PT1621208E - Vacinação com adn para tratamento de doença auto-imune - Google Patents

Description

ΕΡ 1 621 2 Ο 8/PT

DESCRIÇÃO "Vacinação com ADN para tratamento de doença auto-imune"

INTRODUÇÃO A complexidade do sistema imunitário tem sido uma barreira desencorajadora a um entendimento da disfunção do sistema imunitário. Em anos recentes, as técnicas de biologia molecular proporcionaram uma percepção dos mecanismos e componentes que estão subjacentes à imunidade. Em grande extensão, a história da imunidade é a história dos linfócitos. Os linfócitos possuem um sistema extremamente complexo e subtil de interacção uns com os outros, com células que apresentam antigénios e com antigénios e células estranhos. A modulação da resposta imunitária varia com os factores específicos produzidos, e os receptores presentes na célula respondedora. As vias para a sub-regulação de respostas são tão importantes como as necessárias para activação. A tolerância de células T é um mecanismo bem conhecido para a prevenção de uma resposta imunitária a um antigénio particular. Outros mecanismos, como a secreção de citoquinas supressoras, são também conhecidos.

Uma característica comum a várias doenças e condições inflamatórias é o envolvimento de células T CD4+ pró-inflamatórias. Estas células T são responsáveis pela libertação de citoquinas inflamatórias do tipo Thl. As citoquinas caracterizadas como tipo Thl incluem interleucina 2 (IL-2), γ-interferão, TNFa e IL-12. Estas citoquinas pró-inflamatórias actuam para estimular a resposta imunitária, em muitos casos resultando na destruição de tecido autólogo. As citoquinas associadas à supressão da resposta de células T são o tipo Th2, e incluem IL-10, IL-4 e TGF-β. Verificou-se que as células T do tipo Thl e Th2 podem utilizar o receptor de antigénios idêntico em resposta a um imunogénio; no primeiro produzindo uma resposta estimuladora e no último uma resposta supressora.

As citoquinas desempenham um papel crítico no desenvolvimento e recuperação de doenças auto-imunes. As 2 ΕΡ 1 621 208/ΡΤ citoquinas Thl como a interleucina 12 (IL12) e o interferão gama (IFNy) foram encontradas no sistema nervoso central (SNC) de pacientes de esclerose múltipla (EM) bem como em animais com EAE (Issazadeh et al. (1995). J Neuroimmunol 61: 205-12). Verificou-se que as citoquinas Th2 tais como IL4, IL5 e IL10 são elevadas quer durante a remissão de EM quer de EAE (Waisman et al. (1997) Immunointervention in auto-immunity by Thl/Th2 regulation, L. Adorini, ed. (Austin, Texas: R.G. Landes Co.), pp. 129-50). Estudos anteriores mostraram que a administração sistémica de IL4 bem como a administração local no SNC de IFNy podem reduzir a gravidade de EAE (Racke et al. (1994) J Exp Med 180: 1961-6; Voorthuis et al. (1990) Clin Exp Immunol 81: 183-8). Adicionalmente, a adição de IL4 a células T não sensibilizadas (“ingénuas") pode resultar no desenvolvimento de células do tipo Th2, enquanto a adição de IL12 pode resultar no desenvolvimento de células do tipo Thl (Macatonia et al. (1993) Int Immunol 5: 1119-28). A vacinação com ADN é eficaz na protecção de animais experimentais contra patogénios infecciosos e cancro, e recentemente foi utilizada para prevenir a doença auto-imune (Waisman et al. (1996) Nat Med 2, 899-905). A encefalomielite auto-imune experimental (EAE), um modelo animal prototípico de auto-imunidade de células T, reflecte muitas das características clínicas e patológicas da doença humana, esclerose múltipla.

De modo a modificar respostas imunitárias a vacinas de ADN, a co-vacinação com ADN foi realizada com genes de citoquina, juntamente com os genes para certos patogénios. Os exemplos incluem imunização com ADN com antigénios do vírus da hepatite B e ADN de IL2 que aumentou as respostas de Thl, antigénios de HIV com ADN de IL12 que aumentou a actividade de células T citotóxicas, e antigénios de influenza com ADN de IL6 que aumentou a actividade antiviral (veja-se, por exemplo, Chow et al. (1998) J Immunol 160 (3): 1320-9).

Mostrou-se que a vacinação de ratinhos com ADN nu que codifica a cadeia β do receptor de células T (TCR) predominante que é rearranjado em células T reactivas com proteína básica de mielina (PBM), protege os ratinhos contra EAE. Esta imunização induziu um padrão de produção de 3 ΕΡ 1 621 2 Ο 8/PT citoquinas Th2 por células T reactivas com mielina, criando um ambiente supressor que bloqueia a auto-imunidade: células T que reagem com o auto-antigénio de mielina deviam-se de um tipo auxiliar T 1 (Thl) agressivo para um tipo Th2 supressor. 0 desenvolvimento adicional de tratamento que inibe especificamente a activação de células T seria um grande beneficio médico.

Literatura Relevante

Waisman et al. (1996) Nat. Med. 2: 899-905 e) Offner et al. (1998) J. Immunol. 161: 2178-2186 descrevem a utilização de vacinação com ADN para prevenir encefalomielite auto-imune experimental (EAE). A injecção de ADN para promover a vacinação contra micróbios e tumores é discutida em Cohen et al. (1997) Hosp. Pract. 32:169-171; Syrengelas, et al. (1996) Nat. Med. 2: 1038-1041; Ulmer et al. (1996) Curr Opin Immunol. 8: 531-536; Pardoll et al. (1995)Immunity 3:165-169; Davis et al. (1993) Hum. Mol. Genet. 2: 1847-1851; Ulmer et al. (1993) Science 259: 1745-1749; e Tang et al. (1992) Nature 356: 152-154. A imunização genética demonstrou indução tanto de uma resposta imunitária humoral especifica como também uma resposta imunitária celular de reacção mais ampla em modelos animais de cancro, micoplasma, TB, malária e muitas infecções virais, incluindo influenza e HIV. Veja-se, por exemplo, Mor et al. (1995) J Immunol 155:2039-46; Xu e Liew (1995) Immunology 84: 173-6; e Davis et al. (1994) Vaccine 12: 1503-9 . A susceptibilidade a esclerose múltipla (EM) foi associada a certos genes do MHC de Classe II, Oksenberg e Steinman (1990) Current Opinion in Immunology 2:619-621. Ao nível celular, a oligoclonalidade de células T foi descrita no fluido cerebrospinal (FCE) de pacientes de EM, Lee et al., Ann. Neurol. 29: 33-40 (1991).

Os antigénios do SNC, incluindo proteínas de mielina, estudados no contexto da EM estão discutidos em de Rosbo et al., J. Auto-immunity 11:287-299 (1998). WO 97/46253 descreve a imunoterapia da doença auto-imune baseada na entrega de antigénio ou ADN por via de um canhão de genes. Potenciadores 4 ΕΡ 1 621 208/ΡΤ da resposta imunitária a vacinas de ADN incluem dinucleótidos CpG não metilados, Krieg et al. (1998) Trends Microbiol. 6: 23-27, e sequências derivadas de patogénios fundidas, King et al. (1998) Nat. Med. 4: 1281-1286.

Em WO 94/23737 discutem-se os problemas de tratamento de doenças auto-imunes, e descreve-se o tratamento destas doenças através da administração de péptidos auto-antigénicos juntamente com um adjuvante. Kolodka et al. (1995) PNAS April 11, vol. 92 no. 8: 3293-3297 descrevem uma terapia génica para a diabetes mellitus de Tipo I em ratos envolvendo a utilização de um retrovirus para estimular a expressão de baixo nível do gene 1 da insulina de rato por células do fígado. Em WO97/046253 descreve-se um tratamento para doença auto-imune baseada na entrega de antigénio, ou ADN que codifica o antigénio por via de um 'canhão de genes'. Urbanek-Ruiz et al. (2001) Clinicai Immunology, vol.100, n°2, pp.164-171 descrevem a utilização de vacinação de ADN na prevenção de doença auto-imune .

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona uma cassete de expressão de ADN compreendendo uma região de iniciação da transcrição, uma sequência codificante de um auto-antigénio, que codifica pelo menos uma porção de um auto-antigénio e uma região de terminação da transcrição, a região de iniciação da transcrição compreendendo um promotor, para utilização no tratamento de diabetes mellitus dependente de insulina num hospedeiro humano por injecção intramuscular em que o referido auto-antigénio está associado a diabetes mellitus dependente de insulina e o referido tratamento estabiliza ou melhora os sintomas clínicos do referido ser humano. O auto-antigénio pode ser uma proteína endógena humana. Por exemplo, o auto-antigénio pode ser insulina, proinsulina, ácido glutâmico-descarboxilase 65 ou antigénio das células dos ilhéus. A citóquina Th2 pode ser IL-4 (por exemple, IL-4 humana), IL-10 ou TGF-β. A cassete de expressão de ADN pode estar presente num vector, tal com um vector plasmídico. O vector pode ainda 5 ΕΡ 1 621 208/ΡΤ compreender uma segunda cassete de expressão de ADN compreendendo uma segunda sequência que codifica uma citóquina Th2 sob o controlo regulador de um promotor que é activo no hospedeiro humano. A segunda cassete pode estar presente numa segunda construção de ADN. A construção de expressão que codifica a citóquina Th2 e a construção de expressão que codifica pelo menos uma porção de um auto-antigénio podem ser co-formuladas ou formuladas independentemente. A cassete pode ser administrada numa série de pelo menos duas injecções administradas com pelo menos 24 horas de intervalo.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1. Títulos de anticorpos anti-IgG de SCH (A) e anti-PLP139-151 (B) em ratinhos SJL/J após imunização com ADN com o minigene de PLP.

Figura 2. Respostas proliferativas de células dos nódulos linfáticos a PLP139-151 (quadrados) e ao péptido de controlo PLP178-191 (triângulos) para animais injectados com ADN que codifica para PLP139-151 (A) ou vector de controlo, pTARGET (B).

Figura 3. (A) Níveis de γ-interferão (barras tracejadas) ou IL-2 (barras ponteadas) em animais vacinados com ADN plasmídico que codifica para PLP139-151 ou vector sozinho (pTARGET). (B) Detecção e análise por electroforese em gel de poliacrilamida a 5%, de ARNm de citoquinas.

Figura 4. Expressão na superfície de B7.1, B7.2 e I-A3 de células esplénicas após incubação com ADN. Os números nos quadrantes referem-se à percentagem de células no portal de monócitos (A) ou no portal de linfócitos (B) como definido por dispersão directa e lateral.

DESCRIÇÃO DAS CONCRETIZAÇÕES ESPECÍFICAS São aqui descritos métodos para o tratamento terapêutico e investigação de inflamação, através da supressão de respostas de células T específicas de antigénios patogénicos. Uma cassete de expressão de ADN é injectada no tecido muscular do hospedeiro. 0 vector compreende uma sequência de ADN que 6 ΕΡ 1 621 208/ΡΤ codifica pelo menos uma porção de um auto-antigénio. A vacinação pode também incluir sequências de ADN que codificam uma citoquina Th2, e.g. IL4. Em resposta a esta vacinação, é evocada uma resposta supressora. A proliferação de células T especificas do antigénio é inibida e a produção de citoquinas Thl é reduzida.

Crê-se que os métodos aqui descritos constituem um novo método de imunidade protectora, que combina os efeitos de vacinação com ADN e entrega local de genes. Após a vacinação com ADN com um epitopo de auto-antigénio sozinho, as células T são anérgicas. Isto pode em parte ser devido aos efeitos biológicos de motivos de ADN como dinucleótidos CpG não metilados em contextos de bases particulares (motivos CpG-S) (Krieg et al., (1998) Trends in Microbiol. 6: 23-27). A adição de IL4 como co-vacina de ADN recupera a anergia imposta pela vacina de ADN do auto-antigénio, e conduz a resposta para um fenótipo Th2. STAT6 é activado em células de nódulos linfáticos de drenagem pela vacina com ADN de IL4. Crê-se que a IL4 é produzida a partir da vacina de ADN administrada e que esta interactua com o receptor de IL4 em células dos nódulos linfáticos, que por sua vez causam a activação de STAT6 a jusante do receptor. A imunização contra os antigénios que desencadeiam as doenças auto-imunes causadas por células autorreactivas Thl, por exemplo doenças como a esclerose múltipla, a diabetes juvenil e a artrite reumatóide, seriam condições em que a co-vacinação com ADN que codifica IL-4 poderia provar-se benéfica.

Auto-antigénios, como aqui se utiliza, são proteínas endógenas, ou seus fragmentos, que eliciam uma resposta imunitária patogénica. Têm particular interesse os auto-antigénios que induzem uma resposta patogénica inflamatória mediada por células T. A vacinação supressora com o auto-antigénio alvo relevante encontra utilidade no tratamento de doenças auto-imunes caracterizadas pelo envolvimento de células T pró-inflamatórias, como a diabetes mellitus dependente de insulina. Modelos animais, particularmente mamíferos pequenos, e.g. murinos, lagomorfos, etc., têm interesse para investigações experimentais. 7 ΕΡ 1 621 208/ΡΤ

Os métodos de imunização supressora aqui descritos são utilizados para fins profiláticos ou terapêuticos. 0 termo "tratamento" é aqui utilizado para referir tanto a prevenção da doença como o tratamento de condições preexistentes. A prevenção da doença auto-imune envolvendo a vacina com auto-antigénio (VA), é realizada por administração da vacina antes do desenvolvimento da doença declarada. 0 tratamento de uma doença decorrente, onde a vacinação supressora estabiliza ou melhora os sintomas clínicos do paciente, é de particular interesse. Este tratamento é desejavelmente realizado antes da perda completa de função nos tecidos afectados.

Os auto-antigénios que se sabe estarem associados a doença incluem proteínas de mielina com doenças desmielinizantes, e.g. esclerose múltipla e mielite auto-imune experimental; colagénios e artrite reumatóide; insulina, proinsulina, ácido glutâmico-descarboxilase 65 (GAD65); antigénio de células dos ilhéus (ICA512; ICA12) com diabetes dependente de insulina. Uma associação de epítopos de GAD com diabetes está descrita em várias publicações, incluindo a Patente U.S. 5,212,447; e a patente europeia EP 0719340. Uma associação de epítopos de insulina com insulite auto-imune está descrita em Griffin et al. (1995) Am. J. Pathol. 147:845-857. Rudy et al. (1995) Mol. Med. 1:625-633 descrevem um epítopo que é similar em GAD e proinsulina.

Os componentes proteínicos das proteínas de mielina, incluindo a proteína básica de mielina (PBM), a proteína proteolipídica (PLP), a glicoproteína associada a mielina (MAG) e glicoproteína oligodendrocítica de mielina (MOG), são para utilização como imunogénios. A supressão da capacidade de resposta de células T a estes antigénios é utilizada para prevenir ou tratar doenças desmielinizantes. É aqui descrito um exemplo onde o auto-antigénio da vacina é proteolipídico. Por conveniência, é proporcionada uma sequência de referência de PLP humana como SEQ ID NO:l; e proteína básica de mielina humana como SEQ ID NO:3. O proteolípido é um constituinte principal da mielina, e é conhecido como estando envolvido em doenças desmielinizantes (veja-se, por exemplo Greer et al., (1992) J. Immunol. 149: 8 ΕΡ 1 621 208/ΡΤ 783-788 e Nicholson(1997) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94: 9279-9284) . A proteína de membrana integral PLP é um auto-antigénio dominante de mielina. Foram identificados determinantes de antigenicidade de PLP em várias estirpes de ratinhos, e incluem os resíduos 139-151 (Tuohy et ai. (1989) J. Immunol. 142: 1523-1527), 103-116 (Tuohy et al. (1988) J. Immunol. 141: 1126-1130], 215-232 (Endoh et ai. (1990) Int. Arch. Allergy APPI. Immunol. 92: 433-438), 43-64 (Whitham et al. (1991) J.

