KR102359994B1 - 급성 중추 신경계 손상 질병에 대한 헥소키나제2 특이적 억제제의 응용 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 생물의학 분야에 속하며, 급성 중추 신경계 손상 질병을 예방 및 치료하는 헥소키나제2 특이적 억제제의 응용에 관한 것이다. 본 발명은 헥소키나제2 특이적 억제제 및 선택적 유전자 녹다운 헥소키나제2가 모두 미세아교세포가 매개하는 신경 염증 반응을 억제하여, 생쥐의 중뇌동맥 폐색으로 인한 뇌손상을 효과적으로 감소시키는 것을 처음으로 발견하였으며, 이는 각종 헥소키나제2를 선택적으로 억제하는 약물은 신경 보호 작용을 가짐을 의미한다.
Description
본 발명은 생물의학 분야에 속하며, 급성 중추 신경계 손상 질병의 예방 및 치료에서의 헥소키나제2 특이적 억제제의 응용에 관한 것이다.
뇌졸중은 중풍이라고도 불리며, 급성 뇌혈관 질병으로서, 뇌혈관이 갑자기 파열되거나 혈관폐색으로 인해 뇌혈류가 감소되어 뇌조직 손상을 일으키는 질병이며, 허혈성 및 출혈성 중풍을 포함하고, 허혈성 뇌중풍이 전체 병례의 85% 정도를 차지한다.
현재 조직형 플라스미노겐 활성화제(t-PA)는 FDA에서 승인한 항중풍 약물이다. 그러나 t-PA는 중풍 발생 후 3-6시간 내에만 적용되며, 동시에 환자가 치료를 받은 후에도 뇌출혈 및 뇌수종의 위험이 있다. 이러한 문제으로 인해 t-PA의 적용은 매우 제한적이며, 또한 수혜 환자도 매우 적다. 따라서, 안전하고 효과적으로 급성 허혈성 중풍 예방 및 치료에 이용될 수 있는 약물에 대한 기대가 매우 크다.
급성 허혈성 뇌졸중 후 면역계가 매개하는 염증반응은 광범위하게 연구되는 치료 표적이다. 그러나, 현재 이러한 매커니즘을 치료 표적으로 하는 약물의 임상실험 결과는 이상적이지 않다. 예를 들면, 말초 면역계 염증반응에 대한 약물인 핑골리모드(Fingolimod)와 나탈리주맙(Natalizumab)은 뇌실질에 대한 림프구의 침투를 효과적으로 억제할 수 있으나, 임상실험 결과에 의하면 치료를 받은 후 중풍 환자들이 단체적으로 혜택을 받게 할 수 없다. 따라서, 허혈 후 미세아교세포에 의해 매개되는 중추 신경계 염증반응에 대해 깊이 탐구하여 급성 허혈성 뇌졸중의 예방 및 치료를 위한 새로운 치료 표적 및 전략을 제공하고자 한다.
본 발명의 발명자는 선별을 통해 일련의 해당경로 유전자를 얻고, 헥소키나제2의 선택적 상향 조절은 저산소에 의해 유도되는 미세아교세포의 활성화 과정을 매개한다는 것을 검증하였다. 발명자는, 헥소키나제2의 선택적 억제 활성을 갖는 일련의 생물학적 활성물질은 저산소에 의해 유도되는 미세아교세포의 활성화 과정을 억제할 수 있음을 증명하였다. 또한 발명자는 헥소키나제1 및 헥소키나제3의 간섭은 저산소에 의해 유도되는 미세아교세포의 활성화 과정을 억제할 수 없음을 발견하였다.
따라서, 한편으로 본 발명은 급성 중추 신경계 손상 질병을 예방 및 치료하는 약물을 제조함에 있어서의 헥소키나제2 특이적 억제제의 응용을 제공한다.
다른 한편으로 본 발명은 급성 중추 신경계 손상 질병을 예방 및 치료하는 약물을 제조함에 있어서의 헥소키나제2 특이적 억제제를 포함하는 조성물의 응용을 제공한다.
또 다른 한편으로 본 발명은 급성 중추 신경계 손상 질병을 예방 및 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 필요 대상에게 예방적 유효량 또는 치료적 유효량의 헥소키나제2 특이적 억제제 또는 헥소키나제2 특이적 억제제를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
본 발명은 급성 중추 신경계 손상 질병을 예방 및 치료함에 있어서의 헥소키나제2 특이적 억제제의 신경보호작용을 발견하였다. 세포학 실험 및 체내동물 실험에 의하면 선택적인 헥소키나제2의 상향 조절된 발현은 저산소에 의해 유도되는 미세아교세포의 활성화 과정 및 허혈 후 미세아교세포에 의해 매개되는 신경염증반응을 통제조절하며, 헥소키나제2 선택적 억제제 및 유전자 녹다운은 모두 미세아교세포가 매개하는 염증반응을 억제하여 신경보호작용을 일으킨다.
도 1: 해당경로의 증가는 저산소에 의한 미세아교세포의 활성화에 필수적이다. (A) 저산소 환경에 표시된 시간만큼 노출시킨 후의 BV2 미세아교세포의 대표적 이미지이다. 스케일바는 100 μm (n = 4)이다. (B) 도 (A)에서 형태학적 변화가 있는 미세아교세포의 백분율을 정량화한 것이다(n = 4). (C) 저산소에 의한 미세아교세포의 활성화를 분자마커(CD11b)의 상향 조절을 통해 확인한 것이다. 스케일바는 25 μm (n = 3)이다. (D) BV2세포의 저산소는 전염증성 사이토카인의 발생을 현저하게 유도하고, 또한 시간 의존성을 나타낸다(n=3). (E-F) 저산소는 BV2세포의 생존율에 영향을 미치지 않는다. 유세포 분석에 의하면, 1%산소에 24시간 노출시킨 후 AnnexinV+ 또는 PI+ 세포의 수는 현저하게 증가되지 않았다(n=3). (G) 2-[N-(7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸-4-일)아미노]-2-데옥시-D-글루코스(2-NBDG)와 공배양하여 정상 산소 또는 저산소에 1시간 노출시킨 세포에서 2-NBDG를 흡수한 시험의 대표성 이미지이다. 스케일바는 100 μm이다. (H) 다중 검출 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 (G)에서의 평균 형광 강도를 정량화한 것이다(n=4). (I) 해당경로 중 주요 대사물을 도시한 것으로, 저산소에 6시간 노출시킨 후 현저하게 증가된 대사물을 표시했다(n=4). (J-L) 해당경로의 억제제인 2-DG는 저산소 기간의 미세아교세포 활성화를 현저하게 차단하였다. (J) 1%산소에 노출시킨 경우, 2DG를 첨가하거나 또는 첨가하지 않은 BV2세포의 이미지를 비교하였다. (K) (J)에서 2-DG로 처리한 후 활성화된 세포의 백분율이 감소하였다. 스케일바는 50 μm (n = 4)이다. (L) 저산소 조건에서 전염증성 사이토카인의 생성은 2-DG에 의해 현저하게 파괴되었다. *<0.05; **<0.01; ***<0.001
도 2: 저산소에 의해 유도되는 미세아교세포의 활성화 과정은 헥소키나제 계열 구성원의 상향 조절된 발현과 관련이 있다. (A) qRT-PCR에 의해 효소의 mRNA수준을 분석한 것이다. 저산소 상태에서 6시간 후 이들 유전자의 mRNA수준은 전반적으로 증가됨을 나타낸다(n=3). (B-C) 저산소에서 도시된 시간 경과한 후, BV2세포(B)와 1차 미세아교세포(pMG)(C) 중의 HK1, HK2 및 HK3 단백질의 수준을 나타낸 것이다(n-4).
도 3: 헥소키나제2의 간섭은 저산소에 의해 유도되는 미세아교세포의 활성화 과정을 효과적으로 억제할 수 있다. (A) 특이적인 HK2의 녹다운은 BV2미세아교세포의 활성화된 표현형을 차단하기에 충분하다(n-3). HK2 siRNA를 사용하지 않거나 또는 사용하여 BV2세포를 24시간 동안 형질 감염시키고 저산소 조건에서 추가적으로 24시간 동안 자극한 후, 도시된 단백질의 수준을 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. (B) BV2세포는 HK2의 서로 다른 간섭 단편에 형질 감염된 후, 저산소에 의해 유도되는 미세아교세포의 형태학적 변화를 효과적으로 억제할 수 있다. (C) HK2녹다운 세포는 저산소 조건에서 활성화된 미세아교세포의 백분율이 감소된다. (D) HK2녹다운은 CD11b의 발현을 현저하게 억제한다.
