 면역시킨 쥐의 LNCs는 조절 DCs로 면역시킨 쥐의 세포에 비하여 IL-2를 증식 혹은 분비하지 못하였다.
실시예 6
델타 발현 T 세포 하이브리도마스는 동물에서 Der p 1 항원에 대한 면역 발달을 저해할 수 있음
T 세포 하이브리도마스(Der p 1과 반응)를 델타가 세포 표면에 발현되도록 쥐 델타 함유 레트로바이러스로 혹은 조절 레트로바이러스로 형질감염시켰다. C57 BL 쥐에 방사선 조사된 하이브리도마스 천만 i.p.를 주입하였으며 CFA(Complete Freunds Adjuvant)에서 에멀션화된 Der p 1 50㎍으로 피하에서 면역되도록 하였다. 7일후, 소모된 림프 결절을 수집하였으며 Der p 1(10㎍/㎖), Der p 1 펩타이드 110-131(10㎍/㎖) 혹은 Der p 1 펩타이드 81-102(10㎍/㎖)을 사용하여 4 x 105cell/well로 배양하였다. 배양주를 37℃로 72시간동안 배양하였으며 배양의 마지막 8시간동안 삼중수소화 티미딘(tritiated thymidine)을 첨가하였다.
규준 형질감염된(퓨로(puro)) 혹은 델타 형질감여된(Delta-FL)을 주입한 동물세포의 증식분석결과를 도 4에 나타내었다.
결과: 규준 바이러스 형질감염된 하이브리도마스가 주입된 동물의 LNC는 Der p 1, 펩타이드 110-131 혹은 펩타이드 81-102존재시 배양주에서 IL-2가 높은 수준으로 생성하고 증식되었다. 이와 달리, 델타 발현 하이브리도마스가 주입된 동물 세포는 어떠한 Der p 1 항원에 대하여도 반응하지 않았다.(도 4).
실시예 7
델타 발현 인체 T 세포가 정상 T 세포의 반응을 차단함.
인플루엔자-반응 인체 T 세포 클론(HA1.7)을 레트로바이러스 구성물(construct)을 사용하여 쥐 델타로 형질감염시켜 델타 단백질이 세포 표면에 발현되도록 하였다. 정상 HA 1.7을 갖는 상기 세포집단의 혼합이 펩타이드 HA 306-318을 갖는 정상 HA 1.7 및 항원 발현세포와 후속적으로 반응되지 않도록 하였다. 5 x 105HA 1.7을 1 x 106방사선조사된 DRB1*0101 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) + 1㎍ HA306-318과 혼합하였으며 37℃에서 6시간 배양한후 5% 림포컬트(lymphocult)(IL-2 함유 매질)를 총 부피가 1㎖가 되도록 첨가하고 배양시작 후 24시간 경과시, 델타 혹은 규준 레트로바이러스를 첨가하거나 아무것도 첨가하지 않았다.
배양시작후 7일 경과시, 세포를 수집, 세척하고 방사선조사된 세포를 형질감염시켰다. 상기 형질감염된 세포를 2:1 비율로 처리되지 않은 HA 1.7과 혼합하고 2일간 배양하였다. 그후 혼합된 배양주를 수집, 세척하고
a) 2.5 x 104DRBI*0101 PBMCs(매질)
b) 2.5 x 104DRBI*0101 PBMCs + 펩타이드(Ag + APC)
c) 5% 림포컬트(IL-2)
와 함께 2 x 104바이러스 cells/well을 사용하여 배양하였다.
최종 8시간동안 삼중수소화 티미딘을 첨가하고 세포를 68시간후에 수집하였다.
시험결과를 도 5에 나타내었다.
결과: 다음 배양주는 단독 혹은 조절 바이러스 형질감염된 HA1.7를 갖는 경우, 처리되지 않은 HA 1.7를 갖는 경우, 펩타이드 + 항원 발현세포에 잘 반응한다.
델타 형질감염되고 방사선처리된 HA 1.7을 갖는 배양은 항원 + APC에 대한 처리되지 않은 HA 1.7의 반응을 완전히 방지한다. 그러나, 이와같은 세포 반응 뿐만 아니라 IL-2에 대한 처리되지 않은 혹은 규준 바이러스 배양된 HA 1.7은 이들이 단순히 증식되지 않도록 하지 않는 것이 아님을 나타낸다(도 5).
