KR101573650B1

KR101573650B1 - Hcmv 바이러스 복제 억제용 조성물

Info

Publication number: KR101573650B1
Application number: KR1020150017213A
Authority: KR
Inventors: 윤기정; 하수봉
Original assignee: 성균관대학교산학협력단
Priority date: 2015-02-04
Filing date: 2015-02-04
Publication date: 2015-12-01
Also published as: US20160228501A1; US9795651B2

Abstract

본 발명은 노치(Notch) 신호전달체계의 표적 유전자인 Hes1(Hairy and Enhancer of Split-1), Hes5(Hairy and Enhancer of Split-5), Hey1(Hairy/enhancer-of-split related with YRPW motif protein 1), Hey2(Hairy/enhancer-of-split related with YRPW motif protein 2)의 발현을 증가시킴으로써 HCMV(human cytomegalovirus) 복제를 억제하는 새로운 약학적 조성물, 및 이를 이용하여 HCMV 감염 질환을 치료하는 방법 및 용도에 관한 것이다.
본 발명의 신규한 조성물은 HCMV 복제 억제에 우수한 효과가 있으므로 HCMV 감염으로 인해 나타나는 다양한 HCMV 관련 질환을 예방하거나 치료하는 새로운 타겟 및 치료제를 제공할 수 있으며, HCMV 감염 질환 치료라는 신규 용도로 이용할 수 있다.

Description

HCMV 바이러스 복제 억제용 조성물{COMPOSITION FOR HCMV VIRUS REPLICATION INHIBITION}

본 발명은 노치(Notch) 표적 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, HCMV(human cytomegalovirus) 감염 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

허피스 바이러스-5라고 알려진 HCMV(human cytomegalovirus)는 단순 포진바이러스와 달리 배양세포에 대한 종 특이성(種特異性)이 강하고, 사람 태아 섬유아세포에서만 증식한다는 특징이 있다. 전 세계적으로 HCMV 감염은 신생아의 약 1%에서 발생하는 제일 흔한 선천성 감염 중의 하나이며, 인구의 40%가 HCMV에 감염되어 있다. 선천성 CMV 감염 중 증상이 있는 경우는 약 10~15%이며, 이 중 50~90%에서 정신지체나 감각신경성난청 등의 합병증이 발생한다.

질병관리본부에 따르면, 유럽과 미국의 경우 감염으로 인한 질환 발생빈도가 매우 높고, 우리나라의 경우 성인의 95% 이상이 무증상 잠복상태로 유지되고 있으며 유럽과 미국만큼 질병 발생빈도가 높지는 않은 것으로 보고되어 있다. 다만, 백혈병, 암, 면역부전증, 및 장기이식 후 면역억제제를 투여하는 사람의 경우, 잠복상태가 재 활성화되어 망막염, 감염, 대장염 등의 질환을 야기하는 원인이 된다고 알려져 있다. 특히, 국내 장기이식 환자 수가 매년 증가하고 있는 추세여서 HCMV 치료제의 중요성이 더욱 부각되고 있는 실정이다.

HCMV 바이러스는 건강한 사람들에게 감염되었을 때는 증상이 없으나, 면역력이 상대적으로 약한 유아나 면역 결핍 환자들에게 감염되었을 때는 심각한 증상을 유발할 수 있다. 특히, 뇌종양, 대장암, 유방암 등과 같은 악성종양을 더 암화시키는 원인으로 알려져 있다.

HCMV는 간, 뇌, 폐, 귀, 눈 등의 부위에 영향을 미치고, HCMV 감염 질환으로는 폐렴, 거대세포바이러스 단핵구증, 거대세포바이러스 망막염, 거대세포바이러스 간염, 천 거대세포바이러스 감염, 거대세포바이러스 항원혈증 등이 있다. 현재까지 HCMV 감염 질환에 대한 치료법으로는 안티 HCMV 약물 사용, 항바이러스제 투여, 면역글로불린 투여가 주로 시행되고 있지만, 기존의 이러한 치료법은 혈액과 신장 기능, 간 기능을 치료 기간 동안 모니터링 해야 하는 번거로움이 있고, 대부분 암 외의 HCMV 감염 질환을 대상으로 한다는 점 등의 문제점이 있다.