도 4: 헥소키나제1 및 헥소키나제3의 간섭은 저산소에 의해 유도되는 미세아교세포의 활성화 과정을 억제할 수 없다. HK1와 HK3 간섭 단편을 사용하여 헥소키나제1 및 헥소키나제3을 각각 간섭한 후(A와 C), 저산소에 의해 유도되는 미세아교세포의 활성화와 관련된 형태학적 변화를 효과적으로 억제할 수 없다(B와 D)(n=3).
도 5: 피루베이트키나제M2아형(PKM2)의 간섭은 저산소에 의해 유도되는 미세아교세포의 활성화 과정을 억제할 수 없다. (A) 저산소에 의해 자극된 BV2세포 중 PKM2단백질의 발현을 면역 블롯에 의해 분석한 것이다. (B) PKM2녹다운은 저산소에 의해 유도되는 CD11b의 상향 조절에 영향을 주지 않는다. (C) 대표적 이미지로 PKM2녹다운은 저산소에 의해 유도되는 형태학적 변화를 억제할 수 없음을 나타낸다. 스케일바는 50 μm이다.
도 6: 헥소키나제2 억제제인 로니다민은 저산소에 의해 유도되는 미세아교세포의 활성화 과정을 효과적으로 억제한다. (A) 저산소 기간 동안 Pmg와 BV2 배양물의 활성화 상태는 로니다민(50 μM)이 존재하는 상황에서 현저하게 억제된다. 스케일바는 50 μm이다. (B) (A)에서 로니다민으로 처리 후 활성화된 미세아교세포의 백분율이 감소함을 나타낸다. (C) 면역형광시험은 저산소에 의해 자극된 BV2와 pMG세포는 로니다민이 존재할 경우 CD11b발현이 감소함을 나타낸다. 스케일바는 50 μm이다. *<0.05; **<0.01; ***<0.001
도 7: 헥소키나제2의 상향 조절된 발현은 히스톤 아세틸화의 증가 및 전염증성 사이토카인 Il1b의 전사 발현을 초래한다. (A) BV2세포가 저산소 조건에서 6시간 노출된 후의 해당 및 TCA 사이클의 대사물 스펙트럼이다. 데이터는 정상 산소에 대한 저산소의 변화 배수를 나타낸다. 하향 조절된 대사물은 녹색 블록으로 표시되고, 상향 조절된 대사물은 빨간색 블록으로 표시된다(n=4). (B)(D) HK2는 BV2세포를 역전시킨 세포 내 아세틸-CoA의 축적을 억제하고 아세틸화 히스톤의 상향 조절을 억제한다. (C) BV2세포와 초기 미세아교세포(pMG)의 저산소 노출 후의 히스톤 아세틸화의 발현 수준이다(n=3). (E) mRNA수준의 Il1b의 저산소에 의해 유도되는 상향 조절은 HK2억제를 통해 현저하게 감소된다(n=3). (F) 로니다민 전처리는 AcH3 및 AcH4와 Il1b 프로모터의 결합을 감소시킨다. 각 처리군에서 AcH3 또는 AcH4를 갖는 Il1b프로모터의 존재비는 동일한 프라이머를 갖는 상응하는 입력 샘플에 대한 것이다 (n = 3). *<0.05; **<0.01; ***<0.001
도 8: 로니다민은 중뇌동맥폐색으로 인한 뇌손상으로부터 생쥐를 효과적으로 보호한다. (A) 각 처리군 중 2,3,5-트리페닐테트라졸륨클로라이드(TTC)로 염색된 뇌절편의 대표적 이미지이다. (B) 각 군에서 뇌경색의 크기를 정량화한 것으로, 로니다민 투약군은 MCAo로 인한 경색 크기를 현저하게 감소시킴을 나타낸다(n=6/그룹). *<0.05; **<0.01; ***<0.001
도 9: 체내 유전자 녹다운 헥소키나제2는 중뇌동맥폐색으로 인한 뇌손상으로부터 생쥐를 효과적으로 보호한다. (A) AAV 벡터를 주사하고 21일 후에, 전뇌 이미지화를 이용하여 eGFP발현에 의해 바이러스 분포를 모니터링하였다(n=3). (B) 대뇌 선조 영역 절편의 HK2 및 CD11b 염색은 CD11b가 미세아교세포에서 HK2발현과 양의 상관관계임을 나타낸다(n=6/군). 스케일바는 20μm이다. (C) TTC염색은 MCAo수술 후 AAV shHK2로 처리된 군에서 경색 면적이 감소되었음을 나타낸다(n=6/군). (D) 도(C)의 경색 크기를 정량화한 것이다(n=6/군). (E) 선조체Iba-1면역반응성시험은 AAV-shHK2처리가 경색된 뇌반구의 미세아교세포의 활성화를 현저하게 억제함을 나타낸다. 스케일바는 50μm이다. (F) 허혈성 뇌반구의 피질 및 선조 영역의 대표적 이미지로서, 생쥐 MCAo모델에서 AAV9-shHK2 처리 후 IL-1b의 생성이 감소됨을 나타낸다.
도 2: 저산소에 의해 유도되는 미세아교세포의 활성화 과정은 헥소키나제 계열 구성원의 상향 조절된 발현과 관련이 있다. (A) qRT-PCR에 의해 효소의 mRNA수준을 분석한 것이다. 저산소 상태에서 6시간 후 이들 유전자의 mRNA수준은 전반적으로 증가됨을 나타낸다(n=3). (B-C) 저산소에서 도시된 시간 경과한 후, BV2세포(B)와 1차 미세아교세포(pMG)(C) 중의 HK1, HK2 및 HK3 단백질의 수준을 나타낸 것이다(n-4).
도 3: 헥소키나제2의 간섭은 저산소에 의해 유도되는 미세아교세포의 활성화 과정을 효과적으로 억제할 수 있다. (A) 특이적인 HK2의 녹다운은 BV2미세아교세포의 활성화된 표현형을 차단하기에 충분하다(n-3). HK2 siRNA를 사용하지 않거나 또는 사용하여 BV2세포를 24시간 동안 형질 감염시키고 저산소 조건에서 추가적으로 24시간 동안 자극한 후, 도시된 단백질의 수준을 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. (B) BV2세포는 HK2의 서로 다른 간섭 단편에 형질 감염된 후, 저산소에 의해 유도되는 미세아교세포의 형태학적 변화를 효과적으로 억제할 수 있다. (C) HK2녹다운 세포는 저산소 조건에서 활성화된 미세아교세포의 백분율이 감소된다. (D) HK2녹다운은 CD11b의 발현을 현저하게 억제한다.
도 4: 헥소키나제1 및 헥소키나제3의 간섭은 저산소에 의해 유도되는 미세아교세포의 활성화 과정을 억제할 수 없다. HK1와 HK3 간섭 단편을 사용하여 헥소키나제1 및 헥소키나제3을 각각 간섭한 후(A와 C), 저산소에 의해 유도되는 미세아교세포의 활성화와 관련된 형태학적 변화를 효과적으로 억제할 수 없다(B와 D)(n=3).
도 5: 피루베이트키나제M2아형(PKM2)의 간섭은 저산소에 의해 유도되는 미세아교세포의 활성화 과정을 억제할 수 없다. (A) 저산소에 의해 자극된 BV2세포 중 PKM2단백질의 발현을 면역 블롯에 의해 분석한 것이다. (B) PKM2녹다운은 저산소에 의해 유도되는 CD11b의 상향 조절에 영향을 주지 않는다. (C) 대표적 이미지로 PKM2녹다운은 저산소에 의해 유도되는 형태학적 변화를 억제할 수 없음을 나타낸다. 스케일바는 50 μm이다.