실시예 8
항원 발현세포에 의한 세레이트 발현의 T 세포 반응 방지
각 세포 타입을 2 x 104로 사용하여 L 세포 발현 HLA-DRB1*0101(항원 발현세포)존재하에 클론 HA 1.7를 펩타이드 HA 306-318(1.0 ㎍/㎖)과 혼합하였다. 상기 L 세포를 규준(퓨로) 혹은 세레이트(세레이트 L 세포) 발현 레트로바이러스로 형질감염시켰다. 최종 8시간의 배양도중 삼중수소화 티미딘을 첨가하였으며, 증식반응은 72시간 경과후, 측정하였다. HA 1.7 배양주에 대한 결과를 도 6에 나타내었다.
a) 단독 ▒
b) +IL-2
c) + 펩타이드 + DRB1*0101-L 세포
d) + 펩타이드 + DRB1*규준 바이러스로 형질감염된 0101-L 세포 ▤
e) + 펩타이드 + DRB1*세레이트 바이러스로 형질감염된 0101-L 세포 ▧
결과: 세레이트 발현 L 세포로 자극된 HA 1.7은 조절 형질감염된 L 세포로 자극된 것에 비하여 항원에 대하여 저조한 반응을 나타내었다.(도 6)
실시예 9
세레이트를 발현하는 항원 발현세포가 조절 T 세포를 유도함
클론 HA 1.7을 2% IL-2 존재하에 펩타이드 HA306-318 및 L 세포(항원 발현세포로 DRB1*0101 발현)와 혼합하였다. 상기 L 세포는 규준 혹은 세레이트를 발현하는 레트로바이러스로 형질감염시켰다. 7일간 배양주에서 배양한 후, HA 1.7를 수집, 세척하고 새로운 HA 1.7(각 개체로 2 x 104사용)과 혼합하기 전에 방사선 조사하였다. 세포를 펩타이드(1.0 ㎍/㎖) + 정상 항원 발현세포(DRB1*0101 PBMCs)로 자극하기 전에 2일간 더 배양하였다. 증식반응은 72시간후에 측정하였으며, 최종 8시간동안 배양시에는 삼중수소화 티미딘을 첨가하였다. 배양된 새로운 HA 1.7에 대한 결과를 도 7에 나타내었다.
a) 단독 ▒
b) +IL-2
c) + 조절 바이러스 유도된 HA 1.7, 펩타이드 + DRB1*0101 PBMC ▤
d) + 세레이트 바이러스 유도된 HA 1.7, 펩타이드 + DRB1*0101PBMC ▨
결과: 세레이트를 발현하는 L 세포로 유도된 HA1.7(세레이트 유도된 HA 1.7)은 정상 항원 자극에 대한 정상 HA 1.7의 반응을 방지한다(도 7).
이는 세레이트에 대한 노출에 의해, 그 내성을 새로운 세포 집단에 전달함에 의해(감염/방관 내성) 내성이 형성된 세포의 능력을 나타내는 것이다.
실시예 10
델타 발현 T 세포에 의해 유도된 조절이 항원 특이성 있음.
쥐에 델타 혹은 조절 레트로바이러스로 형질도입된 107T 세포 하이브리도마 세포를 주사하였다. 상기 하이브리도마는 Der p1의 펩타이드 110-131에 대하여 특이성을 갖는 2BC3였다. 동시에 동물에는 Der p1 혹은 원전한 Freund 보조제로 에멀션화된 OVA를 수용하였다. 7일 후, 림프 결절 세포를 제거하고 4 x 105세포를 Der p1 혹은 OVA에서 배양(이미 면역처리된 것과 동일한 항원을 사용)하였다. IL-2생산을 배양시작후 24시간 경과시 측정하였다. 규준(퓨로(puro)) 혹은 델타(delta) 레트로바이러스로 형질감염된 하이브리도마스를 주사한 동물에 대한 IL-2 생성에 대한 자극 지수를 도 8a(Der p1으로 면역처리된 동물의 반응) 및 8b(OVA로 면역처리된 동물의 반응)에 나타내었다.