한편, 변이 시 초파리의 날개의 과잉성장을 유도하여 날개의 홈을 만드는 유전자에서 유래한 이름인 노치(Notch)는 세포표면 수용체(cell surface receptor)로써 막 단백질 구조이고, 다세포동물에서 세포간의 빠른 신호전달과 증폭을 목적으로 한다.

노치 신호전달은 척추 동물에서 무척추 동물에 이르기까지 진화론적으로 잘 보존되어 있으며, 발생 초기에 세포의 운명을 결정짓는데 매우 중요한 역할을 수행하는 것으로 보고되어 있다. 노치 신호전달은 신경, 안구, 림프, 근육, 혈구 등의 분화과정을 조절하는 주요 인자로 알려져 있으며, 혈관 발생에도 관여한다고 알려져 있다.

노치 수용체와 리간드들은 모두 막 단백질로써, 두 개의 근접한 세포 간에 리간드와 수용체인 노치가 결합되어 노치 신호전달이 일어난다. 두 번의 가수분해 후 노치 수용체는 세포내 부분(NICD, Notch intracellular domain)이 분리되어 핵 안으로 이동한다. 핵 안에서 NICD는 전사억제인자인 CSL(CBF-1(C-promoter Binding Factor 1)/Suppressor of Hairless/Lag-1)과 결합해 이전에 CSL과 결합해있던 보조 억제인자(CoR, corepressor)를 대체하게 된다. NICD/CSL복합체는 보조 활성인자(CoA, co-activator)인 MAML(mastermind-like)나 p300을 모집해 HES(Hairy/Enhancer of Split), HEY(Hairy/enhancer-of-split related with YRPW motif protein), cyclin D1, p21, NF-κB, c-Myc, pre-Ta(pre-T cell receptor alpha chain), GATA3, NRARP, 그리고 Deltex1와 같은 노치 타겟 유전자들의 발현을 유도 또는 억제한다. 이때, HES는 노치 신호전달의 대표적인 표적 유전자로써 노치 신호전달 경로가 활성화되었을 때 발현되는 전사인자(transcription factor) 중 하나이며, Hes1, Hes3, Hes5 등이 Hes family에 속한다. 또한, HEY 역시 노치 신호전달 체계에 의해 발현양이 증가되는 대표적인 노치의 타겟 유전자로써, hes related family에 속한다.

이와 같은 노치 신호전달이 활성화되면, 여러 암 모델에서 종양 형성을 유발하는 것으로 알려져 있다. 활성 노치인 NICD를 쥐의 조혈세포에 발현시키는 경우 T-cell leukemia/lymphomas를 일으키는 것으로 알려져 있고, TALL(T-cell acute lymphoblastic leukemia)에선 활성화된 노치 1이 50% 정도 발견된바 있다. 또한, 자궁경부암, 폐암, 췌장암, 난소암, 유방암, 전립선암과 같은 다양한 암에서 노치 수용체와 리간드 그리고 노치 신호 전달의 타겟이 활성화되어 있는 것이 보고되어 있고, 노치 1 수용체가 유방암 환자에 있어 안 좋은 예후와 관련이 있으며, 전립선암에서는 암 전이와 관련되어 있는 것으로 알려져 있다.

이러한 이유로 노치 신호전달에 관여하는 인자들에 대한 연구는 인간의 다양한 질환의 원인을 분석하여 그 치료방법을 찾는데 매우 중요하다. 특히, 암 또는 자가 면역질환의 치료에 있어서 노치 신호전달 경로와 같은 신호전달 경로의 역할에 대한 중요성이 강조되고 있는 실정이다.