도 6: 헥소키나제2 억제제인 로니다민은 저산소에 의해 유도되는 미세아교세포의 활성화 과정을 효과적으로 억제한다. (A) 저산소 기간 동안 Pmg와 BV2 배양물의 활성화 상태는 로니다민(50 μM)이 존재하는 상황에서 현저하게 억제된다. 스케일바는 50 μm이다. (B) (A)에서 로니다민으로 처리 후 활성화된 미세아교세포의 백분율이 감소함을 나타낸다. (C) 면역형광시험은 저산소에 의해 자극된 BV2와 pMG세포는 로니다민이 존재할 경우 CD11b발현이 감소함을 나타낸다. 스케일바는 50 μm이다. *<0.05; **<0.01; ***<0.001
도 7: 헥소키나제2의 상향 조절된 발현은 히스톤 아세틸화의 증가 및 전염증성 사이토카인 Il1b의 전사 발현을 초래한다. (A) BV2세포가 저산소 조건에서 6시간 노출된 후의 해당 및 TCA 사이클의 대사물 스펙트럼이다. 데이터는 정상 산소에 대한 저산소의 변화 배수를 나타낸다. 하향 조절된 대사물은 녹색 블록으로 표시되고, 상향 조절된 대사물은 빨간색 블록으로 표시된다(n=4). (B)(D) HK2는 BV2세포를 역전시킨 세포 내 아세틸-CoA의 축적을 억제하고 아세틸화 히스톤의 상향 조절을 억제한다. (C) BV2세포와 초기 미세아교세포(pMG)의 저산소 노출 후의 히스톤 아세틸화의 발현 수준이다(n=3). (E) mRNA수준의 Il1b의 저산소에 의해 유도되는 상향 조절은 HK2억제를 통해 현저하게 감소된다(n=3). (F) 로니다민 전처리는 AcH3 및 AcH4와 Il1b 프로모터의 결합을 감소시킨다. 각 처리군에서 AcH3 또는 AcH4를 갖는 Il1b프로모터의 존재비는 동일한 프라이머를 갖는 상응하는 입력 샘플에 대한 것이다 (n = 3). *<0.05; **<0.01; ***<0.001
도 8: 로니다민은 중뇌동맥폐색으로 인한 뇌손상으로부터 생쥐를 효과적으로 보호한다. (A) 각 처리군 중 2,3,5-트리페닐테트라졸륨클로라이드(TTC)로 염색된 뇌절편의 대표적 이미지이다. (B) 각 군에서 뇌경색의 크기를 정량화한 것으로, 로니다민 투약군은 MCAo로 인한 경색 크기를 현저하게 감소시킴을 나타낸다(n=6/그룹). *<0.05; **<0.01; ***<0.001
도 9: 체내 유전자 녹다운 헥소키나제2는 중뇌동맥폐색으로 인한 뇌손상으로부터 생쥐를 효과적으로 보호한다. (A) AAV 벡터를 주사하고 21일 후에, 전뇌 이미지화를 이용하여 eGFP발현에 의해 바이러스 분포를 모니터링하였다(n=3). (B) 대뇌 선조 영역 절편의 HK2 및 CD11b 염색은 CD11b가 미세아교세포에서 HK2발현과 양의 상관관계임을 나타낸다(n=6/군). 스케일바는 20μm이다. (C) TTC염색은 MCAo수술 후 AAV shHK2로 처리된 군에서 경색 면적이 감소되었음을 나타낸다(n=6/군). (D) 도(C)의 경색 크기를 정량화한 것이다(n=6/군). (E) 선조체Iba-1면역반응성시험은 AAV-shHK2처리가 경색된 뇌반구의 미세아교세포의 활성화를 현저하게 억제함을 나타낸다. 스케일바는 50μm이다. (F) 허혈성 뇌반구의 피질 및 선조 영역의 대표적 이미지로서, 생쥐 MCAo모델에서 AAV9-shHK2 처리 후 IL-1b의 생성이 감소됨을 나타낸다.
하기 실시방식은 본 발명에 대한 추가적인 설명이나, 본 발명의 실시방식은 하기 실시예에 의해 소개된 것에 한정되지 않으며, 본 발명의 원리 또는 이념에 따른 균등한 변화 또는 변동은 모두 본 발명의 보호 범위에 포함된다.
약어
2-NBDG, 2-[N-(7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸-4-일)아미노]-2-데옥시-D-글루코스;
ChIP, 크로마틴 면역침전;
DAB, 3,3'-디아미노벤지딘 테트라 하이드로 클로라이드;
DAMP, 손상관련 분자패턴;
DHAP, 디하이드록시 아세톤포스페이트;
FBP, 과당-1,6-이인산;
G-3-P, 글리세르알데히드3-포스페이트;
HK2, 헥소키나제2;
IL-1β, 인터루킨-1β;
LPS, 지질 다당류;
MCAo, 대뇌중동맥폐색;
NMDA, N-메틸-D-아스파르트산;
PKM2, 피루베이트키나제M2;
qRT-PCR, 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응;
rAAV, 재조합 아데노관련바이러스;
ROS, 활성산소;
siRNA, 짧은 간섭 RNA;
TTC, 2,3,5-트리페닐테트라졸륨클로라이드.
한편으로, 본 발명은 급성 중추 신경계 손상 질병을 예방 및 치료하는 약물을 제조함에 있어서의 헥소키나제2 특이적 억제제의 응용을 제공한다. 상기 헥소키나제2 특이적 억제제는 헥소키나제2(헥소키나제II 또는 HK2라고도 칭함)의 생물학적 활성을 특이적 또는 선택적으로 억제할 수 있는 물질을 말한다.
일부 실시방식에서, 상기 헥소키나제2 특이적 억제제는 헥소키나제2의 항체 또는 이의 단편을 포함한다. 상기 항체는 헥소키나제2에 특이적으로 결합되어 헥소키나제의 활성을 억제 또는 소멸시킬 수 있는 단백질을 말한다. 항체의 단편은 예를 들어 Fab, Fab', (Fab')2 및 Fv를 포함할 수 있다. 항체 또는 이의 단편의 생산 및 정제는 해당 분야에서 이미 알려져 있다.
일부 실시방식에서, 본 발명의 상기 헥소키나제2의 항체는 상기 항체를 인코딩하는 아미노산 서열, 뉴클레오티드 서열, 상기 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열을 포함하는 발현 벡터의 형태로 존재할 수 있다. 일부 실시방식에서, 본 발명의 상기 헥소키나제2의 항체는 융합 단백질의 형태로 발현 벡터 또는 숙주 세포에 존재할 수 있다.
일부 실시방식에서, 상기 헥소키나제2 특이적 억제제는 헥소키나제2 를 특이적으로 억제할 수 있는 mRNA 번역 물질, 또는 헥소키나제2를 특이적으로 분해할 수 있는 mRNA 물질(예를 들면, siRNA, shRNA, miRNA 또는 이들의 변형물)을 포함하여, RNAi 매커니즘을 통해 헥소키나제2의 합성을 간섭한다. siRNA, shRNA 또는 miRNA는 체외 합성 기술을 통해 얻을 수 있으며, 이는 본 분야에서 숙지하고 있는 것이다. 일부 실시방식에서, siRNA, shRNA 또는 miRNA는 세포와 같은 특정 벡터에 존재한다.
일부 실시방식에서, 상기 급성 중추 신경계 손상 질병은 급성 허혈 또는 저산소로 인한 중추 신경계 손상 질병 또는 병증을 지칭하며, 급성 척추 손상, 뇌외상, 막망 손상, 저산소성 뇌손상, 급성 허혈성 뇌손상, 허혈성 뇌졸중, 저산소성 뇌졸중, 신생아 저산소성 허혈성 뇌병증, 중독성 뇌병증, 급성 뇌경색, 열공성 뇌경색, 일과성 허혈성 발작, 중증 뇌손상, 뇌척수 수술 및 뇌척수 방사선 치료 등으로 인한 뇌, 척수 신경 손상을 말하나, 이에 한정되지 않는다.
다른 한편으로, 본 발명은 급성 중추 신경계 손상 질병을 예방 및 치료하는 약물을 제조함에 있어서의 헥소키나제2 특이적 억제제를 포함하는 조성물의 응용을 제공한다.
일부 실시방식에서, 상기 조성물에 포함되는 헥소키나제2 특이적 억제제는 상술한 바와 같으며, 또한 상기 조성물은 기타 헥소키나제2 억제제를 더 포함할 수 있다. 상기 기타 헥소키나제2 억제제는 2-데옥시글루코스; 로니다민(Lonidamine); 3-브로모피루브산(bromopyruvic acid); 글루코스 6-포스페이트(glucose 6-phosphate); 이마티닙(Imatinib); 5-티오-글루코스(5-thio-glucose); 메틸 자스모네이트(methyl jasmonate)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
또 다른 한편으로, 본 발명은 급성 중추 신경계 손상 질병을 예방 및 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 필요 대상에게 예방적 유효량 또는 치료적 유효량의 헥소키나제2 특이적 억제제 또는 헥소키나제2 특이적 억제제를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시방식에서, 상기 대상은 인간과 같은 포유 동물이다. 상기 투여는 피하, 경피, 근육, 정맥 내, 동맥 내, 설하, 구강, 위장관 등을 통해 약물을 인체에 투여하는 방식을 말한다. 일부 실시방식에서, 유전자 치료법을 통해 헥소키나제2 특이적 억제제(예를 들면 핵산 형태)를 치료 또는 예방 대상에게 투여할 수 있다.
또 다른 한편으로, 본 발명은 급성 중추 신경계 손상 질병을 예방 및 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 필요한 대상의 체내에서 헥소키나제2의 활성을 선택적 또는 특이적으로 감소 또는 불활성화시키는 것을 포함한다. 상기 헥소키나제의 활성을 감소 또는 불활성화시키는 것은 예를 들어 유전공학적 수단으로 헥소키나제2 단백질의 발현을 감소 또는 제거함으로써 실현된다. 하나의 예시적 수단은 부위지정돌연변이를 통해 헥소키나제2의 인코딩 뉴클레오티드의 서열을 변화시키는 것이다. 다른 예시적 수단은 RNAi기술을 통해 헥소키나제2의 mRNA의 번역 과정을 간섭하는 것이다. 당업자가 알고 있는 세포 내에서 특정 단백질 발현을 감소시키는 방법은 모두 본 발명의 방법에 이용할 수 있음을 예상할 수 있다.