Immunol. 147: 3803-3808) e 178-191 (Greer, et al. (1992) J.

Immunol. 149: 783-788). A imunização com PLP nativa ou com péptidos sintéticos correspondentes a epítopos de PLP induz EAE. Análogos de péptidos de PLP gerados por substituição de aminoácidos podem prevenir a indução e a progressão de EAE (Kuchroo et al., (1994) J. Immunol. 153: 3326-3336, Nicholson et al. (1997) Proc. Natal. Acad. Sei. USA 94:9279-9284). A MBP é uma proteína de mielina extrínseca que foi extensamente estudada. Pelo menos 26 epítopos de MBP foram reportados (Meinl et al. (1993) J. Clin. Invest. 92: 2633- 2643). São úteis os resíduos 1-11, 59-76 e 87-99. Mostrou-se que os análogos de péptidos de MBP gerados por truncagem invertem a EAE (Karin et al. (1998) J. Immunol. 160: 5188- 5194) . Os ADN que codificam fragmentos de polipéptidos podem compreender sequências de codificação para epítopos imunogénicos, e.g. proteína básica de mielina p84-102, mais particularmente proteína básica de mielina p87-99, (SEQ ID NO:11) VHFFKNIVTPRTP (p87 — 99), ou mesmo o péptido 7-mero truncado (SEQ ID NO: 12) FKNIVTP. As sequências do exão 2 da proteína básica de mielina, incluindo o epítopo imunodominante limitado pelos aminoácidos 59-85, têm também interesse. Por exemplo, veja-se Sakai et al. (1988) J Neuroimmunol 19: 21-32; Baxevanis et al. (1989) J Neuroimmunol 22: 23-30; Ota et al. (1990) Nature 346:183-187; Martin et al. (1992) J Immunol. 148: 1350-1366, Valli et al. (1993) J Clin In 91: 616.

Verificou-se que o péptido de MBP (84-102) imunodominante se liga com elevada afinidade a moléculas DRB1*1501 e DRB5*0101 do haplótipo DR2 associado a doenças. Segmentos de péptidos sobrepostos mas distintos foram importantes para a ligação a estas moléculas; resíduos hidrófobos (Vall89 e Phe92) no segmento de MBP (88-95) para ligação do péptido a moléculas 9 ΕΡ 1 621 208/ΡΤ DRB1*1501; resíduos hidrófobos e carregados (Phe92, Lys93) na sequência de MBP (89-101/102) contribuíram para a ligação a DRB5 * 0101. A glicoproteína transmembranar MOG é um componente minoritário da mielina que se mostrou que induz EAE. Os epítopos de MOG imunodominantes que foram identificados em várias estirpes de ratinhos incluem os resíduos 1-22, 35-55, 64-96 (de Rosbo et al. (1998) J. Auto-immunity 11: 267-299, deRosbo et al. (1995) Eur J Immunol. 25:985-993) e 41-60 (Leadbetter et al., (1998) J Immunol 161: 504-512). A invenção proporciona uma cassete de expressão de ADN que codifica pelo menos uma porção de um auto-antigénio, usualmente como parte de um vector, é introduzida no tecido do beneficiário da vacina. O minigene é expresso no tecido, e o polipéptido codificado actua como imunogénio, ou antigénio. A sequência do auto-antigénio pode ser de qualquer espécie de mamífero ou ave, e.g. espécies de primatas, particularmente seres humanos; roedores, incluindo ratinhos, ratos e hamsters; coelhos; equinos, bovinos, caninos, felinos; etc. Têm particular interesse os segmentos de auto-antigénios humanos e de ratinho. Geralmente, a sequência terá origem na mesma espécie que o animal hospedeiro, preferivelmente será autóloga. A presente cassete de expressão de ADN compreenderá a maior parte ou a totalidade da sequência que codifica um fragmento de auto-antigénio, como definido por Kabat et al., supra. A sequência de codificação pode ser truncada no terminal 5' ou 3' e pode ser um fragmento da sequência completa do polipéptido. Numa concretização da invenção, a sequência codifica um fragmento peptídico que se sabe ser apresentado a células T patogénicas, por exemplo péptidos apresentados por moléculas do MHC de Classe II do hospedeiro. Estes péptidos foram descritos na literatura, e têm tipicamente de cerca de 8 a cerca de 30 aminoácidos de comprimento. A vacina pode ser formulada com uma ou um cocktail de sequências de auto-antigénios. Embora se tenha verificado que uma única sequência é capaz de suprimir uma resposta a 10 ΕΡ 1 621 208/ΡΤ múltiplos epítopos, pode ser desejável em alguns casos incluir múltiplas sequências, onde cada uma codifica um epítopo diferente. Por exemplo, veja-se Leadbetter et al. (1998) J. Immunol. 161: 504-512. Uma formulação composta por múltiplas sequências de codificação pode ser utilizada para induzir uma resposta supressora mais potente e/ou sustentada. Atingindo especificamente múltiplas populações de células T autorreactivas, esta formulação pode retardar ou prevenir o desenvolvimento de resistência a auto-antigénios. A utilização de sequências de PLP em combinação com outros epitopos de proteína de mielina pode suprimir eficazmente o repertório de células T reactivas com mielina. Estão contempladas combinações similares de auto-antigénios para suprimir a resposta auto-imune, e.g., ácido glutâmico-descarboxilase (GAD) e auto-antigénio de células dos ilhéus pancreáticos para o tratamento de diabetes dependente de insulina.

Em adição aos epítopos específicos e polipéptidos de auto-antigénios, a resposta imunitária pode ser melhorada pela inclusão de sequências CpG, como descrito por Krieg et al. (1998) Trends Microbiol. 6: 23-27, e sequência auxiliar, King et al., (1998) Nat. Med. 4:1281-1286. Os efeitos biológicos de motivos de ADN como dinucleótidos CpG não metilados em contextos de bases particulares (motivos CpG-S) podem modular respostas imunitárias inatas quando injectados em animais. Baixos números de motivos CpG, ou a presença de motivos imperfeitos, podem actuar no desenvolvimento de anergia por imunização com auto-antigénios. A sequência de codificação de polipéptidos, que pode ser citoquina ou auto-antigénio, as sequências são inseridas numa cassete de expressão apropriada. A construção de expressão é preparada de maneiras convencionais. A cassete terá as sequências reguladoras da transcrição e da tradução apropriadas para expressão da sequência nas células do beneficiário da vacina. A cassete será geralmente uma parte de um vector, que contém uma origem de replicação adequada, e os genes que codificam marcadores seleccionáveis conforme possa ser necessário para o crescimento, a amplificação e a manipulação do vector, antes da sua introdução no beneficiário. Os vectores adequados incluem plasmídeos, YAC, BAC, bacteriófagos, retrovírus, e similares. Convenientemente, 11 ΕΡ 1 621 208/ΡΤ ο vector de expressão será um plasmídeo. Antes da vacinação, a cassete pode ser isolada das sequências do vector por clivagem, amplificação, etc., como conhecido na arte. Para injecção, o ADN pode ser super-enrolado ou linear, preferivelmente super-enrolado. A cassete pode ser mantida na célula hospedeira durante períodos de tempo prolongados, ou pode ser transiente, geralmente transiente. A manutenção estável é conseguida pela inclusão de sequências que proporcionam a integração e/ou a manutenção, e.g. vectores retrovirais, vectores de EBV e similares. A cassete de expressão geralmente empregará uma região de iniciação da transcrição exógena, i.e. um promotor que não o promotor que está associado ao receptor de células T que ocorre normalmente no cromossoma. 0 promotor é funcional em células hospedeiras, particularmente células hospedeiras que são o alvo da cassete. 0 promotor pode ser introduzido por métodos recombinantes in vitro, ou em resultado de integração homóloga da sequência por uma célula hospedeira adequada. 0 promotor está operativamente ligado à sequência de codificação do auto-antigénio para produzir um transcrito de ARNm traduzível. Os vectores de expressão terão convenientemente locais de restrição localizados próximo da sequência promotora para facilitar a inserção de sequências de auto-antigénios.

As cassetes de expressão são preparadas compreendendo uma região de iniciação da transcrição, que pode ser constitutiva ou indutível, o gene que codifica a sequência do auto-antigénio e uma região de terminação da transcrição. As cassetes de expressão podem ser introduzidas numa variedade de vectores. Os promotores de interesse podem ser indutíveis ou constitutivos, usualmente constitutivos, e proporcionarão níveis elevados de transcrição nas células do beneficiário da vacina. 0 promotor pode ser activo apenas no tipo de células do beneficiário, ou pode ser amplamente activo em muitos tipos de células diferentes. São conhecidos na especialidade muitos promotores fortes para células de mamífero, incluindo o promotor da β-actina, os promotores precoce e tardio de SV40, o promotor de imunoglobulina, o promotor de citomegalovírus humano, LTR retrovirais, etc. Os promotores podem ou não estar associados a potenciadores, onde os potenciadores podem estar 12 ΕΡ 1 621 2 Ο 8/PT naturalmente associados ao promotor particular ou associados a um promotor diferente. A região de terminação é proporcionada a 3' da região de codificação, onde a região de terminação pode estar naturalmente associada ao domínio de região variável ou pode ser derivada de uma fonte diferente. Pode ser empregue uma ampla variedade de regiões de terminação sem afectar adversamente a expressão.

As várias manipulações podem ser realizadas in vitro ou podem ser realizadas num hospedeiro apropriado, e.g. E. coli. Após cada manipulação, a construção resultante pode ser clonada, o vector isolado e o ADN pesquisado ou sequenciado para assegurar a correcção da construção. A sequência pode ser pesquisada por análise de restrição, sequenciação ou semelhantes.

Pode ser inserido um pequeno número de nucleótidos no terminal da sequência do auto-antigénio, usualmente não mais de 20, mais usualmente não mais de 15. A deleção ou inserção de nucleótidos será usualmente o resultado das necessidades da construção, proporcionando locais de restrição convenientes, adição de sinais de processamento, facilidade de manipulação, melhoramento do nível de expressão, ou semelhantes. Em adição, pode-se desejar substituir um ou mais aminoácidos por um aminoácido diferente por razões similares, usualmente não substituindo mais de cerca de cinco aminoácidos na região.

Numa concretização da invenção o auto-antigénio é co-vacinado com sequências de ADN que codificam uma citoquina Th2, grupo este que inclui IL-4, IL-10, TGF-β, etc. A IL4 tem particular interesse. A linfóquina IL-4 tem actividades de factor de crescimento de células T e mastócitos. A IL4 humana é uma glicoproteína de 18 kD. Por conveniência, a sequência de aminoácidos é aqui proporcionada como SEQ ID NO: 13, e a sequência de ADN como SEQ ID NO: 14 (Yokota et al. (1986) P.N.A.S. 83:5894-5898). Esta sequência é a sequência preferida da invenção. Contudo, a invenção não está limitada à utilização desta sequência em construções da invenção. São também úteis as sequências variantes estreitamente relacionadas que têm a mesma actividade biológica, ou 13 ΕΡ 1 621 208/ΡΤ actividade biológica substancialmente similar. Um local alvo de ligação de ADN de STAT6 especifico é encontrado no promotor do gene do receptor de IL4; e STAT6 activa a expressão do gene de IL4 por via deste local. Os interferões inibem a activação induzida por IL4 da expressão génica de STAT6 e dependente de STAT6, pelo menos em parte, induzindo a expressão de S0CS1 (veja-se Kotanides et al. (1996) J. Biol. Chem. 271: 25555-25561)

Sequências variantes codificam subunidades de proteína que, quando presentes numa construção de ADN da invenção, dão à proteína uma ou mais das propriedades biológicas de IL4 como descrito atrás. As sequências de ADN da invenção podem diferir de uma sequência nativa de IL4 pela deleção, inserção ou substituição de um ou mais nucleótidos, desde que codifiquem uma proteína com a actividade biológica apropriada como descrito atrás. Similarmente, podem ser truncadas ou estendidas por um ou mais nucleótidos. Alternativamente, as sequências de ADN adequadas para a prática da invenção podem ser sequências degeneradas que codificam a proteína de IL4 de ocorrência natural. Tipicamente, as sequências de ADN da invenção possuem pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com uma sequência de codificação de IL4 nativa. Podem ser originárias de quaisquer espécies, embora sejam preferidos ADN que codificam proteínas humanas. As sequências variantes podem ser preparadas por qualquer meio adequado conhecido na arte.

Com respeito a substituições, preferem-se as substituições conservativas. Tipicamente, as substituições conservativas são substituições em que o aminoácido substituído é de natureza semelhante ao que está presente na proteína de ocorrência natural, por exemplo em termos de carga e/ou tamanho e/ou polaridade e/ou hidrofobicidade. De modo semelhante, as substituições conservativas têm tipicamente pouco ou nenhum efeito sobre a actividade da proteína. As proteínas da invenção que diferem em sequência da IL4 de ocorrência natural podem ser manipuladas para diferir em actividade da IL4 de ocorrência natural. Estas manipulações serão tipicamente realizadas ao nível do ácido nucleico utilizando técnicas recombinantes, como é conhecido na arte. 14 ΕΡ 1 621 208/ΡΤ A vacina pode ser formulada com um ou um cocktail de sequências de auto-antigénios, o que pode ser no mesmo vector ou em diferentes vectores. Os vectores de ADN são suspensos num tampão fisiologicamente aceitável, geralmente uma solução aquosa, e.g., solução salina normal, solução salina tamponada com fosfato, água, etc. Agentes estabilizantes, agentes molhantes e emulsionantes, sais para variar a pressão osmótica ou tampões para assegurar um valor de pH adequado, e promotores da penetração na pele, podem ser utilizados como agentes auxiliares. 0 ADN estará usualmente presente numa concentração de pelo menos 1 ng/ml e não mais de cerca de 10 mg/ml, usualmente de cerca de 100 μρ a 1 mg/ml.

