BR112019017661A2 - Uso de um inibidor específico à hexoquinase 2, e uso de uma composição - Google Patents
Uso de um inibidor específico à hexoquinase 2, e uso de uma composição Download PDFInfo
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Abstract
são providas aplicações de um inibidor específico à hexoquinase 2 na preparação de um medicamento para prevenir e tratar lesão aguda do sistema nervoso central.
Description
USO DE UM INIBIDOR ESPECÍFICO À HEXOQUINASE 2, E USO DE UMA COMPOSIÇÃO
CAMPO DA INVENÇÃO [001] A presente revelação é no campo de biomedicina e se refere aos usos de inibidores específicos à hexoquinase 2 na profilaxia e tratamento de doenças de lesão aguda do sistema nervoso central (SNC).
HISTÓRICO DA INVENÇÃO [002] Acidente vascular cerebral, isquêmico ou hemorrágico, é uma doença cerebrovascular aguda com dano cerebral causado pelo rompimento de vasos sanguíneos no cérebro ou fornecimento de sangue reduzido devido à oclusão vascular. O acidente vascular cerebral isquêmica soma cerca de 85% dos casos totais. O ativador do plasminogênio tecidual (t-PA) é uma droga aprovada pela FDA para acidente vascular cerebral isquêmico. Entretanto, t-PA é somente adequado para 3 a 6 horas após o acidente vascular cerebral, e há também um risco de hemorragia cerebral e edema cerebral após o tratamento. Estes defeitos tornam a aplicação de t-PA muito limitada e pouquíssimos pacientes se beneficiam. Portanto, são altamente previstas drogas seguras e eficazes que possam ser utilizadas para a profilaxia e tratamento de acidente vascular cerebral isquêmico agudo.
[003] A resposta inflamatória mediada pelo sistema imunológico após o acidente vascular cerebral isquêmico agudo é um alvo terapêutico amplamente estudado. Entretanto, os resultados de estudos clínicos de droga que utilizam esse mecanismo como alvos terapêuticos não são satisfatórios. Por exemplo, Fingolimode e Natalizumabe, ambos são agentes que se direcionam à resposta inflamatória do
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2/34 sistema imunológico periférico, são eficazes em inibir a penetração de linfócitos no parênquima cerebral, mas estudos clínicos apresentaram que pacientes de acidente vascular cerebral não se beneficiam desse tratamento. Portanto, espera-se que a exploração profunda da resposta inflamatória do sistema nervoso central mediada por micróglia após isquemia forneça novos alvos terapêuticos e estratégias para a profilaxia e tratamento de acidente vascular cerebral isquêmico agudo.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO [004] Os inventores da presente selecionaram uma série de genes de via glicolítica, e identificaram que a sobrerregulação seletiva de hexoquinase 2 mediou o processo de ativação de micróglia induzida por hipoxia. Os inventores confirmaram que uma variedade de substâncias biologicamente ativas, que têm uma atividade seletivamente inibidora na hexoquinase 2, podem inibir a ativação de micróglia induzida por hipoxia. Ademais, os inventores também descobriram que as interferências de hexoquinase 1 e 3 não podem inibir a ativação de micróglia induzida por hipoxia.
[005] Assim, um aspecto da invenção provê o uso de um inibidor específico à hexoquinase 2 na preparação de um medicamento para a profilaxia e tratamento de uma lesão aguda do sistema nervoso central.
[006] Em outro aspecto, a invenção provê uso de uma composição farmacêutica compreendendo um inibidor específico à hexoquinase 2 na preparação de um medicamento para profilaxia e tratamento de uma lesão aguda do sistema nervoso central.
[007] Em um aspecto adicional, a invenção provê
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3/34 um método para profilaxia e tratamento de uma doença de lesão aguda do sistema nervoso central compreendendo a administração a um indivíduo, que precisa, de uma quantidade profilática ou terapeuticamente eficaz de um inibidor específico à hexoquinase 2 ou uma composição farmacêutica compreendendo um inibidor específico à hexoquinase 2.
[008] Os inventores da presente descobriram o efeito neuroprotetor de um inibidor específico à hexoquinase 2 na profilaxia e tratamento de lesão aguda do sistema nervoso central. Experimentos citológicos em animais e ín vivo indicaram que a expressão seletivamente sobrerregulada da ativação regulada de hexoquinase 2 de micróglia induzida por hipoxia e respostas neuroinflamatórias mediadas por micróglia após isquemia, enquanto tanto os inibidores seletivos à hexoquinase 2 e silenciamento de gene inibiram significativamente as respostas inflamatórias mediadas por micróglia e, com isso, exerceram efeito neuroprotetor.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [009] Figura 1. Fluxo glicolítico intensificado é essencial para a ativação microglial induzida por hipoxia. (A) Imagens representativas de micróglia BV-2 sujeita à exposição hipóxica para os momentos indicados. Barra de escalas, 100 pm (n = 4) . (B) Quantificação das porcentagens de células de micróglia com alterações morfológicas apresentada em (A) (n = 4). (C) A ativação microglial induzida por hipoxia foi verificada pela sobrerregulação do marcador molecular CD 11b. Barra de escalas, 25 pm (n = 3) .
(D) Citocinas pró-inflamatórias foram notavelmente induzidas por hipoxia em células BV-2 de maneira dependente do tempo (n = 3) . (E-F) A hipoxia não teve efeito na viabilidade de
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4/34 células BV-2. Análise por citometria de fluxo não apresentando aumentos significativos nos números de células por Anexina V+ ou PI+ após a exposição a 1% de oxigênio por 24 horas (n = 3) . (G) Imagens representativas de testes de captação de 2-[N-(7-nitrobenz-2-oxa-l,3-diazol-4-il) amino]2-desoxi-D-glicose (2-NBDG) em célula incubadas com 2-NBDG expostas à normóxia ou hipoxia por 1 hora. Barra de escalas, 100 pm. (Η) A intensidade de fluorescência média em (G) foi quantificada utilizando um leitor de multiplacas com múltiplas detecções (n = 4). (I) Gráficos ilustrando os metabólitos principais na via glicolitica; os metabólitos significativamente intensificados foram marcados após a exposição a hipoxia por 6 horas (n = 4) . (J-L) 2-DG, um inibidor da via glicolitica, significativamente bloqueou a ativação de micróglia durante hipoxia. (J) Imagens de contraste de fase de células BV-2 sujeitas a 1% de oxigênio com ou sem 2-DG. (K) Porcentagem reduzida de células ativadas após o tratamento com 2-DG em (J). Barra de escalas, 50 pm (n = 4) . (L) A produção de citocinas pró-inflamatórias foi significativamente prejudicada por 2-DG sob condições de hipoxia. *<0,05; **<0,01; ***<0,001.
[010] Figura 2. A expressão sobrerregulada de membros da família hexoquinase foi envolvida no processo de ativação de micróglia induzida por hipoxia. (A) Testes dos níveis de mRNA de enzimas por qRT-PCR. Gráficos apresentando um aumento geral nos níveis de mRNA desses genes sob hipoxia por 6 h (n = 3) . (B-C) Níveis de proteína HK1, HK2, e HK3 em BV-2 e células de micróglia primária (pMG) sujeitas à hipoxia para os momentos indicados (n = 4).
