IT202100003470A1 - Vaccines against sars-cov-2 - Google Patents
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Classifications
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Description
VACCINI CONTRO SARS-COV-2
DESCRIZIONE
Campo tecnico dell'invenzione
La presente invenzione riguarda i vaccini di seconda generazione contro COVID-19 per evitare la risposta immunodominante mediata dagli anticorpi derivati dalla regione germinale dell'immunoglobulina G a catena pesante variabile (IGHV) IGHV3-53 e la regione strettamente correlata IGHV3-66. Tali vaccini presentano diversi vantaggi per evitare la propagazione delle varianti di fuga pi? comuni e la generazione di autoanticorpi potenzialmente dannosi. L'invenzione riguarda anche l'uso di tali vaccini nella prevenzione o nel trattamento dell'infezione da SARS-CoV-2 o di condizioni o disturbi derivanti da tale infezione.
Stato dell'arte
Il coronavirus 2 della sindrome respiratoria acuta grave (SARS-CoV-2) ? un coronavirus altamente trasmissibile e patogeno che ? emerso alla fine del 2019 e ha causato una pandemia di malattia respiratoria acuta, denominata "malattia da coronavirus 2019" (COVID-19), che minaccia la salute umana e la sicurezza pubblica. Il programma di vaccinazione globale contro il coronavirus 2 della sindrome respiratoria acuta grave (SARS-CoV-2) sar? molto importante per prevenire la malattia, ma generer? una pressione per le varianti di fuga antigenica. L'infezione e la vaccinazione con SARS-CoV-2, agente infettivo di COVID-19, ? caratterizzata da una risposta anticorpale immunodominante contro il dominio di legame del recettore della proteina spike (RBD). Questa risposta ? mediata da anticorpi derivati dalle germline IGHV3-53 e IGHV3-66, strettamente correlate. Queste germline forniscono un quadro ottimale di protezione in quanto interferiscono con l'interazione tra il RBD e l'enzima umano di conversione dell'angiotensina 2 (ACE2). Anticorpi neutralizzanti molto potenti contro la SARS-CoV-2 possono essere generati espandendo le germinazioni di cellule B preesistenti o aggiungendo pochissime mutazioni somatiche senza la necessit? di un'estesa maturazione dell'affinit?. Dato che gli anticorpi neutralizzanti predominanti nella popolazione umana derivano da queste linee germinali, la maggior parte delle varianti emergenti nascono per sfuggire a questa risposta immunitaria. Infatti, le varianti emergenti, come la B1.1.7, 501Y.V2, B.1.1.28.1 e B.1.1.248, isolate rispettivamente nel Regno Unito, Sud Africa, Brasile e Giappone hanno mostrato mutazioni nei residui N501, E484 e K417, che sono coinvolti nell'interazione tra la RBD e gli anticorpi IGHV3-53/IGHV3-66. ? interessante notare che la malattia grave COVID-19 ? stata anche associata a una serie di patologie difficili da spiegare in pi? organi oltre al tratto respiratorio. Di conseguenza, rimane un bisogno urgente di fornire vaccini contro la SARS-CoV-2 che superino gli svantaggi dei vaccini conosciuti.
Riassunto dell'invenzione
La presente invenzione riguarda un vaccino di seconda generazione contro COVID-19 per evitare la risposta immunodominante mediata dalla regione germinale IGHV3-53/IGHV3-66. Tali vaccini presentano diversi vantaggi per evitare la propagazione delle varianti di fuga pi? comuni e la generazione di autoanticorpi potenzialmente dannosi. Inoltre, la malattia grave COVID-19 ? stata anche associata a una serie di patologie difficili da spiegare in pi? organi oltre al tratto respiratorio. Queste sono associate a un drammatico aumento degli autoanticorpi contro i fosfolipidi con propriet? protrombotiche, degli autoanticorpi contro le citochine e altre proteine immunoregolatrici e degli autoanticorpi contro le proteine della superficie cellulare. Inoltre, i dati degli inventori hanno dimostrato che gli anticorpi neutralizzanti derivati da IGHV3-53 e IGHV3-66 reagiscono in modo incrociato con gli autoantigeni e sono associati a disturbi autoimmuni come la sindrome di Kawasaki. Pertanto, ? possibile che la risposta immunodominante mediata da IGHV3-53/IGHV3-66 contro la RBD del virus SARS-CoV-2 possa contribuire all'aggravamento della malattia COVID-19.
Di conseguenza, in alcuni aspetti, l'invenzione fornisce un polipeptide immunogenico che comprende o consiste in un dominio di legame al recettore (RBD) della proteina spike SARS-CoV-2, in cui detto RBD ? cancellato o mutato per evitare l'espansione delle germinazioni delle cellule B IGHV3-53 e/o IGHV3-66.
In alcuni aspetti, l'invenzione fornisce un polipeptide immunogenico che comprende o consiste nella proteina spike SARS-CoV-2, in cui la RBD ? rimossa da detta proteina spike per evitare l'espansione delle germinazioni delle cellule B IGHV3-53 e/o IGHV3-66.
In alcuni aspetti, l'invenzione fornisce una molecola di acido nucleico isolata che comprende una sequenza nucleotidica che codifica il polipeptide immunogenico secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione qui descritte e un vettore che comprende detta molecola di acido nucleico.
In determinati aspetti, l'invenzione fornisce una composizione immunogenica che comprende il polipeptide immunogenico o la molecola dell'acido nucleico o un vettore secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione qui rivelate, facoltativamente comprendente uno o pi? adiuvanti.
In alcuni aspetti, l'invenzione fornisce i prodotti immunogenici qui descritti per l'uso come vaccino contro l'infezione da SARS-CoV-2.
L'invenzione contempla combinazioni di qualsiasi dei precedenti aspetti e forme di realizzazione dell'invenzione.
Breve descrizione dei disegni
Figura 1. Il ruolo criptico degli anticorpi IGHV3-53 e IGHV3-66 in COVID-19. Riassunto dei ruoli di due germinazioni di anticorpi predominanti suscitati dall'infezione da COVID-19. (A - C) La figura mostra diverse funzioni degli anticorpi IGHV3-53 e IGHV3-66 post-infezione che sono la neutralizzazione del virus (A), l'evoluzione delle varianti di fuga (B) e la possibile autoimmunit? (C).