Em algumas concretizações da presente invenção, é administrado ao paciente tanto uma sequência que codifica um auto-antigénio como uma sequência que codifica uma citoquina Th2. A citoquina e o auto-antigénio podem ser entregues simultaneamente ou dentro de um curto período de tempo, pela mesma via ou por vias diferentes. Numa concretização da invenção, as duas sequências são co-formuladas, significando isto que são entregues juntas como parte de uma única composição. As sequências de codificação podem estar associadas uma à outra por ligação covalente numa única molécula de ácido nucleico, onde podem estar presentes na forma de duas sequências de codificação distintas separadas por uma terminação de tradução, ou podem estar presentes na forma de uma única proteína de fusão. As duas sequências podem também estar juntas por interacção não covalente tal como interacção hidrófoba, ligação de hidrogénio, interacção iónica, interacção de van der Walls, interacção magnética ou suas combinações. Alternativamente, as duas construções podem simplesmente ser misturadas numa suspensão comum, ou encapsuladas numa qualquer forma de dispositivo de entrega tal como, por exemplo, um dispositivo de alginato, uma vesícula de quitosano de lipossoma, etc. (veja-se, por exemplo, WO 98/33520) . A vacina pode ser fraccionada em duas ou mais doses, de pelo menos cerca de 1 μρ, mais usualmente pelo menos cerca de 100 μρ, e preferivelmente pelo menos cerca de 1 mg por dose, administradas com de cerca de 4 dias a uma semana de 15 ΕΡ 1 621 208/ΡΤ intervalo. Em algumas concretizações da invenção, o indivíduo é sujeito a uma série de vacinações para produzir uma resposta imunitária ampla, completa. De acordo com este método, pelo menos duas e preferivelmente quatro injecções são dadas ao longo de um período de tempo. 0 período de tempo entre as injecções pode incluir de 24 horas de intervalo a duas semanas ou mais entre injecções, preferivelmente uma semana de intervalo. Alternativamente, pelo menos duas e até quarto injecções separadas são dadas simultaneamente em diferentes partes do corpo A vacina de ADN é injectada no músculo. É de particular interesse a injecção no músculo esquelético. A vacina genética pode ser administrada directamente no indivíduo a imunizar ou ex vivo em células removidas do indivíduo que são reimplantadas após a administração. Por qualquer via, o material genético é introduzido em células que estão presentes no corpo do indivíduo. Alternativamente, a vacina genética pode ser introduzida por vários meios nas células que são removidas do indivíduo. Estes meios incluem, por exemplo, transfecção, electroporação e bombardeamento de microprojécteis. Depois da construção genética ser tomada pelas células, estas são reimplantadas no indivíduo. Células de outro modo não imunogénicas que possuem construções genéticas nelas incorporadas podem ser tomadas de um indivíduo e implantadas noutro.

Um exemplo de injecção intramuscular pode ser encontrado em Wolff et al. (1990) Science 247: 1465-1468. Injecção por jacto pode também ser utilizada para administração intramuscular, como descrito por Furth et al. (1992) Anal

Biochem 205: 365-368. O ADN pode revestir micropartículas de ouro e ser entregue intradermicamente através de um dispositivo de bombardeamento de partículas ou "canhão de genes". A vacinação com ADN em micropartículas foi descrita na literatura (veja-se, por exemplo, Tang et al. (1992) Nature 356: 152-154). Os microprojécteis de ouro são revestidos com a cassete de vacina e depois bombardeados sobre as células cutâneas.

As vacinas genéticas são formuladas de acordo com o modo de administração a utilizar. Uma pessoa competente na matéria 16 ΕΡ 1 621 208/ΡΤ pode prontamente formular uma vacina genética que compreende uma construção genética. Para injecção intramuscular utiliza-se uma formulação isotónica. Geralmente, os aditivos para isotonicidade podem incluir cloreto de sódio, dextrose, manitol, sorbitol e lactose. As soluções isotónicas como a solução salina tamponada com fosfato são preferidas. Os estabilizantes incluem gelatina e albumina.

Antes, ou simultaneamente com a administração da construção genética, pode ser administrado às células um agente estimulante das células ou proliferativo das células, termos que são aqui utilizados indiferentemente e se referem a compostos que estimulam a divisão celular e facilitam a captação de ADN e ARN.

Bupivacaina ou compostos possuindo uma semelhança funcional podem ser administrados antes ou simultaneamente com a vacina. A bupivacaina é um homólogo da mepivacaina e relaciona-se com a lidocaina. Torna o tecido muscular sensível à tensão eléctrica para provocação com sódio e efectua uma concentração iónica no interior das células. Em adição a bupivacaina, mepivacaina, lidocaina e outros compostos de actuação semelhante, outros agentes estimulantes celulares contemplados incluem lectinas, factores de crescimento, citoquinas e linfoquinas tais como factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), gCSF, gCMSF, factor de crescimento epidérmico (EGF) e IL-4. Cerca de 50 μΐ a cerca de 2 μιηΐ de bupivacaína-HCl a 0,5% e metilparabeno a 0,1% num transportador farmacêutico isotónico podem ser administrados ao local onde se pretende administrar a vacina, preferivelmente 50 μΐ a cerca de 1500 μΐ, mais preferivelmente cerca de 1 ml. A vacina genética pode também ser combinada com colagénio na forma de uma emulsão e entregue intraperitonealmente. A emulsão de colagénio proporciona um meio para a libertação sustentada de ADN. Utilizam-se 50 μΐ a 2 ml de colagénio. A eficiência da vacinação com ADN pode ser melhorada por injecção de cardiotoxina no tecido cerca de uma semana antes da vacinação, como descrito por Davis et al. (1993) FEBS Lett. 333: 146-150, e nos exemplos. A cardiotoxina estimula a degeneração e a regeneração musculares. O músculo é injectado 17 ΕΡ 1 621 208/ΡΤ com cerca de 0,1 a 10 μΜ de cardiotoxina dissolvida num veículo farmacologicamente aceitável. A condição que se está a tratar, e o estado imunitário do hospedeiro determinarão a escolha de sequência(s) de auto-antigénio(s). O hospedeiro pode ser avaliado quanto à responsividade imunitária a um auto-antigénio de vacina candidato através de vários métodos conhecidos na arte. O diagnóstico pode determinar o nível de reactividade, e.g., com base no número de células T reactivas encontradas numa amostra, em comparação com um controlo negativo de um hospedeiro não sensibilizado ("ingénuo"), ou normalizado para uma curva de dados obtida a partir de um ou mais pacientes. Em adição à detecção da presença qualitativa e quantitativa de células T reactivas com auto-antigénios, as células T podem ser tipificadas quanto à expressão de citoquinas que se sabe que aumentam ou suprimem respostas inflamatórias. Pode ser também desejável tipificar a especificidade epitópica das células T reactivas.

As células T podem ser isoladas de sangue periférico, nódulos linfáticos ou preferivelmente do local da inflamação, do paciente. Os ensaios de reactividade podem ser realizados em células T primárias, ou as células podem ser fundidas para gerar hibridomas. Estas células T reactivas podem também ser utilizadas para análise posterior da progressão da doença, por monitoração da sua localização in situ, utilização de receptores de células T, etc. Os ensaios para monitoração da responsividade de células T são conhecidos na arte, e incluem ensaios de proliferação e ensaios de libertação de citoquinas.

Os ensaios de proliferação medem o nível de proliferação de células T em resposta a um antigénio específico, e são amplamente utilizados na arte. Num ensaio exemplificativo, obtêm-se células de nódulos linfáticos, sangue ou baço do paciente. Uma suspensão de cerca de 104 a 107 células, usualmente de cerca de 105 a 106 células é preparada e lavada, depois é cultivada na presença de um antigénio de controlo, e antigénios de teste. Os antigénios de teste podem ser péptidos de quaisquer antigénios autólogos que se suspeite induzirem uma resposta de células T inflamatórias. As células são 18 ΕΡ 1 621 2 Ο 8/PT usualmente cultivadas durante vários dias. A proliferação induzida pelos antigénios é avaliada pela monitoração da sintese de ADN pelas culturas, e.g. incorporação de 3H-timidina durante as últimas 18 h de cultura.

Utilizam-se ensaios imunossorventes com enzima ligada (ELISA) para determinar o perfil de citoquinas de células T reactivas, e podem ser utilizados para monitorar a expressão de citoquinas como IL-2, IL-4, IL-5, ylFN, etc. Os anticorpos de captura podem ser qualquer anticorpo especifico para uma citoquina de interesse, em que os sobrenadantes dos ensaios de proliferação de células T, como atrás descrito, são convenientemente utilizados como fonte de antigénio. Após bloqueio e lavagem, adicionam-se os anticorpos detectores marcados, e determinam-se as concentrações de proteína presentes em função do marcador que está ligado.

Os ensaios de diagnóstico anteriores podem ser realizados com vários péptidos derivados da proteína autóloga de interesse. Podem-se utilizar uma série de péptidos possuindo a sequência de um auto-antigénio, e.g. PLP, MBP, etc. Péptidos possíveis podem ser pesquisados para determinar quais são imunodominantes no contexto de doença auto-imune.

Os péptidos imunodominantes podem ser definidos pela pesquisa com um painel de péptidos derivados da proteína de teste. Os péptidos possuem a sequência de aminoácidos de uma porção da proteína, usualmente pelo menos cerca de 8 e não mais de cerca de 30 aminoácidos, mais usualmente não mais de cerca de 20 aminoácidos de comprimento. O painel de péptidos representará o comprimento da sequência da proteína, i.e. todos os resíduos estão presentes em pelo menos um péptido. Preferivelmente são gerados péptidos sobrepostos, em que cada péptido é desviado 1 a 5 aminoácidos, gerando deste modo um conjunto mais completo de epítopos. Os péptidos podem ser inicialmente pesquisados em conjuntos, e mais tarde pesquisados quanto ao epítopo exacto ao qual a célula T irá responder, como previamente descrito. Os péptidos imunodominantes são reconhecidos por uma fracção significativa dos hibridomas responsivos, restritos por HLA, usualmente pelo menos cerca de 10%, mais usualmente pelo menos cerca de 25%, e pode ser utilizado tanto quanto 80%. 19 ΕΡ 1 621 208/ΡΤ A terapia aqui descrita será desejavelmente administrada durante o estádio pré-sintomático ou pré-clínico da doença, e em alguns casos durante o estádio sintomático da doença. 0 tratamento precoce é preferível, de modo a evitar a perda de função associada aos danos em tecido inflamatório. 0 estádio pré-sintomático ou pré-clínico será definido como o período até ao envolvimento de células T no local da doença, e.g. ilhéus de Langerhans, tecido sinovial, glândula tiróide, etc., mas a perda de função não é ainda suficientemente grave para produzir os sintomas clínicos indicativos de doença declarada. 0 envolvimento de células T pode ser evidenciado pela presença de números elevados de células T no local de doença, pela presença de células T específicas para auto-antigénios, pela libertação de perforinas e granzimas no local de doença, pela resposta a terapia imunossupressora, etc.

As doenças articulares degenerativas podem ser inflamatórias, como com a espondiloartropatias seronegativas, e.g. espondilite anquilosante e artrite reactiva; artrite reumatóide; gota; e lúpus eritematoso sistémico. As doenças degenerativas das articulações têm uma característica comum, o facto da cartilagem da articulação ser erodida, eventualmente expondo a superfície do osso. A destruição da cartilagem começa com a degradação de proteoglicano, mediada por enzimas tais como a estromelisina e a colagenase, resultando na perda da capacidade de resistir a tensão de compressão. Seguem-se alterações na expressão de moléculas de adesão, tais como CD44 (Swissprot P22511), ICAM-1 (Swissprot P05362) e da proteína da matriz extracelular, tal como fibronectina e tenascina. Eventualmente, os colagénios fibrosos são atacados por metaloproteases, e quando o micro-esqueleto colagenoso se perde, é impossível a reparação por regeneração.

Existe uma actividade imunológica significativa no interior do sinóvio durante o decorrer da artrite inflamatória. Embora seja desejável o tratamento durante os estádios iniciais, os sintomas adversos da doença podem ser pelo menos parcialmente aliviados por tratamento durante os estádios mais tardios. Os índices clínicos para a gravidade da artrite incluem dor, inchaço, fadiga e rigidez matinal, e 20 ΕΡ 1 621 208/ΡΤ podem ser quantitativamente monitorados por critérios de Pannus. A progressão da doença em modelos animais pode ser seguida de medição da inflamação da articulação afectada. A terapia para a artrite inflamatória pode combinar o tratamento do indivíduo com o tratamento convencional com ΑΙΝΕ. Geralmente, o este tratamento não será combinado com fármacos modificadores da doença como a ciclosporina A, o metotrexato e similares.

Um aumento quantitativo nas células T autorreactivas com mielina com a capacidade de segregar IFN-gama está associado à patogénese de EM e EAE, sugerindo que linfócitos T indutores/auxiliares auto-imunes no sangue periférico de pacientes de EM podem iniciar e/ou regular o processo de desmielinização em pacientes com EM. A doença declarada está associada a fraqueza muscular, perda de reflexos abdominais, defeitos visuais e parestesias. Durante o período pré-sintomático existe infiltração de leucócitos no fluido cerebrospinal, inflamação e desmielinização. Histórias familiares e a presença do haplótipo de HLA DRB1*1501, DQA1*0102, DQBl*0602, são indicativos de uma susceptibilidade à doença. Os marcadores que podem ser monitorados quanto à progressão da doença são a presença de anticorpos no fluido cerebrospinal, "potenciais evocados" observados por electroencefalografia no córtex visual e tronco cerebral, e a presença de defeitos na medula espinal por MRI ou tomografia computadorizada. O tratamento durante os estádios precoces da doença irá retardar ou parar a posterior perda de função neural. A IDDM humana é uma desordem auto-imune mediada por células que conduz à destruição de células b secretoras de insulina e hiperglicemia declarada. Os linfócitos T invadem os ilhéus de Langerhans, e destroem especificamente as células b produtoras de insulina. A depleção de células b resulta numa incapacidade de regular os níveis de glucose no sangue. A diabetes declarada ocorre quando o nível de glucose no sangue sobe acima de um nível específico, usualmente cerca de 250 mg/dl. Em seres humanos um longo período pré-sintomático precede o início da diabetes. Durante este período há uma perda gradual de função das células b pancreáticas. A progressão da doença pode ser monitorada em indivíduos 21 ΕΡ 1 621 2 Ο 8/PT diagnosticados por história familiar e análise genética como sendo susceptiveis. O efeito genético mais importante é observado com genes do locus de histocompatibilidade principal (IDDMl), embora outros loci, incluindo a região do gene da insulina (IDDM2) apresente também ligação à doença (veja-se Davies et al., supra e Kennedy et al. (1995) Nature Genetics 9:293-298).

Os marcadores que podem ser avaliados durante o estádio pré-sintomático são a presença de insulite no pâncreas, o nível e frequência de anticorpos de células dos ilhéus, anticorpos da superfície de células dos ilhéus, expressão aberrante de moléculas do MHC de Classe II sobre células b pancreáticas, concentração de glucose no sangue e concentração plasmática de insulina. Um aumento no número de linfócitos T no pâncreas, de anticorpos de células dos ilhéus e glucose sanguínea é indicativo da doença, assim como o é uma diminuição na concentração de insulina. Após o início de diabetes declarada, os pacientes com função de células b residuais, evidenciada pela persistência no plasma de péptido de insulina C, podem também beneficiar do tratamento do indivíduo, para prevenir perdas adicionais de função.

As espécies de mamífero susceptiveis a condições inflamatória incluem caninos e felinos; equinos; bovinos; ovinos; etc. e primatas, particularmente seres humanos. Podem ser utilizados modelos animais, particularmente pequenos mamíferos, e.g. murinos, lagomorfos, etc., para investigações experimentais. Os modelos animais de interesse incluem os que estão envolvidos na produção de anticorpos possuindo isotipos associados à produção de IL-4, e.g. IgE, IgGl e IgG4. Outras utilizações incluem investigações onde seja desejável investigar um efeito específico na ausência de inflamação mediada por células T.

