ES2243986T3

ES2243986T3 - Notch.

Info

Publication number: ES2243986T3
Application number: ES97911353T
Authority: ES
Inventors: Jonathan Robert Lamb; Margaret Jane Dallman; Gerald Francis Hoyne
Original assignee: Lorantis Ltd
Current assignee: Celldex Therapeutics Ltd
Priority date: 1996-11-07
Filing date: 1997-11-06
Publication date: 2005-12-01
Anticipated expiration: 2017-11-06
Also published as: GB2353094A; CA2271248C; JP4339406B2; EP1616958A2; CZ295997B6; GB9910276D0; GB2335194B; EP1616958A3; CN1242802A; KR20000053146A; CZ163999A3; GB2353094B; RO120850B1; NZ335549A; EP0942998A1; ATE299184T1; CA2271248A1; AU736361B2; KR100393234B1; DE69733695D1

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE AL USO DE COMPUESTOS TERAPEUTICOS EN LA MODIFICACION DE LAS INTERACCION ENTRE LINFOCITOS T, Y ENTRE CELULAS QUE PRESENTAN EL ANTIGENO Y LINFOCITOS T E INTERACCIONES ENTRE ORGANISMOS PATOGENOS Y CELULAS INMUNOCOMPETENTES DE UN HUESPED. ESTA INVENCION SE REFIERE, EN PARTICULAR, AL USO DE DICHOS COMPUESTOS, POR UNA PARTE, EN LA MODULACION DE LA INTERACCION ENTRE PROTEINAS NOTCH Y SUS LIGANDOS, Y, POR OTRA PARTE, EN EL TRATAMIENTO DE PATOLOGIAS COMO, POR EJEMPLO, EL RECHAZO DE INJERTO, LA AUTOINMUNIDAD, LA ALERGIA, EL ASMA Y ENFERMEDADES INFECCIOSAS.

Description

Notch.

La presente invención se refiere a la utilización de compuestos terapéuticos en la modificación de la activación de las células T. En particular, se refiere a su utilización en la modulación de la interacción entre los miembros de la familia proteica Notch y sus ligandos, y a la utilización de dichos compuestos en la terapia de situaciones como el rechazo de trasplantes, autoinmunidad, alergia, asma, enfermedades infecciosas y tumores.

La interacción controlada entre las células T y entre las células presentadoras de antígenos (APCs) y las células T, es vital para el funcionamiento del sistema inmune humano. Sin embargo, en ciertos estados patológicos puede ser beneficioso modificar terapéuticamente, positiva o negativamente, dichas interacciones. Por ejemplo, en situaciones tales como autoinmunidad, alergia y rechazo de trasplantes, es deseable inducir la regulación a la baja de una respuesta inmune, estimulando las células T negativas, o la interacción célula T -APC. Modelos de "tolerancia infecciosa" y "supresión relacionada" sugieren que la tolerancia puede ser inducida en un pequeño número de células T, y que estas células T transmiten entonces esta tolerancia a otras células T, evitando de este modo un ataque inmunológico efectivo. En otras situaciones patológicas tales como la inmunosupresión inducida por tumores, las infecciones bacterianas o víricas parásitas, la inmunosupresión es una característica común. En dichas circunstancias, será por tanto deseable inhibir las interacciones de las células T transmitiendo la tolerancia infecciosa.

Sin embargo, hasta la fecha, los mecanismos que subyacen a dichas interacciones de células T y de células T-APC, no han sido comprendidos.

La patente WO 92/19734 pretende dar a conocer las secuencias nucleótidas de los genes humanos Notch y Delta y las secuencias aminoácidas de sus proteínas codificadas. La exposición muestra que la familia génica Notch se ha caracterizado bien como esencial para el desarrollo de progenies celulares embriológicas correctas de insectos tales como Drosophila.

Las proteínas que pertenecen a la familia Notch son receptores transmembranosos que contienen varios motivos peptídicos conservados. Cada proteína dentro de la familia muestra repeticiones extracelulares características de tipo EGF (factor epidérmico de crecimiento) y un motivo yuxtramembranoso Lin-12/Notch. Además cada proteína tiene entre 6 y 8 motivos repetitivos de anquirina en la cola citoplásmica, junto a una secuencia PEST. Los ligandos de Notch tienen un dominio diagnóstico DSL (D. Delta, S. Serrate, L, Lag2) que comprende entre 20 y 22 aminoácidos en el extremo amino de la proteína, y entre 3 y 8 repeticiones tipo EGF en la superficie extracelular. Las proteínas tienen una corta cola citoplásmica sin dominios funcionales conservados.

Evidencias recientes sugieren que la señalización de Notch contribuye al compromiso de la progenie de las células T inmaduras en el timo, que predispone el desarrollo de los timocitos hacia la progenie CD8+ que es independiente del reconocimiento de MHC (Robey E, et al. Cell 1996, 87:483-492). Durante la maduración en el timo, las células T adquieren la capacidad de distinguir los antígenos propios de los que no son suyos, procedimiento denominado auto-tolerancia (von Boehmer H, et al., Ann Rev Immunol. 1990;8:531). En la periferia, existen asimismo mecanismos para la inducción y el mantenimiento de la tolerancia y en muchos aspectos su importancia es infravalorada. Existen muchos modelos experimentales del rechazo de trasplantes, de enfermedades autoinmunes y de respuestas específicas a alérgenos, que ilustran claramente la capacidad para inducir un estado de ausencia de respuesta (tolerancia o anergia) en el receptor, por inmunización con un antígeno. De estos sistemas, surgen dos hallazgos importantes. En primer lugar, la inmunización con un fragmento peptídico del antígeno bajo condiciones seleccionadas, puede inhibir las respuestas específicas no sólo para él mismo, sino para otras regiones en la misma molécula, siempre que la proteína intacta se utilice para la inmunización mediante estimulación (supresión relacionada; Hoyne GF, et al. J. Exp. Med. 1993; 178:183. y Metzler B, Wraith DC. Int. Immunol. 1993; 5:1159). En segundo lugar, tal como se describe mejor en modelos experimentales de trasplante, es el fenómeno de "tolerancia infecciosa" en el que se postula que las células inmunocompetentes que se vuelven tolerantes a un antígeno específico, pueden inhibir a otras células de llevar a cabo la respuesta y además, que esta segunda población de células se vuelve reguladora y tolerante (Qui SX, et al. Science 1993; 258:974). Los mecanismos inmunológicos que subyacen a estos fenómenos no se han caracterizado por el momento.

La presente invención surge a partir del descubrimiento de que la familia de receptores Notch y sus ligandos, Delta y Serrate, se expresan en la superficie celular de las células normales adultas del sistema inmune periférico.