Descrizione dettagliata dell'invenzione
Se non diversamente definito nel presente documento, i termini scientifici e tecnici usati in relazione alla presente invenzione avranno i significati comunemente intesi da coloro che hanno un'abilit? ordinaria nell'arte. Inoltre, se non diversamente richiesto dal contesto, i termini singolari includono il plurale e i termini plurali includono il singolare. In generale, la nomenclatura usata in relazione a, e le tecniche di, coltura di cellule e tessuti, biologia molecolare, immunologia, microbiologia, genetica e chimica delle proteine e degli acidi nucleici e ibridazione qui descritte sono quelle ben note e comunemente usate nell'arte. I metodi e le tecniche della presente invenzione sono generalmente eseguiti secondo i metodi convenzionali ben noti nell'arte e come descritto in vari riferimenti generali e pi? specifici che sono citati e discussi in tutta la presente specifica se non diversamente indicato. Vedere, per esempio, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) e Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), e Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990), qui incorporati per riferimento.
I seguenti termini, se non diversamente indicato, devono essere intesi con i seguenti significati:
I termini "polipeptide", "proteina" e "sequenza di aminoacidi" qui utilizzati si riferiscono generalmente a un polimero di residui di aminoacidi e non sono limitati a una lunghezza minima del prodotto. I polipeptidi dell'invenzione possono essere preparati in molti wayse.g.by la sintesi chimica (almeno in parte), digerendo i polipeptidi pi? lunghi usando le proteasi, da traduzione da RNA, da purificazione da coltura cellulare (per esempio da espressione ricombinante), dall'organismo stesso. I metodi biologici sono in generale limitati alla produzione di polipeptidi basati su L-amminoacidi, ma la manipolazione del macchinario di traduzione (ad esempio delle molecole di tRNA aminoacilico) pu? essere usata per permettere l'introduzione di D-amminoacidi (o di altri amminoacidi non naturali, come la iodotirosina o la metilfenilalanina, l'azidohomoalanina, ecc) (Ibba (1996) Biotechnol Genet Eng Rev 13:197-216). Il termine "polipeptide" comprende proteine native o artificiali, frammenti di proteine e analoghi polipeptidici di una sequenza proteica, cio? polipeptidi isolati o purificati. Un polipeptide pu? essere monomerico o polimerico. Il termine "proteina isolata", "polipeptide isolato" ? una proteina, polipeptide che in virt? della sua origine o fonte di derivazione (1) non ? associato a componenti naturalmente associati che lo accompagnano nel suo stato nativo, (2) ? privo di altre proteine della stessa specie, (3) ? espresso da una cellula di una specie diversa, o (4) non avviene in natura. Cos?, un polipeptide che ? sintetizzato chimicamente o sintetizzato in un sistema cellulare diverso dalla cellula da cui proviene naturalmente sar? "isolato" dai suoi componenti naturalmente associati. Una proteina pu? anche essere resa sostanzialmente libera dai componenti naturalmente associati mediante isolamento, utilizzando tecniche di purificazione delle proteine ben note nell'arte. Una proteina o un polipeptide ? "sostanzialmente puro", "sostanzialmente omogeneo", o "sostanzialmente purificato" quando almeno dal 60 al 75% circa di un campione presenta un singolo polipeptide. Il polipeptide o la proteina possono essere monomerici o multimerici. Un polipeptide o una proteina sostanzialmente pura comprender? tipicamente circa il 50%, 60%, 70%, 80% o 90% W/W di un campione di proteina, pi? solitamente circa il 95%, e preferibilmente sar? puro oltre il 99%. La purezza o l'omogeneit? delle proteine pu? essere indicata con una serie di mezzi ben noti nell'arte, come l'elettroforesi su gel di poliacrilammide di un campione di proteine, seguita dalla visualizzazione di una singola banda polipeptidica dopo aver colorato il gel con un colorante ben noto nell'arte. Per certi scopi, una risoluzione pi? alta pu? essere fornita usando HPLC o altri mezzi ben noti nell'arte per la purificazione. Il termine "frammento polipeptidico" qui utilizzato si riferisce a un polipeptide che ha una delezione amino-terminale e/o carbossi-terminale, ma in cui la restante sequenza di aminoacidi ? identica alle posizioni corrispondenti nella sequenza naturale.
Il termine "SARS-CoV-2" sta per Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2), il tipo di coronavirus che causa la malattia da coronavirus 2019 (COVID-19).
Il termine "polinucleotide" come indicato nel presente documento indica una forma polimerica di nucleotidi di almeno 10 basi di lunghezza, sia ribonucleotidi che deossiribonucleotidi o una forma modificata di entrambi i tipi di nucleotide. Il termine include forme a singolo e doppio filamento.
Il termine "polinucleotide isolato" come usato qui significa un polinucleotide di origine genomica, cDNA, o sintetica o qualche combinazione di questi, che in virt? della sua origine il "polinucleotide isolato" (1) non ? associato con tutti o una parte dei polinucleotidi con cui il "polinucleotide isolato" si trova in natura, (2) ? operativamente legato a un polinucleotide al quale non ? legato in natura, o (3) non si trova in natura come parte di una sequenza pi? ampia.
Come usato qui, il termine "acido nucleico" ? inteso per includere molecole di DNA (per esempio, cDNA o DNA genomico) e molecole di RNA (per esempio, mRNA) e analoghi del DNA o RNA generati usando analoghi nucleotidici. L'acido nucleico pu? essere a singolo o doppio filamento.
