JP6653054B2 - Tim−3をターゲットとする脳損傷疾患治療用組成物及びこのスクリーニング方法 - Google Patents
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Description
<1−1>実験動物
Randall Johnson博士が製作したHIF−1α+f/+f(HIF−1α−floxed alleles)を持ったマウスを使用した。骨髄系統細胞でHIF−1αに欠けたマウスは、HIF−1α+f/+fマウスとLysM−Cre形質転換マウスの異種交配から製作した(非特許文献2)。8週令の雄C57BL/6マウス(Orient Bio)を生体内(in vivo)及び試験管内(in vitro)実験に使用した。
C57BL/6雄マウス(8週、Orient Bio)に対して非特許文献3のような方法でH/Iを誘導した。簡単に説明すると、マウスをZoletil(Virbac)及びRompun(Bayer)(4:1)で麻酔させ、それぞれのマウスの右側総頸動脈(common carotid artery)を露出させ、4−0手術用シルク(surgical silk)で二重接合した。切開部位を縫合し、過量の食べ物と水で2時間の間マウスを回復させた。全身性低酸素症(systemic hypoxia)は、温度調節低酸素チャンバ(BioSpherix、C−474)で8%の酸素/バランスN2に露出させて誘導した。このような一時的一側脳虚血症(transient unilateral cerebral ischaemia)モデルは、同側半球(ipsilateral hemisphere)で再生可能な脳損傷を発生させるが、対側半球(contralateral hemisphere)では発生させない。TIM−3−抑制(blocking)実験のために、H/I30分後にマウスに100μgのラット(rat)IgG2a、k isotype(eBioscience、16−4321)または抗TIM−3モノクロニル抗体(eBioscience、RMT−3−23)を静脈注射した。H/Iの24時間が経った後マウスを殺した後、脳を除去し、直ちに2mm厚さのセクションで切った後、TTCと共に37℃で30分間培養した。前記セクションのイメージは、カメラが装着された立体顕微鏡(Zeiss、Stereo Discovery.V20)で観察した。梗塞(infarct)体積は、梗塞組織の浮腫に対して償う間接的な方式で測定し、半球面積に対する損傷面積の割合の百分率で計算し、浮腫による半球の膨潤(swelling)は補正された。梗塞体積の計算式は、以下の通りである(非特許文献4):
梗塞体積(Infarct volume)(%)=[(対側性半球−同側性半球の健康な領域)/対側性半球]×100
マウスを動物ベッドに固定させ、MRI測定装備(Bruker7T BioSpec)下に位置させた後、映像測定の間麻酔させる。Relaxation Enhancement sequenceを持ったRapid Acquisitionを利用してT2−加重された(weighted)イメージを得た。0.7mm厚さの18個の隣接軸スライスを得た[matrix256×256;field of view=20×20mm;TR(Repetition Time)=2,500ms;TE(Echo Time)=35ms;acquisition time=4分;no gap]。ADC(apparent diffusion coefficient)マップは、スピン−エコーシーケンスを利用して拡散加重された(diffusion−weighted)イメージによって得た。このため、8個の隣接軸イメージを得た[thickness 0.7mm、matrix256×128、field of view=20×20mm、TR=2,000ms、TE=26.936ms、acquisition time=16分、1average、b values=45,350、mm2当たり1,000及び2,000s、no gap]。ADCマップは、スキャナで得た。浮腫体積は、T2−加重されたイメージから得、ADCマップは、Image J analyserから得た。浮腫体積(Oedema volume)(%)=[(同側性体積−対側性体積)/対側性体積]×100。