특별히 명시하지 않은 한, 본 발명에서 이용하는 재료 및 실험 방법은 모두 일반적인 재료 및 방법이다.
실시예 1 저산소에 의한 해당경로의 증강은 미세아교세포의 활성에 필수적이다.
재료: 생쥐 BV2미세아교세포주, 고당(high glucose) DMEM배지(Gibco, 11965-118), 소태아혈청(Gibco, 10099-141), 2-데옥시글루코스(Sigma-Aldrich, D8375), 2-(N-7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸-4-아미노)-2-데옥시-D-글루코스(2-NBDG, Thermo Fisher Scientific, N13195), Annexin/PI염색키트(Biotool, B32115), 유세포 분석기(CytoFLEX S), 레이저 공초점 현미경(Nikon A1 Spectral Confocal Microscope), 저산소 챔버(Coy LABORATORY PRODUCTS).
웨스턴 블롯 및 면역 형광에 사용되는 항체 정보:
CD 11b항체(Novus biologicals, NB 110-89474);
TNF-α 항체(CST, 11498);
IL-1β항체(CST, 12507);
IL-6항체(Bioss, bs-6309R);
α-Tubulin 항체(Bioworld, AP0064)。
방법：
a) 세포의 배양: 생쥐의 미세아교세포주BV2는 10%FBS를 함유하는 고당 DMEM배지에서 성장시키며, 5% CO2, 37℃의 항온밀폐식인큐베이터(상대습도 95%) 내에 넣어 계대배양하고, 도립 현미경하에서 성장 상황을 관찰한다. 약 2-3일에 1회 계대하여, 대수성장기 세포를 취하여 정식 실험에 이용한다. 저산소 처리군 세포를 Coy저산소 챔버에 넣고, 산소함량은 1%로 설정하며, CO2함량은 5%로 설정하고, 나머지는 N2로 채운다. 기타 조건은 정상 배양 조건과 같다.
b) 세포단백질의 추출 및 전염증성 사이토카인의 단백질 발현 검출: 35mm 배지에 세포를 접종하여 24시간 정치 후, 상응한 시간 동안 저산소 처리한다. 이후 세포 총 단백질을 추출하여 전염증성 사이토카인 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 단백질 발현을 검출한다.
c) 면역형광법으로 CD11b 발현 검출: 레이저 공초점 전용 배양판에 BV2세포를 접종하고, 24시간 동안 저산소 처리한 후 실온에서 4% 파라포름알데히드로 20분 동안 고정시키며, 이후 PBST를 사용하여 5분씩 3번 세척한다. 세척 완료 후, DAKO항체희석액에 의해 희석된 CD11b항체를 첨가하여 4℃에서 밤새 부화시킨다. 다음날 대응되는 형광표지된 2차 항체를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 부화시킨다. 부화 종료 후, DAPI작동 용액을 첨가하여 세포핵 염색을 10분 동안 진행한다. 처리 완료 후, PBST로 3번 세척하고, 레이저 공초점 현미경으로 이미지화한다.
d) 2-NBDG 흡수 실험: 96웰플레이트 배양판(측변은 검정색이며, 저부는 투명함)에 BV2세포를 접종하고, 24시간 후 200μM 2-NBDG를 함유한 DPBS완충액으로 교체하고, 각각 정상 산소 및 저산소 환경에 놓고 1시간 동안 배양한 후, 새로운DPBS로 교체하여 형광 현미경으로 사진을 찍고, 다기능 마이크로 플레이트 리더로 각 처리군의 형광 값을 검출하여 포도당의 상대적 흡수량을 나타낸다.
e) Annexin/PI염색: 35mm패트리 접시에 세포를 접종하고 24시간 정치한 후, 24시간 동안 저산소 처리를 진행한다. 0.25%트립신으로 소화시켜 세포를 수집한다. 이후, 키트 설명서에 따라 Annexin와 PI염료를 첨가하고, 30분 후 유세포 분석기를 이용하여 저산소가 세포 사멸을 야기하는지 세포 검출을 진행한다.
f) 대사물질의 검출: 600mm패트리 접시에 BV2세포를 접종하고 24시간 정치한 후, 정상 산소 또는 저산소로 6시간 동한 배양한다. 미리 냉각한 PBS로 세포를 3회 세척한 후, 1.5ml의 냉동된 80%의 메탄올을 첨가하고, -80℃의 냉장고에서 30분 동안 부화시킨다. 세포를 수집하여, 4℃에서 14,000g를 15분 동안 원심분리시킨다. 상층 메탄올/수상을 새로운 원심분리관으로 옮겨 -80℃의 냉장고에서 다시 30분 동안 부화시킨다. 원심 분리하여 상청액을 새로운 원심분리관에 수집하고, 질소 분위기에서 샘플을 바람에 건조시킨다. 샘플은 액체 크로마토 그래피-질량분석을 진행하기 전에 -80℃에서 보존한다.
결과:
도 1A에 도시한 바와 같이, 저산소는 미세아교세포의 형태가 뚜렷한 활성화 상태를 나타내도록 유도할 수 있으며, 특징은 세포체가 커지고, 위족이 많아지는 것이며, 이러한 변화는 시간 의존성을 가지며, 저산소에서 24시간 후, 활성화된 형태의 세포는 전체 세포의 약52% 정도를 차지한다(도 1B에 도시한 바와 같다). 동시에, 도 1C의 면역형광의 결과로부터 저산소에서 24시간 후, 미세아교세포가 활성화된 분자마커CD11b도 현저하게 증강되었음을 알 수 있다. 또한, 도 1D에 도시한 바와 같이, 전염증성 사이토카인 TNF-α, IL-1β 및 IL-6은 정상 대조군에서 거의 발현되지 않았으며, 저산소 시간이 길어짐에 따라 이러한 단백질의 발현량도 현저하게 증가되었다. 전체 저산소 과정에서, 1%의 저산소 환경으로 인한 세포의 사멸은 발견되지 않았다(도 1E 및 도 1F에 도시한 바와 같다). 상술한 결과에 의하면, 저산소는 미세아교세포가 염증성 활성화 표현형을 나타낼 수 있도록 한다.
저산소가 진행됨에 따라, BV2세포의 호기적 해당경로도 뚜렷하게 증가한다. 도 1G 및 도 1H에 도시한 바와 같이, 1시간 동안 저산소가 되면 BV2세포의 포도당 흡수량이 약 1.6배 증가할 수 있다. 동시에, 이러한 과정은 해당경로 대사물의 축적 증가도 수반하게 되며, 도 1I에 도시한 바와 같이, 정상 대조군에 비해, 과당-1,6-이인산, 디하이드록시 아세톤포스페이트 및 3-포스포글리세르산은 6시간 동안 저산소 처리한 군에서 모두 현저하게 증가되었다. 2-데옥시글루코스를 사용하여 해당경로를 억제하면, 저산소로 인한 미세아교세포의 활성 표현형은 현저하게 억제되었다(도 1J-도 1L에 도시한 바와 같다). 결론적으로, 해당경로의 증강은 저산소에 의해 유도되는 미세아교세포의 활성에 필수적이다.
실시예 2 저산소에 의해 유도되는 미세아교세포의 활성화 과정은 헥소키나제 계열 구성원의 상향 조절된 발현과 관련된다.
재료: 생쥐 BV2미세아교세포주, 1차 배양 생쥐 미세아교세포, 고당 DMEM배지, 소태아혈청(Gibco, 10099-141), RNA추출 시약 TRIzol(Thermo Fisher Scientific, 15596-018), RNA 정량 키트(Thermo Fisher Scientific, Q10211), SuperReal qPCR PreMix(SYBR Green)(Tiangen, FP202-01), 실시간 PCR 시스템 (Applied Biosystems), 저산소 챔버(Coy LABORATORY PRODUCTS).
