CN113164584A - 免疫原性组合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明在治疗和/或预防病毒感染的领域中。具体而言，本发明涉及包含编码流感病毒抗原的自我复制RNA分子的免疫原性或药物组合物，其用于治疗和/或预防流感感染。

Description

免疫原性组合物及其用途
关于资助的研究的声明
本发明在由DARPA授予的协议号HR0011-12-3-0001的政府支持下进行。政府在本发明中具有某些权利。导致本发明的工作还接受在REA授予协议号626283下的来自欧盟第七框架计划(FP7/2007-2013)的人民计划(Marie Curie行动)资助。
发明领域
本发明处于治疗和/或预防病毒感染的领域中。具体而言，本发明涉及包含编码流感病毒抗原的自我复制RNA分子的免疫原性或药物组合物，其用于治疗和/或预防流感感染。
发明背景
流感(flu)病毒感染每年在全世界导致数千例死亡，并且造成总计数十亿美元的经济负担。疫苗是预防和控制该疾病的主要工具，但由于流感病毒频繁变化，因此每年必须重新配制疫苗。可用的流感疫苗是毒株特异性的，并且仅提供针对疫苗毒株病毒的保护。由病毒表面蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的频繁突变导致的季节性抗原性变化使得前一季的疫苗在第二年在很大程度上无效。此外，由于抗原性转移促成的流感流行性的不可预测性需要不断的监视和大量投资，以维持准备水平。鉴于这些限制，迫切需要开发新型流感疫苗，所述新型流感疫苗提供针对多种毒株和亚型(包括未来的流行性毒株)的持久保护。
活减毒流感疫苗(LAIV)和灭活流感疫苗(IIV)目前用于所有年龄组中的接种疫苗。已经发现两种疫苗均在人和动物中诱导同源和异源免疫。然而，佐剂化的亚单位或分裂疫苗已显示诱导强烈的HA-特异性CD4 T-细胞应答和具有更多样性库的高滴度HA-特异性抗体(Dormitzer等人 Immunol Rev 2011;239:167-77和Khurana等人, Sci Transl Med2011;3:85ra48. Doi:10.1126/scitranslmed.3002336)。这些疫苗的繁琐生产过程涉及感染性病毒在鸡蛋中的大规模生产，并且作为结果，疫苗病毒的抗原结构域被改变。因此，需要开发新的方法来避免可以改变疫苗病毒以及所得疫苗的有效性的复杂生产过程，并且提供显示针对流感病毒的多种毒株和/或亚型的保护的疫苗。
发明概述
本文在第一个方面提供了免疫原性组合物，其包含：(i)第一自我复制RNA分子，其编码包含第一抗原的多肽，和(ii)第二自我复制RNA分子，其编码包含第二抗原的多肽，其中所述第一和第二抗原均来自流感病毒，但所述第一抗原来自与所述第二抗原不同的流感病毒毒株。
在进一步方面，提供了：
- 药物组合物，其包含上述免疫原性组合物和药学上可接受的载体，
- 上述免疫原性组合物或药物组合物，其用作疫苗，
- 上述免疫原性组合物或药物组合物，其用于预防流感，
- 针对流感疾病预防和/或治疗的方法，其包括将上述免疫原性组合物或药物组合物施用于有此需要的人，
- 用于诱导受试者中针对流感病毒感染的免疫应答的方法，其包括向所述受试者施用免疫学有效量的上述药物组合物或免疫原性组合物，
- 针对流感疾病预防和/或治疗的方法，其包括(i)施用包含第一自我复制RNA分子和药学上可接受的载体的第一免疫原性组合物，和(ii)同时或依次施用包含第二自我复制RNA分子和药学上可接受的载体的第二免疫原性组合物，其中所述第一和第二自我复制RNA分子编码多肽，所述多肽编码来自流感病毒的抗原，但所述第一自我复制RNA分子编码来自与由所述第二自我复制RNA分子编码的抗原不同的流感毒株的抗原，
- 包含第一自我复制RNA分子和药学上可接受的载体的第一免疫原性组合物，其用于预防流感疾病的方法中，所述方法包括向有此需要的受试者施用所述第一免疫原性组合物，随后施用包含自我复制RNA分子和药学上可接受的载体的第二免疫原性组合物，其中所述第一和第二自我复制RNA分子各自编码包含抗原的多肽，其中所述抗原来自流感病毒，但由所述第一自我复制RNA分子编码的抗原来自与由所述第二自我复制RNA分子编码的抗原不同的流感病毒毒株，
- 制备如上所述的免疫原性组合物的方法，所述方法包括：(i)提供至少一种形成纳米颗粒的脂质；(ii)提供包含所述自我复制RNA分子的水溶液；和(iii)将(ii)的水溶液和(i)的至少一种脂质组合，由此制备所述组合物。
制备如上所述的免疫原性组合物的方法，所述方法包括：(i)提供水包油乳剂；(ii)提供包含所述自我复制RNA分子的水溶液；和(iii)将(ii)的水溶液和(i)的水包油乳剂组合，由此制备所述组合物。
图/附图描述
图1：双顺反子SAM (H5-H1)的示意图表示和表征。(a)用于测试HA基因的多重表达的双顺反子复制子构建体。(b)在用H1-SAM转染(泳道1)、H5-SAM转染(泳道3)、H5H1-SAM转染(泳道4)或模拟物处理(泳道3)的BHK细胞中的HA蛋白表达。细胞裂解物通过非还原SDS-PAGE分析，随后通过用HA-毒株特异性血清进行Western印迹分析：i)用于检测H1的抗A/California/07/2009 (H1N1) HA血清(NIBSC, London, UK)；ii)用于检测H5的抗A/turkey/Turkey/1/05 (H5N1) HA血清(NIBSC, London, UK)。HA的单体形式由星号(62kDa)指示。SGP =亚基因组启动子；H1 =来自甲型流感/California/07/2009 (H1N1)病毒毒株的H1 HA基因；H5 =来自A/turkey/Turkey/01/2005 (H5N1)病毒毒株的H5 HA基因；2A =全长2A-驱动的序列；nsPs=非结构复制子蛋白；HA *单体。
图2：SAM单顺反子和双顺反子SAM(HA)/LNP候选疫苗的免疫原性。小鼠(n =10)在第0天和第21天用0.1 µg的SAM(H1)、SAM(H5)、SAM(H5-H1)和SAM(H1)+SAM(H5) i.m.免疫。在第二次免疫后2周收集血清和脾脏。针对A/California/07/2009 (H1N1)、A/turkey/Turkey/5/2005 (H5N1)、A/PR/8/1934 (H1N1)和A/Perth/16/2009 (H3N2)-特异性HI滴度分析血清样品(a、b、c、d)。脾细胞(n= 6)在体外用H1-Cal、H1-PR8和H5-turkey肽合并物刺激(e至m)，并且通过流式细胞术分析T细胞的细胞因子产生。各条代表表达细胞因子的H1-Cal、H5-turkey、H1-PR8-特异性CD4+ T细胞(e至g)和CD8+ T细胞(h至j)的累积频率。CD8的CD107a表达(k至m)。
使用Mann-Whitney U检验进行统计分析。**P<0.01，***P<0.001。
图3：多价SAM(HA)/LNP候选疫苗的比较免疫原性。小鼠(n =10)在第0天和第21天用PBS [第1组]和SAM(H3-Biltho)+SAM(H3-Bang)+SAM(H3-Fuj)的组合[第2组]；SAM (H3-Beij)+SAM(H3-Bris)+SAM(H3-Tex) [第3组]；SAM(H1-Cal)+SAM(H1-PR8)+SAM(H5-turkey)+SAM (H7-Shan) [第4组]；SAM(H3-Biltho)+SAM(H3-Bang)+SAM(H3-Fuj)+SAM(H3-Beij)+SAM(H3-Bris)+SAM(H3-Tex) [第5组]和SAM(H3-Biltho)+SAM(H3-Bang)+SAM(H3-Fuj)+SAM(H3-Beij)+SAM(H3-Bris)+SAM(H3-Tex)+SAM(H1-Cal)+SAM(H1-PR8)+SAM(H5-turkey)+SAM(H7-Shan) [第6组] i.m.免疫。在第二次免疫后2周收集血清样品。用同源(a至g)和异源(h至l)流感病毒抗原针对HA-特异性HI滴度分析血清样品。使用Mann-Whitney U检验进行统计分析。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001, ns；不显著)。
图4：由多价SAM(HA)/LNP候选疫苗诱导的比较CD4+ T-细胞应答。小鼠在第0天和第21天用PBS [第1组]和SAM(H3-Biltho)+SAM(H3-Bang)+SAM(H3-Fuj)的组合[第2组]；SAM(H3-Beij)+SAM(H3-Bris)+SAM(H3-Tex) [第3组]；SAM(H1-Cal)+SAM(H1-PR8)+SAM(H5-turkey)+SAM (H7-Shan) [第4组]；SAM(H3-Biltho)+SAM(H3-Bang)+SAM (H3-Fuj)+SAM(H3-Beij)+SAM(H3-Bris)+SAM(H3-Tex) [第5组]和SAM(H3-Biltho)+SAM(H3-Bang)+SAM(H3-Fuj)+SAM(H3-Beij)+SAM(H3-Bris)+SAM(H3-Tex)+SAM(H1-Cal)+SAM(H1-PR8)+SAM(H5-turkey)+SAM (H7-Shan) [第6组] i.m.免疫。脾细胞(n= 6)在体外用HA肽合并物(d至f和i)和重组HA蛋白(a至c、g、h和j至l)刺激。通过流式细胞术针对细胞因子产生分析CD4+ T-细胞介导的同源(a至f)和异源(g至l)应答。各条代表产生细胞因子的CD4+ T细胞的累积频率。
图5：显示用于实施例5的免疫时间表的示意图。
图6：在位置7562-9256处含有H5 HA A/turkey/turkey的插入物的TC83载体的图示图谱。
图7：RNA质量和HA H3基因表达的证实。(A)在变性琼脂糖凝胶上分析编码H3抗原的SAM载体。(B)将编码H3抗原的SAM载体瞬时感染至BHK细胞中，并将细胞裂解物进行SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)，且最后印迹至硝酸纤维素膜。通过使用H3-特异性多克隆抗体的Western印迹将H3表达可视化。
发明详述
在本研究中，通过应用完全合成的新型自我扩增mRNA (SAM)疫苗技术，开发了多价疫苗候选物并在Balb/c小鼠模型中测试免疫原性。制备包含两种或更多种以单顺反子或双顺反子形式表达来自H3N2、H1N1、H5N1和H7N9亚型的全长HA的SAM载体的疫苗，并封装在脂质纳米颗粒(LNP)中。表明在小鼠中，在第二次免疫后3周，SAM(H1)、SAM(H5)、SAM(H5-H1)或SAM(H1)+SAM(H5)诱导CD4+或CD8+ T-细胞介导的异源应答。然而，单顺反子和双顺反子SAM载体的这种比较表明，在单一SAM载体中的两种不同流感抗原的组合在加强功能性抗体应答中不如单顺反子SAM载体有效。制备3、4、6或10种单顺反子SAM(HA)载体的混合物，并且其能够在小鼠中诱导可检测到的交叉反应性B和T-细胞应答。因此，本发明人已经首次显示能够在Balb/c小鼠中诱导针对同源和异源流感病毒的广泛保护性免疫应答的SAM(HA)多价疫苗。
自我复制RNA分子
本发明的免疫原性组合物包含自我复制RNA分子，每种自我复制RNA分子编码包含抗原的多肽。
自我复制RNA分子是本领域中众所周知的，并且可以通过使用衍生自例如甲病毒的复制元件并用编码目标蛋白的核苷酸序列取代结构病毒蛋白来产生。自我复制RNA分子通常是+-链分子，其可以在递送至细胞之后直接翻译，并且该翻译提供了RNA-依赖性RNA聚合酶，其然后从递送的RNA产生反义和有义转录物。因此，递送的RNA导致产生多种子代RNA。这些子代RNA以及共线的亚基因组转录物可以自身翻译以提供编码的抗原(即流感病毒抗原)的原位表达，或者可以转录以提供与递送的RNA同义的另外的转录物，将其翻译以提供所述抗原的原位表达。该转录序列的总体结果是引入的复制子RNA的数目的大量扩增，且因此编码的抗原变为细胞的主要多肽产物。
用于以这种方式实现自我复制的一种合适系统是使用基于甲病毒的复制子。这些复制子是+-链(正有义链)RNA，其导致在递送至细胞后复制酶(或复制酶-转录酶)的翻译。所述复制酶被翻译为多蛋白，其自动切割以提供复制复合物，所述复制复合物产生+-链递送RNA的基因组链拷贝。这些负(-)-链转录物本身可以被转录以产生+-链亲代RNA的进一步拷贝，并且还产生编码所述抗原的亚基因组转录物。所述亚基因组转录物的翻译因此导致感染的细胞原位表达所述抗原。合适的甲病毒复制子可以使用来自辛德比斯病毒、塞姆利基森林病毒、东部马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒等的复制酶。可以使用突变型或野生型病毒序列，例如，已经在复制子中使用VEEV的减毒TC83突变体，参见以下参考文献：WO2005/113782，其上下文通过引用并入。
在一个实施方案中，本文所述的每种自我扩增RNA分子编码(i)可以从自我复制RNA分子转录RNA的RNA-依赖性RNA聚合酶和(ii)包含来自流感病毒的抗原的多肽。所述聚合酶可以是甲病毒复制酶，例如，包含甲病毒蛋白nsP1、nsP2、nsP3和nsP4中的一种或多种。
尽管天然的甲病毒基因组除了非结构复制酶多蛋白以外还编码结构病毒粒子蛋白，但在某些实施方案中，所述自我复制RNA分子不编码甲病毒结构蛋白。因此，所述自我复制RNA可以导致在细胞中产生其自身的基因组RNA拷贝，但不导致含有RNA的病毒粒子的产生。无法产生这些病毒粒子意味着，与野生型甲病毒不同，所述自我复制RNA分子无法以感染性形式自我永存。在野生型病毒中永存所必需的甲病毒结构蛋白在本公开的自我复制RNA中不存在，并且它们的位置被编码目标免疫原的基因占用，使得所述亚基因组转录物编码免疫原而不编码结构甲病毒病毒粒子蛋白。
因此，可用于本发明的自我复制RNA分子可以具有两个开放阅读框。第一(5')开放阅读框编码复制酶；第二(3')开放阅读框编码包含来自流感病毒的抗原的多肽。在一些实施方案中，所述RNA可以具有额外(例如下游)开放阅读框，例如编码另外的抗原或编码辅助多肽。
在某些实施方案中，本文公开的自我复制RNA分子具有5'帽(例如7-甲基鸟苷)。该帽可以增强RNA的体内翻译。在一些实施方案中，必须选择所述自我复制RNA分子的5'序列以确保与编码的复制酶的相容性。
自我复制RNA分子可以具有3'聚-A尾部。其还可以在其3'末端附近包括聚-A聚合酶识别序列(例如AAUAAA)。
自我复制RNA分子可以具有各种长度，但其通常为5000-25000个核苷酸长。自我复制RNA分子将通常是单链的。单链RNA通常可以通过结合TLR7、TLR8、RNA解旋酶和/或PKR来起始佐剂作用。以双链形式递送的RNA(dsRNA)可以结合TLR3，并且该受体也可以由dsRNA触发，所述dsRNA在单链RNA的复制期间或在单链RNA的二级结构内形成。
可以通过体外转录(IVT)方便地制备所述自我复制RNA。IVT可以使用(cDNA)模板，其以质粒形式在细菌中产生和繁殖，或者(例如通过基因合成和/或聚合酶链式反应(PCR)工程改造方法)合成产生。例如，DNA-依赖性RNA聚合酶(诸如噬菌体T7、T3或SP6 RNA聚合酶)，可用于从DNA模板转录自我复制RNA。可以根据需要使用适当的加帽和聚-A添加反应(尽管所述复制子的聚-A通常在DNA模板内编码)。这些RNA聚合酶可以对转录的一个或多个5'核苷酸具有严格的要求，并且在一些实施方案中，这些要求必须与编码的复制酶的要求相匹配，以确保IVT-转录的RNA可以作为其自身编码的复制酶的底物有效地发挥功能。
(除了任何5'帽结构以外)，自我复制RNA可以包括一个或多个具有修饰的核碱基的核苷酸。理想地，用于本发明的RNA在核苷之间仅包括磷酸二酯键，但在一些实施方案中，其可以含有氨基磷酸酯、硫代磷酸酯和/或甲基膦酸酯键。
所述自我复制RNA分子可以编码单一异源多肽抗原(即，来自流感病毒的抗原)，或任选地，以所述序列各自当表示为氨基酸序列时保留其同一性的方式连接在一起(例如，串联连接)的两个或更多个异源多肽抗原。从所述自我复制RNA生成的异源多肽然后可以作为融合多肽产生，或以产生分开的多肽或肽序列的方式进行工程改造。编码单一异源多肽抗原的自我复制RNA分子可以被称为如本文所述的“单顺反子的”。编码多于一种、诸如两种分开的异源多肽抗原的自我复制RNA分子可以分别被称为“多顺反子的”或“双顺反子的”。优选地，根据本发明的自我复制RNA分子是单顺反子的。
可以将本文所述的自我复制RNA分子进行工程改造以从两个或更多个开放阅读框表达多个核苷酸序列，由此允许蛋白、诸如一种、两种或更多种流感病毒抗原与细胞因子或其他免疫调节剂(其可以增强免疫应答的生成)一起共表达。可替代地或另外，流感病毒抗原，例如HA抗原是每种自我复制RNA分子中唯一来自流感病毒的抗原。
如果期望，可以使用本领域技术人员已知的各种体外或体内测试方法来筛选或分析所述自我复制RNA分子，以证实其治疗和预防特性。例如，可以测试包含自我复制RNA分子的疫苗对诱导特定目标淋巴细胞类型(例如，B细胞、T细胞、T细胞系和T细胞克隆)的增殖或效应功能的作用。例如，可以分离来自免疫小鼠的脾细胞，并且细胞毒性T淋巴细胞裂解含有编码来自流感病毒的抗原的自我复制RNA分子的自体靶标细胞的能力。另外，T辅助细胞分化可以通过如下分析：通过ELISA或通过细胞质细胞因子染色和流式细胞术直接在CD4+T细胞中测量TH1(IL-2和IFN-γ)和/或TH2(IL-4和IL-5)细胞因子的增殖或产生。
还可以测试编码来自流感病毒的抗原的自我复制RNA分子诱导体液免疫应答的能力，如例如通过对于目标流感病毒抗原特异性的抗体的B细胞产生的诱导所证明。可以使用例如来自免疫个体的外周B淋巴细胞进行这些测定。此类测定方法是本领域技术人员已知的。可用于表征自我复制RNA分子的其他测定法可以涉及检测由靶标细胞对编码的流感病毒抗原的表达。例如，FACS可用于检测在细胞表面上或细胞内的抗原表达。FACS选择的另一个优点是可以分选不同表达水平；有时可能期望较低的表达。用于鉴定表达特定抗原的细胞的其他合适方法涉及使用板上的单克隆抗体的淘选或使用包被有单克隆抗体的磁珠的捕获。
在一些实施方案中，所述自我复制RNA分子包含编码以下的序列：(i) RNA依赖性RNA聚合酶，其可以从自我复制RNA分子转录RNA和(ii)包含来自流感病毒的抗原的多肽。聚合酶可以是甲病毒复制酶，例如包含甲病毒蛋白nsP1、nsP2、nsP3和nsP4中的一种或多种。
在某些实施方案中，根据本发明的免疫原性组合物包含自我复制分子，其中每种自我复制RNA分子包含编码以下的序列：(i)可以从所述自我复制RNA分子转录RNA的甲病毒复制酶，和(ii)包含血凝素(HA)或其免疫原性片段或变体的多肽。优选地，包含HA或其免疫原性片段或变体的多肽是在所述自我复制RNA分子中编码的唯一异源多肽。通常，所述HA或其免疫原性片段或变体是所述自我复制RNA分子中的唯一的来自流感病毒的抗原。
例如，所述自我复制RNA分子可以包含由SEQ ID NO:2的DNA序列或与SEQ ID NO:2具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性的DNA序列编码的RNA序列。在一个具体实施方案中，所述自我复制RNA分子包含由与SEQ ID NO:2具有至少90%同一性的DNA序列编码的RNA序列。在一些实施方案中，所述自我复制RNA分子包含由SEQ ID NO:2的全长序列的片段编码的RNA序列，其中所述片段包含所述全长序列的核酸序列的连续延伸段，其比所述全长序列短最多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30个核酸。在一个具体实施方案中，所述自我复制RNA分子包含由SEQID NO:2的片段编码的RNA序列，其中所述片段包含全长的核酸序列的连续延伸段，但比全长序列短最多达15个核酸。
如本文所公开的免疫原性组合物可以包含自我复制分子，所述自我复制分子各自包含由与SEQ ID NO:2具有至少90%同一性的DNA序列编码的RNA序列，其中由每种自我复制RNA分子编码的来自流感病毒的抗原是HA或其免疫原性片段或变体，且其中HA或其免疫原性片段或变体是每种自我复制RNA分子中的唯一的来自流感病毒的抗原。在此类实施方案中，对于每种自我复制RNA分子，所述HA可以来自流感病毒的相同亚型(亚型内)或来自流感病毒的不同亚型(异亚型)。
包含来自流感病毒的抗原的多肽
本发明的自我复制RNA分子编码包含来自流感病毒的抗原的多肽。在某些实施方案中，编码的抗原是野生型流感病毒多肽序列，或者是其片段或变体。
多肽抗原序列的“变体”包括当与参考序列相比时具有一个或多个氨基酸取代、插入和/或缺失的氨基酸序列。所述变体可以包含与全长野生型多肽、例如与根据SEQ ID NO:4、6、8、10、12、14、16、18、20或22中任一个的多肽具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性的氨基酸序列。可替代地或另外，多肽抗原的片段可以包含全长多肽的免疫原性片段(即，含有表位的片段)，其可以包含至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或更多个与所述全长多肽的连续氨基酸序列相同的氨基酸的连续氨基酸序列。
当与全长多肽相比时，多肽的片段可以包含N-和/或C-末端缺失，其中所述片段包含从全长序列的N-末端、C-末端或N-末端和C-末端两者的最多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个氨基酸的缺失。可以指定所述缺失是连续氨基酸的缺失。
如本文所用，术语“抗原”是指含有一个或多个表位(例如，线性、构象或两者)的分子，其将刺激宿主的免疫系统以产生体液和/或细胞抗原-特异性免疫应答(即，特异性识别抗原多肽的免疫应答)。“表位”是抗原的决定其免疫学特异性的该部分。
可以将感染人的流感病毒分为3种类型：甲、乙和丙。甲型流感病毒可以基于其HA(18种亚型；H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17和H18)和NA蛋白(11种亚型，N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9、N10和N11)进一步分为不同的亚型。甲型流感病毒可以进一步分为不同的毒株。乙型流感病毒目前不展示不同的HA亚型，但乙型流感病毒毒株确实落入两个不同的谱系。这些谱系出现在1980年代后期，并且具有可以在抗原和/或遗传上彼此区分的HA。目前流行的乙型流感病毒毒株属于以下两种谱系之一：B/Victoria或B/Yamagata。WHO在1979年接受了一项国际公认的流感病毒命名惯例，并且在1980年2月在Bulletin of the World Health Organization, 58(4):585-591(1980)(“A revision of the system of nomenclature for influenza viruses: A WHO memorandum”)中出版。该方法使用命名系统中的许多组分，包括抗原类型(甲型、乙型或丙型)，地理来源，分离的年份和毒株编号。目前，每年的流感疫苗中都包括甲型流感(H1N1)、甲型流感(H3N2)和一种或两种乙型流感毒株。
在本发明的意义上，术语“流感亚型”应理解为具有给定的H亚型或给定的N亚型的甲型流感病毒毒株，并且术语“不同的亚型”是指不共享相同的H亚型或相同的N亚型的流感病毒毒株。“亚型内”是指相同流感亚型内的毒株，例如H1、H2、H3等HA亚型的毒株。“异亚型”是指来自不同流感亚型的毒株，例如来自H1亚型的毒株相比于来自H3亚型的毒株。
甲型流感病毒连续进化并经历抗原变异。病毒RNA聚合酶缺乏有效的校对导致高转录错误率，这可以导致表面糖蛋白(诸如HA和NA蛋白)中的氨基酸取代。这被称为“抗原性漂移”。分段的病毒基因组允许第二类型的抗原变异。如果两种流感病毒同时感染宿主细胞，则称为“抗原性转移”的基因重配可以生成具有新表面或内部蛋白的新型病毒。这些抗原性变化，‘漂移'和‘转移'两者，都是无法预测的，并且从免疫学观点来看可能具有急剧影响，因为它们最终导致新流感病毒毒株的出现，并这使得病毒能够逃避免疫系统，引起众所周知、几乎每年的流行。这两种基因修饰都已经引起导致人类中的流行的新病毒变体。