Por tanto, según la presente invención, se proporciona la utilización de un ligando de Notch, o de un fragmento terapéuticamente activo o de un derivado suyo, o un polinucleótido que codifica un ligando de Notch, o un fragmento terapéuticamente activo, en la preparación de un medicamento para utilizarlo en inmunoterapia.

El patrón de expresión de la familia Notch de receptores y sus ligandos en el sistema inmune periférico adulto normal, no se ha descrito previamente, pero los presentes inventores han mostrado que las células T expresan ARNm Notch 1 constitutivamente, mientras que la expresión de Delta se limita a sólo un subconjunto de células T en los tejidos linfoides periféricos. La expresión de Serrate parece restringida a un subconjunto de células presentadoras de antígenos (APCs) en la periferia (Figura 1). Por tanto, esta familia de ligandos de receptores, puede continuar la regulación del desarrollo celular en el sistema inmune, como se ha mostrado en otros tejidos, más allá del desarrollo embrionario (Ellisen LW, et al. Cell 1991; 66:649). La señalización de Notch puede jugar un papel central en la inducción de la ausencia de respuesta (tolerancia o anergia) periférica y puede proporcionar una explicación física para la supresión relacionada y la tolerancia a la infección.

La presente invención se refiere además a la utilización de un ligando de Notch en el tratamiento de una reacción mediada por las células T. Así, se ha observado que exponiendo una población de células T no sometidas previamente a experimentación, a un ligando de Notch expresado mediante una APC en presencia de un alérgeno o antígeno, el ligando de Notch es capaz de hacer que dicha población de células T se vuelva tolerante a dicho alérgeno o antígeno. Además, esta población celular T, cuando se expuso a continuación a una segunda población de células T no sometidas previamente a experimentación, es capaz de hacer que la segunda población se vuelva tolerante a dicho alérgeno o antígeno.

Así, según otro aspecto de la presente invención, se proporciona la utilización de un ligando de Notch, o de un fragmento terapéuticamente efectivo o de un derivado suyo, o un polinucleótido que codifica un ligando de Notch o un fragmento terapéuticamente efectivo o un derivado suyo, en la preparación de un medicamento para que afecte a la supresión relacionada.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona la utilización de un ligando de Notch o de un fragmento terapéuticamente efectivo o de un derivado suyo, o un polinucleótido que codifica un ligando de Notch o un fragmento terapéuticamente efectivo o un derivado suyo, en la preparación de un medicamento para que afecte a la tolerancia infecciosa (también conocida en la técnica como tolerancia "espectadora")

Otro aspecto de la invención se refiere a la utilización de un ligando de Notch en la modulación de la expresión de una proteína Notch funcional o de una vía de señalización de Notch.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento para hacer que las células T muestren tolerancia a un alérgeno o antígeno, que comprende incubar/exponer dichas células T en un cultivo celular a células presentadoras del antígeno, que expresen o sobreexpresen un ligando de Notch; en presencia de dicho alérgeno o antígeno.

En los aspectos descritos anteriormente de la presente invención, el ligando de Notch puede exponerse a las células T incubando/mezclando las células T con las células presentadoras del antígeno (APCs) o similares, que expresan o sobreexpresan un ligando de Notch en presencia de un alérgeno o antígeno. La sobreexpresión del gen del ligando de Notch puede realizarse mediante las APCs transfectadas con un gen capaz de expresar un ligando de Notch o mediante la exposición de dichas APCs a un agente capaz de regular al alta la expresión del gen (o genes) endógenos del ligando de Notch.

Agentes apropiados que influencian la expresión de ligandos de Notch incluyen agentes que afectan a la expresión de genes Delta o Serrate. Por ejemplo, para la expresión de Delta, la unión de las BMPs (proteínas morfogenéticas óseas, Wilson, P.A. y Hemmati-Brivanlou A. 1997 Neuron 18: 699-710, Hemmati-Brivanlou, A y Melton, D. 1997 Cell 88:13-17) a sus receptores, conduce a la transcripción Delta regulada a la baja, debida a la inhibición de la expresión del factor de transcripción Achaete/Scute Complex. Se cree que este complejo está implicado directamente en la regulación de la expresión de Delta. Así, cualquier agente que inhiba la unión de BMPs a sus receptores, es capaz de producir un aumento en la expresión de Delta y/o Serrate. Dichos agentes incluyen Noggin, Chordin, Follistatin, Xnr3, FGF, Fringe y sus derivados y variantes (véanse referencias para noggin-Smith W. C. y Harland, R.M Cell 70:829-840, chordin-Sasai, Y et al., 1994 Cell 79: 779-790). Noggin y Chordin se unen a BMPs evitando de este modo la activación de su cascada de señalización, que conduce a una disminución en la transcripción de
Delta.

En algunos estados patológicos, el organismo puede estar inmunocomprometido y puede desearse regular a la baja la expresión de Delta y/o Serrate, para superar la inmunosupresión impuesta. Los agentes que inhiben la expresión de Delta y/o Serrate pueden utilizarse en dichas circunstancias. Un ejemplo de agentes que inhiben la expresión de Delta y/o Serrate, incluyen la proteína Toll (Medzhitov, R. et al., 1997, Nature 388: 394-397) BMPs y otros agentes que disminuyen o interfieren con la producción de Noggin, Chordin, Follistatin, Xnr3, FGF y Fringe. Así, según otro aspecto de la presente invención, se proporciona la utilización de un agente capaz de regular a la baja la expresión de las proteínas Delta o Serrate o de reducir su presentación como una proteína de la membrana celular, en la preparación de un medicamento para utilizarlo en la reversión de la inmunosupresión inducida por bacterias, infección o tumor, en la que el agente es una proteína Toll o una proteína morfogenética ósea.

Tal como se ha comentado anteriormente, la invención se refiere asimismo a la modificación de la expresión de la proteína Notch o a la presentación en la membrana celular o en las vías de señalización. Se ha mostrado que éstas se han visto implicadas en las respuestas mediadas por las células T que participan en la inducción de la tolerancia (relacionada y/o "espectador"). Agentes que potencian la presentación de una proteína Notch plenamente funcional en la superficie celular incluyen metaloproteinasas matriciales tales como el producto del gen Kuzbanian de Drosophila (Dkuz, Pan, D y Rubin, G.M. 1997 Cell 90:271-280) y otros miembros de la familia génica ADAMALYSIN. Agentes que reducen o interfieren con su presentación como proteína plenamente funcional de la membrana celular, pueden incluir los inhibidores de MMP, tales como los inhibidores basados en el hidroximato.