Il termine "nucleotidi naturali" come usato qui include deossiribonucleotidi e ribonucleotidi. Il termine "nucleotidi modificati" qui usato include nucleotidi con gruppi di zucchero modificati o sostituiti e simili. Il termine "legami oligonucleotidici" di cui al presente include legami oligonucleotidici come fosforotiato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforanilotiato, fosforaniladato, fosforamidato e simili. Vedi ad esempio, LaPlanche et al., Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec et al, J. Am. Chem. Soc.106:6077 (1984); Stein et al., Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988); Zon et al., Anti-Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon et al. Oligonucleotidi e analoghi: A Practical Approach, pp.87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)); U.S. Patent No. 5,151,510; Uhlmann and Peyman, Chemical Reviews 90:543 (1990), le cui rivelazioni sono qui incorporate per riferimento. Il termine "sequenza di controllo dell'espressione" come usato qui significa sequenze polinucleotidiche che sono necessarie per influenzare l'espressione e l'elaborazione delle sequenze codificanti a cui sono legate. Le sequenze di controllo dell'espressione includono sequenze appropriate di iniziazione, terminazione, promotore ed esaltatore della trascrizione; segnali efficienti di elaborazione dell'RNA come segnali di splicing e poliadenilazione; sequenze che stabilizzano l'mRNA citoplasmatico; sequenze che migliorano l'efficienza della traduzione (cio?, sequenza di consenso di Kozak); sequenze che migliorano la stabilit? della proteina; e, quando desiderato, sequenze che migliorano la secrezione della proteina. La natura di tali sequenze di controllo differisce a seconda dell'organismo ospite; nei procarioti, tali sequenze di controllo includono generalmente il promotore, il sito di legame ribosomiale e la sequenza di terminazione della trascrizione; negli eucarioti, generalmente, tali sequenze di controllo includono i promotori e la sequenza di terminazione della trascrizione. Il termine "sequenze di controllo" intende includere, come minimo, tutti i componenti la cui presenza ? essenziale per l'espressione e l'elaborazione, e pu? anche includere componenti aggiuntivi la cui presenza ? vantaggiosa, per esempio, sequenze leader e sequenze partner di fusione. Il termine "vettore", come usato qui, significa una molecola di acido nucleico capace di trasportare un altro acido nucleico a cui ? stato collegato. In alcune forme di realizzazione, il vettore ? un plasmide, cio? un pezzo circolare a doppio filamento di DNA in cui possono essere legati ulteriori segmenti di DNA. In alcune forme di realizzazione, il vettore ? un vettore virale, in cui i segmenti supplementari del DNA possono essere legati nel genoma virale. In alcune forme di realizzazione, i vettori sono capaci di replicazione autonoma in una cellula ospite in cui sono introdotti (ad esempio, vettori batterici che hanno un'origine batterica di replicazione e vettori episomali di mammiferi). In altre forme di realizzazione, i vettori (ad esempio, vettori non episomali di mammiferi) possono essere integrati nel genoma di una cellula ospite al momento dell'introduzione nella cellula ospite, e quindi vengono replicati insieme al genoma ospite.
Il termine "cellula ospite ricombinante" (o semplicemente "cellula ospite"), come usato qui, indica una cellula in cui ? stato introdotto un vettore di espressione ricombinante. Dovrebbe essere inteso che "cellula ospite ricombinante" e "cellula ospite" significa non solo la particolare cellula del soggetto ma anche la progenie di tale cellula. Poich? alcune modifiche possono verificarsi nelle generazioni successive a causa di mutazioni o influenze ambientali, tale progenie pu? non essere, infatti, identica alla cellula madre, ma sono ancora inclusi nella portata del termine "cellula ospite" come usato qui.
Il termine "identit? di sequenza percentuale" nel contesto delle sequenze nucleotidiche o aminoacidiche indica i residui in due sequenze che sono gli stessi quando allineati per la massima corrispondenza. La lunghezza del confronto dell'identit? di sequenza pu? essere su un tratto di almeno circa nove nucleotidi, solitamente almeno circa 18 nucleotidi, pi? solitamente almeno circa 24 nucleotidi, tipicamente almeno circa 28 nucleotidi, pi? tipicamente almeno circa 32 nucleotidi, e preferibilmente almeno circa 36, 48 o pi? nucleotidi. Ci sono diversi algoritmi conosciuti nell'arte che possono essere usati per misurare l'identit? della sequenza nucleotidica. Per esempio, le sequenze polinucleotidiche possono essere confrontate usando FASTA, Gap o Bestfit, che sono programmi disponibili, forniscono allineamenti e identit? di sequenza percentuale delle regioni della migliore sovrapposizione tra la query e le sequenze di ricerca (Pearson, Methods Enzymol. 183:63-98 (1990); Pearson, Methods MoI. Biol.132:185-219 (2000); Pearson, Methods Enzymol. 266:227-258 (1996); Pearson, J MoI. Biol 276:71-84 (1998); qui incorporato per riferimento). Il termine "somiglianza sostanziale" o "somiglianza sostanziale di sequenza", quando si riferisce a un acido nucleico o frammento di esso, o aminoacidico significa che quando allineato in modo ottimale con opportune inserzioni o cancellazioni nucleotidiche con un altro acido nucleico (o il suo filamento complementare), c'? identit? di sequenza nucleotidica in almeno circa l'85%, preferibilmente almeno circa il 90%, e pi? preferibilmente almeno circa il 95%, 96%, 97%, 98% o 99% delle basi nucleotidiche, come misurato da qualsiasi noto algoritmo di identit? di sequenza, come FASTA, BLAST o Gap, come discusso sopra. Applicato ai polipeptidi, il termine "identit? sostanziale" significa che due sequenze peptidiche, quando allineate in modo ottimale, ad esempio con i programmi GAP o BESTFIT usando i pesi di gap predefiniti forniti con i programmi, condividono almeno il 70%, 75% o 80% di identit? di sequenza, preferibilmente almeno il 90% o 95% di identit? di sequenza, e pi? preferibilmente almeno il 97%, 98% o 99% di identit? di sequenza. In alcune forme di realizzazione, le posizioni dei residui che non sono identiche differiscono per sostituzioni conservative di aminoacidi. Una "sostituzione conservativa di aminoacido" ? quella in cui un residuo di aminoacido ? sostituito da un altro residuo di aminoacido con una catena laterale R con propriet? chimiche simili (ad esempio, carica o idrofobicit?). In generale, una sostituzione aminoacidica conservativa non cambier? sostanzialmente le propriet? funzionali di una proteina. Nei casi in cui due o pi? sequenze di aminoacidi differiscono l'una dall'altra per sostituzioni conservative, la percentuale di identit? di sequenza pu? essere regolata verso l'alto per correggere la natura conservativa della sostituzione. I mezzi per fare questo aggiustamento sono ben noti a chi ? esperto nell'arte. Vedi, ad esempio, Pearson, Methods MoI. Biol.243:307-31 (1994). Esempi di gruppi di aminoacidi che hanno catene laterali con propriet? chimiche simili includono 1) catene laterali alifatiche: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; 2) catene laterali alifaticoidrossiliche: serina e treonina; 3) catene laterali contenenti ammide: asparagina e glutammina; 4) catene laterali aromatiche: fenilalanina, tirosina e triptofano; 5) catene laterali basiche: lisina, arginina e istidina; 6) catene laterali acide: acido aspartico e acido glutammico; e 7) catene laterali contenenti zolfo: cisteina e metionina. I gruppi di sostituzione conservativi degli aminoacidi sono: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutammatoaspartato e asparagina-glutammina. In alternativa, una sostituzione conservativa ? qualsiasi cambiamento che abbia un valore positivo nella matrice di log-likelihood PAM250 rivelata in Gonnet et al, Science 256:1443-45 (1992), qui incorporata per riferimento. Una sostituzione "moderatamente conservativa" ? qualsiasi cambiamento che abbia un valore non negativo nella matrice di log-likelihood PAM250. L'identit? di sequenza per i polipeptidi ? tipicamente misurata utilizzando un software di analisi della sequenza. Il software di analisi delle proteine abbina le sequenze usando misure di somiglianza assegnate a varie sostituzioni, delezioni e altre modifiche, comprese le sostituzioni conservative degli aminoacidi. Per esempio, GCG contiene programmi come "Gap" e "Bestfit" che possono essere utilizzati con parametri predefiniti come specificato dai programmi per determinare l'omologia di sequenza o l'identit? di sequenza tra polipeptidi strettamente correlati, come polipeptidi omologhi da diverse specie di organismi o tra una proteina wild type e una sua muteina.