이에, 암 또는 자가 면역질환을 치료하기 위하여 다양한 부분에서 노치 신호전달을 억제하기 위한 연구가 이루어졌고(한국공개특허 제10-2014-0085790호), 규모 유전체 탐색법, 단백질체 분석법, 및 생물정보학의 비약적인 발달에 힘입어 상당한 수의 노치 신호전달에 영향을 주는 유전자들이 발견되었다.

하지만, 아직까지 이러한 탐색을 통해서 노치 신호전달 경로의 복잡성과 다른 신호전달 경로와의 상호 연관성, 특히 HCMV와의 관련성에 대하여는 알려진 바가 없다.

이에 본 발명자들은 종래 기술의 문제점을 극복하기 위하여, 노치(Notch) 신호전달 경로의 표적 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자에 의하여 HCMV(human cytomegalovirus) 복제를 억제하는 새로운 약학적 조성물의 제공을 그 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 노치(Notch) 표적 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, HCMV(human cytomegalovirus) 감염 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 노치 표적 단백질은 Hes1(Hairy and Enhancer of Split-1), Hes5(Hairy and Enhancer of Split-5), Hey1(Hairy/enhancer-of-split related with YRPW motif protein 1), 및 Hey2(Hairy/enhancer-of-split related with YRPW motif protein 2)로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 HCMV 감염 질환은 뇌종양, 대장암, 유방암, 인두염, 및 폐렴으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 Hes1 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 Hes5 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 Hey1 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 Hey2 단백질은 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 약학적으로 유효량의 HCMV 복제 억제제를 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 HCMV 감염 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 HCMV 복제 억제제를 포함하는 약학적 조성물을 HCMV 감염 질환의 예방 또는 치료에 이용하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 노치(Notch) 표적 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 유효성분으로 포함하고, HCMV(human cytomegalovirus) 복제 억제제를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 숙주세포에 HCMV가 감염되었을 때 HCMV 복제를 저해하는 데에 효과적임을 확인하였다. 따라서, 노치 표적 유전자를 이용해 HCMV의 바이러스 복제를 효과적으로 억제하여 HCMV 감염이 야기하는 뇌종양(neuroblasoma, glioblastoma), 유방암, 간암, 대장암, 인두염, 폐렴 등과 같은 모든 HCMV 감염 질환에 대한 예방 및 치료에 활용할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 HFF(Human foreskin fibroblast) 세포에서 HCMV(human cytomegalovirus) 감염에 의한 노치(Notch) 표적 유전자의 mRNA 발현량을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 HFF 세포에서 HCMV 감염에 의한 Hes1 단백질 발현양을 비교한 웨스턴 블롯 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 HFF 세포에서 노치 표적 유전자 발현에 의한 HCMV 자손 바이러스 복제 억제 효과를 확인한 결과이다.

본 발명은 노치(Notch) 신호전달 체계의 표적 유전자에 의하여 HCMV의 복제를 억제하는 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에서는 HFF(Human foreskin fibroblast) 세포에 HCMV를 감염시켰을 때, HCMV 감염에 의한 노치 표적 유전자의 전사량과 노치 표적 단백질의 발현량을 각각 qRT-PCR과 Western blot을 수행하여 조사하였다(실시예 1 및 실시예 2 참조). 또한, 노치 표적 유전자가 HCMV 복제에 미치는 영향을 알아보았다(실시예 3 참조).

본 발명에서는 HFF 세포에 노치 표적 유전자인 Hes1, Hes5, Hey1, Hey2를 발현시키기 위하여 레트로바이러스(retrovirus) 벡터를 사용하였다. 레트로바이러스 벡터는 세포 내에 감염되었을 때 세포 내 유전물질에 통합(integration) 됨으로써 그 유전자를 발현하는 안정적인 세포주를 만들 수 있다는 장점이 있다.

그 결과, 노치 표적 유전자들이 발현되고 있는 HFF세포에서 HCMV 복제를 억제하는 효과가 있음을 확인하였다. 따라서, 본 발명은 노치 표적 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 HCMV 감염 질환의 예방 또는 치료용으로 이용할 수 있다.