公知の方法によって脳組織から小膠細胞を分離した(非特許文献5)。簡単に説明すると、かん流された(perfused)マウスから脳を除去し、同側性(ipsilateral)及び対側性(contralateral)半球に分けた後、研いで250μgml−1のcollagenase IV/DNase Iを処理した後、37℃で45分間培養して分解した。その細胞分解産物を50/70%Percoll濃度勾配(gradients)で1,000gで25分間分画した。50及び70%バンド間の境界面で小膠細胞を集め、HBSS(hanks’ balanced salt solutions)で洗浄した(Welgene)。分離した小膠細胞の純度は、FACS分析で測定した。公知の方法によって星状細胞を分離した(非特許文献6)。簡単に説明すると、脳組織からの細胞サスペンション(suspensions)を30/60%のPercoll濃度勾配(gradients)で1,000gで25分間分画した。PBS/30%の境界面で星状細胞を収集した。分離した星状細胞の純度は、抗−GFAP抗体を利用したFACS分析で測定した(Cell Signaling Technology、#3670、1:500)。
1ないし3日が過ぎたマウスの大脳皮質からマウス1次混合神経膠細胞(primary mixed glial cells)を培養した(非特許文献7)。抗CD11b抗体を使用したFACS分析によってマウスの混合神経膠細胞の培養で小膠細胞の割合は30.50%と測定された(eBioscience、11−0112、5μgml−1)。14胎児日(embryonic day)のマウスからニューロン強化(enriched)中脳細胞を培養した(非特許文献7)。簡単に説明すると、腹側の中脳組織(ventral mesencephalic tissues)を切開し、CMF−HBSS(Ca2+、Mg2+−free HBSS)で10分間培養し、CMF−HBSS内の0.01%のトリプシン(trypsin)で9分間37℃で培養した。培養物を10%ウシ胎児血清、6mgml−1グルコース、204mgml−1L−グルタミン及びトリプシンの阻害のための100Uml−1ペニシリン/ストレプトマイシン(P/S)を添加したDMEM(Dulbecco’s modified eagle’s medium)で二回洗浄した後、粉砕して単一細胞に分離させた。細胞をポリ−D−lysine(5mgml−1)及びラミニン(laminin)(0.2mgml−1)コーティングプレートに分注した(ウェル当たり2×106細胞)。
Cre再組合酵素遺伝子がサイトメガロウイルスプロモータの調節下で発現される非増殖性アデノウイルス(AD−GFP/Cre)をVector Biolabsから購入した。レポーターAd−GFPを対照群として使用した(Vector Biolabs)。アデノウイルスの形質導入のために、1次混合神経膠細胞をHIF−1α+f/+fマウスから培養し、Ad−GFPまたはAd−GFP/Creで24時間の間感染させた[MOI(multiplicity of infection)=100]。フローサイトメトリーで測定された感染効率(infection efficiency)は、約50%であった。
ChIPアッセイキット(Upstate Biotechnology)を使用してChIPアッセイを行った。マウス1次混合神経膠細胞を低酸素環境で24時間の間培養し、直ちに1%ホルムアルデヒド/ホスフェート−バッファー食塩水(phosphate−buffered saline)で固定し、超音波処理して500ないし1,000−bp DNA断片を得た。クロマチン(chromatin)を5μgの抗HIF−1α(Novus、NB100−134)またはウサギIgGで免疫沈殿させた。免疫沈殿されたDNAをTIM−3−プロモータに特異的なプロモータ対で増幅させた[F,5’−CCTGCTGCTTTGGAATTTGC−3’(序列番号3);及びR,5’−GAGTACTTGGCAGGGGAAATC−3’(序列番号4)]。
FITC−結合された抗CD11b(eBioscience、11−0112、5μgml−1)及びPE−結合された抗Gr−1(Ly6G)(eBioscience、12−5931、2ugml−1)の結合に基づいて、FACS Aria system(BD Bioscience)を使用して好中球を分離した。分類された好中球をトランスウェル(Transwell)の上側チャンバにマウス1次混合神経膠細胞が分注された24−ウェルプレート上に添加した。前記細胞を1%または20%の酸素条件で24時間の間培養した。移動(transmigration)は、ヘマサイトメータ(haematocytometer)及びフローサイトメトリー(flow cytometry)を利用して測定した。