L'espressione "per evitare l'espansione delle germinazioni delle cellule B IGHV3-53 e/o IGHV3-66" significa che la somministrazione del composto immunogenico in un soggetto non stimola o ? destinata a ridurre l'espansione delle germinazioni delle cellule B IGHV3-53 e/o IGHV3-66. Le molecole immunogeniche polipeptidiche o di acido nucleico o le composizioni immunogeniche della presente invenzione forniscono l'induzione di una risposta immunitaria in un soggetto o ospite (umano o animale non umano), ma evitano l'espansione delle cellule B germline IGHV3-53 e/o IGHV3-66. L'induzione selettiva di una risposta immunitaria in un soggetto o ospite (animale umano o non umano) da parte dei prodotti immunogenici qui descritti, pu? essere determinata e caratterizzata dai metodi qui descritti e abitualmente praticati nell'arte. Questi metodi includono saggi in vivo, come gli studi di immunizzazione animale. Un certo numero di saggi in vitro, come i metodi di immunochimica per il rilevamento e l'analisi degli anticorpi, tra cui l'analisi Western immunoblot, ELISA, immunoprecipitazione, radioimmunodosaggio e simili, e combinazioni di questi. Altri metodi e tecniche che possono essere utilizzati per analizzare e caratterizzare una risposta immunitaria includono saggi di neutralizzazione (come un saggio di riduzione della placca o un saggio che misura l'effetto citopatico (CPE) o qualsiasi altro saggio di neutralizzazione praticato da persone esperte nell'arte). Questi e altri saggi e metodi noti nell'arte possono essere utilizzati per caratterizzare gli immunogeni e le loro varianti. Il significato statistico dei risultati ottenuti nei vari saggi pu? essere calcolato e compreso secondo i metodi abitualmente praticati da persone esperte nella relativa arte.
Una "composizione immunogenica" o "vaccino" o "formulazione di vaccino" come usato qui si riferisce ad una composizione che comprende una molecola antigenica in cui la somministrazione della composizione ad un soggetto risulta nello sviluppo nel soggetto di una risposta immunitaria umorale e/o cellulare alla molecola antigenica/immunogenica di interesse. La composizione immunogenica pu? essere introdotta direttamente in un soggetto ricevente, come per iniezione, inalazione, orale, intranasale o qualsiasi altra via di somministrazione parenterale, mucosa o transdermica (ad esempio, intra-rettale o intra-vaginale).
Polipeptidi immunogenici
In alcuni aspetti, l'invenzione fornisce un polipeptide immunogenico che comprende o consiste in un dominio di legame al recettore (RBD) della proteina spike SARS-CoV-2, in cui detto dominio di legame al recettore (RBD) ? cancellato o mutato per evitare l'espansione delle germinazioni delle cellule B IGHV3-53 e/o IGHV3-66. In particolare la classe IgG, IgM e/o IgA e qualsiasi isotipo come ad esempio IgG1, IgG2, IgG3 IgG4 IgA1, IgA2.
In alcune forme di realizzazione l'invenzione fornisce un polipeptide immunogenico che comprende o consiste in un dominio di legame al recettore (RBD) della proteina spike SARS-CoV-2, in cui uno o pi? residui di detto dominio di legame al recettore (RBD) sono cancellati o mutati nelle posizioni 455, 456, 473, 475, 420, 421, 457, 460, 484, 415, 417, 477 in cui la numerazione di dette posizioni si riferisce al SEQ ID NO:1. In una delle forme di realizzazione detto polipeptide immunogenico ? mutato o cancellato in almeno 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 di dette posizioni. In alcune forme di realizzazione l'invenzione fornisce un polipeptide immunogenico che comprende la proteina spike SARS-CoV-2, in cui uno o pi? residui di detto dominio di legame al recettore (RBD) sono cancellati o mutati nelle posizioni 455, 456, 473, 475, 420, 421, 457, 460, 484, 415, 417, 477 in cui la numerazione di tali posizioni si riferisce a SEQ ID NO:1. In alcune forme di realizzazione uno o pi? di questi residui sono cancellati o mutati in alanina o glicina o lisina o fenilalanina o valina o serina o asparagina.
In alcune forme di realizzazione, l'invenzione fornisce un polipeptide immunogenico che comprende o consiste in un dominio di legame al recettore (RBD) della proteina spike SARS-CoV-2 con una o pi? delle seguenti mutazioni: E484K, L455F, A475V, A475S, K417N, S477N.
Preferibilmente il polipeptide immunogenico comprende almeno 2, 3, 4 o 5 di tali mutazioni.