[011] Figura 3. A interferência de hexoquinase
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5/34 inibiu de maneira eficaz a micróglia ativada por hipoxia. (A) 0 silenciamento de HK2 especifico foi suficiente para bloquear o fenótipo ativado de micróglia BV-2 (n = 3) . Os níveis de proteína indicados foram testados por Western blot após as células BV-2 serem transfectadas com ou sem siRNAs de HK2 por 24 h e estimuladas com hipoxia por outras 24 horas. (Β) A transfecção de diferentes fragmentos de interferência de HK2 em células BV2 reprimiu de maneira eficaz as alterações morfológicas induzidas por hipoxia. (C) A porcentagem reduzida de micróglia com morfologias ativadas em células de silenciamento de HK2 sob hipoxia. (D) 0 silenciamento de HK2 reprimiu notavelmente a expressão de CD 11b.
[012] Figura 4. Nem a interferência de HK1 nem de HK3 puderam reprimir a ativação induzida por hipoxia de micróglia. As alterações morfológicas de micróglia relacionadas à ativação induzida por hipoxia (B e D, n=3) não puderam ser efetivamente reprimidas por fragmentos de interferência de HK1 e HK3, respectivamente (A e C).
[013] Figura 5. A interferência de PKM2 não pôde inibir a ativação induzida por hipoxia de micróglia. (A) Análise e imunoblot da expressão de proteína PKM2 em células BV-2 estimuladas por hipoxia. (Β) O silenciamento de PKM2 não afetou a sobrerregulação induzida por hipoxia de CD 11b. (C) Imagens representativas que apresentam que o silenciamento de PKM2 não pôde reprimir as alterações morfológicas induzidas por hipoxia. Barra de escalas, 50 pm.
[014] Figura 6. Lonidamina, um inibidor de HK2, puderam inibir efetivamente a ativação induzida por hipoxia de micróglia. (A) Os estados ativados de culturas de pMG e BV
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6/34 foram notavelmente inibidos na presença de lonidamina (50 μΜ) durante hipoxia. Barra de escalas, 50 pm. (B) Gráficos apresentando as porcentagens reduzidas de células de micróglia ativadas, tratadas com lonidamina em (A). (C) Teste de imunofluorescência ilustrando a redução na expressão de CD 11b na presença de lonidamina em células BV 2 e pMG com estímulo de hipoxia. Barra de escalas, 50 pm. *<0,05; **<0,01; ***<0,001.
[015] Figura 7. A indução de HK2 leva ao nível elevado de acetilação de histona e ativação transcricional da citocina pró-inflamatória Il-lb. (A) O perfilamento metabólito da glicólise e ciclo de TCA após células BV-2 foram expostos a uma hipoxia por 6 horas. Os dados são apresentados como alterações de alterações de vezes de hipoxia versus normóxia. As subrreguladas são representadas por quadrados verdes e as sobrerreguladas por quadrados vermelhos (n = 4) . (B) (D) A inibição de HK2 reverteu o acúmulo de acetil-CoA intracelular e inibiu as histonas acetiladas sobrerreguladas em células BV-2 (n = 4) . (C) Os níveis de expressão de acetilação de histona após exposição de hipoxia em BV 2 e células de micróglia primária (pMG) (n = 3) . (E) A sobrerregulação induzida por hipoxia de Illb no nível de mRNA pôde ser significativamente reduzido por inibição de HK2 (n = 3) . (F) Pré-tratamento de lonidamina diminuiu a associação de AcH3 e AcH4 com o promotor de Illb. A abundância de promotor de Illb com AcH3 ou AcH4 em cada grupo de tratamento foi relativa às amostras de entrada correspondentes com o mesmo iniciador (n = 3). *<0,05;
**<0,01; ***<0,001.
[016] Figura 8. Lonidamina protegeu, de maneira
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7/34 eficaz, ratos de dano cerebral causado por oclusão de artéria cerebral média (MCAo). (A) Imagens representativas de seções cerebrais pigmentadas por cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio (TTC)em cada grupo de tratamento. (B) A quantificação de tamanho de infarto em cada grupo apresentando que a administração de Lonidamina reduziu significativamente o tamanho de infartos causados por MCAo. (n = 6 por grupo) *<0,05; **<0,01; ***<0,001.
[017] Figura 9. O silenciamento de HK2 ín vivo protegeu de maneira eficaz ratos de dano cerebral causado por oclusão de artéria cerebral média (MCAo). (A) A distribuição viral foi monitorada utilizando formação de imagem de todo o cérebro com base em expressão de eGFP, 21 dias após a injeção de vetores de AAV (n = 3) . (B) As seções cerebrais nas estriatas coloridas para HK2 e CD 11b, apresentando que CD 11b foi positivamente correlacionada com a expressão de HK2 em micróglia (n = 6/grupo) . Barra de escalas, 20 pm. (C) Coloração com TTC apresentando tamanho de infarto reduzido no grupo tratado com AAVshHK2 após cirurgia de MCAo (n = 6/grupo). (D) A quantificação do tamanho de infarto em (c) (n = 6/grupo). (E) Imunorreatividade por Iba-1 na estriata apresentando que o tratamento com AAV-shHK2 inibiu drasticamente a ativação microglial no hemisfério do infarto. Barra de escalas, 50 pm. (F) Imagens representativas obtidas de cortices e estriata nos hemisférios isquêmicos apresentando produção reduzida de IL-lb após o tratamento com AAV2/9-shHK2 no modelo de MCAo de rato. *<0,05; **<0,01; ***<0,001.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [018] A invenção é, agora, descrita com
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8/34 referência às realizações a seguir que não devem ser construídas como limitantes ao escopo da invenção. Quaisquer alterações equivalentes ou variação feita de acordo com o princípio ou espírito da invenção são contempladas dentro do escopo da invenção.
[019] Em um aspecto, a invenção provê o uso de um inibidor específico à hexoquinase 2 para a fabricação de um medicamento para a profilaxia e tratamento de uma lesão aguda do sistema nervoso central. O inibidor específico à hexoquinase 2, conforme utilizado aqui, refere-se a uma substância capaz de inibir, de maneira específica ou seletiva a atividade biológica de hexoquinase 2 (também mencionada como hexoquinase II ou HK2).
[020] Em algumas realizações, o inibidor específico à hexoquinase 2 compreende um anticorpo à hexoquinase 2 ou um fragmento deste. O anticorpo se refere a uma proteína capaz de se ligar especificamente à hexoquinase 2 e de inibir ou de suprimir a atividade de hexoquinase 2. Um fragmento de anticorpo pode incluir, por exemplo, Fab, Fab' , (Fab')2, e Εν. A produção e purificação de anticorpos ou fragmentos destes são conhecidas na técnica.
[021] Em algumas realizações, um anticorpo de hexoquinase 2 da invenção também pode existir na forma de uma sequência de aminoácidos ou nucleotídeos que codifica o anticorpo ou um vetor de expressão compreendendo a sequência de nucleotídeos ou aminoácidos. Em algumas realizações, o anticorpo de hexoquinase 2 descrito na presente invenção também pode estar presente em um vetor de expressão ou uma célula hospedeira na forma de uma proteína de fusão.
[022] Em algumas realizações, o inibidor
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9/34 especifico à hexoquinase 2 compreende uma substância capaz de inibir especificamente a transformação de mRNA de hexoquinase 2, ou uma substância capaz de degradar especificamente mRNA de hexoquinase 2, como siRNA, shRNA, miRNA ou suas modificações, com isso, interferindo na síntese de hexoquinase 2 pelo mecanismo de RNAi. siRNA, shRNA ou miRNA podem ser obtidos por técnicas de síntese in vitro que são bem conhecidas na técnica. Em algumas realizações, o siRNA, shRNA ou miRNA descrito na presente invenção está presente em um vetor particular, como em uma célula.