本发明的自我复制RNA分子可以编码来自流感病毒的任何类型(甲型、乙型、丙型)和任何亚型(H1至H18和N1至N11)的流感抗原或其免疫原性片段或变体。通过实例的方式，如本文所述的自我复制RNA分子可以编码多肽，所述多肽编码来自流感病毒的抗原，其中来自流感病毒的抗原包含SEQ ID NO:4、6、8、10、12、14、16、18、20或22中任一个的多肽序列或其免疫原性片段或变体。在一个具体实施方案中，来自流感病毒的抗原包含SEQ ID NO:4、6、8、10、12、14、16、18、20或22中任一个的序列。或者，来自流感病毒的抗原包含与SEQ IDNO:4、6、8、10、12、14、16、18、20或22中任一个的序列具有至少90%同一性的氨基酸序列的变体或由其组成。可替代地或另外，来自流感病毒的抗原包含免疫原性片段或由其组成，所述免疫原性片段包含从SEQ ID NO:4、6、8、10、12、14、16、18、20或22中任一个的全长序列的N-末端、C-末端或N-末端和C-末端两者缺失最多达20个氨基酸。
合适地，由根据本发明的自我复制RNA分子编码的流感病毒抗原来自流行性毒株。流行性毒株意指一种新的流感病毒，大多数人群对其没有免疫力。在整个文件中，“流行性毒株”将是指与流行性流感疾病的爆发相关或可能与流行性流感疾病的爆发相关的流感病毒毒株，诸如流行性流感甲型病毒毒株。可能与流行性病爆发相关的毒株可能包括已感染人且不是人类中的流行的季节性流感毒株(例如不是甲型流感(H1N1)或甲型流感(H3N2)的毒株或Victoria或Yamagata谱系的乙型毒株)的毒株(例如动物流感病毒毒株)。与流行性爆发相关或可能与流行性相关的流行性毒株是本领域技术人员已知的，并且由WHO根据国际公认的标准(参见“Pandemic influenza preparedness and response” A WHOGuidance document, 2009, IBSN 9789241547680)确定。
合适的流行性毒株是H1、H2、H5、H6、H7或H9亚型甲型流感病毒毒株，例如H5N1、H5N3、H2N2、H6N1、H9N2、H7N7、H2N2、H7N1、H7N9和H1N1。在H5亚型内，病毒可能落入不同的进化枝。人中其他合适的流行性毒株是H7N3、H10N7和H5N2。或者，流感病毒抗原可以来自流行的季节性毒株，即非流行性毒株。
在某些实施方案中，来自流感病毒的抗原是血凝素(HA)或神经氨酸酶(NA)或任何其他抗原，诸如基质蛋白2 (M2)、基质蛋白1 (M1)、核蛋白(NP)、PB1或PB2或其免疫原性片段或变体。优选地，所述抗原是HA或其免疫原性片段或变体。
除了来自流感病毒的抗原以外，根据本发明的多肽还可以包含一种或多种异源氨基酸序列(例如另一种抗原序列、另一种信号序列、可检测标签等)。例如，本文的多肽可以是融合蛋白。
核酸及其制备
本文公开了核酸分子，诸如DNA或RNA，其包含编码包含来自流感病毒的抗原的多肽的序列。在根据本发明的免疫原性组合物中，所述自我复制RNA分子包含RNA形式的此类序列。本文还公开了自我复制RNA分子形式的核酸，其具有或不具有编码包含来自流感病毒的抗原的多肽的异源序列。
核酸可以以许多方式制备，例如，通过全部或部分化学合成，通过使用核酸酶(例如限制性酶)消化更长的核酸，通过接合较短的核酸或核苷酸(例如使用连接酶或聚合酶)，从基因组或cDNA文库等制备。例如，可以制备编码包含来自流感病毒的抗原的多肽的cDNA模板。此类cDNA模板可以在细菌中以质粒形式产生和繁殖，或者合成产生(例如通过基因合成和/或聚合酶链式反应(PCR)工程改造方法)。编码本发明的多肽的RNA序列可以例如通过体外转录(IVT)制备，所述通过体外转录(IVT)可以使用DNA依赖性RNA聚合酶(诸如噬菌体T7、T3或SP6 RNA聚合酶)从cDNA模板转录RNA。
术语“核酸”通常意指任何长度的核苷酸的聚合形式，其含有脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或其类似物。其包括DNA、RNA、DNA/RNA杂合物。其还包括DNA或RNA类似物，诸如含有修饰的骨架(例如肽核酸(PNA)或硫代磷酸酯)或修饰的碱基的那些。因此，本发明的核酸包括mRNA、自我复制的RNA、DNA、cDNA、重组核酸、支链核酸、质粒、载体等。在所述核酸采取RNA的形式的情况下，其可以具有或可以不具有5'帽。
本文的核酸包含编码包含来自流感病毒的抗原的多肽的序列。通常，本发明的核酸将呈重组形式，即自然界中不存在的形式。例如，除了编码来自流感病毒的抗原的序列以外，所述核酸还可以包含一个或多个异源核酸序列(例如，编码另一抗原的序列和/或控制序列，诸如启动子或内部核糖体进入位点)。所述核酸可以是载体的一部分，即，经设计用于转导/转染一种或多种细胞类型的核酸构建体的一部分。载体可以是例如经设计用于在宿主细胞中表达核苷酸序列的“表达载体”，或经设计以导致产生重组病毒或病毒样颗粒的“病毒载体”。
可以对编码上述多肽的核酸进行密码子优化。“密码子优化”意为就可以增加核酸的翻译效力和/或半衰期的密码子使用而言的修饰。可以将聚A尾部(例如，约30个或更多个腺苷残基的)附接至RNA的3'末端以增加其半衰期。RNA的5'末端可以用具有结构m7G (5')ppp(5')N(帽0结构)的修饰的核糖核苷酸或其衍生物加帽，所述修饰的核糖核苷酸或其衍生物可以在RNA合成期间并入或可以在RNA转录之后酶促工程改造(例如，通过使用由以下组成的牛痘病毒加帽酶(VCE)：mRNA三磷酸酶、鸟苷基-转移酶和鸟嘌呤-7-甲基转移酶，其催化N7-单甲基化帽0结构的构建)。帽0结构在维持RNA分子的稳定性和翻译效力中发挥重要作用。RNA分子的5'帽可以通过2'-O-甲基转移酶进一步修饰，其导致生成帽1结构(m7Gppp [m2'- O] N)，其可进一步增加翻译效力。
所述核酸可以包含一种或多种核苷酸类似物或修饰的核苷酸。如本文所用，“核苷酸类似物”或“修饰的核苷酸”是指在核苷的含氮碱基(例如，胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)、腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(G))中或上含有一个或多个化学修饰(例如，取代)的核苷酸。核苷酸类似物可以在核苷的糖部分(例如，核糖、脱氧核糖、修饰的核糖、修饰的脱氧核糖、六元糖类似物或开链糖类似物)或磷酸酯中或上含有另外的化学修饰。核苷酸以及修饰的核苷酸和核苷的制备是本领域中众所周知的，参见以下参考文献：美国专利号4373071、4458066、4500707、4668777、4973679、5047524、5132418、5153319、5262530、5700642。许多修饰的核苷和修饰的核苷酸是市售的。
可以并入修饰的核苷和核苷酸中且存在于RNA分子中的修饰的核碱基包括：m5C(5-甲基胞苷)，m5U (5-甲基尿苷)，m6A (N6-甲基腺苷)，s2U (2-硫尿苷)，Um (2'-0-甲基尿苷)，mlA (1-甲基腺苷)；m2A (2-甲基腺苷)；Am (2-1-O-甲基腺苷)；ms2m6A (2-甲硫基-N6-甲基腺苷)；i6A (N6-异戊烯基腺苷)；ms2i6A (2-甲硫基-N6-异戊烯基腺苷)；io6A(N6-(顺-羟基异戊烯基)腺苷)；ms2io6A (2-甲硫基-N6-(顺-羟基异戊烯基)腺苷)；g6A(N6-甘氨酰氨基甲酰腺苷)；t6A (N6-苏氨酰氨基甲酰腺苷)；ms2t6A (2-甲硫基-N6-苏氨酰氨基甲酰腺苷)；m6t6A (N6-甲基-N6-苏氨酰氨基甲酰腺苷)；hn6A(N6-羟基正缬氨酰氨基甲酰腺苷)；ms2hn6A (2-甲硫基-N6-羟基正缬氨酰氨基甲酰腺苷)；Ar(p) (2'-0-核糖基腺苷(磷酸酯))；I (肌苷)；mil (1-甲基肌苷)；m'lm (l ,2'-0-二甲基肌苷)；m3C (3-甲基胞苷)；Cm (2T-0-甲基胞苷)；s2C (2-硫胞苷)；ac4C (N4-乙酰基胞苷)；5FC (甲酰化胞苷)(5-fonnylcytidine)；m5Cm (5,2-O-二甲基胞苷)；ac4Cm (N4乙酰基2TO甲基胞苷)；k2C(赖西丁)(lysidine)；mlG (1-甲基鸟苷)；m2G (N2-甲基鸟苷)；m7G (7-甲基鸟苷)；Gm(2'-0-甲基鸟苷)；m22G (N2,N2-二甲基鸟苷)；m2Gm (N2,2'-0-二甲基鸟苷)；m22Gm (N2,N2,2'-0-三甲基鸟苷)；Gr(p) (2'-0-核糖基鸟苷(磷酸酯))；yW (怀丁苷)；o2yW (过氧怀丁苷)；OHyW (羟基怀丁苷)；OHyW* (修饰不足的羟基怀丁苷)；imG (怀俄苷)；mimG (甲基鸟苷)；Q (辫苷)；oQ (环氧辫苷)；galQ (半乳糖基-辫苷)；manQ (甘露糖基-辫苷)；preQo(7-氰基-7-脱氮鸟苷)；preQi (7-氨基甲基-7-脱氮鸟苷)；G* (古嘌苷)(archaeosine)；D(二氢尿苷)；m5Um (5,2'-0-二甲基尿苷)；s4U (4-硫尿苷)；m5s2U (5-甲基-2-硫尿苷)；s2Um (2-硫基-2'-0-甲基尿苷)；acp3U (3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷)；ho5U (5-羟基尿苷)；mo5U (5-甲氧基尿苷)；cmo5U (尿苷 5-羟乙酸)；mcmo5U (尿苷 5-羟乙酸甲酯)；chm5U (5-(羧基羟基甲基)尿苷))；mchm5U (5-(羧基羟基甲基)尿苷甲酯)；mcm5U (5-甲氧基羰基甲基尿苷)；mcm5Um (S-甲氧基羰基甲基-2-O-甲基尿苷)；mcm5s2U (5-甲氧基羰基甲基-2-硫尿苷)；nm5s2U (5-氨基甲基-2-硫尿苷)；mnm5U (5-甲基氨基甲基尿苷)；mnm5s2U (5-甲基氨基甲基-2-硫尿苷)；mnm5se2U (5-甲基氨基甲基-2-硒代尿苷)；ncm5U(5-氨基甲酰甲基尿苷)；ncm5Um (5-氨基甲酰甲基-2'-0-甲基尿苷)；cmnm5U (5-羧基甲基氨基甲基尿苷)；cnmm5Um (5-羧基甲基氨基甲基-2-L- O甲基尿苷)；cmnm5s2U (5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿苷)；m62A (N6,N6-二甲基腺苷)；Tm (2'-0-甲基肌苷)；m4C (N4-甲基胞苷)；m4Cm (N4,2-0-二甲基胞苷)；hm5C (5-羟基甲基胞苷)；m3U (3-甲基尿苷)；cm5U(5-羧基甲基尿苷)；m6Am (N6,T-0-二甲基腺苷)；rn62Am (N6,N6,0-2-三甲基腺苷)；m2'7G(N2,7-二甲基鸟苷)；m2'2'7G (N2,N2,7-三甲基鸟苷)；m3Um (3,2T-0-二甲基尿苷)；m5D(5-甲基二氢尿苷)；F5Cm (5-甲酰基-2'-0-甲基胞苷)；mlGm (l ,2'-0-二甲基鸟苷)；m'Am(1 ,2-O-二甲基腺苷)牛磺酸甲基尿苷(irinomethyluridine))；tm5s2U (S-牛磺酸甲基-2-硫尿苷))；iniG-14 (4-去甲基鸟苷)；imG2 (异鸟苷)；ac6A (N6-乙酰基腺苷)，次黄嘌呤，肌苷，8-氧代-腺嘌呤，其7-取代的衍生物，二氢尿嘧啶，假尿嘧啶，2-硫尿嘧啶，4-硫尿嘧啶，5-氨基尿嘧啶，5-(Ci-Ce)-烷基尿嘧啶，5-甲基尿嘧啶，5-(C2-C6)-烯基尿嘧啶，5-(C2-Ce)-炔基尿嘧啶，5-(羟基甲基)尿嘧啶，5-氯尿嘧啶，5-氟尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-羟基胞嘧啶，5-(Ci-C6 )-烷基胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶，5-(C2-C6)-烯基胞嘧啶，5-(C2-C6)-炔基胞嘧啶，5-氯胞嘧啶，5-氟胞嘧啶，5-溴胞嘧啶，N2-二甲基鸟嘌呤，7-脱氮鸟嘌呤，8-氮杂鸟嘌呤，7-脱氮-7-取代的鸟嘌呤，7-脱氮-7-(C2-C6)炔基鸟嘌呤，7-脱氮-8-取代的鸟嘌呤，8-羟基鸟嘌呤，6-硫鸟嘌呤，8-氧代鸟嘌呤，2-氨基嘌呤，2-氨基-6-氯嘌呤，2,4-二氨基嘌呤，2,6-二氨基嘌呤，8-氮杂嘌呤，取代的7-脱氮嘌呤，7-脱氮-7-取代的嘌呤，7-脱氮-8-取代的嘌呤，氢(无碱基残基)，m5C，m5U，m6A，s2U，W，或2'-0-甲基-U。这些修饰的核碱基及其相应的核糖核苷中的许多可得自商业供应商。
免疫原性和药物组合物
根据本发明的免疫原性组合物包含自我复制RNA分子，其编码包含来自流感病毒的抗原的多肽。此类组合物可以是疫苗，特别是基于RNA的疫苗。
根据本发明的免疫原性组合物包含编码包含第一抗原的多肽的第一自我复制RNA分子和编码包含第二抗原的多肽的第二自我复制RNA分子。在某些实施方案中，根据本发明的免疫原性组合物包含或含有另外的自我复制分子，诸如3、4、5、6、7、8、9或10种自我复制RNA分子。具体而言，所述免疫原性组合物可以包含编码包含来自流感病毒的第三抗原的多肽的第三自我复制RNA分子以及任选地编码包含来自流感病毒的第四抗原的多肽的第四自我复制RNA分子。本发明的免疫原性组合物中可以存在又进一步的自我复制RNA分子，例如：
· 编码包含来自流感病毒的第5抗原的多肽的第5自我复制RNA分子，和任选地
· 编码包含来自流感病毒的第6抗原的多肽的第6自我复制RNA分子，和任选地
· 编码包含来自流感病毒的第7抗原的多肽的第7自我复制RNA分子，和任选地
· 编码包含来自流感病毒的第8抗原的多肽的第8自我复制RNA分子，和任选地
· 编码包含来自流感病毒的第9抗原的多肽的第9自我复制RNA分子，和任选地
· 编码包含来自流感病毒的第10抗原的多肽的第10自我复制RNA分子。
在这些实施方案中，来自流感病毒的第一、第二、第三和/或任选的后续抗原全部来自不同的流感病毒毒株。在一些实施方案中，与剩余抗原(例如对于HA；H1、H2、H3、H5、H7、H9等)相比，每种自我复制RNA分子中的抗原可以来自不同的流感病毒亚型。在某些实施方案中，具有2、3、4、5、6、7、8、9或10种自我复制分子的免疫原性组合物仅含有这些自我复制RNA分子。
通常，所述免疫原性组合物包含或含有最多达10种自我复制RNA分子，诸如2至10种自我复制RNA分子，2至8种自我复制RNA分子，3至7种自我复制分子，3至6种自我复制RNA分子或4至6种自我复制RNA分子，其中每种自我复制RNA分子编码包含来自流感病毒的抗原的多肽，且其中每种抗原来自不同的流感病毒毒株。在一个具体实施方案中，根据本发明的免疫原性组合物含有3至10种自我复制RNA分子。
在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物中的第一抗原和/或第二抗原和/或任选的后续抗原是血凝素(HA)。通常，所述HA抗原可以源自过去或现在的季节性或流行性毒株的流感病毒。例如，HA可以选自H1或H3类型的季节性毒株，或H1、H2、H5、H6、H7、H9或H10、诸如H5或H7类型的流行性毒株。在一个实施方案中，血凝素是免疫原性组合物中唯一的来自流感病毒的抗原。
在某些实施方案中，所述免疫原性组合物包含第一和/或第二抗原，其为来自流感病毒H1的HA。在其他实施方案中，所述免疫原性组合物包含第一和/或第二抗原，其为来自流感病毒H3的HA。在一个进一步实施方案中，所述第一抗原来自流感病毒H1，且所述第二抗原来自流感病毒H3。具体而言，所述H1流感病毒毒株可以来自A/H1N1，且所述H3流感病毒毒株可以是A/H3N2毒株。
设想了来自流感病毒的抗原的其他组合。例如，对于包含两种自我复制分子的根据本发明的免疫原性组合物，所述第一和第二抗原可以是分别源自以下血凝素毒株类型的HA：H1+H1、H3+H3、H1+H3、H5+H7、H5+H5或H7+H7。对于包含三种自我复制分子的根据本发明的免疫原性组合物，所述第一、第二和第三抗原可以分别源自以下血凝素毒株类型：H1+H1+H1、H1+H1+H3、H1+H3+H3、H3+H3+H3、H1+H3+H5、H3+H3+H5、H3+H3+H7或H1+H5+H7。对于包含四种自我复制分子的根据本发明的免疫原性组合物，所述第一、第二、第三和另外的抗原可以是分别源自以下毒株类型的HA：H1+H1+H3+H3、H1+H3+H3+H3、H1+H3+H3+H5、H1+H3+H5+H7或H3+H3+H3+H3。
在包含两种、三种或四种自我复制分子的任何这些实施方案中，所述HA抗原可以源自A/H1N1毒株。另外，所述HA抗原可以源自A/H3N2毒株。
因此，在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含(i)编码包含第一抗原的多肽的第一自我复制RNA分子和(ii)编码包含第二抗原的多肽的第二自我复制RNA分子，其中：
- 所述第一和第二抗原均来自流感病毒，但所述第一抗原来自与所述第二抗原不同的流感病毒毒株，
- 所述第一和第二抗原是血凝素或其免疫原性片段或变体，
- 所述第一和第二抗原来自具有不同地理起源和/或分离年份的流感病毒毒株。
在一个进一步实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含(i)编码包含第一抗原的多肽的第一自我复制RNA分子和(ii)编码包含第二抗原的多肽的第二自我复制RNA分子，其中：
- 所述第一和第二抗原均来自流感病毒，但所述第一抗原来自与所述第二抗原不同的流感病毒毒株，
- 所述第一和第二抗原是血凝素或其免疫原性片段或变体，且
- 所述第一和第二抗原来自具有不同血凝素亚型的流感病毒。
在一个进一步实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含(i)编码包含第一抗原的多肽的第一自我复制RNA分子和(ii)编码包含第二抗原的多肽的第二自我复制RNA分子，其中：
- 所述第一和第二抗原均来自流感病毒，但所述第一抗原来自与所述第二抗原不同的流感病毒毒株，
- 所述第一和第二抗原是血凝素或其免疫原性片段或变体，且
- 所述第一抗原来自季节性流感病毒(例如H1N1、H3N2、B/Victoria或B/Yamagata毒株)，且所述第二抗原来自流行性流感病毒毒株。
在一个进一步实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含(i)编码包含第一抗原的多肽的第一自我复制RNA分子、(ii)编码包含第二抗原的多肽的第二自我复制RNA分子和(iii)编码包含第三抗原的多肽的第三自我复制RNA分子，其中：
- 所述第一、第二和第三抗原均来自流感病毒，但所述第一、第二和第三抗原全部来自不同的流感病毒毒株，
- 所述第一、第二和第三抗原是血凝素或其免疫原性片段或变体，且
- 所述第一、第二和第三抗原全部来自相同血凝素亚型的流感病毒，但来自具有不同地理起源和/或分离年份的病毒。
在一个进一步实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含(i)编码包含第一抗原的多肽的第一自我复制RNA分子、(ii)编码包含第二抗原的多肽的第二自我复制RNA分子和(iii)编码包含第三抗原的多肽的第三自我复制RNA分子，其中：
- 所述第一、第二和第三抗原均来自流感病毒，但所述第一、第二和第三抗原全部来自不同的流感病毒毒株，
- 所述第一、第二和第三抗原是血凝素或其免疫原性片段或变体，且
- 所述第一和第二抗原来自过去或现在的季节性流感病毒，且所述第三抗原来自流行性流感病毒。
在一个实施方案中，所述免疫原性组合物可以包含多种自我复制RNA分子，其中每种自我复制RNA分子编码包含来自流感病毒H3的HA抗原的多肽。例如，所述组合物可以包含2、3、4、5、6、7、8、9或10种自我复制RNA分子，其编码包含来自流感病毒H3的HA抗原的多肽。
在一些此类实施方案中，所述HA抗原选自流感H3N2亚型的毒株。例如，在一个实施方案中，HA抗原选自流感H3N2亚型的潜在流行性和季节性毒株。可以基于以下标准选择这些H3N2亚型的毒株：1)主要糖基化位点，2)重要的季节性和流行性疫苗毒株，和3)仅细胞适应的毒株。
在一个实施方案中，所述免疫原性组合物包含多种自我复制RNA分子，其中每种自我复制RNA分子编码包含来自不同的H3N2流感病毒毒株的HA抗原的多肽。
在一个实施方案中，所述免疫原性组合物包含三种自我复制RNA分子，其中：(i)第一自我复制RNA分子编码包含来自A/Bilthoven/16398/1968 (EPI362379)的第一抗原的多肽，(ii)第二自我复制RNA分子编码包含来自A/Bangkok/1/79 (EPI367158)的第二抗原的多肽，(iii)第三自我复制RNA分子编码包含来自A/Fujian/411/2002 (EPI362915)的第三抗原的多肽。
在另一个实施方案中，所述免疫原性组合物包含三种自我复制RNA分子，其中：(i)第一自我复制RNA分子编码包含来自A/Beijing/32/92 (EPI365898)的第一抗原的多肽，(ii)第二自我复制RNA分子编码包含来自A/Brisbane/10/2007 (EPI362338)的第二抗原的多肽，且(iii)第三自我复制RNA分子编码包含来自A/Texas/50/2012 (EPI398417)的第三抗原的多肽。
在一个优选实施方案中，所述免疫原性组合物包含六种自我复制RNA分子，其中：(i)第一自我复制RNA分子编码包含来自A/Bilthoven/16398/1968 (EPI362379)的第一抗原的多肽，(ii)第二自我复制RNA分子编码包含来自A/Bangkok/1/79 (EPI367158)的第二抗原的多肽，(iii)第三自我复制RNA分子编码包含来自A/Beijing/32/92 (EPI365898)的第三抗原的多肽，(iv)第四自我复制RNA分子编码包含来自A/Fujian/411/2002(EPI362915)的第四抗原的多肽，(v)第五自我复制RNA分子编码包含来自A/Brisbane/10/2007 (EPI362338)的第五抗原的多肽，且(vi)第六自我复制RNA分子编码包含来自A/Texas/50/2012 (EPI398417)的第六抗原的多肽。编码流感HA蛋白的全长基因的序列信息获得自关于分享所有流感数据的全球倡议Epiflu数据库(www.gisaid.org)。
所有这些实施方案的免疫原性组合物还可以包括一种或多种另外的自我复制RNA分子，其中一种或多种另外的自我复制RNA分子编码包含来自流感病毒H1、H5和/或H7的HA抗原的多肽。在此类实施方案中，所述自我复制RNA分子可以编码包含来自两种不同的流感H1病毒的HA抗原的多肽。另外，所述自我复制RNA分子可以编码包含来自流感亚型H5的HA抗原的多肽。所述自我复制RNA分子还可以编码包含来自流感亚型H7的HA抗原的多肽。
在一个实施方案中，所述免疫原性组合物包含十种自我复制RNA分子，其中：(i)第一自我复制RNA分子编码包含来自A/Bilthoven/16398/1968 (EPI362379)的第一抗原的多肽，(ii)第二自我复制RNA分子编码包含来自A/Bangkok/1/79 (EPI367158)的第二抗原的多肽，(iii)第三自我复制RNA分子编码包含来自A/Beijing/32/92 (EPI365898)的第三抗原的多肽，(iv)第四自我复制RNA分子编码包含来自A/Fujian/411/2002 (EPI362915)的第四抗原的多肽，(v)第五自我复制RNA分子编码包含来自A/Brisbane/10/2007 (EPI362338)的第五抗原的多肽，且(vi)第六自我复制RNA分子编码包含来自A/Texas/50/2012(EPI398417)的第六抗原的多肽，(vii)第七自我复制RNA分子编码包含来自A/California/07/2009 (H1N1)的第七抗原的多肽，(viii)第八自我复制RNA分子编码包含来自A/PR/8/1934 (H1N1)的第八抗原的多肽，(ix)第九自我复制RNA分子编码包含来自A/turkey/Turkey/5/2005 (H5N1)的第九抗原的多肽，且(x)第十自我复制RNA分子编码包含来自A/Shanghai/1/3013 (H7N9)的第十抗原的多肽。