상기 노치 표적 단백질은 Hes1(Hairy and Enhancer of Split-1), Hes5(Hairy and Enhancer of Split-5), Hey1(Hairy/enhancer-of-split related with YRPW motif protein 1), 및 Hey2(Hairy/enhancer-of-split related with YRPW motif protein 2)로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 HCMV 감염 질환은 뇌종양, 대장암, 유방암, 인두염, 및 폐렴으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

이에 더하여, 상기 Hes1, Hes5, Hey1, 및 Hey2 단백질은 각각 서열번호 1, 2, 3, 및 4의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 HCMV 감염 질환에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

이에, 약학적 조성물로 제조하기 위하여 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제, 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제, 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

상기 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제, 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 및 광물유 등이 있다. 상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소, 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 치료효과를 증진시키기 위하여, 바람직하게는 병용되는 약물과 동시에(simultaneous), 별도로(separate), 또는 순차적(sequential)으로 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 구체적으로, 본 발명에 따른 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에서 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구 투여, 비강 내 투여, 경기관지 투여, 동맥 주사, 정맥 주사, 피하 주사, 근육 주사, 또는 복강 내 주사에 의해 투여될 수 있다. 일일 투여량은 약 0.0001 내지 100mg/kg이고, 바람직하게는 0.001 내지 10mg/kg이며, 하루 일회 내지 수회 나누어 투여하는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중, 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께, 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 HCMV 감염 질환의 치료방법을 제공한다.

본 발명에서 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다.

나아가, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 포함하는 HCMV 감염 질환의 예방 또는 치료용도를 제공한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 실험방법

세포　배양

HFF(Human foreskin fibroblast) 세포는 계대수 16-20으로 사용하였다. HFF 세포는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)에 10%의 소태아혈청(FBS, fetal bovine serum)을 추가한 배지로 37℃, 5% CO₂환경에서 배양하였다.

바이러스 감염

숙주세포인 HFF 세포에 HCMV를 MOI(Multiplicity of infection) 0.01로 감염시킨 후, 전체 세포에 HCMV 감염이 될 때까지 3일 간격으로 배지를 갈아주었다. 이후 전체세포에 HCMV가 감염되었음을 확인하고 상층액을 수확하여 HCMV를 얻었다. 얻은 HCMV의 적정은 IE1/2를 ICC(Immunocytochemistry)로 확인하여 진행하였으며, HCMV를 감염하기 전 HFF 세포를 분주하여 90% 정도로 키운 후 감염을 수행하였다.

qRT-PCR(quantitative real time PCR)

전체 RNA는 Trizol reagent를 사용하여 분리하였다. 분리한 RNA에서 샘플당 500ng으로 Oligo dT primer와 MMLV-RT(Moloney murine leukemia virus- reverse transcriptase) 효소를 이용하여 cDNA를 합성하였으며, 하기 실시예 2-1에 기재된 프라이머로 qRT-PCR을 수행하였다.

Western blot

HFF 세포는 protease inhibitor인 PMSF가 포함된 RIPA buffer로 lysis 하였다. 같은 양의 단백질 샘플을 SDS-PAGE 젤에 로딩한 후 이를 PVDF membrane에 transfer 하였다. Transfer한 젤은 TBST(150 mM NaCl, 10mM Tris/HCl, 0.1% (v/v) Tween 20, pH 8.0)에 5%의 skim milk를 추가하여 blocking 과정을 수행하였다. 이후 타겟 단백질에 대한 항체를 사용하여 단백질 발현을 확인하였다.

Immunocytochemistry( ICC )

HFF세포를 4% PFA를 사용하여 고정한 후, 100% 에탄올로 permeablization 하였다. 이후 타겟 단백질에 대한 항체로 IE 1/2의 발현을 확인하였다.

실시예 2. HCMV 감염에 의한 노치(Notch) 표적 유전자의 발현

2-1. 노치(Notch) 표적 유전자 발현량 조사 : mRNA 수준

HFF(Human Foreskin Fibroblast)에 HCMV(Human Cytomegalovirus)를 감염시켰을 때 노치(Notch) 표적 유전자의 발현량을 mRNA 수준에서 조사하였다.