웨스턴 블롯에 사용되는 항체 정보:
Hexokinase 1 항체(Abcam,150423);
Hexokinase 2 항체(CST, 2867s);
Hexokinase 3 항체(Santa Cruz, sc-28890);
α-Tubulin 항체(Bioworld, AP0064)。
실시간 PCR 시스템에 사용되는 프라이머 정보:
생쥐HK1포워드 프라이머: GTAGGGGTACGCTTAGGTGG;
생쥐HK1리버스 프라이머: ACCCAGGAGTCCATAAAGCC;
생쥐HK2포워드 프라이머: GAGAAAGCTCAGCATCGTGG;
생쥐HK2리버스 프라이머: TCCATTTGTACTCCGTGGCT;
생쥐HK3포워드 프라이머: GCTCCGTTGAGAGCAGATTT;
생쥐HK3리버스 프라이머: TTGCTGCAAGCATTCCAGTT;
생쥐PFKM포워드 프라이머: GTTTGGAAGCCTCTCCTCCTC;
생쥐PFKM리버스 프라이머: GACGGCAGCATTCATACCTT;
생쥐PFKL포워드 프라이머: CGCAAGGTATGAATGCTGCT;
생쥐PFKL리버스 프라이머: CGATGGTCAAGTGTGCGTAG;
생쥐PGK1포워드 프라이머: CGAGCCTCACTGTCCAAACT;
생쥐PGK1리버스 프라이머: GTCTGCAACTTTAGCGCCTC;
생쥐PKM1포워드 프라이머: CGTCCGCAGGTTTGATGAGA;
생쥐PKM1리버스 프라이머: TTCAAACAGCAGACGGTGGA;
생쥐PKM2포워드 프라이머: GGCTCCTATCATTGCCGTGA;
생쥐PKM2리버스 프라이머: AAGGTACAGGCACTACACGC;
생쥐Actb포워드 프라이머: TGAGCTGCGTTTTACACCCT;
생쥐Actb리버스 프라이머: TTTGGGGGATGTTTGCTCCA.
방법:
a) 세포의 배양：생쥐의 미세아교세포주BV2는 10%FBS를 함유하는 고당 DMEM배지에서 성장시키며, 5% CO2, 37°C의 항온밀폐식인큐베이터(상대습도 95%)내에 넣어 계대배양하고, 도립 현미경하에서 성장 상황을 관찰한다. 약 2-3 일에 1회 계대하여, 대수성장기 세포를 취하여 정식 실험에 이용한다.
1차 배양미세아교세포: 출생 후 0-2일의 C57BL/6J 갓난 생쥐에서 세포를 분리한다. 구체적으로, 대뇌피층을 적출하여, 뇌막 및 혈관을 제거하며; 조직 가위로 조직 덩어리를 잘게 자르고, 0.125%의 트립신으로 37℃에서 15분 동안 소화시킨다. 10%FBS를 함유하는 DMEM에서 소화를 종료하고, 분리된 단일 세포를 패트리 접시에 접종한다. 혼합 대상의 배양 세포가 융합될 때까지 성장하면, 패트리 접시를 가볍게 흔들어 떠있는 미세아교세포를 분리한다. 세포의 순도는 미세아교세포 특이적 분자마커CD11b를 사용하여 판단한다.
b) 세포단백질의 추출 및 전염증성 사이토카인의 단백질 발현 검출: 35mm배지에 세포를 접종하여 24시간 정치 후, 상응한 시간 동안 저산소 처리한다. 이후 세포 총 단백질을 추출하여 헥소키나제 계열의 단백질 발현을 검출한다.
결과:
도 2A에 도시한 바와 같이, 정상대조군과 비교하면, BV2세포는 6시간 동안 저산소 처리한 후 해당경로 대사효소는 mRNA 수준에서 모두 정도는 다르지만 상향 조절된 발현을 가진다. 그 중, 헥소키나제1, 헥소키나제2 및 헥소키나제3은 모두 현저하게 향상되었다. 또한, BV2세포와 1차 배양 미세아교세포는 서로 다른 시간 동안 저산소 처리한 후, 도 2B 및 2C에서도 헥소키나제 계열 구성원의 단백질 수준이 모두 일시적 또는 지속적으로 상향 조절된 발현을 가짐을 알 수 있다.
실시예3 다른 헥스키나제 계열 구성원이 아니라, 헥소키나제2가 저산소에 의해 유도되는 미세아교세포의 활성화 과정을 매개한다.
(1) 헥소키나제2의 간섭은 저산소에 의해 유도되는 미세아교세포의 활성화 과정을 효과적으로 억제할 수 있다.
재료: 생쥐BV2미세아교세포주，1차 배양 생쥐 미세아교세포，고당 DMEM배지(Gibco, 11965-118), 소태아혈청(Gibco, 10099-141), siRNA단편, siRNA형질 감염 시약(Lipofectamine RNAiMAX Reagent, Thermo Fisher Scientific, 13778-500), 도립 위상차 현미경(Nikon ECLIPSE Ti Microscope), 레이저 공초점 현미경(Nikon A1 Spectral Confocal Microscope), 저산소 챔버(Coy LABORATORY PRODUCTS).
웨스턴 블롯에 사용되는 항체 정보:
Hexokinase 1 항체(Abcam,150423);
Hexokinase 2 항체(CST, 2867s);
Hexokinase 3 항체(Santa Cruz, sc-28890);
CD 11b항체(Novus biologicals, NB 110-89474);
α-Tubulin 항체(Bioworld, AP0064).
방법:
a) 세포의 배양：생쥐의 미세아교세포주BV2는 10%FBS를 함유하는 고당 DMEM배지에서 성장시키며, 5% CO2, 37°C의 항온밀폐식인큐베이터(상대습도 95%) 내에 넣어 계대배양하고, 도립 현미경하에서 성장 상황을 관찰한다. 약 2-3 일 1회 계대하여, 대수성장기 세포를 취하여 정식 실험에 이용한다.
b) RNA간섭: 35mm배지에 세포를 접종하여 24시간 정치 후, RNAiMAX로 50nM siRNA단편을 형질 감염시키고, 스크램블된 RNA를 대조군으로 하며, 12시간 후 새로운 배지로 교체하였다. 이후 24시간 동안 저산소 처리하여 상응하는 단백질의 발현량을 검출한다.
결과:
도 3A-3B에 도시한 바와 같이, BV2세포는 HK2의 서로 다른 간섭 단편에 형질 감염된 후, 저산소에 의해 유도되는 미세아교세포의 형태학적 변화를 효과적으로 억제할 수 있으며, 동시에 저산소에 의한 세포 활성화의 마커CD11b의 상향 조절된 발현도 뚜렷하게 감소한다. 이 과정에서, HK2의 간섭은 HK1과 HK3의 발현에 영향을 주지 않는다.
(2) 헥소키나제1과 헥소키나제3의 간섭은 저산소에 의해 유도되는 미세아교세포의 활성화 과정을 억제할 수 없다.
재료: 생쥐BV2미세아교세포주, 고당 DMEM배지(Gibco, 11965-118), 소태아혈청(Gibco, 10099-141), siRNA단편, siRNA형질 감염 시약(Lipofectamine RNAiMAX Reagent, Thermo Fisher Scientific, 13778-500), 도립 현미경(Nikon ECLIPSE Ti Microscope), 저산소 챔버 (Coy LABORATORY PRODUCTS). 웨스턴 블롯에 사용되는 항체 정보: Hexokinase 1 항체(Abcam, 150423); Hexokinase 3 항체(Santa Cruz, sc-28890); α-Tubulin 항체(Bioworld, AP0064).
방법:
a) 세포의 배양: 생쥐의 미세아교세포주BV2는 10%FBS를 함유하는 고당 DMEM배지에서 성장시키며, 5% CO2, 37℃의 항온밀폐식인큐베이터(상대습도 95%) 내에 넣어 계대배양하고, 도립 현미경하에서 성장 상황을 관찰한다. 약 2-3일에 1회 계대하여, 대수성장기 세포를 취하여 정식 실험에 이용한다.
b) RNA 간섭: 35mm배지에 세포를 접종하여 24시간 정치한 후, RNAiMAX로 50nM siRNA단편을 형질 감염시키고, 스크램블된 RNA를 대조군으로 하며, 12시간 후 새로운 배지로 교체하였다. 이후 24시간 동안 저산소 처리하여 상응하는 단백질의 발현량을 검출한다.
결과:
도 4A와 4C에 도시한 바와 같이, HK1 및 HK3 간섭 단편을 사용하여 헥소키나제1과 헥소키나제3을 각각 간섭한 후, 저산소로 인한 미세아교세포의 활성화와 관련된 형태학적 변화를 효과적으로 억제할 수 없다(도 4B와 4D에 도시).
(3) 피루베이트키나제M2아형(PKM2)의 간섭은 저산소에 의해 유도되는 미세아교세포의 활성화 과정을 억제할 수 없다.
재료: 생쥐BV2미세아교세포주，고당 DMEM배지(Gibco, 11965-118), 소태아혈청(Gibco, 10099-141), siRNA단편, siRNA형질 감염 시약(Lipofectamine RNAiMAX Reagent, Thermo Fisher Scientific, 13778-500), 도립 현미경(Nikon ECLIPSE Ti Microscope), 저산소 챔버(Coy LABORATORY PRODUCTS). 웨스턴 블롯에 사용되는 항체 정보: PKM2 항체(Abcam, 150423); CD 11b항체(Novus biologicals, NB 110-89474); α-Tubulin 항체(Bioworld, AP0064).