Deve entender-se que a presente invenção não está limitada às formulações e reagentes particulares descritos, pois estes podem, evidentemente, variar. Deve também entender-se que a terminologia aqui utilizada é para os fins de descrição apenas das concretizações particulares, e não pretende limitar o âmbito da presente invenção que será limitado apenas pelas reivindicações em anexo. 22 ΕΡ 1 621 208/ΡΤ

Deve-se notar que, como se utiliza aqui e nas reivindicações em anexo, as formas singulares "a", "o", "uma" e "um" incluem aos correspondentes plurais a menos que o contexto determine claramente o contrário. Assim, por exemplo, a referência a "um complexo" inclui uma pluralidade destes complexos e a referência a "a formulação" inclui referência a uma ou mais formulações e seus equivalentes conhecidos pelos peritos na especialidade, e assim por diante. A menos que definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados possuem o mesmo significado que vulgarmente é entendido por uma pessoa competente na matéria à qual a presente invenção pertence. Embora possam ser utilizados quaisquer métodos, dispositivos e materiais similares ou equivalentes aos que aqui se descrevem na prática ou testes da invenção, os métodos, dispositivos e materiais preferidos são agora descritos.

As publicações discutidas atrás e ao longo de todo o texto são proporcionadas somente pela sua divulgação antes da data de apresentação do presente pedido. Nada aqui deve ser entendido como uma admissão de que os inventores não têm direito em termos de antecipação de revelação em invenções anteriores.

Os exemplos que se seguem são adicionados para proporcionar aos peritos na especialidade uma completa descrição e revelação de como fazer e utilizar a presente invenção, e não se pretendem limitantes do âmbito do que é considerado como a invenção. Fizeram-se esforços para assegurar a exactidão relativamente aos números utilizados (e.g. quantidades, temperatura, concentrações, etc.) mas deverão ser tidos em conta alguns erros e desvios experimentais. A menos que indicado de outro modo, as partes são partes em peso, o peso molecular é o peso molecular médio, e a pressão é atmosférica ou próxima da atmosférica. 23 ΕΡ 1 621 208/ΡΤ PARTE EXPERIMENTAL Materiais e Métodos

Animais. Ratinhos SJL/J fêmeas de seis a oito semanas de idade foram adquiridos a Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME).

Antigénios. Sintetizaram-se péptidos num sintetizador de péptidos (modelo 9050: MilliGen, Burlington, MA) através da química do 9-fluorenilmetoxicarbonilo Standard. Os péptidos foram purificados por HPLC. A estrutura foi confirmada por análise dos aminoácidos e espectroscopia de massa. Os péptidos utilizados nas experiências foram: PLP139-151 (SEQ ID NO:5 HSLGKWLGHPDKF) , PLP139-151 L144/R147 (SEQ IDNO:6 HSLGKLLGRPDKF), e PLP178-191 (SEQ ID NO:6 NTWTTCQSIAFPSK). Utilizou-se homogeneizado de medula espinal de porquinhos-da-índia (SCH) após liofilização.

Vector de expressão do péptido PLP. Três minigenes, cada um codificando um epítopo de PLP, foram construídos por hibridação de dois oligonucleótidos com uma sequência 16-mero sobreposta complementar (sublinhada), e extensão com ADN-polimerase e dNTP: PLP (178-191): SEQ ID NO:8 5'-CTGGAGACCA GAATACCTGG ACCACCTGCC AGTCTATTGC CTTCCCTAGC AAGTCTAGAT AGCTA-3' PLP (139-151): SEQ ID NO:9 5'-CTCGAGACCA TGCATTGTTT GGGAAAATGG CTAGGACATCCCGACAAGTTTTCTAGATAGCTA -3'. PLP (139-151) L144/R147 SEQ ID NO:10: 5'-CTCGAGACCATGCATTGTTTG GGA AAACTACTAGGACGCCCCGACAAGTTTTCTAGATAGCTA -3'.

Estas dúplices oligonucleotídicas foram desenhadas para incorporar locais de restrição Xho I e Xba I.

Os produtos foram clonados na região de clonagem múltipla do Vector pTARGET (Promega, Maison, WI), um vector de expressão de mamífero conduzido pelo promotor de CMV. Os clones positivos foram identificados por pesquisa de cor e a orientação correcta das inserções foi confirmada por sequenciação automática do ADN. A purificação do ADN plasmídico foi realizada por Wizard plus Maxipreps (Promega) de acordo com as instruções do fabricante. 24 ΕΡ 1 621 208/ΡΤ

Protocolo de imunização com ADN. Os animais experimentais foram injectados nos quadríceps esquerdos com 0,1 ml de bupivacaina-HCl a 0,25% (Sigma, St. Louis, MO) em PBS. Dois e dez dias mais tarde, os ratinhos foram injectados com 0,05 ml de ADN plasmidico (1 mg/ml em PBS), no mesmo músculo. ELISA para títulos de anticorpos anti-PLPl39-151 ou anti-SCH de porquinho-da-índia. Revestiram-se placas de microtitulo de 96 poços de poliestireno (Dynatech, Chantilly, VA) com 0,1 ml de péptido ou SCH de porquinho-da-índia, diluiu-se em PBS numa concentração de 0,01 mg/ml em PBS. Após bloqueio com PBS + soro fetal de vitelo a 0,5% (Gibco) e tween 20 a 0,05% (Bio-Rad, Hercules, CA) , incubaram-se os soros dos ratinhos durante duas horas à temperatura ambiente e testou-se a ligação do anticorpo através da adição de IgG de cabra anti-ratinho conjugada com fosfatase alcalina (Southern Biotechnology, Birmingham, AL) . Após a adição do substrato da enzima, leram-se as placas a 405 nm num leitor de ELISA. A Figura 1 mostra os resultados para soros colhidos sete dias após a segunda injecção intramuscular expressos como D.O. de amostras individuais num grupo de dez animais. Os valores de D.O. para soros pré-imunes foram: diluição 1:10:0,12, diluição 1:20:0,08 e diluição 1:40:0,03.

Indução de EAE. Dissolveu-se péptido PLP139-151 em PBS até uma concentração de 2 mg/ml e emulsionou-se com um volume igual de Adjuvante Incompleto de Freund suplementado com 4 mg/ml de micobactéria da tuberculose H37Ra morta por calor (Difco Laboratories, Detroit, MI). Os ratinhos foram injectados subcutaneamente com 0,1 ml de emulsão do péptido e, no mesmo dia e 48 h mais tarde, intravenosamente com 0,1 ml de toxina de Bordetella pertussis a 4 μρ/ml em PBS. Os animais experimentais foram classificados como se segue: 0 = sem doença clínica; 1 = fraqueza ou paralisia da cauda; 2 = fraqueza nos membros traseiros; 3 = paralisia nos membros traseiros; 4 = fraqueza ou paralisia nos membros dianteiros; 5 = animal moribundo ou morto.

Ensaios de proliferação de células dos nódulos linfáticos. Removeram-se nódulos linfáticos de drenagem de ratinhos após a fase aguda da doença e testaram-se as células dos nódulos linfáticos (LNC) in vitro quanto a respostas 25 ΕΡ 1 621 208/ΡΤ proliferativas específicas ao péptido PLP139-151. Prepararam-se culturas em placas de microtítulo de 96 poços de fundo liso num volume de 0,2 ml/poço a uma concentração de células de 2,5xl06/ml. O meio de cultura de tecidos para o ensaio consistia em RPMI 1640 suplementado com L-glutamina (2 mM) , piruvato de sódio (1 mM), aminoácidos não essenciais (0,1 mM) , penicilina (100 U/ml), estreptomicina (0,1 mg/ml), 2-mercaptoetanol (5xl0-5 M) , e soro de ratinho normal fresco autólogo a 1%. Após 72 h de incubação a 37°C, pulsaram-se as células durante 18 h com 1 μθί/ρορο de (3H)timidina. Recolheram-se as placas e mediu-se a incorporação de (3H)timidina num contador de cintilação. Após a recuperação a partir da fase aguda da doença os animais injectados com ADN que codifica para PLP139-151 ou vector de controlo, pTARGET, foram sacrificados, e isolaram-se as LNC de drenagem. As células foram testadas in vitro por estimulação com diferentes concentrações do péptido PLP139-151 ou do péptido de controlo PLP178-191. As respostas proliferativas de LNC reunidas de grupos de cinco animais estão mostradas na Figura 2 como média de CPM ± DP de poços em triplicado. As CPM de Concanavalina A (0,001 mg/ml) que estimularam LNC foram 102401 para o grupo A e 76702 para o grupo B.

Determinação de citoquinas. Colheram-se LNC de drenagem (107 células/ml) de animais experimentais após a fase aguda da doença e estimularam-se in vitro com várias concentrações de antigénio. Após 24 e 48 h de estimulação, recolheram-se os sobrenadantes e testaram-se por ELISA de sanduíche.

Ensaio de protecção de ribonuclease. Para a detecção de ARNm, testaram-se amostras de ARN de tecido de LNC de animais experimentais utilizando o sistema de ensaio de protecção de ARNase (RPA) com múltiplas sondas, RiboQuant (Pharmigen, San Diego, CA) de acordo com as instruções do fabricante.

Análise fluorocitométrica. Incubaram-se células do baço (5xl06/ml) de ratinhos SJUJ "ingénuos", na presença de ADN plasmídico que codifica para a sequência de PLP139-151 (0,01 mg/ml) a 37°C. Após 24 h recolheram-se as células e analisaram-se num citómetro de fluxo FACScan (Becton Dickinson). Utilizaram-se os seguintes conjugados de anticorpos: FITC anti-ratinho CD80, clone 16-10A1; FITC anti- 26 ΕΡ 1 621 208/ΡΤ ratinho CD86, clone GL1; FITC anti-ratinho I-Ak, clone 10-3.6; anti-ratinho B220 conjugado com R-PE, clone RA3-6B2; anti-ratinho CDllb conjugado com R-PE, clone Ml/70; anti-ratinho conjugado com PE, clone GK 1.5. Todos os anticorpos foram adquiridos a Pharmigen, San Diego, CA. Após 24 h de incubação in vitro sem ADN (sem ADN) ou com ADN plasmidico que codifica para o péptido PLP139-151 [ADN (PLP139-151)] , células de baço foram coradas com mAb anti-Mac 1, mAb anti-B220, mAb anti-B7.1 e mAb anti-B7.2 como indicado. "Branco" refere-se a uma coloração de fundo não especifica. Os resultados mostrados na Figura 4 são representativos de três experiências.

Resultados O minigene, que codifica para o péptido PLP139-151, foi clonado num vector de expressão e injectado intramuscularmente em ratinhos SJUJ, duas vezes, a intervalos de uma semana. Dez dias depois da última injecção, sangraram-se os animais experimentais e testaram-se os seus soros quanto à presença de anticorpos específicos. Como mostrado na Fig. 1, os títulos de IgG anti-PLP139-151 podem ser detectados nos ratinhos previamente injectados com o minigene PLP139-151. Assim, as respostas imunitárias serológicas específicas são induzidas com esta construção particular.

Para determinar se a injecção de ADN contendo sequências de PLP pode ser eficaz na protecção de ratinhos contra a indução de EAE, a construção do minigene de PLP139-151 foi injectada intramuscularmente, duas vezes, com intervalos de uma semana. Dez dias após a última injecção, os ratinhos foram provocados com o péptido PLP139-151 emulsionado em CFA. Como mostrado na Tabela 1, é observada melhoria da doença clínica aguda nos animais vacinados com o vector plasmidico de PLP139151, em comparação com o grupo do plasmídeo de controlo. O início da doença foi retardado em comparação com o grupo do plasmídeo de controlo (11,5+0,5 dias, p< 0,008), a gravidade média de pico da doença foi reduzida (p< 0,005), e a classificação média da doença foi reduzida (p< 0,0005). Em adição, outros grupos foram injectados com a) um plasmídeo contendo um minigene que codifica o ligando peptídico alterado PLP pl39-151 (W144>L, H147>R), b) um plasmídeo contendo um minigene que codifica o epítopo de PLP pl78-191. O início da doença foi retardado (11,6+0,5 dias, p< 0,009) e a classificação média de pico da doença foi reduzida (p< 0,02) 27 ΕΡ 1 621 208/ΡΤ com ο minigene que codifica o ligando peptídico alterado (W144, H147). Também, o inicio da doença foi retardado (11,5+0,4 dias, p< 0,003), a gravidade média de pico da doença foi reduzida (p< 0,007) e a classificação média da doença foi reduzida (p< 0,0001), com o minigene que codifica o péptido PLP pl78-191.

Tabela 1

Indução de EAE em ratinhos SJL/J imunizados com ADN. ADN injectado Percentagem de incidência Classificação média da doença no dia llf Dia médio do início da doença Gravidade média de pico da doença PLP 139-151 68(13/19)* 0,9+0,3 11,5+0,5 1,7+0,4 (p<0, 0005 )51 (p<0,008) (p<0,005) PLP 178-191 70(14/20) 0,6+0,2 11,5+0,4 1,8+0,3 (p<0,0001) (p< 0, 0035) (p<0,007) PLP 139-151 (L>R) 85(17/20) 1,2+0,3 11,6+0,5 2,0+0,3 (p<0,001) (p<0,009) (p<0,01) pTARGET 90(18/20) 2,7+0,3 10,1+0,27 3,1+0,3 sem plasmídeo 100(10/10) 2,1+0,7 9,9+0,4 3,3+0,3

Os números entre parêntesis significam animais doentes/animais testados + As médias são dadas como média + SEM 1 Todos os valores p são dados em comparação com pTARGET pelo teste t de Student

Os ratinhos, injectados com ADN e depois provocados com o péptido encefalolitogénico PLP 139-151, foram sacrificados após resolução da fase aguda da doença clinica. AS LNC de drenagem foram novamente estimuladas in vitro com o péptido PLP 139-151 e testados quanto às suas respostas proliferativas e produção de citoquinas. A Fig. 2 mostra que as LNC de ratinhos injectados com ADN que codifica para o péptido PLP 139-151 tinham menores respostas proliferativas quando comparados com as LNC de animais de controlo (p< 0,01) . A Fig. 3(A) mostra que, quando estimuladas com o PLP139-151, as LNC de ratinhos imunizados com o ADN plasmídico que codifica para a região do PLP139-151 segregam menores níveis de IL-2 e γ-interferão em comparação com grupos de controlo. De modo a avaliar os níveis de transcritos de ARNm de citoquinas em cérebro inflamado utilizámos um ensaio de protecção de ribonuclease com ARNm isolado de tecido cerebral. A Fig. 3(B) revela uma redução nos níveis de ARNm de γ-interferão e IL-15 em ratinhos imunizados com o minigene que codifica a região de PLP139-151. Portanto, é evidente uma correlação entre a baixa 28 ΕΡ 1 621 208/ΡΤ incidência de doença clinica, reduzidas respostas celulares e baixos níveis de IL-2, IL-15 e γ-interferão nos ratinhos vacinados com ADN de PLP139-151. Os níveis de expressão relativos de bandas de ARNm de citoquinas mostrados na Fig. 3B foram medidos por densitometria. De modo a corrigir diferenças de carga, os valores foram normalizados de acordo com o nível de expressão do gene housekeeping, GAPDH, em cada amostra. Há uma redução do nível de expressão das citoquinas testadas nos cérebros de ratinhos vacinados com o ADN plasmídico que codifica para o determinante de PLP139-151 em comparação com ratinhos vacinados com ADN plasmídico de pTARGET e PLP139-151 (L/R).