계대 수 18인 HFF 세포에 HCMV를 MOI 0, 5, 및 5 HI(Heat inactivation)로 감염시킨 다음, 72시간 후에 Trizol을 통해 세포에서 RNA를 분리하였다. 분리한 RNA를 oligo dT 프라이머와 MMLV-RT(Moloney murine leukemia virus- reverse transcriptase) 효소를 이용하여 샘플당 500ng으로 cDNA를 합성하였다. 합성한 cDNA는 노치 표적 유전자 프라이머로 Quantitative real time PCR을 수행하여 노치 표적 유전자들의 mRNA 발현을 비교하였다. qRT-PCR에 사용된 primer는 다음과 같다.

Hes1

F primer : 5'-GAAGCACCTCCGGAACC-3'

R primer : 5'-GTCACCTCGTTCATGCACTC-3'

Hes5

F primer : 5'-TCAGCCCCAAAGAGAAAAAC-3'

R primer : 5'-TAGTCCTGGTGCAGGCTCTT-3'

Hey1

F primer : 5'-ACG AGA CCG GAT CAA TAA CA-3'

R primer : 5'-ATC CCA AAC TCC GAT AGT CC-3'

Hey2

F primer : 5'-GCA CTC TCG GAA TCC TAT GC-3'

R primer : 5'-CGT CGG GAT CGG ATA AAT AA-3'

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, HCMV 감염에 의해 노치 표적 유전자인 Hes1, Hes5, Hey1, Hey2의 발현이 증가되었음을 확인하였다. 이를 통해 HCMV 감염이 숙주 세포에서 노치 표적 유전자의 발현량을 증가시킴을 알 수 있었다.

또한, HCMV를 56℃에서 30분 동안 열처리를 하여 바이러스의 감염성을 제거한 음성대조군(HI)에서 노치 표적 유전자 발현 증가 현상이 사라지는 것을 확인하였고, 이를 통하여 HCMV에 의한 노치 표적 유전자 발현의 증가는 HCMV와 숙주세포의 접촉에 의한 것이 아닌 HCMV 세포 내 감염에 의한 HCMV viral 유전자에 의한 것임을 알 수 있었다.

2-2. 노치(Notch) 표적 단백질 발현량 조사: 단백질 수준

HFF 세포에 HCMV를 감염시켰을 때 노치(Notch) 표적 유전자의 발현량을 단백질 수준에서 조사하였다.

계대 수 18인 HFF 세포에 HCMV를 MOI 0, 5, 5 HI(Heat inactivation)로 감염시킨 다음, 72시간 후에 세포를 lysis 하였다. Lysis는 RIPA 버퍼로 수행하였으며, protease 억제물질을 추가하였다. lysis 하여 얻은 단백질 샘플을 이용하여 Western blot(12.5% SDS PAGE gel, 100mA transfer/membrane 50min, 5% skim milk blocking RT 1hr, primary Ab(Rb anti Hes1, 1:500, 4'C O/N), secondary Ab(anti Rb IgG HRP, 1:10000, RT 2hr), ATTO ECL solution develop)을 수행함으로써 Hes1 유전자의 발현을 비교하였다. 간단히, 단백질 샘플을 SDS PAGE 젤에 로딩하였고, PVDF membrane에 단백질을 transfer 한 후, 항-Hes1 항체로 단백질 발현을 확인하였다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, HCMV 감염에 의해 노치 표적 유전자 Hes1 단백질의 발현이 증가한 것을 확인할 수 있었다. 상기 실시예 2-1의 RNA 발현 실험과 마찬가지로 HCMV에 의해 Hes1 단백질 발현양이 증가하였으며, 이러한 Hes1단백질 발현양의 증가는 열처리된 HCMV(HI)에서는 확인되지 않았다.