El término "célula presentadora" de un antígeno o similar, tal como se utiliza en la presente memoria, no pretende limitarse a las APCs. El experto en la materia comprenderá que puede utilizarse cualquier vehículo capaz de presentar el ligando deseado de Notch a la población de células T, empleándose para referirse a todas ellas, por conveniencia, el término APCs. Así, ejemplos de APCs apropiadas incluyen células dendríticas, células L, hibridomas, linfomas, macrófagos, células B o APCs sintéticas, tales como membranas lipídicas.

Cuando las APCs son transfectadas con un gen capaz de expresar un ligando de Notch, la transfección puede realizarse mediante un virus tal como un retrovirus o un adenovirus, o mediante cualquier otro vehículo o procedimiento capaz de suministrar un gen a las células, incluyendo cualesquiera vehículos o procedimientos que se muestren efectivos en la terapia génica, e incluyen retrovirus, liposomas, electroporación, otros virus tales como adenovirus, virus adeno-asociados, herpes virus, virus de la vacuna, ADN precipitado con fosfato cálcico, transfección asistida por DEAE dextrano, microinyección, polietilenglicol, complejos ADN-proteínas.

Utilizando dichos vehículos o procedimientos, solos o en combinación, es posible dirigir específicamente el suministro génico a una población particular de células, permitiendo de este modo que se lleve a cabo in vivo. Por ejemplo, un virus puede utilizarse en combinación con liposomas para aumentar la eficiencia de la absorción del ADN. La especificidad del sitio de suministro puede alcanzarse incluyendo proteínas específicas, (por ejemplo, un anticuerpo de cadena única que reacciona con CD11c para las células dendríticas/macrófagos) en la envuelta viral o en el liposoma.

Preferentemente, se utilizarán los constructos a través de los cuales la expresión del gen (por ejemplo, Serrate) se una a la expresión del antígeno. Las APCs que sobreexpresan Serrate expresarán asimismo, por tanto, niveles altos del antígeno significativo y de este modo, interaccionarán preferentemente con las células T de la especificidad apropiada.

Según aún otro aspecto de la presente invención, se proporciona una molécula que comprende una mitad del ligando de Notch, unida operativamente a una mitad del alérgeno o antígeno de la célula T; de modo que, después de la exposición a las células T, ambas mitades son capaces de unirse a sus sitios respectivos. Dicha molécula puede hacer que una célula T específica para un antígeno/alérgeno, sobre la que se basa la mitad del alérgeno o antígeno, se vuelva tolerante a éstos, proporcionando la proximidad cercana de la mitad del alérgeno o antígeno, la especificidad requerida de la mitad del ligando de Notch.

La mitad del antígeno o alérgeno puede ser, por ejemplo, un complejo sintético MHC-péptido. Este es un fragmento de la molécula de MHC sobre la que se encuentra el espacio en forma de ranura del antígeno que transporta un elemento de éste. Dichos complejos se han descrito en Altman JD et al, Science 1996 274; 94-6.

En otra forma de realización más preferida, el compuesto es una proteína de fusión que comprende un segmento de Notch o de un dominio extracelular del ligando de Notch y un segmento F_{c} de inmunoglobulina, preferentemente IgGF_{c} o IgMF_{c}. Así, según otro aspecto de la presente invención, se proporciona la utilización de una proteína de fusión que comprende un segmento de un dominio extracelular del ligando de Notch y un segmento De inmunoglobulina, en la preparación de un medicamento para inmunoterapia.

En todas las formas de realización de la presente invención descritas anteriormente, es preferible que el ligando de Notch pertenezca a las familias Serrate o Delta de proteínas, o a sus derivados, fragmentos o análogos.

Los estados infecciosos o patológicos que pueden describirse como mediados por las células T incluyen cualquiera o algunos de los siguientes: asma, alergia, rechazo de trasplante, autoinmunidad, aberraciones inducidas por tumores en el sistema de células T y enfermedades infecciosas tales como las causadas por especies de Plasmodium, microfilarias, helmintos, micobacterias, VIH, Citomegalovirus, Pseudomonas, Toxoplasma, Echinococcus, Haemophilus influenza de tipo B, sarampión, hepatitis C o Toxicara. Así, con la utilización del alérgeno o antígeno apropiado, un ligando de Notch puede utilizarse según la presente invención para tratar dichas enfermedades o infecciones.

Asimismo, se proporciona un procedimiento para detectar la supresión inmune inducida por un organismo invasor. Dichos organismos pueden generar formas solubles de miembros de la familia de Serrate, Notch, y/o Delta, o de sus derivados o proteínas que afecten a su expresión in vivo, induciendo de este modo la inmunosupresión a la tolerancia infecciosa. El procedimiento comprende un ensayo para detectar la presencia in vivo de Serrate, Delta, Notch, no unidos a la membrana, o de sus derivados y comprende preferentemente un anticuerpo para Serrate, Delta, Notch, o sus derivados.

Los procedimientos de utilización en los ensayos de rastreo para detectar el aumento o disminución de la expresión de Notch, Delta/Serrate y/o del procesamiento, incluyen:

1): La evaluación de la expresión de Notch, Delta/Serrate y Fringe, después de exponer las células aisladas a compuestos de prueba en cultivo, utilizando por ejemplo:

a): a nivel proteico, mediante tinción específica del anticuerpo, utilizando la inmunohistoquímica o la citometría de flujo.

b): a nivel del ARN, cuantificando la reacción en cadena de la polimerasa-transcriptasa inversa (RT-PCR). La RT-PCR puede realizarse utilizando un plásmido de control con estándares preparados para medir la expresión del gen endógeno con los iniciadores específicos para Notch 1 y Notch 2, Serrate 1 y Serrate 2, Delta 1 y Delta 2, Delta 3 y Fringe. Este constructo puede modificarse cuando se identifican nuevos miembros del ligando.

c): A nivel funcional en ensayos de adhesión celular.

El aumento de la expresión de Delta/Serrate o de Notch, conducirá a un aumento de la adhesión entre las células que expresan Notch y sus ligandos Delta/Serrate. Las células de prueba se expondrán a un tratamiento particular en cultivo, y se formarán capas con las células diana marcadas radioactivamente o con fluoresceína (transfectadas con la proteína Notch /Delta/Serrate). Las mezclas celulares se incubarán a 37ºC durante 2 horas. Las células no adherentes se lavarán y el nivel de adherencia se medirá por el nivel de radioactividad/inmunofluorescencia en la superficie de la placa.

Utilizando dichos procedimientos es posible detectar compuestos o ligandos de Notch que afecten a la expresión o al procesamiento de una proteína Notch o a un ligando de Notch.

Asimismo, se proporciona un procedimiento de ensayo que comprende contactar (a) la proteína Notch y un ligando capaz de unirse a la proteína Notch con (b) un compuesto; y determinar si el compuesto afecta a la unión del ligando con la proteína Notch, preferentemente si la proteína Notch está asociada con una célula T.