결과: 델타 발현 2BC3 하이브리도마스를 주사한 동물에서 Der p1에 대한 반응은 사실상 전혀 없었다. 반면에 OVA에 대한 방응에는 영향이 없었다. 이들 결과는 8a 및 8b에 나타냈으며, 각 점은 조절 반응(항원이 첨가되지 않음)의 자극지수(stimulation index, SI)로서 항원에 대한 개개의 쥐에 의한 IL-2 생성을 나타내는 것이다.
실시예 11
델타는 내성(tolerance)의 유도도중 T 세포상에서 발현됨
HA 1.7을 APCs 없이 펩타이드 HA 306-318(50㎍/㎖)존재하에 배양하였다. 이와 같은 조건은 HA 1.7에 내성상태를 초래한다. 0, 30, 120, 240 혹은 360분 후에, 세포(1.5 x 106)을 수집, 펠릿화하고 냉동시켰다. 구아니딘 티오시아네이트 용액에서 균질화한 후 CsCl 밀도 원심분리하여 세포 펠릿으로부터 RNA를 제조하였다. 1㎍ RNA를 올리고 dT 프라이머를 사용하여 cDNA로 전환하였다. 결과물인 cDNA 1/20를 인체 델타 유사물에 대한 특정한 프라이머를 사용하여 PCR(40사이클)에 사용하였다. PCR 시료를 겔 전기영동법으로 분석하였으며(도 9), 이때 레인 1, 마커, 레인 2, t=0, 레인 3, t=30 분, 레인 4, t=120분, 레인 5, t=240분, 레인 6, t=360 분 및 레인 7은 음성 대조군이다.
결과: 나머지 HA 1.7은 델타 mRNA를 발현하지 않으나, 내성화(tolerisation) 프로토콜 저해 2시간이내에 전사물이 발현되었다.
실시예 12
면역조직법(immunohistology)에 의한 내성유도도중 교잡에서 노츠 1, 세레이트 1 및 델타 1 발현 분석
C57 BL/6J 쥐를 100㎍ Der p1 펩타이드 110-131 혹은 대조군 용액(포스페이트 버퍼 식염수, PBS)로 3일간 연속하여 비강내 처리하였다. 이 방법에서 항원의 비강내 투여는 항원에 대한 내성을 유도하는 것으로 알려져 있다. 그 후 어떤 동물은 꼬리 염기내에 50㎍ Der p1/CFA를 피하주사하여 항원으로 재공격하기 전에 2주간 휴식시켰다. 그 후 동물의 외면 림프 결절 및 비장을 여러시점에서 수집하고(내비강처리 혹은 항원재공격 첫째날은 d0) 면역조직 혹은 원위치 교잡을 진행시켰다. 면역조직학적으로서, 조직을 냉동시키고 3㎛ 절편으로 자르고, 얼음으로 차갑게한 아세톤으로 고정하고 노츠 1 및 세레이트 1에 대한 특정한 폴리클론 항체로 염색하였다. 결합된 항체를 기질로서 디아미노벤지딘으로 전개되는 양고추냉이 퍼옥시다아제 결합된 염소 항-토끼 항체를 사용하여 검출하였다. 델타 1 특정 항체는 연구를 위해 사용할 수 없다. 원위치 교잡에서, 냉동된 조직을 자르고 4% 파라포름알데히드로 고정시켰다. 절편을 65℃에서 노츠 1, 세레이트 1 및 델타1에 대한 특정한 디그옥시제닌 결합된 안티센스 RNA 탐침과 교잡하였다. 결합된 탐침은 기질로 NBT 및 BCIP를 사용하여 전개시킨 알카리 포스페타아제 결합된 염소 항-이그옥시제닌 항체로 검출하였다. 표 1 및 2에 나타낸 결과는 각각 면역조직 및 원위치 교잡에 관한 것이다. 시험결과는 내비강 펩타이드만 (PBS/p110-131 일차) 혹은 내비강 혹은 피하 항원(PBS/p110-131)으로 재공격한후 5마리의 별도의 쥐 조직에 대한 분석 결과를 나타낸다.
+ 약한 염색, ++ 완만한 염색, +++ 강한 염색
결과:
노츠, 델타 및 세레이트의 근본적인 수준은 PBS만을 수용하는 대조군 쥐에서 발현된다. PBS를 내비강 적용 및 항원을 피하적용한 쥐는 재공격시 8일 이내에 세 분자 모두에서 발현이 완만하게 증대됨을 나타냈다. 동물에 비강으로 펩타이드만을 적용한 경우, 혹은 비강으로 펩타이드를 적용한 후 항원으로 재공격한 동물은 조절 쥐에 비하여 보다 빠르고 큰 노츠 델타 및 세레이트의 동일한 증대된 같은 발현 패턴을 나타내었다.