In alcune forme di realizzazione il polipeptide immunogenico comprende o consiste in un dominio di legame al recettore (RBD) con una sequenza selezionata tra SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 o SEQ ID NO:9.
In alcuni aspetti, l'invenzione fornisce un polipeptide immunogenico che comprende o consiste in una proteina spike SARS-CoV-2 mutata, in cui il dominio di legame al recettore (RBD) viene rimosso da detta proteina spike per evitare l'espansione delle germinazioni delle cellule B IGHV3-53 e/o IGHV3-66. In una forma di realizzazione il polipeptide immunogenico che comprende solo il dominio N-terminale (NTD) della subunit? S1 e la subunit? S2 di detta proteina spike SARS-CoV-2 mutata, preferibilmente detta proteina spike SARS-CoV-2 mutata ha SEQ ID NO:2.
Secondo alcune forme di realizzazione della presente invenzione, i polipeptidi immunogenici e le loro varianti possono essere prodotti sinteticamente o ricombinando. Per esempio, i polipeptidi immunogenici possono essere espressi da un polinucleotide che ? operativamente legato a una sequenza di controllo dell'espressione, come un promotore, in un costrutto di espressione di acido nucleico. Per esempio possono essere espressi in cellule di mammifero, lievito, batteri, insetti o altre cellule sotto il controllo di opportune sequenze di controllo dell'espressione. I sistemi di traduzione senza cellule possono anche essere impiegati per produrre tali proteine di coronavirus utilizzando acidi nucleici, compresi gli RNA, e costrutti di espressione. Appropriati vettori di clonazione ed espressione per l'uso con ospiti procariotici ed eucariotici sono abitualmente usati da persone esperte nell'arte e sono descritti, per esempio, da Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, NY, (1989) e Third Edition (2001), e possono includere plasmidi, cosmidi, vettori shuttle, vettori virali, e vettori che comprendono un'origine cromosomica di replicazione come descritto in essi.
Molecola dell'acido nucleico
In determinati aspetti, l'invenzione fornisce una molecola isolata dell'acido nucleico che comprende una sequenza del nucleotide che codifica il polipeptide immunogenico secondo c'? ne delle forme di realizzazione qui rivelate. Preferibilmente, dette molecole di acido nucleico sono sequenze di DNA o mRNA. Usando RNA invece di DNA per la vaccinazione genetica, il rischio di integrazione genomica indesiderata e la generazione di anticorpi anti-DNA ? minimizzato o evitato. In alcune forme di realizzazione detto mRNA ? all'interno di nanoparticelle lipidiche. Le nanoparticelle lipidiche formate da lipidi cationici con altri componenti lipidici, come lipidi neutri, colesterolo, PEG, lipidi PEGylated, e oligonucleotidi sono stati utilizzati per bloccare la degradazione degli RNA nel plasma e facilitare l'assorbimento cellulare degli oligonucleotidi. Le procedure per la fabbricazione di detto vaccino mRNA sono note nell'arte vedi per esempio in US 10,576,146, US 10,485,884 e US 9,950,065 qui incorporato per riferimento.
Vettore
In determinati aspetti, l'invenzione fornisce il vettore che comprende la molecola dell'acido nucleico che codifica il polipeptide immunogenico secondo c'? ne delle forme di realizzazione qui rivela. In determinati aspetti, l'invenzione fornisce il vettore per uso come vaccino o come vettori di espressione per produrre i polipeptidi immunogenici detti. Il vettore comprende facoltativamente una sequenza di controllo di espressione operativamente collegata alla molecola dell'acido nucleico. In alcune forme di realizzazione detto vettore ? selezionato tra i vettori del virus dell'RNA, vettori del virus del DNA, vettori virali del plasmide, vettori dell'adenovirus, vettori del virus associato all'adenovirus, vettori dell'herpes virus e vettori del retrovirus. In alcune forme di realizzazione detti vettori sono vettori adenovirali, e in particolare vettori adenovirali simici, sono generalmente noti nell'arte. Un certo numero di adenovirus ricombinanti con difetto di replicazione sono descritti per esempio in WO 2005/071093. I vettori che comprendono queste molecole di acido nucleico possono essere usati per la trasfezione o la trasformazione di una cellula ospite adatta di mammifero, pianta, batterio o lievito. La trasfezione o trasformazione pu? avvenire con qualsiasi metodo noto per l'introduzione di polinucleotidi in una cellula ospite. I metodi per l'introduzione di polinucleotidi eterologhi in cellule di mammifero sono ben noti nell'arte e comprendono la trasfezione mediata da destrano, la precipitazione di fosfato di calcio, la trasfezione mediata da polibrene, la fusione di protoplasti, l'elettroporazione, l'incapsulamento del polinucleotide (o dei polinucleotidi) in liposomi, nanoparticelle lipidiche e la microiniezione diretta del DNA nei nuclei. Inoltre, le molecole di acido nucleico possono essere introdotte in cellule di mammiferi tramite vettori virali. I metodi di trasformazione delle cellule sono ben noti nell'arte (vedi, ad esempio, i brevetti statunitensi n.
4.399.216, 4.912.040, 4.740.461 e 4.959.455, qui incorporati per riferimento).
Composizione immunogenica
In alcuni aspetti, l'invenzione fornisce una composizione immunogenica o un vaccino che comprende il polipeptide immunogenico o la molecola di acido nucleico o un vettore secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione qui descritte, facoltativamente comprendente uno o pi? adiuvanti.