De modo a esclarecer um mecanismo para as respostas de células T diminuídas, testámos in vitro o efeito de APC, cultivadas na presença de ADN, sobre as respostas proliferativas de células T específicas de PLP139-151. Incubaram-se os esplenócitos com ADN plasmídico que codifica para o segmento de PLP139-151, ou com o péptido PLP139-151 e utilizaram-se como uma fonte de APC para estimular células L139, uma linha de células T específicas de PLP139-151. As respostas proliferativas da linha de células T L139 às APC anteriores foram comparadas na presença ou ausência de contas revestidas com anticorpo anti-CD28. Como mostrado na Tabela 2, as células L139 responderam a APC singénicas pré-incubadas com o péptido sintético PLP139-151 [8512 cpm médias]. Esta resposta é aumentada com a adição de anticorpos anti-CD28 [127281 cpm médias]. Contudo, quando as APC foram incubadas com o ADN plasmídico contendo a sequência de codificação de PLP139-151, as células L139 foram incapazes de responder às APC [3358 cpm médias], mesmo na presença de anticorpos anti-CD28 (4532 cpm médias]. Esta infra-regulação não foi um efeito do próprio plasmídeo, uma vez que as APC incubadas com plasmídeo contendo uma sequência irrelevante não afectam a resposta proliferativa de células L139 a anticorpos anti-CD28 [4532 cpm versus 26363 cpm médias, p< 0, 0001] . Portanto, as células T específicas de PLP139-151 são incapazes de responder a co-estimulação com CD28 quando cultivadas na presença de APC carregado ADN plasmídico que codifica para a sequência de PLP139-151. 29 ΕΡ 1 621 208/ΡΤ

Tabela 2

Respostas proliferativas da linha de células T específicas de PLP139-151 na presença de esplenócitos singénicos carregados com ADN plasmídico ou péptido sintético. ADN ADN plasmídico péptido péptido Co-estimulação CPM1 2 3 plasmídico de pTARGET4 de PLP139-1514 HSV-VP164 PLP139-1514 Anti-CD285 (média) - - - - - 2186 - - + - - 2402 - - + - + 15139 - - - + - 8512 - - - + + 127281 + - - - - 2331 + - - - + 26363* - + - - - 3358 - + - - + 4532* '4 esplenócitos (5xlOb/ml) de ratinhosSJL/J"ingénuos" foram irradiados(3000rad) e incubados na presença de ADN plasmídico que codifica para a sequência de PLP139-151, plasmídeo sozinho (pTARGET) , péptido PLP139-151 ou péptido de controlo (HSV VP16). A concentração de ADN plasmídico foi de 0,01 mg/ml e a concentração de péptido foi de 0,001 mg/ml. Após as 24 h iniciais de incubação, lavaram-se os esplenócitos duas vezes e adicionaram-se 10 000 células T da linha de células 1

Os resultados estão expressos como CPM médias de poços em triplicado. 2 O valor P é <0, 0001 para a diferença entre as CPM de células T incubadas na presença de esplenócitos com ADN plasmídico de pTARGET versus células T incubadas 3 na presença de esplenócitos com ADN plasmídico de PLP139-151, na presença de 4 específicas do péptido PLP139-151, L139, a cada poço. Após mais 48 h de incubação marcou-se a placa com 1H-timidina e avaliou-se a proliferação por colheita 18 mais tarde e contagem da incorporação de 1H-timidina. Para demonstrar que o ADN nu aplicado exogenamente é captado pelos esplenócitos, e é expresso, utilizámos a técnica da reacção em cadeia com a polimerase transcritase inversa (RT-PCR). Putrificou-se o ARN total dos esplenócitos utilizando o kit de ARN total Rneasy (Quiagen Inc., Valência, CA) . A RT-PCR foi realizada utilizando o Sistema Access RT-PCR (Promega Corp., Maison, WI) e os iniciadores oligonucleotídicos específicos para o minigene de PLP139-151. Os iniciadores específicos do vector foram utilizados numa reacção RT-PCR separada para excluir a possibilidade de contaminação com ADN. Uma única banda correspondente ao minigene de PLP139-151 foi amplificada a partir do ARN total purificado dos esplenócitos carregados com o ADN plasmídico de PLP139-151 (dados não mostrados). 5 O sinal de co-estimulação foi entregue por adição de contas revestidas anti-CD28 (5 000 por poço) juntamente com as células T. O anticorpo anti-CD28 (clone 37.51) foi obtido de PharMingen (San Diego, CA) . As microesferas de látex de sulfato de poliestireno de 5 0,1 μηι de diâmetro foram obtidas de Interfacial Dynamics Corporation (Portland, OR) . As contas (6 x 106) foram suspendas em 6 ml de PBS e incubadas com 24 μg de anticorpo anti-CD28 durante 1,5 horas a 37°C. As contas foram lavadas extensamente com PBS e ressuspensas em RPMI-FCS a 10% e deixadas a bloquear durante pelo menos 30 minutos à temperatura ambiente. 6 anticorpos anti-CD28. 30

ΕΡ 1 621 2 Ο 8/PT Ο presente estudo demonstra a protecção contra a imunização com ADN plasmidico que codifica minigenes de mielina. Foi criada uma vacina de ADN por inserção da sequência de codificação para a região PLP139-151 num plasmideo bacteriano, sob o controlo do promotor de CMV. Este vector foi injectado em ratinhos SJUJ antes da indução de EAE por imunização com o péptido PLP139-151 em CFA. Os animais que receberam o plasmideo que codifica para o epítopo encefalolitogénico ficaram protegidos contra a indução de EAE. A análise das respostas imunitárias em animais protegidos demonstra menor proliferação de células T e secreção diminuída de citoquinas pró-inflamatórias, tanto nos órgãos linfáticos como no interior do órgão alvo, o cérebro, em comparação com o grupo de controlo. Estas características sugerem que a imunização com ADN cria anergia contra células T patogénicas. A capacidade de construções de minigene de mielina para infra-regular o efeito co-estimulante de anticorpos anti-CD28 sobre uma linha de células T específica de PLP enfatiza a sua capacidade para modular interacções APC-célula T. Realizaram-se análises fluorocitométricas para determinar se a imunização com ADN influencia a expressão na superfície de ligandos CD28 em APC. Após 24 h de incubação com o ADN plasmidico, coraram-se os esplenócitos com anticorpos anti-B7.1(CD80) ou anti-B7.2(CD86). Como mostrado na Fig. 4, é observada sobre-regulação de B7.1 e B7,2 em células positivas para Mac-1, mas não em células B220+ onde se observa infra-regulação de B7.2. A expressão de I-As em células do baço aumentou também tanto em células positivas para Mac-1 como positivas para B220, após incubação com ADN.

Observou-se uma similar sobre-regulação de moléculas co-estimulantes in vivo em linfócitos do sangue periférico e células do baço de animais inoculados com cassetes de ADN de expressão de ADN que codifica para a proteína 55 de núcleo de HIV. Em contraste com esta observação, verificámos que em respostas auto-imunes a PLP139-151 as alterações de expressão de moléculas co-estimulantes após imunização com ADN exercem um efeito protector por modulação do potencial proliferativo e da produção de citoquinas de células T autorreactivas. Recentemente, foi relatado que na EAE, há um aumento da expressão de B7.1 relativamente a B7.2 em ambiente esplénico, 31 ΕΡ 1 621 208/ΡΤ uma verificação que pode ajudar a explicar como o sistema imunitário tende na direcção da auto-imunidade, em vez de ignorância imunológica do próprio. É interessante que B7.2 aumenta no SNC durante a EAE activa e durante relapsos. A infra-regulação de B7.2 correlaciona-se com a remissão. Alterações na expressão de B7-1 e B7-2 após assimilação do ADN por células apresentadoras do antigénio pode constituir um factor-chave na regulação de respostas de células T na direcção de auto-antigénios em doenças auto-imunes.

As vacinas de ADN foram eficazes a gerar respostas imunitárias protectoras em vários modelos de cancro, e de infecções virais, bacterianas e parasiticas. Embora a geração de respostas do tipo Thl possa ser uma propriedade de vacinas de ADN que têm como alvo antigénios não próprios, as respostas Thl eliciadas ao próprio com vacinação com ADN não foram conseguidas.

Os efeitos biológicos de motivos de ADN como dinucleótidos CpG não metilados em contextos de bases particulares (motivos CpG-S) podem modular respostas imunitárias inatas quando injectados em animais (Krieg, A.M. et al. 1998, Trends in Microbiol. 6, 23-27). Embora não possamos rejeitar um possível efeito destas sequências nas construções de PLP 139-151 e PLP 139/151 (UR), os motivos CG nestas inserções não preenchem todos os critérios para motivos CpG-S.

A supressão de EAE foi relatada em ratos Lewis por imunização prévia com ADN que codifica um péptido MBP imunodominante em tandem com receptor de Fc de IgG. A vacinação suprimiu os sinais clínicos e histopatológicos de EAE, e reduziu a produção de interferão γ após provocação com péptido MBP 68-85 [Lobell et al. (1998) J. Exp. Med. 187: 1543-1548]. A vacinação não foi bem sucedida sem a inclusão da construção de Fc de IgG em tandem. Nas experiências apresentadas aqui, aparentemente não houve necessidade de qualquer construção em tandem em conjunto com o minigene de mielina. Tanto neste artigo como nas experiências utilizando ADN com a construção de Fc de IgG, observou-se imunidade Thl contra o próprio defectiva. Em contraste, o nosso laboratório relatou a indução de respostas protectoras do tipo Th2 por 32 ΕΡ 1 621 208/ΡΤ imunização com ADN em EAE [Waisman, 1996 supra.]. Portanto, a resposta imunitária a uma vacina de ADN que codifica o próprio pode ser muito diferente do que é observado com a vacinação com ADN contra antiqénios estranhos. Pode-se prever que respostas imunitárias induzidas por antigénios próprios codificados em vacinas de ADN terão um paralelo com o que se observa com a imunização com o mesmo auto-antigénio na forma de péptido ou proteína. Os nossos resultados sugerem que um antigénio próprio codificado num vector de ADN pode criar anergia em células T autorreactivas, e prevenir um ataque auto-imune. A co-estimulação de células T por ADN que codifica auto-antigénios é prejudicada, atenuando assim células T patogénicas. As nossas observações na EAE sugerem um modelo onde a imunização com ADN pode ser utilizada para tratamento de doença auto-imune.

Exemplo 2

Protecção contra doença auto-imune com uma co-vacina de ADN de interleucina-4 por via de indução de células T auxiliares 2 e activação de STAT6 0 exemplo seguinte demonstra que a co-vacinação com genes para a citoquina IL4 juntamente com o gene para PLP139-151, na forma de dois plasmídeos separados pode proporcionar imunidade protectora contra EAE. Em adição, é proposto um mecanismo, em que a IL4 funcional expressa a partir da vacina de ADN actua localmente sobre células T autorreactivas por via de activação de ST AT 6 para desviar o seu perfil de citoquinas para o tipo Th2. Estes resultados mostram a manipulação de um novo método de tratamento de doenças auto-imunes que combina os efeitos específicos de antigénios da vacinação com ADN com os efeitos benéficos da entrega local de genes.

Resultados A vacina de ADN de IL4 produz proteína IL4. De modo a construir a vacina de ADN de IL4, amplificou-se a sequência de codificação completa para IL4 por PCR a partir de ADNc de baço de ratinho. Este gene foi clonado no vector de expressão de mamífero pTargeT sob o controlo do promotor de CMV, e o plasmídeo foi purificado como descrito nos métodos. Para demonstrar que a construção de ADNc de IL4 pode de facto produzir proteína IL4 de comprimento completo, utilizou-se um 33 ΕΡ 1 621 208/ΡΤ sistema de tradução in vitro. Quando o plasmídeo de ADNc de IL4 foi transcrito e traduzido in vitro com 35S-metionina e resolvido por SDS-PAGE (electroforese em gel de poliacrilamida) e autorradiografia, observou-se um único produto com o tamanho correcto para IL4 de ratinho. Uma reacção de controlo com ADN do vector sem inserção ou plasmídeo codificando PLP139-151 não produziu produto detectável. 0 peso molecular previsto para PLPi39_i5i é aproximadamente de 1,5 kD e, portanto, seria extremamente difícil visualizá-lo por electroforese. A vacinação com ADN de IL4 provoca activação de STAT6. Para demonstrar que uma vacina de ADN pode actuar como um veículo de entrega de genes, quisemos explorar a questão de se a citoquina IL4 funcional era realmente expressa a partir da vacina de ADN administrada ao animal. Sabe-se que a IL4 actua através do receptor de IL4 para activar especificamente STAT6, um membro da família dos transdutores de sinal e activadores da transcrição (Takeda et al. (1996) Nature 380: 627-30; Quelle et al. (1995) Mol Cell Biol 15: 3336-43.

Vacinaram-se ratinhos intramuscularmente numa base de uma vez por semana com ADN plasmídico que codifica o ADNc de IL4 como descrito nos métodos. Dissecaram-se nódulos linfáticos de drenagem uma semana após a última vacina de ADN. Isolaram-se os lisados de proteína das células de nódulos linfáticos, e sondaram-se quanto à presença de STAT6 activado por Western blotting utilizando um anticorpo policlonal específico para a forma fosforilada de STAT6. Como controlos, vacinaram-se também ratinhos com vector pTargeT sozinho ou sem ADN. O STAT6 activado ou fosforilado foi apenas observado em nódulos linfáticos de ratinhos vacinados com ADN de IL4. O STAT6 fosforilado identificado corre a aproximadamente 60 kD.

Obtiveram-se resultados idênticos numa experiência separada em que os ratinhos receberam três doses diárias, em vez de semanalmente, doses da vacina de ADN. Os ratinhos foram vacinados intramuscularmente com ADN plasmídico numa base diária durante três dias. Um dia depois da última vacina de AND, obtiveram-se lisados de proteína dos nódulos linfáticos de drenagem e analisaram-se como anteriormente num Western anti-STAT6 fosforilado. Observou-se uma banda de 60 kD apenas 34 ΕΡ 1 621 208/ΡΤ nas células de nódulos linfáticos de ratinhos vacinados com ADN de IL4. A co-vacinação com ADN que codifica IL4 e o minigene de PLP139-151 protege contra a indução de EAE. Para explorar o efeito da modificação da protecção conferida pela imunização com ADN com o gene que codifica PLPi39_i5i, co-vacinámos ratinhos com os genes para IL4 e PLP139_151, na forma de dois plasmideos separados. 0 gene de IL4 murino foi clonado no vector de expressão de mamífero pTargeT sob o controlo do promotor de CMV como descrito anteriormente. 0 gene que codifica PLPi39_151 foi obtido como descrito anteriormente.