所述免疫原性组合物可以包含病毒或非病毒递送系统。所述递送系统(在本文中也称为递送媒介物)可以具有佐剂作用，其增强来自流感病毒的编码抗原的免疫原性。例如，可以将所述自我复制RNA分子封装在脂质体、无毒的可生物降解的聚合物微粒或病毒复制子颗粒(VRP)中，或与阳离子水包油乳剂的颗粒复合。在一些实施方案中，基于核酸的疫苗包含阳离子纳米乳剂(CNE)递送系统或脂质纳米颗粒(LNP)递送系统。在一些实施方案中，所述基于核酸的疫苗包含非病毒递送系统，即，基于核酸的疫苗基本上没有病毒衣壳。或者，基于核酸的疫苗可以包含病毒复制子颗粒。在其他实施方案中，基于核酸的疫苗可以包含裸核酸，诸如裸RNA(例如mRNA)，但经由CNE或LNP的递送是优选的。
在某些实施方案中，基于核酸的疫苗包含阳离子纳米乳剂(CNE)递送系统。CNE递送系统及其制备方法描述于以下参考文献中：WO2012/006380。在CNE递送系统中，将编码抗原的核酸分子(例如，RNA)与阳离子水包油乳剂的颗粒复合。阳离子水包油乳剂可用于将带负电荷的分子(诸如RNA分子)递送至细胞。乳剂颗粒包含油核和阳离子脂质。所述阳离子脂质可以与带负电荷的分子相互作用，由此将分子锚定至乳剂颗粒。有用的CNE的进一步的细节可以在以下参考文献中找到：WO2012/006380；WO2013/006834；和WO2013/006837 (其各自的内容以其整体并入本文)。
因此，在某些实施方案中，在根据本发明的免疫原性组合物中，可以将编码包含来自流感病毒的抗原的多肽的自我复制RNA分子与阳离子水包油乳剂的颗粒复合。所述颗粒通常包含在25℃下呈液相的油核(例如植物油或角鲨烯)，阳离子脂质(例如磷脂)和任选表面活性剂(例如脱水山梨醇三油酸酯，聚山梨酯80)；也可以包括聚乙二醇。在一些实施方案中，所述CNE包含角鲨烯和阳离子脂质，诸如1,2-二油酰基氧基-3-(三甲基铵基)丙烷(DOTAP)。在一些优选的实施方案中，所述递送系统是非病毒递送系统，诸如CNE。这可以在引发体液和细胞免疫应答中特别有效。优点还包括不存在限制性的抗载体免疫应答和缺乏基因组整合的风险。
在一些实施方案中，根据本发明的自我复制RNA分子可以与亚微米阳离子水包油乳剂复合。在一些实施方案中，所述阳离子水包油乳剂的特征在于平均粒径为约80 nm至180 nm直径(或可替代地约80 nm至约150 nm；约80 nm至130 nm；或约100 nm)。在一些实施方案中，在RNA复合之前，所述乳剂中的DOTAP的浓度为至少约2.5 mM，或约2.5 mM至约8mM。在一个具体实施方案中，所述乳剂中的DOTAP的浓度为约4 mg/ml (5.73 mM)。所述油可以是角鲨烯或角鲨烷。
在一些实施方案中，在本发明的免疫原性组合物中，将自我复制RNA分子与阳离子水包油乳剂复合，所述阳离子水包油乳剂在柠檬酸盐缓冲液中包含DOTAP、角鲨烯、脱水山梨糖醇三油酸酯和聚山梨酸酯80。适合用于递送编码包含来自流感病毒的抗原的多肽的RNA分子的阳离子水包油乳剂可以含有约2 mg/ml至7 mg/ml DOTAP；约3mg/ml至6 mg/mlSpan 85；约3 mg/ml至6 mg/ml Tween 80；和约30 mg/ml至50 mg/ml角鲨烯。在某些实施方案中，在与RNA复合之前，所述阳离子水包油乳剂包含约4.3% w/v角鲨烯、0.5% Tween 80、0.5% SPAN85和4 mg/mL DOTAP。
因此，在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含(i)编码包含第一抗原的多肽的第一自我复制RNA分子和(ii)编码包含第二抗原的多肽的第二自我复制RNA分子，其中：
- 所述第一和第二抗原均来自流感病毒，但所述第一抗原来自与所述第二抗原不同的流感病毒毒株，
- 所述第一和第二抗原是血凝素或其免疫原性片段或变体，
- 所述自我复制RNA分子被配制在脂质纳米颗粒(LNP)中。
因此，在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含(i)编码包含第一抗原的多肽的第一自我复制RNA分子和(ii)编码包含第二抗原的多肽的第二自我复制RNA分子，其中：
- 所述第一和第二抗原均来自流感病毒，但所述第一抗原来自与所述第二抗原不同的流感病毒毒株，
- 所述第一和第二抗原是血凝素或其免疫原性片段或变体，
- 所述自我复制RNA分子被配制在阳离子纳米乳剂(CNE)中。
因此，在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含(i)编码包含第一抗原的多肽的第一自我复制RNA分子和(ii)编码包含第二抗原的多肽的第二自我复制RNA分子，其中：
- 所述第一和第二抗原均来自流感病毒，但所述第一抗原来自与所述第二抗原不同的流感病毒毒株，
- 所述第一和第二抗原是血凝素或其免疫原性片段或变体，
- 所述自我复制RNA分子被配制在脂质纳米颗粒(LNP)或阳离子纳米乳剂(CNE)中，且
- 除了编码包含来自流感病毒的抗原的多肽以外，每种自我复制RNA分子还编码RNA-依赖性的RNA聚合酶，其可以从所述自我复制RNA分子转录RNA。
在一个进一步实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含(i)编码包含第一抗原的多肽的第一自我复制RNA分子、(ii)编码包含第二抗原的多肽的第二自我复制RNA分子和(iii)编码包含第三抗原的多肽的第三自我复制RNA分子，其中：
- 所述第一、第二和第三抗原均来自流感病毒，但所述第一、第二和第三抗原全部来自不同的流感病毒毒株，
- 所述第一、第二和第三抗原是血凝素或其免疫原性片段或变体，且
- 所述自我复制RNA分子被配制在脂质纳米颗粒(LNP)或阳离子纳米乳剂(CNE)中。
在一个进一步实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含(i)编码包含第一抗原的多肽的第一自我复制RNA分子、(ii)编码包含第二抗原的多肽的第二自我复制RNA分子和(iii)编码包含第三抗原的多肽的第三自我复制RNA分子，其中：
- 所述第一、第二和第三抗原均来自流感病毒，但所述第一、第二和第三抗原全部来自不同的流感病毒毒株，
- 所述第一、第二和第三抗原是血凝素或其免疫原性片段或变体，
- 所述自我复制RNA分子被配制在脂质纳米颗粒(LNP)或阳离子纳米乳剂(CNE)中，且
- 除了编码包含来自流感病毒的抗原的多肽以外，每种自我复制RNA分子还编码RNA-依赖性的RNA聚合酶，其可以从所述自我复制RNA分子转录RNA。
还提供了制备根据本发明的免疫原性组合物的方法，其中所述自我复制RNA分子与阳离子水包油乳剂复合，所述方法包括：(i)提供如本文所述的水包油乳剂；(ii)提供包含所述自我复制RNA分子的水溶液；和(iii)将(ii)的水溶液和(i)的水包油乳剂组合，由此制备所述免疫原性组合物。如果期望，包含RNA分子的水溶液可以是缓冲液。所述缓冲液可以包含一种或多种盐、缓冲剂、糖或聚合物。在一个优选实施方案中，所述缓冲液包含560mM蔗糖、20 mM NaCl和10 mM柠檬酸盐，其可以与本文所述的阳离子水包油乳剂混合以产生包含280 mM蔗糖、10 mM NaCl和10 mM柠檬酸盐的最终水相。
还提供了制备根据本发明的免疫原性组合物的方法，其中将所述自我复制RNA分子封装在脂质纳米颗粒(LNP)中，所述方法包括：(i)提供至少一种形成纳米颗粒的脂质；(ii)提供包含所述自我复制RNA分子的水溶液；和(iii)将(ii)的水溶液和(i)的至少一种脂质组合，由此制备所述组合物。
LNP递送系统和无毒的可生物降解的聚合物微粒及其制备方法描述于以下参考文献中：WO2012/006376 (LNP和微粒递送系统)；Geall等人 (2012) PNAS USA. Sep 4; 109(36): 14604-9 (LNP递送系统)；和WO2012/006359 (微粒递送系统)。LNP是其中可以封装核酸分子(例如RNA)的非病毒粒子脂质体颗粒。所述颗粒可以包括一些外部RNA(例如在颗粒的表面上)，但至少一半的RNA(且理想地其中全部)被封装。脂质体颗粒可以例如由两性离子、阳离子和阴离子脂质的混合物形成，所述脂质可以是饱和或不饱和的，例如；DSPC(两性离子的，饱和的), DlinDMA (阳离子的，不饱和的)，和/或DMG (阴离子的，饱和的)。在一些实施方案中，所述LNP包含中性脂质、阳离子脂质、胆固醇和聚乙二醇(PEG)，且形成涵盖自我扩增RNA的纳米颗粒。用于本发明的优选的LNP包括两亲性脂质(辅助脂质)，其可以任选地与至少一种阳离子脂质(诸如DOTAP、DSDMA、DODMA、DLinDMA、DLenDMA等)组合形成脂质体。有用的辅助脂质包括两性离子脂质，诸如DPPC、DOPC、DSPC、十二烷基磷酸胆碱、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺(DOPE)和1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPyPE)；固醇类，诸如胆固醇；和PEG化脂质、诸如PEG-DMPE (PEG缀合的1,2-二肉豆蔻酰基-Sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)])或PEG-DMG (PEG缀合的1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油，甲氧基聚乙二醇)。在一些实施方案中，有用的PEG化脂质可以是PEG2K-DMPE(PEG缀合的1,2-二肉豆蔻酰基-Sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000])或PEG2K-DMG (PEG缀合的1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油，甲氧基聚乙二醇-2000)。DSPC、DlinDMA、PEG-DMG和胆固醇的混合物是特别有效的。其他有用的LNP描述于以下参考文献中：WO2012/006376；WO2012/030901；WO2012/031046；WO2012/031043；WO2012/006378；WO2011/076807；WO2013/033563；WO2013/006825；WO2014/136086；WO2015/095340；WO2015/095346；WO2016/037053。在一些实施方案中，所述LNP是RV01脂质体，参见以下参考文献：WO2012/006376和Geall等人 (2012) PNAS USA. Sep 4; 109(36): 14604-9。在一个实施方案中，所述LNP是RV01脂质体，其中阳离子脂质是DLin-DMA。
Figure 774334DEST_PATH_IMAGE001
在一些实施方案中，本文的阳离子脂质包含式I的结构：
Figure 770103DEST_PATH_IMAGE002
其中n = 1至3的整数，且
(i) R1为CH3，R2和R3均为H，且Y为C；或
(ii) R1和R2共同地为CH2-CH2，且与氮一起形成五元、六元或七元杂环烷基，R3为CH3，且Y为C；或
(iii) R1为CH3，R2和R3均不存在，且Y为O；
其中o为0或1；
其中X为：
(i)
Figure 549840DEST_PATH_IMAGE003
，其中R4和R5独立地为在ω 6和9位置中的一个或两个处具有一个或两个顺式烯基的C10-20烃链；或
(ii) -CH(-R6)-R7，其中
(1) R6为-(CH2)p-O-C(O)-R8或-Cp-R8；
(2) R7为-(CH2)p'-O-C(O)-R8'或-Cp'-R8'，
(3) p和p'独立地为0、1、2、3或4；且
(4) R8和R8'独立地为
(A) 在ω 6和9位置中的一个或两个处具有一个或两个顺式烯基的-C8-20烃链；
(B) -C1-3-C(-O-C6-12)-O-C6-12饱和或不饱和烃链；
(C) -C6-16饱和烃链；
(D) -C(-C6-16)-C6-16饱和或不饱和烃链；
(E) -C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O-C(O)-C4-12饱和或不饱和烃链；和
(F) -C6-16饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，R1为CH3，R2和R3均为H，且Y为C。在一些实施方案中，R1和R2共同地为CH2-CH2，且与氮一起形成五元、六元或七元杂环烷基，R3为CH3，且Y为C。在一些实施方案中，R1为CH3，R2和R3均不存在，且Y为O。
在一个实施方案中，X为
Figure 945050DEST_PATH_IMAGE004
，其中R4和R5独立地为在ω 6和9位置中的任一个或两个处具有一个或两个顺式烯基的C10-20烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-(CH2)p-O-C(O)-R8，R7为-(CH2)p'-O-C(O)-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；R8为在ω 6和9位置中的任一个或两个处具有一个或两个顺式烯基的-C8-20烃链；且R8'为在ω 6和9位置中的任一个或两个处具有一个或两个顺式烯基的-C8-20烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-(CH2)p-O-C(O)-R8，R7为-(CH2)p'-O-C(O)-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；R8为在ω 6和9位置中的任一个或两个处具有一个或两个顺式烯基的-C8-20烃链；且R8'为-C1-3-C(-O-C6-12)-O-C6-12饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-(CH2)p-O-C(O)-R8，R7为-(CH2)p'-O-C(O)-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；R8为在ω 6和9位置中的任一个或两个处具有一个或两个顺式烯基的-C8-20烃链；且R8'为-C6-16饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-(CH2)p-O-C(O)-R8，R7为-(CH2)p'-O-C(O)-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；R8为在ω 6和9位置中的任一个或两个处具有一个或两个顺式烯基的-C8-20烃链；且R8'为-C(-C6-16)-C6-16饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-(CH2)p-O-C(O)-R8，R7为-(CH2)p'-O-C(O)-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；R8为在ω 6和9位置中的任一个或两个处具有一个或两个顺式烯基的-C8-20烃链；且R8'为-C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O-C(O)-C4-12饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-(CH2)p-O-C(O)-R8，R7为-(CH2)p'-O-C(O)-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；R8为在ω 6和9位置中的任一个或两个处具有一个或两个顺式烯基的-C8-20烃链；且R8'为-C6-16饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-(CH2)p-O-C(O)-R8，R7为-(CH2)p'-O-C(O)-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；R8为-C1-3-C(-O-C6-12)-O-C6-12饱和或不饱和烃链；且R8'为在ω 6和9位置中的任一个或两个处具有一个或两个顺式烯基的-C8-20烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-(CH2)p-O-C(O)-R8，R7为-(CH2)p'-O-C(O)-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；R8为-C1-3-C(-O-C6-12)-O-C6-12饱和或不饱和烃链；且R8'为-C1-3-C(-O-C6-12)-O-C6-12饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-(CH2)p-O-C(O)-R8，R7为-(CH2)p'-O-C(O)-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；R8为-C1-3-C(-O-C6-12)-O-C6-12饱和或不饱和烃链；且R8'为-C6-16饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-(CH2)p-O-C(O)-R8，R7为-(CH2)p'-O-C(O)-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；R8为-C1-3-C(-O-C6-12)-O-C6-12饱和或不饱和烃链；且R8'为-C(-C6-16)-C6-16饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-(CH2)p-O-C(O)-R8，R7为-(CH2)p'-O-C(O)-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；R8为-C1-3-C(-O-C6-12)-O-C6-12饱和或不饱和烃链；且R8'为-C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O-C(O)-C4-12饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-(CH2)p-O-C(O)-R8，R7为-(CH2)p'-O-C(O)-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；R8为-C1-3-C(-O-C6-12)-O-C6-12饱和或不饱和烃链；且R8'为-C6-16饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-(CH2)p-O-C(O)-R8，R7为-(CH2)p'-O-C(O)-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；R8为-C6-16饱和烃链；且R8'为在ω 6和9位置中的任一个或两个处具有一个或两个顺式烯基的-C8-20烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-(CH2)p-O-C(O)-R8，R7为-(CH2)p'-O-C(O)-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；R8为-C6-16饱和烃链；且R8'为-C1-3-C(-O-C6-12)-O-C6-12饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-(CH2)p-O-C(O)-R8，R7为-(CH2)p'-O-C(O)-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；R8为-C6-16饱和烃链；且R8'为-C6-16饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-(CH2)p-O-C(O)-R8，R7为-(CH2)p'-O-C(O)-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；R8为-C6-16饱和烃链；且R8'为-C(-C6-16)-C6-16饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-(CH2)p-O-C(O)-R8，R7为-(CH2)p'-O-C(O)-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；R8为-C6-16饱和烃链；且R8'为-C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O-C(O)-C4-12饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-(CH2)p-O-C(O)-R8，R7为-(CH2)p'-O-C(O)-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；R8为-C6-16饱和烃链；且R8'为-C6-16饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-(CH2)p-O-C(O)-R8，R7为-(CH2)p'-O-C(O)-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；R8为-C(-C6-16)-C6-16饱和或不饱和烃链；且R8'为在ω6和9位置中的任一个或两个处具有一个或两个顺式烯基的-C8-20烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-(CH2)p-O-C(O)-R8，R7为-(CH2)p'-O-C(O)-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；且R8为-C(-C6-16)-C6-16饱和或不饱和烃链；且R8'为-C1-3-C(-O-C6-12)-O-C6-12饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-(CH2)p-O-C(O)-R8，R7为-(CH2)p'-O-C(O)-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；且R8为-C(-C6-16)-C6-16饱和或不饱和烃链；且R8'为-C6-16饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-(CH2)p-O-C(O)-R8，R7为-(CH2)p'-O-C(O)-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；且R8为-C(-C6-16)-C6-16饱和或不饱和烃链；且R8'为-C(-C6-16)-C6-16饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-(CH2)p-O-C(O)-R8，R7为-(CH2)p'-O-C(O)-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；且R8为-C(-C6-16)-C6-16饱和或不饱和烃链；且R8'为-C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O-C(O)-C4-12饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-(CH2)p-O-C(O)-R8，R7为-(CH2)p'-O-C(O)-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；且R8为-C(-C6-16)-C6-16饱和或不饱和烃链；且R8'为-C6-16饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-(CH2)p-O-C(O)-R8，R7为-(CH2)p'-O-C(O)-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；且R8为-C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O-C(O)-C4-12饱和或不饱和烃链；且R8'为在ω 