내성유도중 노츠 및 세레이트 단백질의 발현
처리 0일 1일 4일 8일 12일
노츠 1 PBS 일차 + + + + +
PBS 재공격 + + + +/++ +/++
p110-131 일차 + + ++ +++ +++
p110-131 재공격 + + ++ +++ +++
세레이트1 PBS 일차 + + + + +
PBS 재공격 + + + +/++ +/++
p110-131 일차 + + ++ +++ +++
p110-131 재공격 + + ++ +++ +++
내성유도중 노츠, 델타 및 세레이트 전사체의 발현
처리 0일 1일 4일 8일 12일
노츠 1 PBS 일차 + + + + +
PBS 재공격 + + + +/++ +/++
p110-131 일차 + + ++ +++ +++
p110-131 재공격 + + ++ +++ +++
세레이트1 PBS 일차 + + + + +
PBS 재공격 + + + +/++ +/++
p110-131 일차 + + ++ +++ +++
p110-131 재공격 + + ++ +++ +++
델타 1 PBS 일차 + + + + +
PBS 재공격 + + + +/++ +/++
p110-131 일차 + + ++ +++ +++
p110-131 재공격 + + ++ +++ +++
본 발명에 의하면, 노츠 리간드를 면역치료용 약제제조에 사용하게 되며, 작용성 노츠-단백질 혹은 노츠 신호경로 발현 및 세포막 혹은 신호경로상의 노츠 단백질의 발현 혹은 표현을 조절하게 된다. 또한 노츠 리간드를 사용함으로써 질병 혹은 감염을 치료할 수 있는 것이다.

Claims (34)

  1. T 세포 매개성 질병 또는 감염의 치료에 사용되는 노츠-리간드를 포함하는 면역치료용 의약품.
  2. 삭제
  3. 제 1항에 있어서, 상기 T 세포 매개성 질병 또는 감염은 하나 또는 그 이상의 알레르기, 자가면역, 이식거부반응, T 세포 시스템에 대한 종양 유도된 이상(abberation) 및 플라스모디움종(Plasmodium species), 미크로필라리아(Microfilariae), 헬민스(Helminths), 마이코박테리아(Mycobacteria), HIV, 사이토메갈로바이러스, 슈도모나스, 톡소플라즈마(Toxoplasma), 에키노코쿠스, 헤모필러스 인플루엔자 타입 B(Haemophilus influenza type B), 홍역, C형 간염 또는 톡시카라에 기인한 질병과 같은 감염성 질병에 기인함을 특징으로 하는 의약품.
  4. 1항 내지 3항중 어느 한항에 있어서, 상기 노츠-리간드는 세레이트, 델타 혹은 그 분절(fragments), 유도체 혹은 유사체로부터 선택됨을 특징으로 하는 의약품.
  5. 연쇄억제(linked suppression) 유발에 사용되는 노츠-리간드 혹은 그 분절, 유도체 혹은 유사체.
  6. 감염내성 유발에 사용되는 노츠-리간드 혹은 그 분절, 유도체 혹은 유사체.
  7. 생체외에서(ex-vivo), 알레르겐 혹은 항원존재하에 T 세포를 항원 발현세포 발현 혹은 과발현 노츠-리간드에 대하여 배양/노출시킴을 포함하는 알레르겐 혹은 항원에 대한 T 세포 내성형성방법.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 노츠-리간드의 (과)발현은 상기 리간드를 발현할 수 있는 바이러스로 형질감염된 APC에 기인함을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 7항에 있어서, 상기 노츠-리간드의 (과)발현은 노츠-리간드 발현 유전자의 발현을 상향-조절하는 약제(agent)에 의해 자극되는 APC에 기인함을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 약제는 노긴(Noggin), 초르딘(Chordin), 폴리스타틴(Follistatin), Xnr3, 섬유아세포 성장 인자 혹은 그 유도체 혹은 절편으로 부터 선택됨을 특징으로하는 방법.