방법:
a) 세포의 배양: 생쥐의 미세아교세포주BV2는 10%FBS를 함유하는 고당 DMEM배지에서 성장시키며, 5% CO2, 37℃의 항온밀폐식인큐베이터(상대습도 95%) 내에 넣어 계대배양하고, 도립 현미경하에서 성장 상황을 관찰한다. 약 2-3일에 1회 계대하여, 대수성장기 세포를 취하여 정식 실험에 이용한다.
b) RNA 간섭: 35mm배지에 세포를 접종하여 24시간 정치한 후, RNAiMAX로 50nM siRNA단편을 형질 감염시키고, 스크램블된 RNA를 대조군으로 하며, 12시간 후 새로운 배지로 교체하였다. 이후 24시간 동안 저산소 처리하여 상응하는 단백질의 발현량을 검출한다
결과:
도 5A에 도시한 바와 같이, 저산소에 의해 유도되는 미세아교세포의 활성화 과정에서, PKM2단백질은 일시적으로 상승 발현되는 추세가 나타난다. 그러나 PKM2간섭 단편을 사용하여 PKM2의 발현을 간섭한 후, 저산소로 인한 미세아교세포의 활성화와 관련된 형태학적 변화를 효과적으로 억제할 수 없다(도 5B와 5C에 도시).
3) 헥소키나제2억제제 로니다민은 저산소에 의해 유도되는 미세아교세포의 활성화 과정을 효과적으로 억제할 수 있다.
재료: 생쥐BV2미세아교세포주, 1차 배양 생쥐 미세아교세포，고당 DMEM배지(Gibco, 11965-118), 소태아혈청(Gibco, 10099-141), 로니다민(Selleck, S2610), 도립 현미경(Nikon ECLIPSE Ti Microscope), 레이저 공초점 현미경(Nikon A1 Spectral Confocal Microscope), 저산소 챔버(Coy LABORATORY PRODUCTS). 면역 형광에 사용되는 항체 정보: CD 11b항체(Novus biologicals, NB 110-89474); α-Tubulin 항체(Bioworld, AP0064).
방법:
a) 세포의 배양: 생쥐의 미세아교세포주BV2는 10%FBS를 함유하는 고당 DMEM배지에서 성장시키며, 5% CO2, 37℃의 항온밀폐식인큐베이터(상대습도 95%) 내에 넣어 계대배양하고, 도립 현미경하에서 성장 상황을 관찰한다. 약 2-3일에 1회 계대하여, 대수성장기 세포를 취하여 정식 실험에 이용한다.
1차 배양 미세아교세포: 출생 후 0-2일의 C57BL/6J 갓난 생쥐에서 세포를 분리한다. 구체적으로, 대뇌피층을 적출하여, 뇌막 및 혈관을 제거하며; 조직 가위로 조직 덩어리를 잘게 자르고, 0.125%의 트립신으로 37℃에서 15분 동안 소화시킨다. 10%FBS를 함유하는 DMEM에서 소화를 종료하고, 분리된 단일 세포를 패트리 접시에 접종한다. 혼합 대상의 배양 세포가 융합될 때까지 성장하면, 패트리 접시를 가볍게 흔들어 떠있는 미세아교세포를 분리한다. 세포의 순도는 미세아교세포 특이적 분자마커CD11b를 사용하여 판단한다.
b) 면역형광법으로 CD11b 발현 검출: 레이저 공초점 전용 배양판에 BV2세포 및 1차 배양 미세아교세포를 접종하고, 24시간 동안 저산소 처리한 후 실온에서 4% 파라포름알데히드로 20분 동안 고정시키며, 이후 PBST를 사용하여 5분씩 3번 세척한다. 세척 완료 후, DAKO항체희석액에 의해 희석된 CD11b항체를 첨가하여 4℃에서 밤새 부화시킨다. 다음날 대응되는 형광표지된 2차 항체를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 부화시킨다. 부화 종료 후, DAPI작동 용액을 첨가하여 세포핵 염색을 10분 동안 진행한다. 처리 완료 후, PBST로 3번 세척하고, 레이저 공초점 현미경으로 이미지화한다.
결과:
도 6A와 6B에 도시한 바와 같이, BV2세포 및 1차 미세아교세포에서, 24시간 동안 저산소 처리한 후, CD11b의 단백질 발현이 뚜렷하게 상향 조절되며, 동시에 뚜렷한 활성화 형태도 관찰될 수 있다. 그러나, 헥소키나제2 억제제 로니다민이 존재할 경우, CD 11b의 상향 조절된 발현은 현저히 억제되며, DMSO의 용매가 첨가된 대조군은 CD 11b의 발현에 영향을 주지 않는다. 로니다민 사용량은 50 μM이며, DMSO는 그 용매이다.
실시예4 헥소키나제2의 상향 조절된 발현은 히스톤 아세틸화의 증가 및 전염증성 사이토카인
Il1b
의 전사발현을 초래한다.
재료: 생쥐BV2미세아교세포주, 1차 배양 생쥐 미세아교세포, 고당 DMEM배지(Gibco, 11965-118), 소태아혈청(Gibco, 10099-141), 로니다민(Selleck, S2610), 3-브로모피루브산(Sigma, 16490), RNA추출 시약TRIzol(Thermo Fisher Scientific, 15596-018), RNA정량 키트(Thermo Fisher Scientific, Q10211), SuperReal qPCR PreMix(SYBR Green)(Tiangen, FP202-01), 실시간 PCR 시스템(Applied Biosystems), 크로마틴 면역침전키트(Millipore, 17-245), 저산소 챔버(Coy LABORATORY PRODUCTS), 도립 현미경(Nikon ECLIPSE Ti Microscope). 웨스턴 블롯에 사용되는 항체 정보: acetyl-Histone H3 항체(Millipore,06-599); acetyl-Histone H4항체(Millipore,06-866); α-Tubulin 항체(Bioworld, AP0064).
방법:
a) 세포의 배양: 생쥐의 미세아교세포주BV2는 10%FBS를 함유하는 고당 DMEM배지에서 성장시키며, 5% CO2, 37℃의 항온밀폐식인큐베이터(상대습도 95%) 내에 넣어 계대배양하고, 도립 현미경하에서 성장 상황을 관찰한다. 약 2-3일에 1회 계대하여, 대수성장기 세포를 취하여 정식 실험에 이용한다.
1차 배양 미세아교세포: 출생 후 0-2일의 C57BL/6J 갓난 생쥐에서 세포를 분리한다. 구체적으로, 대뇌피층을 적출하여, 뇌막 및 혈관을 제거하며; 조직 가위로 조직 덩어리를 잘게 자르고, 0.125%의 트립신으로 37℃에서 15분 동안 소화시킨다. 10%FBS를 함유하는 DMEM에서 소화를 종료하고, 분리된 단일 세포를 패트리 접시에 접종한다. 혼합 대상의 배양 세포가 융합될 때까지 성장하면, 패트리 접시를 가볍게 흔들어 떠있는 미세아교세포를 분리한다. 세포의 순도는 미세아교세포 특이적 분자마커CD11b를 사용하여 판단한다.
b) 세포단백질의 추출 및 아세틸화 히스톤의 발현 검출: 35mm 배지에 BV2세포 및 1차 배양 미세아교세포를 접종하여 24시간 정치 후, 상응한 시간 동안 저산소 처리한다. 이후 세포 총 단백질을 추출하여 아세틸화 히스톤의 단백질 발현을 검출한다.
C) 대사물질의 검출: 600mm패트리 접시에 BV2세포를 접종하고 24시간 정치한 후, 정상 산소 또는 저산소로 6시간 동한 배양한다. 미리 냉각한 PBS로 세포를 3회 세척한 후, 1.5ml의 냉동된 80%의 메탄올을 첨가하고, -80℃의 냉장고에서 30분 동안 부화시킨다. 세포를 수집하여, 4℃에서 14,000g를 15분 동안 원심분리시킨다. 상층 메탄올/수상을 새로운 원심분리관으로 옮겨 -80℃의 냉장고에서 다시 30분 동안 부화시킨다. 원심 분리하여 상청액을 새로운 원심분리관에 수집하고, 질소 분위기에서 샘플을 바람에 건조시킨다. 샘플은 액체 크로마토 그래피-질량분석을 진행하기 전에 -80℃에서 보존한다.
d) 크로마틴 면역 침전 실험은 아세틸화 히스톤H3 및 아세틸화 히스톤H4 와 Il1b유전자 프로모터 영역의 결합을 검출한다: 100mm패트리 접시에 BV2세포를 접종하고 24시간 정치한 후, DMSO 또는 로니다민으로 1시간 예비 처리한 후 6시간 동안 저산소 처리한다. 저산소 처리 완료 후, 세포 배지에 포름알데히드 용액(Sigma， F8775)을 추가하여 최종 농도를 1%로 하고, 10분 동안 가교한다. 세포를 수집하여, 초음파 파쇄기로 DNA가 100-1000bp로 단절되게 파쇄한다. 샘플을 희석시키고, 10%를 취하여 input로 한다. 나머지 샘플에 아세틸화 히스톤H3 또는 아세틸화 히스톤 H4 항체를 추가하여 4℃에서 밤새 부화시킨다. 동시에, 정상 토끼에서 추출한 동등한 양의 IgG를 음성대조군으로 한다. 다음날, 단백질G-아가로스를 2시간 동안 첨가하였다. 이후 세척액으로 샘플을 세척하고, 0.2M NaCl용액에서 65℃로 4시간 부화시켜 가교 결합을 해제하였다. 페놀-클로로포름법에 의해 DNA를 추출한 후 후속 정량PCR 반응시켜 Il1b의 결합량을 검출한다. Il1b프로모터 영역의 프라이머 서열은 아래와 같다:
포워드: 5'-AGGTCAAAGGTTTGGAAGCAG-3';
리버스: 5'-ATGGAAGTCTGTCTGCTCAGTATTG-3'.