Los ligandos de Notch que se utilizan en la presente invención son preferentemente proteínas o polipéptidos miembros de la familia Serrate o Delta o sus derivados. Se obtienen preferentemente utilizando técnicas estándar de la tecnología recombinante que son bien conocidas par el experto en la materia. De publicaciones tales como las patentes WO97/01571, WO 96/27610 y WO 92/19734 pueden obtenerse secuencias génicas apropiadas para generar dichos compuestos de la presente invención. La invención no está, sin embargo, limitada de ninguna manera por las secuencias Serrate, Delta, Notch que se dan a conocer en estas publicaciones. Más preferentemente, dichas Serrate, Delta o Notch o miembros de la familia, proteínas o polipéptidos o sus derivados, son fragmentos de los dominios extracelulares de Serrate, Delta o Notch, o miembros de la familia, o son derivados de dichos fragmentos. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "ligando de Notch" incluye además cualquier ligando o miembro de la familia de ligandos, que interactúa con un miembro de la familia de proteínas Notch e incluye el grupo de proteínas a las que se alude como "proteínas toporítmicas", es decir, el producto proteico de los genes Delta, Serrate, Deltex y Enhancer of split, así como de otros miembros de esta familia génica que pueden identificarse debido a la capacidad de sus secuencias génicas para hibridizarse a, o a su homología con las proteínas Serrate, Delta o Notch, o la capacidad de sus genes para exhibir interacciones fenotípicas.

Serrate, Delta o Notch se describieron al principio en Drosophila y representan por tanto proteínas prototípicas del receptor Notch y de los miembros de la familia de ligandos de Notch, respectivamente. Ahora se han descrito múltiples proteínas y ligandos de Notch en muchas especies de vertebrados e invertebrados, pero su nomenclatura puede diferir de la que se utiliza en la mosca. Por ejemplo, Notch es un homólogo de Lin 12 y Glp 1, Serrate/Delta son homólogos de Jagged, Apx1 y Lag-2.

Las formulaciones farmacéuticas de la presente invención pueden formularse según los principios que se conocen bien en la técnica. Así, la naturaleza del excipiente y la cantidad de actividad dependerán del compuesto de la presente invención que va a formularse.

Preferentemente, las composiciones farmacéuticas están en forma de dosis unitaria.

Las dosificaciones de compuestos de la presente invención, para ser administradas a un paciente en forma de una formulación farmacéutica, podrían determinarse por un médico apropiado.

La vía de administración preferida de una formulación de la presente invención es cualquiera de los procedimientos habituales de administración, que incluyen el intramuscular e intraperitoneal, inyección intravenosa, inhalación intranasal, inhalación pulmonar, vías subcutánea, intradérmica, intraarticular, intratecal, tópica y del tracto alimentario (por ejemplo, mediante los parches Peyers).

El término "derivado", tal como se utiliza en la presente memoria en relación a proteínas o polipéptidos de la presente invención, incluye cualquier sustitución, variación, modificación, reemplazo, deleción o adición de uno o más residuos aminoácidos de o para la secuencia, siempre que la proteína resultante en el polipéptido posea la capacidad de modular las interacciones Notch-ligando de Notch.

El término "variante", tal como se utiliza en la presente memoria en relación a proteínas o polipéptidos de la presente invención, incluye cualquier sustitución, variación, modificación, reemplazo, deleción o adición de uno o más residuos aminoácidos de o para la secuencia, siempre que la proteína resultante en el polipéptido posea la capacidad de modular las interacciones Notch-ligando de Notch.

El término "análogo", tal como se utiliza en la presente memoria, en relación a proteínas o polipéptidos de la presente invención, incluye cualquier peptidomimético, es decir, un compuesto químico que posee la capacidad de modular las interacciones Notch-ligando de Notch, de forma similar a la proteína o polipéptido parentales. Éstos incluyen compuestos que pueden agonizar o antagonizar la expresión o actividad de una proteína Notch o de un ligando de Notch.

Puede considerarse que un compuesto modula las interacciones Notch-ligando de Notch si es capaz de inhibir o potenciar la interacción de Notch con sus ligandos, preferentemente, en un grado suficiente para proporcionar una eficacia terapéutica.

La expresión Notch-ligando de Notch, tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a la interacción entre un miembro de la familia Notch y un ligando capaz de unirse a uno o varios de dichos miembros.

El término "terapia", tal como se utiliza en la presente memoria, deberá emplearse para abarcar las aplicaciones profilácticas y diagnósticas.

El término "médico" incluye aplicaciones humanas y veterinarias.

Tal como se utilizan en la presente memoria, los términos proteína y polipéptido son sinónimos, utilizándose "proteína" meramente en un sentido general, para indicar una secuencia aminoácida relativamente más larga que la que se encuentra en un polipéptido.

La presente invención se describirá ahora mediante ejemplos no limitativos, haciendo referencia a los dibujos adjuntos, en los que:

La Figura 1 muestra los resultados de las hibridizaciones in situ realizadas tal como se describe en el Ejemplo 1 de la presente memoria.

La Figura 2 muestra los resultados del experimento que se describe en el Ejemplo 4.

La Figura 3 muestra los resultados del experimento que se describe en el Ejemplo 5.

La Figura 4 muestra los resultados del experimento que se describe en el Ejemplo 6.

La Figura 5 muestra los resultados del experimento que se describe en el Ejemplo 7.

La Figura 6 muestra los resultados del experimento que se describe en el Ejemplo 8.

La Figura 7 muestra los resultados del experimento que se describe en el Ejemplo 9.

La Figura 8a y 8b muestra los resultados del experimento que se describe en el Ejemplo 10.

La Figura 9 muestra los resultados del experimento que se describe en el Ejemplo 11.

Ejemplo 1 Serrate, Delta y Notch se expresan en el sistema inmune periférico

Se sintetizaron sondas de ARN antisentido específicas para Serrate, Delta, Notch y se incorporó a ellas UTP marcado con digoxigenina. Cada sonda se disolvió en tampón de hibridación, se calentó a 70ºC entre 5 y 10 minutos y se añadió a portas revestidos con TESPA que contenían cortes de 10 mm de bazo o timo que se habían fijado previamente con paraformaldehído al 4%+PBS. Los portas se hibridizaron durante la noche a 65ºC. Al día siguiente, se lavaron dos veces a 65ºC, y dos veces a temperatura ambiente (RT) con 1xSSC/Formaldehído al 50%/Tween 20 al 0,1%. Los portas se lavaron dos veces con 0,1 M de ácido maleico/0,15 M NaCl/Tween 20 al 0,1%, pH 7,5, tampón (MART) a temperatura ambiente, bloqueándose entonces durante 2 horas con MABT+suero de cabra al 20%+reactivo bloqueante 296 de Boehringer (BBR). Los portas se incubaron durante la noche a temperatura ambiente (RT) con fragmentos F_{ab} de anti-digoxigenina. Después de cuatro lavados con MABT, los portas se lavaron otras 2 veces en tampón substrato alcalino. La presencia de sondas de ARN antisentido unidas, se detectó incubando en la oscuridad los portas en tampón substrato que contenía NBT+BCIP. Los portas se contrastaron con hematoxilina y se montaron en medio Depx de montaje.