[023] Em algumas realizações, a lesão aguda do sistema nervoso central se refere a uma doença ou condição do dano ao sistema nervoso central causado por isquemia ou hipoxia aguda, incluindo, entre outros, dano ao encéfalo/espinhal causado por lesão espinhal aguda, trauma cerebral, dano à retina, lesão cerebral hipóxica, lesão cerebral isquêmica aguda, acidente vascular cerebral isquêmico, acidente vascular cerebral hipóxico, encefalopatia isquêmica hipóxica neonatal, encefalopatia tóxica, infarto cerebral agudo, infarto lacunar, ataque isquêmico transitório lesão crâniocerebral grave, cirurgia cerebroespinhal e radioterapia do encéfalo/espinhal.
[024] Em outro aspecto, a invenção provê uso de uma composição compreendendo um inibidor específico à hexoquinase 2 para a fabricação de um medicamento para a profilaxia e tratamento de uma doença de lesão aguda do sistema nervoso central.
[025] Em algumas realizações, os inibidores específicos à hexoquinase 2 compreendidos na composição são os descritos acima, e a composição pode, ainda, compreender
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10/34 outros inibidores à hexoquinase 2, incluindo, entre outros, 2-desoxiglicose, Lonidamina, ácido bromopirúvico, glicose 6fosfato, Imatinibe, 5-tio-glicose e metiljasmonato.
[026] Um aspecto adicional da invenção provê um método de prevenção e tratamento de uma lesão aguda do sistema nervoso central, o método compreendendo administração a um indivíduo, que precisa, de uma quantidade profilaticamente eficaz ou uma quantidade terapeuticamente eficaz de um inibidor específico à hexoquinase 2 ou uma composição compreendendo um inibidor específico à hexoquinase 2 .
[027] Em algumas realizações, o indivíduo é um indivíduo mamífero, como um humano. A administração é realizada via subcutânea, transdérmica, intramuscular, intravenosa, intra-arterial, sublingual, bucal, gastrointestinal ou semelhantes a um, por exemplo, indivíduo humano. Em algumas realizações, um inibidor específico à hexoquinase 2 (por exemplo, na forma de ácido nucleico) pode ser administrado a um indivíduo sendo tratado ou prevenido por terapia genética.
[028] Um aspecto adicional da presente invenção provê um método para a prevenção e tratamento de uma lesão aguda do sistema nervoso central, compreendendo a redução ou inativação, de maneira seletiva ou especificamente, da atividade de hexoquinase 2 em um indivíduo que precisa disso. Essa redução ou inativação da atividade de hexoquinase pode ser alcançada, por exemplo, por medidas de concepção genética para reduzir ou eliminar a expressão da proteína hexoquinase 2. Uma medida exemplar é alterar a sequência de nucleotídeo que codifica hexoquinase 2 por mutagênese direcionada a sítio
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Outro meio exemplar é interferir no processo de transformação de mRNA de hexoquinase 2 por tecnologia de RNAi. Qualquer método conhecido aos técnicos no assunto para reduzir a expressão de uma proteína particular em uma célula é contemplado para uso nos métodos da invenção.
EXEMPLOS [029] Os materiais e métodos empregados na presente invenção são materiais e métodos convencionais, a menos que especificado de outra forma.
EXEMPLO 1. FLUXO GLICOLÍTICO INTENSIFICADO É ESSENCIAL PARA A ATIVAÇÃO MICROGLIAL INDUZIDA POR HIPOXIA
Materiais [030] Células de microglia BV2 de camundongos, meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, Gibco, 11965-118), soro bovino fetal (Gibco, 10099-141), 2-desoxi-D-glicose (Sigma-Aldrich, D8375), 2-[N-(7-nitrobenz-2-oxa-l,3-diazol-4il) amino]-2-desoxi-D-glicose (2-NBDG, Thermo Fisher Scientific, N13195), kit de detecção de Anexina/PI (Biotool, B32115), citômetro de fluxo (CytoFLEX S), microscópio confocal de escaneamento a laser (Microscópio Confocal Espectral Nikon Al), câmara anóxica (Coy Laboratory Products).
[031] Anticorpos utilizados em Western blot e imunofluorescência:
[032] anticorpo CD 11b (Novus biologicals, NB 110-89474) ;
| 033] | Anticorpo | ΤΝΕ-α | (CST, | 11498) ; |
| 034] | Anticorpo | IL-Ιβ | (CST, | 12507) ; |
| 035] | Anticorpo | IL-6 | (Bioss, | bs-6309R) ; |
| 036] | Anticorpo | α-Tubulina ( | B i owo r1d, AP 0 0 64)o |
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Métodos [037] a) Cultura celular: células BV2 foram cultivadas em DMEM contendo 10% de soro bovino fetal (FBS), colocadas em CO2 5%, cultivadas em uma incubadora de temperatura constante a 37 °C (umidade relativa foi 95%), e observadas sob microscópio invertido. A passagem foi realizada aproximadamente 2-3 dias, e células de fase de crescimento logaritmico foram utilizadas para experimentos formais. As células no grupo de tratamento hipóxico foram colocadas na câmara anóxica Coy com 1% de O2, 5% de CO2, e 94% de N2; outras condições foram as mesmas que as condições de cultura normal.
[038] b) Teste de extração de proteína e de expressão de proteína citocina pró-inflamatória: Depois de incubadas em placas de cultura de 35 mm e colocadas por 24 horas, as células foram sujeitas a tratamento de hipoxia pelo tempo indicado. A proteína celular total foi, então, extraída para detectar a expressão de proteína de TNF-a, IL-Ιβ e IL-6 de citocinas pró-inflamatórias.
[039] c) expressão de CD 11b detectada por Imunofluorescência: células BV2 foram cultivadas em uma placa de cultura específica para confocal a laser, e tratadas com hipoxia por 24 horas, fixadas em paraformaldeído 4% em temperatura ambiente por 20 minutos e, então, lavadas três vezes com PBST por 5 minutos cada vez. Após a lavagem, o anticorpo CD 11b, diluído com a diluição de anticorpo DAKO, foi adicionado e incubado durante a noite a 4 °C. No dia seguinte, as amostras foram incubadas com o anticorpo secundário marcado de maneira fluorescente indicado a 37 °C por 1 hora. Após a incubação, a solução funcional DAPI foi
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13/34 adicionada para coloração nuclear por 10 minutos. As amostras foram, então, lavadas três vezes com PBST e tiveram a imagem formada utilizando um microscópio confocal a laser.
[040] d) teste de captação de 2-NBDG: células BV2 foram cultivadas em uma placa de cultura de placa de 96 poços (preta nas laterais, transparente no fundo) e o meio celular foi substituído por tampão DPBS contendo 200 μΜ de 2NBDG após 24 horas. As células foram, então, cultivadas em condições normóxicas ou hipóxicas. Após uma hora de incubação o meio foi trocado por DPBS fresco. Por fim, as imagens foram capturadas e a captação de 2-NBDG foi quantificada com um teste de microplaca de fluorescência.
[041] e) coloração de Anexina/PI: As células foram cultivadas em uma placa de cultura de 35 mm e cultivadas por 24 horas e, então, cultivadas em condição hipóxica por 24 horas. As células foram colhidas com tripsina 0,25% e coloridas por corantes Anexina e PI seguindo as instruções fornecidas pelo fabricante. Análise por citometria de fluxo foi realizada após 30 minutos para detectar se a hipoxia causou morte celular.
[042] f) Extração e perfilamento de metabólito: células BV2 foram cultivadas em uma placa de cultura de 60 mm e cultivadas por 24 horas e, então, cultivadas em condições normóxicas ou hipóxicas por 6 horas. Para perfilamento de metabólito, os metabólitos foram extraídos utilizando 1,5 mL de metanol 80% resfriado em gelo. Após incubação a -80 °C por 30 minutos, as células foram extraídas e centrifugadas a 14.000 g por 15 minutos a 4 °C. As fases de metanol/água superiores foram transferidas a novos tubos e incubadas a -80 °C por outros 30 minutos. As fases superiores foram
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14/34 centrifugadas e secas sob gás de nitrogênio e as amostras secas foram armazenadas a -80 °C antes da análise LC-MS.