神経学的後遺症は、神経学的スコアリングシステム(neurological scoring system)を使用して評価した(非特許文献8)。マウスの神経学的点数は、以下の通りである:0、正常運動機能(normal motor function);1、しっぽ持ち上げによる対側性胴体及び前肢の屈折(flexion ofcontralateral torso and forelimb upon lifting by tail);2、対側への回転(circling to the contralateral side when mouse was held by the tail、but normal posture at rest);3、休息期対側への偏向(leaning to contralateral side at rest);及び4、自発的運動能力の喪失(no spontaneous motor activity)。
免疫組織化学のために脳を除去し、パラフィンに固定及び包埋した。ミクロトーム(microtome)を使用して梗塞部位を通じて冠状部(coronal sections)(10−mm厚さ)を切ってスライドにマウントした。パラフィンを除去し、セクションをPBS−Tで洗浄し、10%ウシ血清アルブミンで2時間の間ブロッキングした。その後、次の1次抗体を適用した:goat anti−TIM−3(Santa Cruz Biotechnology、sc−30326、2μgml−1)、rat anti−Gr−1(Ly6G)(eBioscience、MPO(Dako、A0398、10μgml−1)、rabbit anti−Iba−1(Wako、#019−19741、2μgml−1)、rabbit anti−cleaved caspase−3(Cell Signaling Technology、#9662S、1:300)、mouse anti−NeuN(Millipore、#MAB377、10μgml−1)。ピモニダゾール(pimonidazole)(Hypoxyprobe−1、Natural Pharmacia International)を使用して低酸素領域を検出した(非特許文献9)。共焦点顕微鏡(Carl Zeiss LSM510)を使用してイメージを得た。1次神経膠細胞でTIM−3発現の測定のために、マウス1次混合神経膠細胞をメタノールで固定し、PBS−Tで洗浄し、抗TIM−3抗体(R&D Systems、AF1529、1μgml−1)で4℃で培養した。
ゲノムDNAからマウスTIM−3プロモータの1,517−bp断片(始めコドンに対して−1,517から+1)をPCR−増幅し、PGL3 basic vector(Promega)にクローニングした。突然変異プライマー及びPhusion High−Fidelity DNA重合酵素(NEB)を使用して、それぞれのHREの部位特異的突然変異(site−directed mutagenesis)を行った。全ての製作物(constructs)は、DNAシークエンシングで確認した。Lipofectamine2000(Invitrogen)を使用してマウス1次混合神経膠細胞(primary mixed glial cells)をトランスフェクションした。トランスフェクション後に、細胞を1%または20%の酸素条件で24時間の間培養し、luciferase assay system(Promega)でレポーター遺伝子活性を測定した。トランスフェクション効率の標準化(normalization)のためにベータ−ガラクトシダーゼ(β−Galactosidase)活性を測定した。
H/Iマウスの右側及び左側半球を切開し、プロテアーゼ阻害剤(protease inhibitors)[2mM phenylmethylsulphonyl fluoride、100μgml−1 leupeptin、10μgml−1 pepstatin、1μgml−1 aprotinin及び2mM EDTA]を含有した氷冷却したRIPAバッファーでpellet pestle(Fisher)で均質化した。均質化物を4℃で12,000rpmで30分間遠心分離し、上層液を収去した。サンプルをSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で分離し、ニトロセルロース膜(nitrocellulose membranes)に移し、次の1次抗体と共に培養した:goat anti−TIM−3(R&D Systems、AF1529、0.1μgml−1)、mouse anti−PARP(Zymed、33−3100、2μgml−1)、rabbit anti−MPO(Dako、A0398、2μgml−1)、goat anti−Iba−1(Abcam、ab5076、0.5μgml−1)、mouse anti−GFAP(Cell Signaling Technology、#3670、1:1,000)、mouse anti−NeuN(Millipore、#MAB377、1μgml−1)、mouse anti−α−tubulin(Sigma、T5168、1:5,000)、microtubule−associated protein 2(Millipore、#MAB3418、1μgml−1)、glutamate decarboxylase(Abcam、ab11070、1μgml−1)、peroxidase−conjugated goat anti−rabbit(Bio−Rad,#170−6515,1:5,000)、peroxidase−conjugated rabbit anti−goat(Zymed,R−21459,1:5,000)、peroxidase−conjugated goat anti−mouse(Bio−Rad,#170−6516,1:5,000)。結果は、増加された化学発光システム(enhanced chemiluminescence system)を使用して視覚化し、濃度計(densitometric analysis)(Image J software、NIH)で定量した。全ての実験は、独立して少なくとも3回繰り返して行われた。
Easy−Blue(iNtRON)を使用して総RNAを分離し、avian myeloblastosis virus reverse transcriptase(TaKaRa)を製造社の説明に従って使用してcDNAを合成した。25−30サイクルの連続反応でPCRを行った。全ての実験は、独立して少なくとも3回繰り返して行われ、PCR産物は、NIH Image Jを使用して定量してアクチンに対して標準化した。QuantiFast SYBR Green PCR kit(Qiagen)を使用してreal−time PCRを行った。Roche LightCycler 480 Real−Time PCR System(Roche Applied Science)及びLigthCycler 480 Quantification Software Version1.5を使用してreal−time PCRを行い分析した。
IL−1βに対して(forward)5’−GGATGAGGACATGAGCACCT−3’(序列番号5)及び(reverse)5’−TCCATTGAGGTGGAGAGCTT−3’(序列番号6);
CXCL1に対して(forward)5’−TGCACCCAAACCGAAGTCAT−3’(序列番号7)及び(reverse)5’−TTGTCAGAAGCCAGCGTTCAC−3’(序列番号8);
HIF−1αに対して(forward)5’−CTCATCAGTTGCCACTTCC−3’(序列番号9)及び(reverse)5’−TCATCTTCACTGTCTAGACCAC−3’(序列番号10);
GAPDHに対して(forward)5’−TGTCGTGGAGTCTACTGGTGTCTTC−3’(序列番号11)及び(reverse)5’−CGTGGTTCACACCCATCACAA−3’(序列番号12)。
TIM−3に対して(forward)5’−CCCTGCAGTTACACTCTACC−3’(序列番号13)及び(reverse)5’−GTATCCTGCAGCAGTAGGTC−3’(序列番号14);
HIF1αに対して(forward)5’−AGCCTTAACCTGTCTGCCACTT−3’(序列番号15)及び(reverse)5’−GAAATCATTTAACATTGCATATATACTAGAACAT−3’(序列番号16);
MPOに対して(forward)5’−AGGATAGGACTGGATTTGCCTG−3’(序列番号17)及び(reverse)5’−GTGGTGATGCCAGTGTTGTCA−3’(序列番号18);
IL−1βに対して(forward)5’−TACAGGCTCCGAGATGAACAACAA−3’(序列番号19)及び(reverse)5’−TGGGGAAGGCATTAGAAACAGTCC−3’(序列番号20);
CXCL1に対して(forward)5’−CGCTCGCTTCTCTGTGCAGC−3’(序列番号21)及び(reverse)5’−GTGGCTATGACTTCGGTTTGG−3’(序列番号22);
Actinに対して(forward)5’−CATGTTTGAGACCTTCAACACCCC−3’(序列番号23)及び(reverse)5’−GCCATCTCCTGCTCGAAGTCTAG−3’(序列番号24)。