결과:
도 7A에 도시한 바와 같이, 정상대조군과 비교하면, 6시간 동안 저산소 처리한 군의 해당경로, 트리카트복실산 순환경로 및 펜토스 포스페이트 경로 대사물은 모두 정도는 다르지만 변화되었고, 그 중 저산소로 인해 아세틸-CoA의 축적이 가장 뚜렷하였다. 동시에 이러한 변화는 헥소키나제2의 억제제 로니다민(사용량: 50 μM) 및 3-브로모피루브산(사용량: 10 μM)에 의해 억제된다(도 7B에 도시한 바와 같다). 그밖에, 도 7C에 도시한 바와 같이, 저산소 시간이 연장됨에 따라 BV2 및 1차 미세아교세포 중의 아세틸화 히스톤H3와 아세틸화 회스톤H4도 일시적으로 상향 조절된 발현 또는 지속적으로 상향 조절된 발현을 나타내는 추세이다.
BV2세포에서, 6시간 동안 저산소로 인한 아세틸화 히스톤의 상향 조절된 발현도 핵소키나제2의 억제제에 의해 역전될 수 있으며, 도 7D에 도시된 바와 같다. 추가적으로 전염증성 사이토카인의 mRNA발현 수준을 검출하며, 도 7E에 도시한 바와 같이, 실시간 PCR 결과에 의하면 저산소는 Tnfa，Il1b 및 Il6의 mRNA 상향 조절된 발현을 유도하나, Il1b만 로니다민(사용량: 50 μM) 및 3-브로모피루브산(사용량: 10 μM)에 의해 뚜렷하게 억제될 수 있다. 크로마틴 면역침전 결과는 저산소 후 아세틸화 히스톤과 Il1b의 프로모터의 결합을 증가시킬 수 있으며, 로니다민으로 전처리하면 양자의 결합이 현저하게 억지됨을 보여준다(도 7F에 도시한 바와 같다).
실시예5 헥소키네자2의 억제는 미세아교세포가 매개하는 신경 염증을 억제함으로써 중뇌동맥폐색으로 인한 뇌손상으로부터 생쥐를 효과적으로 보호한다.
(1) 로니다민은 중뇌동맥폐색으로 인한 뇌손상으로부터 생쥐를 효과적으로 보호한다.
재료: 로니다민(Selleck, S2610), 건강한 수컷SPF급 Spague-Dawley(SD) 생쥐, 2,3,5-트리페닐테트라졸륨클로라이드(2,3,5-TriphenylTetrazolium Chloride, TTC)(분석 순도), 염소수화물(분석 순도)(Tianjin Kemiou Chermical Reagent Co.Ltd에서 구입), MCAo나일론사.
방법:
a) 우측내경동맥을 나일론사로 폐쇄하는 방법으로 대뇌중동맥폐색(Middle Cerebral Artery Occlusion, MCAO)모델을 제조한다. SD 생쥐는 수술 전 12시간 단식시키고, 물은 마음대로 마시게 한다. 10%의 염소수화물을 복강에 주사하여 마취시키고, 앙와위 자세로 37℃의 항온수술대에 고정시키며, 원활한 호흡을 유지시킨다. 목의 정중앙을 절개하여, 악하선을 둔성 분리하고, 현미경하에서 우측총경동맥을 분리하여, 미세혈관집개로 집어놓는다. 우측외경동맥을 분리하여, 그 원단(遠端)을 결찰하고, 우측총경동맥 분기점에서 상기 외경동맥의 결찰선 사이에 느슨한 매듭을 만들고, 우측내경동맥을 분리하여 미세혈관집개로 집어놓는다. 미세안과수술용 가위로 두 결찰선 사이에 작은 개구를 절개하여, 나일론사를 아래를 향해 총경동맥까지 삽입하고, 느슨한 매듭을 꼭 묶으며, 외경동맥의 원단 결찰 부분의 하측, 나일론사가 삽입된 상측에서 우측외경동맥을 절단하고, 내경동맥의 미세혈관집게를 제거하며, 나일론사의 삽입단이 우측총경동맥 분기점에 위치하게 한다. 외경동맥을 바깥 아래쪽으로 당겨, 내경동맥과 동일한 직선에 위치하게 한다. 나일론사를 내경동맥 방향으로 저항이 느껴질 때까지 삽입하며, 출혈을 방지하기 위해 나일론사를 꼭 묶는다. 미세혈관집게를 제거하고 절개된 개구를 봉합한다. 수술 2시간 후, 로니다민 또는 대응되는 용매 제어(solvent control)를 10mg/kg으로 투여한 후 실을 빼내고 24시간 관류 후에 뇌경색 부피를 측정하였다.
b) 관련 문서에 소개된 방법에 따라 뇌경색 부피를 측정하며, 구체적으로 생쥐를 단두 치사시켜 신속하게 생쥐의 뇌를 적출하고, 10분 동안 차가운 식염수에 넣고, 관상면을 취하여 2mm두께의 뇌절편으로 균일하게 자르고, 신속하게 1%의 TTC용액에 넣어 37℃에서 30분간 염색한 후, 4%파라포름알데히드 완충액으로 고정시킨다. 24시간 후 디지털 카메라로 사진을 찍어, 컴퓨터에 입력하고, 이미지처리 소프트웨어(ADOBE PHOTOSHOP CS6)로 각 뇌절편의 경색 면적(핑크색 부분은 정상 뇌조직이며, 흰색 부분은 경색 부분임)을 계산한 후 적분하여 경색 용적으로 전환시킨다. 경색 용적 백분비=각 뇌절편의 경색 영역 부피의 합/각 뇌절편의 전체 뇌조직 부피의 합*100%.
결과:
도 8A에 도시한 바와 같이, TTC염색 후 관찰한 결과, 2시간 동안 뇌허혈 후 다시 24시간 후 관류 후 모델군의 생쥐 뇌조직과 용매대조군의 뇌조직은 모두 뚜렷한 경색 영역을 나타내었고, 반면 약물처리군의 상응하는 뇌 영역의 경색 정도는 뚜렷하게 감소되었다. 뇌 경색 부피를 계산하여 통계학적 분석을 한 결과, 용매대조군과 비교하면, 10 mg/kg의 로니다민은 생쥐의 중뇌동맥폐색으로 인한 허혈성 뇌손상에 대해 현저한 보호 작용이 있다(도 8B에 도시한 바와 같다).
(2) 체내 유전자 녹다운 헥소키나제2는 중뇌동맥폐색으로 인한 뇌손상으로부터 생쥐를 효과적으로 보호한다.
재료: 로니다민(Selleck, S2610), 건강한 수컷SPF급 Spague-Dawley(SD)생쥐, 2,3,5-트리페닐테트라졸륨클로라이드(2,3,5-TriphenylTetrazolium Chloride, TTC)(분석 순도), 염소수화물(분석 순도)(Tianjin Kemiou Chermical Reagent Co.Ltd에서 구입), MCAo나일론사, shHK2단편을 가진 재조합 아데노 관련 바이러스 혈청형9(rAAV-shHK2), 스크램블된 대조군 단편을 가진 재조합 아데노 관련 바이러스 혈청형9(rAAV-shNC), 면역 조직 화학 키트(Abcam, ab80436), 뇌정위고정장치, 도립 현미경(Nikon ECLIPSE Ti Microscope), 레이저 공초점 현미경 (Nikon A1 Spectral Confocal Microscope).