Ratinhos SJL/J foram injectados com 100 μg de cada plasmídeo intramuscularmente, duas vezes, com intervalos de uma semana. Os ratinhos de controlo foram injectados com vector apenas ou com PBS. Dez dias após a última injecção, os ratinhos foram provocados para indução de EAE com o péptido encefalolitogénico PLP139-151 emulsionado em adjuvante completo de Freund (CFA) . Como mostrado na Tabela 3, há uma diminuição significativa nas classificações médias de doença de ratinhos co-vacinados com ambos os plasmideos, de IL4 e de PLP139-151, em comparação com controlos (veja-se a tabela para os valores de p) . Há também uma diminuição na incidência de doença e gravidade média de pico da doença com a co-vacina em comparação com controlos. O início da doença não foi significativamente retardado em comparação com os grupos de controlo. Não foi observada protecção significativa contra a doença em ratinhos vacinados apenas com ADN que codifica IL4.

Tabela 2.

Gravidade da doença EAE em ratinhos vacinados com ADN ADN n Percent. de incidência Gravidade média do pico da doençaa Classif. média no dia 12 Classif. média no dia 14 Classif. média no dia 16 Nenhum 14 86 2,3+0,3 1,610,4 1,210,2 0,710,3 pTargeT 15 93 2,410,2 1,610,3 1,710,2 1,110,2 IL4 15 80 2,7+0,3 1,410,3 1,110,2 0,410,2 IL4 & PLP 139-151 15 53 1,610,3 (p< 0, 0383)b 0,810,3 (p< 0,0494) 0,710,3 (p< 0,0075) 0,510,2 (p< 0,0411) a médias dadas como média ± SEM. b Todos os valores p dados por comparação de IL4/PLP139-151 com pTargeT pelo teste t de Student desemparelhado. 35

ΕΡ 1 621 2 Ο 8/PT A co-vacinação com ADN que codifica IL4 recupera respostas proliferativas de células T em animais vacinados com ADN de PLP13g-151. Ratinhos que foram vacinados com ADN e provocados para indução da doença com péptido PLP139-151 foram sacrificados após a recuperação da doença aguda inicial.

Obtiveram-se células de nódulos linfáticos de drenagem (LNC) destes ratinhos e re-estimularam-se in vitro com o péptido de PLP139—151 para determinar as suas respostas proliferativas. Adicionalmente, mantiveram-se linhas de células T especificas do antigénio destas LNC para analisar os seus perfis de secreção de citoquinas.

As LNC foram testadas quanto às suas respostas proliferativas ao péptido PLP139-151. Não houve alteração significativa no padrão proliferativo de LNC de ratinhos co-vacinados com ADN de IL4 e PLP139-151 em comparação com ratinhos de controlo vacinados com apenas vector. Em contraste, as LNC de ratinhos vacinados apenas com ADN de PLP139-151 têm uma capacidade proliferativa reduzida. Mostrámos previamente que estas células T são anérgicas (Exemplo 1). Portanto, a adição de IL4 na forma de co-vacina de ADN é capaz de recuperar a anergia imposta pela vacina de ADN de PLP139-151. Assim, pode ser produzido um mecanismo de protecção diferente por co-vacinação com ADN de IL4 em comparação com vacinação com apenas ADN de PLP139-151. A co-vacinação com ADN que codifica IL4 altera o fenótipo de células T para um tipo Th2. Isolaram-se linhas de células T especificas de PLPi39_i5i de ratinhos provocados para indução de doença com o péptido PLPi39_i5i e previamente vacinados com várias combinações de ADN, e mantiveram-se em cultura. Estas linhas de células T foram testadas quanto à produção de citoquinas após estimulação in vitro com o péptido PLPi39_i5i. As células T de ratinhos co-vacinados com ADN de IL4 e PLP139-151 produziram quantidades significativamente maiores de IL4 (média de 716 ± 237 pg/ml vs. 0,208 ± 0,36 pg/ml de ratinhos vacinados com pTargeT, p< 0,0064) e IL10 (média de 1073 ± 221 pg/ml vs. 464 ± 44 pg/ml de ratinhos vacinados com pTargeT, p< 0,0151) em comparação com células T de ratinhos de controlo. Em adição, células T dos ratinhos co-vacinados com ADN de IL4 e PLPi39_i5i produziram menores quantidades de IFNy 36 ΕΡ 1 621 208/ΡΤ em comparaçao com células T de controlo (média de 1389 ± 108 pg/ml vs. 6689 ± 85 pg/ml de ratinhos vacinados com pTargeT, p< 0, 0001) . Assim, células T isoladas dos ratinhos co-vacinados e protegidos produziram mais citoquinas do tipo Th2 em comparação com células T de controlo. Como relatado atrás, as células T de ratinhos vacinados com ADN de PLP!39_151 sozinho tinham uma quantidade reduzida de IFNy, mas não sofrem um desvio para Th2. A protecção contra EAE em ratinhos co-vacinados com ADN de IL4 e PLP139-151 pode ser transferida por células T. As células T derivadas de ratinhos co-vacinados tanto com ADN de IL4 como ADN de PLP139-151, que mantiveram a capacidade proliferativa mas sofreram um desvio para Th2, foram depois testadas quanto à capacidade de transferir a protecção. Os ratinhos foram imunizados com o péptido encefalolitogénico PLPi39_i5i emulsionado em CFA, e oito dias depois injectaram-se 10 milhões de células T intravenosamente em cada ratinho. Os animais foram então seguidos quanto ao fenótipo da doença. Células T de controlo que são específicas para PLP139-151 e se sabe que induzem EAE foram também injectadas como controlo. Os ratinhos injectados com células T derivadas dos ratinhos co-vacinados tinham incidência reduzida (1/5 dos ratinhos em comparação com 4/5 de ratinhos nos controlos) e classificações de doença reduzidas em comparação com ratinhos de controlo injectados com células T. Estes resultados indicam que o efeito protector conseguido por co-vacinação com ADN de IL4 e PLP139—151 pode ser transferido para animais "ingénuos" por células Th2 específicas do antigénio.

Discussão

Este exemplo demonstra um novo método de imunidade protectora que combina os efeitos da vacinação com ADN e da entrega local de genes. Primeiro, demonstrámos que a vacina genética de IL4 entrega IL4 funcional. Após confirmação de que a IL4 de comprimento completo é de facto expressa in vitro a partir da construção de ADN utilizada para a vacinação, mostrámos então que é activado STAT6 em células dos nódulos linfáticos de drenagem pela vacina de ADN de IL4. Como o STAT6 é especificamente activado por IL4, acredita-se que a conclusão mais provável é de que a IL4 é produzida a partir da 37 ΕΡ 1 621 208/ΡΤ vacina de ADN administrada e que interactua com o receptor de IL4 nas células de nódulos linfáticos, que por sua vez provocam a activação de STAT6 a jusante do receptor. 0 STAT6 fosforilado identificado no presente estudo tem aproximadamente 60 kD. Embora a isoforma predominante do STAT6 descrita na literatura seja de 100 kD, foram descritas outras isoformas em tecidos imunitários de ratinho (Quelle et al., 1995) . Adicionalmente, um estudo recente demonstrou a existência de uma isoforma de 65 kD em mastócitos de ratinho (Sherman et al., 1999). A IL4 entregue pela vacina genética de ADN parece activar especificamente esta isoforma. Não nos foi possível detectar respostas de anticorpos contra IL4 nos ratinhos vacinados com ADN de IL4. Portanto, postulámos que o gene de IL4 deste modo entregue e expresso é eficaz para gerar imunidade protectora sem indução de uma resposta imunitária contra IL4.

Quando os ratinhos foram imunizados tanto com a vacina de ADN de IL4 como com uma vacina de ADN separada para o auto-péptido PLP139-151 próprio, estes ratinhos ficaram protegidos contra a indução da doença pelo péptido PLP139-151 emulsionado em CF A. A vacina de ADN de IL4 sozinho não proporcionou protecção significativa. Quando o perfil de citoquinas das células T de ratinhos co-vacinados e protegidos foi examinado, observou-se um desvio para um padrão de secreção de citoquinas do tipo Th2. Adicionalmente, estas células Th2 podiam transferir a protecção contra a indução da doença para ratinhos “ingénuos". Propusemos assim que a combinação da entrega local de IL4 e da vacinação com ADN de PLP139_i51 faz com que as células T autorreactivas específicas do antigénio se desviem no seu fenótipo para uma resposta do tipo Th2, mais protectora. Estas células T protectoras, específicas do antigénio, são então dirigidas a locais de danos na mielina e atenuem a resposta auto-imune patogénica.

Um possível mecanismo de como este desvio fenotípico pode ocorrer é de que as vacinas de ADN de IL4 e PLP139-151 são assimiladas por células apresentadoras do antigénio (APC) no local da administração das vacinas. O péptido PLP139-151 é expresso nas APC e apresentado no MHC de classe II às células T específicas do antigénio que são deste modo recrutadas. As APC também expressam IL4, que é segregada 38 ΕΡ 1 621 208/ΡΤ localmente durante a interacção entre as APC e as células T. Esta IL4 segregada faz então com que o fenótipo da célula T específica do antigénio assuma mais um tipo Th2 de fenótipo. Este modelo é compatível com estudos anteriores que mostraram que células T crescidas em cultura podem ser levadas a assumir um fenótipo mais do tipo Th2 através de crescimento na presença de IL4 (Macatonia et al. (1993) Int Immunol 5: 1119-28) .

Estudos anteriores demonstraram que as APC profissionais quer presentes no local de administração quer recrutadas a partir da medula óssea, podem assimilar o ADN nu e viajar para órgãos linfóides (Chattergoon et al. (1998) J. Immunol 160: 5707-18). É possível que duas APC separadas ou mesmo distantes assimilem os dois plasmídeos diferentes. Acreditamos, contudo, que é o microambiente local durante a interacção entre APC e célula T que é importante pois não foi observado um aumento detectável de IL4 no soro nos ratinhos vacinados com ADN de IL4. Como método de entrega de um produto génico potencialmente adverso, tal como uma citoquina em doses elevadas, esta técnica pode ser desejável relativamente a métodos de terapia génica tradicionais pois a entrega do gene actua localmente e não sistemicamente.

As vacinas de ADN provaram-se eficazes na protecção contra alguns modelos animais de doença auto-imune. Uma das muitas vantagens das vacinas de ADN relativamente aos tratamentos tradicionais de doença auto-imune é a capacidade de facilmente modificar o veículo de tratamento. Mostrámos aqui que com a adição de uma citoquina IL4 entregue geneticamente à vacina de ADN de PLPi39_i5i, pudemos proteger contra EAE e, adicionalmente, conduzir a resposta protectora mais para tipo Th2. A adição de IL4 na forma de co-vacina de ADN recupera a anergia imposta pela vacina de ADN de PLPi39_i5i, e conduz a resposta para um fenótipo Th2. Este mecanismo de protecção produzida por co-vacinação com ADN de IL4 em comparação com a vacinação apenas com ADN de PLP139-151, pode ter vantagens particulares. Esta técnica pode-se provar benéfica no tratamento de outras doenças auto-imunes. A imunização contra os antigénios que desencadeiam estas doenças auto-imunes causadas por células autorreactivas Thl, doenças como a esclerose múltipla, a diabetes juvenil e a artrite 39 ΕΡ 1 621 2 Ο 8/PT reumatóide, seriam condições em que a co-vacinação com ADN que codifica IL-4 pode provar-se benéfica. Em conclusão, os resultados apresentados aqui implicam uma poderosa e nova ferramenta, nomeadamente a combinação de entrega local de genes e vacinação com ADN especifico de um antigénio, que pode ser aplicada universalmente a todas as vacinas de ADN.

Procedimentos Experimentais

Animais. Ratinhos SJUJ fêmeas de seis a oito semanas de idade foram adquiridas a The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) . Péptidos. Os péptidos foram sintetizados num sintetizador de péptidos (modelo 9050; MilliGen, Burlington, MA) através da química do 9-fluorenilmetoxicarbonilo Standard. Os péptidos foram purificados por HPLC. As estruturas foram confirmadas por análise dos aminoácidos e espectroscopia de massa. Os péptidos utilizados nestas experiências foram: (SEQ ID NO:15) PLP139-i5i (HSLGKWLGHPDKF) e (SEQ ID NO: 16) HSVP16 P45 (DMTPADALDDRDLEM).

Vacinas de ADN. Construiu-se um minigene que codifica PLP i39-i5i, como descrito atrás. O gene de IL4 murino foi clonado por PCR a partir de ADNc de baço (Clontech, Paio Alto, CA) utilizando os seguintes iniciadores de PCR: (SEQ ID NO:17) 5'-CGCGGATCCTTGATGGGTCTCAACCCCCAGCTAGTTGTC-3' e (SEQ ID NO:18) 5'-ACGCTCGAGGTACTACGAGTAATCCATTTGCATGATGC-3'. Ambas estas construções foram clonadas na região de clonagem múltipla do vector pTargeT (Promega, Madison, WI), conduzido pelo promotor de CMV. Os clones correctos foram confirmados por sequenciação automática de ADN. A purificação do ADN plasmídico foi realizada utilizando o kit Qiagen Endo-free Mega Prep (Qiagen, Santa Clara, CA) . A pureza do ADN plasmídico foi confirmada por espectrofotometria de UV e electroforese em gel de agarose. Apenas foi utilizado ADN com uma razão de absorvância a 260 nm/280 nm superior a 1,7.

Tradução in vitro. As construções de ADN utilizadas para a vacinação com ADN foram testadas quanto à produção do produto de tamanho correcto através de um ensaio de tradução in vitro. Incubou-se aproximadamente 1 μρ de ADN plasmídico 40 ΕΡ 1 621 208/ΡΤ durante 2 horas a 30°C num volume de 50 μΐ contendo o

seguinte: 25 μΐ de lisado de reticulócitos de coelho TNT (Promega Corp., Maison, WI), 2 μΐ de tampão de reacção de TNT (Promega Corp., Maison, WI), 1 μΐ de ARN-polimerase de T7 para TNT (Promega Corp., Maison, WI) , 1 μΐ de uma mistura 1 mM de aminoácidos sem metionina (Promega Corp., Maison, WI), 4 μρ de 35S-metionina a 10 mCi/ml (Amersham Life Sciences Inc.,

Arlington Heights, IL) , e 1 μΐ de inibidor de ribonuclease ARNasina a 40 U/μΐ (Promega Corp., Maison, WI). Misturou-se um volume de 3 μΐ dos produtos desta reacção com tampao de amostra-SDS e correu-se num gel de poliacrilamida com SDS a 18%. Após secagem, o gel foi então exposto a filme para autorradiografia.