Resultados: Los resultados de estas hibridizaciones se muestran en la Fig 1, que muestra que en un bazo de un ratón de 3 meses de edad, Delta y Serrate se expresan por células aisladas en la vaina periarteriolar y no en el centro germinal (gc). Notch se expresa otra vez en muchas células en la vaina periarteriolar.

Ejemplo 2 Producción de la proteína de fusión Delta-Fc

El vector de expresión pIG-1 [D. Simmons, "Cloning cell surface molecules by transient surface expression in mammalian cells" pp 93-128, Cellular Interactions in Development Ed. D. Hartley, pub. Ox. Uni. Press (1993)] permite la producción de una proteína de fusión que contiene la parte extracelular de Delta 1 unida al dominio IgG1-F_{c} humano. Un fragmento enzimático de restricción que contenía sólo el dominio extracelular de la proteína Delta 1, se clonó en el vector pIG-1. El plásmido resultante, se transformó en E. Coli MC 1061, y se hizo crecer en SOB que contenía 10 \mug/ml de tetraciclina/ampicilina. El vector purificado se utilizó para transfectar las células COS in vitro. Las células COS se hicieron crecer hasta confluencia de entre el 50 y el 75%, transfectándose 10 \mug de ADN plasmídico por placa, mediante el procedimiento DEAE-dextrano. A las 24 horas después de la transfección, se reemplazó el medio de cultivo con otro que contenía FCS al 1%, cultivándose las células in vitro otros 3 a 6 días. Las células se hicieron rotar durante 5 minutos a 5000 rpm para sedimentar las células y los desechos, descartándose el sobrenadante y guardándolo hasta que se necesitara. La fusión Delta-Fc se purificó a partir de los sobrenadantes del cultivo, añadiendo 2 ml de una lechada al 50% de proteína A Sepharose (Pharmacia) y se sometió a rotación durante la noche a 4ºC. Las perlas de Sepharose se aislaron haciendo pasar los sobrenadantes del cultivo a través de un filtro de 0,45 mm, se lavaron y se transfirieron a una columna de plástico de 10 ml. El constructo de fusión Delta-Fc se eluyó con 2 ml de tampón de elución, pH 4,0. El eluato se neutralizó añadiendo 1M de Tris base.

Ejemplo 3 Ejemplos de modelos en los que la vía de señalización del ligando de Notch puede investigarse

La tolerancia periférica a los autoantígenos puede analizarse en los receptores de células T (TCR) de los ratones transgénicos, en los que el ligando de TCR se expresa sólo como un autoantígeno en la periferia. La tolerancia periférica a los antígenos de trasplante puede inducirse de varias formas, que incluyen el pretratamiento del receptor con anticuerpos para las células T, o el bloqueo de la coestimulación. Es por tanto posible demostrar ambas, la tolerancia a la infección y la supresión "relacionada". La tolerancia periférica a los alérgenos puede ser inducida por la administración intranasal de péptidos derivados de alérgenos. La expresión de ligandos de Notch-Notch se mide en células reclutadas en las vías aéreas y/o en los tejidos linfoides después de la inhalación del alérgeno, demostrándose modificaciones en la tolerancia. Además, en los modelos experimentales de infecciones con agentes infecciosos, la expresión de ligandos de Notch-Notch puede medirse en el organismo (patógeno) y en las células inmunocompetentes en el huésped.

Ejemplo 4 Los hibridomas que expresan Delta pueden inhibir las respuestas de lo linfocitos sensibilizados por los antígenos

Se inmunizaron ratones con un péptido sintético que contenía un epítopo inmunodominante de los alérgenos de los ácaros del polvo de la casa (HMD), Der p1 (p110-31), o con ovalbúmina (OVA, proteína de los huevos blancos de la gallina). Una semana más tarde, se extrajeron las células de los nódulos linfáticos (LNCs) y se realizaron suspensiones celulares. Los nódulos linfáticos de los animales inmunizados con distintos antígenos, se mantuvieron separados. A estas células LNCs de los nódulos linfáticos se las hace alusión como células sensibilizadas de los nódulos linfáticos.

Los hibridomas de las células T se transfectaron con el (dominio) Delta completo (longitud entera) o con un plásmido de control, de forma que Delta se expresó como una proteína de membrana. Después de dos días en cultivo, los hibridomas se irradiaron para evitar que proliferaran o que produjeran citoquinas. Por tanto, la única respuesta que se midió en el ensayo proviene sólo de las células de los nódulos linfáticos.

Los hibridomas irradiados se añadieron crecientemente a los cultivos que contenían las LNCs sensibilizadas. Se añadió el antígeno apropiado (es decir, p110-131 u OVA) y las células se cultivaron durante 24 horas. Se recuperaron entonces los líquidos sobrenadantes y se ensayaron respecto al contenido de IL-2 (un factor de crecimiento importante de las células T). Asimismo, se midieron las respuestas proliferativas de las células del nódulo linfático después de 72 horas.

Resultados: Las células de nódulos linfáticos cultivadas en presencia de hibridomas irradiados que expresaban un plásmido de control, proliferaron todavía, tal como se muestra en la Figura 2 y secretaron IL-2 cuando se estimularon en cultivo con el antígeno apropiado. Su reactividad se mantuvo con una proporción de 1:1 LNC:hidridoma. Al contrario, la respuesta proliferativa y la producción de IL-2 por las células de los nódulos linfáticos se redujo en por lo menos un 88% cuando se cultivaron en presencia de hibridomas que expresaban el Delta completo (con una proporción de 1:1) con el antígeno apropiado. Hibridomas transfectados con el virus de control (círculos abiertos), virus Delta (cuadrados abiertos). La Figura 2 muestra los datos presentados como contajes por minuto (cpm) de la incorporación de ^{3}H-Tdr 72 horas después del comienzo del cultivo. Cpm de las células de los nódulos linfáticos (LNC) cultivadas con hibridomas que expresan constructos de control o Delta. Número total de células/pocillo = 4 x 10^{5} (es decir, el número de LNCs varía según la proporción de hibridomas a LNC, por lo que los cpm variarán). p110-131 LNC son células sensibilizadas con Der p1 (p110-131), OVA LNC son células sensibilizadas con OVA. 2BB11 y 2BC3 son dos distintos hibridomas reactivos Der p1.