La quantit? del composto immunogenico in ogni dose di vaccino ? selezionata come una quantit? che induce una risposta immunoprotettiva senza effetti collaterali avversi significativi nei vaccini tipici. Tale quantit? varia a seconda di quale immunogeno specifico viene impiegato e del tipo e della quantit? di adiuvante utilizzato. Una quantit? ottimale per un particolare vaccino pu? essere accertata da studi standard che prevedono l'osservazione dei titoli anticorpali e altre risposte nei soggetti. In generale, ci si aspetta che ogni dose comprenda l-1000?g di immunogeno, per esempio l-200?g, o 10-100?g. Una dose tipica conterr? 10-50?g, per esempio 15- 25?g, opportunamente circa 20?g di immunogeno. In alternativa, un approccio "dose-sparing" pu? essere utilizzato, per esempio in una situazione pandemica. Questo si basa sulla constatazione che ? possibile fornire lo stesso effetto protettivo utilizzando dosi inferiori di antigene, grazie alla presenza di un adiuvante efficace. Di conseguenza, ogni dose umana pu? contenere una quantit? significativamente inferiore di immunogeno, per esempio da 0,1 a 10 ?g, o da 0,5 a 5?g, o da 1 a 3?g, opportunamente 2?g di proteine per dose. Con il termine "dose umana" si intende una dose che ? in un volume adatto all'uso umano. Generalmente, questo ? compreso tra 0,3 e 1,5 ml. In una forma di realizzazione, una dose umana ? di 0,5 ml. Dopo una vaccinazione iniziale, i soggetti ricevono tipicamente una spinta dopo un intervallo da 2 a 4 settimane, per esempio un intervallo di 3 settimane, opzionalmente seguito da spinte ripetute per tutto il tempo in cui esiste un rischio di infezione. In una specifica forma di realizzazione dell'invenzione, viene fornito un programma di vaccinazione a dose singola, in cui una dose di composto immunogenico in combinazione con l'adiuvante ? sufficiente a fornire protezione contro la SARS CoV-2, senza la necessit? di alcun impulso dopo la vaccinazione iniziale. Le composizioni immunogeniche dell'invenzione possono essere fornite attraverso una variet? di vie come quella orale, topica, sottocutanea, mucosale (tipicamente intravaginale), intravenosa, intramuscolare, intranasale, sublinguale, intradermica e tramite supposta.
L'immunizzazione pu? essere profilattica o terapeutica. L'invenzione qui descritta riguarda principalmente ma non esclusivamente la vaccinazione profilattica contro la SARS-COV-2.
Appropriati trasportatori o eccipienti farmaceuticamente accettabili per l'uso nell'invenzione sono ben noti nell'arte e includono per esempio acqua o tamponi. La preparazione del vaccino ? generalmente descritta in Pharmaceutical Biotechnology, Vol.61 Vaccine Design - the subunit and adjuvant approach, a cura di Powell e Newman, Plenum Press New York, 1995. New Trends and Developments in Vaccines, a cura di Voller et al, University Park Press, Baltimora, Maryland, U.S.A. 1978.
In alcune forme di realizzazione le composizioni immunogeniche dell'invenzione possono inoltre comprendere uno o pi? coadiuvanti, come per esempio emulsione olio-in-acqua, minerale contenente, composizioni, formulazioni di saponina e altri coadiuvanti conosciuti nello stato dell'arte. I metodi di produzione delle emulsioni olio-in-acqua sono ben noti alla persona esperta nell'arte. Comunemente, il metodo comprende la miscelazione della fase oleosa (opzionalmente comprendente un tocol) con un tensioattivo come una soluzione PBS/TWEEN80?, seguita dall'omogeneizzazione con un omogeneizzatore. Le composizioni contenenti minerali adatte all'uso come coadiuvanti nella divulgazione includono i sali minerali, quali i sali di alluminio.e i sali di calcio. La divulgazione include sali minerali come idrossidi (ad esempio ossidrossidi), fosfati (ad esempio idrossifosfati, ortofosfati), solfati, ecc. (ad esempio, vedere i capitoli 8 e 9 di Vaccine design: the subunit and adjuvant approach (1995) Powell & Newman. ISBN 0-306-44867-X), o miscele di diversi composti minerali, con i composti che assumono qualsiasi forma adatta (ad esempio, gel, cristallino, amorfo, ecc.), e con adsorbimento preferito. Le composizioni contenenti minerali possono anche essere formulate come particelle di sale metallico. Vedere WO00/23105.
I polipeptidi, le molecole di acido nucleico, i vettori e le composizioni immunogeniche qui descritte riguardano principalmente ma non esclusivamente la vaccinazione profilattica contro la SARS-COV-2. L'immunizzazione pu? essere profilattica o terapeutica. I polipeptidi, le molecole di acido nucleico, i vettori e le composizioni immunogeniche qui descritte possono essere fornite attraverso una variet? di vie come quella orale, topica, sottocutanea, mucosale (tipicamente intravaginale), intravenosa, intramuscolare, intranasale, sublinguale, intradermica e tramite supposta. In alcune forme di realizzazione i polipeptidi, le molecole di acido nucleico, i vettori e le composizioni immunogeniche qui descritte sono per l'uso come vaccino contro l'infezione da SARS-CoV-2, in particolare per l'uso in un trattamento profilattico o terapeutico dell'infezione da SARS-CoV-2 o di condizioni o disturbi derivanti da tale infezione, pi? in particolare per l'uso nella prevenzione della malattia COVID-19.
La seguente sezione sperimentale ? fornita esclusivamente a titolo illustrativo e non limitativo e non intende limitare la portata dell'invenzione come definita nelle rivendicazioni allegate. Le rivendicazioni sono parte integrante della descrizione.
ESEMPI
1.1 Approccio di mutagenesi della proteina spike e della RBD di SARS-CoV-2
Sono stati utilizzati diversi approcci sperimentali per generare proteine spike e RBD mutate. Di seguito, riportiamo tre diversi approcci:
SARS-CoV-2 spike e mutagenesi di RBD. Attualmente nel nostro laboratorio utilizziamo la mutagenesi site specific per i nostri vettori spike e RBD. Specifici primer forward e reverse, che includono le mutazioni a punto singolo di interesse, vengono utilizzati per la PCR di estensione della sovrapposizione. Brevemente, la digestione con diversi enzimi come, ma non limitato a, AgeI e NheI sono utilizzati per aprire e linearizzare il plasmide. I primer vengono digeriti con enzimi omologhi e poi legati nei plasmidi linearizzati. I plasmidi mutati spike e RBD legati e circolarizzati sono subclonati in E. Coli. I batteri trasformati vengono coltivati e poi i plasmidi vengono purificati utilizzando GenElute HP Plasmid DNA Midiprep o Maxiprep Kit (Sigma-Aldrich). Dato che questo approccio ? attualmente utilizzato nel nostro laboratorio, siamo sicuri che avremo successo nell'introdurre queste mutazioni nello spike e nella RBD e generare i costrutti desiderati.