6和9位置中的任一个或两个处具有一个或两个顺式烯基的-C8-20烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-(CH2)p-O-C(O)-R8，R7为-(CH2)p'-O-C(O)-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；且R8为-C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O-C(O)-C4-12饱和或不饱和烃链；且R8'为-C1-3-C(-O-C6-12)-O-C6-12饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-(CH2)p-O-C(O)-R8，R7为-(CH2)p'-O-C(O)-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；且R8为-C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O-C(O)-C4-12饱和或不饱和烃链；且R8'为-C6-16饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-(CH2)p-O-C(O)-R8，R7为-(CH2)p'-O-C(O)-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；且R8为-C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O-C(O)-C4-12饱和或不饱和烃链；且R8'为-C(-C6-16)-C6-16饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-(CH2)p-O-C(O)-R8，R7为-(CH2)p'-O-C(O)-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；且R8为-C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O-C(O)-C4-12饱和或不饱和烃链；且R8'为-C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O-C(O)-C4-12饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-(CH2)p-O-C(O)-R8，R7为-(CH2)p'-O-C(O)-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；且R8为-C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O-C(O)-C4-12饱和或不饱和烃链；且R8'为-C6-16饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-(CH2)p-O-C(O)-R8，R7为-(CH2)p'-O-C(O)-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；且R8为-C6-16饱和或不饱和烃链；且R8'为在ω 6和9位置中的任一个或两个处具有一个或两个顺式烯基的-C8-20烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-(CH2)p-O-C(O)-R8，R7为-(CH2)p'-O-C(O)-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；且R8为-C6-16饱和或不饱和烃链；且R8'为-C1-3-C(-O-C6-12)-O-C6-12饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-(CH2)p-O-C(O)-R8，R7为-(CH2)p'-O-C(O)-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；且R8为-C6-16饱和或不饱和烃链；且R8'为-C6-16饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-(CH2)p-O-C(O)-R8，R7为-(CH2)p'-O-C(O)-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；且R8为-C6-16饱和或不饱和烃链；且R8'为-C(-C6-16)-C6-16饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-(CH2)p-O-C(O)-R8，R7为-(CH2)p'-O-C(O)-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；且R8为-C6-16饱和或不饱和烃链；且R8'为-C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O-C(O)-C4-12饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-(CH2)p-O-C(O)-R8，R7为-(CH2)p'-O-C(O)-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；且R8为-C6-16饱和或不饱和烃链；且R8'为-C6-16饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-(CH2)p-O-C(O)-R8，R7为-Cp'-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；R8为在ω 6和9位置中的任一个或两个处具有一个或两个顺式烯基的-C8-20烃链；且R8'为在ω 6和9位置中的任一个或两个处具有一个或两个顺式烯基的-C8-20烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-(CH2)p-O-C(O)-R8，R7为-Cp'-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；R8为在ω 6和9位置中的任一个或两个处具有一个或两个顺式烯基的-C8-20烃链；且R8'为-C1-3-C(-O-C6-12)-O-C6-12饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-(CH2)p-O-C(O)-R8，R7为-Cp'-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；R8为在ω 6和9位置中的任一个或两个处具有一个或两个顺式烯基的-C8-20烃链；且R8'为-C6-16饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-(CH2)p-O-C(O)-R8，R7为-Cp'-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；R8为在ω 6和9位置中的任一个或两个处具有一个或两个顺式烯基的-C8-20烃链；且R8'为-C(-C6-16)-C6-16饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-(CH2)p-O-C(O)-R8，R7为-Cp'-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；R8为在ω 6和9位置中的任一个或两个处具有一个或两个顺式烯基的-C8-20烃链；且R8'为-C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O-C(O)-C4-12饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-(CH2)p-O-C(O)-R8，R7为-Cp'-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；R8为在ω 6和9位置中的任一个或两个处具有一个或两个顺式烯基的-C8-20烃链；且R8'为-C6-16饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-(CH2)p-O-C(O)-R8，R7为-Cp'-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；R8为-C1-3-C(-O-C6-12)-O-C6-12饱和或不饱和烃链；且R8'为在ω 6和9位置中的任一个或两个处具有一个或两个顺式烯基的-C8-20烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-(CH2)p-O-C(O)-R8，R7为-Cp'-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；R8为-C1-3-C(-O-C6-12)-O-C6-12饱和或不饱和烃链；且R8'为-C1-3-C(-O-C6-12)-O-C6-12饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-(CH2)p-O-C(O)-R8，R7为-Cp'-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；R8为-C1-3-C(-O-C6-12)-O-C6-12饱和或不饱和烃链；且R8'为-C6-16饱和烃链。
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在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-(CH2)p-O-C(O)-R8，R7为-Cp'-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；R8为-C1-3-C(-O-C6-12)-O-C6-12饱和或不饱和烃链；且R8'为-C6-16饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-(CH2)p-O-C(O)-R8，R7为-Cp'-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；R8为-C6-16饱和烃链；且R8'为在ω 6和9位置中的任一个或两个处具有一个或两个顺式烯基的-C8-20烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-(CH2)p-O-C(O)-R8，R7为-Cp'-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；R8为-C6-16饱和烃链；且R8'为-C1-3-C(-O-C6-12)-O-C6-12饱和或不饱和烃链。
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在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-(CH2)p-O-C(O)-R8，R7为-Cp'-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；R8为-C6-16饱和烃链；且R8'为-C(-C6-16)-C6-16饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-(CH2)p-O-C(O)-R8，R7为-Cp'-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；R8为-C6-16饱和烃链；且R8'为-C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O-C(O)-C4-12饱和或不饱和烃链。
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在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-Cp-R8，R7为-(CH2)p'-O-C(O)-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；R8为-C6-16饱和烃链；且R8'为-C1-3-C(-O-C6-12)-O-C6-12饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-Cp-R8，R7为-(CH2)p'-O-C(O)-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；R8为-C6-16饱和烃链；且R8'为-C6-16饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-Cp-R8，R7为-(CH2)p'-O-C(O)-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；R8为-C6-16饱和烃链；且R8'为-C(-C6-16)-C6-16饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-Cp-R8，R7为-(CH2)p'-O-C(O)-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；R8为-C6-16饱和烃链；且R8'为-C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O-C(O)-C4-12饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-Cp-R8，R7为-(CH2)p'-O-C(O)-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；R8为-C6-16饱和烃链；且R8'为-C6-16饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-Cp-R8，R7为-(CH2)p'-O-C(O)-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；且R8为-C(-C6-16)-C6-16饱和或不饱和烃链；且R8'为在ω 6和9位置中的任一个或两个处具有一个或两个顺式烯基的-C8-20烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-Cp-R8，R7为-(CH2)p'-O-C(O)-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；且R8为-C(-C6-16)-C6-16饱和或不饱和烃链；且R8'为-C1-3-C(-O-C6-12)-O-C6-12饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-Cp-R8，R7为-(CH2)p'-O-C(O)-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；且R8为-C(-C6-16)-C6-16饱和或不饱和烃链；且R8'为-C6-16饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-Cp-R8，R7为-(CH2)p'-O-C(O)-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；且R8为-C(-C6-16)-C6-16饱和或不饱和烃链；且R8'为-C(-C6-16)-C6-16饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-Cp-R8，R7为-(CH2)p'-O-C(O)-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；且R8为-C(-C6-16)-C6-16饱和或不饱和烃链；且R8'为-C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O-C(O)-C4-12饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-Cp-R8，R7为-(CH2)p'-O-C(O)-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；且R8为-C(-C6-16)-C6-16饱和或不饱和烃链；且R8'为-C6-16饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-Cp-R8，R7为-(CH2)p'-O-C(O)-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；且R8为-C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O-C(O)-C4-12饱和或不饱和烃链；且R8'为在ω 6和9位置中的任一个或两个处具有一个或两个顺式烯基的-C8-20烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-Cp-R8，R7为-(CH2)p'-O-C(O)-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；且R8为-C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O-C(O)-C4-12饱和或不饱和烃链；且R8'为-C1-3-C(-O-C6-12)-O-C6-12饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-Cp-R8，R7为-(CH2)p'-O-C(O)-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；且R8为-C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O-C(O)-C4-12饱和或不饱和烃链；且R8'为-C6-16饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-Cp-R8，R7为-(CH2)p'-O-C(O)-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；且R8为-C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O-C(O)-C4-12饱和或不饱和烃链；且R8'为-C(-C6-16)-C6-16饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-Cp-R8，R7为-(CH2)p'-O-C(O)-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；且R8为-C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O-C(O)-C4-12饱和或不饱和烃链；且R8'为-C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O-C(O)-C4-12饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-Cp-R8，R7为-(CH2)p'-O-C(O)-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；且R8为-C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O-C(O)-C4-12饱和或不饱和烃链；且R8'为-C6-16饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-Cp-R8，R7为-(CH2)p'-O-C(O)-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；且R8为-C6-16饱和或不饱和烃链；且R8'为在ω 6和9位置中的任一个或两个处具有一个或两个顺式烯基的-C8-20烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-Cp-R8，R7为-(CH2)p'-O-C(O)-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；且R8为-C6-16饱和或不饱和烃链；且R8'为-C1-3-C(-O-C6-12)-O-C6-12饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-Cp-R8，R7为-(CH2)p'-O-C(O)-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；且R8为-C6-16饱和或不饱和烃链；且R8'为-C6-16饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-Cp-R8，R7为-(CH2)p'-O-C(O)-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；且R8为-C6-16饱和或不饱和烃链；且R8'为-C(-C6-16)-C6-16饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-Cp-R8，R7为-(CH2)p'-O-C(O)-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；且R8为-C6-16饱和或不饱和烃链；且R8'为-C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O-C(O)-C4-12饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-Cp-R8，R7为-(CH2)p'-O-C(O)-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；且R8为-C6-16饱和或不饱和烃链；且R8'为-C6-16饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-Cp-R8，R7为-Cp'-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；R8为在ω 