全ての染色段階は、闇中で行われ、BD Fc Blockで遮断された。新たに得た小膠細胞及び星状細胞を、次の抗体で染色した:rabbit anti−Iba−1(Wako、#019−19741、1μgml−1)後にAlexa 488−conjugated chick anti−rabbit(Invitrogen、A21441、2μgml−1)、及びPE−conjugated anti−mouse TIM−3(eBioscience、RMT−3−23、2μgml−1)またはisotype control Ab(eBioscience、2μgml−1)で4℃で30分間、GFAPの細胞内染色のために、IC fixation/permeabilizationバッファー(eBioscience)を使用して細胞を20分間固定及び透過化し、透過化(permeabilization)バッファーで二回洗浄し、抗GFAP(Cell Signaling Technology、#3672、1:500)と共に透過化バッファーで30分間培養し、Alexa 488−conjugated chick anti−mouse(Invitrogen、A21200、2μgml−1)で染色した。データは、Cell−Quest software(BD Bioscience)及びFlow Jo software(Treestar)パッケージで分析した。
TIM−3(GE Dharmacon)のコーディング序列をPLL3.7.EF1αプラスミド(Addgene、Inc.)に接合させてPLL3.7.EF1α−TIM3を製作した。前記プラスミドを使用して再組合レンチウイルスLV−TIM3−GFPを製作した。対照群としてGFPのみを発現するレンチウイルスベクター(LV−GFP)を作った。レンチウイルスをフローサイトメトリーを使用して滴定した(非特許文献10)。脳固定装置(stereotaxic instrument)を利用してLV−TIM3−GFPまたはLV−GFPを注射した。それぞれのマウスは、4回のレンチウイルス(5×106TUml−1を含有した20μリットルを右側半球に)頭蓋注射(intracranial injections)を打たれた。試験管内(in vitro)蛍光イメージングのため、収集された細胞をFACS及び抗GFP抗体(Santacruz、sc−9996、1:1,000)を使用したウエスタンブロッティングで分析した。Caliper Life Science’s Xenogen IVIS Spectrumを使用して全身の生体内(in vivo)イメージングを行った[励起(excitation)フィルターで445から490nm、放出(emission)フィルターで515から575nmで照射]。
全てのデータは、平均±s.dで表示した。SigmaPlot10.0を使用してPost−hoc comparisons(Student−Newman−Keuls test)を行った。神経学的点数(neurological scores)は非母数的(nonparametric)統計処理で評価した。二つのグループ(IgG vs anti−TIM−3、HIF−1α+f/+fマウス vs LysM−Hif−1α−/−マウス、LV−GFP注射 LysM−Hif−1α−/−マウス vs LV−TIM3−GFP注射LysM− Hif−1α−/−)間の比較は、Mann−hitney U−testsで分析した。
虚血性脳損傷と炎症間の相互依存的関連性の基礎となる分子的機作を調べるために、本発明者らは、脳の低酸素虚血症(cerebral hypoxia−ischaemia、H/I)による病態生理学的炎症反応に主な役割をすることができる候補分子を調査した。このため、右側頚動脈の一方接合(unilateral ligation)後、全身的低酸素症(systemic hypoxia)を誘発した一時的一側脳虚血症(transient unilateral cerebral ischaemia)マウスモデルを利用した(非特許文献11)。H/Iの24時間後に対側性(contralateral)及び半陰影(penumbral)皮質領域から組織を得た後、多様な炎症関連分子の発現水準をRNA及びタンパク質水準で調査した。その結果、同側性半陰影(ipsilateral penumbra)でTIM−3(T−cell immunoglobulin and mucin domain−3)の転写水準が対側性領域(contralateral regions)ではるかに高く増加したことを発見した。また、同側性半陰影(ipsilateral penumbra)でTIM−3タンパク質も対側性領域より増加したことを確認した(図1a、b)。前記同側性半陰影領域は、低酸素下で陽性対照群(positive control)であるHIF−1の転写体及びタンパク質水準が高いと報告された(非特許文献12;及び非特許文献13)。