Estos datos muestran que la inhibición de respuestas por las células T que expresan Delta puede suministrarse en trans. Aunque en este cultivo los hibridomas T que expresan Delta, específicos para Der p1, pudieron inhibir la respuesta de las células T sensibilizadas por OVA, esta aparente falta de especificidad parece deberse a la cercana proximidad de las células, forzada por el sistema de cultivo. Verdaderamente, los datos que se muestran en las Figuras 8a y 8b muestran que en los animales los hibridomas que expresan Delta deben compartir la especificidad antigénica con el inmunógeno para ejercer allí un efecto modulador sobre la respuesta inmune para ese inmunógeno. En este caso parece que las células T que expresan Delta sólo pueden aproximarse a las células T respondedoras si reconocen el mismo antígeno sobre las mismas APC.

Ejemplo 5 Las células Dendríticas que expresan Serrate evitan la sensibilización antigénica de los linfocitos T

Las células dendríticas (DCs) son las primeras células presentadoras de antígenos en el sistema inmune y son críticas para estimular las respuestas de las células T. Las DCs se obtuvieron del bazo y se transfectaron, bien con un retrovirus que permitiera la expresión de la proteína Serrate completa, o bien con un retrovirus de control. Las DCs también se sometieron a impulsos con el péptido HDM p110-131 durante 3 horas a 37ºC. Las DCs se lavaron entonces y se utilizaron para inmunizar subcutáneamente ratones no sometidos previamente a experimentación, utilizando 10^{5} células/ratón. Después de 7 días, las LNCs drenantes se recuperaron y se volvieron a estimular en cultivo con el péptido a razón de 4x10^{5} células/pocillo. Ya que los ratones se inmunizaron sólo con las DCs sometidas a impulsos con el péptido, esto nos proporciona una medida de la capacidad de estas células para sensibilizar una respuesta inmune.

Resultados: la Figura 3 muestra los datos presentados como cpm de las LNCs, 72 horas después del cultivo de animales inmunizados con células dendríticas (DCs) transfectadas de control (círculos abiertos) o transfectadas con Serrate (cuadrados abiertos).

La inmunización de los ratones con las DCs que expresaban Serrate, dio lugar a una disminución de 10 veces en el número de células recuperadas de los nódulos linfáticos, cuando se comparó a la inmunización con las DCs de control. Se observó además que las LNCs de los ratones inmunizados con DCs+Serrate, no proliferaron (reducción del 93% respecto a los valores de control, Figura 3) o no secretaron IL-2 cuando se compararon a las células de los ratones inmunizados con las DCs de control.

Ejemplo 6 Los hibridomas de células T que expresan Delta pueden inhibir el desarrollo de inmunidad para el antígeno Der p1 en animales

Hibridomas de células T (que reaccionan con Der p1) se transfectaron con un retrovirus que contenía Delta de ratón, de tal modo que Delta se expresó en la superficie celular o con un retrovirus de control. A ratones C57 BL se les inyectó intraperitonealmente con 10 millones de hibridomas irradiados y fueron inmunizados subcutáneamente con 50 microgramos de Der p1 emulsificado en Adyuvante Completo de Freund (CFA). Después de 7 días, las células drenantes de los módulos linfáticos se recuperaron y cultivaron a razón de 4 x 10^{5} células/pocillo con Der p1 (10 microgramos/ml), el péptido 110-131 de Der p1 (10 microgramos/ml), o el péptido 81-102 de Der p1 (10 microgramos/ml). Los cultivos se incubaron a 37ºC durante 72 horas y durante las 8 horas finales del cultivo, se añadió timidina tritiada. Los resultados de los ensayos de proliferación de las células de los animales a los que se había inyectado con hibridomas transfectados con el virus de control (puro) o con hibridomas que expresaban la transfección Delta (Delta-FL), se muestran en la Figura 4.

Resultados: Las LNC de los animales a los que se inyectó con los hibridomas transfectados con el virus de control produjeron niveles altos de IL-2 y proliferaron en el cultivo en presencia de Der p1, del péptido 110-131 o del péptido 81-102. Al contrario, las células de los animales a los que se inyectó con los hibridomas que expresaban Delta, no respondieron a ninguno de los antígenos Der p1 (Fig 4).

Ejemplo 7 Células T humanas que expresan Delta pueden bloquear la respuesta de las células T normales

Un clon de células T humanas influenza-reactivo (HA1.7) se transfectó con el Delta de ratón, utilizando un constructo retrovírico para permitir la expresión de la proteína Delta en la superficie celular. La mezcla de esta población celular con el HA1.7 normal evitó la reactividad subsiguiente de estos HA1.7 con el péptido HA306-318 y las células de presentación del antígeno. 5 x 10^{5} HA1.7 se mezclaron con 1 x 10^{6} células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMC) irradiadas con DRB1*0101+1 microgramo de HA306-318, cultivándose a 37ºC. 6 horas después se añadió linfocult al 5% (medio que contiene IL-2) en un volumen total de 1 ml. 24 horas después de la iniciación, se añadió Delta, o el retrovirus de control, o nada. 7 días después del inicio del cultivo, las células se recuperaron, se lavaron y las células transfectadas se irradiaron. Las células transfectadas se mezclaron en una proporción de 2:1 con HA1.7 no tratados y se cultivaron durante 2 días. Los cultivos mezclados se recuperaron entonces, se lavaron y se sembraron utilizando 2 x 10^{4} células viables/pocillo conjuntamente con

a): 2,5 x 10^{4} DRB1*0101 PBMCs (medio)

b): 2,5 x 10^{4} DRB1*0101 PBMCs+péptido (Ag+APC)

c): linfocult al 5% (IL-2)

Las células se recuperaron después de 68 horas, añadiendo timidina tritiada durante las 8 horas finales. Los resultados se muestran en la Figura 5.

Resultados: Después del cultivo solo o con el HA1.7 transfectado con el virus de control, el HA1.7 no tratado responde bien a las células que presentan antígeno+péptido. La incubación con el HA1.7 transfectado con Delta e irradiado, evita completamente la respuesta del HA1.7 no tratado al antígeno+APC. Sin embargo, dichas células responden, así como el HA1.7 no tratado o incubado con el virus de control a la IL-2, indicando que no son simplemente incapaces de proliferar (Fig 5).