Resultados [043] Conforme apresentado na Figura IA, o estímulo de hipoxia levou a alterações morfológicas profundas em células BV-2, com corpos celulares ampliados e formação de filopodia ou lamelipodia sendo observada. As alterações morfológicas foram dependentes do tempo e células de microglia com alterações morfológicas aumentaram a cerca de 52% das células totais após 24 horas de exposição à hipoxia (Figura 1B). Também, a expressão intensificada de CD 11b, um marcador molecular de ativação microglial, após 24 horas de exposição à hipoxia foi observada. Além disso, conforme apresentado na Figura 1D, produções de TNF-a, IL-Ιβ e IL-6 de citocinas pró-inflamatórias foram induzidas notavelmente de maneira dependente do tempo. Notavelmente, a exposição a 1% de oxigênio por 24 horas não causou morte celular óbvia (Figuras IE e 1F) . Os resultados acima indicaram que exposição à hipoxia levou a um fenótipo inflamatório ativado de micróglia.
[044] A via de glicólise aeróbica em células BV2 foi significativamente elevada após a exposição à hipoxia Conforme retratado na Figura 1G e 1H, a captação de 2-NBDG foi aumentada em 1,6 vez após 1 hora de exposição hipóxica. O perfilamento metabólico também apresentou uma abundância significativamente elevada de intermediários metabólicos da via glicolítica após 6 horas de exposição hipóxica, incluindo frutose-1, 6-bifosfato, diidroxiacetona fosfato e gliceraldeído 3-fosfato (G-3-P) (Figura II) . Na presença de 500 μΜ de 2-desoxiglicose (2-DG) , um inibidor eficaz de
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15/34 glicólise, a porcentagem de células BV-2 com alterações morfológicas ativadas foi significativamente reduzida (Figuras 1J-L). De maneira coletiva, estes dados demonstram que glicólise intensificada é essencial para ativação microglial após a exposição à hipoxia.
EXEMPLO 2. A SOBRERREGULAÇÃO DE MEMBROS DA FAMÍLIA HEXOQUINASE FOI ENVOLVIDA NA ATIVAÇÃO MICROGLIAL APÓS A EXPOSIÇÃO Ã HIPOXIA
Materiais [045] Linhagem celular de microglia BV2 de camundongo, microglia de camundongo cultivada primária, meio DMEM de glicose alta (Gibco, 11965-118), soro bovino fetal (Gibco, 10099-141), reagente de extração de RNA TRIzol (Thermo Fisher Scientific, 15596-018), kit de quantificação de RNA (Thermo Fisher Scientific, Q10211), PreMix de qPCR SuperReal (SYBR Green) (Tiangen, FP202-01), sistema de PGR em tempo real (Applied Biosystems), câmara anóxica (Coy Laboratory Products) [046] Anticorpos utilizados no teste de Western blot:
| [047] | Anticorpo | de | hexoquinase 1 | (Abeam,150423) |
| [048] | Anticorpo | de | hexoquinase 2 ( | :CST, 2867s), |
| [049] | Anticorpo | de | hexoquinase 3 | (Santa Cruz, |
| sc-28890), | ||||
| [050] | anticorpo | de a-Tubulina | (Bioworld, |
AP0064).
[051] As seguintes sequências de iniciador genético de camundongo foram utilizadas em PGR em tempo real.
| Iniciadores | Direta | Reversa |
| HK1 HK2 | GTAGGGGTACGCTTAGGTGG GAGAAAGCTCAGCATCGTGG | ACCCAGGAGTCCATAAAGCC TCCATTTGTACTCCGTGGCT |
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16/34
HK3
PFKM
PFKL
PGK1
PKM1
PKM2
Actb
GCTCCGTTGAGAGCAGATTT
GTTTGGAAGCCTCTCCTCCTC
CGCAAGGTATGAATGCTGCT
CGAGCCTCACTGTCCAAACT
CGTCCGCAGGTTTGATGAGA
GGCTCCTATCATTGCCGTGA
TGAGCTGCGTTTTACACCCT
TTGCTGCAAGCATTCCAGTT
GACGGCAGCATTCATACCTT CGATGGTCAAGTGTGCGTAG GTCTGCAACTTTAGCGCCTC TTCAAACAGCAGACGGTGGA AAGGTACAGGCACTACACGC TTTGGGGGATGTTTGCTCCA
Métodos [052] a) Cultura celular: células BV2 foram cultivadas em DMEM contendo 10% soro bovino fetal (FBS), colocadas em CO2 5%, cultivadas em uma incubadora de temperatura constante a 37 °C (umidade relativa foi 95%), e observadas sob microscópio invertido. A passagem foi realizada aproximadamente 2-3 dias, e células de fase de crescimento logarítmico foram utilizadas para experimentos formais.
[053] Para o isolamento e cultura de micróglia primária, as células foram isoladas para camundongos C57BL/6J recém-nascidos. Resumidamente, os cortices cerebrais desprovidos de meninges e vasos sanguíneos foram dissociados de camundongos PO-2 e digeridos por 0,125% de tripsina a 37 °C por 15 minutos. A digestão foi encerrada pela adição de DMEM contendo FBS 10% e células únicas isoladas foram cultivadas em placas de cultura. Após a culturas misturadas se tornarem confluentes, microglias foram separadas de outros tipos celulares por agitação leve e purificação foi identificada pelo marcador específico à micróglia CD 11b.
[054] b) Teste de extração de proteína total e de expressão de proteínas da família hexoquinase: As células foram cultivadas em placas de cultura de 35 mm por 24 horas, e estimuladas com hipoxia pelo tempo indicado. A proteína total foi, então, extraída para detectar a expressão de
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17/34 proteínas da família hexoquinase.
Resultados [055] Após 6 horas de hipoxia, uma sobrerregulação geral dos níveis de mRNA destas enzimas foi detectada. Todas as três isoformas de HK testadas apresentaram expressão de mRNA significativamente aumentada (Figura 2A). Resultados adicionais revelaram que a expressão de proteína dessas isoformas também apresentou aumentos transitórios ou sustentados em células de micróglia BV 2 (Figura 2b) e primárias (Figura 2c).
EXEMPLO 3 HEXOQUINASE 2, AO INVÉS DE OUTROS MEMBROS DA FAMÍLIA HEXOQUINASE, MEDIOU ATIVAÇÃO INDUZIDA POR HIPOXIA DE MICRÓGLIA (1) A interferência de Hexoquinase 2 podería inibir efetivamente o processo de ativação induzida por hipoxia de micróglia
Materiais [056] Linhagem celular de micróglia BV2 de camundongo, micróglia de camundongo cultivada primária, meio DMEM de glicose alta (Gibco, 11965-118), soro bovino fetal (Gibco, 10099-141), fragmentos de siRNA, reagente de transfecção de siRNA (Reagente RNAiMAX de Lipofectamina, Thermo Fisher Scientific, 13778-500), microscópio de contraste de fase invertido (Microscópio Ti Nikon ECLIPSE), microscópio confocal a laser (Microscópio Confocal Espectral Nikon Al), câmara anóxica (Coy Laboratory Products).
[057] Anticorpos utilizados no teste de Western blot:
[058] Anticorpo de hexoquinase 1 (Abeam,150423) [059] Anticorpo de hexoquinase 2 (GST, 2867s),
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18/34 [060] Anticorpo de hexoquinase 3 (Santa Cruz, sc-28890), [061] Anticorpo CD 11b (Novus biologicals, NB
110-89474), [062] Anticorpo de α-Tubulina (Bioworld, AP0064).