本発明者は、H/I後に如何なる細胞がTIM−3の上向き調節(upregulation)を表すについて調査した。ウエスタンブロット分析の結果、H/I24時間後にH/Iマウスの同側性皮質で、活性化された小膠細胞マーカーであるIba−1(ionized calciumbinding adaptor molecule−1)及び活性化された星状膠細胞マーカーであるGFAP(glial fibrillary acidic protein)のタンパク質発現水準が対側性皮質よりさらに高かった。一方、NeuN(neuronal nuclei)、マイクロチューブル−連関タンパク質2(microtubule−associated protein 2)及びグルタメートデカルボキシラーゼ(glutamate decarboxylase)のようなニューロン細胞マーカーの発現水準は、半陰影皮質組織(penumbral cortex tissues)で減少した。
前記実験結果に基づいて本発明者らは、神経膠細胞(glial cell)でTIM−3の発現が酸素分圧(oxygen tension)によって変更され得るか否かを、BV2小膠細胞及び1次培養された神経膠細胞を使用して実験した。BV2細胞は、正常酸素(normoxic)(20%のO2)または低酸素(hypoxic)(1%のO2)条件で24時間の間培養し、TIM−3の細胞表面水準は、FACS分析で測定した。興味深いことに、TIM−3発現は、低酸素条件で非常に増加した(図2a)。免疫細胞化学(immunocytochemistry)の分析結果も、マウス1次混合神経膠細胞(primary mixed glial cells)でTIM−3発現が正常酸素(normoxic)環境に比べて低酸素(hypoxic)環境で非常に増加するということを示した(図2b)。また、本発明者らは、低酸素環境でTIM−3の転写水準が1次混合神経膠細胞では増加したことに対し、1次ニューロン細胞(primary neuronal cells)では増加しないことを確認した(図2c、d)。このような結果は、神経膠細胞で低酸素症がTIM−3発現を誘導することを示す。
H/Iマウスモデルの神経膠細胞でTIM−3が上向き調節されたので、本発明者らは、大脳(cerebral)H/I後に脳で低酸素誘導されたTIM−3の役割を調査した。このため、H/I24時間後にTIM−3−抑制抗体が脳損傷に及ぼす影響をTTC(2,3,5−triphenyltetrazolium)染色を利用して調査した。図3aに示すように、対照群IgG−注射マウスに比べて100μgのTIM−3−抑制抗体を静脈注射したマウスでTTC−陰性領域が非常に減少したことを確認することができた。このような結果は、低酸素環境でTIM−3−抑制抗体が脳損傷を減少させることができることを示す。
様々な研究によると、好中球は、虚血性脳で数時間中に速く浸潤されて、炎症反応と脳損傷の発生に関与する(非特許文献20;及び非特許文献21)。神経膠細胞は、虚血症発生後の数分内に関連した活性を表す脳損傷に1次的に反応する細胞のうち一つであるので、本発明者らは、神経膠細胞でTIM−3のHIF−1−依存的増加が好中球の虚血半陰影(ischaemic penumbra)への浸潤に影響を及ぼし、TIM−3が好中球を集める能力の下向き調節(downregulation)は、脳虚血後の脳損傷を減少させることができるという仮説を立てた。これにより、先ず代表的な二つの好中球マーカーであるMPO(myeloperoxidase)及びGr−1(granulocyte receptor−1)の発現を測定し、H/I後、24時間になった時、対側性領域に比べて半陰影皮質(penumbral cortex)及び線条体(striatum)で前記マーカーに陽性である細胞(MPO+Gr−1+)が大きく増加することを確認した。次に、本発明者らは、神経膠細胞(glial cells)が低酸素環境でGr−1highCD11bhigh好中球を集めることができるか否かについて調査した。C57BL/6マウスから脾臓細胞(splenocytes)を分離し、1次混合神経膠細胞または兔疫細胞を損傷部位に集めると知られたマウス胎仔線維芽細胞(murine embryonic fibroblast)の対照群細胞を含むか含まないトランスウェル(Transwell)システムにおいて、1または20%の酸素条件で24時間の間培養した(非特許文献22)。