Ejemplo 8 La expresión de Serrate mediante las células que presentan el antígeno, evita las respuestas de las células T

El clon HA1.7 se mezcló con el péptido HA306-318 (1,0 microgramos/ml) en presencia de células L que expresan HLA-DRB1* 0101 (como células presentadoras del antígeno), utilizando 2x10^{4} de cada tipo celular. Las células L se transfectaron, bien con el retrovirus que expresa Serrate (células L Serrate) o bien con el de control (puro). La respuesta proliferativa se midió al cabo de 72 horas después de añadir timidina tritiada durante las últimas 8 horas del cultivo. Los resultados se muestran en la Figura 6 para los cultivos de HA1.7:

a): solo 101

b): +IL-2 102

c): + péptido+células L-DRB1*0101 103

d): + péptido+células L-DRB1*0101 transfectadas con el virus de control 104

e): + péptido+células L-DRB1*0101 transfectadas con el virus Serrate 105

Resultados: HA1.7 estimulado mediante las células L que expresan Serrate respondió escasamente al antígeno, cuando se comparó con los estimulados mediante las células L transfectadas con el control (Fig 6).

Ejemplo 9 Células presentadoras del antígeno que expresan Serrate inducen células T reguladoras

El clon HA1.7 se mezcló con el péptido HA306-318 y células L (que expresan DRB1*0101 como células presentadoras del antígeno) en presencia de IL-2 al 2%. Las células L se transfectaron, bien con el retrovirus que expresa Serrate o bien con el de control. Después de 7 días en cultivo, HA1.7 se recuperaron, lavaron e irradiaron antes de mezclarse con HA1.7 recién preparado (utilizando cada población 2x10^{4}). Las células se cultivaron durante otros 2 días antes de ser estimuladas con péptido (1,0 microgramos/ml)+células presentadoras del antígeno normal (DRB1*0101 PBMCs). La respuesta proliferativa se midió al cabo de 72 horas después de añadir timidina tritiada durante las últimas 8 horas del cultivo. Los resultados se muestran en la Figura 7 para los HA1.7 recién preparados que se culti-
varon:

a): solo 101

b): + IL-2 102

c): + HA1.7 inducido por el virus de control, entonces el péptido+DRB1*0101 PBMC 104

d): + HA1.7 inducido por el virus Serrate, entonces el péptido+DRB1*0101 PBMC 105

Resultados: HA1.7 inducido por las células L que expresan Serrate (HA1.7 inducido por Serrate) evitó la respuesta del HA1.7 normal a un estímulo antigénico normal (Fig 7). Esto muestra la capacidad de las células que han tolerado la exposición a Serrate, para transmitir su tolerancia a una población de células que no ha sido sometida previamente a experimentación (tolerancia infecciosa/"espectadora").

Ejemplo 10 La regulación inducida por las células T que expresan Delta es antígeno específica

Se inyectaron ratones con 10^{7} células de hibridoma de células T transducidas con el retrovirus de control o Delta. El hibridoma era 2BC3, que es específico para el péptido 110-131 de Der p1. Al mismo tiempo, los animales recibieron bien Der p1 o bien ovoalbúmina emulsificada en adyuvante completo de Freund. 7 días después, se extrajeron las células de los nódulos linfáticos y 4 x 10^{5} células se cultivaron en presencia de Der p1 u ovoalbúmina (utilizando el mismo antígeno con el que ya habían sido inmunizadas).

La producción de IL-2 se midió 24 horas después del inicio del cultivo. Los índices de estimulación para la producción de IL-2 se muestran en las Figuras 8a (respuestas de animales inmunizados con Der p1) y 8b (respuestas de los animales inmunizados con OVA) para los animales inyectados con los hibridomas transfectados con el retrovirus control (puro) o Delta (Delta).

Resultados: La respuesta a Der p1 en los animales a los que se inyectó con los hibridomas 2BC3 que expresaban Delta, se abolió virtualmente completamente, mientras que la respuesta a la ovalbúmina no se vio afectada. Estos datos se muestran en la Fig 8a y 8b, en las que cada punto representa la producción de IL-2 por un ratón individual para el antígeno como un índice de estimulación (SI) de las respuestas de control (sin añadir antí-
geno).

Ejemplo 11 Delta se expresa en las células T durante la inducción de la tolerancia

Se cultivó HA1.7 en presencia del péptido HA306-318 (50 \mug/ml) en ausencia de APCs. Dichas condiciones dan lugar a un estado de tolerancia en el HA1.7. Después de 0, 30, 120, 240 ó 360 minutos, se recuperaron las células (1,5 x 10^{6}), se sedimentaron y se congelaron. Se preparó ARN a partir de los sedimentos celulares mediante homogeneización en solución de tiocianato de guanidio, seguido por centrifugación en densidad de CsCl. 1\mug de ARN se convirtió en ADNc utilizando un oligo dT iniciador. Del ADNc resultante, 1/20 se utilizó en la PCR (40 ciclos) utilizando iniciadores específicos para el homólogo del Delta humano. Las muestras PCR se analizaron mediante electroforesis en gel (Figura 9) en la que: carril 1, marcador, carril 2, t=0, carril 3, t=30 minutos, carril 4, t=120 minutos, carril 5, t=240 minutos, carril 6, t=360 minutos y carril 7 es el control negativo.

Resultados: El HA1.7 en reposo no expresó ARNm Delta, pero aparecieron transcritos a las 2 horas de la iniciación del protocolo de tolerancia.

Ejemplo 12 Análisis de la expresión de Notch 1, Serrate 1 y Delta 1 durante la inducción de la tolerancia por inmunohistología e hibridización dirigida

Ratones C57 BL/6J se trataron intranasalmente, bien con 100 microgramos, del péptido 110-131 de Der p1, o con una solución de control (solución salina tamponada de fosfato, PBS), tres días consecutivos. Se sabe que la administración intranasal del antígeno, de esta manera, induce la tolerancia al antígeno. Algunos animales reposaron entonces durante 2 semanas antes de volver a ser estimulados con el antígeno mediante inyección de 50 \mug de Der p1/CFA subcutáneamente en la base de la cola. Los nódulos linfáticos superficiales y los bazos de los animales se recuperaron en distintos tiempos (siendo d0 el primer día de tratamiento intranasal o de reestimulación con el antígeno) y procesándose respecto a la inmunohistología o a la hibridización in situ. Para la inmunohistología, los tejidos se congelaron y se realizaron cortes de 3 \mum, se fijaron en acetona enfriada con hielo y teñidos con anticuerpos policlonales específicos para Notch 1 y Serrate 1. El anticuerpo unido se detectó utilizando un anticuerpo anti-conejo de cabra conjugado con peroxidasa de rábano, revelado con diaminobencidina como substrato. Los anticuerpos específicos para Delta 1 no estaban disponibles para el estudio. Para la hibridización in situ, los tejidos congelados se seccionaron y se fijaron en paraformaldehído al 4%. Los cortes se hibridizaron con sondas de ARN antisentido unidas a digoxigenina específicas para Notch 1, Serrate 1 y Delta 1, a 65ºC. La sonda unida se detectó mediante anticuerpo anti-digoxigenina de cabra conjugado con fosfatasa alcalina revelado utilizando NBT y BCIP como substrato. Los datos que se muestran en las tablas 1 y 2, son para la inmunohistología y la hibridización in situ, respectivamente. Los datos representan el análisis de los tejidos de 5 ratones separados después de administración intranasal del péptido solo (PBS/p110-131 primario) o de la reestimulación intranasal y con antígeno subcutáneo (PBS/p110-
131).