  11. 제 7, 8, 9 혹은 10 항에 있어서, 상기 APC는 수상돌기 세포, L 세포, 하이브리도마스, 림프종, 마크로파아지, B 세포 혹은 지질막과 같은 합성 APC로 부터 선택됨을 특징으로 하는 방법
  12. 제 7항 내지 11항중 어느한항에 있어서, 상기 노츠-리간드는 세레이트, 델타 혹은 그 분절, 유도체 혹은 유사체로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  13. T 세포에 노출시 두 부위가 모두 그들 각각의 자리에 결합되도록 T 세포 알레르겐 혹은 항원부위에 작용되도록 결합된 노츠-리간드 부를 포함하는 분자.
  14. 제 12 또는 13항에 있어서, 상기 노츠-리간드 부분은 세레이트, 델타 혹은 그 분절, 유도체 혹은 유사체로 부터 선택됨을 특징으로 하는 분자.
  15. 노츠 리간드 세포외 도메인 및 면역 글로블린 Fc분절을 포함하는 융합 단백질
  16. 제 15항에 있어서 상기 노츠 리간드 세포외 도메인은 노츠, 델타 혹은 세레이트로 부터 유도됨을 특징으로 하는 융합 단백질
  17. 제 15항 또는 16항에 있어서, 상기 Fc분절은 IgGFc혹은 IgMFc임을 특징으로 하는 융합 단백질
  18. 병원체, 이식된 조직 혹은 숙주 세포로 부터 기인한 가용성 노츠 리간드를 측정할 수 있도록 하는 고정된 노츠 혹은 노츠과(科)멤버를 포함하는 키트
  19. (a)노츠 단백질 및 노츠 단백질에 결합할 수 있는 리간드와 (b) 화합물을 접촉시키는 단계; 및 화합물이 노츠 단백질에 대한 리간드의 결합에 영향을 주는지를 측정하는 단계;
    를 포함하는 분석방법.
  20. 치료에 사용하기 위해 병원 유기체 종양 혹은 이식 조직에 의해 발현되거나 혹은 분비되는 델타 혹은 세레이트 단백질 혹은 그 유도체에 결합가능한 리간드
  21. 가용성 유리 세레이트, 노츠 혹은 델타과(科)멤버 혹은 그 종류의 생체내 수준을 측정함을 포함하는 분석방법
  22. 세포 발현 노츠-단백질 혹은 노츠 리간드와 화합물을 접촉시키는 단계; 및 상기 단백질 혹은 리간드 발현 혹은 진행의 증가 혹은 감소를 모니터하는 단계;
    를 포함하는 작용성 노츠-단백질 혹은 노츠 리간드의 발현 혹은 진행에 영향을 주는 화합물의 검출분석방법.
  23. 청구항 22의 분석에 의해 검출되는 화합물, 그 노츠-리간드, 유도체, 분절 혹은 유사체.
  24. 박테리아, 감염 혹은 종양-유도된 면역을 억제하는데 사용되는 약제제조시 세포막 단백질로서 델타 혹은 세레이트 단백질의 발현을 하향조절하거나 혹은 그 발현을 감소시킬 수 있는 약제
  25. 제 24항에 있어서, 상기 약제는 톨(Toll) 단백질 혹은 뼈 형태발생 단백질임을 특징으로 하는 약제.
  26. 작용성 노츠-단백질의 발현 또는 노츠 신호경로 조절용 노츠-리간드.
  27. 노츠 리간드 또는 노츠 리간드의 발현을 상향조절하는 약제를 포함하는 T-세포 활성 조절용 의약품.
  28. 노츠 신호전달 경로의 조절제를 포함하는 면역치료용 의약품.
  29. 연쇄억제를 유발하도록 사용되는 노츠 신호전달 경로의 조절제를 포함하는 의약품.
  30. 감염 내성을 유발하도록 사용되는 노츠 신호전달 경로의 조절제를 포함하는 의약품.
  31. T-세포 활성화의 조절에 사용되는 노츠 신호전달 경로의 조절제를 포함하는 의약품.
  32. T-세포 활성화의 조절에 사용되는 노츠 리간드를 포함하는 의약품.
  33. 면역치료에 사용되는 노츠/노츠 리간드 상호작용의 조절제를 포함하는 의약품.
  34. 노츠 리간드 유전자의 발현이 항원의 발현과 연결된 구성물(construct).
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