神経膠細胞またはマウス胎仔線維芽細胞の存在下で、Gr−1highCD11bhigh細胞は、低酸素環境では下側チャンバに非常に多く移動したが、正常(normoxic)環境では数個の細胞のみが移動した。しかし、このようなGr−1highCD11bhigh細胞の移動の低酸素依存的増加は、神経膠細胞のない状態では非常に減少した。このような結果は、神経膠細胞が低酸素環境でGr−1highCD11bhigh細胞を集めることに関与し得ることを示唆する。
膠細胞TIM−3が好中球の移動に及ぼす影響をさらに特異的に測定するために、低酸素環境で膠細胞が好中球を補充する能力がTIM−3の遮断によって影響を受けるか否かを調査した。トランスウェル(Transwell)システムを利用して、1次膠細胞(primary glial cells)を下側チャンバにプレーティングし、TIM−3−抑制抗体または対照群IgGで前処理した後、上側チャンバに脾臓細胞(splenocytes)をローディングした。1%の酸素条件で24時間の間細胞を培養し、下側チャンバにあるGr−1highCD11bhigh細胞の割合をFACS分析で測定した。その結果、低酸素環境で下側チャンバにあるGr−1highCD11bhigh細胞が、対照群IgGに比べて、10mgのTIM−3−抑制抗体によって非常に減少したことを確認した(図5a)。
上記の結果をさらに検証するために、低酸素環境で骨髄(BM)由来のGr−1highCD11bhigh細胞の移動を調査した。Gr−1highCD11bhigh
細胞をBM細胞から分離して上側チャンバにプレーティングし、下側チャンバには、1%の酸素条件でTIM−3−抑制抗体または対照群IgG−処理された1次混合神経膠細胞(primary mixed glial cells)をローディングした。上記の結果と一致するように、BM由来のGr−1highCD11bhigh細胞の下側チャンバへの移動は、対照群IgG処理に比べてTIM−3−抑制抗体処理によって非常に減少した(図5b)。このような結果は、脳虚血後、低酸素領域に好中球が補充されるにあたって膠細胞TIM−3の役割を明確に示す。
好中球の炎症または損傷部位への浸潤は、化学走性因子(chemoattractants)によって調節され、これらは虚血後脳の好中球浸潤に先立って上向き調節される(非特許文献23)。従って、本発明者らは、TIM−3抑制が虚血状態の脳で好中球化学走性因子として作用するIL−1β及びCXCL1の水準に及ぼす影響を調査した(非特許文献24)。H/I後、30分になった時、マウスに100mgのTIM−3−抑制抗体または対照群IgGを静脈注射した。24時間後に、同側性及び対側性皮質組織でIL−1β及びCXCL1転写水準を調査した。図5c、dに示すように、対照群IgGを注射したH/Iマウスの同側性皮質領域でIL−1β及びCXCL1の転写体水準が全て非常に増加したが、このような効果は、TIM−3−抑制抗体を注射したマウスでは非常に減少した。
低酸素環境の神経膠細胞でHIF−1αがTIM−3の発現を調節するという発見に基づいて、本発明者らは、HIF−1αが低酸素環境で神経膠細胞の好中球の補充能力に影響を及ぼすか否かを調査した。HIF−1α+f/+fマウスから培養した1次混合神経膠細胞をAd−GFPまたはAd−GFP/Creで感染させ、トランスウェル(Transwell)システムで脾臓細胞(splenocytes)と共に1%または20%の酸素条件で24時間の間培養した。低酸素環境で下側チャンバのGr−1highCD11bhigh細胞の割合は、脾臓細胞をAd−GFP/Cre感染されたHIF−1α−欠乏神経膠細胞と共に培養した時、対照群Ad−GFP−感染細胞に比べて非常に減少した。一方、20%の酸素条件で移動したGr−1highCD11bhigh細胞の数は、HIF−1α−欠乏及び正常細胞の間に大きな差がなかった(図6a)。次に、本発明者らは、移動したBM−由来Gr−1highCD11bhigh細胞の数が、1%の酸素条件でHIF−1α−欠乏神経膠細胞と共に培養することによって非常に減少したことを発見した(図6b)。また、対照群Ad−GFP−感染細胞に比べて、TIM−3の低酸素−依存的増加が表れないAd−GFP/Cre−感染されたHIF−1α−欠乏神経膠細胞でIL−1β及びCXCL1の低酸素−依存的増加は非常に減少した(図6c、d)。