따라서, HCMV 감염이 노치 표적 유전자의 RNA 뿐만 아니라 단백질 발현양도 증가시킴을 확인할 수 있었다.

실시예 3. 노치(Notch) 표적 유전자에 의한 HCMV 억제 효과 확인

HCMV가 HFF 세포에 감염되면 productive한 replication을 통해 자손 바이러스를 형성한다. 이러한 현상을 이용하여 노치(Notch) 표적 유전자가 HCMV 복제에 미치는 영향을 알아보기 위한 실험을 수행하였다.

계대 수 17인 HFF 세포에 레트로바이러스(retrovirus)를 통해 노치 표적 유전자를 발현시킨 후, HCMV를 감염시켰다. 대조군으로는 GFP(green fluorescence protein)를 발현시킨 HFF세포를 이용하였다. HFF 세포에서 생성된 자손 HCMV를 감염시간에 따라 나누어 수확하였고, 이러한 자손 HCMV를 새로운 HFF 세포에 감염시켜 시간 별로 생성된 HCMV가 포함된 미디어를 얻은 다음, 노치 표적 유전자들이 HCMV 복제에 어떠한 영향을 미치는지를 확인하였다. 노치 표적 유전자들이 HCMV 복제에 미치는 영향을 확인하기 위하여 새로운 HFF세포에 HCMV를 감염시킨 후, 하루 뒤 자손 HCMV의 양을 HCMV viral 유전자인 항-IE1/2 항체로 Immunocytochemistry(ICC)를 진행하였다. HFF세포를 4% PFA를 사용하여 고정한 후, 100% 에탄올로 permeablization 하였다. 이후, 하기에 기재된 항체로 IE1/2의 발현을 확인하였다. ICC에서 사용한 항체는 다음과 같다.

Rb anti Hes1, Millipore 1:500

Anti Rb IgG HRP, Abcam, 1:10000

Rb anti IE1/2, LabFrontier, 1:1000

Anti b-actin, Sigma, 1:10000

(1' Ab, Rb anti IE1/2, 1:1000 > 2' Ab: anti Rb IgG 555, 1:1000와 비교)

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 대조군(GFP)에 비하여 노치 표적 유전자들이 발현되고 있는 HFF 세포에서 HCMV 복제가 억제됨을 확인하였고, 특히 Hes5, Hey1이 과발현된 HFF 세포에서 HCMV 복제가 억제되는 현상이 두드러지게 나타남을 확인하였다.

따라서, 노치 표적 유전자 발현 증가는 HCMV 복제 억제에 효과적임을 알 수 있었으며, HCMV에 대한 숙주세포의 방어기작에 의해, HCMV 감염 시 노치 표적 유전자의 발현이 증가함을 확인하였다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해되어야 한다.