Westerns de STAT6. Após dissecção dos nódulos linfáticos de drenagem de ratinhos vacinados com ADN, os tecidos foram mecanicamente homogeneizados em 1 ml do seguinte tampão: NaCl 0,1 M, Tris-HCl 0,01 M, pH7,4, EDTA 0,001 M, aprotinina a 1 μρ/ιηΐ, Pefabloc SC 1,6 μΜ (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Utilizaram-se 0,5 ml do lisado resultante num ensaio da proteína BCA (Pierce, Rockford, IL) para determinar a concentração total de proteína. Os restantes 0,5 ml foram adicionados a 0,25 ml de tampão de carga SDS 3x (New England Biolabs, Beverly, MA) contendo DTT numa concentração final de 0,04 M. Os produtos foram resolvidos num gel de SDS-PAGE com gradiente de 4-15% (Bio-Rad, Hercules, CA) . Utilizaram-se marcadores pré-corados para determinar os pesos moleculares (Bio Rad, Hercules, CA) . Após electroforese, os géis foram transferidos para membranas de PVDF (Amersham Life Sciences Inc., Arlington Heights, IL) a uma voltagem constante de 100 V em Tris 25 mM, glicina 192 mM e metanol a 20% (v/v) como tampão de transferência. As membranas foram bloqueadas durante 1 hora à temperatura ambiente com solução salina tamponada com Tris (TBS), Tween 20 a 0,1%, e leite desidratado sem gordura a 20%. Após lavagem das membranas com TBS e Tween 20 a 0,1%, hibridaram-se as membranas durante a noite a 4°C com anticorpo anti-fosf0STAT6 (New England Biolabs, Beverly, MA) diluído de 1:1000 em TBS, Tween 20 a 0,1%, BSA a 5%. As membranas foram então processadas como no 41 ΕΡ 1 621 208/ΡΤ protocolo ECL Plus (Amersham Life Sciences Inc., Arlington Heights, IL) para visualização das bandas por quimioluminescência. As membranas foram removidas por incubação em β-mercaptoetanol 100 mM, SDS a 2% (p/v) , e Tris-HC1 62,5 mM, pH 7,4, durante 30 minutos a 60°C. Estas mesmas membranas foram então sondadas com um anticorpo contra CD34 de ratinho (Pharmingen, San Diego, CA) como controlo para verificar a igualdade da carga das pistas.

Protocolo de imunização com ADN. Os animais foram injectados nos quadríceps esquerdos com 0,1 ml de bupivicaína-HC1 a 0,25% (Sigma, St. Louis, MO) em PBS. Dois e 9 dias mais tarde, os ratinhos foram injectados com 100 μρ de ADN plasmídico (numa concentração de 1 mg/ml em PBS) no mesmo músculo. Os animais que receberam co-vacina receberam duas injecções separadas de cada ADN plasmídico.

Indução de EAE. Sete a 10 dias após a vacina final de ADN, induziu-se EAE em ratinhos com 100 μρ de péptido PLP139_i5i. O péptido foi dissolvido em PBS numa concentração de 2 mg/ml e emulsionado com um volume igual de adjuvante incompleto de Freund suplementado com 4 mg/ml de micobactéria da tuberculose H37Ra morta por calor (Difco Laboratories, Detroit, MI). Os ratinhos foram injectados subcutaneamente com 0,1 ml da emulsão de péptido. Os animais experimentais foram classificados como se segue: 1 , fraqueza ou paralisia da cauda; 2, fraqueza nos membros traseiros; 3, paralisia nos membros traseiros; 4, fraqueza ou paralisia nos membros dianteiros; e 5, animais moribundos ou mortos.

Ensaios de proliferação de células de nódulos linfáticos. Após a fase aguda da doença, dissecaram-se nódulos linfáticos de drenagem e cultivaram-se as células dos nódulos linfáticos (LNC) in vitro para resposta proliferativa específica ao péptido PLP139—151. As LNC foram preparadas em placas de microtítulo de 96 poços num volume de 0,2 ml/poço numa concentração de 2,5 x 106 células/ml. O meio de cultura consistia em RPMI enriquecido (RPMI 1640 suplementado com L-glutamina [2 mM], piruvato de sódio [1 mM] , aminoácidos não 42

ΕΡ 1 621 2 Ο 8/PT essenciais [0,1 mM], penicilina [100 U/ml], estreptomicina [0,1 mg/ml], 2-ME [5 X 10-5 M] ) suplementado com 1% de soro de ratinho normal fresco autólogo. Incubaram-se as culturas a 37°C e após 72 horas, pulsaram-se as células durante 18 horas com 1 μθί/ροςο de [3H]timidina. As células foram então recolhidas e contadas num contador beta.

Determinação do perfil de citoquinas. Estabeleceram-se linhas de células T a partir de LNC derivadas de ratinhos vacinados com ADN. Estas células T foram então testadas quanto à produção de várias citoquinas. Incubaram-se 50 x 103 células T/ml com 2,5 x 106 APC singénicas irradiadas/ml em RPMI enriquecido e FCS a 10%. Após 6 dias de cultura recolheram-se os sobrenadantes e testaram-se por ELISA de sanduíche utilizando kits de ELISA Standard (Pharmingen, San Diego, CA).

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Lawrence Steinman Pedro Ruiz Hideki Garren

<120> VACINAÇÃO COM ADN PARA TRATAMENTO DE DOENÇA AUTO-IMUNE

<130> STAN-123WO <150> 09/267590 <151> 1999-03-12 <160> 14 <170> FastSEQ para Windows Versão 4.0

<210> 1 <211> 2777 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (119)...(952) 43 ΕΡ 1 621 208/ΡΤ <400> 1 gaattcggga aaagaccgaa gaaggaggct ggagagacca ggatccttcc agctgaacaa 60 agtcagccac aaagcagact agccagccgg ctacaattgg agtcagagtc ccaaagac 118 atg ggc ttg tta gag tgc tgt gea aga tgt ctg gta ggg gee ccc ttt 166 Met 1 Gly Leu Leu Glu 5 Cys Cys Ala Arg Cys 10 Leu Vai Gly Ala Pro 15 Phe gct tec ctg gtg gee act gga ttg tgt ttc ttt ggg gtg gea ctg ttc 214 Ala Ser Leu Vai 20 Ala Thr Gly Leu Cys 25 Phe Phe Gly Vai Ala 30 Leu Phe tgt ggc tgt gga cat gaa gee etc act ggc aca gaa aag cta att gag 262 Cys Gly Cys 35 Gly His Glu Ala Leu 40 Thr Gly Thr Glu Lys 45 Leu Ile Glu acc tat ttc tec aaa aac tac caa gac tat gag tat etc ate aat gtg 310 Thr Tyr 50 Phe Ser Lys Asn Tyr 55 Gin Asp Tyr Glu Tyr 60 Leu Ile Asn Vai ate cat gee ttc cag tat gtc ate tat gga act gee tet ttc ttc ttc 358 Ile 65 His Ala Phe Gin Tyr 70 Vai Ile Tyr Gly Thr 75 Ala Ser Phe Phe Phe 80 ctt tat 999 gee etc ctg ctg gct gag ggc ttc tac acc acc ggc gea 406 Leu Tyr Gly Ala Leu 85 Leu Leu Ala Glu Gly 90 Phe Tyr Thr Thr Gly 95 Ala gtc agg cag ate ttt ggc gac tac aag acc acc ate tgc ggc aag ggc 454 Vai Arg Gin Ile 100 Phe Gly Asp Tyr Lys 105 Thr Thr Ile Cys Gly 110 Lys Gly ctg age gea a cg gta aca 999 ggc cag aag 999 agg ggt tec aga ggc 502 Leu Ser Ala 115 Thr Vai Thr Cl \r — — J Gl” 120 ·% T '·_ «9 ri .. « ___ SVL y Gly 125 Ser Arg Gly 44 ΕΡ 1 621 208/ΡΤ caa cat caa gct cat tct ttg gag cgg gtg tgt act tgt ttg gga aaa 550 Gin His 130 Gin Ala His Ser Leu 135 Glu Arg Val Cys Thr 140 Cys Leu Gly Lys tgg cta gga cat ccc gac aag ttt gtg ggc ate acc tat gcc ctg acc 598 Trp 145 Leu Gly His Pro Asp 150 Lys Phe Val Gly Ile 155 Thr Tyr Ala Leu Thr 160 gtt gtg tgg ctc ctg gtg ttt gcc tgc tct gct gtg cct gtg tac att 646 Vai Val Trp Leu Leu 165 Val Phe Ala Cys Ser 170 Ala Val Pro Val Tyr 175 Ile tac ttc aac acc tgg acc acc tgc cag tct att gcc ttc ccc age aag 694 Tyr Phe Asn Thr 180 Trp Thr Thr Cys Gin 185 Ser lie Ala Phe Pro 190 Ser Lys acc tct gcc agt ata ggc agt ctc tgt gct gac gcc aga atg tat ggt 742 Thr Ser Ala 195 Ser Ile Gly Ser Leu 200 Cys Ala Asp Ala Arg 205 Met Tyr Gly gtt ctc cca tgg aat gct ttc cct ggc aag gtt tgt ggc tcc aac ctt 790 Vai Leu 210 Pro Trp Asn Ala Phe 215 Pro Gly Lys Val Cys 220 Gly Ser Asn Leu ctg tcc ate tgc aaa aca gct gag ttc caa atg acc ttc cac ctg ttt 838 Leu 225 Ser Ile Cys Lys Thr 230 Ala Glu Phe Gin Met 235 Thr Phe His Leu Phe 240 att gct gea ttt gtg ggg gct gea gct aca ctg gtt tcc ctg ctc acc 886 Ile Ala Ala Phe Val 245 Gly Ala Ala Ala Thr 250 Leu Val Ser Leu Leu 255 Thr ttc atg att gct gcc act tac aac ttt gcc gtc ctt aaa ctc atg ggc 934 Phe Met Ile Ala 260 Ala Thr Tyr Asn Phe 265 Ala Val Leu Lys Leu 270 Met Gly cga ggc acc aag ttc tga tcccccgtag aaatccccct ttctctaata 982

Arg Gly Thr Lys Phe * 275

gcgaggctcc tctaaccaca cagcctacaa ttgccaccaa ctggccctct tcttacttga tgattaaggt ctctctttgg actctcccct atagctggtt cctgctagaa atgggaaatg acaaaggaat ggaggctcta attgaatttt tcttctcaaa gggtacttcc actgatggaa gagaaggaat gtctttggtc ctcttgccat tacaaaatgg aattcattct ggtctctcta tcagaaaaac aataagagcg tttgcccaaa aaagcaagga tctttcaccc acagaaagag aagccctaac tcagccaacc ttacttacag agggggcatc tggccttaca cctcgttagg tcactccctt ctccttgata acagctacca aatagaagga aactagctta catgagaaca gctaatggtg taacctgaga tggccctctg gcatgtcttt ttttctgtta attagttgtg gtgctcattfc catggggtat tatccattca tgttttagaa tgatgcacat ttcatgtatt atcagaaatg tctggagaat aattctttga ff?.C3tt22ÇC utdttu«w«S caagtattct gcctttgcag aaacagattt gatcgttctt tctagctaat ggaaaatgat agagttaggt ttaacataaa ggttattttc tgctgcgtct cccatcttaa ctctttgcct tgagtgtaac aagaaaggag agtcttgcag cttatgtacc tcttttagtc attttgcttc cctaagaaga tgacttccca actcgaagtc caagcatctc ctgaggatca gaaagtaatt acaaagtgga aggaaagaag gtcaggtaca ctataggggc caaatatatt ctctttggtg ttaccactga agatagaaga aaaaagaatg tctgcctatt gcagctggga gaagggggtc agcactgacc ccgatggcga tggactactg cataagggag cgtagaatct gtgtagacga gaagagaaac agggtgttgt cagcatcttc tgacaaccct gtggtttcca aggagctgag gactggcctg aggagcagca gttcctggtg gtagacacag gatagataac tctttggata tactctggcc tctgtcatat cttcacaatg gtcatcgtag gtgatttgaa ggtcttgatt ccagtttgtt tattacttat ttggggttgc ttatgactgt tttttaaact aggaaaattg ttggctagtt gaatctactg ggatcttcta ggtgaatttg aatctcaatt tgagtaatct tttacttagc aatgttatct tggtgtgtta tcctgatata gatcacataa cagaatgcac 1042 1102 1162 1222 1282 1342 1402 1462 1522 1582 1642 1702 1762 1822 1882 1942 2002 2062 2122 2182 2242 2302 2362 45 ΕΡ 1 621 208/ΡΤ 2422 2482 2542 2602 2662 2722 2777 cagtcatcag ctattcagtt ggtaagcttc caggaaaaag gacaggcaga aagagtttga gacctgaata gctcccagat ttcagtcttt tcctgttttt gttaactttg ggttaaaaaa aaaaaaagtc tgattggttt taattgaagg aaagatttgt actacagttc ttttgttgta aagagttgtg ttgttctttt cccccaaagt ggtttcagca atatttaagg agatgtaaga gctttacaaa aagacacttg atacttgttt tcaaaccagt atacaagata agcttccagg ctgcatagaa ggaggagagg gaaaatgttt tgtaagaaac caatcaagat aaaggacagt gaagtaatcc gtaccttgtg ttttgttttg atttaataac ataacaaata accaa

<210> 2 <211> 277 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2

Met 1 Gly Leu Leu Glu 5 Cys Cys Ala Arg Cys 10 Leu Val Gly Ala Pro 15 Phe Ala Ser Leu Vai 20 Ala Thr Gly Leu Cys 25 Phe Phe Gly Val Ala 30 Leu Phe Cys Gly Cys 35 Gly His Glu Ala Leu 40 Thr Gly Thr Glu Lys 45 Leu Ile Glu Thr Tyr 50 Phe Ser Lys Asn Tyr 55 Gin Asp Tyr Glu Tyr 60 Leu Ile Asn Val Ile 65 His Ala Phe Gin Tyr 70 Vai Ile Tyr Gly Thr 75 Ala Ser Phe Phe Phe 80 Leu Tyr Gly Ala Leu 85 Leu Leu Ala Glu Gly 90 Phe Tyr Thr Thr Gly 95 Ala Vai Arg Gin Ile 100 Phe Gly Asp Tyr Lys 105 Thr Thr Ile Cys Gly 110 Lys Gly Leu Ser Ala 115 Thr Vai Thr Gly Gly 120 Gin Lys Gly Arg Gly 125 Ser Arg Gly Gin His 130 Gin Ala His Ser Leu 135 Glu Arg Val Cys Thr 140 Cys Leu Gly Lys Trp 145 Leu Gly His Pro Asp 150 Lys Phe Val Gly Ile 155 Thr Tyr Ala Leu Thr 160 Vai Vai Trp Leu Leu 165 Vai Phe Ala Cys Ser 170 Ala Val Pro Val Tyr 175 Ile Tyr Phe Asn Thr 180 Trp Thr Thr Cys Gin 185 Ser Ile Ala Phe Pro 190 Ser Lys Thr Ser Ala 195 Ser Ile Gly Ser Leu 200 Cys Ala Asp Ala Arg 205 Met Tyr Gly Vai Leu 210 Pro Trp Asn Ala Phe 215 Pro Gly Lys Val Cys 220 Gly Ser Asn Leu Leu 225 Ser Ile Cys Lys Thr 230 Ala Glu Phe Gin Met 235 Thr Phe His Leu Phe 240 Zle Ala Ala Phe Vai 245 Gly Ala Ala Ala Thr 250 Leu Val Ser Leu Leu 255 Thr Phe Arg Met Gly Ile Thr 275 Ala 260 Lys Ala Phe Thr Tyr Asn Phe 265 Ala Val Leu Lys Leu 270 Met Gly <210> 3 <211> 2139 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (37).. ..(552) 46 ΕΡ 1 621 208/ΡΤ <400> 3 gaaaacagtg cagccacctc cgagagcctg gatgtg atg gcg tca cag aag aga 54