+ tinción débil, ++ tinción moderada, +++ tinción intensa.

Resultados: Los niveles basales de Notch, Delta y Serrate se expresan en los ratones de control que recibieron sólo PBS. Los ratones a los que se administraron dosis intranasales con PBS y subcutáneamente con antígeno, mostraron un aumento moderado en la expresión de las tres moléculas a los 8 días de la reestimulación. Los animales a los que se administró péptido solo intranasal, o el péptido intranasal seguido por reestimulación con el antígeno, mostraron el mismo patrón de aumento de la expresión de Notch, Delta y Serrate, que fue más rápido que y superior al de los ratones de control.

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TABLA 1 Expresión de las proteínas Notch y Serrate durante la inducción de tolerancia

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	tratamiento	día 0	día 1	día 4	día 8	día 12

Notch 1	PBS primario	+	+	+	+	+
	PBS reestimulación	+	+	+	+/++	+/++
	p110-131 primario	+	+	++	+++	+++
	p110-131 reestimulación	+	+	++	+++	+++

Serrate 1
	PBS primario	+	+	+	+	+
	PBS reestimulación	+	+	+	+/++	+/++
	p110-131 primario	+	+	++	+++	+++
	p110-131 reestimulación	+	+	++	+++	+++

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 2 Expresión de los transcritos de Notch, Delta y Serrate durante la inducción de la tolerancia

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	tratamiento	día 0	día 1	día 4	día 8	día 12

Notch 1	PBS primario	+	+	+	+	+
	PBS reestimulación	+	+	+	+/++	+/++
	p110-131 primario	+	+	++	+++	+++
	p110-131 reestimulación	+	+	++	+++	+++

Serrate 1	PBS primario	+	+	+	+	+
	PBS reestimulación	+	+	+	+/++	+/++
	p110-131 primario	+	+	++	+++	+++
	p110-131 reestimulación	+	+	++	+++	+++

Delta 1	PBS primario	+	+	+	+	+
	PBS reestimulación	+	+	+	+/++	+/++
	p110-131 primario	+	+	++	+++	+++
	p110-131 reestimulación	+	+	++	+++	+++

Otras modificaciones de la presente invención serán evidentes para los expertos en la materia.

Claims

1. Utilización de un ligando de Notch o de un fragmento terapéuticamente efectivo o de su derivado, o de un polinucleótido que codifica un ligando de Notch o de un fragmento terapéuticamente efectivo o de su derivado, en la preparación de un medicamento para su utilización en inmunoterapia.

2. Utilización según la reivindicación 1, en la que la inmunoterapia implica el tratamiento de una enfermedad o infección mediada por las células T.

3. Utilización según la reivindicación 2, en la que la enfermedad o infección mediada por las células T presenta una o más causas de entre alergia, autoinmunidad, rechazo de trasplantes, aberraciones inducidas por tumores del sistema de células T y enfermedades infecciosas.

4. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el ligando de Notch es seleccionado de entre Serrate, Delta o fragmentos o sus derivados.

5. Utilización de un ligando de Notch o de un fragmento terapéuticamente efectivo o de su derivado, o de un polinucleótido que codifica un ligando de Notch o de un fragmento terapéuticamente efectivo o de su derivado, en la preparación de un medicamento que afecta a la supresión relacionada.

6. Utilización de un ligando de Notch o de un fragmento terapéuticamente efectivo o de su derivado, o de un polinucleótido que codifica un ligando de Notch o de un fragmento terapéuticamente efectivo o de su derivado, en la preparación de un medicamento que afecta a la tolerancia infecciosa.

7. Procedimiento para que las células T toleren un alérgeno o antígeno, que comprende la incubación/exposición de dichas células T en un cultivo celular a las células presentadoras del antígeno que expresan o sobreexpresan un ligando de Notch, en presencia de dicho alérgeno o antígeno.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que la expresión o sobreexpresión del ligando de Notch se debe a que las APC son transfectadas con un virus capaz de expresar dicho ligando.

9. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que la expresión o sobreexpresión del ligando de Notch se debe a que las APC son estimuladas por un agente que regula al alta la expresión de un gen que expresa un ligando de Notch.

10. Procedimiento según la reivindicación 9, en el que el agente es seleccionado de entre Noggin, Chordin, Follistatin, Xnr3, factores de crecimiento fibroblástico o derivados o sus fragmentos.

11. Procedimiento según las reivindicaciones 7, 8, 9 ó 10, en el que las APC son seleccionadas de entre células dendríticas, células L, hibridomas, linfomas, macrófagos, células B o APCs sintéticas.

12. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, en el que el ligando de Notch es seleccionado de entre Serrate, Delta o fragmentos o sus derivados.

13. Molécula que comprende una mitad del ligando de Notch unida operativamente a una mitad del antígeno o alérgeno de la célula T, de modo que por la exposición a las células T, ambas mitades son capaces de unirse a sus sitios respectivos.

14. Molécula según la reivindicación 12 ó 13, en la que la mitad del ligando de Notch es seleccionada de entre Serrate, Delta o fragmentos terapéuticamente efectivos o sus derivados.

15. Utilización de una proteína de fusión, que comprende un segmento de un dominio extracelular del ligando de Notch y un segmento F_{c} de una inmunoglobulina, en la preparación de un medicamento para inmunoterapia.

16. Utilización según la reivindicación 15, en la que el dominio extracelular del ligando de Notch se deriva de Notch, Delta o Serrate.

17. Utilización según la reivindicación 15 ó 16, en la que el segmento F_{c} es IgGF_{c} o IgMF_{c}.

18. Utilización de un agente capaz de regular a la baja la expresión de las proteínas Delta o Serrate o de reducir su presentación como una proteína de la membrana celular, en la preparación de un medicamento para su utilización en la reversión de la inmunosupresión inducida por tumor, infección o bacteria, en la que el agente es una proteína Toll o una proteína morfogenética ósea.