<110> RESEARCH & BUSINESS FOUNDATION SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY <120> COMPOSITION FOR HCMV VIRUS REPLICATION INHIBITION <130> PB14-12427 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 280 <212> PRT <213> Homo sapiens Hes1 <400> 1 Met Pro Ala Asp Ile Met Glu Lys Asn Ser Ser Ser Pro Val Ala Ala 1 5 10 15 Thr Pro Ala Ser Val Asn Thr Thr Pro Asp Lys Pro Lys Thr Ala Ser 20 25 30 Glu His Arg Lys Ser Ser Lys Pro Ile Met Glu Lys Arg Arg Arg Ala 35 40 45 Arg Ile Asn Glu Ser Leu Ser Gln Leu Lys Thr Leu Ile Leu Asp Ala 50 55 60 Leu Lys Lys Asp Ser Ser Arg His Ser Lys Leu Glu Lys Ala Asp Ile 65 70 75 80 Leu Glu Met Thr Val Lys His Leu Arg Asn Leu Gln Arg Ala Gln Met 85 90 95 Thr Ala Ala Leu Ser Thr Asp Pro Ser Val Leu Gly Lys Tyr Arg Ala 100 105 110 Gly Phe Ser Glu Cys Met Asn Glu Val Thr Arg Phe Leu Ser Thr Cys 115 120 125 Glu Gly Val Asn Thr Glu Val Arg Thr Arg Leu Leu Gly His Leu Ala 130 135 140 Asn Cys Met Thr Gln Ile Asn Ala Met Thr Tyr Pro Gly Gln Pro His 145 150 155 160 Pro Ala Leu Gln Ala Pro Pro Pro Pro Pro Pro Gly Pro Gly Gly Pro 165 170 175 Gln His Ala Pro Phe Ala Pro Pro Pro Pro Leu Val Pro Ile Pro Gly 180 185 190 Gly Ala Ala Pro Pro Pro Gly Gly Ala Pro Cys Lys Leu Gly Ser Gln 195 200 205 Ala Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Gly Gly Phe Gln Val Val Pro Ala 210 215 220 Pro Asp Gly Gln Phe Ala Phe Leu Ile Pro Asn Gly Ala Phe Ala His 225 230 235 240 Ser Gly Pro Val Ile Pro Val Tyr Thr Ser Asn Ser Gly Thr Ser Val 245 250 255 Gly Pro Asn Ala Val Ser Pro Ser Ser Gly Pro Ser Leu Thr Ala Asp 260 265 270 Ser Met Trp Arg Pro Trp Arg Asn 275 280 <210> 2 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens Hes5 <400> 2 Met Ala Pro Ser Thr Val Ala Val Glu Leu Leu Ser Pro Lys Glu Lys 1 5 10 15 Asn Arg Leu Arg Lys Pro Val Val Glu Lys Met Arg Arg Asp Arg Ile 20 25 30 Asn Ser Ser Ile Glu Gln Leu Lys Leu Leu Leu Glu Gln Glu Phe Ala 35 40 45 Arg His Gln Pro Asn Ser Lys Leu Glu Lys Ala Asp Ile Leu Glu Met 50 55 60 Ala Val Ser Tyr Leu Lys His Ser Lys Ala Phe Val Ala Ala Ala Gly 65 70 75 80 Pro Lys Ser Leu His Gln Asp Tyr Ser Glu Gly Tyr Ser Trp Cys Leu 85 90 95 Gln Glu Ala Val Gln Phe Leu Thr Leu His Ala Ala Ser Asp Thr Gln 100 105 110 Met Lys Leu Leu Tyr His Phe Gln Arg Pro Pro Ala Ala Pro Ala Ala 115 120 125 Pro Ala Lys Glu Pro Lys Ala Pro Gly Ala Ala Pro Pro Pro Ala Leu 130 135 140 Ser Ala Lys Ala Thr Ala Ala Ala Ala Ala Ala His Gln Pro Ala Cys 145 150 155 160 Gly Leu Trp Arg Pro Trp 165 <210> 3 <211> 308 <212> PRT <213> Homo sapiens Hey1 <400> 3 Met Lys Arg Ala His Pro Glu Tyr Ser Ser Ser Asp Ser Glu Leu Asp 1 5 10 15 Glu Thr Ile Glu Val Glu Lys Glu Ser Ala Asp Glu Asn Gly Asn Leu 20 25 30 Ser Ser Ala Leu Gly Ser Met Ser Pro Thr Thr Ser Ser Gln Ile Leu 35 40 45 Ala Arg Lys Arg Arg Arg Gly Ile Ile Glu Lys Arg Arg Arg Asp Arg 50 55 60 Ile Asn Asn Ser Leu Ser Glu Leu Arg Arg Leu Val Pro Ser Ala Phe 65 70 75 80 Glu Lys Gln Val Met Glu