Métodos [063] a) Cultura celular: células BV2 foram cultivadas em DMEM contendo 10% de soro bovino fetal (FBS), colocadas em CO2 5%, cultivadas em uma incubadora de temperatura constante a 37 °C (umidade relativa foi 95%), e observadas sob microscópio invertido. A passagem foi realizada aproximadamente 2-3 dias, e células de fase de crescimento logaritmico foram utilizadas para experimentos formais.
[064] b) interferência de RNA: As células foram cultivadas em uma placa de cultura de 35 mm por 24 horas. RNAs interferentes pequenos (siRNAs) foram transfectados com Reagente RNAiMAX. RNA com sequência aleatória foi utilizado como um controle. No total, 50 nM de siRNAs foram transf ectados em culturas, e após 12 horas, o meio foi substituído por meio fresco. As células foram, então, estimuladas com hipoxia por 24 horas para detectar o nível de expressão das proteínas indicadas.
Resultados [065] Conforme apresentado nas Figuras 3A-3D, o silenciamento da expressão de HK2 utilizando diferentes fragmentos levou à inibição significativa das morfologias ativadas de micróglia, o que também foi acompanhado pela expressão reduzida de CD 11b. Notavelmente, os siRNAs que
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19/34 focalizam HK2 não tiveram efeito na expressão de HK1 e HK3.
(2) A interferência de Hexoquinase 1 e hexoquinase 3 não pôde inibir a ativação induzida por hipoxia de micróglia
Materiais [066] Linhagem celular de micróglia BV2 de camundongo, meio DMEM de glicose alta (Gibco, 11965-118), soro bovino fetal (Gibco, 10099-141), fragmentos de siRNA, reagente de transfecção de siRNA (Reagente RNAiMAX de Lipofectamina, Thermo Fisher Scientific, 13778-500), microscópio de contraste de fase invertido (Microscópio Ti Nikon ECLIPSE), microscópio confocal a laser (Microscópio Confocal Espectral Nikon Al), câmara anóxica (Coy Laboratory Products).
[067] Anticorpos utilizados no teste de Western blot: Anticorpo de hexoquinase 1 (Abeam,150423), Anticorpo de hexoquinase 2 (CST, 2867s), Anticorpo de hexoquinase 3 (Santa Cruz, sc-2 8 8 90), [068] anticorpo de α-Tubulina (Bioworld, AP0064).
Métodos [069] a) Cultura celular: células BV2 foram cultivadas em DMEM contendo 10% de soro bovino fetal (FBS), colocadas em CO2 5%, cultivadas em uma incubadora de temperatura constante a 37 °C (umidade relativa foi 95%), e observadas sob microscópio invertido. A passagem foi realizada aproximadamente 2-3 dias, e células de fase de crescimento logaritmico foram utilizadas para experimentos formais.
[070] b) interferência de RNA: As células foram
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20/34 inoculadas em uma placa de cultura de 35 mm por 24 horas. RNAs interferentes pequenos (siRNAs) foram transfectados com Reagente RNAiMAX. RNA com sequência aleatória foi utilizado como um controle. No total, 50 nM de siRNAs foram transf ectados em culturas, e após 12 horas, o meio foi substituído por meio fresco. As células foram, então, estimuladas com hipoxia por 24 horas para detectar o nível de expressão das proteínas indicadas.
Resultados [071] Conforme apresentado nas Figuras 4A-4D, o silenciamento nem de HK1 nem de HK3 foi capaz de bloquear a ativação microglial.
(3) A interferência do subtipo Piruvato quinase M2 (PKM2) não pôde inibir a ativação induzida por hipoxia de micróglia
Materiais [072] Linhagem celular de micróglia BV2 de camundongo, meio DMEM de glicose alta (Gibco, 11965-118), soro bovino fetal (Gibco, 10099-141), fragmentos de siRNA, reagente de transfecção de siRNA (Reagente RNAiMAX de Lipofectamina, Thermo Fisher Scientific, 13778-500), microscópio de contraste de fase invertido (Microscópio Ti Nikon ECLIPSE), microscópio confocal a laser (Microscópio Confocal Espectral Nikon Al), câmara anóxica (Coy Laboratory Products).
[073] Anticorpos utilizados no teste de Western blot: anticorpo de PKM2 (Abeam, 150423) , anticorpo CD 11b (Novus biologicals, NB 110-89474), anticorpo de a-Tubulina (Bioworld, AP0064).
Métodos
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21/34 [074] a) Cultura celular: células BV2 foram cultivadas em DMEM contendo 10% de soro bovino fetal (FBS), colocadas em CO2 5%, cultivadas em uma incubadora de temperatura constante a 37 °C (95% de umidade relativa), e observadas sob microscópio invertido. A passagem foi realizada aproximadamente 2-3 dias, e células de fase de crescimento logarítmico foram utilizadas para experimentos formais.
[075] b) interferência de RNA: As células foram inoculadas em uma placa de cultura de 35 mm por 24 horas. RNAs interferentes pequenos (siRNAs) foram transfectados com Reagente RNAiMAX. RNA com sequência aleatória foi utilizado como um controle. No total, 50 nM de siRNAs foram transfectados em cultura, e após 12 horas, o meio foi
| substituído por meio | fresco. As | células | foram, | então, |
| estimuladas com hipoxia | por 24 horas | para detectar o | nível de | |
| expressão das proteínas | indicadas. | |||
| Resultados | ||||
| [076] Os | resultados | apresentaram | que a | |
| expressão de proteína PKM2 apresentou | aumentos | temporários em |
células BV-2 estimuladas por hipoxia (Figura 5A) . Surpreendentemente, alterações morfológicas induzidas por hipoxia não foram inibidas pelo silenciamento de PKM2 (Figura 5B-C).
(4) Lonidamina, um inibidor de hexoquinase 2, foi eficaz em inibir a ativação de micróglia induzida por hipoxia.
Materiais [077] Linhagem celular de micróglia BV2 de camundongo, micróglia de camundongo cultivada primária, meio DMEM de glicose alta (Gibco, 11965-118), soro bovino fetal
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22/34 (Gibco, 10099-141), Lonidamina (Selleck, S2610), microscópio de contraste de fase invertido (Microscópio Ti Nikon ECLIPSE) microscópio confocal a laser (Microscópio Confocal Espectral Nikon Al), câmara anóxica (Coy LABORATORY PRODUCTS). Anticorpos utilizados no teste de Western blot: anticorpo CD 11b (Novus biologicals, NB 110-89474), anticorpo de aTubulina (Bioworld, AP0064).
Métodos [078] a) Cultura celular: células BV2 foram cultivadas em DMEM contendo 10% de soro bovino fetal (FBS), colocadas em CO2 5%, cultivadas em uma incubadora de temperatura constante a 37 °C (umidade relativa foi 95%), e observadas sob microscópio invertido. A passagem foi realizada aproximadamente 2 a 3 dias, e células de fase de crescimento logaritmico foram utilizadas para experimentos formais.
[079] Para o isolamento e cultura de micróglia primária, as células foram isoladas para camundongos C57BL/6J recém-nascidos. Resumidamente, cortices cerebrais desprovidos de meninges e vasos sanguíneos foram dissociados de camundongos PO-2 e digeridos por 0,125% de tripsina a 37 °C por 15 minutos. A digestão foi encerrada pela adição de DMEM contendo FBS 10% e células únicas isoladas foram cultivadas em placas de cultura. Após as culturas misturadas se tornarem confluentes, a micróglia foi separada de outros tipos celulares por leve agitação e a purificação foi identificada pelo marcador específico a micróglia CD 11b.