減少された梗塞(infarct)の体積及びニューロン細胞の死滅が神経機能の改善と連関するか否かを調べるために、公知の方法を使用してH/IモデルでNDS(neurological deficit score)を測定した(非特許文献26;及び非特許文献27)。神経学的後遺症(neurological deficits)は、対側性胴体(contralateral torso)と前肢の屈折(flexion)、対側への回転(circling to the contralateral side)、停止期の対側への偏向(leaning to the contralateral side at rest)、及び自発的運動活動(spontaneous motor activity)によって測定した。H/Iによる神経学的後遺症は、IgG−処理マウスに比べて、TIM−3−抑制抗体を処理したマウスで減少した。H/Iの20時間後に、IgG処理マウスに対するNDSは2.8±0.8(±s.d.)であったことに対し、TIM−3−抑制抗体処理マウスに対するNDSは0.8±0.8であった(表1;P=0.012;Mann−Whitney U−test)。
本発明者らは、TIM−3がH/I後にHIF−1α−欠乏マウスの形質に影響を及ぼし得るか否かを実験した。このため、TIM−3及びGFPを発現するレンチウイルスベクター(LV−TIM3−GFP)を製作した。先ず、レンチウイルスが神経膠細胞を感染できるか否かを調査した後、レンチウイルス−注射マウスのGFP−陽性−CD11bhighCD45low神経膠細胞でTIM−3の発現が非常に増加したことを観察した。脳固定装置(stereotaxic instrument)を利用してウイルスをLysM−Hif−1α−/−マウスの右側半球に注射した。対照群マウスには、GFPのみを発現するLV−GFPを注射した。それぞれのマウスの右側半球に4回の頭蓋内注射(intracranial injection)を行った(図8a)。H/Iは、LysM−Hif−1α−/−マウスにLV−TIM3−GFPまたはLV−GFPを注射し、5日後に誘導し、梗塞大きさ(infarct size)及び神経学的結果は、24時間後に調査した。図8b、cに示すように、対照群LV−GFP−注射マウス(n=6)に比べて、LV−TIM3−GFP注射マウス(n=5)でTTC−染色−陰性領域が非常に増加した。また、LV−TIM3−GFPを注射したLysM−Hif−1α−/−マウスに対する平均NDSは、LV−GFP−注射対照群マウスより高かった(図8d)(1.1±0.7 vs.2.3±0.8、P=0.046)。このような結果は、低酸素環境でHIF−1/TIM−3軸と脳損傷の関連性を再度示す結果である。
上記で行った実施例における実験は、TIM−3に対する抗体を利用して行い、さらに、本発明者らは、TIM−3を抑制することができるまた他の方法として、TIM−3に対するshRNAの使用可能性を確認した。このため、先ず一次培養膠細胞(図10A)またはV2小膠細胞(図10B)にTIM−3に対するshRNAを発現するレンチウイルスまたは対照群レンジウイルスを製品生産会社(Santacruz #sc−72015−V)から提供された説明書に従って細胞内に感染させた。以後、感染された細胞を24時間の間1%または20%の酸素条件で培養し、逆転写重合酵素連鎖反応分析法、免疫細胞化学法及び流細胞分析法を利用してTIM−3の発現を確認し、このような実験は、3回の独立した繰返し実験から結果を得て、meanSDとして示した。
Claims (5)
- TIM−3(T−cell immunoglobulin and mucin domain protein 3)抗体を有効成分として含む脳損傷疾患の予防または治療用薬学的組成物。
- 前記抗体は、配列番号1のアミノ酸配列で表されるTIM−3に結合するか、これと反応して、TIM−3の活性を特異的に抑制または減少させる拮抗抗体であることを特徴とする請求項1に記載の組成物。
- 前記TIM−3抗体は、HIF−1(hypoxia−inducible factor−1)の発現または活性を抑制させることを特徴とする請求項1に記載の組成物。
- 前記TIM−3抗体は、好中球走化因子(neutrophil chemotactic factor)の発現または活性を減少させることを特徴とする請求項1に記載の組成物。
- 前記脳損傷疾患は、脳梗塞、脳卒中、低酸素性脳損傷、虚血性脳疾患及び中風からなる群から選択されることを特徴とする請求項1ないし4のいずれか一項に記載の組成物。
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