6和9位置中的任一个或两个处具有一个或两个顺式烯基的-C8-20烃链；且R8'为在ω 6和9位置中的任一个或两个处具有一个或两个顺式烯基的-C8-20烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-Cp-R8，R7为-Cp'-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；R8为在ω 6和9位置中的任一个或两个处具有一个或两个顺式烯基的-C8-20烃链；且R8'为-C1-3-C(-O-C6-12)-O-C6-12饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-Cp-R8，R7为-Cp'-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；R8为在ω 6和9位置中的任一个或两个处具有一个或两个顺式烯基的-C8-20烃链；且R8'为-C6-16饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-Cp-R8，R7为-Cp'-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；R8为在ω 6和9位置中的任一个或两个处具有一个或两个顺式烯基的-C8-20烃链；且R8'为-C(-C6-16)-C6-16饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-Cp-R8，R7为-Cp'-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；R8为在ω 6和9位置中的任一个或两个处具有一个或两个顺式烯基的-C8-20烃链；且R8'为-C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O-C(O)-C4-12饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-Cp-R8，R7为-Cp'-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；R8为在ω 6和9位置中的任一个或两个处具有一个或两个顺式烯基的-C8-20烃链；且R8'为-C6-16饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-Cp-R8，R7为-Cp'-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；R8为-C1-3-C(-O-C6-12)-O-C6-12饱和或不饱和烃链；且R8'为在ω 6和9位置中的任一个或两个处具有一个或两个顺式烯基的-C8-20烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-Cp-R8，R7为-Cp'-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；R8为-C1-3-C(-O-C6-12)-O-C6-12饱和或不饱和烃链；且R8'为-C1-3-C(-O-C6-12)-O-C6-12饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-Cp-R8，R7为-Cp'-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；R8为-C1-3-C(-O-C6-12)-O-C6-12饱和或不饱和烃链；且R8'为-C6-16饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-Cp-R8，R7为-Cp'-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；R8为-C1-3-C(-O-C6-12)-O-C6-12饱和或不饱和烃链；且R8'为-C(-C6-16)-C6-16饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-Cp-R8，R7为-Cp'-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；R8为-C1-3-C(-O-C6-12)-O-C6-12饱和或不饱和烃链；且R8'为-C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O-C(O)-C4-12饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-Cp-R8，R7为-Cp'-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；R8为-C1-3-C(-O-C6-12)-O-C6-12饱和或不饱和烃链；且R8'为-C6-16饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-Cp-R8，R7为-Cp'-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；R8为-C6-16饱和烃链；且R8'为在ω 6和9位置中的任一个或两个处具有一个或两个顺式烯基的-C8-20烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-Cp-R8，R7为-Cp'-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；R8为-C6-16饱和烃链；且R8'为-C1-3-C(-O-C6-12)-O-C6-12饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-Cp-R8，R7为-Cp'-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；R8为-C6-16饱和烃链；且R8'为-C6-16饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-Cp-R8，R7为-Cp'-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；R8为-C6-16饱和烃链；且R8'为-C(-C6-16)-C6-16饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-Cp-R8，R7为-Cp'-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；R8为-C6-16饱和烃链；且R8'为-C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O-C(O)-C4-12饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-Cp-R8，R7为-Cp'-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；R8为-C6-16饱和烃链；且R8'为-C6-16饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-Cp-R8，R7为-Cp'-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；且R8为-C(-C6-16)-C6-16饱和或不饱和烃链；且R8'为在ω 6和9位置中的任一个或两个处具有一个或两个顺式烯基的-C8-20烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-Cp-R8，R7为-Cp'-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；且R8为-C(-C6-16)-C6-16饱和或不饱和烃链；且R8'为-C1-3-C(-O-C6-12)-O-C6-12饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-Cp-R8，R7为-Cp'-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；且R8为-C(-C6-16)-C6-16饱和或不饱和烃链；且R8'为-C6-16饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-Cp-R8，R7为-Cp'-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；且R8为-C(-C6-16)-C6-16饱和或不饱和烃链；且R8'为-C(-C6-16)-C6-16饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-Cp-R8，R7为-Cp'-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；且R8为-C(-C6-16)-C6-16饱和或不饱和烃链；且R8'为-C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O-C(O)-C4-12饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-Cp-R8，R7为-Cp'-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；且R8为-C(-C6-16)-C6-16饱和或不饱和烃链；且R8'为-C6-16饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-Cp-R8，R7为-Cp'-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；且R8为-C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O-C(O)-C4-12饱和或不饱和烃链；且R8'为在ω 6和9位置中的任一个或两个处具有一个或两个顺式烯基的-C8-20烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-Cp-R8，R7为-Cp'-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；且R8为-C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O-C(O)-C4-12饱和或不饱和烃链；且R8'为-C1-3-C(-O-C6-12)-O-C6-12饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-Cp-R8，R7为-Cp'-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；且R8为-C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O-C(O)-C4-12饱和或不饱和烃链；且R8'为-C6-16饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-Cp-R8，R7为-Cp'-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；且R8为-C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O-C(O)-C4-12饱和或不饱和烃链；且R8'为-C(-C6-16)-C6-16饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-Cp-R8，R7为-Cp'-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；且R8为-C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O-C(O)-C4-12饱和或不饱和烃链；且R8'为-C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O-C(O)-C4-12饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-Cp-R8，R7为-Cp'-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；且R8为-C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O-C(O)-C4-12饱和或不饱和烃链；且R8'为-C6-16饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-Cp-R8，R7为-Cp'-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；且R8为-C6-16饱和或不饱和烃链；且R8'为在ω 6和9位置中的任一个或两个处具有一个或两个顺式烯基的-C8-20烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-Cp-R8，R7为-Cp'-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；且R8为-C6-16饱和或不饱和烃链；且R8'为-C1-3-C(-O-C6-12)-O-C6-12饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-Cp-R8，R7为-Cp'-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；且R8为-C6-16饱和或不饱和烃链；且R8'为-C6-16饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-Cp-R8，R7为-Cp'-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；且R8为-C6-16饱和或不饱和烃链；且R8'为-C(-C6-16)-C6-16饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-Cp-R8，R7为-Cp'-R8''，p和p'独立地为0、1、2、3或4；且R8为-C6-16饱和或不饱和烃链；且R8'为-C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O-C(O)-C4-12饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为-CH(-R6)-R7，R6为-Cp-R8，R7为-Cp'-R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；且R8为-C6-16饱和或不饱和烃链；且R8'为-C6-16饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，示例性阳离子脂质是具有以下结构的RV28：
Figure 759422DEST_PATH_IMAGE005
在一个实施方案中，示例性阳离子脂质是具有以下结构的RV31：
Figure 316305DEST_PATH_IMAGE006
在一个实施方案中，示例性阳离子脂质是具有以下结构的RV33：
Figure 176814DEST_PATH_IMAGE007
在一个实施方案中，示例性阳离子脂质是具有以下结构的RV37：
Figure 110135DEST_PATH_IMAGE008
在一个实施方案中，所述LNP包含阳离子脂质RV39，即2,5-双(4-(二甲基氨基)丁酸(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基)苄酯)：
Figure 513434DEST_PATH_IMAGE009
在一个实施方案中，示例性阳离子脂质是具有以下结构的RV42：
Figure 615120DEST_PATH_IMAGE010
在一个实施方案中，示例性阳离子脂质是具有以下结构的RV44：
Figure 900608DEST_PATH_IMAGE011
在一个实施方案中，示例性阳离子脂质是具有以下结构的RV73：
Figure 637620DEST_PATH_IMAGE012
在一个实施方案中，示例性阳离子脂质是具有以下结构的RV75：
Figure 505213DEST_PATH_IMAGE013
在一个实施方案中，示例性阳离子脂质是具有以下结构的RV81：
Figure 935057DEST_PATH_IMAGE014
在一个实施方案中，示例性阳离子脂质是具有以下结构的RV84：
Figure 379945DEST_PATH_IMAGE015
在一个实施方案中，示例性阳离子脂质是具有以下结构的RV85：
Figure 655068DEST_PATH_IMAGE016
在一个实施方案中，示例性阳离子脂质是具有以下结构的RV86：
Figure 892015DEST_PATH_IMAGE017
在一个实施方案中，示例性阳离子脂质是具有以下结构的RV88：
Figure 227181DEST_PATH_IMAGE018
在一个实施方案中，示例性阳离子脂质是具有以下结构的RV91：
Figure 533266DEST_PATH_IMAGE019
在一个实施方案中，示例性阳离子脂质是具有以下结构的RV92：
Figure 612081DEST_PATH_IMAGE020
在一个实施方案中，示例性阳离子脂质是具有以下结构的RV93：
Figure 313321DEST_PATH_IMAGE021
在一个实施方案中，示例性阳离子脂质是二辛酸2-(5-((4-((1,4-二甲基哌啶-4-羰基)氧基)十六烷基)氧基)-5-氧杂戊基)丙烷-1,3-二基酯( RV94)，其具有以下结构：
Figure 84967DEST_PATH_IMAGE022
在一个实施方案中，示例性阳离子脂质是具有以下结构的RV95：
Figure 35606DEST_PATH_IMAGE023
在一个实施方案中，示例性阳离子脂质是具有以下结构的RV96：
Figure 918111DEST_PATH_IMAGE024
在一个实施方案中，示例性阳离子脂质是具有以下结构的RV97：
Figure 129650DEST_PATH_IMAGE025
在一个实施方案中，示例性阳离子脂质是具有以下结构的RV99：
Figure 806619DEST_PATH_IMAGE026
在一个实施方案中，示例性阳离子脂质是具有以下结构的RV101：
Figure 978974DEST_PATH_IMAGE027
在一个实施方案中，所述阳离子脂质选自：RV28、RV31、RV33、RV37、RV39、RV42、RV44、RV73、RV75、RV81、RV84、RV85、RV86、RV88、RV91、RV92、RV93、RV94、RV95、RV96、RV97、RV99和RV101。在一个实施方案中，所述阳离子脂质选自：RV39、RV88和RV94。
用于合成具有式I和RV28、RV31、RV33、RV37、RV39、RV42、RV44、RV73、RV75、RV81、RV84、RV85、RV86、RV88、RV91、RV92、RV93、RV94、RV95、RV96、RV97、RV99和RV101的化合物的组合物和方法可以在2014年12月17日提交的PCT/US2014/070882(公开号WO/2015/095340)和PCT/US2014/070891(公开号WO/2015/095346)；以及在2015年9月4日提交的PCT/US2015/048535(公开号WO/2016/037053)中找到。
在一些实施方案中，制造包含封装RNA的脂质体的非病毒递送系统的方法包括以下步骤：(a)混合(i)包含溶剂、可电离的阳离子脂质、两性离子脂质、固醇和选择的PEG化脂质的第一溶液；(ii)包含水和RNA的第二溶液；和(b)除去溶剂。所述混合可以在T-形结装置、微流体装置等中实施，如WO2012031046和/或PCT/IB2018/053850中所述。
根据本发明的免疫原性组合物可以是药物组合物，例如疫苗组合物。因此，所述组合物还可以包含药学上可接受的载体。
“药学上可接受的载体”包括本身不诱导产生对接受所述组合物的个体有害的抗体的任何载体。合适的载体通常是大的、缓慢代谢的大分子，诸如蛋白、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物、蔗糖、海藻糖、乳糖和脂质聚集体(诸如油滴或脂质体)。此类载体是本领域普通技术人员众所周知的。所述组合物还可以含有药学上可接受的稀释剂，诸如水盐水、甘油等。另外，可以存在辅助物质，诸如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。不含热原的无菌磷酸盐缓冲生理盐水是典型的载体。
药物组合物可以包括在普通水(例如“w.f.i.”)中或在缓冲液、例如磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、硼酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液或柠檬酸盐缓冲液中在本文别处描述的免疫原性组合物、核酸序列和/或多肽序列。缓冲盐将通常包括在5-20mM范围内。药物组合物可以具有在5.0和9.5之间、例如在6.0和8.0之间的pH。组合物可以包括钠盐(例如氯化钠)，以提供张力。10 ± 2 mg/mL NaCl的浓度是典型的，例如约9 mg/mL。组合物可以包括金属离子螯合剂。这些可以通过除去可以加速磷酸二酯水解的离子来延长RNA稳定性。因此，组合物可以包括EDTA、EGTA、BAPTA、戊酸等中的一种或多种。此类螯合剂通常以10 -500μM之间、例如0.1 mM存在。柠檬酸盐，诸如柠檬酸钠，也可以充当螯合剂，同时有利地还提供缓冲活性。药物组合物可以具有在200 mOsm/kg和400 mOsm/kg之间、例如在240-360 mOsm/kg之间或在290-310 mOsm/kg之间的重量摩尔渗透压浓度。药物组合物可以包括一种或多种防腐剂，诸如硫柳汞或2-苯氧基乙醇。无汞的组合物是优选的，并且可以制备无防腐剂的疫苗。药物组合物可以是防腐的或无菌的。药物组合物可以是无热原的，例如，含有<1 EU(内毒素单位，一种标准量度)/剂量，且优选<0.1 EU/剂量。药物组合物可以无谷蛋白。药物组合物可以以单位剂型制备。在一些实施方案中，单位剂量可以具有在0.1 - 1.0mL之间、例如约0.5 ml的体积。