[080] b) expressão de CD 11b detectada por Imunofluorescência: células BV2 foram cultivadas em uma placa de cultura específica para confocal a laser, e tratadas com
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23/34 hipoxia por 24 horas, fixadas em paraformaldeido 4% em temperatura ambiente por 20 minutos e, então, lavadas três vezes com PBST por 5 minutos cada vez. Após a lavagem, o anticorpo CD 11b, diluído com a diluição de anticorpo DAKO, foi adicionado e incubado durante à noite a 4 °C. No dia seguinte, as amostras foram incubadas com o anticorpo secundário marcado de maneira fluorescente indicado a 37 °C por 1 hora. Após a incubação, a solução funcional DAPI foi adicionada para coloração nuclear por 10 minutos. As amostras foram, então, lavadas três vezes com PBST e tiveram a imagem formada utilizando um microscópio confocal a laser.
Resultados [081] O estímulo de hipoxia levou a profundas alterações morfológicas em células BV 2 e pMG, assim como uma expressão intensificada de CD 11b (Figuras 6A-B). O teste de imunofluorescência ilustrou a redução na expressão de CD 11b na presença de Lonidamina (50 μΜ, DMSO como solvente), enquanto DMSO, como controle, não teve efeito na expressão de CD 11b.
EXEMPLO 4 A INDUÇÃO DE HEXOQUINASE 2 LEVOU À ACETILAÇÃO DE HISTONA AUMENTADA E ATIVAÇÃO TRANSLACIONAL DE IL1B
Materiais [082] Linhagem celular de micróglia BV2 de camundongo, micróglia de camundongo cultivada primária, meio DMEM de glicose alta (Gibco, 11965-118), soro bovino fetal (Gibco, 10099-141), Lonidamina (Selleck, S2610), 3bromopiruvato (Sigma, 16490), reagente de extração de RNA TRIzol (Thermo Fisher Scientific, 15596-018), kit de quantificação de RNA (Thermo Fisher Scientific, Q10211),
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PreMix de qPCR SuperReal (SYBR Green) (Tiangen, FP202-01), sistema de PCR em tempo real (Applied Biosystems), kit de imunoprecipitação de cromatina (Millipore, 17-245), câmara anóxica (Coy Laboratory Products), microscópio de contraste de fase invertido (Microscópio Ti Nikon ECLIPSE). Anticorpos utilizados no teste de Western blot: acetil-Histona H3 anticorpo (Millipore, 06-599); acetil-Histona H4 anticorpo (Millipore, 06-866); anticorpo de a-Tubulina (Bioworld, AP0064).
Métodos [083] a) Cultura celular: células BV2 foram cultivadas em DMEM contendo 10% de soro bovino fetal (FBS), colocadas em CO2 5%, cultivadas em uma incubadora de temperatura constante a 37 °C (umidade relativa foi 95%), e observadas sob microscópio invertido. A passagem foi realizada aproximadamente 2-3 dias, e células de fase de crescimento logarítmico foram utilizadas para experimentos formais.
[084] Para o isolamento e cultura de micróglia primária, as células foram isoladas para camundongos C57BL/6J recém-nascidos. Resumidamente, cortices cerebrais desprovidos de meninges e vasos sanguíneos foram dissociados de PO-2 camundongos e digeridos por 0,125% de tripsina a 37 °C por 15 minutos. A digestão foi encerrada pela adição de DMEM contendo FBS 10% e isoladas as únicas células foram cultivadas em placas de cultura. Após as culturas misturadas se tornarem confluentes, a micróglia foi separada de outros tipos celulares por leve agitação e a purificação foi identificada pelo marcador específico a micróglia CD 11b.
[085] b) Teste de extração de proteína total e
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25/34 de expressão de histona acetilada: As células foram inoculadas em uma placa de cultura de 35mm por 24 horas, e estimuladas com hipoxia pelo tempo indicado. A proteína total foi, então, extraída para detectar a expressão de proteínas de histona acetilada.
[086] c) Perfilamento de metabólito: células BV2 foram cultivadas em uma placa de cultura de 60 mm e cultivadas por 24 horas e, então, cultivadas em condições normóxicas ou hipóxicas por 6 horas. Metabolites foram extraídos utilizando 1,5 mL de metanol 80% resfriado em gelo. Após incubação a -80 °C por 30 minutos, as células foram extraídas e centrifugadas a 14.000 g por 15 min a 4 °C. As fases de metanol/água superiores foram transferidas a novos tubos e incubadas a -80 °C por outros 30 minutos. As fases superiores foram centrifugadas e secas sob gás de nitrogênio e as amostras secas foram armazenadas a -80 °C antes da análise LC-MS.
[087] d) Teste de imunoprecipitação de cromatina (ChIP): células BV-2 foram tratadas com dimetilsulfóxido ou Lonidamina por 1 hora antes de 6 horas de exposição hipóxica. Então, as células foram ligadas de maneira cruzada com uma solução de 1% de formaldeído (Sigma, F8775) por 10 minutos a 37 °C. Lisados celulares foram sonicados para gerar 100-1000 bp fragmentos de DNA. As amostras foram diluídas, e 10% da quantidade total foi retida para entrada. As partes restantes de cada amostra foram préclareadas, e anticorpos anti-H3 ou anti-H4 foram adicionados; um anticorpo de IgG de coelho normal foi utilizado simultaneamente como o controle negativo. No dia seguinte, proteína G-agarose foi adicionada e as amostras foram lavadas
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26/34 após 2 horas de incubação. As ligações cruzadas foram, então, revertidas por incubação a 65 °C por 4 horas em 0,2 M de NaCl DNAs foram extraídos das amostras de entrada input e IP, e testes de gPCR foram realizados. As sequências iniciadoras de promotor de Illb foram como segue: 5'-AGGTCAAAGGTTTGGAAGCAG3' (direta) e 5'-ATGGAAGTCTGTCTGCTCAGTATTG-3' (reversa).
Resultados [088] Conforme apresentado na Figura 7A, após estímulo de hipoxia por 6 horas, alterações metabólicas na glicólise, ciclo de TCA e vias de pentoses fosfato firam observadas, em que coenzima A de metil foi mais significativamente afetada por hipoxia. Na presença de inibidores de HK2, Lonidamina (50 μΜ) e 3-Br-piruvato (BrPA, 10 μΜ) , o acúmulo induzido por hipoxia de acetil-coenzima A foi notavelmente prejudicado (Figura 7B) . Conforme apresentado na Figura 7C, as histonas acetiladas 3 e 4 foram sobrerreguladas de maneira temporária ou contínua em células BV 2 e pMG ao longo do tempo de exposição à hipoxia. Em células BV-2, o acúmulo induzido por hipoxia de acetilação de histona também foi revertido por inibidores de HK2 (Figura 7D) .
[089] Depois, testes quantitativos de reação em cadeia de polimerase reversa foram realizados para examinar os níveis de mRNA de diversas citocinas pró-inflamatórias na presença ou ausência de inibidores de HK2. Lonidamina (50 μΜ) e 3-BrPA (10 μΜ) inibiu drasticamente a expressão de Illb induzida por hipoxia no nível de mRNA, mas não teve efeito na expressão Tnfa e 116. Testes de imunoprecipitação de cromatina foram realizados para examinar a ligação endógena de histonas acetiladas ao promotor de Illb. A ligação de AcH3
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27/34 e AcH4 ao promotor de Illb aumentou durante a hipoxia, enquanto pôde ser reduzido pelo pré-tratamento com Lonidamina (Figura 7F).