Gln Gly Ser Ala Lys Leu Glu Lys Ala Glu 85 90 95 Ile Leu Gln Met Thr Val Asp His Leu Lys Met Leu His Thr Ala Gly 100 105 110 Gly Lys Gly Tyr Phe Asp Ala His Ala Leu Ala Met Asp Tyr Arg Ser 115 120 125 Leu Gly Phe Arg Glu Cys Leu Ala Glu Val Ala Arg Tyr Leu Ser Ile 130 135 140 Ile Glu Gly Leu Asp Ala Ser Asp Pro Leu Arg Val Arg Leu Val Ser 145 150 155 160 His Leu Asn Asn Tyr Ala Ser Gln Arg Glu Ala Ala Ser Gly Ala His 165 170 175 Ala Gly Leu Gly His Ile Pro Trp Gly Thr Val Phe Gly His His Pro 180 185 190 His Ile Ala His Pro Leu Leu Leu Pro Gln Asn Gly His Gly Asn Ala 195 200 205 Gly Thr Thr Ala Ser Pro Thr Glu Pro His His Gln Gly Arg Leu Gly 210 215 220 Ser Ala His Pro Glu Ala Pro Ala Leu Arg Ala Pro Pro Ser Gly Ser 225 230 235 240 Leu Gly Pro Val Leu Pro Val Val Thr Ser Ala Ser Lys Leu Ser Pro 245 250 255 Pro Leu Leu Ser Ser Val Ala Ser Leu Ser Ala Phe Pro Phe Ser Phe 260 265 270 Gly Ser Phe His Leu Leu Ser Pro Asn Ala Leu Ser Pro Ser Ala Pro 275 280 285 Thr Gln Ala Ala Asn Leu Gly Lys Pro Tyr Arg Pro Trp Gly Thr Glu 290 295 300 Ile Gly Ala Phe 305 <210> 4 <211> 337 <212> PRT <213> Homo sapiens Hey2 <400> 4 Met Lys Arg Pro Cys Glu Glu Thr Thr Ser Glu Ser Asp Met Asp Glu 1 5 10 15 Thr Ile Asp Val Gly Ser Glu Asn Asn Tyr Ser Gly Gln Ser Thr Ser 20 25 30 Ser Val Ile Arg Leu Asn Ser Pro Thr Thr Thr Ser Gln Ile Met Ala 35 40 45 Arg Lys Lys Arg Arg Gly Ile Ile Glu Lys Arg Arg Arg Asp Arg Ile 50 55 60 Asn Asn Ser Leu Ser Glu Leu Arg Arg Leu Val Pro Thr Ala Phe Glu 65 70 75 80 Lys Gln Gly Ser Ala Lys Leu Glu Lys Ala Glu Ile Leu Gln Met Thr 85 90 95 Val Asp His Leu Lys Met Leu Gln Ala Thr Gly Gly Lys Gly Tyr Phe 100 105 110 Asp Ala His Ala Leu Ala Met Asp Phe Met Ser Ile Gly Phe Arg Glu 115 120 125 Cys Leu Thr Glu Val Ala Arg Tyr Leu Ser Ser Val Glu Gly Leu Asp 130 135 140 Ser Ser Asp Pro Leu Arg Val Arg Leu Val Ser His Leu Ser Thr Cys 145 150 155 160 Ala Thr Gln Arg Glu Ala Ala Ala Met Thr Ser Ser Met Ala His His 165 170 175 His His Pro Leu His Pro His His Trp Ala Ala Ala Phe His His Leu 180 185 190 Pro Ala Ala Leu Leu Gln Pro Asn Gly Leu His Ala Ser Glu Ser Thr 195 200 205 Pro Cys Arg Leu Ser Thr Thr Ser Glu Val Pro Pro Ala His 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Claims

노치(Notch) 표적 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, HCMV(human cytomegalovirus) 복제 억제용 약학적 조성물로서,
상기 노치 표적 단백질은 Hes1(Hairy and Enhancer of Split-1), Hes5(Hairy and Enhancer of Split-5) 또는 Hey1(Hairy/enhancer-of-split related with YRPW motif protein 1)이고,
상기 HCMV 복제 억제에 의하여 뇌종양, 대장암, 유방암, 인두염 및 폐렴으로 이루어진 군에서 선택되는 HCMV 감염질환이 예방 또는 치료되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
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제 1 항에 있어서,
상기 Hes1 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 Hes5 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 Hey1 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
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