在一些实施方案中，本文公开的组合物是免疫原性组合物，当施用于受试者时，其诱导体液和/或细胞抗原特异性免疫应答(即，特异性识别天然存在的流感病毒抗原多肽的免疫应答)。例如，在流感病毒感染后，相对于未治疗的受试者，免疫原性组合物可以诱导记忆性T和/或B细胞群。在一些实施方案中，所述受试者是脊椎动物，诸如哺乳动物，例如人或兽医哺乳动物。
本发明的免疫原性组合物可以配制为疫苗组合物。所述疫苗将包含免疫有效量的抗原。“免疫有效量”意指向受试者施用该量(在单个剂量中或作为一系列的部分)对于诱导受试者中的可测量的针对流感病毒的免疫应答是有效的。该量取决于待治疗个体的健康和身体状况、年龄、待治疗个体的分类群(例如人、非人灵长类等)、个体免疫系统合成抗体的能力、期望的保护程度、所述组合物或疫苗的制剂、治疗医生对医疗状况的评价、疾病的严重程度、施用的化合物的功效、施用模式以及其他相关因素而变。预期该量将落入可以通过常规试验确定的相对广泛的范围内。如本文所公开的疫苗可以是预防性的(即预防感染)或治疗性的(即治疗感染)，但通常将是预防性的。在一些实施方案中，本文公开的疫苗组合物可以诱导针对流感病毒感染的有效免疫应答，即足以治疗或预防流感病毒感染的应答。
在一些实施方案中，本发明的免疫原性组合物进一步包含额外的抗原。在一些实施方案中，将所述免疫原性组合物与包含额外的抗原的另外的组合物组合施用于受试者。
在一个具体实施方案中，提供了药物组合物(诸如疫苗组合物)，其包含以下或由以下组成：(i) 3至10种自我复制RNA分子，其中每种自我复制RNA分子编码包含来自流感病毒的抗原的多肽，其中每种抗原来自与其他抗原不同的流感病毒毒株，且其中所述自我复制RNA分子被配制在脂质纳米颗粒(LNP)中，(iii)药物载体、稀释剂和/或缓冲剂，和任选地(iii)佐剂。
例如，提供了疫苗组合物，其包含以下或由以下组成：(i)在脂质纳米颗粒(LNP)中配制的3至10种自我复制RNA分子，和(ii)药物载体、稀释剂和/或缓冲剂，其中：
- 每种自我复制RNA分子编码包含来自流感病毒的抗原的多肽，
- 每种抗原来自与其他抗原不同的流感病毒毒株，且
- 所述LNP包含中性脂质、阳离子脂质、胆固醇和聚乙二醇(PEG)，其形成涵盖自我复制RNA的纳米颗粒。在某些实施方案中，所述中性脂质是DSPC，且所述阳离子脂质是DLinDMA。
本发明的免疫原性组合物还可以包含一种或多种佐剂(例如疫苗佐剂)或与一种或多种佐剂(例如疫苗佐剂)结合施用。佐剂意指，与单独施用所述抗原相比，其能够增强针对抗原的免疫应答。在一些方面，如本文所公开的佐剂组合物进一步包含一种或多种免疫刺激剂，例如皂苷，诸如QS21。
可用于本发明的组合物中的佐剂包括但不限于：(A)含有矿物质的组合物，例如铝和钙盐，诸如磷酸铝。(B)油乳剂，例如水包角鲨烯乳剂，诸如MF59或AS03。也可以使用完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IF A)。(C)皂苷制剂。(D)病毒体和病毒样颗粒(VLP)。(E)细菌或微生物衍生物，诸如肠细菌脂多糖(LPS)的无毒衍生物、脂质A衍生物、免疫刺激性寡核苷酸和ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物。(F)人免疫调节剂，例如细胞因子，诸如白介素、干扰素、巨噬细胞集落刺激因子和肿瘤坏死因子。(G)生物粘合剂和粘膜粘合剂，诸如酯化的透明质酸微球，聚(丙烯酸)、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖和羧甲基纤维素的交联衍生物。(H)微粒，例如由可生物降解且无毒的材料(例如，聚(a-羟基酸)、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚酸酐、聚己内酯等，其中聚(丙交酯-共-乙交酯)是优选的)形成的直径为~100nm至~150μm、更优选直径为~200nm至~30μm且最优选直径为~500nm至~10 μm)的颗粒，其任选地经处理以具有带负电荷的表面(例如用SDS)或带正电荷的表面(例如用阳离子去垢剂，诸如CTAB)。(I)脂质体。(J)聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯制剂。(K)聚磷腈(PCPP)。(L)胞壁酰肽。(M)咪唑并喹诺酮化合物，例如咪喹莫特及其同系物。
本发明也可以使用以上鉴定的一种或多种佐剂的组合。
在一个具体实施方案中，提供了根据本发明的疫苗组合物。
施用和用途
使用方法
在一些实施方案中，提供了用于诱导有此需要的受试者中针对流感病毒感染的免疫应答的方法，其包括施用免疫有效量的如本文所公开的免疫原性或药物组合物的步骤。
在一些实施方案中，提供了本文公开的组合物用于诱导有此需要的受试者中针对流感病毒抗原的免疫应答的用途。在一些实施方案中，提供了本文公开的组合物用于诱导受试者中针对流感病毒感染的免疫应答的用途。在一些实施方案中，提供了如本文所公开的组合物在制备诱导受试者中针对流感病毒感染的免疫应答的药物中的用途。
“受试者”意为脊椎动物，诸如哺乳动物，例如人或兽医哺乳动物。在一些实施方案中，所述受试者是人。“免疫应答”意指体液和/或细胞抗原特异性免疫应答(即特异性识别抗原多肽的免疫应答)，其可以被证明在体外中和流感病毒或在体内控制/减少/消除感染病毒感染。在一些实施方案中，所述免疫应答的特征在于针对流感病毒的免疫记忆和/或有效的流感病毒应答性记忆性T细胞群体。
在一些实施方案中，本文公开的组合物用于疗法或医学中。在一个优选实施方案中，所述疗法是疫苗疗法。优选地，所述疗法是预防流感病毒感染的疫苗。在一些实施方案中，本文公开的组合物用于预防或治疗流感或用于预防或治疗有此需要的受试者中的流感病毒感染。在一些实施方案中，本文公开的组合物用于诱导有此需要的受试者中针对流感病毒感染的免疫应答。
本文所述的组合物可用于预防多种不同的流感病毒毒株的流感病毒感染，或用于诱导针对多种不同的流感病毒毒株中的任一种的感染的免疫应答。例如，组合物可用于针对两种或更多种H1型和/或两种或更多种H3型流感病毒毒株预防或缩短流感病毒感染。所述组合物可以用于针对季节性和流行性流感病毒毒株两者预防或缩短流感病毒感染。在一些实施方案中，本文所述的组合物可用于针对流感病毒的同源和/或异源毒株预防流感病毒感染。在一个实施方案中，所述组合物可用于针对流感病毒的亚型内和/或异亚型毒株预防流感病毒感染。
因此，在某些实施方案中，提供了如本文所公开的免疫原性或药物组合物，其用于针对流感病毒的亚型内毒株预防流感病毒感染。
在一个具体实施方案中，提供了用于针对流感病毒的同源和/或异源毒株预防流感病毒感染的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物包含(i)编码包含第一抗原的多肽的第一自我复制RNA分子和(ii)编码包含第二抗原的多肽的第二自我复制RNA分子，其中：
- 所述第一和第二抗原均来自流感病毒，但所述第一抗原来自与所述第二抗原不同的流感病毒毒株，
- 所述第一和第二抗原是血凝素或其免疫原性片段或变体，且
- 所述自我复制RNA分子被配制在脂质纳米颗粒(LNP)或阳离子纳米乳剂(CNE)中。
在一个具体实施方案中，提供了用于针对流感病毒的同源和/或异源毒株预防流感病毒感染的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物包含(i)编码包含第一抗原的多肽的第一自我复制RNA分子和(ii)编码包含第二抗原的多肽的第二自我复制RNA分子，其中：
- 所述第一和第二抗原均来自流感病毒，但所述第一抗原来自与所述第二抗原不同的流感病毒毒株，
- 所述第一和第二抗原是血凝素或其免疫原性片段或变体，
- 所述自我复制RNA分子被配制在脂质纳米颗粒(LNP)或阳离子纳米乳剂(CNE)中，且
- 除了编码包含来自流感病毒的抗原的多肽以外，每种自我复制RNA分子还编码RNA-依赖性的RNA聚合酶，其可以从所述自我复制RNA分子转录RNA。
在一个进一步具体实施方案中，提供了用于针对流感病毒的同源和/或异源的亚型内毒株预防流感病毒感染的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物包含(i)编码包含第一抗原的多肽的第一自我复制RNA分子和(ii)编码包含第二抗原的多肽的第二自我复制RNA分子，其中：
- 所述第一和第二抗原均来自流感病毒，但所述第一抗原来自与所述第二抗原不同的流感病毒毒株，
- 所述第一和第二抗原是血凝素或其免疫原性片段或变体，且
- 除了编码包含来自流感病毒的抗原的多肽以外，每种自我复制RNA分子还编码RNA-依赖性的RNA聚合酶，其可以从所述自我复制RNA分子转录RNA。
在一个进一步具体实施方案中，提供了用于针对流感病毒的同源和/或异源的亚型内毒株预防流感病毒感染的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物包含(i)编码包含第一抗原的多肽的第一自我复制RNA分子、(ii)编码包含第二抗原的多肽的第二自我复制RNA分子和(iii)编码包含第三抗原的多肽的第三自我复制RNA分子，其中：
- 所述第一、第二和第三抗原均来自流感病毒，但所述第一、第二和第三抗原全部来自不同的流感病毒毒株，
- 所述第一、第二和第三抗原是血凝素或其免疫原性片段或变体，且
- 所述自我复制RNA分子被配制在脂质纳米颗粒(LNP)或阳离子纳米乳剂(CNE)中。
在一个进一步具体实施方案中，提供了用于针对流感病毒的同源和/或异源的亚型内毒株预防流感病毒感染的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物包含(i)编码包含第一抗原的多肽的第一自我复制RNA分子、(ii)编码包含第二抗原的多肽的第二自我复制RNA分子和(iii)编码包含第三抗原的多肽的第三自我复制RNA分子，其中：
- 所述第一、第二和第三抗原均来自流感病毒，但所述第一、第二和第三抗原全部来自不同的流感病毒毒株，
- 所述第一、第二和第三抗原是血凝素或其免疫原性片段或变体，且
- 除了编码包含来自流感病毒的抗原的多肽以外，每种自我复制RNA分子还编码RNA-依赖性的RNA聚合酶，其可以从所述自我复制RNA分子转录RNA。
在一个进一步具体实施方案中，提供了用于针对流感病毒的同源和/或异源的亚型内毒株预防流感病毒感染的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物包含(i)编码包含第一抗原的多肽的第一自我复制RNA分子、(ii)编码包含第二抗原的多肽的第二自我复制RNA分子和(iii)编码包含第三抗原的多肽的第三自我复制RNA分子，其中：
- 所述第一、第二和第三抗原均来自流感病毒，但所述第一、第二和第三抗原全部来自不同的流感病毒毒株，
- 所述第一、第二和第三抗原是血凝素或其免疫原性片段或变体，
- 所述自我复制RNA分子被配制在脂质纳米颗粒(LNP)或阳离子纳米乳剂(CNE)中，且
- 除了编码包含来自流感病毒的抗原的多肽以外，每种自我复制RNA分子还编码RNA-依赖性的RNA聚合酶，其可以从所述自我复制RNA分子转录RNA。
在一些实施方案中，提供了用于在有此需要的受试者中预防或缩短流感病毒感染和/或减轻或预防流感病毒感染后的临床症状的方法，其包括向所述受试者施用免疫有效量的如本文所提供的免疫原性组合物。
在一些实施方案中，提供了用于针对多种不同的流感病毒毒株预防或缩短流感病毒感染的方法。例如，所述方法可用于针对两种或更多种H1型和/或两种或更多种H3型流感病毒毒株和任选地针对两种或更多种乙型流感病毒毒株预防或缩短流感病毒感染。所述方法可以用于针对季节性和流行性流感病毒毒株两者预防或缩短流感病毒感染。在一些实施方案中，本文所述的方法可用于针对流感病毒的同源和/或异源毒株预防流感病毒感染。
在一些实施方案中，提供了本文公开的组合物在制备免疫原性组合物中的用途，所述免疫原性组合物用于预防或缩短受试者中的流感病毒感染和/或减少或预防受试者中的流感病毒感染后的临床症状。
在一些实施方案中，所述受试者是人受试者。在具体实施方案中，所述人受试者已经暴露于流感病毒感染或处于暴露于流感病毒感染的风险中。
在一些实施方案中，可以使用包含一种或多种自我复制RNA分子的多种组合物，所述自我复制RNA分子编码包含来自流感病毒的抗原的多肽。因此，提供了针对流感疾病预防和/或治疗的方法，其包括(i)施用包含第一自我复制RNA分子和药学上可接受的载体的第一免疫原性组合物，和(ii)同时或依次施用包含第二自我复制RNA分子和药学上可接受的载体的第二免疫原性组合物，其中所述第一和第二自我复制RNA分子各自编码来自流感病毒的抗原的多肽，但所述第一自我复制RNA分子编码来自与由所述第二自我复制RNA分子编码的抗原不同的流感毒株的抗原。
所述组合物可以依次施用，例如在基本上相同的时间，诸如以少于10小时、1秒至10小时或1秒至1小时的间隔，或者以10小时至6个月、10小时至1个月、10小时至2周、10小时至1周或10小时至1天的较大间隔施用。优选地，以1秒至10小时的间隔依次施用。所述第一或第二免疫原性组合物可以包含一种或多种额外的(例如，第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9和/或第10种)自我复制RNA分子，其各自编码包含来自流感病毒的抗原的多肽，但其中每种自我复制RNA分子中的抗原来自与来自流感病毒的其他抗原不同的流感病毒毒株。
因此，在一个具体实施方案中，提供了针对流感疾病预防和/或治疗的方法，其包括(i)施用包含第一自我复制RNA分子和药学上可接受的载体的第一免疫原性组合物，和(ii)同时或依次施用包含第二自我复制RNA分子和药学上可接受的载体的第二免疫原性组合物，其中：
- 所述第一和第二自我复制RNA分子各自编码多肽，所述多肽编码来自流感病毒的抗原，但所述第一自我复制RNA分子编码来自与由所述第二自我复制RNA分子编码的抗原不同的流感毒株的抗原，
- 所述来自流感病毒的抗原是血凝素或其免疫原性片段或变体，且
- 在所述第一免疫原性组合物之后1天至6个月施用所述第二免疫原性组合物。
还提供了包含第一自我复制RNA分子和药学上可接受的载体的第一免疫原性组合物，其用于预防流感疾病的方法中，所述方法包括向有此需要的受试者施用所述第一免疫原性组合物，随后施用包含自我复制RNA分子和药学上可接受的载体的第二免疫原性组合物，其中所述第一和第二自我复制RNA分子各自编码包含抗原的多肽，其中所述抗原来自流感病毒，但由所述第一自我复制RNA分子编码的抗原来自与由所述第二自我复制RNA分子编码的抗原不同的流感病毒毒株。
所述组合物可以以少于10小时、1秒至10小时或1秒至1小时的间隔，或者以10小时至6个月、10小时至1个月、10小时至2周、10小时至1周或10小时至1天的较大间隔施用。所述第一/第二免疫原性组合物可以包含一种或多种额外的(例如，第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9和/或第10种)自我复制RNA分子，其各自编码包含来自流感病毒的抗原的多肽，但其中每种自我复制RNA分子中的抗原来自与来自流感病毒的其他抗原不同的流感病毒毒株。
在一个具体实施方案中，提供了包含第一自我复制RNA分子和药学上可接受的载体的第一免疫原性组合物，其用于预防流感疾病的方法中，所述方法包括向有此需要的受试者施用所述第一免疫原性组合物，随后施用包含自我复制RNA分子和药学上可接受的载体的第二免疫原性组合物，其中：
- 所述第一和第二自我复制RNA分子各自编码包含抗原的多肽，其中所述抗原来自流感病毒，但由所述第一自我复制RNA分子编码的抗原来自与由所述第二自我复制RNA分子编码的抗原不同的流感病毒毒株，且
- 所述来自流感病毒的抗原是血凝素或其免疫原性片段或变体，且
- 在所述第一免疫原性组合物之后1天至6个月施用所述第二免疫原性组合物。
施用途径/剂量
本文公开的组合物通常将直接施用于受试者。直接递送可以通过肠胃外注射(例如皮下、腹膜内、静脉内、肌肉内、真皮内注射或注射至组织的间隙)来完成。替代的递送途径包括直肠、经口(例如片剂，喷雾剂)、经颊、舌下、阴道、局部、透皮或经皮、鼻内、经眼、经耳、经肺或其他粘膜施用。皮内和肌肉内施用是两种优选的途径。注射可以经由针头(例如皮下注射针头)，但可以替代地使用无针头注射。剂量体积可以是0.25ml至1ml，特别是0.5ml或0.7ml。将常规地根据原始散装样品中的RNA浓度以及还根据递送途径进行剂量体积的轻微调整，而其中较小剂量通过鼻内或皮内途径给予。典型的人肌肉内剂量体积为0.5ml。
自我复制RNA疫苗的剂量可以具有约50 μg至约100 μg核酸。在一个实施方案中，疫苗剂量含有50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100 μg自我复制RNA。在其他实施方案中，根据本发明的组合物的剂量可以具有＜10μg自我复制RNA；例如1-10μg，诸如约1μg、2.5μg、5μg、7.5μg或10μg，但表达可以在低得多的水平看到；例如使用<1μg/剂、<100ng/剂、<10ng/剂、<1ng/剂等。
在优选实施方案中，本文公开的组合物以有效剂量施用于受试者，所述有效剂量意指足以实现期望的免疫应答、诸如诱导针对流感病毒的中和抗体和/或针对流感病毒感染的保护的剂量。
在一些实施方案中，本文所述的组合物(诸如疫苗组合物)具有的有效剂量小于或等于编码相同抗原的DNA疫苗或疫苗组合物的有效剂量的50%、40%、30%、20%或10%。在一些实施方案中，本文描述的疫苗具有的有效剂量是编码相同抗原的DNA疫苗或疫苗组合物的有效剂量的三分之一或更少。
制备/配制的方法
本文提供了用于制备自我复制RNA的方法。在一些实施方案中，制备自我复制RNA的方法包括如本文别处所述的体外转录(IVT)的步骤。在一些实施方案中，制备自我复制RNA的方法包括IVT以产生RNA的步骤，并且进一步包括组合RNA与如本文别处所述的非病毒递送系统的步骤。在一些实施方案中，制备自我复制RNA的方法包括IVT以产生RNA的步骤，并且进一步包括组合RNA与如本文别处所述的CNE或LNP递送系统的步骤。
序列同一性
关于氨基酸序列的同一性或同源性在本文中定义为，在比对序列并按需要引入空位以达到最大序列同一性百分比，并且不将任何保守取代视作序列同一性的一部分之后与参考氨基酸序列相同的候选序列中的氨基酸残基的百分比。关于核酸序列的同一性或同源性在本文中定义为，在比对序列并按需要引入空位以达到最大序列同一性百分比之后与参考核酸序列相同的候选序列中的核苷酸的百分比。
序列同一性可以通过标准方法确定，所述标准方法通常用于比较两个多肽的氨基酸位置的相似性。使用计算机程序诸如BLAST，比对两个多肽以使它们各自的氨基酸最佳匹配(沿着一个或两个序列的全长或沿着一个或两个序列的预定部分)。程序提供默认开放罚分和默认空位罚分，以及评分矩阵、诸如PAM 250 [标准评分矩阵；参见Dayhoff等人, 于Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, supp. 3 (1978)]可以与计算机程序结合使用。例如，百分比同一性然后可以计算为：相同匹配的总数乘以100，然后除以匹配范围内较长序列的长度和引入较短序列中以便比对两个序列的空位数之和。用于比较多肽的相同方法也可以用于计算两个多核苷酸序列的百分比同一性。
在本发明通过参考UniProt或Genbank登录码指代序列的情况下，所指的序列是在本申请的申请日的当前版本。
通用
除非另有解释，本文使用的所有技术和科学术语具有如本公开内容所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。单数术语"一个/种(a)"、"一个/种(an)"和"所述/该"包括复数指示对象，除非上下文清楚地另外指示。类似地，词语"或"意在包括"和"，除非上下文清楚地另外指示。术语"复数"是指两个/种或更多个/种。另外，关于物质的浓度或水平(例如溶液组分浓度或其比率)和反应条件(例如温度、压力和循环时间)给出的数值限制旨在是近似的。本文使用的术语“约”意指量±10％。
术语“包含”意指“包括”。因此，除非上下文另有要求，词语“包含(comprises)”和变体、诸如“包含(comprise)”和“包含(comprising)”将被理解为暗示包括所述化合物或组合物(例如，核酸，多肽，抗原)或步骤，或一组化合物或步骤，但不排除任何其他化合物、组合物、步骤或其组。被描述为包括某些组分的实施方案意在包括由指示的组分组成的实施方案。
缩写“例如(e.g.)”衍生自拉丁语例如(exempli gratia)，并且在本文中用于指示非限制性实例。因此，缩写“例如(e.g.)”与术语“例如(for example)”是同义的。
将通过参考以下非限制性附图和实施例进一步描述本发明。
实施例
实施例1 - 材料和方法
流感H3N2疫苗毒株的选择
基于以下三个主要标准选择流感H3N2亚型的潜在流行性和季节性毒株：1)主要糖基化位点，2)重要的季节性和流行性疫苗毒株，3)仅细胞适应的毒株。编码流感HA蛋白的全长基因的序列信息获得自关于分享所有流感数据的全球倡议Epiflu数据库(www.gisaid.org)。选择来自A/Bilthoven/16398/1968 (EPI362379)、A/Bangkok/1/79(EPI367158)、A/Beijing/32/92 (EPI365898)、A/Fujian/411/2002 (EPI362915)、A/Brisbane/10/2007 (EPI362338)和A/Texas/50/2012 (EPI398417)的所有一共6种H3N2 HA基因区段。
毒株 EPI-区段-ID*
A/California/07/2009 (H1N1) EPI516528
A/PR/8/34 (H1N1) EPI131282
A/turkey/Turkey/1/2005 (H5N1) EPI102703
A/Bilthoven/16398/1968 (H3N2) EPI362379
A/Bangkok/1/79 (H3N2) EPI367158
A/Beijing/32/92 (H3N2) EPI365898
A/Fujain/411/2002 (H3N2) EPI362915
A/Brisbane/10/2007 (H3N2) EPI362338
A/Texas/50/2012 (H3N2) EPI398417
A/Anhui/1/2013 (H7N9) EPI539507
A/Memphis/1/1971 (H3N2) EPI137302
A/Moscow/10/1999 (H3N2) EPI103359
A/Japan/305/1957 (H2N2) EPI240974
A/duck/Hongkong/562/1979 (H10N9) EPI42118
*来源：关于分享所有流感数据的全球倡议Epiflu数据库(www.gisaid.org)。
SAM复制子和RNA合成
在基于甲病毒的SAM载体TC83中分别克隆A/California/07/2009 (H1N1)、A/PR/8/1934 (H1N1)、A/turkey/Turkey/5/2005 (H5N1)、A/Bilthoven/16398/1968 (H3N2)、A/Bangkok/1/79 (H3N2)、A/Beijing/32/92 (H3N2)、A/Fujian/411/2002 (H3N2)、A/Brisbane/10/2007 (H3N2)、A/Texas/50/2012 (H3N2)和A/Shanghai/1/2013 (H7N9)的全长HA基因区段之后，生成单顺反子SAM (HA)疫苗构建体，SAM (H1-Cal)、SAM (H1-PR8)、SAM(H5-turkey)、SAM (H3-Biltho)、SAM (H3-Bang)、SAM (H3-Beij)、SAM (H3-Fuj)、SAM (H3-Bris)、SAM (H3-Tex)和SAM (H7-Shan)。类似地，通过使用通过重叠延伸剪接(SOEing)方法以单体HA形式作为初始PCR模板，克隆在全长2A-驱动序列下游的第二HA基因，产生携带两个HA基因(H5和H1)的双顺反子SAM构建体(图1a)。用于SOEIng PCR的引物在下面显示：