EXEMPLO 5. O BLOQUEIO DE HEXOQUINASE 2 PREVENIU A LESÃO CEREBRAL ISQUÊMICA PELA REPRESSÃO DE NEUROINFLAMAÇÃO MEDIADA POR MICRÓGLIA EM UM MODELO EXPERIMENTAL DE ACIDENTE VASCULAR CEREBRAL (1) Lonidamina protegeu o cérebro de lesão isquêmica em um modelo de rato MCAo
Materiais [090] Lonidamina (Selleck, S2610), ratos Spague-Dawley (SD) SPF machos higidos, cloreto de 2,3,5trifeniltetrazólio (TTC) (analiticamente puro), hidrato de cloral (grau analítico) (comprado de Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd.), monofilamento de nylon de MCAo.
Métodos [091] a) Modelo de oclusão de artéria cerebral média (MCAO) foi estabelecido por técnica de fio intraluminal da Artéria Carótida Interna direita. Antes da cirurgia, Ratos SD estavam em jejum por 12 horas, mas com livre acesso para beber água. Os animais foram anestesiados por injeção intraperitoneal de 10% de hidrato de cloral, e colocados em uma posição de supino em uma mesa de operação termostática a 37 °C para manter uma respiração suave. Sob o microscópio de operação, a CCA direita foi exposta por meio de incisão de linha média e ocluída com um grampo microvascular. A artéria carótida externa direita foi exposta e ligada na extremidade distai. Um nó frouxo foi feito entre a bifurcação da artéria carótida comum direita e a ligadura da artéria carótida externa anterior. A Artéria Carótida Interna direita foi
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28/34 dissecada e presa com um grampo microvascular. Uma tesoura cirúrgica oftálmica microscópica foi utilizada para cortar uma pequena abertura entre as duas ligaduras, e o fio de nylon foi inserido abaixo da artéria carótida comum. Então, o nó frouxo foi apertado, e a artéria carótida externa direita foi cortada abaixo da ligação distai da artéria carótida externa, mas acima do ponto de inserção de sutura. 0 grampo microvascular na artéria carótida interna foi, então, retirado, e a extremidade de inserção do fio foi colocada na bifurcação da artéria carótida comum direita. A artéria carótida externa foi puxada para fora e para baixo de modo que estivesse alinhada à artéria carótida interna. Uma sutura de monofilamento de nylon foi inserida à artéria carótida interna até uma leve resistência ser sentida. Para impedir sangramento, o fio foi apertado. 0 grampo microvascular foi retirado e a incisão foi suturada. Duas horas após a operação Lonidamina ou o solvente controle indicado foi administrado em 10 mg/kg, e então o fio foi retirado, e o volume de infarto cerebral foi medido 24 horas após a perfusão.
[092] b) Medição de volume de infarto: Os ratos foram decapitados e os cérebros foram rapidamente removidos e colocados em solução fisiológica com gelo por 10 minutos. Os tecidos cerebrais foram congelados e fatiados em seções coronals (2 mm de espessura). As seções foram, então, incubadas em cloreto de 2,3,5 - trifeniltetrazólio (TTC) 1,0% a 37 °C por 30 minutos e fixadas em uma solução de paraformaldeído 4,0% durante a noite. Para cada fatia coronal o tecido de infarto (área não colorida) e área bi-hemisférica total foram delineadas na imagem escaneada com Adobe Photoshop CS6. O volume de infarto foi calculado como a
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29/34 proporção das áreas não coloridas totais (brancas) pela área bi-hemisférica total.
Resultados [093] Conforme apresentado na Figura 8A, por coloração de TTC, foi observada área de infarto óbvio 24 horas após 2 horas de reperfusão de isquemia cerebral em ratos MCAo e grupo controle. A administração de Lonidamina reduziu significativamente o tamanho do infarto. 10 mg/kg de Lonidamina pôde proteger efetivamente os cérebros dos ratos de dano isguêmico (Figura 8B) .
(2) O silenciamento de hexoquinase 2 ín vivo protegeu efetivamente ratos de dano cerebral em um modelo de MCAo em rato
Materiais [094] Lonidamina (Selleck, S2610), ratos Spague-Dawley (SD) SPF machos higidos, cloreto de 2,3,5trifeniltetrazólio (TTC) Analiticamente puro, hidrato de cloral (grau analítico) (comprado de Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd.), sutura de nylon para MCAo, sorotipo de virus 9 associado ao adeno recombinante carregando fragmento de shHK2 (rAAV-shHK2), sorotipo de virus 9 associado ao adeno recombinante carregando fragmentos controle de sequências aleatórias (rAAV-shNC), kit de imuno-histoquimica (Abeam, ab80436), sistema esterotáxico cerebral, microscópio de contraste de fase invertido (Microscópio Ti Nikon ECLIPSE) , microscópio confocal a laser (Microscópio Confocal Espectral Nikon Al).
Métodos [095] a) Modelo de oclusão de artéria cerebral média (MCAO) foi estabelecido por técnica de fio intraluminal
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30/34 da Artéria Carótida Interna direita. Antes da cirurgia, Ratos SD estavam em jejum por 12 horas, mas com livre acesso para beber água. Os animais foram anestesiados por injeção intraperitoneal de 10% de hidrato de cloral, e colocados em uma posição de supino em uma mesa de operação termostática a 37 °C para manter uma respiração suave. Sob o microscópio de operação, a CCA direita foi exposta por meio de incisão de linha média e ocluida com um grampo microvascular. A artéria carótida externa direita foi exposta e ligada na extremidade distai. Um nó frouxo foi feito entre a bifurcação da artéria carótida comum direita e a ligadura da artéria carótida externa anterior. A Artéria Carótida Interna direita foi dissecada e presa com um grampo microvascular. Uma tesoura cirúrgica oftálmica microscópica foi utilizada para cortar uma pequena abertura entre as duas ligaduras, e o fio de nylon foi inserido abaixo da artéria carótida comum. Então, o nó frouxo foi apertado, e a artéria carótida externa direita foi cortada abaixo da ligação distai da artéria carótida externa, mas acima do ponto de inserção de sutura. O grampo microvascular na artéria carótida interna foi, então, retirado, e a extremidade de inserção do fio foi colocada na bifurcação da artéria carótida comum direita. A artéria carótida externa foi puxada para fora e para baixo de modo que estivesse alinhada à artéria carótida interna. Uma sutura de monofilamento de nylon foi inserida à artéria carótida interna até uma leve resistência ser sentida. Para impedir sangramento, o fio foi apertado. O grampo microvascular foi retirado e a incisão foi suturada. Duas horas após a operação Lonidamina ou o solvente controle indicado foi administrado em 10 mg/kg, e então o fio foi retirado, e o volume de
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31/34 infarto cerebral foi medido 24 horas após a perfusão.
[096] b) Medição de volume de infarto: Os ratos foram decapitados e os cérebros foram rapidamente removidos e colocados em solução fisiológica com gelo por 10 minutos. Os tecidos cerebrais foram congelados e fatiados em seções coronals (2 mm de espessura). As seções foram, então, incubadas em cloreto de 2,3,5 - trifeniltetrazólio (TTC) 1,0% a 37 °C por 30 minutos e fixadas em uma solução de paraformaldeído 4,0% durante a noite. Para cada fatia coronal o tecido de infarto (área não colorida) e área bi-hemisférica total foram delineadas na imagem escaneada com Adobe Photoshop CS6. O volume de infarto foi calculado como a proporção das áreas não coloridas totais (brancas) pela área bi-hemisférica total.