SARS-CoV-2 varianti di spike e RBD tramite librerie yeast-display. Un altro approccio che pu? essere utilizzato per produrre varianti di spike o RBD sono le librerie yeast-display. Brevemente, le librerie di mutanti contenenti una media di 2,7 mutazioni di aminoacidi per variante possono essere costruite nel picco e RBD. Le varianti generate possono essere collegate a sequenze di codici a barre uniche per facilitare il sequenziamento a valle e il monitoraggio delle diverse varianti generate (A. J. Greaney et al., Complete Mapping of Mutations to the SARS-CoV-2 Spike Receptor-Binding Domain that Escape Antibody Recognition. Cell Host & Microbe 29, 44-57.e49 (2021).
Stabilizzazione del picco SARS-CoV-2. L'intera proteina spike pu? essere ingegnerizzata per rimuovere il RBD. Un approccio per realizzare questo compito ? l'uso della progettazione di antigeni vaccinali basata sulla struttura che ? gi? stata usata per diversi patogeni umani come l'immunodeficienza umana-1 (HIV-1) e il virus respiratorio sinciziale (RSV) (B. S. Graham, M. S. A. Gilman, J. S. McLellan, Structure-Based Vaccine Antigen Design. Annual review of medicine 70, 91-104 (2019). Il successo di questa strategia si basa sulla stabilizzazione dell'antigene mutando i residui chiave che congeleranno l'antigene nella conformazione desiderata. Lo stesso approccio ? stato utilizzato per stabilizzare la proteina spike SARS-CoV-2 nella sua conformazione di prefusione sostituendo sei proline che portano a un costrutto con una maggiore resa di produzione e stabilit? (C.-L. Hsieh et al., Structure-based design of prefusion-stabilized SARS-CoV-2 spikes. 369, 1501-1505 (2020)). Usando lo stesso concetto, possiamo generare una versione mutata della proteina spike che non presenta il dominio RBD e usare le mutazioni selezionate per stabilizzare l'antigene appena generato senza perdere la conformazione tridimensionale originale.
1.2 Espressione della proteina spike SARS-CoV-2 e del RBD
Il plasmide che codifica la proteina spike SARS-CoV-2 e i costrutti RBD possono essere trasfettati transitoriamente a 1 ?g/mL nelle cellule Expi293F? (Thermo Fisher) usando il reagente ExpiFectamine? 293. Le cellule sono cresciute per sei giorni a 37 ?C con 8% CO2 agitando 125 rpm secondo il protocollo del produttore (Thermo Fisher); ExpiFectamine? 293 Transfection Enhancers 1 e 2 vengono aggiunti 16-18 ore dopo la trasfezione per aumentare la trasfezione, la vitalit? cellulare e l'espressione della proteina. Le colture cellulari vengono raccolte tre e sei giorni dopo la trasfezione. Le cellule sono separate dal mezzo mediante centrifugazione (1.100 g per 10 minuti a 24?C). Surnatanti raccolti vengono poi riuniti e chiarificati mediante centrifugazione (3.000 g per 15 min a 4 ? C) seguita da filtrazione attraverso un filtro da 0,45 ?m. Questo approccio ? gi? stato descritto e utilizzato nel nostro laboratorio per generare questi reagenti (E. Andreano et al., Extremely potent human monoclonal antibodies from convalescent Covid-19 patients.
2020.2010.2007.328302 (2020)).
1.3 Purificazione della proteina spike della SARS-CoV-2 e della RBD
La cromatografia viene condotta a temperatura ambiente utilizzando il sistema di purificazione ?KTA go della GE Healthcare Life Sciences. Le proteine espresse sono purificate utilizzando una cromatografia di affinit? metallica immobilizzata (FF Crude) seguita da dialisi in tampone finale. In particolare, il surnatante filtrato cultura ? purificato con un 5 mL HisTrap FF Crude colonna (GE Healthcare Life Sciences) precedentemente equilibrato in Buffer A (20 mM NaH2PO4, 500 mM NaCl 30 mM imidazol pH 7.4).
La velocit? di flusso per tutte le fasi della colonna HisTrap FF Crude ? di 5 mL/min. Il surnatante della coltura della proteina spike e della coltura cellulare RBD viene applicato a una singola colonna HisTrap FF Crude da 5 mL. La colonna viene lavata in Buffer A per 4 volumi di colonna (CV) con tutti e 4 i CV raccolti come lavaggio della colonna. Le proteine ricombinanti vengono eluite dalla colonna applicando una prima eluizione di 4 CV di 50% Buffer B (20 mM NaH2PO4, 500 mM NaCl 500 mM imidazol pH 7.4) e una seconda eluizione di 2 CV di 100% Buffer B. L'eluizione viene raccolta in 1 frazioni di 1 mL ciascuna. Le frazioni eluite vengono poi analizzate mediante SDS-PAGE e le frazioni appropriate contenenti proteine ricombinanti vengono raggruppate. I pool finali vengono dializzati contro la soluzione salina tampone fosfato (PBS) a pH 7.4 utilizzando Slide-A-Lyzer? G2 Dialysis Cassette 3.5K (Thermo Scientific) per una notte a 4?C. Il tampone di dialisi utilizzato ? almeno 200 volte il volume del campione. La concentrazione finale delle proteine viene determinata misurando l'A520 utilizzando il kit per il dosaggio delle proteine Pierce? BCA (Thermo Scientific? ). La proteina finale viene dispensata in aliquote di 0,5 ml ciascuna e conservata a -80?C. Questo approccio ? gi? stato descritto e utilizzato nel nostro laboratorio per purificare le proteine SARS-CoV-2 spike e RBD (10).