Figure 134012DEST_PATH_IMAGE028
如先前所述(Hekele等人 Emerg Microbes Infect 2013;2 doi:ARTN e52DOI10.1038/emi.2013.54)制备自我扩增mRNA。简而言之，全长HA基因是化学合成的(GeneArt,Thermo Fischer, USA)或从使用正向引物5'-ATT CCC GTC GAC GCC ACC ATG AAG GCAATA CTA GTA GTT CT-3'和反向引物5'-ATT TAC GCC TAG GTT ATC AAA TAC ATA TTC TACACT GTA GAG AC-3')从流感H1N1 A/California/07/2009的逆转录的RNA基因组扩增。还扩增来自A/turkey/Turkey/01/2005 (H5N1)病毒毒株的全长H5 HA基因(H5)。进一步，从DNA片段扩增来自A/Shanghai/2/2013的H7 HA基因，基于先前描述的具有错误校正的酶促等温组装方法(Dormitzer等人 Sci Transl Med 2013, 15;5(185):185ra68)，使用正向引物5'-AAT TAA GTC GAC GCC ACC ATG AAC ACT CAA ATC CTG GTA TTC G-3'和反向引物5'-AAT TAA TCT AGA TTA TCA TAT ACA AAT AGT GCA CCG CAT G-3'进行组装。将扩增子克隆至显示为SEQ ID NO:[对于TC83序列，INSERT no.]的A836 TC83载体中。
质粒在大肠杆菌中扩增，并使用Qiagen maxi Kits (Qiagen, Valencia, CA,USA)纯化。通过用PmeI限制性消化，DNA在自我扩增RNA序列的紧接3'末端之后线性化。使用MEGAscript T7 Kit (Life Technologies)将线性化的DNA质粒转录成RNA，并通过LiCl沉淀纯化。RNA然后使用ScriptCap m7G加帽系统(Cell Script)加帽，并在配制前通过2.8 MLiCl沉淀纯化。蛋白表达通过转染的幼仓鼠肾脏(BHK)细胞裂解物的Western印迹分析进行证实。
RNA扩增和蛋白表达分析
实施RNA扩增效率，如先前所报道(Magini等人, PLoS One 2016;11(8):e0161193)。简而言之，将BHK细胞用200 ng RNA电穿孔，并在37℃和5% CO2下孵育过夜(15-17)小时。第二天，收集细胞并用Live/Dead Aqua (Invitrogen)，APC-缀合的抗双链(ds)RNA抗体(J2单克隆小鼠抗体IgG2aκ链，Bioclass)染色。通过FACS CANTO II流式细胞仪(BDBiosciences)分析dsRNA+细胞的频率。
为了证实来自复制子RNA的HA的表达，使用Lipofectamine 2000TM(LifeTechnologies, CA, USA)用3 µg每种RNA转染106个BHK细胞。转染后16小时收获细胞，并在100 µL具有完全蛋白酶抑制剂混合物(Roche, Madison, WI, USA)的1X放射-免疫沉淀测定(RIPA)缓冲液(Cell Signaling Technology, MA, USA)中裂解。将裂解物进行SDS-PAGE并印迹至PVDF膜上。用HA-特异性单克隆或多克隆抗体检测蛋白表达。
LNP/RNA制剂
将等量的RNA混合，然后封装于LNP中。针对粒径、RNA浓度、封装效率和RNA完整性(使用凝胶电泳)表征制剂，如先前所述(Hekele等人, Emerg Microbes Infect 2013)。如先前所述(Geall等人 Proc Natl Acad Sci USA 2012;109:14604-9)进行RNA在LNP内的封装。如先前所述(Heyes等人, J Control Release 107:276-287)合成DLinDMA。1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)购自Genzyme。胆固醇获得自Sigma-Aldrich。1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](铵盐)(PEG DMG 2000)获得自Avanti Polar Lipids。使用乙醇稀释工艺来生产具有以下脂质组分摩尔比的LNP制剂：DSPC: 胆固醇: PEG-DMG 2000: DLinDMA 10:48:2:40摩尔百分比。对于制剂，使用8:1 N:P摩尔比(DlinDMA上的氮:RNA上的磷酸酯)和100 mM柠檬酸盐缓冲液(pH 6)。在线混合的第一步中，经由KDS-220注射泵(kdScientific)通过T-型接头，将等体积的脂质(在乙醇中)和RNA在缓冲液中混合，并且将具有等体积的缓冲液的第三个注射器同时添加至脂质/RNA混合物中。在室温下平衡1 h后，将混合物进一步用1:1 vol/vol柠檬酸盐缓冲液稀释。接下来，将获得的(“RV01” LNPs)浓缩，并使用切向流过滤(TFF)(Spectrum Labs)用具有100-kDa孔径截止值和20 cm2表面积的聚醚砜(PES)中空纤维膜针对1× PBS进行透析。对于体外和体内实验，将制剂用1× PBS (Teknova)稀释至所需的RNA浓度。
体内模型
遵照ARRIVE准则以及GSK动物福利政策和标准，将小鼠圈养在GlaxoSmithKline(GSK)疫苗动物设施中。6-8周龄的雌性BALB/c小鼠获得自Charles River Laboratories,Italy。为了获得广泛的免疫应答，10只小鼠的组用各0.1μg的各LNP封装的单顺反子或双顺反子SAM RNA以3周间隔两次肌肉内(i.m.)免疫：单独的SAM (H1-Cal)；SAM (H5-turkey)；SAM (H5-H1)或以下组的组合：SAM(H1)+SAM(H5)；SAM(H3-Biltho)+SAM(H3-Bang)+SAM(H3-Fuj) [第2组]；SAM(H3-Beij)+SAM(H3-Bris)+SAM(H3-Tex) [第3组]；SAM(H1-Cal)+SAM(H1-PR8)+SAM(H5-turkey)+SAM (H7-Shan) [第4组]；SAM(H3-Biltho)+SAM(H3-Bang)+SAM(H3-Fuj)+SAM(H3-Beij)+SAM(H3-Bris)+SAM(H3-Tex) [第5组]和SAM(H3-Biltho)+SAM(H3-Bang)+SAM(H3-Fuj)+SAM(H3-Beij)+SAM(H3-Bris)+SAM(H3-Tex)+SAM (H1-Cal)+SAM(H1-PR8)+SAM(H5-turkey)+SAM (H7-Shan) [第6组](参见图5)。使用PBS作为对照[第1 组]。第二次免疫后2周收集血液样品，用于HA-特异性体液应答评价。从每组收集来自6只动物的脾脏，用于评估CD4+和CD8+ T细胞应答。
血凝抑制测定法
通过血凝抑制(HI)测定法测量的血清Ab滴度，根据标准程序使用成体火鸡红细胞的0.5%悬浮液进行。为了失活非特异性抑制剂，所有血清样品都根据制造商的说明用受体破坏酶(DENKA, Tokyo, Japan)进行预处理。将单独血清的一式两份重复在V-型微量滴定板中连续2-倍稀释，以达到1:10的血清最终稀释度。将稀释的血清样品与等体积的毒株-特异性流感抗原在室温下孵育60 min，随后与0.5%火鸡红血细胞悬浮液孵育60 min。通过目视检查分析结果，并计算HI滴度作为发生最后完全凝集的最后血清稀释度的倒数。
细胞内细胞因子染色
为了表征抗原特异性T-细胞应答，将1.5x106个脾细胞的单细胞悬浮液与2.5 µg/ml 的H1-Cal或H5-turkey (JPT, Berlin, Germany)或H1-PR8 (Department ofBiochemistry, University of Lausanne, Switzerland)肽合并物或CD4限制的ALNNRFQIKGVELKS (对于A/Memphis/1/1971, H3N2)(Fitzmaurice等人, Vaccine 1996;14:553-60)肽和5 µg/ml浓度的重组HA蛋白在含有布雷菲德菌素A的完全RPMI培养基中在CD107a FITC (BD Biosciences, USA)存在的情况下一起培养。对于流式细胞术分析，然后将细胞用Live/Dead Near InfraRed (Invitrogen, USA)、抗CD62L (BD Pharmingen)染色，固定并用Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences)透化，并进一步与抗CD16/CD32 Fc-block (BD Biosciences)孵育。T-细胞用抗CD3-PerCp-Cy5.5、抗CD4-BV510、抗CD8-PE-Texas Red、抗CD44-240 V450、抗IFN-γ Bv785、抗IL-2-PEcy5、抗TNF-BV605 (全部来自eBiosciences)染色。然后在LSRII特殊顺序流式细胞仪(BD Biosciences)上采集样品，并使用FlowJo软件9.7.4版(TreeStar)分析数据。在减去每种细胞因子的相应阴性对照中测量的背景后，测定抗原特异性T-细胞的频率。
统计分析
所有统计分析都使用GraphPad Prism 5软件(GraphPad Software, La Jolla,USA)进行。使用Mann-Whitney U检验来分析HI滴度和T-细胞频率。小于0.05的P值被认为是显著的。
实施例2 - 表达一种或多种流感HA抗原的SAM疫苗的生成和表征
首先，将来自H1N1 (A/California/07/2009)和H5N1 (A/turkey/Turkey/5/2005)的全长HA基因区段克隆至由含有T7 DNA聚合酶启动子的VEE/SINV(委内瑞拉马脑炎-辛德比斯病毒)嵌合复制子(Perri等人; Journal of Virology Oct 2003, p10394-10403)构成的TC83甲病毒载体中，作为单顺反子SAM (H1-Cal)、SAM (H5-turkey)和双顺反子SAM(H5-H1)复制子。在下一步中，再生成8种单顺反子SAM (HA)复制子SAM (H1-PR8)、SAM (H3-Biltho)、SAM (H3-Bang)、SAM (H3-Beij)、SAM (H3-Fuj)、SAM (H3-Bris)、SAM (H3-Tex)和SAM (H7-Shan)。通过来自线性化DNA的酶促转录反应，实施从所有SAM复制子的RNA体外合成。通过定量检测BHK细胞中的细胞内dsRNA，随后进行流式细胞术分析，测量RNA的自我扩增效率。
用单顺反子和双顺反子SAM (HA)复制子转染后dsRNA阳性的BHK细胞与具有已知功效的RNA相当。SAM复制子的蛋白表达能力通过转染BHK细胞且然后进行western印迹分析来测试。从单顺反子和双顺反子SAM(图1)复制子表达来自H1、H5(图1)、H3(图7)和H7的流感HA，使用HA特异性抗体显示蛋白表达。在小鼠免疫之前，如实施例1中所述将SAM复制子封装在LNP递送系统中。通过动态光散射对所有11种LNP/RNA制剂测量平均粒径和多分散性。LNP的Z平均直径范围为137至163 nm，其中多分散指数为0.01至0.14。还针对封装效率测试另外的SAM/LNP复合物，并且显示LNP能够封装近似95%的mRNA。LNP/RNA粒径和封装效率数据表明，LNP是用于核酸递送的优异的递送媒介物。琼脂糖凝胶电泳显示在配制期间维持了RNA完整性。
实施例3-单顺反子SAM(H1-Cal)、SAM(H5-turkey)或双顺反子SAM (H5-H1)疫苗后的体液免疫应答
如先前所提及，10只Balb/c小鼠的各组用0.1 µg并以LNP配制的SAM (H1-Cal)、SAM (H5-turkey)、SAM(H1)+SAM(H5)两者的混合物或SAM (H5-H1)以3周的间隔i.m.接种疫苗两次。第一次免疫后约3周和第二次免疫后2周收集血清样品。然而，针对抗体应答，仅分析最终血清样品，因为先前的结果表明，SAM疫苗可以在第一次免疫后3周已经诱导免疫应答(Hekele等人, Emerg Microbes Infect, 2013; 2, e52)。
通过HI测定法针对HA-特异性功能抗体的存在测试来自接种疫苗的Balb/c小鼠的血清样品。接受单顺反子SAM(H1-Cal)/LNP或SAM(H5-turkey)/LNP疫苗候选物的动物发展的分别针对同源A/California/07/2009 (H1N1)和A/turkey/Turkey/5/2005 (H5N1)的几何平均滴度(GMT)分别为597和905 (图2a和b)。有趣的是，SAM(H5-H1)/LNP的双顺反子的HIGMT看起来比针对A/California/07/2009 (H1N1)和A/turkey/Turkey/5/2005 (H5N1)病毒的单顺反子疫苗低超过两倍，表明单一SAM载体中的两种不同流感抗原的组合在加强功能性抗体应答中是无效的(图2a和b)。此外，SAM(H1)+SAM(H5)/LNP候选疫苗的组合诱导与单顺反子SAM(H1-Cal)或SAM(H5-turkey)相当的应答，并且差异不是统计学显著的(图2a和b)。接下来，我们测试两种不同抗原的组合是否可以诱导交叉反应的功能性抗体。来自接种疫苗的小鼠的血清用抗原性不同的A/PR/8/1934 (H1N1)和A/Perth/16/2009 (H3N2)病毒毒株进行HI分析。在任何接种疫苗组中都没有观察到交叉反应性(图2 c和d)。
讨论
开发了表达来自两种不同流感亚型(H1N1和H5N1)的HA的双顺反子SAM (HA)载体，并测试诱导交叉反应性免疫应答的能力。现有报道表明两种亚型均在人和动物中诱导交叉保护性免疫(Brazzoli等人, J Virol 2015;90:332-44, Wrammert等人, J Exp Med2011;208:181-93, Sridhar等人, Front Immunol 2016;7, Florek等人, J Virol 2014;88:13418-28)。在2剂的双顺反子SAM(H5-H1)或单顺反子SAM(H1-Cal)、SAM(H5-turkey)或SAM(H1)+SAM(H5)疫苗的组合后，没有检测到针对抗原远距离的异源毒株A/PR/8/1934(H1N1)和A/Perth/16/2009)的交叉反应性抗体。不存在抗体介导的交叉反应不足为奇，并且与季节性流感疫苗的每年更新的义务一致。然而，由双顺反子SAM (H5-H1)诱导的抗体应答的强度低于SAM(H1-Cal)或SAM(H5-turkey) (<p= 0.001)，表明表达流感病毒抗原的单个SAM (HA)复制子是更有效的。有趣的是，检测到交叉反应性亚型内和异亚型CD4+和CD8+。结果表明，在交叉反应性中和抗体不存在的情况下，T细胞可以提供针对抗原性不同病毒的保护。
实施例4-单顺反子SAM(H1-Cal)、SAM(H5-turkey)或双顺反子SAM (H5-H1)疫苗后的细胞免疫应答
为了表征由疫苗候选物诱导的功能性T-细胞应答，用0.1 µg SAM/LNP免疫Balb/c小鼠，并且在第二次接种疫苗后2周收集脾细胞，并且用涵盖来自H1-Cal和H5-turkey的全长HA序列的肽合并物进行体外刺激。通过流式细胞术分析产生抗原特异性CD4+和CD8+细胞因子(IFN-γ、TNFα和IL-2)的T-细胞的频率。所有疫苗组都引发具有T辅助(Th)细胞概况Th0/Th1表型的HA-特异性CD4+ T-细胞应答(以IFN-γ以及IFN-γ/TNF和IFN-γ/TNF/IL-2的组合的分泌为主) (图2 e、f和g)。还研究了流感病毒HA-特异性CD8+ T-细胞，并且发现大多数HA-特异性T细胞对IFN-γ和TNF细胞因子是阳性的(图2 h、I和j)。此外，还观察到细胞表面标志物CD107a的表达，其对于与细胞毒性活性相关的脱粒是特异性的。发现大量CD8+T-细胞对于CD107a是阳性的(图2 k、l和m)。用跨越来自H1/PR/8流感病毒的全长HA的肽合并物刺激来自用SAM (H1-Cal)和SAM (H5-turkey)接种疫苗的Balb/c小鼠的脾细胞，用于测定异源T-细胞应答。受刺激的CD4+和CD8+细胞与错配的H1-PR8肽合并物反应(图2 g、j和m)，表明在来自异源病毒毒株的HA抗原中存在共享的T-细胞表位。由于脾细胞数量的限制，未测试针对双顺反子疫苗候选物的交叉反应性T-细胞应答。
实施例5-用表达H3、H1、H5和H7流感亚型的HA的SAM载体的混合物接种疫苗
功能性抗体的诱导
在本研究中，已经评价由10种SAM复制子构成的混合物的多价疫苗的免疫原性，所述SAM复制子表达来自四种不同流感亚型(H1N1、H3N2、H5N1和H7N9)的HA。将3、4、6或10种不同的mRNA(各自0.1μg)的混合物封装在脂质纳米颗粒(LNP)中。10只Balb/c小鼠的各组用多价SAM (HA)疫苗或PBS进行i.m.免疫。在第二次免疫后两周(第35天)收集血清样品，并且通过HI测定法研究功能性抗体。
首先，用与SAM (HA)混合物疫苗中含有的那些相同的流感HA病毒抗原分析来自接种疫苗的小鼠的血清(同源应答)(图3a至g)。显示所有接种疫苗的小鼠都诱导功能性抗体应答。针对含有3种SAM(HA)的疫苗混合物组(第2组和第3组)的功能性抗体应答显示比混合物组6 (含有10种SAM(HAs))更强的应答。
为了评估多价疫苗是否可以在针对错配流感病毒的保护中具有作用，用异源流感病毒抗原分析血清样品。发现针对除了H7N9 (A/Anhui/2013)以外的所有异源病毒毒株的交叉反应性功能抗体(图3)。在H3N2亚型中观察到更大的应答。还分析针对不同疫苗混合物的HI应答的强度。与具有相同亚型的6种不同RNA的LNP(第5组)相比，具有3种SAM RNA的LNP(第2组和第3组)使抗体应答加强1.1至2.7倍(P< 0.3006)(图3d至g)。而在来自其他亚型的SAM复制子(第2组和第3组，相比于第6组)存在的情况下，3种SAM复制子将应答加强1.3至2.6倍(P <0.0252)(图3 d至g)。与10种SAM RNA(第6组)相比，在具有6种SAM RNA的LNP(第5组)中没有发现增加。在第4组和第6组之间，检测到1.7至4倍的增加(P<0.0094)(图3a和b)。
诱导CD4 + 介导的免疫应答
为了确定多价SAM(HA)疫苗诱导的CD4+ T-细胞应答是否提供针对错配的流感病毒的保护，各组小鼠以3周的间隔用多价SAM (HA)疫苗接种疫苗两次。通过用全长重组HA蛋白和肽合并物体外刺激来自接种疫苗的Balb/c小鼠的脾细胞来分析CD4+ T细胞应答。
首先，测试针对来自同源流感病毒的HA重组蛋白或肽的CD4+ T-细胞应答：A/Fujian/411/2002、A/Brisbane/10/2007、A/Texas/50/2012 (H3N2)、A/turkey/Turkey/1/2005 (H5N1)和A/California/07/2009, A/PR/8/1934 (H1N1)。结果表明针对所有同源流感HA的CD4+ T细胞应答(图4 a至f)。有趣的是，用来自A/California/07/2009、A/PR/8/1934 (H1N1)和A/turkey/Turkey/1/2005 (H5N1)的肽合并物刺激的CD4+ T细胞也诱导其他组中的应答，在所述其他组中，在SAM多价疫苗中不包括来自那些毒株的抗原(图4a至c)。为了确定由多价SAM疫苗赋予的交叉保护，我们分析具有亚型内和异亚型病毒毒株的小鼠脾细胞。含有H3的所有SAM (HA)疫苗组(第2组、第3组、第5组和第6组)都诱导针对远距离或密切相关的H3N2流感病毒毒株的交叉反应性CD4+ T细胞应答。这些结果表明，该病毒的亚型内毒株共有足够数量的T细胞表位。此外，检测到针对其他亚型的CD4+ T细胞应答，在SAM(HA)多价疫苗中未包括来自其他亚型的HA抗原(图4 k和图1)。然而，表达细胞因子的CD4+ T细胞的细胞频率仅为< 0.1%。用10种表达HA抗原的SAM (HA)的第6组中的CD4 T细胞应答表现出与用更少SAM (HA)抗原的那些相当的应答，表明SAM疫苗平台用于开发多价流感疫苗的效用。
讨论
糖基化模式对毒力有直接贡献，并且部分负责流感病毒的独特抗原性。HA的球状头部结构域上存在的糖基化位点可以耐受取代而不损害功能，并且生成的抗体通常是毒株特异性的，且交叉反应性的广度有限(Gomez Lorenzo等人, Chest 2013;143:502-10)。相反，HA茎结构域在几种病毒毒株间高度保守，并且在许多研究中，发现针对该茎的抗体具有交叉中和特性(Sun等人, J Virol, 2013;87:8756-66和Nabel等人, Nat Med 2010;16:1389-91)。因此，HA是多价流感疫苗的有吸引力的候选物。在本实施例中，由于HA抗原中糖基化的较高变异性，因此集中于含有H3N2亚型的多价疫苗。主要选择来自过去和现在的季节性疫苗的毒株，以及流行性毒株。具体而言，从1968年至2012年选择H3毒株，以尝试和捕获头部中的糖基化位点中看到的变异性。
本文所述的实验通过组合来自H1、H3、H5和H7亚型的3种、4种、6种或10种SAM (HA)使用混合物策略，以探索Balb/c小鼠模型中的交叉保护性B和T-细胞免疫应答。特定毒株的序列显示于表2中。通过HI测定法，对于诱导针对同源和异源流感病毒的功能性抗体测试多价SAM (HA)疫苗。由于高氨基酸同源性，观察到同源和亚型内抗体应答(图3 h、i、j和l)(参见下表1)。
Figure 950789DEST_PATH_IMAGE029
表1：流感亚型间的HA基因片段的氨基酸相似性(%)。
使用ClustalW (EMBL-EBI)工具对于H1-Cal (A/California/07/2009)；H1-PR8(A/PR/8/1934)；H5-turkey (A/turkey/Turkey/5/2005)；H3-Biltho (A/Bilthoven/16398/1968)；H3-Bang (A/Bangkok/1/79)；H3-Beij (A/Beijing/32/92)；H3-Fuj (A/Fujian/411/2002)；H3-Bris (A/Brisbane/10/2007)；H3-Tex (A/Texas/50/2012)；H7-Anh(A/Anhui/1/2013)；H3-Mem (A/Memphis/1/1971)；H3-Mos (A/Moscow/10/1999)；H2-Jap(A/Japan/305/1957)；H10-Ho (A/duck/Hongkong/562/1979)的全长HA基因序列进行氨基酸相似性搜索。
毒株 EPI-区段-ID*
A/California/07/2009 (H1N1) EPI516528
A/PR/8/34 (H1N1) EPI131282
A/turkey/Turkey/1/2005 (H5N1) EPI102703
A/Bilthoven/16398/1968 (H3N2) EPI362379
A/Bangkok/1/79 (H3N2) EPI367158
A/Beijing/32/92 (H3N2) EPI365898
A/Fujain/411/2002 (H3N2) EPI362915
A/Brisbane/10/2007 (H3N2) EPI362338
A/Texas/50/2012 (H3N2) EPI398417