방법:
a) 우측내경동맥을 나일론사로 폐쇄하는 방법으로 대뇌중동맥폐색(Middle Cerebral Artery Occlusion, MCAO)모델을 제조한다. SD 생쥐는 수술 전 12시간 단식시키고, 물은 마음대로 마시게 한다. 10%의 염소수화물을 복강에 주사하여 마취시키고, 앙와위 자세로 37℃의 항온수술대에 고정시키며, 원활한 호흡을 유지시킨다. 목의 정중앙을 절개하여, 악하선을 둔성 분리하고, 현미경하에서 우측총경동맥을 분리하여, 미세혈관집개로 집어놓는다. 우측외경동맥을 분리하여, 그 원단(遠端)을 결찰하고, 우측총경동맥 분기점에서 상기 외경동맥의 결찰선 사이에 느슨한 매듭을 만들고, 우측내경동맥을 분리하여 미세혈관집개로 집어놓는다. 미세안과수술용 가위로 두 결찰선 사이에 작은 개구를 절개하여, 나일론사를 아래를 향해 총경동맥까지 삽입하고, 느슨한 매듭을 꼭 묶으며, 외경동맥의 원단 결찰 부분의 하측, 나일론사가 삽입된 상측에서 우측외경동맥을 절단하고, 내경동맥의 미세혈관집게를 제거하며, 나일론사의 삽입단이 우측총경동맥 분기점에 위치하게 한다. 외경동맥을 바깥 아래쪽으로 당겨, 내경동맥과 동일한 직선에 위치하게 한다. 나일론사를 내경동맥 방향으로 저항이 느껴질 때까지 삽입하며, 출혈을 방지하기 위해 나일론사를 꼭 묶는다. 미세혈관집게를 제거하고 절개된 개구를 봉합한다.
b) 관련 문서에 소개된 방법에 따라 뇌경색 부피를 측정하며, 구체적으로 생쥐를 단두 치사시켜 신속하게 생쥐의 뇌를 적출하고, 10분 동안 차가운 식염수에 넣고, 관상면을 취하여 2mm두께의 뇌절편으로 균일하게 자르고, 신속하게 1%의 TTC용액에 넣어 37℃에서 30분간 염색한 후, 4%파라포름알데히드 완충액으로 고정시킨다. 24시간 후 디지털 카메라로 사진을 찍어, 컴퓨터에 입력하고, 이미지처리 소프트웨어(ADOBE PHOTOSHOP CS6)로 각 뇌절편의 경색 면적(핑크색 부분은 정상 뇌조직이며, 흰색 부분은 경색 부분임)을 계산한 후 적분하여 경색 용적으로 전환시킨다. 경색 용적 백분비=각 뇌절편의 경색 영역 부피의 합/각 뇌절편의 전체 뇌조직 부피의 합*100%.
c) 뇌선조체에 rAAV9바이러스를 주사한다: 293T세포에서 바이러스 포장을 진행하고, qPCR는 적도를 3.2 × 1012-3.5 × 1012 V.G./ml로 측정했다. 사용되는 HK2에 대한 간섭 서열은, 5′GCGCAACATTCTCATCGATTT-3′; 5′GAATGTTGCGC-3′; 스크램블된 대조군 shRNA서열은 TTCTCCGAACGTGTCACGT이다. 뇌정위고정장치를 사용하여 상기 바이러스를 각각 대뇌 선조체 영역에 주입하고, 구체적 좌표는 브레그마 전방 1.0mm, 중간선 우측 3.0mm, 경막 아래 4.5mm이다. 주사한 바이러스 부피는 2 μL이며, 주사 속도는 분당0.2 μL이다. 주사 완료 후, 미량의 주사제를 주사 부위에 5분간 머무르게 한 후 뽑는다.
d) 조직 면역 형광법으로 뇌 내에서의 바이러스의 분포(eGFP), 헥소키나제2 및 Iba-1(미세아교세포가 활성화된 다른 분자마저)의 발현을 검출한다: 생쥐 뇌허혈 2시간 후 24시간 관류하고, 마취시켜 온전한 뇌조직을 적출하며, 파라핀으로 매립하여 절편하고, 뇌절편의 두께는 대략 4 ㎛이다. 뇌절편은 파라핀 제거, 재수화 및 항원 복원을 거친 후 상기 항체를 부화시키며, 4℃에서 밤을 샌다. 다음날, 형광표지된 2차 항체를 첨가하여, 37℃에서 1시간 동안 부화시킨다. 부화 종료 후, DAPI 작동 용액을 첨가하여 세포핵을 10분동안 염색시킨다. 처리 완료 후, PBST로 3번 세척하고 레이저 공초점 현미경으로 이미지화한다.
e) IL-1β발현의 면역 조직 화학적 검출: 생쥐 뇌허혈 2시간 후 24시간 관류하고, 마취시켜 온전한 뇌조직을 적출하며, 파라핀으로 매립하여 절편하고, 뇌절편의 두께는 대략 4 ㎛이다. 뇌절편은 파라핀 제거, 재수화 및 항원 복원을 거친 후 상기 항체를 부화시키며, 4℃에서 밤을 샌다. 다음날, 샘플은 PBS세척 후 HRP 연결된 2차 항체를 첨가하여, 실온에서 15분 동안 부화시킨 후, DAD 현상액을 추가하고 1분간 부화시킨다. 마지막으로, 헤마톡실린으로 세포핵을 염색한 후, 니콘 현미경으로 이미지화한다.
결과:
rAAV9-shHK2 및 rAAV9-shNC을 주사한지 20일 후, 두 그룹의 동물 체중을 재고, 통계 분석 결과 현저한 차이가 없었다(두 그룹의 동물 체중은 각각 273.2 ± 6.9 g, 269.3 ± 5.0 g이다). 수술 전 각 그룹에서 3마리를 선택하여 온전한 뇌조직을 적출한 후 eGFP의 발현에 따라 뇌 내에서의 바이러스 분포를 검출하였으며, 도 9A의 이미징 결과, 바이러스는 대뇌 내에서 양호한 조직 분포를 나타내었다. 수술 후 절편은 염색하여 나타냈으며, 정상 대조군과 비교하면, 수술한 경색 측의 헥소키나제2는 상향 조절된 발현이 뚜렷하였다. 바이러스가 확산됨에 따라, rAAV9-shHK2군의 헥소키나제2의 발현은 뚜렷하게 억제되었으며, rAAV9-shNC를 주사한 후 헥소키나제2의 발현에 현저한 영향을 미치지 않았다(도 9B에 도시한 바와 같다). TTC염색 결과(도 9C와 9D에 도시한 바와 같음), rAAV9-shNC군의 생쥐와 비교하면, rAAV9-shHK2군의 생쥐의 뇌경색 면적은 현저하게 감소되었다. 동시에 도 9E에 도시한 바와 같이, 선조체 영역의 Iba-1염색은 rAAV9-shNC군의 생쥐의 뇌경색 반구에 나타나고, 미세아교세포 돌기가 수축되면서, 활성화된 형태를 나타내며, ShHK2군은 미세아교세포가 정상 형태를 나타내고, Iba-1의 발현도 현저하게 감소한다. 도 9F에 도시한 바와 같이, 피층 및 선조체 영역의 Il-1β에 대해 면역조직 화학 염색한 결과, 체내 헥소키나제2의 녹다운에 의해 매개되는 신경보호작용은 Il-1β의 발현 감소와 관련된다. 대조군에서, Il-1β는 피층 및 선포체 영역에 분포되며, rAAV9-shHK2군에서 Il-1β의 발현은 현저하게 억제되었다.
Claims (10)
- 헥소키나제2 특이적 억제제 및 약제학적으로 허용되는 담체
를 포함하는, 급성 중추 신경계 손상 질병의 예방 또는 치료용 약제로서,
상기 급성 중추 신경계 손상 질병은 미세아교세포(microglia)의 활성화에 의해 매개되고,
상기 헥소키나제2 특이적 억제제는 로니다민, 또는 헥소니카제2의 mRNA를 간섭하는 siRNA 또는 shRNA인, 약제. - 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 siRNA 또는 shRNA는 벡터 내에 존재하는, 약제. - 제1항에 있어서, 상기 헥소키나제2 특이적 억제제는 로니다민인, 약제.
- 제1항에 있어서, 상기 급성 중추 신경계 손상 질병은 급성 척추 손상, 뇌외상, 막망 손상, 저산소성 뇌손상, 급성 허혈성 뇌손상, 허혈성 뇌졸중, 저산소성 뇌졸중, 신생아 저산소성 허혈성 뇌병증, 중독성 뇌병증, 급성 뇌경색, 열공성 뇌경색, 일과성 허혈성 발작, 중증 뇌손상, 뇌척수 수술, 및 뇌 또는 척수 방사선 치료로 이루어진 군에 선택되는 것에 의해 야기되는 뇌 또는 척수 신경 손상인, 약제.
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 약제는 2-데옥시글루코스, 브로모피루브산, 글루코스 6-포스페이트, 이마티닙, 5-티오-글루코스 및 메틸 자스모네이트로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 더 포함하는, 약제.
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