Met 1 Ala Ser Gin Lys 5 Arg ccc tcc cag agg cac gga tcc aag tac ctg gcc aca gea agt acc atg 102 Pro Ser Gin Arg 10 His Gly Ser Lys Tyr 15 Leu Ala Thr Ala Ser 20 Thr Met gac cat gcc agg cat ggc ttc ctc cca agg cac aga gac acg ggc ate 150 Asp His Ala Arg 25 His Gly Phe Leu 30 Pro Arg His Arg Asp 35 Thr Gly Ile ctt gac tcc ate ggg cgc ttc ttt ggc ggt gac agg ggt gcg cca aag 198 Leu Asp 40 Ser Ile Gly Arg Phe 45 Phe Gly Gly Asp Arg 50 Gly Ala Pro Lys cgg ggc tct ggc aag gac tca cac cac ccg gea aga act gct cac tat 246 Arg 55 Gly Ser Gly Lys Asp 60 Ser His His Pro Ala 65 Arg Thr Ala His Tyr 70 ggc tcc ctg ccc cag aag tca cac ggc cgg acc caa gat gaa aac ccc 294 Gly Ser Leu Pro Gin 75 Lys Ser His Gly Arg 80 Thr Gin Asp Glu Asn 85 Pro gta gtc cac ttc ttc aag aac att gtg acg cct cgc aca cca ccc ccg 342 Vai Vai His Phe 90 Phe Lys Asn Ile Vai 95 Thr Pro Arg Thr Pro 100 Pro Pro tcg cag gga aag ggg aga gga ctg tcc ctg age aga ttt age tgg ggg 390 Ser Gin Gly 105 Lys Gly Arg Gly Leu 110 Ser Leu Ser Arg Phe 115 Ser Trp Gly gcc gaa ggc cag aga cca gga ttt ggc tac gga ggc aga gcg tcc gac 438 Ala Glu 120 Gly Gin Arg Pro Gly 125 Phe Gly Tyr Gly Gly 130 Arg Ala Ser Asp tat aaa tcg gct cac aag gga ttc aag gga gtc gat gcc cag ggc acg 486 Tyr 135 Lys Ser Ala His Lys 140 Gly Phe Lys Gly Vai 145 Asp Ala Gin Gly Thr 150 ctt tcc aaa att ttt aag ctg gga gga aga gat agt cgc tct gga tca 534 Leu Ser Lys Ile Phe 155 Lys Leu Gly Gly Arg 160 Asp Ser Arg Ser Gly 165 Ser ccc atg gct aga cgc tga aaacccacct ggttccggaa tcctgtcctc 582

Pro Met Ala Arg Arg * 170 agcttcttaa tataactgcc ttaaaacttt aatcccactt gcccctgtta cctaattaga 642 gcagatgacc cctcccctaa tgcctgcgga gttgtgcacg tagtagggtc aggccacggc 702 agcctaccgg caatttccgg ccaacagtta aatgagaaca tgaaaacaga aaacggttaa 762 aactgtccct ttctgtgtga agatcacgtt ccttcccccg caatgtgccc ccagacgcac 822 gtgggtettc agggggccag gtgcacagac gtccctccac gttcacccct ecacccttgg 882 actttctttt cgccgtggct cggcaccctt gcgcttttgc tggtcactgc catggaggca 942 cacagctgca gagacagaga ggacgtgggc ggcagagagg actgttgaca tccaagcttc 1002 ctttgttttt ttttcctgtc cttctctcac ctcctaaagt agacttcatt tttcctaaca 1062 ggattagaca gtcaaggagt ggcttactac atgtgggagc tttttggtat gtgacatgcg 1122 ggctgggcag ctgttagagt ccaacgtggg gcagcacaga gagggggcca cctccccagg 1182 ccgtggctgc ccacacaccc caattagctg aattcgcgtg tggcagaggg aggaaaagga 1242 ggcàdacgCg ggctgggcaa tggcctcaca taggaaacag ggtcttcctg gagatttggt 1302 gatggagatg tcaagcaggt ggcctctgga cgtcaccgtt gccctgcatg gtggccccag 1362 agcagcctct atgaacaacc tcgtttccaa accacagccc acagccggag agtccaggaa 1422 gacttgcgca ctcagagcag aagggtagga gtcctctaga cagcctcgca gccgcgccag 1482 47 ΕΡ 1 621 208/ΡΤ 1542 1602 1662 1722 1782 1842 1902 1962 2022 2082 2139 tcgcccatag acactggctg tgaccgggcg tgctggcagc ggcagtgcac agtggccagc actaaccctc cctgagaaga taaccggctc attcacttcc tcccagaaga cgcgtggtag cgagtaggca caggcgtgca cctgctcccg aattactcac cgagacacac gggctgagca gacggcccct gtgatggaga caaagagctc ttctgaccat atccttctta acacccgctg gcatctcctt tcgcgcctcc ctccctaacc tactgaccca ccttttgatt ttagcgcacc tgtgattgat aggccttcca aagagtccca cgctggcatc accctccccg aggacggaga tgaggagtag tcagcgtgat gccaaaacgc gtcttcttaa tccaattcta attctgaatg tttcgtgtgg gcttaatacc atgtctatta atatatagcc tcgatgatga gagagttaca aagaacaaaa ctccagacac aaacctccaa atttttcagc agaagcactc tgcgtcgctg agctgaggtc ggctctgcga tccatacgtg gccgcaccca cacagcacgt gctgtgacga tggctgaacg gaaagtgtac actgttcctg aatattgaaa taaaacaata aactttt

<210> 4 <211> 171 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4

Met Ala Ser Gin Lys Arg Pro Ser Gin Arg His Gly Ser Lys Tyr Leu 1 5 10 15 Ala Thr Ala Ser Thr Met Asp His Ala Arg His Gly Phe Leu Pro Arg 20 25 30 His Arg Asp Thr Gly lie Leu Asp Ser Ile Gly Arg Phe Phe Gly Gly 35 40 45 Asp Arg Gly Ala Pro Lys Arg Gly Ser Gly Lys Asp Ser His His Pro 50 55 60 Ala Arg Thr Ala His Tyr Gly Ser Leu Pro Gin Lys Ser His Gly Arg 65 70 75 80 Thr Gin Asp Glu Asn Pro Vai Vai His Phe Phe Lys Asn Ile Vai Thr 85 90 95 Pro Arg Thr Pro Pro Pro Ser Gin Gly Lys Gly Arg Gly Leu Ser Leu 100 105 110 Ser Arg Phe Ser Trp Gly Ala Glu Gly Gin Arg Pro Gly Phe Gly Tyr 115 120 125 Gly Gly Arg Ala Ser Asp Tyr Lys Ser Ala His Lys Gly Phe Lys Gly 130 135 140 Vai Asp Ala Gin Gly Thr Leu Ser Lys Ile Phe Lys Leu Gly Gly Arg 145 150 155 160 Asp Ser Arg Ser Gly Ser Pro Met Ala Arg Arg 165 170 <210> 5 <211> 13

<212> PRT <213> M. musculus <400> 5

His Ser Leu Gly Lys Trp Leu Gly His Pro Asp l»ys Phe 1 5 10 <210> 6 <211> 13

<212> PRT <213> M. musculus 48 ΕΡ 1 621 208/ΡΤ <400> 6

His Ser Leu Glv Lys Leu Leu Gly Arg Pro Asp Lys Phe 15 <210> 7 <211> 14 <212> PRT <213> M. musculus <400> 7

Asn Thr Trp Thr Thr Cys Gin Ser Ile Ala Phe Pro Ser Lys 15 10 <210> 8 <211> 65

<212> ADN <213> M. musculus <400> 8 ctggagacca gaatacctgg accacctgcc agtctattgc cttccctagc aagtctagat 60 agcta 65 <210> 9 <211> 63

<212> ADN <213> M. musculus <400> 9 ctcgagacca tgcattgttt gggaaaatgg ctaggacatc ccgacaagtt ttctagatag 60 cta 63 <210> 10 <211> 63

<212> ADN <213> M. musculus <400> 10 60 63 ctcgagacca tgcattgttt gggaaaacta ctaggacgcc ccgacaagtt ttctagatag cta

<210> 11 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11

Vai His Phe Phe Lys Asn Ile Vai Thr Pro Arg Thr Pro 15 10 49 ΕΡ 1 621 208/ΡΤ

<210> 12 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12

Phe Lys Asn Ile Vai Thr Pro 1 5

<210> 13 <211> 153 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13

Met Gly Leu Thr Ser Gin Leu Leu Pro Pro Leu Phe Phe Leu Leu Ala 1 a 5 10 15 Cys Ala Gly Asn Phe Vai His Gly His Lys Cys Asp Ile Thr Leu Gin 20 25 30 Glu Ile Ile I.ys Thr Τ,οπ Asn cer Y W9U W1__ X 111. Glu Gin Lys Thr Leu Cys 35 40 45 Thr Glu Leu Thr Vai Thr Asp Ile Phe Ala Ala Ser Lys Asn Thr Thr 50 55 60 Glu Lys Glu Thr Phe Cys Arg Ala Ala Thr Vai Leu Arg Gin Phe Tyr 65 70 75 80 Ser His His Glu Lys Asp Thr Arg Cys Leu Gly Ala Thr Ala Gin Gin 85 90 95 Phe His Arg His Lys Gin Leu Ile Arg Phe Leu Lys Arg Lèu Asp Arg 100 105 110 Asn Leu Trp Gly Leu Ala Gly Leu Asn Ser Cys Pro Vai Lys Glu Ala 115 120 125 Asn Gin Ser Thr Leu Glu Asn Phe Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met 130 135 140 Arg Glu Lys Tyr Ser Lys Cys Ser Ser 145 150

<210> 14 <211> 614 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (64)...(525) <221> mat_peptide <222> (136)...(522) 50 ΕΡ 1 621 208/ΡΤ < 4 0 0 > 14 gatcgttagc ttctcctgat aaactaattg cctcacattg tcactgcaaa tcgacaccta 60 tta atg Met 1 ggt Gly ctc Leu acc Thr tcc Ser 5 caa Gin ctg Leu ctt Leu ccc Pro cct Pro 10 ctg Leu ttc Phe ttc Phe ctg Leu cta Leu 15 108 gca tgt gcc ggc aac ttt gtc cac gga cac aag tgc gat ate acc tta 156 Ala Cys Ala Gly Asn 20 Phe Vai His Gly His 25 Lys Cys Asp Ile Thr 30 Leu cag gag ate ate aaa act ttg aac age ctc aca gag cag aag act ctg 204 Gin Glu Ile Ile 35 Lys Thr Leu Asn Ser 40 Leu Thr Glu Gin Lys 45 Thr Leu tgc acc gag ttg acc gta aca gac ate ttt gct gcc tcc aag aac aca 252 Cys Thr Glu 50 Leu Thr Vai Thr Asp 55 Ile Phe Ala Ala Ser 60 Lys Asn Thr act gag aag gaa acc ttc tgc agg gct gcg act gtg ctc cgg cag ttc 300 Thr Glu 65 Lys Glu Thr Phe Cys 70 Arg Ala Ala Thr Vai 75 Leu Arg Gin Phe tac age cac cat gag aag gac act ege tgc ctg ggt gcg act gca cag 348 Tyr Θ0 Ser His His Glu Lys 85 Asp Thr Arg Cys Leu 90 Gly Ala Thr Ala Gin 95 . cag ttc cac agg cac aag cag ctg ate cga ttc ctg aaa cgg ctc gac 396 Gin Phe His Arg His 100 Lys Gin Leu Ile Arg 105 Phe Leu Lys Arg Leu 110 Asp agg aac ctc tgg ggc ctg gcg ggc ttg aat tcc tgt cct gtg aag gaa 444 Arg Asn Leu Trp 115 Gly Leu Ala Gly Leu 120 Asn Ser Cys Pro Vai 125 Lys Glu gcc aac caa snf • J — ά r*n — ttg rra a 3 — *« aag v» W W C)ââ agg cta aag acg ate 492 Ãla Asn Gin 130 Ser Thr Leu Glu Asn 135 Phe Leu Glu Arg Leu 140 Lys Thr Ile atg Met aga Arg 145 gag Glu aaa Lys tat tea Tyr Ser aag Lys 150 tgt Cys teg Ser age Ser tga * atattttaat ttatgagttt 545 ttgatagctt tattttttaa gtatttatat àtttataact catcataaaa taaagtatat 60S atagaatct 614

Lisboa, 2010-03-30

Claims (12)

1. ΕΡ 1 621 208/ΡΤ 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Cassete de expressão de ADN compreendendo uma região de iniciação da transcrição, uma sequência de codificação de um auto-antigénio que codifica pelo menos uma porção de um auto-antigénio e uma região de terminação da transcrição, a região de iniciação da transcrição compreendendo um promotor, utilização no tratamento de diabetes mellitus dependente de insulina num hospedeiro humano por injecção intramuscular, em que o referido auto-antigénio está associado a diabetes mellitus dependente de insulina e o referido tratamento estabiliza ou melhora os sintomas clínicos do referido ser humano.
2. 2. Cassete de expressão de ADN para utilização de acordo com a reivindicação 1 em que o referido auto-antigénio é uma proteína humana endógena.
3. 3. Cassete de expressão de ADN para utilização de acordo com a reivindicação 1 ou 2 em que o referido auto-antigénio é insulina, proinsulina, ácido glutâmico-descarboxilase 65 ou antigénio de células dos ilhéus.
4. 4. Cassete de expressão de ADN para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em que a cassete de expressão está presente num vector.
5. 5. Cassete de expressão de ADN para utilização de acordo com a reivindicação 4, em que a referida cassete de expressão de ADN está num vector plasmídico.
6. 6. Cassete de expressão de ADN para utilização de acordo com a reivindicação 4 ou 5, em que o vector compreende ainda uma segunda cassete de expressão de ADN compreendendo uma segunda sequência que codifica uma citoquina Th2 sob o controlo regulador de um promotor que é activo no referido hospedeiro humano. ΕΡ 1 621 208/ΡΤ 2/2
7. 7. Cassete de expressão de ADN para utilização de acordo com a reivindicação 4 ou 5 que compreende ainda a utilização de uma segunda cassete de expressão de ADN compreendendo uma segunda sequência que codifica uma citoquina Th2 sob o controlo regulador de um promotor que é activo no referido hospedeiro humano, estando a cassete presente numa construção de ADN separada.
8. 8. Cassete de expressão de ADN para utilização de acordo com a reivindicação 7, em que a referida construção de expressão que codifica a referida citoquina Th2 e a referida construção de expressão que codifica pelo menos uma porção de um auto-antigénio são co-formuladas.
9. 9. Cassete de expressão de ADN para utilização de acordo com a reivindicação 7, em que a referida construção de expressão que codifica a referida citoquina Th2 e a referida construção de expressão que codifica pelo menos uma porção de um auto-antigénio são formuladas independentemente.
10. 10. Cassete de expressão de ADN para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 9 em que a referida citoquina Th2 é IL-4, IL-10 ou TGF-β.
11. 11. Cassete de expressão de ADN para utilização de acordo com a reivindicação 10, em que a referida IL-4 é IL-4 humana.
12. 12. Cassete de expressão de ADN para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a cassete é administrada numa série de pelo menos duas injecções administradas com intervalo de pelo menos 24 horas. Lisboa, 2010-03-30