A/Anhui/1/2013 (H7N9) EPI539507
A/Memphis/1/1971 (H3N2) EPI137302
A/Moscow/10/1999 (H3N2) EPI103359
A/Japan/305/1957 (H2N2) EPI240974
A/duck/Hongkong/562/1979 (H10N9) EPI42118
表2：获得自关于分享所有流感数据的全球倡议Epiflu数据库(www.gisaid.org)的序列。
尽管不存在针对异型病毒毒株的交叉反应性功能抗体，但用SAM (HA) H3N2多价疫苗接种疫苗显示针对A/PR/8/1934 (H1N1)、A/California/07/2009 (H1N1)和A/turkey/turkey/2005 (H5N1)的交叉保护性CD4+ T-细胞(图4a至c)。还检测到针对H7N9、H10N9和H2N2的异型CD4+ T细胞应答，但程度较轻。
在该研究中，基于SAM技术的替代疫苗平台技术用于同时递送多种流感抗原并诱导保护性免疫应答。这种疫苗平台技术可以诱导广泛范围的免疫应答，并同时递送多种流感抗原，而不损害抗原性。该技术可能对通用流感疫苗的开发是有益的。
条款
条款1. 免疫原性组合物，其包含：(i)编码包含第一抗原的多肽的第一自我复制RNA分子和(ii)编码包含第二抗原的多肽的第二自我复制RNA分子，其中所述第一和第二抗原均来自流感病毒，但所述第一抗原来自与所述第二抗原不同的流感病毒毒株。
条款2. 条款1的免疫原性组合物，其中所述第一和第二抗原是血凝素(HA)。
条款3. 条款1的免疫原性组合物，其中所述第一和第二抗原是血凝素(HA)的免疫原性片段或变体。
条款4. 任一前述条款的免疫原性组合物，其中所述第一抗原来自与所述第二抗原不同亚型的流感病毒。
条款5. 任一前述条款的免疫原性组合物，其中所述第一和第二抗原是所述自我复制RNA分子中的唯一的源自流感病毒的抗原。
条款6. 任一前述条款的免疫原性组合物，其进一步包含：(iii)第三自我复制RNA分子，其编码包含第三抗原的多肽，其中所述第三抗原来自流感病毒，但来自与所述第一和第二抗原均不同的流感病毒毒株。
条款7. 条款6的免疫原性组合物，其中所述第一、第二和第三抗原是所述自我复制RNA分子中的唯一的源自流感病毒的抗原。
条款8. 条款6或7的免疫原性组合物，其进一步包含：(iii)第四自我复制RNA分子，其编码包含第四抗原的多肽，其中所述第四抗原来自流感病毒，但来自与所述第一、第二和第三抗原均不同的流感病毒毒株。
条款9. 任一前述条款的免疫原性组合物，其中所述第一抗原来自甲型流感亚型H1，且所述第二抗原来自与所述第一抗原不同的H1毒株。
条款10. 条款1至8中任一项的免疫原性组合物，其中所述第一和第二抗原来自甲型流感亚型H3，且其中两种抗原源自不同的H3流感病毒毒株。
条款11. 条款8的免疫原性组合物，其中所述第一和第二抗原来自甲型流感亚型H1，且所述第三和第四抗原来自甲型流感亚型H3，且其中所述第一和第二抗原源自不同的H1病毒毒株，且所述第三和第四抗原来自不同的H3流感病毒毒株。
条款12. 条款9或11的免疫原性组合物，其中所述抗原来自流感亚型H1N1。
条款13. 条款10或11的免疫原性组合物，其中所述抗原来自流感亚型H3N2。
条款14. 条款8至13中任一项的免疫原性组合物，其进一步包含一种或多种另外的自我复制RNA分子，其中每种另外的自我复制RNA分子编码包含另外的抗原的多肽，其中每种另外的抗原来自流感病毒，但来自与组合物中的任何其他抗原不同的流感病毒毒株。
条款15. 条款14的免疫原性组合物，其中所述组合物包含5、6、7、8、9或10种另外的自我复制RNA分子。
条款16. 任一前述条款的免疫原性组合物，其中所述组合物包含六种自我复制RNA分子，其中每种自我复制RNA分子编码包含来自不同流感亚型H3N2毒株的抗原的多肽。
条款17. 任一前述条款的免疫原性组合物，其进一步包含佐剂。
条款18. 任一前述条款的免疫原性组合物，其中所述自我复制RNA分子源自甲病毒。
条款19. 条款18的免疫原性组合物，其中所述甲病毒选自：辛德比斯病毒(SIN)、委内瑞拉马脑炎病毒(VEE)、塞姆利基森林病毒(SFV)及其组合。
条款20. 任一前述条款的免疫原性组合物，其中所述自我复制RNA分子是单顺反子的。
条款21. 药物组合物，其包含根据前述条款中任一项所述的免疫原性组合物和药学上可接受的载体。
条款22. 条款21的药物组合物，其进一步包含阳离子脂质、脂质体、微粒、病毒复制子颗粒(VRP)、水包油乳剂或阳离子纳米乳剂。
条款23. 条款23的药物组合物，其中所述自我复制RNA分子被封装在阳离子脂质、脂质体、微粒、病毒复制子颗粒(VRP)、水包油乳剂或阳离子纳米乳剂中，与其结合或吸附在其上。
条款24. 条款1至20中任一项的免疫原性组合物或条款21至23中任一项的药物组合物，其中所述自我复制RNA分子被配制在脂质纳米颗粒(LNP)或阳离子纳米乳剂(CNE)中。
条款25. 条款1至20中任一项的免疫原性组合物或条款21至23中任一项的药物组合物，其用作疫苗。
条款26. 条款1至20中任一项的免疫原性组合物或条款21至23中任一项的药物组合物，其用于预防流感。
条款27. 针对流感疾病预防和/或治疗的方法，其包括向有此需要的人施用根据条款1至20中任一项所述的免疫原性组合物或根据条款21至23中任一项所述的药物组合物。
条款28. 用于诱导受试者中的免疫应答的方法，其包括向所述受试者施用有效量的根据条款21至23中任一项所述的药物组合物或条款1至20中任一项的免疫原性组合物。
条款29. 针对流感疾病预防和/或治疗的方法，其包括(i)施用包含第一自我复制RNA分子和药学上可接受的载体的第一免疫原性组合物，和(ii)同时或依次施用包含第二自我复制RNA分子和药学上可接受的载体的第二免疫原性组合物，其中所述第一和第二自我复制RNA分子编码多肽，所述多肽编码来自流感病毒的抗原，但所述第一自我复制RNA分子编码来自与由所述第二自我复制RNA分子编码的抗原不同的流感毒株的抗原。
条款30. 包含第一自我复制RNA分子和药学上可接受的载体的第一免疫原性组合物，其用于预防流感疾病的方法中，所述方法包括向有此需要的受试者施用所述第一免疫原性组合物，随后施用包含自我复制RNA分子和药学上可接受的载体的第二免疫原性组合物，其中所述第一和第二自我复制RNA分子各自编码包含抗原的多肽，其中所述抗原来自流感病毒，但由所述第一自我复制RNA分子编码的抗原来自与由所述第二自我复制RNA分子编码的抗原不同的流感病毒毒株。
条款31. 根据条款30所用的免疫原性组合物，其中所述第一和第二免疫原性组合物同时、基本上同时或依次施用。
条款32. 根据条款30所用的免疫原性组合物，其中所述第一和第二免疫原性组合物以小于10小时、1秒至10小时或1秒至1小时的间隔依次施用。
条款33. 制备根据条款1至20或24中任一项所述的免疫原性组合物的方法，所述方法包括：(i)提供水包油乳剂；(ii)提供包含所述自我复制RNA分子的水溶液；和(iii)将(ii)的水溶液和(i)的水包油乳剂组合，由此制备所述组合物。
条款34. 制备条款1至20或24中任一项的免疫原性组合物的方法，所述方法包括：(i)提供至少一种形成纳米颗粒的脂质；(ii)提供包含所述自我复制RNA分子的水溶液；和(iii)将(ii)的水溶液和(i)的至少一种脂质组合，由此制备所述组合物。
序列表
SEQ ID NO:1: 含有T7 DNA聚合酶启动子的A836 TC83 VEE/SINV(委内瑞拉马脑炎-辛德比斯病毒)嵌合复制子的核苷酸cDNA序列
Figure 798660DEST_PATH_IMAGE030
Figure 520628DEST_PATH_IMAGE031
Figure 744936DEST_PATH_IMAGE032
Figure 383597DEST_PATH_IMAGE033
Figure 667947DEST_PATH_IMAGE034
SEQ ID NO:2: 没有插入物的A836 TC83 VEE/SINV嵌合复制子的核苷酸cDNA序列
Figure 673950DEST_PATH_IMAGE035
Figure 701948DEST_PATH_IMAGE036
Figure 86793DEST_PATH_IMAGE037
Figure 276466DEST_PATH_IMAGE038
SEQ ID NO:3: 来自流感病毒A/California/07/2009 (H1N1)的血凝素(HA)的核苷酸cDNA序列
Figure 254918DEST_PATH_IMAGE039
SEQ ID NO:4: 来自流感病毒A/California/07/2009 (H1N1)的HA的氨基酸序列
Figure 821028DEST_PATH_IMAGE040
SEQ ID NO:5: 来自流感病毒A/PR/8/34 (H1N1)的HA的核苷酸DNA序列
Figure 716172DEST_PATH_IMAGE041
SEQ ID NO:6: 来自流感病毒A/PR/8/34 (H1N1)的HA的氨基酸序列
Figure 76746DEST_PATH_IMAGE042
SEQ ID NO:7: 来自流感病毒A/Bilthoven/16398/1968 (H3N2)的HA的核苷酸cDNA序列
Figure 463865DEST_PATH_IMAGE043
SEQ ID NO:8: 来自流感病毒A/Bilthoven/16398/1968 (H3N2)的HA的氨基酸序列
Figure 833667DEST_PATH_IMAGE044
SEQ ID NO:9: 来自流感病毒A/Bangkok/1/79 (H3N2)的HA的核苷酸cDNA序列
Figure 458683DEST_PATH_IMAGE045
SEQ ID NO:10: 来自流感病毒A/Bangkok/1/79 (H3N2)的HA的氨基酸序列
Figure 724579DEST_PATH_IMAGE046
SEQ ID NO:11: 来自流感病毒A/Beijing/32/92 (H3N2)的HA的核苷酸cDNA序列
Figure 465175DEST_PATH_IMAGE047
SEQ ID NO:12: 来自流感病毒A/Beijing/32/92 (H3N2)的HA的氨基酸序列
Figure 107509DEST_PATH_IMAGE048
SEQ ID NO:13: 来自流感病毒A/Fujain/411/2002 (H3N2)的HA的核苷酸cDNA序列
Figure 852611DEST_PATH_IMAGE049
SEQ ID NO:14: 来自流感病毒A/Fujain/411/2002 (H3N2)的HA的氨基酸序列
Figure 679621DEST_PATH_IMAGE050
SEQ ID NO:15: 来自流感病毒A/Brisbane/10/2007 (H3N2)的HA的核苷酸cDNA序列
Figure 323223DEST_PATH_IMAGE051
SEQ ID NO:16: 来自流感病毒A/Brisbane/10/2007 (H3N2)的HA的氨基酸序列
Figure 34827DEST_PATH_IMAGE052
SEQ ID NO:17: 来自流感病毒A/Texas/50/2012 (H3N2)的HA的核苷酸cDNA序列
Figure 227911DEST_PATH_IMAGE053
SEQ ID NO:18: 来自流感病毒A/Texas/50/2012 (H3N2)的HA的氨基酸序列
Figure 366769DEST_PATH_IMAGE054
SEQ ID NO:19: 来自流感病毒A/turkey/Turkey/1/2005 (H5N1)的HA的核苷酸cDNA序列
Figure 419038DEST_PATH_IMAGE055
SEQ ID NO:20: 来自流感病毒A/turkey/Turkey/1/2005 (H5N1)的HA的氨基酸序列
Figure 668754DEST_PATH_IMAGE056
SEQ ID NO:21: 来自流感病毒A/Shanghai/2/2013 (H7N9)的HA的核苷酸cDNA序列
Figure 231191DEST_PATH_IMAGE057
SEQ ID NO:22: 来自流感病毒A/Shanghai/2/2013 (H7N9)的HA的氨基酸序列
Figure 540950DEST_PATH_IMAGE058
SEQ ID NO:23: 流感H1N1 A/California/07/2009插入物的正向引物
Figure 80516DEST_PATH_IMAGE059
SEQ ID NO:24 流感H1N1 A/California/07/2009插入物的反向引物
Figure 133922DEST_PATH_IMAGE060
SEQ ID NO:25: 来自A/Shanghai/2/2013的H7 HA基因的正向引物
Figure 301598DEST_PATH_IMAGE061
SEQ ID NO:26: 来自A/Shanghai/2/2013的H7 HA基因的反向引物
Figure 782258DEST_PATH_IMAGE062
SEQ ID NO:27肽
Figure 74699DEST_PATH_IMAGE063
SEQ ID NO:28 SB63引物
Figure 931797DEST_PATH_IMAGE064
SEQ ID NO:29 SB74引物
Figure 970291DEST_PATH_IMAGE065
SEQ ID NO:30 SB76引物
Figure 684169DEST_PATH_IMAGE066
SEQ ID NO:31 SB66引物
Figure 463907DEST_PATH_IMAGE067
Figure IDA0003022317540000011
Figure IDA0003022317540000021
Figure IDA0003022317540000031
Figure IDA0003022317540000041
Figure IDA0003022317540000051
Figure IDA0003022317540000061
Figure IDA0003022317540000071
Figure IDA0003022317540000081
Figure IDA0003022317540000091
Figure IDA0003022317540000101
Figure IDA0003022317540000111
Figure IDA0003022317540000121
Figure IDA0003022317540000131
Figure IDA0003022317540000141
Figure IDA0003022317540000151
Figure IDA0003022317540000161
Figure IDA0003022317540000171
Figure IDA0003022317540000181
Figure IDA0003022317540000191
Figure IDA0003022317540000201
Figure IDA0003022317540000211
Figure IDA0003022317540000221
Figure IDA0003022317540000231
Figure IDA0003022317540000241
Figure IDA0003022317540000251
Figure IDA0003022317540000261
Figure IDA0003022317540000271
Figure IDA0003022317540000281
Figure IDA0003022317540000291
Figure IDA0003022317540000301
Figure IDA0003022317540000311
Figure IDA0003022317540000321
Figure IDA0003022317540000331
Figure IDA0003022317540000341
Figure IDA0003022317540000351
Figure IDA0003022317540000361
Figure IDA0003022317540000371
Figure IDA0003022317540000381
Figure IDA0003022317540000391
Figure IDA0003022317540000401
Figure IDA0003022317540000411
Figure IDA0003022317540000421
Figure IDA0003022317540000431
Figure IDA0003022317540000441
Figure IDA0003022317540000451
Figure IDA0003022317540000461
Figure IDA0003022317540000471
Figure IDA0003022317540000481
Figure IDA0003022317540000491
Figure IDA0003022317540000501
Figure IDA0003022317540000511
Figure IDA0003022317540000521
Figure IDA0003022317540000531
Figure IDA0003022317540000541

Claims (29)

1.免疫原性组合物，其包含：(i)第一自我复制RNA分子，其编码包含第一抗原的多肽，和(ii)第二自我复制RNA分子，其编码包含第二抗原的多肽，其中所述第一和第二抗原均来自流感病毒，但所述第一抗原来自与所述第二抗原不同的流感病毒毒株。
2.权利要求1的免疫原性组合物，其中所述第一和第二抗原是血凝素(HA)或其免疫原性片段或变体。
3.权利要求1或2的免疫原性组合物，其中所述第一抗原来自与所述第二抗原不同亚型的流感病毒。
4.任一前述权利要求的免疫原性组合物，其中所述第一和第二抗原是所述自我复制RNA分子中的唯一的源自流感病毒的抗原。
5.任一前述权利要求的免疫原性组合物，其进一步包含：(iii)第三自我复制RNA分子，其编码包含第三抗原的多肽，其中所述第三抗原来自流感病毒，但来自与所述第一和第二抗原均不同的流感病毒毒株。
6.权利要求5的免疫原性组合物，其中所述第一、第二和第三抗原是所述自我复制RNA分子中的唯一的源自流感病毒的抗原。
7.权利要求5或6的免疫原性组合物，其进一步包含：(iii)第四自我复制RNA分子，其编码包含第四抗原的多肽，其中所述第四抗原来自流感病毒，但来自与所述第一、第二和第三抗原均不同的流感病毒毒株。
8.任一前述权利要求的免疫原性组合物，其中所述第一抗原是来自甲型流感亚型H1的HA或其免疫原性片段或变体，且所述第二抗原是来自与所述第一抗原或其免疫原性片段或变体不同的H1毒株的HA。
9.权利要求1至7中任一项的免疫原性组合物，其中所述第一和第二抗原是来自甲型流感亚型H3的HA或其免疫原性片段或变体，且其中两种抗原源自不同的H3流感病毒毒株。
10.权利要求7的免疫原性组合物，其中所述第一和第二抗原是来自甲型流感亚型H1的HA或其免疫原性片段或变体，且所述第三和第四抗原来自甲型流感亚型H3或其免疫原性片段或变体，且其中所述第一和第二抗原源自不同的H1病毒毒株，且所述第三和第四抗原来自不同的H3流感病毒毒株。
11.任一前述权利要求的免疫原性组合物，其进一步包含佐剂。
12.任一前述权利要求的免疫原性组合物，其中所述自我复制RNA分子源自甲病毒。
13.任一前述权利要求的免疫原性组合物，其中所述甲病毒选自：辛德比斯病毒(SIN)、委内瑞拉马脑炎病毒(VEE)、塞姆利基森林病毒(SFV)及其组合。
14.药物组合物，其包含根据前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物和药学上可接受的载体。
15.权利要求14的药物组合物，其进一步包含阳离子脂质、脂质体、微粒、病毒复制子颗粒(VRP)、水包油乳剂或阳离子纳米乳剂。
16.权利要求15的药物组合物，其中所述自我复制RNA分子被封装在阳离子脂质、脂质体、微粒、病毒复制子颗粒(VRP)、水包油乳剂或阳离子纳米乳剂中，与其结合或吸附在其上。
17.权利要求1至13中任一项的免疫原性组合物或权利要求14至16中任一项的药物组合物，其中所述自我复制RNA分子被配制在脂质纳米颗粒(LNP)或阳离子纳米乳剂(CNE)中。
18.权利要求1至13中任一项的免疫原性组合物或权利要求14至17中任一项的药物组合物，其用作疫苗。
19.权利要求1至13中任一项的免疫原性组合物或权利要求14至17中任一项的药物组合物，其用于预防流感。
20.针对流感疾病预防和/或治疗的方法，其包括向有此需要的人施用根据权利要求1至13中任一项所述的免疫原性组合物或根据权利要求14至17中任一项所述的药物组合物。
21.用于诱导受试者中的免疫应答的方法，其包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求14至17中任一项所述的药物组合物或权利要求1至13中任一项的免疫原性组合物。
22.针对流感疾病预防和/或治疗的方法，其包括(i)施用包含第一自我复制RNA分子和药学上可接受的载体的第一免疫原性组合物，和(ii)同时或依次施用包含第二自我复制RNA分子和药学上可接受的载体的第二免疫原性组合物，其中所述第一和第二自我复制RNA分子编码多肽，所述多肽编码来自流感病毒的抗原，但所述第一自我复制RNA分子编码来自与由所述第二自我复制RNA分子编码的抗原不同的流感毒株的抗原。
23.包含第一自我复制RNA分子和药学上可接受的载体的第一免疫原性组合物，其用于预防流感疾病的方法中，所述方法包括向有此需要的受试者施用所述第一免疫原性组合物，随后施用包含自我复制RNA分子和药学上可接受的载体的第二免疫原性组合物，其中所述第一和第二自我复制RNA分子各自编码包含抗原的多肽，其中所述抗原来自流感病毒，但由所述第一自我复制RNA分子编码的抗原来自与由所述第二自我复制RNA分子编码的抗原不同的流感病毒毒株。
24.根据权利要求23所用的免疫原性组合物，其中所述第一和第二免疫原性组合物同时、基本上同时或依次施用。
25.根据权利要求23所用的免疫原性组合物，其中所述第一和第二免疫原性组合物以小于10小时、1秒至10小时或1秒至1小时的间隔依次施用。
26.制备根据权利要求1至13或17中任一项所述的免疫原性组合物的方法，所述方法包括：(i)提供水包油乳剂；(ii)提供包含所述自我复制RNA分子的水溶液；和(iii)将(ii)的水溶液和(i)的水包油乳剂组合，由此制备所述组合物。
27.制备根据权利要求1至13或17中任一项所述的免疫原性组合物的方法，所述方法包括：(i)提供至少一种形成纳米颗粒的脂质；(ii)提供包含所述自我复制RNA分子的水溶液；和(iii)将(ii)的水溶液和(i)的至少一种脂质组合，由此制备所述组合物。
28.包含多种自我复制RNA分子的免疫原性组合物，其中每种自我复制RNA分子编码包含来自流感H3N2亚型的不同毒株的HA抗原的多肽。
29.权利要求28的免疫原性组合物，其包含六种自我复制RNA分子，其中：(i)第一自我复制RNA分子编码包含来自A/Bilthoven/16398/1968的第一抗原的多肽，(ii)第二自我复制RNA分子编码包含来自A/Bangkok/1/79的第二抗原的多肽，(iii)第三自我复制RNA分子编码包含来自A/Beijing/32/92的第三抗原的多肽，(iv)第四自我复制RNA分子编码包含来自A/Fujian/411/2002的第四抗原的多肽，(v)第五自我复制RNA分子编码包含来自A/Brisbane/10/2007的第五抗原的多肽，且(vi)第六自我复制RNA分子编码包含来自A/Texas/50/2012的第六抗原的多肽。
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