Elenco delle sequenze nella descrizione
SEQ ID NO:1 Proteina spike SARS-CoV-2
MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNV TWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNAT NVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQG NFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSY LTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVE KGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNS ASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGC VIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQ SYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLT ESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDV NCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQT QTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCT MYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGF NFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPP LLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIA NQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDK VEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGY HLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQR NFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDIS GINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTI MLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT
SEQ ID NO:2 Proteina spike SARS-CoV-2 con RBD cancellata
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SEQ ID NO: 3 SARS-CoV- 2 (E484K)
MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNV TWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNAT NVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQG NFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSY LTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVE KGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNS ASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGC VIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVKGFNCYFPLQ SYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLT ESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDV NCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQT QTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCT MYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGF NFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPP LLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIA NQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDK VEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANL
SEQ ID NO: 4 SARS-CoV- 2 proteina spike
(L455F)MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLP FFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIV NNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLE GKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLA LHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTL KSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADY SVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLP DDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRFFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFN CYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLT GTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAV LYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGIC ASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTS VDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKD FGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLT VLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYEN QKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDIL SRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAE
SEQ ID NO:5 Proteina spike SARS-CoV-2 (A475V)
MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNV TWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNAT NVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQG NFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSY LTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVE KGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNS ASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGC VIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQVGSTPCNGVEGFNCYFPLQ SYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLT ESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDV NCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQT QTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCT MYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGF NFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPP LLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIA NQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDK VEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANL
SEQ ID NO:6 Proteina spike SARS-CoV-2 (A475S)
MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNV TWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNAT NVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQG NFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSY LTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVE KGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNS ASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGC VIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQSGSTPCNGVEGFNCYFPLQS YGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTE SNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVN CTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQT NSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYI CGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQ ILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTD EMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQF NSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEA EVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANL
SEQ ID NO:7 Proteina spike SARS-CoV-2 (K417N)
MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNV TWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNAT NVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQG NFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSY LTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVE KGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNS ASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGC VIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQ SYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLT ESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDV NCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQT QTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCT MYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGF NFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPP LLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIA NQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDK VEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANL
SEQ ID NO:8 SARS-CoV-2 spike protein (S477N)
MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNV TWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNAT NVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQG NFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSY LTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVE KGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNS ASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGC VIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGNTPCNGVEGFNCYFPLQ SYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLT ESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDV NCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQT QTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCT MYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGF NFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPP LLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIA NQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDK VEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGY HLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQR NFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDIS GINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTI MLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT
SEQ ID NO:9 SARS-CoV-2 spike protein ( E484K, L455F, A475V, K417N, S477N)
MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNV TWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNAT NVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQG NFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSY LTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVE KGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNS ASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGC VIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRFFRKSNLKPFERDISTEIYQVGNTPCNGVKGFNCYFPLQ SYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLT ESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDV NCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQT QTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCT MYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGF NFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPP LLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIA NQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDK VEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGY HLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQR NFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDIS GINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTI MLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT
Claims (15)
1. Polipeptide immunogenico comprendente o costituito da un dominio di legame al recettore (RBD) della proteina spike di SARS-CoV-2, in cui detto dominio di legame al recettore (RBD) ? eliminato o mutato per evitare l'espansione delle linee germinali delle cellule B IGHV3-53 e/o IGHV3-66.
2. Il polipeptide immunogenico secondo la rivendicazione 1, in cui uno o pi? dei residui di detto dominio di legame al recettore (RBD) nelle posizioni 455, 456, 473, 475, 420, 421, 457, 460, 484, 415, 417, 477 sono eliminati o mutati, in cui la numerazione di tali posizioni si riferisce a SEQ ID NO:1.
3. Il polipeptide immunogenico secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui detto dominio di legame al recettore (RBD) ha una o pi? delle seguenti mutazioni: E484K, L455F, A475V, A475S, K417N, S477N
4. Il polipeptide immunogenico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3, in cui detto polipeptide immunogenico comprende o consiste nella proteina spike di SARS-CoV-2, avente SEQ ID NO:1, in cui uno o pi? dei residui di detto dominio di legame al recettore (RBD) nelle posizioni 455, 456, 473, 475, 420, 421, 457, 460, 484, 415, 417, 477 sono eliminati o mutati.
5. Il polipeptide immunogenico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4, in cui detto polipeptide immunogenico ha una sequenza selezionata tra SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 o SEQ ID NO:9.
6. Il polipeptide immunogenico comprendente o costituito dalla proteina spike di SARS-CoV-2 mutata, in cui il dominio di legame al recettore (RBD) viene rimosso da detta proteina spike per evitare l'espansione delle linee germinali delle cellule B IGHV3-53 e/o IGHV3-66.
7. Il polipeptide immunogenico secondo la rivendicazione 6 comprendente solo il dominio N-terminale (NTD) della subunit? S1 e la subunit? S2 di detta proteina spike di SARS-CoV-2 mutata, in particolare detta proteina spike SARS-CoV-2 mutata ha SEQ ID NO:2.
8. Una molecola di acido nucleico isolata comprendente una sequenza nucleotidica che codifica il polipeptide immunogenico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 7.
9. Una molecola di acido nucleico isolata secondo la rivendicazione 8, in cui detta molecola di acido nucleico ? una sequenza di DNA o mRNA.
10. Un vettore comprendente la molecola dell'acido nucleico secondo la rivendicazione 8 o 9, in cui il vettore comprende facoltativamente una sequenza di controllo dell'espressione operativamente collegata alla molecola dell'acido nucleico, preferibilmente detto vettore ? selezionato tra vettori virali ad RNA, vettori virali a DNA, vettori virali del plasmide, vettori adenovirali, vettori virali associati all'adenovirus, vettori dell'herpes virus e vettori retrovirali.
11. Il polipeptide immunogenico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 7 o la molecola di acido nucleico secondo la rivendicazione 8 o 9 o un vettore secondo la rivendicazione 10, per l'uso come vaccino contro l'infezione da SARS-CoV-2.
12. Il polipeptide immunogenico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 7 o la molecola di acido nucleico secondo la rivendicazione 8 o 9 o un vettore secondo la rivendicazione 10, per l'uso in un trattamento profilattico o terapeutico dell'infezione da SARS-CoV-2 o condizioni o disturbi derivanti da tale infezione, in particolare la malattia COVID-19.
13. Una composizione immunogenica comprendente secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 7 o la molecola di acido nucleico secondo la rivendicazione 8 o 9 o un vettore secondo la rivendicazione 10.
14. La composizione immunogenica secondo la rivendicazione 13 ulteriormente comprendente uno o pi? adiuvanti.
15. La composizione immunogenica secondo la rivendicazione 13 o 14, per l'uso nella prevenzione o nel trattamento dell'infezione da SARS-CoV-2 o di condizioni o disturbi derivanti da tale infezione, in particolare la malattia COVID-19.
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