[097] c) Vetores de vírus adenoassociado recombinante (rAAV) foram produzidos em células 293T. As titulações genômicas dos vírus variaram de 3,2 χ 1012 a 3,5 * 1012 V.G./mL, conforme determinadas por qPCR. Para construir os vetores AAV2/9, as seguintes sequências que focalizam HK2 foram utilizadas: 5 '-GCGCAACATTCTCATCGATTT-3 ' e 5'-AAATCGATGAGAATGTTGCGC-3 ' . A sequência de shRNA controle foi 5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3 ' . No total, 2 pL dos vetores virais foram injetados de maneira unilateral às estriatas de ratos anestesiados, fixados em uma estrutura estereotáxica. As coordenadas de local de injeção foram: 1,0 mm rostral para bregma, 3,0 mm lateral para linha média, e 4,5 mm ventral para dura, com o conjunto de barra de dentes a zero. Microinjeções foram realizadas em uma taxa de 0,2 pL/minutos. Após a injeção, a microsseringa permaneceu in sítu por 5 minutos adicionais antes de ser retirada.
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32/34 [098] d) Imunofluorescência de tecido foi utilizada para detectar a distribuição de vírus no cérebro (eGFP), e expressões de hexoquinase 2 e Iba-1 (outro marcador molecular de ativação de micróglia): Após isquemia por 2 horas e reperfusão por 24 horas, o tecido cerebral intacto foi removido por anestesia e embebido em parafina para obter seções. A espessura das fatias de cérebro foi aproximadamente de 4 pm. As fatias de cérebro foram desparafinizadas e hidratadas, e sujeitas à recuperação de antígeno. As amostras foram incubadas nos anticorpos indicados a 4 °C durante a noite. No dia seguinte, o anticorpo secundário marcado de maneira fluorescente foi adicionado e as amostras foram incubadas as 37 °C por 1 hora. Após a incubação, uma solução funcional DAPI foi adicionada para coloração nuclear por 10 minutos. No final do tratamento, as amostras foram lavadas três vezes com PBST e tiveram a imagem formada utilizando um microscópio confocal a laser.
[099] e) A detecção imuno-histoquímica da expressão de IL-Ιβ: Após isquemia por 2 horas e reperfusão por 24 horas, o tecido cerebral intacto foi removido por anestesia e embebido em parafina para obter as exceções. A espessura das fatias cerebrais foi de aproximadamente 4 pm. As fatias cerebrais foram desparafinizadas e hidratadas, e sujeitas à recuperação de antígeno. As amostras foram incubadas em anticorpos primários indicados durante a noite a 4 °C. No dia seguinte, as amostras foram lavadas em solução fisiológica fosfato tamponada, sujeita à incubação em série em complemento e um conjugado de peroxidase de rábano (HRP). Após incubação por 15 minutos em temperatura ambiente, as amostras foram incubadas com solução de desenvolvimento de
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DAB por 1 minuto. Por fim, as amostras foram coloridas com hematoxilina e tiveram a imagem formada utilizando um microscópio Nikon.
Resultados [0100] Os pesos dos animais foram monitorados constantemente, e não foi detectada significância estatística 20 dias após a injeções de rAAV9-shHK2 e rAAV9-shNC. (Os pesos dos animais nos grupos AAV2/9-shNC e AAV2/9-shHK2 foram 273,2 ± 6,9 g e 269, 3 ± 5,0 g, respectivamente) . Antes da cirurgia, tecidos de todo o cérebro de ratos foram coletados para detectar a dispersão de .AAVs utilizando tecnologia de formação de imagem óptica in vivo com base na expressão de eGFP (Figura 9A). A coloração de fatias do cérebro apresentou que HK2 é significativamente sobrerregulado por cirurgia de MCAo. Devido à distribuição disseminada de AAVs, entretanto, a HK2 sobrerregulada por cirurgia de MCAo foi inibida efetivamente no grupo rAAV9-shHK2, enquanto injeção de rAAV9shNC não teve efeito significativo na inibição de HK2 (Figura 9B). Semelhante à inibição de HK2, a coloração de TTC apresentou que tamanhos de infarto se reduziram significativamente em ratos com silenciamento de HK2, comparado a seus equivalentes injetados com AAVs carregando shRNA controle (Figura9C-D).
[0101] Conforme revelado na Figura 9E, micróglia no grupo rAAV9-shNC teve característica morfológica de micróglia ativada, com a ampliação de corpos celulares e retração de projeções, enquanto suas morfologias ativadas foram notavelmente reprimidas no grupo de tratamento shHK2. O efeito neuroprotetor de silenciamento de HK2 foi associado à inibição proeminente da expressão de Iba-1 (Figura 9E) .
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Conforme retratado na Figura 9, a coloração imunohistoquímica de Il-ΐβ nas regiões de córtex e estriata apresentou que a neuroproteção mediada por silenciamento de hexoquinase 2 endógena é associada à expressão reduzida de Il-ΐβ; no grupo controle, Il-ΐβ é distribuído no córtex e estriata, enquanto no grupo rAAV9-shHK2, a expressão de Ι1-1β foi significativamente inibida.
Claims (9)
- REIVINDICAÇÕES1. USO DE UM INIBIDOR ESPECÍFICO À HEXOQUINASE 2, caracterizado pela fabricação de um medicamento para profilaxia e tratamento de lesão aguda do sistema nervoso central.
- 2. USO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo inibidor especifico à hexoquinase 2 ser um anticorpo de hexoquinase 2 ou um fragmento deste, ou siRNA, shRNA, miRNA ou uma modificação destes que interfira no mRNA de hexoquinase 2.
- 3. USO, de acordo com a reivindicação 2, em que o anticorpo de hexoquinase 2 existe em uma forma de uma sequência
de aminoácido que codifica o anticorpo, uma sequência de nucleotídeo que codifica o anticorpo, ou um vetor de expressão caracterizado por compreender a . sequência de aminoácido ou nucleotídeo. 4 . USO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo anticorpo de hexoquinase 2 existir em uma forma de uma proteína de fusão contida em um vetor de expressão ou célula hospedeira. - 5. USO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fragmento do anticorpo ser Fab, Fab', (Fab')2 ou Fv.
- 6. USO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo siRNA, shRNA, miRNA ou uma modificação destes ser contido em um determinado vetor.
- 7. USO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela lesão aguda do sistema nervoso central ser um dano ao encéfalo/espinhal causado por qualquer um de um grupo consistindo em lesão espinhal aguda, trauma cerebral,Petição 870190082596, de 23/08/2019, pág. 43/1062/2 dano à retina, lesão cerebral hipóxica, lesão cerebral isquêmica aguda, acidente vascular cerebral isquêmico, acidente vascular cerebral hipóxico, encefalopatia isquêmica hipóxica neonatal, encefalopatia tóxica, infarto cerebral agudo, infarto lacunar, ataque isquêmico transitório, lesão crâniocerebral grave, cirurgia cerebroespinhal e radioterapia do encéfalo/espinhal.
- 8. USO DE UMA COMPOSIÇÃO, caracterizado por compreender inibidor específico à hexoquinase 2 na fabricação de um medicamento para profilaxia e tratamento de lesão aguda do sistema nervoso central.
- 9. USO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo inibidor específico à hexoquinase 2 ser um anticorpo de hexoquinase 2 ou um fragmento deste, ou siRNA, shRNA, miRNA ou uma modificação destes que interfira no mRNA de hexoquinase 2.
- 10. USO, de acordo com a reivindicação 8, em que a composição é caracterizada por ainda compreender um ou mais compostos selecionados de um grupo consistindo em 2desoxiglicose, Lonidamina, ácido bromopirúvico, glicose 6fosfato, Imatinibe, 5-tio-glicose e metiljasmonato.
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